ES2221922T3 - Peptidos del virus de epstein-barr y anticuerpos contra estos peptidos. - Google Patents

Abstract

Péptidos del virus de Epstein-Barr y anticuerpos contra estos péptidos. La presente invención se refiere a péptidos inmunoquímicamente reactivos con anticuerpos contra el virus de Epstein-Barr (EBV), a anticuerpos monoclonales contra estos péptidos, a líneas celulares capaces de producir anti-cuerpos monoclonales y a anticuerpos anti-idiotipo. La invención también se refiere a reactivos inmunológicos y a métodos para la detección de EBV o de anticuerpos anti-EBV. El EBV es un herpesvirus humano ubicuo que se descubrió por primera vez en asociación con la forma africana (endémica o e) del linfoma de Burkitt (BL). Posteriormente, se descubrió que el virus también estaba asociado con un carcinoma nasofaríngeo (NPC) y se demostró que era el agente causante de la mononucleosis infecciosa (IM). La infección normalmente se realiza durante la primera fase de la infancia, produciendo generalmente una manifestación subclínica, ocasionalmente con síntomas leves. Sin embargo, la infección durante la adolescencia o la edad adulta puede producir una IM caracterizada por la presencia de linfocitos atípicos en la periferia. La mayoría de estos linfocitos son linfocitos T; sin embargo, en su número se incluye una pequeña población de linfocitos B infectados por EBV. La infección de linfocitos B también puede realizarse in vitro. Tales células se transforman y proliferan indefinida-mente en cultivo y se han denominado ¿inmortalizadas¿, ¿infectadas latentemente¿ o ¿de crecimiento transformado¿. Que se sepa, todos los individuos que se infectan con EBV permanecen infectados latentemente durante su vida. Esto se refleja por la presencia continua a lo largo de la vida de pequeños números de células B transformadas positivas con respecto al genoma de EBV entre los linfocitos de sangre periférica circulante y el derramamiento continuo pero periódico de virus en la orofaringe.

Description

Péptidos del virus de Epstein-Barr y anticuerpos contra estos péptidos.

La presente invención se refiere a péptidos inmunoquímicamente reactivos con anticuerpos contra el virus de
Epstein-Barr (EBV), a anticuerpos monoclonales contra estos péptidos, a líneas celulares capaces de producir anticuerpos monoclonales y a anticuerpos anti-idiotipo. La invención también se refiere a reactivos inmunológicos y a métodos para la detección de EBV o de anticuerpos anti-EBV.

El EBV es un herpesvirus humano ubicuo que se descubrió por primera vez en asociación con la forma africana (endémica o e) del linfoma de Burkitt (BL). Posteriormente, se descubrió que el virus también estaba asociado con un carcinoma nasofaríngeo (NPC) y se demostró que era el agente causante de la mononucleosis infecciosa (IM). La infección normalmente se realiza durante la primera fase de la infancia, produciendo generalmente una manifestación subclínica, ocasionalmente con síntomas leves. Sin embargo, la infección durante la adolescencia o la edad adulta puede producir una IM caracterizada por la presencia de linfocitos atípicos en la periferia. La mayoría de estos linfocitos son linfocitos T; sin embargo, en su número se incluye una pequeña población de linfocitos B infectados por EBV. La infección de linfocitos B también puede realizarse in vitro. Tales células se transforman y proliferan indefinidamente en cultivo y se han denominado "inmortalizadas", "infectadas latentemente" o "de crecimiento transformado". Que se sepa, todos los individuos que se infectan con EBV permanecen infectados latentemente durante su vida. Esto se refleja por la presencia continua a lo largo de la vida de pequeños números de células B transformadas positivas con respecto al genoma de EBV entre los linfocitos de sangre periférica circulante y el derramamiento continuo pero periódico de virus en la orofaringe.

En la inmensa mayoría de los casos, la infección por EBV produce una enfermedad linfoproliferativa que puede ser temporalmente debilitadora, pero siempre es benigna y autolimitante. Sin embargo, en ciertos individuos inmunosuprimidos, el resultado puede ser una malignidad en estado avanzado. Esto se produce en individuos que se han inmunosuprimido intencionadamente, particularmente niños que reciben trasplantes de órganos que se tratan con ciclosporina A, o de forma oportunista, como en el caso de individuos infectados con VIH, o genéticamente, como en el caso de mujeres afectadas que llevan el gen XLP (síndrome linfoproliferativo asociado al cromosoma x). En estos casos, las malignidades resultantes proceden de la proliferación policlonal de células B infectadas por EBV. Además, en tales pacientes, se puede detectar una replicación epitelial incontrolada del virus en lesiones de leucoplaquia pilosa oral. De esta manera, la respuesta inmune juega un papel central en el control de la infección por
EBV.

La presencia de EBV en células o tejidos puede demostrarse por medio de la detección del genoma viral o la demostración de la proteína EBNA-1, el único producto proteico asociado con la latencia que se expresa universalmente en células infectadas por EBV.

Como se ha mencionado anteriormente, EBV es un miembro de los herpesvirus. Posee las siguientes propiedades estructurales:

- El genoma de EBV consta de una molécula de ADN bicatenaria lineal (172.000 pares de bases).

- El virión consta de un núcleo (proteínas y ADN) rodeado por una cápsida icosahédrica, y una envuelta de membrana que encierra la cápsida. La cápsida icosahédrica está constituida por decapsómeros hexaméricos y pentaméricos. La envuelta de membrana consta de una membrana de proteína/bicapa lipídica con salientes en forma de espiga en su superficie externa. El espacio entre la cápsida y la envuelta está relleno de una proteína amorfa, denominada tegumento.

- Como todos los herpesvirus, el EBV es capaz de establecer una infección latente a lo largo de la vida en su hospedador después de la infección primaria. Esta latencia representa un perfecto equilibrio entre el EBV y su hospedador humano, controlado por el sistema inmune de los hospedadores.

Hasta la fecha, la mayoría de los estudios bioquímicos y biológicos se han realizado en tres cepas prototipo de EBV, que son B95-8 (virus transformante producido en una línea de células de tití), P3HR1 (virus no transformante producido por una línea de células tumorales de linfoma de Burkitt) y Raji (virus latente en una línea de células tumorales de linfoma de Burkitt).

Durante los últimos años, se ha determinado la secuencia de ADN entera de la cepa del virus prototipo B95-8. El análisis de esta secuencia ha dado como resultado la identificación de más de 80 fases de lectura abiertas (Baer et al., 1984, Nature 310, pág. 207-211).

La biología del EBV plantea un problema especial a los investigadores porque sus características biológicas (infección latente) no se prestan al análisis clásico de los virus. Además, su serie de células y hospedadores se limitan eficazmente a linfocitos B humanos (y los de algunos primates superiores) y a células epiteliales que generalmente no son susceptibles de cultivo in vitro. Además, la ausencia de un tipo celular completamente permisivo, uno en el que se replique el virus líticamente, ha limitado gravemente la capacidad de producir grandes cantidades del virus.

Las moléculas de ADN de B95-8, y de aislados P3HR1 y Raji han sido los prototipos para un mapeo detallado por endonucleasas de restricción y para la clonación en plásmidos de Escherichia coli (E. coli) y en el bacteriófago lambda, y para la secuenciación de nucleótidos.

El genoma de EBV consta de una sola molécula de ADN bicatenaria construida con elementos de ADN únicos y repetidos en tándem. Cada extremo de la molécula de ADN contiene múltiples secuencias terminales que permiten la unión covalente y la circularización del genoma. En las partículas víricas, el genoma de EBV sólo es detectable en una forma lineal. Por el contrario, existe como un episoma circular dentro del núcleo de células infectadas de forma latente y ocasionalmente se integra en los cromosomas de la célula hospedadora.

Las secuencias repetidas internas, IR1 a IR4, separan el genoma de EBV en 5 regiones únicas. Las regiones U2 y U3 varían extensivamente entre diferentes aislados de EBV y, la primera se deleciona casi completamente en la cepa P3HR-1 de EBV.

La nomenclatura para las fases de lectura de EBV se basa en su posición en el genoma del virus. Los nombres empiezan con las iniciales del fragmento de restricción BamH1 o EcoR1 en el que empieza la expresión. La tercera letra del nombre es L o R, dependiendo de si la expresión es hacia la izquierda o hacia la derecha en el mapa convencional. (De esta forma, BLLF2 es la segunda fase de lectura hacia la izquierda que empieza en el fragmento de restricción BamH1 L).

La clasificación serológica de antígenos del virus en el ciclo de producción de EBV se basa en diferentes técnicas de fluorescencia.

Los antígenos detectados específicamente por medio de la técnica de inmunofluorescencia anti-complemento en el núcleo de células B infectadas latentemente fijadas (por ejemplo, células Raji) se clasifican como antígenos nucleares de Epstein-Barr (EBNA).

Tras la activación de la expresión del gen viral por factores químicos o virales, se detecta una clase de antígenos tempranos (EA) cuya síntesis no se bloquea por la inhibición de la síntesis de ADN viral. Dependiendo del tipo de agente de fijación usado (metanol o acetona), son detectables dos series distintas de EA, EA_{R} y BA_{D}. EA es detectable por inmunofluorescencia indirecta en citoplasma y núcleo de células inducidas. Tras el inicio de la síntesis de ADN viral (y dependiendo de ello), se sintetizan proteínas estructurales del virus (VCA) que se pueden detectar por inmunofluorescencia indirecta en el citoplasma y núcleo de células productoras de virus (por ejemplo, células P_{3}HR_{1}). En la superficie de células infectadas viables, inducidas para la producción de virus, se puede detectar una serie de antígenos (MA) por inmunofluorescencia indirecta. Estos antígenos también pueden encontrarse en la envuelta viral y son dianas importantes para la neutralización del virus.

La detección de anticuerpos específicos para EBV en sueros humanos puede realizarse rutinariamente por técnicas serológicas tales como las descritas por Heule y Heule (Human Pathology, 5, 551-565, 1974).

Basándose en los datos bioquímicos y de inmunofluorescencia, es posible distinguir cinco clases diferentes de moléculas de antígeno. Los diferentes polipéptidos virales se diseñan por su peso molecular, y no se ha establecido ninguna nomenclatura común para todas las proteínas de EBV para permitir su descripción especial.

Los cinco grupos diferentes de antígenos son:

A. El grupo de antígenos que se expresan durante una fase de latencia (EBNA y LMP).

B. El grupo de antígenos que son responsables de la activación del genoma y la inducción inicial de la replicación viral (IEA).

C. El grupo de antígenos que se inducen por productos del gen IEA y que se requieren para la replicación del ADN viral; estos antígenos son principalmente enzimas virales (EA).

D. El grupo de antígenos que son componentes estructurales de la partícula viral y se expresan posteriormente en el ciclo de replicación viral (VCA) después del inicio de la síntesis del ADN viral.

E. El grupo de antígenos que se expresan en la membrana celular de la célula infectada (MA).

Antígenos nucleares de Epstein-Barr (EBNA)

El antígeno nuclear de Epstein Barr 1 (EBNA-1), codificado en la fase de lectura BKRF 1, es la única proteína codificada por EBV expresada universalmente en todas las células asociadas con tumores e infectadas latentemente in vivo e in vitro y constituye una molécula diana importante para estudiar los mecanismos de replicación de ADN y activación de genes.

EBNA-1 se identificó por inmunotransferencia y radioinmunoelectroforesis en líneas celulares EBV-positivas, pero no en tres líneas celulares EBV negativas, utilizando cuatro sueros humanos EBV-positivos en comparación con dos sueros humanos EBV-negativos. Los antígenos identificados tenían diferentes pesos moleculares en las diferentes líneas celulares analizadas, que variaban de 65.000 a 73.000. Un antígeno que se fijaba el complemento se había purificado parcialmente más de 200 veces y se descubrió que se co-purificaba con el EBNA de 65-kDa identificado por inmunotransferencia. Como EBNA se define por inmunofluorescencia anti-complemento (ACIF), se sugirió que el antígeno de 65-kDa era un componente principal de EBNA.

El gen EBNA se mapeó transfectando células de ratón con el fragmento de enzimas de restricción BamHI K clonado de ADN de EBV. La transfección de una línea de fibroblastos de ratón con este fragmento, junto con un marcador selectivo dominante, condujo a la expresión estable de un antígeno nuclear identificado en ACIF con suero humano EBNA-positivo, pero no EBNA-negativo. En un estudio posterior, se descubrió que las células transfectadas con Bam K expresaban un polipéptido de 78 kDa que co-migraba con el polipéptido EBNA-1 de las células B95-8.

Otros estudios más recientes han revelado una región inmunodominante dentro de la región de repetición glicina-alanina, normalmente denominada p62 o p107, que es fuertemente reactiva con el suero humano. Sin embargo, se demostró que este fragmento gly-ala estaba contenido dentro de proteínas humanas normales y se descubrió que era la diana para auto-anticuerpos. Además, otros estudios han revelado que especialmente los anticuerpos IgM del suero de pacientes con infecciones activas por CMV, HSV o Toxoplasma muestran ocasionalmente reactividad cruzada con este péptido. Además, se demostró que un fragmento C-terminal de 28 kD que codifica AA 461-641 de EBNA-1, que se expresa en E. coli, era reactivo con anticuerpos de suero humano. Los demás estudios realizados hasta la fecha no han podido identificar fragmentos de la proteína EBNA-1 que puedan usarse para reemplazar la proteína EBNA-1 intacta en ensayos de diagnóstico.

El tamaño molecular de EBNA-1 puede usarse para la identificación de cepas (tipificación EBNO), ya que el tamaño de la región de repetición gly-ala puede mostrar una variación significativa entre las cepas virales individuales.

EBNA-1 se ha detectado inmunológicamente en células de linfoma de Burkitt, carcinoma nasofaríngeo y células de Reed-Sternberg encontradas en la enfermedad de Hodgkin.

Además, también se ha detectado EBNA en lesiones linfoproliferativas policlonales en transplantes y pacientes con SIDA, y es el primer marcador para la identificación del linfocitos B en cultivos celulares.

En la molécula de EBNA-1 se han identificado varios dominios funcionales, tales como el dominio de unión a ADN (Ori-P), el dominio de localización nuclear, el dominio de transactivación, el dominio de bucle de ADN y el dominio de dimerización. EBNA-1 ejerce su función de unión al ADN como una molécula homodimérica.

En el momento actual, la serodiagnosis específica de EBV se realiza por ensayos de inmunofluorescencia más bien subjetivos. El progreso a una diagnosis más sencilla y uniforme (por ejemplo, un ELISA) se ve impedido debido a que no es posible una producción voluminosa y purificación de antígenos virales usando líneas de células productoras de virus convencionales.

La única forma de conseguir esto sería usar uno o más antígenos de EBV preparados alternativamente. Estos antígenos de EBV podrían prepararse con técnicas de ingeniería genética o técnicas de péptidos sintéticos.

Para el desarrollo de un método específico y sensible para permitir realizar un diagnóstico fiable en diversas fases de la infección con EBV, tiene gran importancia identificar proteínas virales inmunodominantes y epítopos de las mismas.

La presente invención proporciona péptidos inmunoquímicamente reactivos con anticuerpos contra el virus de Epstein-Barr, que constan de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1.

Son realizaciones adicionales de la presente invención un péptido o péptidos que constan de una o más de las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID Nº: 2-6.

Los péptidos de acuerdo con la invención se consideran particularmente adecuados para uso en un método de diagnóstico para la determinación de la presencia de EBV o anticuerpos contra EBV en una muestra. Además, un péptido de acuerdo con la invención puede usarse en formas de dosificación farmacéuticas adecuadas en el tratamiento de una enfermedad relacionada con EBV. La preparación de vacunas obtenidas de esta manera que contienen un péptido o fragmento del mismo como ingredientes activos, es conocida para un especialista en la técnica.

A diferencia del EBV natural, los péptidos de acuerdo con la invención tienen la gran ventaja de que son de un origen no infeccioso seguro.

La invención también comprende fragmentos de dichos péptidos que son inmunoquímicamente reactivos con anticuerpos contra el virus de Epstein-Barr.

Las características específicas de dicha región peptídica de EBNA-1 hacen que sea accesible a anticuerpos tanto en la configuración nativa como en la configuración desnaturalizada de la proteína EBNA-1.

El término "péptido", como se usa en este documento, se refiere a una cadena molecular de aminoácidos con una actividad biológica, y no se refiere a una longitud específica del producto. De esta manera, entre otras, se incluyen proteínas, proteínas de fusión o péptidos oligopéptidos y polipéptidos. Si se requiere, los péptidos de acuerdo con la invención pueden modificarse in vivo o in vitro, por ejemplo por glicosilación, amidación, carboxilación o fosforilación. Por lo tanto, también se consideran parte de la presente invención variantes funcionales tales como, por ejemplo, sales de adición de ácidos, amidas, ésteres, y específicamente ésteres C-terminales, y derivados N-acilo de los péptidos de acuerdo con la invención. Se entenderá que para las proteínas o polipéptidos particulares incluidos en la presente invención, también pueden existir variaciones naturales. Estas variaciones pueden demostrarse por diferencias de aminoácidos en la secuencia global o por deleciones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de uno o más aminoácidos en dichas secuencias. Se han descrito sustituciones de aminoácidos a partir de las cuales puede esperarse que no alteren esencialmente las actividades biológicas e inmunológicas. Son reemplazos de aminoácidos entre aminoácidos relacionados o reemplazos que se han producido frecuentemente en la evolución, entre otros, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (véase Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5. suppl. 3). Basándose en esta información, Lipman y Pearson desarrollaron un método para una comparación rápida y sensible de proteínas (Science 277, 1435-1441, 1985) y para determinar la analogía funcional entre proteínas homólogas.

El término "fragmento", como se usa en este documento, significa una secuencia de aminoácidos que comprende una subsecuencia de un péptido de la invención. Dicho fragmento es un péptido que tiene uno o más determinantes inmunogénicos de la proteína EBNA-1. Los fragmentos pueden producirse, entre otras cosas, por escisión enzimática de moléculas precursoras, usando endonucleasas de restricción para el ADN y proteasas para los polipéptidos. Otros métodos incluyen la síntesis química de los fragmentos o la expresión de fragmentos peptídicos por fragmentos de ADN.

Pueden encontrarse fragmentos inmunogénicos adecuados de un péptido de acuerdo con la invención que contiene uno o más epítopos por medio del método descrito en la Solicitud de Patente WO 86/06487, Geysen, H.M. et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. 81, 3998-4002, 1984), Geysen, H.M. et al. (J. Immunol. Meth. 102, 259-274, 1987) basándose en el denominado método pepscan, donde se sintetiza una serie de péptidos parcialmente solapantes correspondientes a secuencias parciales del polipéptido completo en consideración, y se investiga su reactividad con anticuerpos.

Además, varias regiones de los péptidos pueden ser epítopos diseñados basándose en consideraciones teóricas, aunque el valor predictivo de estas consideraciones teóricas está limitado. La determinación de estas regiones se basa en una combinación de los criterios de hidrofilia de acuerdo con Hopp y Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 3824-3828, 1981) y los aspectos de la estructura secundaria de acuerdo con Chou y Fasman (Advances in Enzymology 47, 45-148, 1987).

Los péptidos preferidos de acuerdo con la invención son péptidos que constan de al menos una de las secuencias representadas en las SEC ID Nº: 2 a 6.

Los péptidos que tienen las secuencias mostradas en la SEC ID Nº: 2-4 son fragmentos del péptido con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1 y corresponden a los aminoácidos número 368-391, 395-425 y 419-449 de la secuencia de EBNA-1 respectivamente. Un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 5 es un péptido que comprende una combinación de fragmentos (SEC ID Nº: 2-4) de la secuencia de la SEC ID Nº: 1.

La preparación de los péptidos de acuerdo con la invención se realiza por medio de uno de los métodos de química orgánica conocidos para la síntesis de péptidos o con la ayuda de técnicas de ADN recombinante.

Se considera que los métodos de química orgánica para la síntesis de péptidos incluyen el acoplamiento de los aminoácidos requeridos por medio de una reacción de condensación, en fase homogénea o con la ayuda de una denominada fase sólida.

La reacción de condensación puede realizarse como se indica a continuación:

a)

condensación de un compuesto (aminoácido, péptido) con un grupo carboxilo libre y otros grupos reactivos protegidos con un compuesto (aminoácido, péptido) con un grupo amino libre y otros grupos reactivos protegidos, en presencia de un agente de condensación;

b)

condensación de un compuesto (aminoácido, péptido) con un grupo carboxilo activado y otros grupos de reacción libres o protegidos con un compuesto (aminoácido, péptido) con un grupo amino libre y otros grupos reactivos libres o protegidos.

La activación del grupo carboxilo puede tener lugar, entre otras cosas, por conversión del grupo carboxilo en un haluro de ácido, azida, anhídrido, imidazolida o un éster activado, tal como el éster de N-hidroxi-succinimida, N-hidroxi-benzotriazol o p-nitrofenilo.

Los métodos más comunes para las reacciones de condensación anteriores son: el método de carbodiimida, el método de azida, el método de anhídrido mixto y el método que usa ésteres activados, tal como se describe en The Peptides Analysis, Synthesis, Biology Vol. 1-3 (Ed. Gross, E. y Meienhofer, J.) 1979, 1980, 1981 (Academic Press, Inc.).

La preparación de fragmentos adecuados de péptidos mencionados anteriormente de acuerdo con la invención usando la "fase sólida" se describe, por ejemplo, en J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149 (1963) y Int. J. Peptide Protein Res. 35, 161-214 (1990). El acoplamiento de los aminoácidos del péptido a preparar normalmente empieza por el lado del extremo carboxilo. Por este método, se necesita una fase sólida sobre la que hay grupos reactivos o sobre la que pueden introducirse tales grupos. Éste puede ser, por ejemplo, un copolímero de benceno y divinilbenceno con grupos clorometilo reactivos, o una fase sólida polimérica que sea hecho reactiva con una función hidroximetilo o amina.

Una fase sólida particularmente adecuada es, por ejemplo, la resina de alcohol p-alcoxibencílico (resina de 4-hidroxi-metil-fenoxi-metil-copoliestireno-1% de divinilbenceno) descrita por Wang (1974) J. Am. Chem. Soc. 95, 1328. Después, de la síntesis, los péptidos pueden separarse de esta fase sólida en condiciones suaves.

Después de la síntesis de la secuencia de aminoácidos deseada, se realiza la separación del péptido de la resina, por ejemplo, con ácido trifluorometanosulfónico o con ácido metanosulfónico disuelto en ácido trifluoroacético. El péptido también puede retirarse del soporte por transesterificación con un alcohol inferior, preferiblemente metanol o etanol, en cuyo caso se forma directamente un éster de alquilo inferior del péptido. De forma similar, la separación con la ayuda de amoniaco proporciona la amida de un péptido de acuerdo con la invención.

Los grupos reactivos que pueden no participar en la reacción de condensación, como se indica, están protegidos eficazmente por grupos que pueden retirarse de nuevo muy fácilmente por hidrólisis con la ayuda de un ácido, base o por reducción. De esta manera, un grupo carboxilo puede protegerse eficazmente, por ejemplo, por esterificación con metanol, etanol, butanol terciario, alcohol bencílico o alcohol p-nitrobencílico y aminas unidas a un soporte sólido.

Los grupos que pueden proteger eficazmente un grupo amino son los grupos etoxicarbonilo, benciloxicarbonilo, t-butoxicarbonilo (t-boc) o p-metoxi-benciloxicarbonilo, o un grupo ácido derivado de un ácido sulfónico, tal como el grupo benceno-sulfonilo o p-tolueno-sulfonilo, pero también pueden usarse otros grupos, tales como grupos arilo o aralquilo sustituidos o no sustituidos, por ejemplo, bencilo y trifenilmetilo, o grupos tales como orto-nitrofenil-sulfenilo y 2-benzoil-1-metil-vinilo. Un grupo \alpha-amino protector particularmente adecuado es, por ejemplo, el grupo 9-fluorenil-metoxicarbonil (Fmoc) sensible a bases [Carpino & Han (1970) J. Amer. Chem. Soc. 92, 5748].

Puede encontrarse una lista más amplia de posibles grupos protectores en The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1 - 9 (Eds. Gross, Udenfriend y Meienhofer) 1979 - 1987 (Academic Press, Inc.).

También es necesario proteger el grupo e-amino de la lisina y aconsejable para el grupo guanidina de la arginina. Son grupos protectores habituales a este respecto un grupo Boc para la lisina y un grupo Pmc o Pms o Mbs o un grupo Mtr para la arginina.

Los grupos protectores pueden separarse por diversos métodos convencionales, dependiendo de la naturaleza del grupo particular, por ejemplo con la ayuda de ácido trifluoroacético o por reducción suave, por ejemplo, con hidrógeno y un catalizador, tal como paladio o con HBr en ácido acético glacial.

Como ya se ha indicado anteriormente, los péptidos de acuerdo con la invención pueden prepararse de forma similar con la ayuda de técnicas de ADN recombinante. Esta posibilidad tiene importancia particularmente cuando el péptido se incorpora en una secuencia de repetición ("en tándem") o cuando el péptido puede prepararse como un constituyente de una proteína o polipéptido (mucho mayor) o como una proteína de fusión con, por ejemplo, (parte de) la \beta-galactosidasa. Por lo tanto, este tipo de péptidos de forma similar está dentro del alcance de la invención. Para este fin, como constituyente de un ADN recombinante, se usa una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de acuerdo con la invención y que, además, carece sustancialmente de segmentos de ácido nucleico que, en el genoma de EBV natural, flanquean la secuencia de ácido nucleico indicada anteriormente.

Este último método implica la preparación del péptido deseado expresando un polinucleótido recombinante con una secuencia de ácido nucleico que codifica uno o más de los péptidos en cuestión en un microorganismo adecuado como hospedador.

Una secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de acuerdo con la presente invención puede unirse a diversas secuencias de ADN que efectúan la replicación con las que no está asociado o unido en la naturaleza, dando como resultado una denominada molécula de vector recombinante que puede usarse para la transformación de un hospedador adecuado. Las moléculas de vector recombinante útiles preferiblemente proceden, por ejemplo, de plásmidos, bacteriófagos, cósmidos o virus.

Los vectores específicos o vehículos de clonación que pueden usarse para clonar secuencias de ácidos nucleicos se conocen en la técnica e incluyen, entre otros, vectores plasmídicos tales como péptidos pBR322, los diversos plásmidos pUC, pGEM y Bluescript, bacteriófagos, por ejemplo, kgt-Wes, Charon 28 y los fagos derivados de M13 o vectores virales tales como SV40, adenovirus o poliomavirus (véase también Rodríguez, R.L. y D.T. Denhardt, ed., Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Butterworths, 1988; Lenstra, J.A. et al., Arch. Virol. 110, 1-24, 1990). Los métodos a usar para la construcción de una molécula de vector recombinante son conocidos para los especialistas en la técnica y, entre otros, se indican en Maniatis, T. et al. (Molecular Cloning A Laboratory Manual, segunda edición; Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Por ejemplo, la inserción de la secuencia de ácido nucleico que codifica un péptido de acuerdo con la invención en un vector de clonación puede conseguirse fácilmente cuando tanto los genes como el vehículo de clonación deseado se han cortado con la misma o mismas enzimas de restricción, con lo que se producen extremos de ADN complementarios.

Las moléculas de vector recombinante pueden contener además una o más actividades marcadoras que pueden usarse para seleccionar los transformantes deseados, tal como resistencia a ampicilina y a tetraciclina en pBR322, tal como, por ejemplo, resistencia a ampicilina y el \alpha-péptido de la \beta-galactosidasa en pUC8.

Por supuesto, debe entenderse que las secuencias de nucleótidos insertadas en el sitio seleccionado del vector de clonación pueden incluir sólo un fragmento de la secuencia de ácido nucleico completa que codifica los péptidos de acuerdo con la invención siempre que el hospedador transformado produzca un polipéptido que tiene al menos uno o más determinantes inmunogénicos.

También forman parte de la presente invención anticuerpos, dirigidos a un péptido de acuerdo con la invención.

Los péptidos preparados y descritos anteriormente pueden usarse para producir anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra péptidos de acuerdo con la invención pueden producirse fácilmente por un especialista en la técnica.

Antes de la presente invención, no ha habido ningún informe de anticuerpos generados contra este fragmento peptídico específico de EBNA-1. Ningún especialista en la técnica hasta este momento conocerá la disponibilidad de los epítopos para unir los anticuerpos.

Los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la presente invención, por lo tanto, proporcionan un nuevo medio para el diagnóstico de la infección por EBV.

Son anticuerpos preferidos de acuerdo con la invención anticuerpos monoclonales que tienen la misma reactividad con EBNA-1 que los anticuerpos monoclonales producidos por la línea celular de hibridoma depositada en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down (UK), con el número de depósito Nº 92071613.

Se generó un nuevo anticuerpo (monoclonal) de acuerdo con la invención, que se denomina EBNA.OTIx, inmunizando ratones con la proteína EBNA-1 derivada de Baculovirus que carecía de la región de repetición Gly-Ala. Con fragmentos de deleción de EBNA-1 expresado en E. Coli, se localizó el epítopo de unión de EBNA.OT1x en la posición 430-438 próxima a la supuesta señal de localización nuclear (secuencia representada en la SEC ID Nº: 6). EBNA.OT1x se ha usado en estudios de inmunoprecipitación. EBNA.OT1x también se une al EBNA-1 desnaturalizado usado en estudios de transferencia de Western e inmunofluorescencia en células permeabilizadas fijas (FACS) usando técnicas de detección indirecta, y reacciona con EBNA-1 de una amplia diversidad de cepas de virus y células diana infectadas con virus. EBNA.OT1x se une a EBNA-1 de múltiples aislados de EBV y puede usarse en la tinción inmunohistoquímica en una diversidad de tejidos tumorales humanos.

También forman parte de la presente invención líneas de células inmortalizadas capaces de excretar anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención.

La preparación de líneas celulares que producen anticuerpos monoclonales puede realizarse, por ejemplo, por la técnica de Kohler y Milstein (Kohler y Milstein inventaron las técnicas que dieron como resultado la formación de hibridomas productores de anticuerpos monoclonales (G. Kohler y C. Milstein, 1975, Nature 256:495-497; 1976, Eur. J. Immunol. 6:511-519)), transformación con virus de Epstein-Barr, o una técnica de transformación directa de linfocitos B con ADN oncogénico, o una fusión directa de linfocitos B humanos con una molécula de fusión que es un mieloma híbrido humano o ratón-humano, o una fusión directa de una línea de células B transformadas con EBV con dichas líneas de células de mieloma.

Una línea de células preferida de acuerdo con la invención es la línea celular depositada en la European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down (UK) con el número de depósito 92071613.

Esta línea de células de hibridoma se produjo por la fusión de una célula de mieloma con un linfocito derivado de un ratón previamente inoculado con un péptido EBNA-1 de acuerdo con la invención. (Un péptido con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 5).

La invención también comprende el uso de anticuerpos contra dicho péptido en métodos inmunológicos y bioquímicos destinados a detectar la proteína de longitud entera en un fluido de ensayo o en una muestra de tejido.

Hasta ahora, la detección de EBNA-1 en células infectadas por EBV se realizó usando la técnica de inmunofluorescencia anti-complemento (ACIF) usando suero humano como fuente de anticuerpo anti-EBNA-1. Las técnicas de inmunofluorescencia indirecta no pudieron detectar anticuerpos de unión a EBNA-1 en el suero humano. El ACIF se complica por la etapa de incubación del complemento extra y la inestabilidad del propio complemento. Además, frecuentemente se encuentran reacciones falso positivas y falso negativas cuando no se usan de manera apropiada los reactivos usados para ACIF.

El anticuerpo EBNA.OT1x, por otra parte, elimina esos problemas y permite la detección sensible de EBNA-1 en una diversidad de células infectadas por EBV por medio de inmunofluorescencia indirecta. La presencia de EBNA-1 en el núcleo celular es la marca de infección por EBV latente en las células, tanto in vivo como in vitro.

EBNA.OTxl es capaz de penetrar en las células permitiendo de esta manera la detección de EBNA-1 intracelularmente en células infectadas por EBV. El anticuerpo EBV-OT1x puede aplicarse en análisis de separación celular por fluorescencia (FACS) de tinción nuclear de células infectadas por EBV permeabilizadas por fijación con formalina-acetona tamponada (BFA) como se describe por Slaper-Cortenbach et al. (Blood, 72, 1639-1644, 1988). Este método tiene la ventaja de ser sencillo y rápido y de permitir la detección de linfocitos B infectados por EBV cultivados in vitro. Esta tecnología también puede aplicarse a la detección y control de enfermedades linfoproliferativas asociadas con EBV y linfoma.

Los anticuerpos, tanto monoclonales como policlonales, dirigidos contra péptidos de acuerdo con la invención son muy adecuados en el diagnóstico e inmunocitoquímica para la detección in situ en muestras de tejidos, mientras que los anticuerpos que son neutralizadores son muy útiles en inmunoterapia pasiva.

Los anticuerpos de acuerdo con la invención también pueden usarse en la tipificación por EBNO de diferentes aislados de EBV. Como se ha mencionado anteriormente, los aislados de EBV (cepas) puede caracterizarse por el peso molecular de la molécula de EBNA-1 producida, debido a la variación extensiva en longitud de la región de repetición glicina-alanina en esta proteína. A diferencia de los reactivos descritos previamente, que son principalmente suero humano, el anticuerpo monoclonal EBNA.OT1x es un reactivo estable y reproducible, detectando un epítopo de unión que está muy conservado dentro de la familia de EBV, que es muy adecuado para tipificación por EBNO de cepas de EBV.

Parte de la invención también es la "humanización" de los anticuerpos monoclonales en cuestión. En la técnica se conocen técnicas para inducir los anticuerpos monoclonales "humanizados".

Especialmente, los anticuerpos monoclonales pueden usarse para inducir anticuerpos anti-idiotipo. En la técnica se conocen técnicas para inducir anticuerpos anti-idiotipo.

Los anticuerpos anti-idiotipo reactivos con los anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención, como se han descrito anteriormente, forman parte de la presente invención.

Los anticuerpos anti-idiotipo son anticuerpos dirigidos contra la parte variable de inmunoglobulinas. Una subpoblación de anticuerpos anti-idiotipo se conoce como "anti-idiotipo \beta" o "imágenes internas". Estos anticuerpos anti-idiotipo \beta tienen un parecido estructural o tridimensional con el antígeno (Uytdehaag, F.G.C.M. et al. Immunol. Rev. 90; 93-113; 1986). Este tipo de anticuerpos anti-idiotipo se usa ampliamente como vacuna contra enfermedades infecciosas en modelos animales (Hiernaux J.R.; Infect. Immun.; 56; 1407-1413; 1988, Kennedy, R.C. et al.; Science 232; 220-223; 1986). Para uso en ensayos, los anticuerpos anti-idiotipo pueden inducirse en grandes cantidades.

En la técnica se conocen técnicas para inducir anticuerpos anti-idiotipo. Por ejemplo, pueden obtenerse anticuerpos anti-idiotipo de acuerdo con la invención inmunizando ratones BALB/c con anticuerpos monoclonales, acoplados a KLH con glutaraldehído de acuerdo con procedimientos bibliográficos convencionales, mezclados con adyuvante completo de Freund. Las células de bazo de estos ratones pueden inmortalizarse y los hibridomas obtenidos de esta manera pueden seleccionarse con respecto a la producción de anticuerpos anti-idiotipo. La selección de los hibridomas puede realizarse, por ejemplo, uniendo anticuerpos monoclonales de acuerdo con la invención a una fase sólida (pocillos de placas de microtitulación) e incubando la fase sólida con el sobrenadante de cultivo de hibridomas en crecimiento. Puede añadirse un péptido EBV acoplado a peroxidasa de rábano picante (HRP). La presencia de anticuerpos anti-idiotipo en el sobrenadante de cultivo después se indicará por la inhibición de la unión de este conjugado peptídico a los anticuerpos monoclonales aplicados como un recubrimiento sobre la fase sólida.

Los anticuerpos anti-idiotipo pueden usarse, por ejemplo, para inhibir la unión de antígenos de EBV humano y/o animal en un inmunoensayo usando anticuerpos contra EBV. Como alternativa, pueden usarse anticuerpos anti-idiotipo como agente mimético del reactivo inmunoquímico mencionado más adelante en este documento.

Dichos anticuerpos anti-idiotipo también son útiles para el diagnóstico y tratamiento de EBV, así como el para el esclarecimiento de regiones epitópicas importantes de antígenos de EBV.

También forma parte de la presente invención un reactivo inmunoquímico que comprende uno o más péptidos o anticuerpos de acuerdo con la invención.

La expresión "reactivo inmunoquímico" de acuerdo con la invención normalmente consta de uno o más péptidos de acuerdo con la invención y un soporte adecuado o una sustancia de marcaje.

Los soportes que pueden usarse son, por ejemplo, la pared interna de un pocillo de microensayo o una cubeta, un tubo o capilar, una membrana, un filtro, una tira de ensayo o la superficie de una partícula tal como, por ejemplo, una partícula de látex, un eritrocito, un sol colorante, un sol metálico o compuesto metálico como partícula de sol, una partícula de soporte tal como BSA o KLH.

Las sustancias de marcaje que pueden usarse son, entre otras, un isótopo radiactivo, un compuesto fluorescente, una enzima, un sol colorante, sol metálico o compuesto metálico como partícula de sol.

En un método para la detección de anticuerpos dirigidos contra EBV en una muestra, un reactivo inmunoquímico de acuerdo con la invención se pone en contacto con la muestra. Después de esto, se detecta la presencia de complejos inmunes formados entre el péptido y los anticuerpos en la muestra y, por medio de esta detección, se conoce la presencia de anticuerpos EBV en la muestra y puede determinarse cuantitativamente.

Dependiendo de la naturaleza y de las características adicionales del reactivo inmunoquímico, la reacción inmunoquímica que tiene lugar es una denominada reacción de sándwich, una reacción de aglutinación, una reacción competitiva o una reacción de inhibición.

Para la detección de EBV en una muestra, un reactivo inmunoquímico de acuerdo con la invención que contiene uno o más péptidos de acuerdo con la invención puede ponerse en contacto con la muestra y puede detectarse la presencia de complejos inmunes formados y, a partir de esto, puede determinarse la presencia de EBV en una muestra.

Un método particularmente adecuado para la detección de EBV en una muestra se basa en una reacción competitiva entre un péptido de acuerdo con la invención que dispone de una sustancia marcadora y un antígeno de EBV (presente en la muestra), con lo que el péptido y el antígeno compiten con el anticuerpo dirigido contra EBV unido a un soporte sólido.

La invención también comprende un método para la detección del virus de Epstein-Barr en una muestra, caracterizado porque un anticuerpo de acuerdo con la invención se pone en contacto con una muestra tras lo cual se detecta la presencia de complejos inmunes formados, que es una medida de la presencia del virus de Epstein-Barr en la muestra.

Un kit de ensayo de acuerdo con la invención comprende, como constituyente esencial, un reactivo inmunoquímico como se ha descrito anteriormente. Para realizar una reacción de sándwich para la detección de anticuerpos contra EBV, el kit de ensayo puede comprender, por ejemplo, el péptido de acuerdo con la invención aplicado como un recubrimiento sobre un soporte sólido, por ejemplo, la pared interna de un pocillo de microensayo, y un péptido marcado de acuerdo con la invención o un anticuerpo marcado.

Para realizar una reacción competitiva, el kit de ensayo puede comprender un péptido de acuerdo con la invención aplicado como un recubrimiento sobre un soporte sólido, y un anticuerpo marcado dirigido contra EBV, preferiblemente un anticuerpo monoclonal dirigido contra dicho péptido.

En una reacción de aglutinación, el kit de ensayo comprende un reactivo inmunoquímico que puede comprender un péptido de acuerdo con la invención aplicado como un recubrimiento en partículas o soles.

Otra realización de un kit de ensayo es, por ejemplo, el uso de un péptido marcado de acuerdo con la invención como reactivo inmunoquímico en una reacción competitiva con un antígeno contra EBV para detectar un sitio de unión en el anticuerpo dirigido contra EBV, que se aplica como un recubrimiento sobre un soporte sólido.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: resultados del análisis pepscan con sueros humanos. En el eje X se indican las posiciones de partida relativas de cada péptido 12-mero individual en la secuencia de EBNA-1, de tal forma que "0" representa el péptido 12-mero que empieza en AA 348 y así sucesivamente. En el eje Y se indican las unidades de absorbancia relativa a 450 nm.

La línea nº 1 representa la inmunorreactividad de un suero humano negativo para EBV hacia los péptidos 12-meros respectivos.

La línea nº 2-6 representa la reactividad inmune de sueros humanos positivos para EBV hacia los péptidos 12-meros.

Figura 2: reactividad ELISA (densidad óptica a 450 nm) de 46 muestras de suero humano en las que se ha ensayado la reactividad de IgG contra péptidos sintéticos seleccionados derivados de la proteína EBNA-1.

\Delta indica suero negativo por medio de un análisis serológico convencional

\Box indica suero positivo por medio de un análisis serológico convencional

X indica suero positivo por inmunotransferencia sólo para EBNA-1.

\Box* indica sueros sin anticuerpos anti EBNA-1 detectables por inmunotransferencia pero, por lo demás, EBV-seropositivos (es decir anti-VCA).

A = péptido 348-369

B = péptido 368-387

C = péptido 394-420

D = péptido 424-452

E = péptido Gly-Ala

F = combi-péptido

G = EBNA-1 Baculo

Figura 3: resultados del análisis PEPSCAN usando anticuerpos monoclonales de ratón y sueros de conejo. En el eje X se indican las posiciones de partida relativas de cada péptido 12-mero individual en la secuencia de EBNA-1, de tal forma que "0" representa el péptido 12-mero que empieza en el AA 348 y así sucesivamente. En el eje Y se indican las unidades de absorbancia relativa a 450 nm.

La línea 1 representa la reactividad de un anticuerpo monoclonal anti EBV VCA p40 (EBV.OT41A) hacia los péptidos derivados de EBNA-1, usado como control negativo.

La línea 2-4 representa la reactividad del anticuerpo monoclonal de ratón anti-EBNA-1 EBNA.OTIx en diferentes concentraciones (5 \mug/ml, 10 ng/ml y 1 ng/ml respectivamente).

La línea 5 representa la reactividad de suero de conejo no inmunizado.

La línea 6 indica la reactividad de suero de conejo inmunizado con EBNA-1 recombinante.

Figura 4: inmunofluorescencia indirecta para la detección de EBNA-1 en células infectadas con EBV usando el anticuerpo monoclonal EBNA.OT1x. A: células X50-7, infectadas de forma latente con células EBV. B: HH514.c16 en las que se ha inducido de la expresión de EBV mezcladas en una proporción 1:1 con células BJAB EBV nega-
tivas.

Figura 5: análisis FACS de la tinción de EBNA-1 intranuclear en una diversidad de células linfoides y líneas celulares:

A: Análisis de células Jurkat EBV negativas,

B: Análisis de células de linfoma de Burkitt humanas EBV positivas (Daudi),

C: Análisis de linfocitos de sangre periférica procedentes de un donante seronegativo para EBV,

D: Análisis de linfocitos B humanos transformados con EBV policlonales,

E y F: Análisis de células B clonadas establecidas (EBV-positivas).

El eje Y representa el número de células contadas, mientras que el eje X representa la intensidad de fluorescencia por célula.

La línea de trazos de cada gráfico representa el anticuerpo de control. (anti HIV-p24).

Figura 6:

A: Resultados de tipificación por EBNO de diferentes cepas de EBV con el anticuerpo monoclonal EBNA.OT1x

B: Resultados de la tipificación por EBNO de diferentes cepas de EBV con suero humano.

1 = BJAB

2 = CR+B95.8

3 = CR+QIMR-WIL

4 = PB-LCL

5 = CR+BL72

6 = CR+Mwika

7 = CR+AG876

8 = CR-Ambobi

9 = CR + WW1

10 = CR + WW2

La invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1 Localización de dominios inmunorreactivos por PEPSCAN

Se sintetizaron péptidos con una longitud de 12 aminoácidos (AA) y un solapamiento de 11 AA de la secuencia de AA de ORF, BKRF_{1}, posiciones 348-470, por medio de una síntesis de péptidos en fase sólida automática sobre púas de polietileno activadas químicamente como se describe originalmente por Geijsen et al. (P.N.A.S., USA, 83, 3998-4002, 1984).

La inmunorreactividad para anticuerpos específicos para EBV se determinó como se describe por Middeldorp y Meloen (J. Virol. Meth. 21, 147-159, 1988). Los resultados de tal análisis PEPSCAN para 6 sueros humanos individuales se muestran en la figura 1.

A partir de esta figura puede verse que se encuentran regiones reactivas con los péptidos 12-meros empezando en el AA20-31, 43-65, 74-85 y 90-98, representado AA 372-381, 391-413, 422-433 y 438-446 en la secuencia de EBNA-1 respectivamente. Se encontraron reactividades similares con series adicionales de sueros humanos. No se encontró ninguna reacción significativa cuando se usaron sueros EBV seronegativos, como se indica por la línea número 1 en la figura 1.

Ejemplo 2 Selección de péptidos sintéticos inmunorreactivos

A continuación se indica la selección de péptidos sintéticos, derivados de la proteína EBNA-1 codificada por BKRF_{1}, por un análisis informático y PEPSCAN, y el análisis de la inmunorreactividad de estos péptidos con sueros de donantes humanos normales.

Se obtuvieron péptidos sintéticos por síntesis en fase sólida convencional usando la bioquímica t-BOC. Se seleccionaron péptidos del fragmento AA 348-470 de la proteína EBNA-1 codificada por BKRF_{1} basándose en la alta antigenicidad prevista usando el programa informático "índice antigénico" ("antigenic index") desarrollado por Jameson y Wolf (CABIOS 4, 181-186, 1988) [basándose en esto, se seleccionaron los péptidos 348-369 y 368-387] o basándose en la alta reactividad de antígeno funcional en PEPSCAN como se describe en el ejemplo 1 [basándose en esto se seleccionaron los péptidos 394-420 y 424-452].

Además, se obtuvo un combi-péptido que representa una combinación de los cuatro dominios más reactivos (B-E en la figura 1) identificados por PEPSCAN. La secuencia de este combi-péptido se representa en la SEC ID Nº: 5.

Para el control, se usó el péptido copolimérico de glicina-alanina P107 como se describe por A. Linde et al. (J. Infect. Dis., 161, 903-910, 1990). Este péptido representa un dominio inmunorreactivo publicado previamente de la proteína EBNA-1. Además, se usó una forma recombinante de la proteína EBNA-1, que contenía la secuencia de EBNA-1 de longitud complete excepto el dominio de glicina-alanina. Esta proteína recombinante se purificó a partir de células de insecto infectadas con Baculovirus rec. como se describe por Frappier y O'Donnell (J. Biol. Chem., 266, 7819-7826, 1991).

Los péptidos y proteínas descritos anteriormente se aplicaron como un recubrimiento sobre la fase sólida; los pocillos de placas de microtitulación de poliestireno, a 1 \mug por ml en tampón NaHCO_{3} 0,05 M de pH 9,6 durante una noche a 4ºC. Después de lavar dos veces con solución salina tamponada con fosfato a pH 7,4 (PBS), los pocillos se rellenaron con 100 \mul de suero humano, diluido 1:100 en PBS que contenía Tween-20 (PBST) al 0,05% y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Después de 3 lavados con PBST, se añadieron anticuerpos IgG de oveja anti-IgG humana marcados con HRP a la dilución apropiada en PBST y se incubaron durante 1 hora a 37ºC. Después de tres lavados con PBST, se detectó la actividad enzimática unida usando TMB como sustrato. La reacción se detuvo a los 30 minutos añadiendo 100 \mul de H_{2}SO_{4} 1 M. La absorbancia de midió a 450 nm usando un fotómetro Multiscan. Los sueros se ensayaron con respecto a la presencia de anticuerpos contra EBV usando una serología de inmunofluorescencia convencional o un análisis de inmunotransferencia como se describe por Middeldorp y Herbrink (J. Virol. Meth. 21, 133-146, 1988).

La figura 2 muestra los resultados de experimentos ELISA usando los reactivos EBNA-1 respectivos aplicados como un recubrimiento sobre la fase sólida y un panel de 36 sueros EBV-seropositivos (D) y 10 sueros EBV-seronegativos (\Delta). En esta figura puede verse que los sueros que no contenían anticuerpos detectables contra EBNA-1 por inmunotransferencia eran negativos con todos los péptidos derivados de EBNA excepto con el combi-péptido y la proteína EBNA-1 derivada de Baculo.

Por los experimentos descritos anteriormente, es evidente que las predicciones informáticas basadas en el programa "índice antigénico" no tienen ningún valor predictivo con respecto a la inmunogenicidad hacia sueros de individuos infectados de forma natural, ya que casi todos los sueros son negativos con los péptidos altamente cargados 348-369 y 368-387.

Los péptidos seleccionados basándose en PEPSCAN muestran una buena reactividad con el 80-90% de los sueros para los péptidos 349-420 (combinación de dominios B+C de la figura 1) y 424-452 (combinación de dominio D+E). Sorprendentemente, el combi-péptido muestra una reactividad positiva con el 100% de los sueros EBV-seropositivos ensayados. Los sueros EBV-seronegativos no muestran ninguna reactividad con el combi-péptido, mientras que uno de tales sueros mostró una reacción falsa positiva con la proteína EBNA-1 derivada de Baculo.

Ejemplo 3 Localización de epítopos inmunorreactivos de EBNA-1 usando anticuerpos monoclonales de ratón

El procedimiento usado para la localización de epítopos inmunorreactivos en el fragmento 348-470 de EBNA-1 usando anticuerpos monoclonales de ratón y sueros de conejo son como ya se han descrito en el ejemplo 1 para la localización de epítopos usando sueros humanos.

La unión de anticuerpos de ratón a los péptidos unidos a púas se midió usando IgG de oveja anti-ratón marcada con peroxidasa, mientras que la unión a anticuerpos de conejo se midió usando anticuerpo de oveja anti-conejo marcado con peroxidasa.

Los resultados se muestran en la figura 3. Por estos resultados puede verse que los anticuerpos monoclonales no dirigidos específicamente a las proteínas EBNA (anti EBV VCA-p40 o suero de conejo no inmunizado) no reaccionan con ninguno de los péptidos EBNA-1 ensayados.

El anticuerpo monoclonal EBNA.OT1x reconoce un epítopo en AA420-445 cuando se usa a alta concentración, que se restringe con la dilución del anticuerpo a un epítopo en AA430-438. El suero de conejo 121-3, inducido por inmunización con la proteína EBNA-1 derivada de Baculo, reconoce tres epítopos en la región de EBNA-1 analizada.

Ejemplo 4 Inmunofluorescencia indirecta para la detección de EBNA-1 en células infectadas con EBV, usando EBNA.OT1x

Células X50-7, infectadas de forma latente con EBV, se fijaron con acetona-metanol (1:1) en portaobjetos de vidrio de 12 pocillos teñidos con anticuerpo EBNA.OT1x a 2 \mug/ml en solución salina tamponada con fosfato pH 7,4 (PBS) que contenía un 1% de albúmina de suero bovino (BSA) durante 1 hora a 37ºC. Después de cuatro lavados con PBS, se añadió la IgG de conejo anti-ratón marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC), se diluyó en PBS + BSA al 1% y se incubó durante una 1 hora a 37ºC. Después de cuatro lavados más con PBS, se añadió anticuerpo de cabra anti-conejo marcado con FITC y se incubó como se ha indicado anteriormente. Finalmente, después de cuatro lavados con PBS, los portaobjetos se cubrieron con fluido de montaje (glicerol al 50% pH 9,0) y se sellaron con un cubreobje-
tos.

B: se mezclaron células HH514.c16, un clon superinducible de la línea de células productoras de EBV P_{3}HR_{1}, inducidas para la expresión de EBV usando TPA y butirato durante 6 días, en una proporción 1:1, con células BJAB EBV-negativas y se fijaron en portaobjetos de vidrio de 12 pocillos usando acetona al 100%. Se añadió EBNA.OT1x como se describe en el apartado A y, después de cuatro lavados con PBS, se añadió F(ab) de cabra anti-ratón-FITC, diluido de manera apropiada en PBS + BSA al 1%, y la mezcla se incubó a 37ºC durante 1 hora. Después de 4 lavados con PBS, los portaobjetos se cubrieron con fluido de montaje y se sellaron con un cubreobjetos.

Todas las incubaciones (en A y B) se realizaron en una cámara humidificada para prevenir la evaporación de los reactivos. La tinción fluorescente se visualizó usando un microscopio de fluorescencia Zeiss Axioscope (400 aumentos).

Los resultados representados en la figura 4A y 4B muestran un modelo de tinción EBNA nuclear característico en el 100% de las células infectadas de forma latente con EBV, tal como el encontrado para la línea de células X50-7 mostrada en el panel A, cuando se usa una técnica de doble tinción FITC, para aumentar la sensibilidad. Los resultados del panel B muestran la especificidad de la tinción por EBNA.OT1x, ya que la mayoría de las células BJAB EBV-negativas pequeñas no muestran ninguna tinción, mientras que las células productoras de EBV grandes muestran un fuerte modelo de tinción nuclear en aproximadamente un 50% de las células.

Ejemplo 5 Análisis de separación de células por fluorescencia (FACS)

Se fijaron células T-humanas EBV negativas (Jurkat), células de linfoma de Burkitt humanas EBV positivas (Daudi), linfocitos B humanos transformados con EBV policlonales, líneas de células B clonadas establecidas o linfocitos de sangre periférica de un donante seronegativo para EBV, de acuerdo con el método BFA y se incubaron con EBNA.OT1x (1 \mug/ml) en PBS más BSA al 1% a una concentración de células de 2 x 10^{6}/ml a 4ºC. Después de lavar con PBS tres veces, las células se incubaron con IgG de cabra anti-ratón-F(ab)_{2} marcado con FITC, diluido de manera apropiada en PBS-BSA. Después de otra etapa de lavado, se analizaron 10^{4} células con un citómetro de flujo (FACSCAN, Becton-Dickinson). Como control negativo, cada experimento se repitió por medio de una incubación separada de las mismas células con un anticuerpo monoclonal no relevante (anti HIV-24, IgG).

Los resultados de los experimentos descritos anteriormente se proporcionan en la figura 5A-F. La línea de trazos en cada gráfico representa el anticuerpo monoclonal de control, mientras que la línea continua muestra los resultados obtenidos para el anticuerpo monoclonal EBNA.OT1x. A partir de estos experimentos, puede concluirse que, usando BFA como método de fijación como se ha descrito por Slaper-Cortenbach et al. (Blood 72, 1639-1644, 1988). EBNA.OT1x es capaz de penetrar en las células permitiendo de esta manera la detección de EBNA-1 intracelularmente en las células infectadas por EBV.

Ejemplo 6 Tinción de inmunotransferencia y tipificación de EBNO

A continuación se ilustra la detección de la proteína EBNA-1 desnaturalizada por medio de tinción de inmunotransferencia y su aplicación en la tipificación por EBNO de diferentes aislados de EBV usando el anticuerpo EBNA.OTIx de acuerdo con la invención.

En la figura 6 se muestra un ejemplo de un análisis con una diversidad de cepas de EBV diferentes presentes en líneas de células B obtenidas a partir de diferentes regiones geográficas del mundo.

En cada línea de la figura 6A y 6B, una muestra de 5x10^{4} células infectadas por EBV o de control (BJAB), desnaturalizadas por ebullición en un tampón de muestra de SDS-PAGE reductor, se sometió a SDS-PAGE convencional y a transferencia a nitro celulosa.

El panel A (figura 6A) muestra la tinción de EBNA usando el anticuerpo monoclonal EBNA.OT1x, mientras que el panel B muestra el mismo análisis usando un suero humano monoespecífico para la tinción de EBNA-1 (es decir, no reactivo con más moléculas de EBNA). A pesar de las diferencias de intensidad, los modelos de tinción para los dos reactivos son idénticos, lo cual demuestra la variación de pesos moleculares entre los aislados de EBV individuales. BJAB representa un extracto de línea celular negativa para EBV.

A partir de estos experimentos, puede concluirse que EBNA.OT1x reacciona con múltiples cepas de EBV y puede usarse como reactivo en la tipificación de EBNO.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: Akzo, N.V.

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(B)

CALLE: Velperweg 76

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(C)

CIUDAD: Arnhem

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(E)

PAIS: Países Bajos

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6824 BM

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Péptidos del Virus de Epstein-Barr y anticuerpos contra estos péptidos

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

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(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión # 1.25 (EPO)

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: EP 92202797.4

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 14-SEP-1992

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.500000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 123 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

1

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácidos

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(C)

CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly}

\sac{Glu Lys Arg Pro Arg Ser Pro Ser Ser Gln}

\sac{Ser Ser Ser Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 58 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Asp Val Pro Pro Gly Ala Ile Glu Gln}

\sac{Gly Pro}

Claims (8)

1. Péptido inmunoquímicamente reactivo con anticuerpos contra el virus de Epstein-Barr, que consta de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID Nº: 1.

2. Péptido o péptidos, inmunoquímicamente reactivos con anticuerpos contra el virus de Epstein-Barr, que constan de una o más de las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID Nº: 2 a 6.

3. Anticuerpo dirigido contra un péptido de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

4. Anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 3, siendo el anticuerpo un anticuerpo monoclonal.

5. Anticuerpo monoclonal dirigido contra el péptido de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene la misma reactividad con EBNA-1 que los anticuerpos monoclonales producidos por la línea de células de hibridoma depositada con la European Collection of Animal Cultures (ECACC), Porton Down (UK) con el número de depósito nº 92071613.

6. Línea celular inmortalizada capaz de producir anticuerpos monoclonales de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Línea celular inmortalizada de acuerdo con la reivindicación 6, depositada en la European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), Porton Down (UK), con el número de depósito nº 92071613.

8. Anticuerpo antiidiotípico reactivo con el anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-5.