KR100384250B1 - 엡스타인-바바이러스펩티드및이펩티드에대한항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 엡스타인-바 바이러스(EBV) 항체와 면역화학적으로 반응성인 펩티드 또는 이것의 단편에 관한 것이다. 이 펩티드 또는 이것의 단편에 대해 유발되는 신규 모노클로널 항체도 또한 본 발명의 일부분이다.

본 발명은 또한 시험액중의 EBV 또는 항-EBV 를 검측하는 방법, 본 발명의 펩티드, 단편 또는 폴리펩티드를 함유하는 면역화학 시약, 및 상기 검측 방법을 수행할 때 사용되는 시험 킷트에 관한 것이다.

또한, 천연 및 변성된 본래의 작용성 EBNA-1 단백질을 검측할 수 있는 것을 특징으로 하며, 상기 펩티드에 대해 유발되는 모노클로널 항체 및 폴리클로널 항체를 사용하여 시험액이나 조직 표본중에 존재하는 EBV를 검측하는 방법도 본 발명의 일부분이다.

Description

엡스타인-바 바이러스 펩티드 및 이 펩티드에 대한 항체

본 발명은 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr Virus; EBV)에 대한 항체와 면역화학적으로 반응성이 있는 펩티드, 이 펩티드에 대한 모노클로널 항체(monoclonal antibody), 모노클로널 항체 및 항-유전인자형 항체(anti-idiotype antibody)를 생산할 수 있는 세포주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 EBV 또는 항-EBV 항체를 검출하는데 사용되는 면역학적 시약 및 방법에 관한 것이다.

EBV는 아프리카(풍토병 또는 e)형의 버키트 임파종(BL)과 관련이 있는 것으로 처음 발견된 편재하는 인간 헤르페스 바이러스이다. 이 바이러스는 그 후 비인두암(NPC)과도 관련이 있는 것으로 밝혀졌고, 전염성 단핵증(IM)의 원인 인자인 것으로 밝혀졌다. 보통 초기 유년기에 감염이면 일반적으로 준임상적 증상을 나타내고, 때로 약한 증후를 나타내기도 한다. 그러나, 청년기나 성인기의 감염은 말초내에 부정형 임파구의 존재를 특징으로 하는 IM을 형성시킬 수 있다. 이러한 임파구의 대부분은 T 임파구이다; 그러나, EBV에 감염된 소수의 B 임파구도 포함된다. 또한, B 임파구의 감염은 시험관내에서 실시될 수 있다. 이 세포들이 형질 전환되어 배양액내에서 무한 증식하게 되면, "무한 증식성", "잠복 감염성", 또는 "증식 형질 전환성" 세포로 나타낸다. 공지된 바와 같이, EBV로 감염된 모든 개체는 생존 동안 잠복 감염 상태를 유지한다. 이것은 생존 동안 순환성 말초 혈액 임파구 중에서는 소수의 EBV-게놈 양성 형질전환된 B-세포가 지속적으로 존재하고, 구강 인두내에서는 바이러스가 지속적이지만 주기적으로 박리되는 것으로부터 알려졌다.

대부분의 경우에 EBV 감염은 일시적으로 무기력해질 수 있는 임파 세포 증식 질환을 일으키지만, 이것은 항상 양성이고 자기 제어적이다. 그러나, 특정 면역 억제 환자인 경우에는 악성 종양을 일으킬 수 있다. 이것은 의도적으로 면역 억제된 개체, 특히 시클로스포린 A로 처리하여 기관 이식을 받은 어린이, 또는 기회주의적으로 면역 억제된 개체, 구체적으로 HIV로 감염된 개체, 또는 유전자적으로 면역 억제된 개체, 구체적으로 XLP(x-연관 임파 증식 증후군) 유전자를 지닌 병에 걸린 남성 중에서 발생한다. 이런 경우에 있어서, 결과적으로 발병되는 악성 종양은 EBV-감염된 B 세포의 폴리클로널(polyclonal) 증식으로부터 유래한다. 또한, 이러한 환자들에서는 융모성 구강 백반의 병변부내에서 상기 바이러스의 비제어적 상피 복제가 검출가능하다. 따라서, 면역 반응은 EBV 감염의 제어에 있어서 중심 역할을 한다.

세포 또는 조직내에 EBV의 존재는 바이러스 게놈의 검출이나 EBNA-1 단백질의 발현으로 입증될 수 있는데, 이 단백질은 EBV-감염 세포내에서 보편적으로 형질 발현되는 잠복기에 연관된 유일한 단백질 산물이다.

전술한 바와 같이 EBV는 헤르페스바이러스의 일군이다. 이 EBV는 다음과 같은 구조적 성질을 갖고 있다:

- EBV 게놈은 선형의 이본쇄 DNA 분자(172,000 염기쌍)로 구성된다.

- 비리온은 이십면체 캡시드로 둘러싸인 코어(단백질과 DNA), 및 캡시드를 에워싼 막 엔벨로프로 구성된다. 이 이십면체 캡시드는 6량체 및 5량체캡소메아(capsomere)로 구성된다. 막 엔벨로프는 외측 표면위에 스파이크(spike)를 지닌 단백질/지질 이중층 막으로 이루어져 있다. 캡시드 쉘과 엔벨로프 사이의 공간은 피포(tegument)라고 명명되는 무정형 단백질로 채워져 있다.

-모든 헤르페스바이러스 처럼, EBV는 일차 감염에 이어 숙주내에서 일생동안 잠복 감염 상태를 유지할 수 있다. 이 잠복성은 숙주의 면역 시스템에 의해 조절되는, EBV와 이것의 인간 숙주 사이의 완전한 균형을 의미한다.

지금까지 대부분의 생화학적 및 생물학적 연구는 EBV의 3가지 원형 균주인 B95-8(마모세트 세포주내에서 생성되는 형질전환 바이러스), P3HR1(버키트 임파종 종양 세포주에 의해 생성되는 비형질전환 바이러스), 및 Raji(버키트 임파종 종양 세포주내의 잠복 바이러스)에 대해 수행되었다.

지난 몇 년동안 원형 바이러스 균주인 B95-8의 전체 DNA 서열이 결정되었다. 이 서열의 분석으로 80가지 이상의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 동정할 수 있게 되었다(Baer et al., 1984, Nature 310, p. 207-211).

EBV 생물학은 EBV의 생물학적 특성(잠복 감염)이 고전적인 바이러스 분석에 적합하지 않기 때문에 연구자들에게는 특별한 문제점을 제공하였다. 더욱이, EBV 세포와 숙주 범위는 일반적으로 시험관내 배양이 쉽지 않은 인간(및 소수의 고등 영장류) B-임파구 및 상피 세포에만 극히 한정된다. 또한, 바이러스가 용균적으로 복제하는 완전 허용성(fully permissive) 세포 유형이 없기 때문에 다량의 바이러스를 생성할 수 있는 능력이 심하게 제한되었다.

B95-8, P3HR1- 및 Raji- 분리물의 DNA 분자는 상세한 제한 엔도뉴클레아제지도화, 및에스케리키아 콜리(이. 콜리)플라스미드 내로의 클로닝 및 박테리오파지 람다 내로의 클로닝, 및 뉴클레오티드 서열 결정에 대한 원형으로 사용되었다.

EBV-게놈은 비반복(unique) DNA 인자 및 직렬 반복 DNA 인자를 가진 단일 이본쇄 DNA 분자 구조물로 이루어진다. 이 DNA 분자의 각 말단은 게놈의 공유 결합 및 환형화를 가능하게 하는 다중 말단 서열을 함유한다. 바이러스 입자에서 EBV-게놈은 단지 선형으로만 검출가능하다. 이와 반대로, EBV-게놈은 잠복 감염된 세포의 핵내에서는 환형 에피좀(episome)으로 존재하고, 때로 숙주 세포의 염색체내로 병입되기도 한다.

내부 반복 서열인 IR1 내지 IR4는 EBV-게놈을 5개의 비반복 영역으로 분리시킨다. U2 및 U3 영역은 여러가지 EBV 분리물마다 매우 다르며, U2 영역은 EBV의 P3HR-1 균주에서는 거의 완전히 결실되어 있다.

EBV 리딩 프레임의 명명은 바이러스 게놈내에서의 위치를 근거로 한다. 그 명칭은 발현이 시작되는 BamHI 또는 EcoRI 제한 단편의 머릿글자로 시작한다. 그 명칭의 3번째 문자는 표준 지도상에서 발현이 좌향성 또는 우향성인지에 따라 L 또는 R이다(따라서, BLLF2는 BamHI 제한 단편 L로 시작하는 제2의 좌향성 리딩 프레임이다).

EBV의 증식 사이클 중에서 바이러스 항원의 혈청학적 분류는 여러가지 형광 기법을 바탕으로 한 것이다.

고정된 잠복 감염 B-세포(예, Raji 세포)의 핵내에서 항-보체 면역형광법에 의해 특이적으로 검출된 항원을 엡스타인-바 핵 항원(EBNA)으로 분류한다.

화학적 인자 또는 바이러스 인자에 의해 바이러스 유전자의 발현이 활성화되면, 일군의 초기 항원(early antigen)(EA)이 검출되는데, 이는 그 항원의 합성이 바이러스 DNA 합성의 억제로 인해 차단되지 않기 때문이다. 사용된 고정액의 종류(메탄올 또는 아세톤)에 따라, 2가지 독특한 EA, EA_R및 EA_D가 검출가능하다. EA는 유도된 세포의 세포질 및 핵내에서 간접 면역 형광법에 의해 검출될 수 있다. 바이러스 DNA-합성이 개시된 다음(그리고 그것에 좌우되어), 바이러스의 구조 단백질(VCA)이 합성되는데, 이것은 바이러스 증식 세포(예, P₃HR₁세포)의 세포질 및 핵내에서 간접 면역 형광법에 의해 검출가능하다. 생존하는 감염 세포의 표면상에서, 바이러스 증식시 유도되는 일군의 항원(MA)은 간접 면역 형광법으로 검출될 수 있다. 또한, 이 항원들은 바이러스 엔벨로프상에서 발견될 수 있으며 바이러스 중화에 대한 중요한 표적이다.

인간의 혈청중에 존재하는 EBV-특이적인 항체의 검출은 문헌[Heule and Heule, Human Pathology, 5, 551-565, 1974]에 기술된 바와 같은 혈청학적 기법에 의해 통상적으로 실시될 수 있다.

항원 분자는 생화학적 데이타와 면역형광 데이타를 기초로 하여 5가지 상이한 군으로 구별할 수 있다. 여러가지 바이러스 폴리펩티드는 그들의 분자량으로 표기되며, 모든 EBV-단백질을 고유하게 나타내기 위한 공통적인 명명법은 아직 확립되지 않았다.

항원의 5가지 군은 다음과 같다:

A. 잠복 상태 동안 발현되는 항원 군(EBNA 및 LMP).

B. 게놈 활성화 및 바이러스 복제의 초기 유도에 원인이 되는 항원 군(IEA).

C. IEA-유전자 산물에 의해 유도되고 바이러스 DNA 복제에 요구되는 항원 군; 이 항원들은 대부분 바이러스 효소이다(EA).

D. 바이러스 입자의 구조적 성분이며, 바이러스 DNA-합성의 개시후 바이러스 복제 사이클(VCA)에서 후기에 발현되는 항원 군.

E. 감염 세포의 세포막에서 발현되는 항원 군(MA).

엡스타인-바 핵 항원(EBNA)

리딩 프레임 BKRF1에서 암호화되는 엡스타인 바 핵 항원 1(EBNA-1)은 생체내 및 생체외에서 모든 잠복 감염 세포 및 종양 관련 세포에서 보편적으로 발현되는 유일한 EBV-암호화된 단백질이며, DNA 복제 및 유전자 활성화의 기작을 연구하는데 중요한 표적 분자를 형성한다.

EBNA-1은 비교군으로서 2가지 EBV-음성의 인간 혈청과 함께 4가지 EBV-양성의 인간 혈청을 이용하여, 면역 블롯팅 및 방사선 면역 전기영동에 의해 EBV-양성 세포주에서 동정되었다. 그러나, 3가지 EBV-음성 세포주에서는 동정되지 않았다. 동정된 항원은 분석된 여러가지 세포주에서 65,000 내지 73,000 범위의 상이한 분자량을 갖고 있었다. 보체-고정 항원은 200배 이상 부분적으로 정제되었고, 면역 블롯팅에 의해 동정된 65kDa의 EBNA와 동시 정제되는 것으로 밝혀졌다. EBNA는 항-보체 면역 형광법(ACIF)에 의해 동정되는 바, 이것은 65kDa 항원이 EBNA의 주성분임을 암시하는 것이다.

EBNA 유전자는 마우스 세포를 EBV DNA의 클로닝된 BamHI K 제한 효소 단편으로 형질 감염시켜 지도화하였다. 이 단편과 함께 우성의 선택가능 마커로 마우스 섬유아세포 세포주를 형질 감염시킨 결과, EBNA-음성의 인간 혈청이 아닌 EBNA-양성의 인간 혈청에 의해 ACIF에서 동정되는 핵 항원을 안정하게 발현시킬 수 있었다. 또한, 후속 연구를 통해 BamK-형질 감염된 세포가 B95-8 세포의 EBNA-1 폴리펩티드와 함께 동시 이동되는 78kDa의 폴리펩티드를 발현한다는 것이 밝혀졌다.

보다 최근의 연구에서는 p62 또는 p107로 일반적으로 나타내는 글리신-알라닌 반복 영역내에 인간 혈청과 강력하게 반응하는 면역우성 영역이 존재함을 밝힌 바 있다. 그러나, gly-ala 단편은 정상적인 인간 단백질내에도 포함되어 있는 것으로 나타났고, 자가 항체의 표적인 것으로 밝혀진다. 또한, 추가 연구를 통해, 활성 CMV, HSV 또는 톡소플라스마(Toxoplasma) 감염 환자에게서 채취한 혈청중에 존재하는 IgM 항체가 특히 때로 상기 펩티드와 교차 반응성을 나타낸다는 것을 발견했다. 더욱이,이. 콜리내에서 발현되는 EBNA-1의 AA 461-641을 암호화하는 28kD의 C-말단 단편은 인간 혈청 항체와 반응성이 있는 것으로 밝혀졌다. 진단에 있어서 본래의 EBNA-1 단백질을 대체하는데 사용될 수 있는 EBNA-1 단백질의 단편을 분리해 낸 연구는 지금까지 개시된 연구들 중에서는 없었다.

개개의 바이러스 균주 중에서 gly-ala 반복 영역의 크기가 상당한 변이를 나타낼 수 있기 때문에, EBNA-1의 분자 크기도 균주 동정(EBNO 타이핑; typing)에 사용될 수 있다.

EBNA-1은 버키트 임파종 세포, 비인두암 세포 및 호지킨 질환에서 발견된바있는 리드-스턴버그 세포에서 면역학적으로 검출되었다.

또한, EBNA는 이식조직 및 AIDS 환자 중의 폴리클로널 임파 세포-증식성 병변부 내에서 검출된 바 있으며, 세포 배양물 중에서 B-임파구를 동정하는데 사용된 최초의 마커이다.

EBNA-1 분자상에서는 여러가지 작용성 도메인, 예를 들면, DNA-결합(Ori-P) 도메인, 핵 정위(localization) 도메인, 트란스활성화 도메인, DNA-루핑 도메인 및 이량체화 도메인이 동정되었다. EBNA-1은 동종 이량체 분자로서 DNA-결합 작용을 한다.

현재, EBV 특이적인 혈청진단은 다소 주관적인 면역형광 시험법에 의해 실시된다. 또한, 이 바이러스 항원의 대량 생산 및 정제는 표준 바이러스 생산 세포주를 사용함으로써 실행 가능하지 않기 때문에, 보다 간단하고 일정한 진단법(예, ELISA)의 개발도 방해된다.

이것을 성취할 수 있는 유일한 방법은 다른 방법으로 제조된 EBV 항원(들)을 이용하는 것이다. 이 EBV 항원들은 유전공학 기법이나 합성 펩티드 기법으로 제조할 수 있다.

다양한 EBV 감염 단계에 대하여 믿을만한 진단법으로서 특이적이고 민감한 방법의 개발을 위해서는, 면역우성 바이러스 단백질 및 이것의 에피토프를 동정하는 것이 매우 중요하다.

본 발명은 서열 번호 1에 기재한 아미노산 서열을 적어도 일부분 함유하며, 엡스타인-바 바이러스에 대한 항체와 면역화학적으로 반응성이 있는 펩티드를 제공한다.

따라서, 서열 번호 1에 기재한 아미노산 서열과 이것의 단편을 갖는 펩티드도 본 발명의 일부분이다.

본 발명에 의한 펩티드는 시료 중에서 EBV 또는 EBV 항체의 존재를 측정하기 위한 진단 방법에 사용하기에 특히 적합한 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 본 발명에 따른 펩티드는 EBV-관련 질환의 치료에 적합한 약학적 투여 형태로 사용될 수 있다. 이와 같이 얻어지는, 활성성분으로서 펩티드 또는 이것의 단편을 함유하는 백신의 제조는 당업자에게 공지되어 있다.

천연의 EBV와는 반대로, 본 발명의 펩티드는 이것이 안전한 비감염성 기원을 갖는다는 점에서 큰 장점을 갖고 있다.

또한, 본 발명은 엡스타인-바 바이러스에 대한 항체와 면역화학적으로 반응성이 있는 상기 펩티드의 단편을 포함한다.

EBNA-1의 상기 펩티드 영역의 특이적인 특징은 EBNA-1 단백질의 천연 구조 및 변성 구조 모두에서 항체에 접근가능하게 한다는 것이다.

본원 명세서에서 사용되는 "펩티드"란 용어는 생물학적 활성을 지닌 아미노산의 분자쇄를 의미하는 것이며, 특정 길이의 생성물을 의미하는 것이 아니다. 따라서, 단백질, 융합 단백질 또는 융합 펩티드, 올리고펩티드 및 폴리펩티드도 포함된다. 본 발명의 바람직한 펩티드는 생체내에서 또는 시험관 내에서 예를 들면 글리코실화, 아미드화, 카르복실화 또는 포스포릴화에 의해 수식될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 펩티드의 산 부가염, 아미드, 에스테르 및 특이적으로 C-말단 에스테르 및 N-아실 유도체와 같은 작용성 변이체 역시 본 발명의 일부분인 것으로 간주된다. 본원에 포함되는 특정 단백질 또는 폴리펩티드에 있어서, 천연의 변이체가 또한 존재할 수 있다는 것은 자명한 것이다. 이러한 변이체는 총 서열중의 아미노산 차이(들)에 의해, 또는 상기 서열 중의 아미노산(들)의 결실, 치환, 삽입, 역위 또는 첨가에 의해 나타날 수 있다. 또한, 생물학적 활성 및 면역학적 활성을 본질적으로 변화시키지 않는 것으로 추정되는 아미노산 치환에 대해서는 개시되어 있다. 즉, 연관된 아미노산 간의 아미노산 치환, 또는 진화중에 자주 발생하는 치환은 특히 Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val 간에 일어날 수 있다(Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, Vol. 5, suppl, 3 참조). 이러한 정보를 바탕으로 하여 립만(Lipman)과 피어슨(Pearson)은 빠르고 민감한 단백질 비교(Science 227, 1435-1441, 1985) 그리고 상동성 단백질간의 기능 유사성을 결정하는 방법을 개발하였다.

본원에 사용된 "단편"이란 용어는 본 발명의 펩티드의 아서열(subsequence)을 포함하는 아미노산 서열을 의미한다. 이 단편은 EBNA-1 단백질 중 1개 이상의 면역원성 결정인자(immunogenic determinant)를 갖는 펩티드이다. 특히, 단편은 DNA의 제한 엔도뉴클레아제 및 폴리펩티드의 프로테아제를 사용하여 전구체 분자를 효소 절단시켜 얻을 수 있다. 다른 방법으로는 단편의 화학적 합성이나, 또는 DNA 단편을 통한 펩티드 단편의 발현을 포함한다.

에피토프(들)를 함유하는 본 발명에 의한 펩티드의 적합한 면역원성 단편은소위 펩스캔(pepscan) 법을 기초로 한 특허 출원 공개 번호 WO 86/06487, 문헌[Geysen, H. M. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3998-4002, 1984; Geysen, H. M. et al., J. Immunol. Meth. 102, 259-274, 1987]에 기술된 방법에 따라 밝힐 수 있으며, 이 방법에서는 시험 중에 있는 완전한 폴리펩티드의 부분 서열에 상응하는 일련의 부분 중첩성 펩티드들을 합성하고, 이 펩티드들과 항체와의 반응성을 조사한다.

또한, 펩티드의 많은 영역들은 이론적 고찰의 예상값이 제한적일지라도, 이론적인 고찰을 바탕으로 하여 에피토프를 표시할 수 있다. 이런 영역들의 결정은 홉 및 우즈(Hopp and Woods, Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 3824-3828, 1981)에 의한 친수성(hydrophilicity) 기준과, 츄 및 파스만(Chou and Fasman, Advances in Enzymology 47, 45-148, 1987)에 의한 2차 구조 측면의 조합을 바탕으로 한다.

본 발명의 바람직한 펩티드는 서열 번호 2 내지 6에 기술된 바와 같은 서열을 하나 이상 함유하는 펩티드이다.

서열 번호 2 내지 4에 기재한 서열을 갖는 펩티드는 서열 번호 1에 기재한 아미노산 서열을 갖는 펩티드의 단편이며, 각각 EBNA-1 서열의 아미노산 번호 268 내지 391, 395 내지 425, 및 419 내지 449에 상응한다. 서열 번호 5에 기재한 아미노산 서열을 갖는 펩티드는 서열 번호 1의 서열중 단편들(서열 번호 2 내지 4)의 복합체를 함유하는 펩티드이다.

본 발명에 따른 펩티드 또는 그 단편의 제조는 펩티드 합성에 관한 공지된 유기 화학적 방법중 1가지 방법 또는 재조합 DNA 기법으로 수행된다.

펩티드 합성의 유기 화학적 방법들은 균질 상 중에서, 또는 소위 고체 상을 이용하여 축합 반응을 실시함으로써 필요한 아미노산을 커플링하는 것을 포함한다.

축합 반응은 다음과 같이 실시할 수 있다:

a) 축합제의 존재하에서, 유리 카르복실기와 보호된 다른 반응기를 지닌 화합물(아미노산, 펩티드)을, 유리 아미노기와 보호된 다른 반응기를 지닌 화합물(아미노산, 펩티드)과 축합시키는 반응;

b) 활성화된 카르복실기와 유리 또는 보호된 다른 반응기를 지닌 화합물(아미노산, 펩티드)을, 유리 아미노기와 유리 또는 보호된 다른 반응기를 지닌 화합물(아미노산, 펩티드)과 축합시키는 반응.

특히 카르복실기를 산 할로겐화물, 산 아지드화물, 산 무수물, 산 이미다졸화물, 또는 활성화된 에스테르, 예컨대 N-히드록시-숙신이미드, N-히드록시-벤조트리아졸 또는 p-니트로페닐 에스테르로 전환시킴으로써, 카르복실기의 활성화를 실시할 수 있다.

상기 축합 반응에 있어서 가장 흔한 방법은 카르보디이미드 법, 아지드 법, 혼합 무수물 법 및 활성화된 에스테르를 사용하는 방법이고, 이 방법들은 문헌[The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology Vol. 1-3(Ed. Cross, E. and Meienhofer, J.) 1979, 1980, 1981 (Academic Press, Inc.)] 등에 기술되어 있다.

"고체 상"을 사용하여 본 발명에 따른 전술한 펩티드의 적합한 단편을 제조하는 방법은, 예컨대, 문헌[J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149(1963) and Int. J. Peptide Protein Res. 35, 161-214(1990)]에 기술되어 있다. 제조할 펩티드를 구성하는 아미노산의 커플링은 일반적으로 카르복실 말단측에서부터 시작한다. 이 방법에서는 고체상이 필요하며, 여기에 반응기가 존재하거나, 또는 반응기가 도입될 수 있다. 예를 들면, 반응성 클로로메틸기를 지닌 디비닐벤젠과 벤젠의 공중합체이거나, 또는 히드록시메틸이나 아민기와 반응할 수 있는 중합체 고체 상일 수 있다.

특히 적합한 고체 상은, 예컨대 p-알콕시벤질 알콜 수지 (4-히드록시-메틸-페녹시-메틸-코폴리스티렌-1% 디비닐벤젠 수지)이며, 문헌[Wang(1974), J. Am. Chem. Soc. 95, 1328]에 기술되어 있다. 합성후, 펩티드는 온화한(mild) 조건하에서 상기 고체 상으로부터 분리될 수 있다.

목적한 아미노산 서열의 합성후, 수지로부터 펩티드의 분리는, 예컨대 트리플루오로아세트산 중에 용해된 메탄술폰산이나 트리플루오로메탄술폰산으로 처리하여 수행한다. 또한, 저급 알콜, 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 사용하여 에스테르 교환 반응시킴으로써 펩티드를 운반체(carrier)로부터 분리시킬 수 있는데, 이 경우에는 상기 펩티드의 저급 알킬 에스테르가 직접 형성된다. 이와 유사하게, 암모니아를 사용하여 분리시킨 경우에는 본 발명에 따른 펩티드의 아미드가 얻어진다.

축합 반응에 관여하지 않는 반응기는 산 염기 또는 환원을 이용하는 가수분해에 의해 매우 용이하게 다시 제거될 수 있는 기들로 보호되는 것이 효과적이다. 따라서, 카르복실기는, 예컨대 메탄올, 에탄올, 3차 부탄올, 벤질 알콜 또는 p-니트로벤질 알콜과 고체 상 지지체에 결합된 아민과의 에스테르화에 의해 효과적으로 보호될 수 있다.

아미노기를 효과적으로 보호할 수 있는 기는 에톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐, t-부톡시-카르보닐(t-boc) 또는 p-메톡시-벤질옥시카르보닐 기, 또는 술폰산으로 부터 유도된 산기, 예컨대 벤젠-술포닐 기 또는 p-톨루엔-술포닐기이며, 또한 다른 기들도 사용될 수 있는데, 그 예로는 벤질 및 트리페닐메틸과 같은 치환 또는 비치환 아릴 또는 아르알킬기, 또는 오르토-니트로페닐-술페닐 및 2-벤조일-1-메틸-비닐과 같은 기를 들 수 있다. 특히, 적합한 α-아미노-보호기는 예컨대 염기 민감성 9-플루오레닐-메톡시카르보닐(Fmoc)기이다[Carpino & Han (1970) J. Amer. Chem. Soc. 92, 5748].

가능한 보호기에 대한 보다 상세한 설명은 문헌[The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1-9(Eds. Gross, Udenfriend and Meienhofer)1979-1987(Academic Press, Inc.)]에서 발견될 수 있다.

또한, 리신의 ε-아미노기를 보호하는 것은 필수적이며 아르기닌의 구아니딘기도 보호하는 것이 적당하다. 이와 관련이 있는 통상적인 보호기는 리신에 대해서는 Boc기이고, 아르기닌에 대해서는 Pmc기, Pms기, Mbs기 또는 Mtr기이다.

보호기는 특정기의 성질에 따라 통상적인 각종 방법으로 분리할 수 있는데, 예를 들면, 트리플루오로아세트산을 보조로 사용하거나, 또는 온화한 환원, 예를 들면, 수소 및 팔라듐과 같은 촉매를 사용하거나, 또는 빙초산중의 HBr을 사용하여 분리할 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 펩티드는 재조합 DNA 기법을 보조로 사용하여 제조할 수 있다. 이러한 사용 가능성은 (i) 상기 펩티드가 반복 서열("직렬로")로병입되는 경우, 또는 (ii) 상기 펩티드가 (보다 큰) 단백질이나 폴리펩티드의 한 성분으로서 제조되거나, 또는 예를 들면, β-갈락토시다제(이것의 일부분)와의 융합 단백질로서 제조될 수 있는 경우 특히 중요하다. 따라서, 이런 종류의 펩티드 역시 본 발명의 영역에 속한다. 이런 목적을 위해, 재조합 DNA의 한 성분으로서 사용되는 핵산 서열은 본 발명에 따른 펩티드를 암호화하고, 더욱이 천연에 존재하는 EBV 게놈내에서 전술한 핵산 서열의 측면에 위치한 핵산 단편이 거의 없는 핵산 서열이다.

전술한 방법(ii)는, 숙주로서 적합한 미생물 중에서 목적하는 1종 이상의 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 지닌 재조합 폴리뉴클레오티드를 발현시킴으로써 목적하는 펩티드를 제조하는 것을 포함한다.

본 발명에 따른 펩티드를 암호화하는 핵산 서열은, 천연 상태에서는 결합되거나 연관되어 있지 않지만 복제에 영향을 미치는 각종 DNA 서열에 결합하여, 적합한 숙주의 형질 전환에 사용될 수 있는 소위 재조합 벡터 분자를 제공할 수 있다. 유용한 재조합 벡터 분자는, 예를 들면 플라스미드, 박테리오파아지, 코스미드 또는 바이러스로부터 유래되는 것이 바람직하다.

핵산 서열을 클로닝하는데 사용될 수 있는 특이적인 벡터 또는 클로닝 매개체(vehicle)는 당업계에 공지되어 있고, 특히 pBR322, 다양한 pUC, pGEM 및 블루스크립트(Bluescript) 플라스미드와 같은 플라스미드 벡터; kgt-Wes, Charon 28 및 M13 유래의 파아지와 같은 박테리오파아지; 또는 SV4O, 아데노바이러스 또는 폴리오마 바이러스와 같은 바이러스 벡터를 포함한다(Rodriquez, R.L. and D.T.Denhardt, ed., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths, 1988; Lenstra, J. A. et al., Arch. Virol 110, 1-24, 1990). 재조합 벡터 분자의 작제에 사용되는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 특히 문헌[Maniatis, T. et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, second edition; Cold Spring Harbor Laboratory, 1989]에 기술되어 있다.

예를 들면, 본 발명에 따른 펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 클로닝 벡터내로 삽입하는 것은 유전자와 목적하는 클로닝 매개체를 동일한 제한 효소(들)로 절단하여 상보적인 DNA 말단을 형성시킴으로써 쉽게 수행할 수 있다.

재조합 벡터 분자는 부가적으로 목적하는 형질 전환체를 선택하는데 사용될 수 있는 하나 이상의 마커 활성을 포함할 수 있으며, 그 예로는 pBR322내의 암피실린 및 테트라사이클린 내성, pUC8내의 β-갈락토시다제의 α-펩티드 및 암피실린 내성을 들 수 있다.

물론, 형질 전환된 숙주가 적어도 하나 또는 그 이상의 면역원성 결정인자를 갖는 폴리펩티드를 생성하기만 한다면, 클로닝 벡터의 소정의 부위에 삽입된 뉴클레오티드 서열이 본 발명의 펩티드를 암호화하는 완전한 핵산 서열의 한 단편만을 포함할 수 있다는 것은 당연한 것이다.

본 발명의 펩티드에 대해 지향성인 항체 역시 본 발명의 일부분이다.

전술한 바와 같이 제조된 펩티드 또는 이것의 단편은 폴리클로널 및 모노클로널 항체를 생성하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 펩티드에 대해 지향성인 모노클로널 항체는 당업자에 의해 쉽게 생성될 수 있다.

본 발명보다 이전에 EBNA-1의 상기 특이적인 펩티드 단편에 대하여 생성되는 항체가 보고된 적이 없다. 지금까지 당업자들에게는 항체 결합에 대한 에피토프의 유용성이 알려진 바 없다.

따라서, 본 발명에 따른 모노클로널 항체는 EBV 감염을 진단하기 위한 새로운 수단을 제공한다.

본 발명에 따른 바람직한 항체는 영국 포르톤 다운에 소재하는 유럽 동물 세포 배양물 수집소(ECACC)에 기탁 번호 제92071613호로서 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 모노클로널 항체로서 EBNA-1과 동일한 반응성을 갖는 모노클로널 항체이다.

EBNA.OT1x로서 표기되는 본 발명에 따른 신규 (모노클로널) 항체는 Gly-Ala 반복 영역이 결실된 바큘로바이러스 유래의 EBNA-1 단백질로 마우스를 면역화시켜 얻었다.이. 콜리에서 발현시킨 EBNA-1 유래의 결실 단편의 경우에, EBNA.OT1x의 결합 에피토프는 추정되는 핵 정위 시그널(서열 번호 6에 기술된 바와 같은 서열)에 가까운 위치 430-438내에 위치하였다. 또한, EBNA.OT1x는 면역침전 연구에서 사용되었다. EBNA.OT1x는 또한 간접 검출 기법을 사용하는 고정된 투과 세포(fixed permeabilized cells)(FACS)상에 있어서의 면역 형광법 및 웨스턴 블롯 연구에 사용된 것과 같은 변성된 EBNA-1에 결합하고, 다양한 바이러스 균주 및 바이러스 감염된 표적 세포로부터의 EBNA-1과 반응한다. EBNA.OT1x는 다수의 EBV-분리물로부터의 EBNA-1에 결합하고, 다양한 인체 종양 조직에 있어서의 면역조직 화학적 염색에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 모노클로널 항체를 분비할 수 있는 무한증식성 세포주(immortalized cell line)도 본 발명의 일부분이다.

모노클로널 항체를 생성하는 세포주의 제조는 예를 들면, 켈러와 밀스타인 기법[켈러와 밀스타인에 의해 고안된 모노클로널 항체-생산 하이브리도마를 형성시키는 기법(G. Kholer and C. Milstein, 1975, Nature 256:495-497; 1976, Eur. J. Immunol 6: 511-519)], 엡스타인-바 바이러스로의 형질 전환, 또는 종양원성 DNA에 의한 B 임파구의 직접적인 형질전환 기법, 또는 인간 또는 마우스-인간 하이브리드 골수종 세포주인 융합 파트너와 인간 B-임파구의 직접적인 융합법, 또는 상기 골수종 세포주와 EBV-형질전환된 B 세포주의 직접적인 융합법에 의해 수행될 수 있다.

본 발명의 바람직한 세포주는 영국 포르톤 다운에 소재하는 유럽 동물 세포 배양물 수집소(ECACC)에 기탁번호 제92071613호로서 기탁된 세포주이다.

이 하이브리도마 세포주는 본 발명의 EBNA-1 펩티드(서열 번호 5에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 펩티드)로 사전에 접종된 마우스로부터 유래되는 임파구와 골수종 세포를 융합시킴으로써 생성되었다.

또한, 본 발명은 시험액이나 조직 표본내에 존재하는 총 길이의 단백질을 검출하기 위한 면역학적 방법 및 생화학적 방법에 상기 펩티드에 대한 항체를 사용하는 것을 포함한다.

지금까지 EBV 감염세포내에 존재하는 EBNA-1의 검출은 항 EBNA-1 항체원으로서 인간 혈청을 이용하여 항-보체 면역형광(ACIF) 기법을 사용함으로써 실시되었다. 간접 면역형광 기법으로는 인간 헐청내의 EBNA-1 결합 항체를 검출하지 못했다. ACIF는 과잉의 보체-배양 단계 및 보체 그 자체의 불안정성을 내포하고 있다. 또한, ACIF에 사용된 시약이 적절하게 사용되지 않는 경우 허위-양성 및 허위-음성 반응이 자주 발생한다.

한편 EBNA.OT1x 항체는 이러한 문제점을 제거하며, 간접 면역형광법에 의해 다양한 EBV-감염 세포내의 EBNA-1을 민감하게 검출할 수 있도록 한다.

세포핵내에 EBNA-1의 존재는 생체내 및 생체외에 있어서의 세포내 잠복 EBV-감염의 특징이다.

EBNA.OT1x는 세포내로 침투하여, EBV-감염 세포내에서 EBNA-1을 세포내에서 검출할 수 있다: 이 EBV.OT1x 항체는 문헌[Slaper-Cortenbach et al., Blood, 72, 1639-1644, 1988]에 기술된 바와 같이 완충된 포르말린-아세톤(BFA) 고정액으로 투과성화된 EBV-감염 세포에서 핵 염색의 형광 활성화 세포 분류기(FACS) 분석에 적용될 수 있다. 이 방법은 간단하고 빠르다는 장점이 있으며, 시험관 내에서 배양된 EBV-감염된 B-임파구의 검출을 가능하게 한다. 또한, 이 기법은 EBV-관련 임파 세포 증식 질환 및 임파종을 검출하고 모니터하는데 적용될 수 있다.

본 발명의 펩티드에 대하여 지향성인 모노클로널 항체 및 폴리클로널 항체는 조직 표본을 그 자리에서 검출하는 면역 세포 화학 및 진단법에 매우 적합하며, 중화 항체들은 수동 면역요법에 매우 유용하다.

본 발명의 항체는 여러가지 EBV 분리물의 EBNO-타이핑에도 사용될 수 있다. 전술한 바와 같이, EBV 분리물(균주)은 생성되는 EBNA-1 분자의 분자량이 특징적인데, 이것은 상기 단백질내에 글리신-알라닌 반복 영역의 길이가 매우 가변적이기때문이다. 주로 인간의 혈청인 전술한 시약과는 달리, EBNA.OT1x 모노클로널 항체는 EBV과(科) 중에서 매우 보존적이며 EBV 균주의 EBNO-타이핑에 매우 적합한 결합 에피토프를 검출할 수 있는 안정하고 재현성있는 시약이다.

또한, 목적하는 모노클로널 항체를 "인체화"(humanizing)하는 것도 본 발명의 일부분이다. "인체화된" 모노클로널 항체를 유발시키는 기법은 당업계에 공지되어 있다.

특히, 모노클로널 항체는 항-유전인자형(anti-idiotype) 항체를 유발시키는데 사용될 수 있다. 항-유전인자형 항체를 유발시키는 기법은 당업계에 공지되어 있다

전술한 바와 같이 본 발명의 모노클로널 항체와 반응성이 있는 항-유전인자형 항체도 본 발명의 일부분이다.

항-유전인자형 항체는 면역글로불린의 가변부에 대해 지향성인 항체이다. 항-유전인자형 항체의 아군(sub-population)은 "항-유전인자형 β" 또는 "내부 영상"(internal images)이라고 한다. 이 항-유전인자형 β 항체는 항원과 구조적 또는 3차원적 유사성을 갖고 있다(Uytdehaag, F. G. C. M. et al. Immunol Rev. 90; 93-113;1986). 이런 종류의 항-유전인자형 항체는 동물 모델에서 감염질환에 대한 백신으로서 널리 사용된다(Hiernaux J. R. ; Infect. Immun. ; 56; 1407-1413; 1988, Kennedy, R. C. et al.; Science 232, 220-223; 1986). 항-유전인자형 항체는 분석에 사용하기 위해 다량으로 생성시킬 수 있다.

항-유전인자형 항체를 생성시키기 위한 기법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들면, 문헌에 기술된 표준 절차에 따라 글루타르알데히드에 의하여 KLH에 커플링되고 프로인트 완전 보조액에 혼합된 모노클로널 항체로 BALB/c 마우스를 면역화시킴으로써 본 발명의 항-유전인자형 항체를 얻을 수 있다. 이 마우스의 비장 세포를 무한 증식화하여, 얻어지는 하이브리도마를 항-유전인자형 항체 생성에 대하여 선별할 수 있다. 하이브리도마의 선별은, 예를 들면 본 발명의 모노클로널 항체를 고체 상(마이크로타이터 플레이트의 웰)에 결합시키고, 그 고체 상을 증식성 하이브리도마의 배양 상청액과 함께 항온 배양시킴으로써 실시할 수 있다. 그 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)에 커플링된 EBV 펩티드를 첨가할 수 있다. 그 다음 배양 상청액내 항-유전인자형 항체의 존재는 고체상에 도포된 모노클로널 항체에 대한 상기 펩티드 접합체의 결합 억제를 통해 확인한다.

항-유전인자형 항체는, 예를 들면 EBV-항체를 사용하는 면역 분석법에서 인간 및/또는 동물의 EBV-항원의 결합을 억제시키는데 사용될 수 있다. 또한, 항-유전인자형 항체는 후술되는 면역화학 시약의 유사제(mimicking agent)로서 사용될 수 있다.

또한, 상기 항-유전인자형 항체는 EBV의 진단 및 치료에 유용할 뿐만 아니라, EBV-항원의 중요한 에피토프 영역을 규명하는데 유용하다.

본 발명의 1종 이상의 펩티드 또는 항체를 함유하는 면역화학 시약도 또한 본 발명의 일부분이다.

본 발명의 "면역화학 시약"이란 용어는 일반적으로 본 발명의 1종 이상의 펩티드 및 적합한 지지체 또는 표지(label) 물질로 구성된다.

사용될 수 있는 지지체의 예로는 마이크로테스트 웰이나 큐베트의 내벽, 튜브 또는 모세관, 막, 여과지, 시험 스트립, 또는 라텍스 입자, 적혈구, 염료 솔(sol), 금속 솔 또는 솔 입자로서의 금속 화합물과 같은 입자의 표면, BSA 또는 KLH와 같은 운반체(carrier) 단백질을 들 수 있다.

사용될 수 있는 표지 물질은, 특히 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소, 염료 솔, 금속 솔 또는 솔 입자로서의 금속 화합물이다.

시료내의 EBV에 대해 지향성인 항체를 검출하기 위한 방법으로서, 본 발명의 면역화학 시약을 시료와 접촉시킨다. 그 후, 시료내의 항체와 펩티드간에 형성된 면역 복합체의 존재를 검출하고, 이 검출에 의해 시료내의 EBV 항체의 존재를 알 수 있으며, 이를 정량적으로 측정할 수 있다.

면역화학 시약의 성질 및 추가 특징에 따라, 발생하는 면역화학 반응은 소위 샌드위치 반응, 응집 반응, 경쟁 반응 또는 저해 반응이다.

시료내의 EBV를 검출하기 위해, 본 발명의 1종 이상의 펩티드를 함유하는 본 발명에 따른 면역화학 시약을 시료와 항-EBV에 접촉시키고, 그 후 형성된 면역 복합체의 존재를 검출하고, 이로부터 시료내의 EBV 존재를 결정할 수 있다.

시료내의 EBV를 검출하기에 특히 적합한 방법은 표지 물질을 가진 본 발명의 펩티드와 EBV 항원(시료내에 존재)간의 경쟁 반응에 기초한 것이며, 이로 인해 펩티드와 항원은 고체 지지체에 부착된 EBV에 대하여 지향성인 항체와 경쟁한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 항체를 시료와 접촉시키고, 그 후 형성된 면역 복합체의 존재를 시료내의 엡스타인-바 바이러스 존재에 대한 척도로서 검출하는것을 특징으로 하는 시료내의 엡스타인-바 바이러스를 검출하는 방법을 포함한다.

본 발명의 시험 킷트는 필수 성분으로서 전술한 바와 같은 면역화학 시약을 포함한다. EBV 항체를 검출하기 위해 샌드위치 반응을 실행하는 경우, 시험 킷트는 예를 들면 마이크로테스트 웰의 내벽과 같은 고체 지지체에 피복된 본 발명의 펩티드 및 본 발명의 표지화된 펩티드 또는 표지화된 항-항체를 포함할 수 있다.

경쟁 반응을 실행하는 경우, 시험 킷트는 고체 지지체에 도포된 본 발명의 펩티드, 및 EBV에 대하여 지향성인 표지 항체, 바람직하게는 상기 펩티드에 대해 지향성인 모노클로널 항체를 포함할 수 있다.

응집 반응시에는, 시험 킷트는 입자 또는 솔에 도포된 본 발명의 펩티드를 함유할 수 있는 면역화학 시약을 포함한다.

시험 킷트의 또 다른 구체예는, 예컨대 고체 지지체에 도포되어 있는 EBV에 대하여 지향성인 항체상의 결합 부위에 대해 검출되는 EBV 항원과의 경쟁 반응에서, 면역화학 시약으로서 본 발명의 표지화된 펩티드를 사용하는 것이다.

제1도는 인간 혈청을 가지고 펩스캔(PEPSCAN) 분석한 결과를 나타낸 것이다. X 축은 EBNA-1 서열 상에 존재하는 각각의 12-mer 펩티드의 상대적인 출발 위치를 나타내며, "O"은 AA348 등에서 출발하는 12-mer 펩티드를 나타낸 것이다. Y 축은 450nm에서의 상대적인 흡광도 유니트를 나타낸 것이다.

라인 1은 각각의 12-mer 펩티드들에 대한 EBV 음성인 인간 혈청의 면역 반응성을 나타낸 것이다.

라인 2 내지 6은 12-mer 펩티드 들에 대한 EBV 양성인 인간 혈청의 면역 반응성을 나타낸 것이다.

제2도는 EBNA-1 단백질로부터 유래되는 소정의 합성 펩티드들에 대한 IgG-반응성에 대해 시힘된 46가지 인간 혈청 시료의 ELISA 반응성(450nm에서의 광학 밀도)을 나타낸 것이다.

△ 는 표준 혈청학적 분석시에 음성인 혈청을 나타내고,

□은 표준 혈청학적 분석시에 양성인 혈청을 나타내고,

× 는 단지 EBNA-1에 대한 면역블롯시에 양성인 혈청을 나타낸다.

,^*은 면역블롯으로 검출가능한 항 EBNA-1 항체는 없으나, 다른 (즉, 항-VCA) EBV-혈청 반응 양성인 혈청을 나타낸다.

A = 펩티드 348-369

B = 펩티드 368-387

C = 펩티드 394-420

D = 펩티드 424-452

E = 펩티드 Gly-Ala

F = 콤비-펩티드

G = EBNA-1 바큘로

제3도는 마우스 모노클로널 항체 및 토끼 혈청을 사용하여 펩스캔(PEPSCAN) 분석한 결과를 나타낸 것이다. X 축은 EBNA-1 서열상에 존재하는 각각의 12-mer 펩티드의 상대적인 출발 위치를 나타내며, "0"은 AA 348 등에서 출발하는 12-mer 펩티드를 나타낸 것이다. Y축은 450nm에서의 상대적인 흡광도 유니트를 나타낸다.

라인 1은 음성 대조군으로서 사용된 EBNA-1 유래의 펩티드에 대한 항 EBV VCA p40 모노클로널(EBV.OT41A)의 반응성을 나타낸다.

라인 2 내지 4는 여러가지 농도(각각 5㎍/ml, 10ng/ml 및 1ng/ml)에서의 항 EBNA-1 마우스 모노클로널 항체 EBNA.OT1x의 반응성을 나타낸다.

라인 5는 비면역화된 토끼 혈청의 반응성을 나타낸다.

라인 6은 재조합 EBNA-1로 면역화된 토끼 혈청의 반응성을 나타낸다.

제4도는 EBNA.OT1x 모노클로널 항체를 사용하여 EBV-감염 세포 중에 존재하는 EBNA-1을 검출하기 위한 간접 면역형광법을 나타낸 것이다. A : EBV로 잠복 감염된 X50-7 세포, B : EBV 음성 BJAB 세포와 1:1 혼합되어 EBV 발현이 유도된 HH514.c16 세포.

제5도는 다양한 임파구양 세포 및 세포주 중에 존재하는 핵내 EBNA-1 염색의 FACS 분석을 나타낸 것이다:

A: EBV 음성 주르카트(Jurkat) 세포의 분석,

B: EBV 양성 인체 버키트(Burkitt) 임파종 세포(Daudi)의 분석,

C: EBV 혈청 반응 음성인 공급체(donor)로부터 채취한 말초 혈액 임파구의 분석,

D: 폴리클로널 EBV 형질전환된 인체 B 임파구의 분석,

E 및 F : 확립된 클로닝된 B-세포(EBV-양성)의 분석.

Y 축은 계수된 세포의 수를 나타내고, X 축은 세포당 형광 농도를 나타낸다.

각 그래프중의 점선은 대조군 항체(항 HIV-p24)를 나타낸다.

제6도:

A: 여러가지 EBV 균주를 모노클로널 항체 EBNA.OT1x로 EBNO 타이핑한 결과를 나타낸 것이다.

B: 여러가지 EBV 균주를 인간 혈청으로 EBNO 타이핑한 결과를 나타낸 것이다.

1 = BJAB

2 = CR+B95.8

3 = CR+QIMR-WIL

4 = PB-LCL

5 = CR+BL72

6 = CR+Mwika

7 = CR+AG876

8 = CR+Ambobi

9 = CR+WW1

10 = CR+WW2

본 발명은 하기 실시예로 추가 예시된다:

실시예 1:

펩스캔에 의한 면역 반응성 도메인들의 정위(localization)

아미노산(AA) 길이가 12개이고, 위치 348-470, ORF-BKRF₁의 AA 서열의 11개 AA 중복부를 갖는 펩티드를 문헌[Geijsen et al. P.N.A,S., USA. 83, 3998-4002, 1984]에 처음 기재된 바와 같이 화학적으로 활성화된 폴리에틸렌 핀위에 자동 고체상 펩티드 합성법에 의해 합성했다.

EBV-특이적인 항체의 면역반응성은 문헌[Middeldorp and Meloen, J. Virol, Meth. 21, 147-159, 1988]에 기재된 바와 같이 측정했다. 6명 개개의 인체 혈청에 대한 상기 펩스캔 분석의 결과는 제1도에 나타냈다.

이 도면으로부티, 반응성 영역이 각각 EBNA-1 서열상에서 AA 20-31, 43-65, 74-85 및 90-98에서 시작하는 12-mer 펩티드로 AA 372-381, 391-413, 422-433 및 438-446을 나타낸다는 것을 알 수 있다. 이와 유사한 반응성은 다른 인간 혈청군에서도 발견되였다. 제1도에 라인 1로서 나타낸 바와 같이, EBV-혈청 반응 음성 혈청을 사용하는 경우 현저한 반응성은 관찰되지 않았다.

실시예 2:

면역 반응성이 있는 합성 펩티드의 선별

컴퓨터 분석 및 펩스캔에 의해 BKRF₁-암호화 EBNA-1 단백질로부터 유래되는 합성 펩티드의 선별, 및 정상 인간 공급자 혈청과 이들 펩티드의 면역 반응성의 분석에 대하여 하기 요약한다.

합성 펩티드는 t-BOC 화학을 사용하여 표준 고체상 합성법으로 제조했다. BKRF₁-암호화 EBNA-1 단백질의 AA 348-470 단편으로부터의 펩티드는 제임슨 및울프(CABIOS 4, 181-186, 1988)에 의해 개발된 컴퓨터 프로그램 "항원성 지수"(antigenic index)를 사용하여 예상되는 높은 항원성을 기초로 하여 선별하거나[이 기준에 의해 펩티드 348-369 및 368-387이 선별됨], 또는 실시예 1에 기술된 바와 같은 펩스캔에서 나타나는 기능적인 높은 항원 반응성을 기초로 하여 선별하였다[이 기준에 의해 펩티드 394-420 및 424-452가 선별됨].

또한, 펩스캔에 의해 동정된 가장 반응성이 큰 4개의 도메인(제1도의 B 내지 E)을 복합시킨 콤비-펩티드(combi-peptide)를 제조했다. 이 콤비 펩티드의 서열을 서열 번호 5에 나타냈다.

대조용으로서, 문헌[A. Linde et al., J. Infect. Dis., 161, 903-910, 1990]에 기술된 바와 같은 P107 글리신-알라닌 공중합체 펩티드를 사용했다. 이 펩티드는 이미 공지된 EBNA-1 단백질의 면역 반응성 도메인을 나타낸다. 또한, 글리신-알라닌 도메인을 제외한 총 길이의 EBNA-1 서열을 함유하는 EBNA-1 단백질의 재조합 형태를 사용했다. 이 재조합 단백질은 문헌[Frappier and O'Donnell, J. Biol. Chem., 266, 7819-7826, 1991]에 기술된 바와 같이 재조합 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포로부터 정제했다.

전술한 펩티드 및 단백질을 고체상, 즉 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트의 웰위에 0.05M NaHCO₃완충액(pH9.6) 1ml당 1㎍의 양으로 4℃에서 하룻밤 동안 도포시켰다. 그 다음 웰을 pH 7.4의 인산염-완충 식염수(PBS)로 2회 세정한 후, 0.05% Tween 20을 함유하는 PBS(PBST)로 1:100으로 희석시킨 인간 혈청 100μl를채운 뒤, 37℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. PBST로 3회 세정한 후, HRP-표지된 양의 항-인간 IgG 항체를 PBST로 적당히 희석시켜 첨가하고 37℃에서 1 시간 동안 항온처리하였다. PBST로 3회 세정한 후, 결합된 효소 활성을 기질로서 TMB를 사용하여 검출했다. 이 반응은 30분 경과시킨 후 1M H₂SO₄100μl를 첨가함으로써 정지시켰다. 멀티스캔(Multiscan) 광도계를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정했다. 또한, 문헌[Middeldorp and Herbrink, J. Virol. Meth., 21, 123-146, 1988]에 기술된 바와 같이 표준 면역 형광 혈청학 또는 면역 블롯 분석법을 사용하여 EBV-항체의 존재에 대하여 혈청을 시험했다.

제2도는 고체상위에 도포된 각각의 EBNA-1 시약과 36가지 EBV-혈청 반응 양성 혈청(□) 및 10 가지 EBV-혈청 반응 음성 혈청(△)의 패널을 사용하여 ELISA 실험한 결과를 나타낸 것이다. 이 도면으로부터, 면역블롯했을 경우 EBNA-l에 대한 검출 가능한 항체를 함유하지 않는 혈청은, 콤비-펩티드 및 바큘로-유래의 EBNA-1 단백질을 제외한 모든 EBNA 유래의 펩티드와 반응시 음성을 나타냈다는 것을 알 수 있다.

전술한 실험으로부터, "항원성 지수" 프로그램에 기초한 컴퓨터 예상 분석은, 거의 모든 혈청이 높은 전하를 갖는 펩티드 348-369 및 368-387과의 반응시에 음성인 만큼, 자연적으로 감염된 개체로부터 채취한 혈청의 면역원성에 대하여 예측값을 전혀 제공하지 못한다는 것이 명백하다.

펩스캔을 바탕으로 하여 선택된 펩티드는 펩티드 394-420(제1도의 도메인B+C의 복합체) 및 펩티드 424-452(도메인 D+E의 복합체)에 대하여 80-90%의 혈청과 우수한 반응성을 나타냈다. 놀랍게도, 콤비-펩티드는 시험된 EBV-혈청반응 양성인 혈청과 100% 양성의 반응성을 나타낸다. EBV 혈청 반응 음성인 혈청은 콤비-펩티드와 어떤 반응성도 나타내지 않는 반면, 상기 혈청중 1가지는 바큘로 유래의 EBNA-1 단백질과 허위-양성 반응을 나타냈다.

실시예 3:

마우스 모노클로널 항체를 이용한 EBNA-1 상에 존재하는 면역반응성 에피토프의 정위

마우스 모노클로널 항체 및 토끼 혈청을 사용하여 EBNA-1 단편 348-470상에 존재하는 면역 반응성 에피토프의 정위에 사용되는 절차는 인간 혈청을 사용하여 에피토프를 정위시키는 실시예 1에 기술된 것과 같다.

핀(pin)-결합된 펩티드에 대한 마우스 항체-결합성은 퍼옥시다제로 표지화된 양의 항-마우스 IgG를 사용하여 측정한 반면, 토끼 항체-결합성은 퍼옥시다제로 표지화된 양의 항-토끼 IgG를 사용함으로써 측정했다.

그 결과를 제3도에 나타냈다. 이 결과로부터 EBNA 단백질에 대해 특이적 지향성이 아닌 모노클로널 항체(항 EBV VCA-p40 또는 비면역화된 토끼 혈청)는 시험된 어떤 EBNA-1 펩티드와도 반응하지 않는다는 것을 알 수 있었다.

마우스 모노클로널 EBNA.OT1x는 고농도로 사용되는 경우 AA 420-445에 있는 에피토프를 인식하며, 항체를 희석시키면 AA 430-438에 있는 에피토프를 좁게 인식한다. 바큘로 유래의 EBNA-1 단백질로 면역화시 유발되는 토끼 혈청 121-3은 분석된 EBNA-1 영역 중에 존재하는 3개의 에피토프를 인식한다.

실시예 4:

EBNA.OT1x를 사용하여 EBV-감염 세포내의 EBNA-1을 검출하기 위한 간접 면역 형광법

A. 1% 소 혈청 알부민(BSA)을 함유하는 인산염 완충 식염수(PBS, pH7.4)중에 2㎍/ml 농도인 EBNA.OT1x 항체로 염색된 12 웰의 유리 슬라이드상에, EBV로 잠복 감염된 X50-7 세포를 아세톤-메탄올(1:1)로 37℃에서 1시간 동안 고정시켰다. PBS로 4회 세정한 후, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)로 표지화된 토끼 항-마우스 IgG를 첨가한 뒤, PBS + 1% BSA로 희석시킨 후 37℃에서 1시간 동안 항온 처리하였다. PBS로 추가 4회 세정한 후, FITC로 표지화된 염소 항-토끼를 첨가하고 전술한 바와 같이 항온 처리하였다. 마지막으로, PBS로 4회 세정한 후, 슬라이드를 봉입액(mounting fluid)(50% 글리세롤, pH 9.0)으로 도포한 뒤, 덮개 유리로 밀봉시켰다.

B: TPA 및 부티레이트를 사용하여 6일 동안 EBV-발현 유도된 EBV-증식 세포주 P₃HR₁으로부터 유래되는 과잉유도성 클론(superinducible clone)인 HH514.c16 세포를 EbV-음성 BJAB 세포와 1:1 혼합한 뒤, 12웰의 유리 슬라이드 상에 100% 아세톤을 사용하여 고정시켰다. EBNA.OT1x를 전술한 A항에서 기술한 바와 같이 첨가하고, PBS로 4회 세정한 후, 염소 항-마우스 F(ab)-FITC를 첨가하고, PBS+1% BSA로 적당히 희석한 뒤 37℃에서 1시간 동안 항온 처리시켰다. PBS로 4회 세정한 후, 슬라이드를 봉입액으로 덮고, 덮개 유리로 밀봉시켰다.

항온 처리는 모두(A 및 B) 시약의 증발을 방지하기 위해 가습실내에서 실시했다. 짜이스 옥시오스코프(Zeiss Axioscope) 형광 현미경 (400×배율)을 사용하여 형광 염색을 가시화시켰다.

그 결과, 제4A도 및 제4B도에 나타낸 바와 같이, 감도를 증가시키기 위해 이중 FITC-염색 기법을 사용하는 경우, 패널 A에 나타낸 X50-7 세포주에 대하여 밝혀진 바와 같이 EBV로 잠복 감염된 세포 100% 내에서 특징적인 핵 EBNA 염색 패턴을 나타냈다. EBV-음성인 작은 BJAB 세포의 대부분이 전혀 염색성을 나타내지 않는 반면, 큰 EBV-증식 세포는 세포의 약 50% 내에서 강한 핵 염색 패턴을 나타내는 바와 같이, 패널 B의 결과는 EBNA.0T1x에 의한 염색의 특이성을 나타냈다.

실시예 5:

형광 활성화 세포 분류기(FACS) 분석법

EBV-음성인 인간 T-세포(Jurkat), EBV-양성인 인간 버키트-임파종 세포(Daudi), 폴리클로널 EBV-형질전환된 인간 B-임파구, 확립된 클로닝된 B-세포주, 또는 EBV-혈청 반응 음성인 공급체로부터의 말초 혈액 임파구를 BFA 법에 따라 고정시키고 2 ×10⁶/ml의 세포 농도에서 PBS + 1% BSA중의 EBNA.OT1x(1㎍/ml)와 함께 4℃에서 항온 처리하였다. PBS로 3회 세정한 후, 세포를 PBS-BSA로 적당히 희석시킨 FITC로 표지화된 염소 항-마우스 IgG-F(ab)₂와 함께 항온 처리하였다. 다시 세정한 후, 10⁴세포를 유동 세포계수기(flow cytometer)(FACSCAN, Becton-Dickinson)로 분석했다. 음성 대조군으로서, 상기와 동일 세포를 비연관 모노클로널 항체(항 HIV-p24, IgG)와 별도로 항온 처리함으로써 각 실험을 병행하였다.

전술한 실험의 결과를 제5A도 내지 제5F도에 나타냈다. 각 그래프중의 점선은 대조군 모노클로널 항체를 나타내는 반면, 연속 선은 EBNA.OT1x 모노클로널 항체에 대해 얻어진 결과를 나타낸다. 이러한 실험으로부터 문헌[Slaper-Cortenbach et al., Blood, 72, 1639-1644, 1988]에 기술된 바와 같은 고정 방법으로서 BFA를 사용하면 EBNA.OT1x를 세포내로 침투시킬 수 있고, 이로써 EBV 감염 세포내의 EBNA-1을 세포내에서 검출할 수 있다.

실시예 6:

면역블롯 염색 및 EBNO 타이핑

면역블롯 염색에 의한 변성 EBNA-1의 검출 및 이것을 본 발명의 EBNA.OT1x 항체를 사용한 여러가지 EBV 분리물의 EBNO 타이핑에 적용하는 방법을 하기에 기술한다.

제6도에서는 전세계의 여러 지역에서 입수한 B-세포주내에 존재하는 다양한 여러가지 EBV 균주를 분석한 실례를 나타낸 것이다.

제6A도 및 제6B도의 각 라인에 있어서, 환원 SDS-PAGE 시료 완충액 중에서 가열 처리하여 변성시킨 5 ×10⁴EBV-감염 세포 또는 대조군(BJAB) 세포의 시료를 표준 SDS-PAGE 처리하고 니트로셀룰로즈에 블롯팅시켰다.

패널 A(제6A도)는 EBNA.OT1x 모노클로널 항체를 사용하여 EBNA-염색시킨 것을 나타내는 반면, 패널 B는 EBNA-1 염색에 대해 단일 특이적인(즉, 부가적인 EBNA 분자와 반응성이 없음) 인간 혈청을 사용하여 동일하게 분석한 것을 나타낸다. 강도의 차이에도 불구하고, 상기 2가지 시약에 대한 염색 패턴은 동일한데, 이것은 개개의 EBV-분리물 중에서 분자량 변이를 나타내는 것이다. BJAB는 EBV 음성인 세포주 추출물을 나타낸다.

이 실험으로부터 EBNA.OT1x는 다수의 EBV균주와 반응하며 EBNO 타이핑시 시약으로서 사용될 수 있다고 결론을 내릴 수 있다.

서열 목록

Claims (14)

1. 서열 번호 1에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열로 구성된, 엡스타인-바(Epstein-Barr) 바이러스에 대한 항체와 면역화학적으로 반응성이 있는 펩티드 또는 면역화학적으로 반응성이 있는 이의 단편.
2. 서열 번호 2, 3, 4, 5 또는 6에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열로 구성된 엡스타인-바 바이러스에 대한 항체와 면역화학적으로 반응성이 있는 펩티드.
3. 제1항 또는 제2항에 기재된 펩티드에 대하여 형성된 항체.
4. 제3항에 있어서,

   상기 항체가 모노클로널 항체임을 특징으로 하는 항체.
5. 유럽 동물 세포 배양물 수집소(ECACC)[영국, 포르톤 다운 소재]에 기탁번호 제92071613호로서 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성되는 모노클로널 항체와 동일한, EBNA-1에 대한 반응성을 갖는 모노클로널 항체.
6. 제5항에 기재된 모노클로널 항체를 생성할 수 있는 무한증식성 세포주(immortalized cell line).
7. 유럽 동물 세포 배양물 수집소(ECACC)[영국, 포르톤 다운 소재]에 기탁번호 제92071613호로서 기탁된 무한증식성 세포주.
8. 제3항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체와 반응성이 있는 항-유전인자형(anti-idiotype) 항체.
9. 적합한 운반체(carrier) 또는 표지(label)에 결합된 제1항 또는 제2항 기재의 펩티드를 함유하는 면역화학 시약.
10. 적합한 운반체 또는 표지에 결합된, 제3항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체를 함유하는 면역화학 시약.
11. 제3항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 기재된 항체와 생체로부터 분리된 시료를 생체외에서 접촉시킨 후, 형성된 면역 복합체의 존재를 검출하며, 이로부터 상기 시료중의 EBV의 존재를 결정하는 것을 포함하는, 시료 중의 EBV를 검출하는 방법.
12. 제9항에 기재된 면역화학 시약을 생체로부터 분리된 시험액과 생체외에서 접촉시킨 후, 이 시험액 중에 형성된 면역 복합체의 존재를 검출하는 것을 특징으로하는, 시험액 중의 엡스타인-바 바이러스에 대하여 지향성인 항체를 검출하는 방법.
13. 제9항에 기재된 면역화학 시약을 생체로부터 분리된 시험액 및 엡스타인-바 바이러스에 대하여 지향성인 항체와 생체외에서 접촉시키고, 그 다음 형성된 면역 복합체의 존재를 검출하고, 이로부터 시험액중의 엡스타인-바 바이러스의 존재를 결정하는 것을 특징으로 하는, 시험액 중의 엡스타인-바 바이러스를 검출하는 방법.
14. 제11항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 기재된 방법을 수행하기 위한 시험 킷트.