FI114781B - Epstein-Barr-viruksen peptidejä ja näitä peptidejä vastaan suunnattuja vasta-aineita - Google Patents

Description

114781 i

Epstein-Barr-viruksen peptidejä ja näitä peptidejä vastaan suunnattuja vasta-aineita «

V

Keksintö liittyy Epstein-Barr-virusta (EBV) vastaan 0 5 suunnattujen vasta-aineiden kanssa immunokemlallisesti reagoiviin peptideihin, näitä peptidejä vastaan suunnattuihin monoklonaalisiin vasta-aineisiin, solulinjoihin, jotka kykenevät tuottamaan monoklonaalisia vasta-aineita, sekä anti-idiotyyppisiin vasta-aineisiin. Tämä keksintö 10 koskee lisäksi immunologisia reagensseja sekä menetelmiä EBV:n tai EBV:tä vastaan suunnattujen vasta-aineiden havaitsemiseksi.

EBV on kaikkialla tavattava humaaniherpesvirus, joka löydettiin ensimmäisen kerran Burkittin lymfooman 15 (BL) afrikkalaisen (endeemisen eli e-) muodon yhteydessä. Virus löydettiin myöhemmin myös nasofaryngeaalikarsinooman (NPC) yhteydessä ja sen osoitettiin olevan infektoivaa mononukleoosia (IM) aiheuttava tekijä. Infektio saadaan tavallisesti varhaislapsuuden aikana ja se johtaa tavalli-20 sesti subkliinlsenä ilmenevään tautiin, jossa toisinaan esiintyy lieviä oireita. Nuoruusiässä tai aikuisuudessa saadusta infektiosta voi syntyä IM, jolle on luonteenomaista, että periferaallsessa veressä esiintyy atyyppisiä lymfosyyttejä. Suurin osa näistä lymfosyyteistä on 4. 25 T-lymfosyyttejä; näihin kuuluu kuitenkin pieni EBV:n in fektoima B-lymfosyyttlpopulaatlo. B-lymfosyytit voidaan saada infektoitumaan myös in vitro -olosuhteissa. Nämä solut transformoituvat ja lisääntyvät loputtomasti viljelmässä ja niitä on kutsuttu "immortallsoituneiksi", "laten-30 tin infektion sisältäviksi" tai "kasvamaan transformoitu- • : noiksi". Sikäli kun tiedetään, kaikkiin EBV-infektion saa- neisiin potilaisiin jää elinikäinen latentti infektio.

• Tätä heijastaa se, että näiden potilaiden kiertävän peri-feraalisen veren lymfosyyteissä esiintyy koko eliniän ajan 35 jatkuvasti pieniä määriä EBV-genomin suhteen positiivisia 2 114781 transformoituneita B-soluja ja että näiden suunielussa vapautuu virusta jatkuvasti, joskin ajoittain.

EBV-infektio aiheuttaa ylivoimaisesti suurimmassa osassa tapauksista lymfoproliferatiivisen taudin, joka voi 5 olla väliaikaisesti yleiskuntoa heikentävä mutta joka on aina hyvänlaatuinen ja itsestään rajoittuva. Kuitenkin tietyillä potilailla, joiden immunologisen järjestelmän toiminta on heikentynyt, infektio voi johtaa täysinpuhjen- \ neeseen pahanlaatuisten kasvainten muodostumiseen. Täl-10 laista tapahtuu potilaissa, joiden immunologisen järjestelmän toimintaa on rajoitettu tarkoituksellisesti, mikä koskee erityisesti lapsia, joille suoritetaan elinsiirtoja ja joita hoidetaan syklosporiini-A:lla, tai jonka järjestelmän toiminta on heikentynyt opportunistlsesti, kuten 15 HIV-infektion saaneiden potilaiden ollessa kyseessä, tai geneettisesti, kuten sellaisten XLP (X:ään liittynyt lym-foproliferatiivinen tauti) -geenin kantajina olevien miesten ollessa kyseessä, joilla tämä tauti ilmenee. Näissä tapauksissa tuloksena olevat pahanlaatuiset kasvaimet joh-20 tuvat siitä, että EBV:llä infektoituneet B-solut lisääntyvät polyklonaalisesti. Näissä potilaissa havaitaan lisäksi viruksen replikoi tuvan epiteelikudoksessa kontrolloimattomana oraalisen karvasoluleukoplakian leesiolssa. Immuunivasteella on siten keskeinen osuus EBV-infektion rajoitta-25 misessa.

EBV:n voidaan osoittaa esiintyvän soluissa tai kudoksissa sillä perusteella, että niissä on havaittu esiintyvän viruksen genomia tai että niissä on osoitettu olevan EBNA-1-proteiinia, joka on ainoa EBV:llä infektoituneessa 30 solussa universaalisena ilmentyvä ja latenssiin liittyvä proteiinituote.

Kuten edellä mainittiin, EBV on herpesvirusten ryhmän jäsen. Sen rakenteelliset ominaisuudet ovat seuraavat: - EBV:n genomi koostuu lineaarisesta kaksinauhai-35 sesta DNA-molekyylistä (172 000 emäsparia).

i 3 114781

Virioni koostuu ytimestä (proteiineista ja DNA:sta), jonka ympärillä on ikosahedraalinen kapsidi, ja kapsidia ympäröivästä membraanivaipasta. Ikosahedraalinen kapsidi rakentuu heksameerisistä ja pentaxneerisistä kapso-5 meereista. Membraanivaippa koostuu proteiini/lipldikak-soiskerroksesta muodostuvasta membraanista, jonka ulkopinnalla on ulokkeita. Kapsidlkuoren ja vaipan välisessä tilassa on amorfista proteiinia, josta käytetään nimitystä tegumentti.

10 - Kalkkien herpesvirusten tavoin EBV kykenee pri maarisen infektion jälkeen muodostamaan isännässään latentin elinikäisen infektion. Tämä latenssi edustaa EBV:n ja sen humaani-isännän välillä olevaa täydellistä tasapainoa, jota isäntien immunologinen järjestelmä säätelee.

15 Tähän mennessä useimmat biokemialliset ja biologi set tutkimukset on suoritettu kolmella EBV:n prototyyppi-kannalla, jotka ovat B95-8 (marmosettisolullnjassa tuotettu transformoiva virus), P3HR1 (Burkittin lyrafoomatuumo-risolulinjan tuottama transformoimaton virus) ja Raji 20 (Burkittin lymfoomatuumorisolulinjassa oleva latentti virus).

Muutaman viimeksi kuluneen vuoden aikana on määritetty prototyyppisen B95-8-viruskannan koko DNA-jakso.

Tämän jakson analyysin perusteella siitä on tunnistettu . 25 yli 80 avointa lukukehystä [Baer, et ai., Nature 310 (1984) 207 - 211].

EBV:n biologia muodostaa tutkijoille erityisen ongelman, koska viruksen biologisia ominaisuuksia (latenttia infektiota) ei ole mahdollista tutkia klassisen virus-30 tutkimuksen avulla. Sen solu- ja isäntäpiirl rajoittuvat * j lisäksi käytännöllisesti katsoen humaani- (ja joidenkin korkeampien kädellisten) B-lymfosyytteihin ja epiteelisoluihin, joita ei tavallisesti kyetä viljelemään in vitro -olosuhteissa. Se, että käytettävissä ei ole ollut täydel-35 lisesti permissiivistä eli viruksen lyyttistä replikaatio- 114781 4 ta edistävää solutyyppiä, on haitannut huomattavasti mahdollisuuksia tuottaa suuria määriä virusta.

B95-8-, P3HR1- ja Raji-isolaatioiden DNA-molekyy-lit ovat olleet prototyyppejä, jotka on kartoitettu yksi-5 tyiskohtaisesti restrlktioendonukleaaseilla ja kloonattu

Escherichia colin (E. coli) plasmideihin ja bakteriofagi lambdaan ja joiden nukleotidijaksoa on selvitetty.

EBV:n genomi koostuu yhdestä kaksinauhaisesta DNA- '·» molekyylistä, joka on muodostunut ainutlaatuisista ja 10 toistuvista peräkkäisistä jaksoista. DNA-molekyylln molem missa päissä on useita terminaalisia jaksoja, joiden avulla genomi kykenee liittymään kovalenttisesti päistään yhteen ja muodostamaan rengasmaisen genomirakenteen. Virus-partikkeleissa EBV:n genomi on havaittavissa ainoastaan 15 lineaarisessa muodossa. Sellaisten solujen tiimassa, joissa on latentti Infektio, se esiintyy taas rengasmaisena epi-somina ja se liittyy toisinaan isäntäsolun kromosomeihin.

Sisäiset toistumajaksot IR1 - IR4 jakavat EBV:n ge-nomin viiteen ainutlaatuiseen alueeseen. U2- ja U3-alueis-20 sa on eri EBV-lsolaatlolssa huomattavaa vaihtelua ja EBV:n P3HR-l-kannassa edellinen on miltei kokonaan deletoitunut.

EBV:n lukukehysten nimitystäpä perustuu niiden sijaintiin viruksen genomissa. Nimet alkavat sen BamHl- tai EcoRl-restriktiofragmentin alkukirjaimilla, jossa ilmenty-25 mlnen alkaa. Nimen kolmas kirjain on L tai R sen mukaan, suuntautuuko ilmentyminen tavallisessa kartassa vasemmalle vaiko oikealle. (Siten BLLF2 on BamHl-restriktiofragmen-tista L alkava toinen vasemmalle etenevä lukukehys.) EBV:n muodostumlssyklissä olevien viruksen antigee-30 nien serologinen luokitus perustuu erilaisiin fluoresens-simenetelmiin.

Anti-komplementti-immunofluoresenssimenetelmällä spesifisesti havaittavat antigeenit, joita esiintyy sellaisten kiinnitettyjen B-solujen tumassa, joissa on la- 5 114781 tentti infektio (esimerkiksi Raji-solut), luokitellaan Epstein-Barr-tuma-antigeeneiksi (EBNA).

Viruksen geenien ilmentymisen aktivoituessa kemiallisilla tai viraalisilla tekijöillä havaitaan varhaisten 5 antigeenien ryhmä (EA), jonka synteesi ei esty viruksen DNA-synteesin inhibition vaikutuksesta. Käytetyn kiinnite-tyypin (metanoll tai asetoni) mukaan on havaittavissa kaksi toisistaan poikkeavaa EA-ryhmää, EA, ja EA,. EA on havaittavissa epäsuoralla immunofluoresenssilla indusoitu-10 neiden solujen sytoplasmassa ja tumassa. Viruksen DNA-synteesin käynnistyttyä (ja tästä riippuvaisena) syntetisoituu viruksen rakenneproteiineja (VCA), jotka ovat havaittavissa epäsuoralla Immunofluoresenssilla virusta tuottavien solujen (esimerkiksi P3HR1-solujen) sytoplasmassa ja 15 tumassa. Virusten tuottoon indusoituneiden elinkykyisten infektoituneiden solujen pinnalla on epäsuoralla immunofluoresenssilla havaittavissa ryhmä antigeenejä (MA). Näitä antigeenejä esiintyy myös viruksen vaipassa ja ne ovat tärkeitä viruksen neutralisaatiokohteita.

20 EBV:lle spesifisiä vasta-aineita voidaan havaita humaani seerumeista julkaisussa Heule ja Heule [Human Pathology 5 (1974) 551 - 565] kuvatuilla serologisilla rutii-nimenetelmillä.

Biokemiallisten ja immunofluoresenssilla saatujen ’ 25 koetulosten perusteella on mahdollista erottaa viisi eri- laista antigeenimolekyyliluokkaa. Viruksen eri polypeptl-deille on annettu nimitykset niiden suhteellisten moolimassojen perusteella, mutta ei ole luotu sellaista kaikkia EBV-proteiineja koskevaa yhteistä nimityskäytäntöä, jolla 30 nämä voitaisiin esittää yksiselitteisesti.

* *: Nämä viisi eri antigeeniryhmää ovat: A. Latenssitilan aikana ilmentyvä antigeeniryhmä (EBNA- ja LMP-antigeenit).

B. Genomin aktivaatiosta ja viruksen replikaation 35 aloittavasta induktiosta vastuussa olevien antigeenien ryhmä (IEA).

114781 6 C. IEA-geenien tuotteilla indusoituvien sellaisten antigeenien ryhmä, joita tarvitaan viruksen DNA:n repli-koitumiseen; nämä antigeenit ovat enimmäkseen viruksen entsyymejä (EA).

5 D. Antigeeniryhmä, joka koostuu viruspartikkelin rakennekomponenteista ja jotka ilmentyvät viruksen repli-kaatiosyklin myöhäisessä vaiheessa (VCA) viruksen DNA-syn-teesin käynnistyttyä.

E. Sellaisten antigeenien ryhmä, jotka Ilmentyvät 10 infektoidun solun solumembräänissä (MA).

Epsteln-Barr-tuma-antigeenit (EBNA)

Epstein-Barr-tuma-antigeeni 1 (EBNA-1), jota vastaava koodi on lukukehyksessä BKRF 1, on ainoa EBV:n koodaama proteiini, joka ilmentyy in vivo- ja in vitro -olo-15 suhteissa universaalisesti kaikissa latenttisesti infektoituneissa sekä tuumoreihin assosioituneissa soluissa, ja se on tärkeä kohdemolekyyli DNA:n replikaatio- ja geenien aktivaatiomekanismeja koskevissa tutkimuksissa.

EBNA-1 on tunnistettu EBV-positiivisista solulin-20 joista mutta ei kolmesta EBV-negatiivisesta solulinjasta immunoblottaus- ja radioimrounoelektroforeesitutkimuksissa, jotka oli tehty neljällä EBV-positiivisella humaanlseeru-milla ja kahdella vertailuseerumeina käytetyllä EBV-nega-tiivisella humaaniseexumilla. Tunnistetut antigeenit ero-25 sivat tutkituissa eri solulinjolssa toisistaan suhteellisten moolimassojensa suhteen, jotka olivat alueella 65 000 - 73 000. Komplementtia sitova antigeeni oli puhdistettu osittain yli 200-kertaisestl ja sen oli havaittu puhdistuvan yhdessä immunoblottauksella tunnistetun 65 30 kDa:n suuruisen EBNA:n kanssa. EBNA:lie ominaisen anti-komplementti-immunof luoresenssin (ACIF) vuoksi ehdotettiin 65 kDa:n suuruisen antigeenin olevan EBNA:n suurimman komponentin.

EBNA-geeni kartoitettiin transfektoimalla kloonattu 35 EBV-DNA:n BamHI K -restriktioentsyymifragmentti hiiren 7 114781 soluihin. Hiiren fibroblastilinjan transfektlosta tällä fragmentilla, jonka ohella käytettiin dominanttia selek-tiomarkkeria, saavutettiin tulos, jonka mukaan linja ilmensi pysyvästi tuma-antigeenia, joka oli tunnistettavissa 5 EBNA-positiivisilla mutta ei EBNA-negatiivisilla humaani-seerumeilla ACIF:ssä. Myöhemmin suoritetussa tutkimuksessa havaittiin, että Bam K:11a transfektoidut solut ilmensivät 78 kOa:n suuruista polypeptidiä, joka liikkui yhdessä B95-8-solujen EBNA-l-polypeptidin kanssa.

10 Melko äskettäin tehdyissä tutkimuksissa on löytynyt glysiini-alaniini-toistumajakson alueella oleva immunodo-minantti alue, josta käytetään tavallisesti nimitystä p62 tai pl07 ja joka reagoi voimakkaasti humaaniseerumien kanssa. Tämän gly-ala-fragmentin osoitettiin kuitenkin 15 sisältyvän normaaleihin humaaniproteiineihin ja sitä vastaan havaittiin syntyvän autovasta-aineita. Jatkotutkimuksissa on lisäksi käynyt ilmi, että tällä peptidillä esiintyy toisinaan ristireagoivuutta erityisesti sellaisten potilaiden seerumissa olevien IgM-vasta-aineiden kanssa, 20 joilla on aktiivinen CMV-, HSV- tai toksoplasmainfektio. Lisäksi E. colissa ilmennetyn 28 kO:n suuruisen C-terminaalisen fragmentin, joka koodaa EBNA-l:n aminohappoja 461 - 641, osoitettiin olevan reaktlokykylnen humaaniseerumin vasta-aineiden kanssa. Muissa tutkimuksissa ei ole 25 tähän mennessä kyetty tunnistamaan sellaisia EBNA-l-pro-teiinin fragmentteja, joita voitaisiin käyttää diagnostiikassa kokonaisen EBNA-1-proteiinin tilalla.

EBNA-l:n molekyylikokoa voidaan käyttää kantojen tunnistamiseen (EBNO-tyypitys), koska gly-ala-toistumajak-30 son koko voi vaihdella merkittävästi yksittäisissä virus-* kannoissa.

EBNA-1 on havaittu immunologisesti Burkittin lymfoomasoluissa, nasofaryngeaalikarslnoomasoluissa ja Hodgkinin taudissa esiintyvissä Reedin ja Stembergin so-35 luissa.

114781 8

Lisäksi EBNA-1 on havaittu myös siirteissä esiintyvissä polyklonaalisissa lymfoproliferatiivisissa vaurioissa sekä AIDS-potilaissa, ja se on soluviljelmässä kasvatettavien B-lymfosyyttien varhaisin tunnistusmarkkeri.

5 EBNA-l-molekyylistä on tunnistettu useita toimin nallisia domeeneja, kuten DNA:ta sitova (Ori-P-) domee-ni, tumaan paikallistava domeeni, transaktivaatiodomeeni, DNA-silmukan aikaansaava domeeni ja dimerisaatiodomeeni. EBNA-1 toimii DNA:ta sitoessaan homodimeerisenä molekyyli-10 nä.

Nykyisin EBV:lie spesifinen serodiagnoosi suoritetaan melko subjektiivisia immunofluoresenssitutkimuksia käyttäen. Edistystä yksinkertaisempaan ja yhtenäisempään diagnoosiin (esimerkiksi ELISA:aan) estää se, että viruk-15 sen antigeenejä ei ole mahdollista tuottaa ja puhdistaa suurina määrinä tavallisia virusten tuotantosolulinjoja käyttäen.

Ainoa keino tämän tavoitteen saavuttamiseksi olisi käyttää vaihtoehtoisella tavalla valmistettu(j)a EBV-anti-20 geeniä(ejä). Näitä EBV-antigeenejä voitaisiin valmistaa joko geneettisillä muokkausmenetelmillä tai peptidisyntee-simenetelmillä.

Sellaisen spesifisen ja herkän menetelmän kehittämiseksi, jolla EBV-infektio voitaisiin diagnostisoida luo-25 tettavasti infektion eri vaiheissa, on erittäin tärkeää tunnistaa viruksen immunodominantit proteiinit ja niiden epitoopit.

Tästä keksinnöstä saadaan käyttöön Epstein-Barr-virusta vastaan suunnattujen vasta-aineiden kanssa immuno-30 kemiallisesti reagoivia peptidejä, jotka koostuvat jakso-tunnisteessa nro 1 esitetystä aminohappojaksosta.

< Tämän vuoksi tähän keksintöön kuuluu peptidi, jon ka aminohappojakso on jaksotunnisteen nro 1 mukainen jakso.

9 114781 Tämän keksinnön mukaisten peptidien on havaittu soveltuvan erityisesti käytettäväksi diagnostisessa menetelmässä näytteessä olevan EBV:n tai siinä olevien EBV-vasta-aineiden määrittämiseksi. Tämän keksinnön mukaista 5 peptidiä voidaan lisäksi käyttää sopivissa farmaseuttisissa annostelumuodoissa EBV:hen liittyvien tautien hoidossa.

Näin aikaansaadut rokotteet, jotka sisältävät aktiivisina ainesosinaan peptidin tai sen fragmentin, ovat valmistettavissa alan ammattikokemuksesta tunnetulla tavalla.

10 Luonnollisesta EBV:stä poiketen on tämän keksinnön mukaisilla peptideillä se suuri etu, että ne on saatu turvallisista infektiokyvyttömistä lähtömateriaaleista.

Tämä keksintö käsittää myös mainittujen peptidien fragmentit, joissa immunokemialllnen reagoivuus Epstein-15 Barr-virusta vastaan suunnattujen vasta-aineiden kanssa on yhä tallella.

EBNA-l:n mainitun peptidialueen erityisominaisuudet tekevät tästä alueesta sellaisen, että vasta-aineet pääsevät EBNA-1-proteiinissa oleviin kohteisiin sekä tämän na-20 tiiveissa että tämän denaturoituneissa konfiguraatioissa.

Termi "peptidi" tarkoittaa tässä keksinnössä aminohapoista muodostunutta biologisesti aktiivista molekyyli-ketjua, mutta se ei viittaa mihinkään tietynpituiseen tuotteeseen. Tähän keksintöön kuuluvat siten muun muassa t. 25 proteiinit, fuusioproteiinit tai -peptidit, oligopeptidit •.

sekä polypeptidit. Tämän keksinnön mukaisia peptidejä voidaan tarvittaessa muokata in vitro- tai in vivo -olosuhteissa esimerkiksi glykosyloimalla, amidoimalla, karboksy-loimalla tai fosforyloimalla. Tämän keksinnön mukaisten 30 peptidien toiminnallisten varianttien, kuten esimerkiksi 'j happoadditiosuolojen, amidien, estereiden ja erityisesti C-terminaalisten estereiden sekä N-asyylijohdannaisten, katsotaan tämän vuoksi kuuluvan tähän keksintöön. On selvää, että tämän keksinnön piiriin kuuluvista tietyistä 35 nimenomaisista proteiineista tai polypeptideistä voi olla ίο 114781 olemassa myös luonnollisia variantteja. Näiden varianttien olomassaolo voidaan osoittaa niiden täysimittaisessa jaksossa olevan(ien) jon(iden)kin aminohappoeroavuuden(ksien) perusteella sekä mainitussa jaksossa esiintyvien aminohap-5 podeleetioiden -substituutioiden, -insertioiden tai -lisäyksien perusteella. On kuvattu aminohapposubstituutioi-ta, joista voidaan odottaa sitä, etteivät ne olennaisesti muuta biologisia ja immunologisia aktiivisuuksia. Toisiaan muistuttavien aminohappojen välillä tapahtuneita aminohappo pojen korvautumisia tai evoluutiossa usein esiintyviä korvautumisia ovat muun muassa Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn ja Ile/Val (tätä on käsitelty julkaisussa Dayhof, M.O., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found. Washington D.C., 1978, osa 5, täyden-15 nysosa 3). Tämän informaation perusteella Lipman ja Pearson ovat kehittäneet nopean ja herkän menetelmän proteiinien vertailemiseksi [Science 227 (1985) 1435 - 1441] ja homologisten proteiinien välisen toiminnallisen vastaavuuden määrittämiseksi.' 20 Termi "fragmentti" tarkoittaa tässä keksinnössä aminohappojaksoa, joka käsittää tämän keksinnön mukaisen peptidin jaksoonsa kuuluvana osana. Mainittu fragmentti on peptidi, joka sisältää EBNA-l-protelinin yhden tai useamman immunogeenisen determinantin. Fragmentteja voidaan 25 valmistaa muun muassa pilkkomalla lähtömateriaalina käytettäviä molekyylejä entsymaattisesti käyttämällä DNA:n kyseessä ollessa restriktloendonukleaaseja ja polypepti-dien kyseessä ollessa proteaaseja. Muihin menetelmiin kuuluvat fragmenttien kemiallinen synteesi tai peptidi-30 fragmenttien ilmentäminen DNA-fragmenttien avulla.

Tämän keksinnön mukaisen(ia) epitoopin(peja) sisältäviä sopivia immunogeenisiä peptidifragmentteja voidaan saada käyttämällä julkaisuissa WO 86/06 487, Geysen, H.M., et ai., [Proc. Natl. Acad. Sei. 81 (1987) 3998 - 4002] ja 35 Geysen, H.M., et ai., [J. Immunol. Meth. 102 (1987) 259 - 11 114781 274] kuvattua menetelmää, joka perustuu niin kutsuttuun pepscan-menetelmään, jossa syntetisoidaan sarja limittäisiä peptidejä, jotka vastaavat tarkasteltavana olevan täydellisen polypeptidin osittaisia jaksoja ja joista tutki-5 taan niiden reagoivuus vasta-aineiden kanssa.

Lisäksi peptidien useiden alueiden voidaan teoreettisen tarkastelun perusteella katsoa olevan epitooppeja, vaikkakin näiden teoreettisten tarkasteluperustelden en-nustusarvo on rajoitettua. Näiden alueiden määritys pe-10 rustuu Hoppin ja Woodsin (Proc. Natl. Acad. Sei. 78 (1981) 3824 - 3828) hydrofiilisyyskriteereihin ja Choun ja . Fas-manin [Advances in Enzymology 47 (1987) 45 - 148] julkaisun mukaisiin sekundaarista rakennetta koskeviin näkökohtiin.

15 Tämän keksinnön mukaiset edulliset peptidit ovat peptidejä, jotka käsittävät ainakin yhden jaksotunnisteis-sa nro 2-6 kuvatuista jaksoista.

Peptidit, joiden jaksot ovat jaksotunnisteiden nro 2-4 mukaisia, ovat sellaisen peptidin fragmentteja, jon-20 ka aminohappo jakso on j aksotunnlsteen nro 1 mukainen, ja nämä vastaavat EBNA-1:n jakson aminohappoja nro 268 - 391, 395 - 425 ja 419 - 449, tässä järjestyksessä mainittuna. Peptidi, jonka aminohappojakso on jaksotunnisteessa nro 5 esitetyn jakson mukainen, on peptidi, joka käsittää jakso-. 25 tunnisteen nro 1 jakson fragmenttien (jaksotunnisteet nro 2-4) yhdistelmän.

Tämän keksinnön mukaisia peptidejä tai niiden fragmentteja valmistetaan jollakin tunnetulla orgaaniseen kemiaan kuuluvalla peptidisynteesimenetelmällä tai yhdistel-30 mä-DNA-menetelmillä.

* *: Orgaaniseen kemiaan kuuluvien peptidisynteesimene telmien katsotaan sisältävän tarvittavien aminohappojen kytkemisen kondensaatioreaktlon avulla joko homogeenisessa faasissa tai niin kutsutun kiinteän faasin avulla.

114781 12

Kondensaatioreaktio voidaan suorittaa seuraavasti: a) yhdiste (aminohappo, peptidi), jossa on vapaa karboksyyllryhmä ja jonka muut reagoivat ryhmät ovat suojattuja, kondensoldaan kondensolvan aineen läsnä ollessa 5 yhdisteen (aminohappo, peptidi) kanssa, jossa on vapaa amlnoryhmä ja jonka muut reagoivat ryhmät ovat suojattuja; b) yhdiste (aminohappo, peptidi), jossa on aktivoitu karboksyyllryhmä ja jonka muut reagoivat ryhmät ovat vapaita tai suojattuja, kondensoldaan yhdisteen (aminohap- 10 po, peptidi) kanssa, jossa on vapaa amlnoryhmä ja jonka muut reagoivat ryhmät ovat vapaita tai suojattuja.

Karboksyyllryhmä voidaan aktivoida muun muassa muuntamalla karboksyyllryhmä happohalogenidiksl, atsldik-si, anhydridiksi, imidatsoliksi tai aktivoiduksi esterik-15 si, kuten N-hydroksisukkinimidiksi, N-hydroksibentsotriat-soliksi tai p-nitrofenyyliesteriksi.

Yleisimmät menetelmät edellä olevia kondensaatio-reaktioita varten ovat: karbodi-imidimenetelmä, atsidime-netelmä, seka-anhydridimenetelmä ja aktivoitujen esterien 20 käyttöön perustuva menetelmä, ja niitä on kuvattu teoksessa The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, osat 1-3 (toim. Gross, E. ja Meienhofer, J.) 1979, 1980, 1981 (Academic Press, Inc.).

Tämän keksinnön mukaisten edellä mainittujen pepti-25 dlen sopivien fragmenttien valmistus "kiinteää faasia" käyttäen on kuvattu esimerkiksi julkaisuissa J. Amer. Chem. Soc. 85 (1963) 2149 ja J. Peptide Protein Res. 35 (1990) 161 - 214. Valmistettavan peptidin aminohappojen kytkeminen aloitetaan tavallisesti karboksyylipään puolel-30 ta. Tätä menetelmää käytettäessä tarvitaan kiinteä faasi, jossa on reagoivia ryhmiä tai jonka pinnalle tällaisia ryhmiä voidaan liittää. Tämä voi esimerkiksi olla reagoivia kloorimetyyliryhmiä sisältävä bentseenin ja divinyyli-bentseenin kopolymeeri, tai kiinteä polymeerifaasi, joka 13 114781 on tehty reagoivaksi funktionaalisella hydroksimetyyli-tai amiiniryhmällä.

Erityisen sopiva kiinteä faasi on esimerkiksi p-al-koksibentsyylialkoholihartsi (hartsi, jossa on 4-hydroksi-5 metyylifenoksimetyylikopolystyreeniä ja 1 % divinyylibent-seeniä), joka on kuvattu julkaisussa Wang, J. Am. Chem.

Soc. 95 (1974) 1328. Synteesin jälkeen peptidit voidaan irrottaa tästä kiinteästä faasista lievästi vaikuttavissa olosuhteissa.

10 Kun haluttu aminohappojakso on syntetisoitu, irro tetaan peptidi sitten hartista esimerkiksi trlfluorimetaa-nisulfonihapolla tai trifluorietikkahappoon liuotetulla metaanisulfonihapolla. Peptidi voidaan myös poistaa kantajasta transesterifioimalla alemmalla alkoholilla, edulli-15 sesti metanolilla tai etanolilla, jossa tapauksessa muodostuu suoraan peptidin (alempi alkyyli)esteri. Irrottamisesta ammoniakin avulla saadaan samalla tavoin tämän keksinnön mukaisen peptidin amidi.

Kuten edellä mainittiin, on tehokas keino niiden 20 reagoivien ryhmien suojaamiseksi, jotka eivät saa osallistua kondensaatioreaktioon, käyttää ryhmiä, jotka voidaan puolestaan poistaa hyvin helposti happo- tai emäshydrolyy-sillä tai pelkistämällä. Tehokas keino karboksyyliryhmän suojaamiseksi on esimerkiksi esteröinti metanolilla, eta-\ 25 nolilla, tertiaarisella butanolilla, bentsyylialkoholilla tai p-nitrobentsyylialkoholilla sekä kiinteään tukimateriaaliin liitetyillä amiineilla.

Ryhmät, jotka voivat suojata tehokkaasti aminoryh-mää, ovat etoksikarbonyyli, bentsyylloksikarbonyyli, t-bu-30 toksikarbonyyli (t-boc) tai p-metoksibentsyylioksikarbo-* nyyli tai sulfonihaposta peräisin oleva happoryhmä, kuten bentseenisulfonyyli- tai tolueenisulfonyyliryhmä, mutta voidaan myös käyttää muita ryhmiä, kuten substituoituja tai substituoimattomia aryyli- tai aralkyyliryhmiä, esi-35 merkiksi bentsyyliä ja trifenyylimetyyliä, tai ortonitro- 114781 14 fenyylisulfenyylin ja 2-bentsoyyli-l-metyylivinyylin tyyppisiä ryhmiä. Erityisen sopiva α-aminoa suojaava ryhmä on esimerkiksi emäkselle herkkä 9-fluorenyylimetoksikarbonyy-liryhmä (Fmoc-ryhmä) [Carpino & Han, J. Amer. Chem. Soc.

5 92 (1970) 5748].

Laajahko katsaus mahdollisiin suo jääviin ryhmiin on esitetty teoksessa The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, osat 1-9 (toim. Gross, Udenfriend ja Meienhofer, J.) '1979 - 1987 (Academic Press, Inc.).

10 On myös tarpeellista suojata lysiinin e-aminoryhmä ja tämä on suositeltavaa myös arginiinin guanidiiniryhmän kyseessä ollessa. Tavanomaisia suojaavla ryhmiä tässä yhteydessä ovat lysiinille käytettävä Boc-ryhmä ja arginii-nille käytettävät Pmc- tai Pms- tai Mbs-ryhmät tai Mtr-15 ryhmä.

Suo jaavat ryhmät voidaan irrottaa tietyn nimenomaisen ryhmän luonteen mukaan useilla tavanomaisilla menetelmillä, esimerkiksi trlfluorletikkahapon avulla tai käyttämällä lievää pelkistystä, kuten vetyä ja katalyyttiä, ku-20 ten palladiumia, tai käyttäen jääetikkaan valmistettua HBr:ää.

Kuten edellä on jo mainittu, voidaan tämän keksinnön mukaisia peptidejä valmistaa yhtä lailla yhdistelmä-DNA-menetelmillä. Tämä mahdollisuus on merkittävä erityi-25 sesti silloin, kun peptidi liitetään toistuvaan jaksoon ("peräkkäisessä järjestyksessä") tai kun peptidi voidaan valmistaa osana (paljon suurempaa) proteiinia tai polypep-tidiä tai fuusioproteiinina esimerkiksi β-galaktosidaasiin (tämän osaksi) liitettynä. Tämäntyyppiset peptidit kuulu-30 vat samoin tämän keksinnön piiriin. Tätä tarkoitusta varten käytetään yhdistelmä-DNA:n osana tämän keksinnön mukaista peptidiä koodaavaa nukleiinihappojaksoa, josta lisäksi puuttuu huomattava osa niistä nukleiinihapposegmen-telstä, jotka sijaitsevat EBV:n luonnonmukaisessa geno-35 missä edellä mainitun nukleiinihappojakson vieressä.

15 114781 Tämä viimeksi mainittu menetelmä sisältää sen, että siinä valmistetaan haluttu peptidi saattamalla yhtä tai useampaa kysymyksessä olevaa peptidiä koodaavaa nukleiinihappoa sisältävä yhdistelmäpolynukleotidi ilmentymään so-5 pivassa isäntänä käytettävässä mikro-organismissa.

Tämän keksinnön mukaista peptidiä koodaava nukleiinihappojakso voidaan liittää useisiin replikoitu-viin DNA-jaksoihin, joihin se ei ole luonnossa assosioitunut tai liittynyt, mistä on tuloksena yhdistelmävektorlmo-10 lekyyli, jolla sopiva isäntä voidaan transformoida. Käyttökelpoiset yhdistelmävektorimolekyylit ovat edullisesti peräisin esimerkiksi plasmideista, bakteriofageista, kos-mideista tai viruksista.

Tällä alalla tunnetaan spesifisiä vektoreita eli 15 kloonausvehikkeleitä, joita voidaan käyttää nukleiinihappojen kloonaukseen, ja näihin kuuluvat muun muassa plasmi-divektorit, kuten pBR322, useat erilaiset pUC-, pGEM- ja Bluescript-plasmidit, bakteriofagit, esimerkiksi kgt-Wes, Charon 28 ja M13:sta peräisin olevat faagit, tai virusvek-20 torit, kuten SV40, adenovirus tai polyomavirus [näitä on myös käsitelty julkaisuissa Rodriquez, R.L. ja Denhardt, D. T., toim., Vectors: a survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterwoths, 1988; Lenstra, J.A., et al., Arch. Virol. 110 (1990) 1 - 24]. Yhdistelmävektorlmo-| 25 lekyylln konstruoimiseen käytettävät menetelmät kuuluvat « β alan tavallisen ammattikokemuksen piiriin ja niitä on muun muassa kuvattu teoksessa Maniatis, T., et. ai., (Molecular Cloning A Laboratory Manual, toinen laitos; Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

30 Tämän keksinnön mukaista peptidiä koodaava nukleli- * *: nihappojakso voidaan esimerkiksi liittää helposti kloo naus vektori in, kun sekä geenit että haluttu kloonausvehlk-keli on pilkottu samalla(oilla) restriktioentsyym(e)illä, koska tästä on tuloksena komplementaariset DNA-päät.

114781 16

Yhdistelmävektorimolekyylit voivat lisäksi sisältää yhden tai useamman markkeriaktiivisuuden, kuten pBR322:ssa olevan ampisilliini- ja tetrasykliiniresistens-sin, jollaisia ovat esimerkiksi pUC8:ssa oleva ampisillii-5 niresistenssi sekä β-galaktosidaasin α-peptidi, jota voidaan käyttää haluttujen transformanttien selektioon.

On luonnollisesti selvää, että kloonausvektorin haluttuun kohtaan liitettyihin nukleiinihappo jaksoihin voi li sisältyä ainoastaan tämän keksinnön mukaisia peptidejä 10 koodaavan täydellisen nukleiinihapon fragmentti, sikäli kun transformoitu isäntä tuottaa polypeptidiä, jossa on ainakin yksi tai useampi immunogeeninen determinantti.

Tämän keksinnön mukaista peptidiä vastaan suunnatut vasta-aineet kuuluvat myös tähän keksintöön.

15 Edellä esitetyllä tavalla valmistettuja ja edelli sen kuvauksen mukaisia peptidejä tai niiden fragmentteja voidaan käyttää sekä polyklonaalisten että monoklonaalis-ten vasta-aineiden valmistamiseen. Tämän keksinnön mukaisia peptidejä vastaan suunnattuja vasta-aineita voidaan 20 valmistaa vaivatta tämän alan ammattikokemuksen perus teella.

Ennen tätä keksintöä ei ollut käytettävissä raportteja vasta-aineista, jotka olisivat olleet muodostettuja tätä EBNA-l:n spesifistä peptidifragmenttia vastaan. Tämän 25 alan ammattikokemuksesta saatavan tiedon perusteella ei ole tähän mennessä ollut saatavilla epitooppeja, joita saataisiin sitoutumaan vasta-aineisiin.

Tämän keksinnön mukaisista monoklonaalisista vasta-aineista saadaan tämän vuoksi käyttöön uusi keino EBV-in-30 fektion diagnostisoimiseksi.

Tämän keksinnön mukaisia edullisia vasta-aineita ovat monoklonaalinen vasta-aine, jonka reagoivuus EBNA-l:n kanssa on samanlainen kuin talletuslaitokseen European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down 17 114781 (UK), hakunumerolla 92 071 613 talletetun hybridoomasolu-linjan tuottamilla monoklonaalisilla vasta-aineilla.

Tämän keksinnön mukaisia uusia (monoklonaalisia) vasta-aineita, joille on annettu nimitys EBNA.OTlx, val-5 niistettiin immunisoimalla hiiriä bakulovlruksen avulla valmistetulla ΕΒΝΆ-1-proteiinilla, josta puuttui toistuva Gly-Ala-alue. Käyttäen E. colissa ilmennetystä ΕΒΝΑ-1 :stä peräisin olevia deleetiofragmentteja paikannettiin EBNA.OTlx:n sltoutumisalue otaksutun tumaan palkantumi-10 sen signaalin lähellä olevaan asemaan 430 - 438 (jakso on jaksotunnisteessa nro 6 esitetyn jakson mukainen). EBNA.OTlx :ää on käytetty immunosaostustutkimuksissa. EBNA.OTlx sitoutuu myös denaturoituun EBNA-1 :een sellaisena kuin sitä on käytetty Hestem-blottitutkimuksissa ja 15 immunofluoresenssitutkimuksissa kiinnitetyillä permeabili-soiduilla soluilla (FACS) käyttäen epäsuoria havaitsemis-menetelmiä, ja se reagoi useista erilaisista viruskannoista ja viruksen infektoimista kohdesoluista peräisin olevan EBNA-1:n kanssa. EBNA.OTlx sitoutuu useista EBV-isolaa-20 tioista peräisin olevaan EBNA-1:een ja sitä voidaan käyttää useilla erilaisilla humaanituumorikudoksilla tehtävässä immunohistokemiallisessa värjäyksessä.

Tähän keksintöön kuuluvat myös immortalisoidut solui in jät, jotka kykenevät erittämään tämän keksinnön mu-25 kaisla monoklonaalisia vasta-aineita.

Monoklonaalisia vasta-aineita tuottavia solulinjoja voidaan valmistaa esimerkiksi Kohlerin ja Milsteinin menetelmällä {Kohler ja Milstein ovat kehittäneet menetelmiä, joilla saadaan valmistettua monoklonaallsta vasta-ainetta 30 muodostavia hybridoomia [Kohler, G. ja Milstein, C., * ; Nature 256 (1975) 495 - 497; Eur. J. Immunol. 6 (1976) 511 - 519]}, Epstein-Barr-viruksella suoritettavalla transformaatiolla tai suoralla transformaatiomenetelmällä, jossa B-lymfosyyttejä transformoidaan onkogeenlsella 35 DNA:11a, tai humaani-B-lymfosyyttien suoralla fuusiolla 114781 18 toiseen fuusio-osapuoleen, joka on joko humaanlmyelooma-solulinja tai muriini-humaanihybridimyeloomasolulinja, tai EBV:llä transformoidun B-solulinjan suoralla fuusiolla mainittuihin myeloomasolullnj olhin.

5 Tämän keksinnön mukainen edullinen solullnja on talletuslaitokseen European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down (UK), hakunumero 11 a 92 071 613 talletettu solulinja.

Tämä hybridoomasolulinja valmistettiin fuusioimalla 10 myeloomasolu tämän keksinnön mukaisella EBNA-1-peptidillä aikaisemmin rokotetusta hiirestä peräisin olevaan lymfosyyttiin. (Tähän käytettiin peptidiä, jonka aminohappo jakso on esitetty jaksotunnisteessa nro 5.) Tämä keksintö käsittää lisäksi mainittua peptidiä 15 vastaan suunnattujen vasta-aineiden käytön immunologisissa ja biokemiallisissa menetelmissä, joilla on tarkoituksena havaita täysimittainen proteiini tutkittavassa nesteessä tai kudosnäytteessä.

Tähän mennessä EBNA-1:n havaitsemiseen EBV:llä in-20 fektoituneista soluista on käytetty anti-komplementti-im- munofluoresenssi (ACIF) -menetelmää, jossa anti-EBNA-1-vasta-aineen lähtömateriaalina käytetään humaaniseerumia. Epäsuorilla immunofluoresenssimenetelmillä ei ole kyetty havaitsemaan EBNA-1:tä sitovia vasta-aineita humaanisee-25 rumeista. ACIF:n tekevät monimutkaiseksi ylimääräinen vaihe, jossa suoritetaan inkubointi komplementilla, sekä itse komplementin pysymättömyys. Tutkimuksessa saadaan usein vääriä positiivisia ja negatiivisia reaktioita, kun ACIF:ään käytettäviä reagensseja käytetään epäasianmukai-30 sella tavalla.

EBNA.OTlx-vasta-aine eliminoi toisaalta nämä ongelmat ja sillä on mahdollista havaita EBNA-1 vaivatta useissa erilaisissa EBV:llä infektoiduissa soluissa epäsuoran immunofluoresenssin avulla.

19 114781 EBNA-1:n esiintyminen solun tumassa on soluissa olevan latentin EBV-infektion tuntomerkki sekä In vivo-että In vitro -olosuhteissa.

EBNA.OTxl kykenee tunkeutumaan soluihin, minkä 5 avulla on siten mahdollista havaita EBNA-1 solun sisällä: EBV.OTlx-vasta-ainetta voidaan käyttää fluoresenssiakti-voidulla solulajittelijalla (FACS) tehtävässä tumavärjäys-analyysissa, jossa kiinnitys suoritetaan puskuroidulla fo!rmaliinin ja asetonin seoksella (BFA), permeabillsoi-10 duissa EBV:llä infektoituneissa soluissa julkaisussa Slaper-Cortenbach, et ai., [Blood 72 (1988) 1639 - 1644] kuvatulla tavalla. Tällä menetelmällä on se etu, että se on yksinkertainen ja nopea ja sillä on mahdollista havaita EBVrllä infektoituneet viljellyt B-lymfosyytit in 15 vitro -olosuhteissa. Tätä tekniikkaa voidaan myös käyttää EBVihen liittyvien lymfoproliferatiivisten sairauksien ja lymfooman havaitsemiseen ja seurantaan.

Sekä monoklonaaliset vasta-aineet että polyklonaa-liset vasta-aineet, jotka on suunnattu tämän keksinnön 20 mukaisia peptidejä vastaan, soveltuvat erittäin hyvin diagnoosissa ja immunosytokemiassa havaitsemiseen kudosnäytteestä in situ -olosuhteissa, kun taas neutraloivat vasta-aineet ovat hyvin käyttökelpoisia passiivisessa iromunoterapiassa.

| 25 Tämän keksinnön mukaisia vasta-aineita voidaan myös käyttää eri EBV-lsolaatioiden EBNO-tyypityksessä. Kuten edellä mainittiin, voidaan EBV-isolaatioita (kantoja) luonnehtia niiden muodostaman EBNA-1-molekyylin suhteellisen moolimassan perusteella, koska tässä proteiinissa ole-30 van glysiini-alaniini-toistuma-alueen pituus vaihtelee * *· huomattavasti. Poiketen aikaisemmin kuvatuista reagens- seista, jotka ovat enimmäkseen humaaniseerumeita, on mono-klonaalinen EBNA.OTlx-vasta-aine pysyvä ja toistettavia tuloksia tuottava reagenssi, jolla havaitaan EBV-ryhmässä 114781 20 muuttumattomana säilyvä sitova epitooppi ja joka soveltuu erittäin hyvin EBV-kantojen EBNO-tyypitykseen.

Tähän keksintöön kuuluu osana myös kysymykseen tulevien monoklonaallsten vasta-aineiden "humanisointi".

5 Tällä alalla tunnetaan menetelmiä "humanisoitujen" mono-klonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi.

Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan erityisesti käyttää anti-idiotyyppisten vasta-aineiden valmistamiseen.

i · Tällä alalla tunnetaan menetelmiä anti-idiotyyppisten vas-10 ta-aineiden valmistamiseksi.

Tämän keksinnön mukaisten edellä kuvattujen mono-klonaalisten vasta-aineiden kanssa reagoivat anti-idio-tyyppiset vasta-aineet kuuluvat tähän keksintöön.

Anti-idiotyyppiset vasta-aineet ovat immunoglobu-15 liinien vaihtelevaa osaa vastaan suunnattuj a vasta-aineita. Anti-idiotyyppisten vasta-aineiden yhtä alapopulaatio-ta nimitetään "anti-idiotyyppiseksi β-muodoksi" eli "sisäisiksi hahmoiksi". Nämä anti-idiotyyppiset β-vasta-ai-neet muistuttavat antigeeniä joko rakenteeltaan tai kolml-20 ulotteisilta ominaisuuksiltaan [Uytdehaag, F.G.C.M, et ai., Immunol. Rev. 90 (1986) 93 - 113]. Tämäntyyppisiä anti-idiotyyppisiä vasta-aineita käytetään laajalti rokotteina infektiotauteja vastaan eläinmalleissa [Hiemaux, J.R., Infect. Immun. 56 (1988) 1407 - 1413; Kennedy, R.C., 25 et ai., Science 232 (1986) 220 - 223]. Anti-idiotyyppisiä vasta-aineita voidaan valmistaa suurina määrinä määrityksissä käytettäväksi.

Tällä alalla tunnetaan anti-idiotyyppisten vasta-aineiden valmistamiseen käytettäviä menetelmiä. Tämän kek-30 sinnön mukaisia anti-idiotyyppisiä vasta-aineita voidaan saada immunisoimalla BALB/c-hiiriä monoklonaalisilla vasta-aineilla, jotka on kytketty KLH:hon glutaarialdehydillä tavanomaisilla ammattikirjallisuudessa esitetyillä menetelmillä ja jotka on sekoitettu Freundin täydelliseen ad-35 juvanttiin. Näiden hiirten pernasolut voidaan immortali- 21 114781 soida ja tällä tavoin saaduista hybridoomista voidaan seuloa esiin anti-idiotyyppistä vasta-ainetta tuottavat hyb-ridoomat. Hybridoomien seulonta voidaan suorittaa esimerkiksi antamalla tämän keksinnön mukaisten monoklonaalisten 5 vasta-aineiden sitoutua kiinteään faasiin (mikrotiitteri- levyn kuoppiin) ja inkuboimalla kiinteää faasia kasvavien hybridoomien viljelmäsupematantin kanssa. Seokseen voidaan lisätä EBV-peptidiä, johon on kiinnitetty piparjuuri-peroksidaasi (HRP). Viljelmäsupematantissa esiintyvät 10 anti-idiotyyppiset vasta-aineet saadaan sitten selville sen perusteella, että ne inhiboivat tämän peptidikonjugaa-tin sitoutumista kiinteän faasin pinnalle päällystettyihin monoklonaalisiin vasta-aineisiin.

Anti-idiotyyppisiä vasta-aineita voidaan käyttää 15 esimerkiksi inhiboimaan humaanisen ja/tai eläimestä peräisin olevan EBV-antigeenin sitoutumista EBV-vasta-aineisiin perustuvassa immunomäärltyksessä. Anti-idiotyyppisiä vasta-aineita voidaan vaihtoehtoisesti käyttää tuonnempana mainittua immunokemialllsta reagenssia jäljittelevänä ai-20 neena.

Mainitut anti-idiotyyppiset vasta-aineet ovat myös käyttökelpoisia EBV:n diagnoosiin ja hoitoon sekä EBV-an-tigeenien tärkeiden epitooppialueiden selvittämiseen.

Tähän keksintöön kuuluu osana myös immunokemialli-25 nen reagenssi, joka käsittää yhden tai useamman tämän keksinnön mukaisen peptidin tai vasta-aineen.

Termi "immunokemiallinen reagenssi" tarkoittaa tässä keksinnössä sitä, että se koostuu tavallisesti yhdestä tai useammasta tämän keksinnön mukaisesta peptidistä ja 30 sopivasta tukiaineesta tai aineesta, josta saadaan käyt- ' : töön leima.

Tukiaineita, joiden käyttö voi tulla kysymykseen, ovat esimerkiksi mikrotestikuopan tai kyvetin sisäseinä, koeputki tai kapillaariputki, membraani, suodatin, testi-35 liuska tai partikkelin, kuten esimerkiksi lateksipartikke- 114781 22

Iin, pinta, erytrosyytti, väriainesooli, metallisooli, tai soolipartikkelina toimiva metalliyhdiste, tai kantoaine-proteiini, kuten BSA tai KLH.

Leimalla varustamiseen käytettäviä aineita, joiden 5 käyttö voi tulla kysymykseen, ovat muun muassa radioaktiivinen isotooppi, fluoresoiva yhdiste, entsyymi, väriainesooli, metallisooli tai soolipartikkelina toimiva metalli-yhdiste.

'i ·

Menetelmässä, joka on tarkoitettu näytteessä ole-10 vien EBV:tä vastaan suunnattujen vasta-aineiden havaitsemiseksi, saatetaan tämän keksinnön mukainen immunokemlal-linen reagenssi kosketukseen näytteen kanssa. Tämän jälkeen havaitaan peptidin ja näytteessä olevien vasta-aineiden kesken muodostuneet immuunlkompleksit ja tämän havait-15 semisen perusteella näytteen tiedetään sisältävän EBV-vas-ta-aineita, jotka voidaan määrittää kvantitatiivisesti.

Immunokemiallisen reagenssin luonteen ja muiden ominaisuuksien mukaan tapahtuva immunokemiallinen reaktio on niin kutsuttu kerrosreaktlo, agglutinaatioreaktio, kom-20 petitioreaktio tai inhibitioreaktio.

Näytteessä olevan EBV:n havaitsemiseksi voidaan tämän keksinnön mukainen immunokemiallinen reagenssi, joka sisältää yhden tai useamman tämän keksinnön mukaisen peptidin, saattaa kosketukseen näytteen ja anti-EBV:n kanssa, 25 minkä jälkeen muodostuneiden immuunikompleksien esiintyminen voidaan havaita ja tästä voidaan päätellä näytteen sisältäneen EBV:tä.

Erityisen sopiva menetelmä näytteessä olevan EBV:n havaitsemiseksi perustuu tämän keksinnön mukaisen pepti-30 din, joka on varustettu leiman antavalla aineella, ja (näytteessä olevan) EBV-antigeenln väliseen koinpetitio-reaktioon, jossa peptidi ja antigeeni kilpailevat kiinteään tukimateriaaliin kiinnitetystä EBV:tä vastaan suunnatusta vasta-aineesta.

23 114781 Tämä keksintö käsittää lisäksi menetelmän näytteessä olevan Epstein-Barr-viruksen havaitsemiseksi, jolle menetelmälle on luonteenomaista, että tämän keksinnön mukainen vasta-aine saatetaan kosketukseen näytteen kanssa 5 ja havaitaan muodostuneet immuunikompleksit osoituksena siitä, että näyte sisältää Epstein-Barr-virusta.

Tämän keksinnön mukainen testipakkaus käsittää olennaisena osanaan edellä esitetyn kuvauksen mukaisen im-munokemiallisen reagenssin. Kerrosreaktion suorittamiseksi 10 EBV-vasta-aineiden havaitsemiseksi testipakkaus voi käsittää esimerkiksi kiinteällä tukimateriaalille, esimerkiksi mlkrotestikuopan sisäseinään, päällystetyn tämän keksinnön mukaisen peptidin ja joko tämän keksinnön mukaisen leimalla varustetun peptidin tai vasta-ainetta vastaan valmistele tun leimalla varustetun vasta-aineen.

Kompetitioreaktlon suorittamiseksi testipakkaus voi käsittää kiinteälle tukimateriaalille päällystetyn tämän keksinnön mukaisen peptidin ja EBV:tä vastaan suunnatun leimalla varustetun vasta-aineen, joka on edullisesti mai-20 nittua peptidiä vastaan suunnattu monoklonaalinen vasta-aine.

Agglutinaatioreaktiossa testipakkaus käsittää immu-nokemiallisen reagenssin, joka voi käsittää tämän keksinnön mukaisen peptidin, josta on valmistettu tätä sisäl-25 tävä päällyste partikkeleiden tai soollen pinnalle.

t

Vielä yksi testipakkauksen sovellutusmuoto on esimerkiksi tämän keksinnön mukaisen leimalla varustetun peptidin käyttö lmmunokemiallisena reagenssina kompetitio-reaktlossa, jossa se ja havaittavana oleva EBV-antigeeni 30 kilpailevat EBV:tä vastaan suunnatun ja kiinteälle tukima-. teriaalille päällystetyn vasta-aineen pinnalla olevasta sitoutumiskohdasta.

Kuvioiden pääpiirteittäinen kuvaus

Kuvio 1: humaaniseerumeilla suoritetun pepscan-ana-35 lyysin tulokset. Kuvion X-akselille on merkitty kunkin 114781 24 yksittäisen 12-meerisen peptidin lähtöasemat EBNA-l:n jaksossa siten, että "0" edustaa aminohappoasemasta 348 alkavaa 12-meeristä peptidiä jne. Y-akselille on merkitty suhteelliset absorbanssiyksiköt 450 nm:n kohdalta.

5 Viiva nro 1 edustaa EBV-negatiivlsen humaanlseeru- min immunologista reagoivuutta vastaavia 12-meerisiä peptidejä kohtaan.

Viivat nro 2-6 edustavat EBV-positiivisten humaa-nlseerumien immunologista reagoivuutta 12-meerisiä pepti-10 dejä kohtaan.

Kuvio 2: Sellaisten 46 humaanlseerumlnäytteiden reagolvuus ELISA:ssa (absorbanssi 450 nm:n kohdalta), joista tutkittiin IgG-reagoivuus EBNA-1-proteiinista peräisin olevia valikoituja synteettisiä peptidejä vastaan.

15 Δ tarkoittaa normaalin serologisen tutkimuksen mu kaan negatiivisia seerumeita, O tarkoittaa normaalin serologisen tutkimuksen mukaan positiivisia seerumeita, X tarkoittaa immunoblotissa ainoastaan EBNA-1:n 20 suhteen positiivisia seerumeita ja Q* tarkoittavat sellaisia seerumeita, joissa im-munoblotin mukaan el ole havaittavia anti-EBNA-l-västa-aineita mutta jotka ovat muutoin (toisin sanoen anti-VCA-) EBV-seropositiivisia.

25 A - peptidi 348 - 369 B - peptidi 368 - 387 C « peptidi 394 - 420 D - peptidi 424 - 452 E » peptidi Gly-Ala 30 F - kombi-peptidi G - EBNA-1-bakulo

Kuvio 3: tulokset Pepscan-analyysistä, jossa oli käytetty hiiressä tehtyjä monoklonaalisia vasta-aineita ja kaniinin seerumeita. Kuvion X-akselille on merkitty kunkin 35 EBNA-1:n jaksossa olevan yksittäisen 12-meerlsen peptidin 25 114781 lähtöasemat siten, että "O" edustaa aminohappoasemasta 348 alkavaa 12-meeristä peptidiä jne. Y-akselille on merkitty suhteelliset absorbanssiyksiköt 450 nm:n kohdalta.

Viiva 1 edustaa negatiivisena kontrollina käytetyn 5 monoklonaalisen anti-EBV VCA p40 -vasta-aineen (EBV.0T41A) reagoivuutta EBNA-l:stä peräisin olevia peptidejä vastaan.

Viivat 2 - 4 edustavat EBNA-l:tä vastaan suunnatun hiiressä tehdyn monoklonaalisen EBNA.OTlx-vasta-aineen reagoivuutta eri konsentraatioissa (5 pg/ml, 10 ng/ml ja 10 1 ng/ml, vastaavassa järjestyksessä ilmoitettuna).

Viiva 5 edustaa immunisoimattoman kaniinin seerumin reagoivuutta.

Viiva 6 edustaa yhdistelmä-EBNA-l:llä immunisoidun kaniinin seerumin reagoivuutta.

15 Kuvio 4: Epäsuora immunofluoresenssi EBNA-l:n ha vaitsemiseksi EBV:llä infektoiduissa soluissa monoklonaa-lista EBNA.OTlx-vasta-ainetta käyttäen. A: X50-7-solut, joissa on latentti EBV-infektio. B: HH514.cl6-solut, jotka on indusoitu ilmentämään EBV:tä ja sekoitettu suhteessa 20 1:1 EBV-negatiivisiin BJAB-soluihin.

Kuvio 5: EBNA-1 :n tumansisäisen värjäytymisen FACS-analyysi useissa erilaisissa lymfoidisoluissa ja solulin-joissa: A: EBV-negatiivisten Jurkat-solujen analyysi, B: EBV-positiivisten humaanisten Burkittin lymfoomasolujen 25 (Daudi) analyysi, C: EBV-seronegatiivisesta luovuttajasta peräisin olevien periferaalisen veren lymfosyyttien ana-lyysi. D: polyklonaalisten EBVillä transformoitujen humaa-ni-B-lymfosyyttien analyysi, E ja F: vakiintuneiden kloonattujen B-solujen (EBV-positiiviset solut) analyysi.

30 Y-akseli edustaa laskettuja solujen lukumääriä, kun , taas X-akseli edustaa fluoresenssin voimakkuutta solua kohti.

Kussakin kuvaajassa oleva pilkkuviiva edustaa kon-trollivasta-ainetta (anti-HIV-p24).

26 114781

Kuvio 6: A: Tulokset eri EBV-kantojen EBNO-tyypi-tyksestä monoklonaalisella EBNA.OTlx-vasta-aineella. B: Tulokset eri EBV-kantojen EBNO-tyypityksestä humaaniseeru-milla.

5 1 - BJAB

2 - CR+B95.8

3 - CR+QIMR-WIL

4 - PB-LCL

5 - CR+BL72 10 6 - CR+Mwika 7 - CR+A0876 8 - CR+Ambobi 9 - CR+WW1 10 - CR+WW2 15 Seuraavia esimerkkejä käytetään tätä keksintöä tarkemmin kuvaavina esimerkkeinä.

Esimerkki 1

Xmmunologisesti reagoivien domeenien paikantaminen

Pepscanilla 20 Peptidejä, jotka olivat 12 aminohapon (AA) mittai sia ja jotka olivat limittäin 11 aminohapon verran ORF BKRF1:n aminohappoj akson asemien 348 - 470 alueella, syntetisoitiin automaattisella kiinteän faasin peptidisyntee-sillä kemiallisesti aktivoitujen polyeteenipuikkojen pin-25 nalle alunperin julkaisussa Gejsen, et ai., (P.N.A.S., USA, 83 (1984) 3998 - 4002, kuvatulla tavalla.

Immunologinen reagoivuus EBV:lle spesifisiä vasta-aineita kohtaan määritettiin Middeldorpin ja Meloenin [J. Virol. Meth. 21 (1988) 147 - 159] julkaisussa kuvatulla 30 tavalla. Tällaisen Pepscan-analyysin tulokset kuudesta erillisestä humaaniseerumista on esitetty kuviossa 1.

Tästä kuviosta voidaan havaita, että reagoivia alueita esiintyy 12-meerisillä peptideillä, joiden alkukohdat ovat alueilla AA20 - 31, 43 - 65, 74 - 85 ja 90 -35 98, jotka edustavat EBNA-l:n jakson alueita AA372 - 381, 1U7 81 27 4 391 - 413, 422 - 433 ja 438 - 446, tässä järjestyksessä mainittuna. Samanlaisia reaktiivisuuksia havaittiin muilla humaani seerumien ryhmillä. Minkäänlaista merkittävää reaktiota ei havaittu EBV-seronegatiivisia seerumeita käytet- * 5 täessä, kuten kuviossa 1 olevasta viivasta nro 1 käy ilmi. Esimerkki 2

Immunologisesti reagoivien synteettisten peptidien valinta * ' Seuraavassa esitetään pääpiirteittäin BKHF1:n koo-10 daamasta EBNA-1-proteiinista peräisin olevien synteettisten peptidien valinta tietokoneanalyysin ja Pepscanin avulla ja näiden peptidien immunologisen reagoivuuden analyysi normaaleista donoreista saaduilla humaaniseerumell-la.

15 Synteettiset peptidit valmistettiin tavallisella kiinteän faasin synteesillä käyttäen t-BOC-kemiaa. Peptidit, jotka olivat peräisin BKRFx:n koodaamasta EBNA-1-proteiinin AA 348 - 470 -fragmentista, valikoitiin joko ennustetun suuren antigeenlsyyden perusteella käyttäen "an-20 tigeenisuuskerroin" ("antigenic index") -tietokoneohjel maa, jonka ovat kehittäneet Jameson ja Wolf [CAB10S 4 (1988) 181 - 186] [tämän perusteella valittiin peptidit 394 - 420 ja 424 - 452] tai Pepscanissa havaittavan toiminnallisen suuren antigeenlreagoivuuden perusteella esi-25 merkissä 1 kuvatulla tavalla [tämän perusteella valittiin peptidit 394 - 420 ja 424 - 452].

Valmistettiin lisäksi kombi-peptidi, joka edustaa Pepscanilla tunnistettujen neljän eniten reagoivan domee-nin (kuvion 1 domeenit B - E) yhdistelmää. Tämän kombipep-30 tidin sekvenssi on esitetty jaksotunnisteessa nro 5.

Kontrollitarkoituksiin käytettiin A. Linde, et ai. in [J. Infect. Dis. 161 (1990) 903 - 910] kuvaamaa P107-glysiini-alaniinikopolymeeripeptidiä. Tämä peptidi edustaa EBNA-l-proteiinin aiemmin puhdistettua lmmunologi-35 sesti reagoivaa domeenia. Lisäksi käytettiin EBNA-l-pro- 114781 28 teiinin rekombinanttimuotoa, joka glysiini-alaniini-domee-nia lukuun ottamatta sisältää täysimittaisen EBNA-1-jakson. Tämä rekomblnanttlprotellnl puhdistettiin yhdistelmä-bakulovlruksella lnfektoldulsta hyöntelssolulsta julkai-5 sussa Frappler ja O'Donnell [J. Blol. Chem. 266 (1991) 7819 - 7826] kuvatulla tavalla.

Kiinteä faasi, polystyreenistä valmistettujen mik-rotiitterilevyjen kuopat, päällystettiin yön yli 4 °C:ssa edellä kuvatuilla peptideillä ja proteiineilla, joiden 10 konsentraatio oli 1 pg/ml ja jotka oli valmistettu 0,05-molaariseen NaHC03-puskurlln, jonka pH oli 9,6. Kun kuopat oli pesty kaksi kertaa fosfaatilla puskuroidulla fysiologisella suolaliuoksella (PBS), jonka pH oli 7,4, kuoppiin lisättiin 100 μΐ humaaniseerumia, joka oli laimennettu 15 suhteessa 1:100 PBS:ään, joka sisälsi 0,05 % Tween 20:tä (PBST), ja niitä inkuboitiin 1 tunti 37 eC:ssa. Kolmen PBST-pesun jälkeen kuoppiin lisättiin HRP-leimalla varustettuja lampaassa tehtyjä anti-humaani-IgG-vasta-aineita sopivana laimennoksena PBST:ssä ja seosta inkuboitiin 20 1 tunti 37 "C:ssä. Kolmen PBST:llä suoritetun pesun jäl keen havaittiin sitoutunut entsyymiaktiivisuus käyttäen substraattina TMB:tä. Reaktio pysäytettiin 30 minuutin kohdalla lisäämällä 100 μΐ 1-molaarista H2S04:ää. Absor-banssi määritettiin 450 nm:n kohdalta käyttäen Multlscan-25 fotometriä. Seerumeista tutkittiin EBV-vasta-aineet käyttäen tavallista immunofluoresenssiserologiaa tai Middel-dorpin ja Herbrinkin julkaisussa [J. Virol. Meth. 21 (1988) 133 - 146] kuvattua immunoblottianalyysiä.

Kuviossa 2 on esitetty sellaisten ELISA-kokeiden 30 tulokset, joissa oli käytetty vastaavia kiinteän faasin pinnalle päällystettyjä EBNA-l-reagensseja ja 36:sta EBV-seropositilvisesta seerumista (□) ja 10:stä EBV-seronega-tiivisesta seerumista (Δ) valmistettua paneelia. Tästä kuviosta voidaan nähdä, että seerumit, joissa ei ollut immu-35 noblotilla havaittavia EBNA-1:tä vastaan suunnattuja vas- i 29 114781 ta-aineita, olivat negatiivisia kaikilla EBNA:sta peräisin olevilla peptideillä, lukuun ottamatta kombipeptidiä ja bakuloviruksesta peräisin olevaa EBNA-l-proteiinia.

Edellä kuvatuista kokeista käy ilmi, että tietoko-5 ne-ennusteilla, jotka perustuvat "antigeenisuuskerröin"-ohjelmaan, ei ole ennustusarvoa sellaisia seerumeita vastaan suunnatun immunogeenisuuden ollessa kyseessä, jotka ovat peräisin luonnollisesti Infektoituneista potilaista, » koska miltei kaikki seerumit ovat negatiivisia varaukselle) lisiä ryhmiä hyvin runsaasti sisältävillä peptideillä 348 - 369 ja 368 - 387.

Pepscanin perusteella valikoitujen peptidien rea-goivuus on hyvä 80 - 90 prosentilla seerumeista peptidien 394 - 420 (kuvion 1 mukaisten domeenien B+C yhdistelmä) ja 15 peptidien 424 - 452 (domeenien D+E yhdistelmä) ollessa kyseessä. Kombipeptidi osoittautui yllättäen positiivisesti reagoivaksi 100 prosentilla tutkituista EBV-seroposi-tiivisista seerumeista. EBV-seronegatiivisilla seerumeilla ei osoittautunut olevan reagoivuutta kombipeptidin kanssa, 20 kun taas yhdestä tällaisesta seerumista havaittiin väärä positiivinen reaktio bakulosta peräisin olevan EBNA-l-pro-teiinin kanssa.

Esimerkki 3 EBNA-1:ssä olevien immunologisesti reagoivien epi-25 tooppien paikantaminen hiiressä tehtyjä monoklonaa- $ lisiä vasta-aineita käyttäen

Työvaiheet EBNA-1:n fragmentissa 348 - 470 olevien immunologisesti reagoivien epitooppien paikantamiseksi hiiressä tehtyjä monoklonaalisia vasta-aineita ja kaniinin 30 seerumeita käyttäen olivat samat kuin edellä esimerkissä 1 ' *. kuvatut vaiheet, joilla epitoopit paikannettiin humaani- seerumeita käyttäen.

Hiiressä tehtyjen vasta-aineiden sitoutuminen puikkoihin kiinnitettyihin peptideihin määritettiin lampaassa 35 tehdyllä ja peroksidaasileimalla varustetulla anti-hiiri- m 114781 30

IgGillä, kun taas kaniinissa tehdyn vasta-aineen sitoutuminen määritettiin lampaassa tehdyllä ja peroksldaasilei-malla varustetulla anti-kaniini-reagenssilla.

Tulokset on esitetty kuviossa 3. Näistä tuloksista 5 voidaan nähdä, että monoklonaaliset vasta-aineet, jotka eivät ole suunnattuja spesifisesti EBNA-proteiineja vastaan (anti-EBV VCA-p40 tai immunisoimattoman kaniinin seerumi), eivät reagoi minkään tutkitun EBNA-1-peptidin kanssa. ' 10 Hiiressä tehty monoklonaalinen EBNA.OTlx-vasta-aine tunnistaa AA420 - 445-alueella olevan epitoopin suuressa konsentraatiossa käytettynä, joka alue supistuu vasta-ainetta laimennettaessa alueella AA430 - 438 olevaan epi-tooppiin. Kaniinin seerumi 121-3, joka oli valmistettu 15 immunisoimalla bakuloviruksen avulla saadulla EBNA-l-pro-teiinilla, tunnistaa kolme epitooppia tutkitulla EBNA-1-alueella.

Esimerkki 4

Epäsuora immunofluoresenssi EBNA-1:n havaitsemisek-20 si EBVrllä infektoituneissa soluissa EBNA.OTlx:ää käyttäen A. X50-7-solut, joissa oli latentti EBV-infektio, kiinnitettiin asetonin ja metanolin seoksella (1:1) 12-kuoppaisille objektilaseille ja soluja värjättiin 1 tunnin 25 ajan 37 eC:ssa EBNA.OTlx-vasta-aineella, jonka konsentraa- » tio oli 2 pg/ml ja joka oli valmistettu fosfaatilla puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen (PBS), jonka pH oli 7,4 ja joka sisälsi 1 %:n naudan seerumialbumiinia (BSA).

Kun objektilasit oli pesty neljä kertaa PBS:llä, niille 30 lisättiin kaniinissa tehtyä anti-hiiri IgG:tä, joka oli varustettu fluoreskeiini-isotiosyanaattileimalla (FITC-leima) ja joka oli laimennettu PBS:ää ja 1 %:n BSA:ta sisältävällä seoksella, ja objektilaseja inkuboitiin 1 tunti 37 eC:ssa. Kun objektilasit oli pesty vielä neljä kertaa 35 PBS:llä, niille lisättiin vuohessa tehtyä ja FITC-leimalla 31 114781 varustettua anti-kaniini-reagenssia ja niitä inkuboitiin edellä kuvatulla tavalla. Lopuksi objektilaseille lisättiin neljän PBS-pesun jälkeen peitinliuosta (mounting fluid), (50-prosenttinen glyseroli, jonka pH oli 9,0) ja 5 objektilasit peitettiin peitinlasilla.

B: HH514.cl6-soluja, jotka ovat EBVrtä tuottavan solulinjan PjHRi superindusoituva klooni ja joita oli indusoitu kuuden päivän ajan TPA:lla ja butyraatilla ilmentämään EBV:tä, sekoitettiin suhteessa 1:1 EBV-negatiivi-10 siin BJAB-soluihin ja seos kiinnitettiin 12-kuoppaisille objektilaseille 100-prosenttista asetonia käyttäen. Objektilaseille lisättiin EBNA.OTlx:ää kohdassa A esitetyllä tavalla ja neljän PBS-pesun jälkeen objektilaseille lisättiin vuohessa tehtyä anti-hiiri-F(ab)-FITC:tä, joka oli 15 laimennettu asiaankuuluvalla tavalla seoksella, joka si sälsi PBS:ää ja 1 %:n BSA:ta, ja niitä inkuboitiin 1 tunti 37 eC:ssa. Objektilaseille lisättiin neljän PBS-pesun jälkeen peitinliuosta ja ne peitettiin peitinlasilla.

Kalkki inkuboinnit (kohdissa A ja B) suoritettiin 20 kosteassa atmosfäärissä pidetyssä kammiossa reagenssien haihtumisen estämiseksi. Fluoresensslvärjäys visualisoitiin käyttäen Zeiss-Axioscope-fluoresenssimikroskooppla (400-kertainen suurennus).

Kuvioissa 4A ja 4B esitetyissä tuloksissa näkyy , ; 25 luonteenomainen tuman EBNA-värjäytymistulos 100 prosentti- a« la soluja, joissa on latentti EBV-infektio, kuten solulinjan X50-7 kyseessä ollessa saatu ja osakuviossa A esitetty tulos, joka on saatu käyttäen kaksois-FITC-värjäystekniik-kaa herkkyyden lisäämiseksi. Osakuviossa B esitetyt tulok-30 set osoittavat, että värjäytyminen EBNA.OTlxrllä on spesi-' .·* fistä, koska suurimmalla osalla pienistä EBV-negatllvisis- ta BJAB-soluista ei esiinny lainkaan värjäytymistä, kun taas suurissa EBV:tä tuottavissa soluissa noin 50 prosentilla soluista esiintyy voimakas tumien värjäytymistulos.

. 114781 32

Esimerkki 5

Fluoresenssiaktivoitu solulajittelija (FACS) -analyysi EBV-negatiivisia humaani-T-soluja (Jurkat), EBV-5 positiivisia humaani-B-lymfosyyttejä, vakiintuneita kloonattuja B-solulinjoja tai EBV-seronegatiivisesta luovuttajasta peräisin olevia periferaalisen veren lymfosyyttejä kiinnitettiin BFA-menetelmällä ja näitä inkuboitiin 4 eC:n lämpötilassa EBNA.OTlx:llä (1 pg/ml), seoksessa, jossa oli 10 PBS:ää ja 1 % BSA:ta ja jonka solukonsentraatio oli 2 x 106/ml. Kun solut oli pesty kolme kertaa PBS:llä, niitä inkuboitiin vuohessa tehdyn ja FITC-leimalla varustetun anti-hiiri-IgG-F(ab)2m kanssa, josta oli tehty asiaankuuluva laimennos PBS:n ja BSA:n seokseen. Vielä yhden pesu-15 vaiheen jälkeen analysoitiin 104 solua virtaussytometrillä (Facscan, Beckton-Dickinson). Kussakin kokeessa käytettiin rinnakkaisena negatiivisena kontrollina samojen solujen erillistä inkubolntia tutkimuskohteiden ulkopuolisella monoklonaalisella vasta-aineella (anti-HIV-p24, IgG).

20 Edellä kuvattujen kokeiden tulokset on esitetty kuviossa 5A - F. Kussakin kuvaajassa oleva pilkkuviiva edustaa kontrollina käytettyä monoklonaalista vasta-ainetta, kun taas yhtenäinen viiva esittää monoklonaalisella EBNA.OTlx-vasta-aineella saatuja tuloksia. Näistä tulok-25 sista voidaan tehdä se johtopäätös, että käyttäen kiinnitysmenetelmänä BFA:ta julkaisussa Slaper-Cortenbach, et ai. [Blood 72 (1988) 1639 - 1644] kuvatulla tavalla EBNA.OTlx kykenee tunkeutumaan soluihin ja tekee mahdolliseksi havaita EBNA-l:n solunsisäisesti soluissa, joissa on 30 EBV-infektio.

Esimerkki 6

Immunoblottivärjäys ja EBNO-tyypitys

Seuraavaksi on esitetty denaturoidun EBNA-l:n havaitseminen immunoblottivärjäyksellä ja tämän soveltaminen 33 114781 eri EBV-isolaatioiden EBNO-tyypitykseen käyttäen tämän keksinnön mukaista EBNA.OTlx-vasta-ainetta.

Kuviossa 6 on esitetty esimerkki analyysistä, joka on suoritettu käyttäen useita erilaisia EBV-kantoja sel-5 Iäisinä kuin ne esiintyvät B-solulinjoissa, jotka on saatu maailman eri maantieteellisiltä alueilta.

Kussakin kuvion 6A ja 6B kanavassa suoritettiin tavallinen SDS-PAGE ja blottaus nitroselluloosalle EBVrllä irtfektoitujen solujen tai kontrollisolujen (BJAB) näyt-10 teille, joiden solumäärä oli 5 x 104 ja jotka oli denaturoitu keittämällä niitä pelkistävässä SDS-PAGE-näytepusku-rissa.

Osakuvio A (kuvio 6A) esittää EBNA-värjäystä, jossa käytettiin monoklonaalista EBNA.OTlx-vasta-ainetta, kun 15 taas osakuvio B esittää samaa analyysiä, jossa käytettiin EBNA-l-värjäytymisen suhteen monospesifistä humaaniseeru-mia (toisin sanoen sellaista humaaniseerumia, joka ei reagoi muiden EBNA-molekyylien kanssa). Värjäytymisvoimakkuu-dessa olevista eroista huolimatta ovat kummankin reagens-20 sln värjäytymistulokset identtiset, mikä osoittaa, että suhteellinen moolimassa erillisissä EBV-isolaatloissa vaihtelee. BJAB edustaa EBV-negatiivlsen solulinj an uutetta.

Näistä kokeista voidaan tehdä se johtopäätös, että 25 EBNA.OTlx reagoi useiden EBV-kantojen kanssa ja että sitä voidaan käyttää reagenssina EBNO-tyypityksessä.

114781 34

SEQUENCE LISTING

(1) GENERAL INFORMATION: 5 (i) APPLICANT: (A) NAME: Akzo N.V.

(B) STREET: Velperweg 76 (C) CITY: Arnhem 10 (E) COUNTRY: The Netherlands

(F) POSTAL CODE (ZIP): 6824 BM

(ii) TITLE OF INVENTION: Epsteln-Barr Virus peptides and antibodies against these 15 peptides.

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 6 (iv) COMPUTER READABLE FORM: 20 (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0,

Version #1.25 (EPO) 25 (vi) PRIOR APPLICATION DATA: (A) APPLICATION NUMBER: EP 92202797.4 (B) FILING DATE: 14-SEP-1992 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 123 amino acids 35 (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 35 114781 (ii) MOLECULE TYPE: peptide 5 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:

Gly Gly Ser Gly Gly Arg Arg Gly Arg Gly 1 5 10 10 Arg Glu Arg Ala Arg Gly Gly Ser Arg Glu 15 20

Arg Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly 25 30

Glu Lys Arg Pro Arg Ser Pro Ser Ser Gin 15 35 40

Ser Ser Ser Ser Gly ser Pro Pro Arg Arg 45 50

Pro Pro Pro Gly Arg Arg Pro Phe Phe His 55 60 20 Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr 65 70

His Gin Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro 75 80 < . Asp Val Pro Pro Gly Ala lie Glu Gin Gly 25 85 90

Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser 95 100

Thr Gly Pro Arg Gly Gin Gly Asp Gly Gly 105 110 ’ 30 Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp Phe Gly Lys 115 120

His Arg Gly (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2: 35 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 amino acids * 36 1 1 4 7 81 (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 5 (ii) MOLECULE TYPE: peptide (Xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2: 10

Arg Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly 15 10

Glu Lys Arg Pro Arg Ser Pro Ser Ser Gin 15 20 15 Ser Ser Ser Ser (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 20 (A) LENGTH: 31 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 25 (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3: 30

Pro Arg Arg Pro Pro Pro Gly Arg Arg Pro 15 10

Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr 15 20 35 Phe Glu Tyr His Gin Glu Gly Gly Pro Asp 25 30

Gly 37 114781 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: 5 (A) LENGTH: 31 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 10 (ii) MOLECULE TYPE: peptide (XX) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4: 15

Gin Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp 1 5 10

Val Pro Pro Gly Ala lie Glu Gin Gly Pro 15 20 20 Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr 25 30

Gly (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5: • < * 25 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 58 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single *'· 30 (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide 35 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5: 114781 38

Pro Pro Arg Arg.Pro Pro Pro Gly Arg Arg 15 10

Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp 15 20 5 Tyr Phe Glu Tyr His Gin Glu Cys Cys Asp 25 30

Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly Ala lie 35 40

Glu Gin Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu 10 45 50

Gly Pro Ser Thr Gly Pro Arg Gly (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6: 15 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 12 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 20 (ii) MOLECULE TYPE: peptide 25 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:

Pro Asp Val Pro Pro Gly Ala lie Glu Gin 1 5 10

Gly Pro 30

Claims (14)

1. 39 114781
2. 1. Epstein-Barr-virusta vastaan suunnattujen vas- .. ta-aineiden kanssa itnmunokemiallisesti reagoiva peptidi, S tunnettu siitä, että se koostuu sekvenssinumerolla 1 esitetystä aminohappojaksosta.
3. 2. Epstein-Barr-virusta vastaan suunnattujen vas-ta-äineiden kanssa immunokemiallisesti reagoiva(t) peptidi t tai peptidit, tunnettu siitä, että se/ne koostuu yh- 10 destä tai useammasta sekvenssinumerolla 2-6 esitetyistä aminohappojaksoista.
4. 3. Vasta-aine, tunnettu siitä, että se on suunnattu patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista peptidiä vastaan.
5. 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen vasta-aine, tunnettu siitä, että vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine.
6. 5. Monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että se on suunnattu patenttivaatimuksen 1 mukaista 20 peptidiä vastaan, ja jonka reagoivuus EBNA-1:n kanssa on samanlainen kuin monoklonaalisilla vasta-aineilla, jotka ovat talletuslaitokseen European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down (UK) , hakunumerolla 92 071 613 talletetun hybridoomasolulinjan tuottamia vas-·. 25 ta-aineita.
7. 6. Immortalisoitu solulinja, tunnettu siitä, että se on talletuslaitokseen European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down (UK), hakunumerolla 92 071 613 talletettu solulinja.
8. 7. Anti-idiotyyppinen vasta-aine, tunnettu > siitä, että se reagoi minkä tahansa patenttivaatimuksista 3-5 mukaisen vasta-aineen kanssa.
9. 8. Immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen 35 peptidin, joka on kiinnitetty sopivaan kantoaineeseen tai leimaan. 114781 40
10. 9. Immunokemiallinen reagenssi, tunnettu siitä, että se käsittää minkä tahansa patenttivaatimuksista 3-5 mukaisen vasta-aineen, joka on kiinnitetty sopivaan kantoaineesen tai leimaan.
11. 10. Menetelmä näytteessä olevan EBV:n havaitsemi seksi, tunnettu siitä, että se käsittää sen, että saatetaan mainittu näyte kosketukseen minkä tahansa patenttivaatimuksista 3-5 mukaisen vasta-aineen kanssa, jonka jälkeen havaitaan muodostuneet immuunikompleksit, 10 minkä perusteella päätellään, sisältääkö näyte EBV:tä.
12. 11. Menetelmä tutkittavassa nesteessä olevien Ep-stein-Barr-virusta vastaan suunnattujen vasta-aineiden havaitsemiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 9 mukainen immunokemiallinen reagenssi saatetaan 15 kosketukseen tutkittavan nesteen kanssa ja havaitaan tutkittavassa nesteessä muodostuneet immuunikompleksit.
13. 12. Menetelmä tutkittavassa nesteessä olevan Ep-stein-Barr-viruksen havaitsemiseksi, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksen 9 mukainen immunokemi ai linen rea- 20 genssi saatetaan kosketukseen tutkittavan nesteen ja Ep- stein-Barr-virusta vastaan suunnattujen vasta-aineiden kanssa, minkä jälkeen havaitaan tutkittavassa nesteessä muodostuneet immuunikompleksit, minkä perusteella päätellään, sisältääkö näyte Epstein-Barr-virusta. .1 25 13. Testipakkaus patenttivaatimuksen 11 mukaisen menetelmän suorittamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää kiinteän faasin, johon patenttivaatimuksen 10 mukainen immunokemiallinen reagenssi on immobilisoitu ja välineet minkä tahansa mainitun immunokemiallisen reagenssin 30 ja Epstein-Barr-viruksen välisten immunokompleksien ha- * vaitsemiseksi näytteessä. 41 114781
14. 14. Testipakkaus patenttivaatimuksen 12 tai 13 mukaisen menetelmän suorittamiseksi, tunnettu siitä, että se käsittää kiinteän faasin, johon patenttivaatimuk-^ sen 9 mukainen immunokemiallinen reagenssi on immobilisoi- 5 tu ja välineet minkä tahansa muodostuneen immunokompleksin havaitsemiseksi. * i 1 •ψ · Λ 114781 42