JP2008273972A - エプスタイン・バールウイルスのペプチド及びこれらのペプチドに対する抗体 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】エプスタイン−バールウイルス(EBV)と免疫化学的に反応するペプチドもしくはその断片。このペプチドもしくはその断片に対する新規モノクローナル抗体。検査液中のEBVもしくは抗EBV抗体の検出のための方法、及び、この検出法を実施する際に用いる本発明のペプチド、断片、もしくは、ポリペプチドを含む免疫化学的試薬及び検査キット。このペプチドに対するモノクローナル及びポリクローナル抗体を使用し、天然及び変成させた無傷の機能的EBNA−1蛋白質の両方を検出検査液もしくは組織検体中に含まれるEBVの検出。
【選択図】なし
Description
EBVの産生周期におけるウイルス抗原の血清学的分類は様々な蛍光技術に基づいている。
読み取り枠BKRF1中にコードされているエプスタイン・バール核抗原1(EBNA−1)は、インビボ及びインビトロにおいて、潜伏感染細胞及び腫瘍関連性細胞の全てにおいて普遍的に発現される唯一のEBVコード蛋白質であり、かつ、DNA複製及び遺伝子活性化の機構を研究するための重要な標的分子を形成している。
a)遊離のカルボキシル基及び保護されている他の反応基を有する化合物(アミノ酸、ペプチド)と、遊離のアミノ基及び保護されている他の反応基と有する化合物(アミノ酸、ペプチド)との、縮合試薬の存在下における縮合、
b)活性化されているカルボキシル基及び遊離のもしくは保護されている他の反応基を有する化合物(アミノ酸、ペプチド)と、遊離のアミノ基及び遊離のもしくは保護されている他の反応基を有する化合物(アミノ酸、ペプチド)との縮合。
Butterworths、1988; Lenstra 、J.A. et al.、Arch. Virol.110、1−24、1990)。組換えベクター分子の構築のために使用すべき方法は当業者に知られているものであり、かつ、これらは中でも、Maniatis、T.ら(Molecular Cloning A LaboratoryManual、second edition;Cold Spring Harbor Laboratory、
1989)において説明されている。
図1:ヒト血清を使用したペプスキャン分析の結果。X軸上にEBNA−1配列上の個々の各12merペプチドの相対的開始位置を示し、例えば、“0”はAA348で開始する12merペプチドを表わす等々である。Y軸上には、450nmにおける相対的吸光度単位を示す。
B=ペプチド368−387
C=ペプチド394−420
D=ペプチド424−452
E=ペプチドGly−Ala
F=コンビ(combi)−ペプチド
G=EBNA−1 Baculo
A:EBV陰性Jurkat細胞の分析、
B:EBV陽性ヒトバーキットリンパ腫細胞(Daudi)の分析、
C:EBV血清陰性ドナーからの末梢血リンパ球の分析、
D:ポリクローナルEBV形質転換ヒトB−リンパ球の分析、
E及びF:樹立されたクローン化B−細胞(EBV−陽性)の分析。
A:モノクローナル抗体EBNA.OT1xを使用した、異なるEBV株のEBNOタイピングの結果。
2=CR+B95.8
3=CR+QIMR−WIL
4=PB−LCL
5=CR+BL72
6=CR+Mwika
7=CR+AG876
8=CR+Ambobi
9=CR+WW1
10=CR+WW2
12アミノ酸(AA)の長さを有するペプチド、及び、ORF BKRF1のAA配列の11AAの重複部分、位置 348−470を、Geijsen ら(P.N.A.S.、USA 、83、3998− 4002、1984)により元来記載されているように、化学的に活性化させたポリエチレン製のピン上に自動固相ペプチド合成により合成した。
コンピューター分析による、BKRF1 によってコードされるEBNA−1蛋白質に由来する合成ペプチドの選択、及び、これらのペプチドの、正常ヒトドナー血清との免疫反応性の分析を以下に要約する。
マウスモノクローナル抗体及びウサギ血清を用いる、EBNA−1断片348−470上の免疫反応性エピトープの位置決定について用いられる方法は、ヒト血清を用いるエピトープの位置決定のために、既に実施例1において記載してある。ピンに結合しているペプチドに対するマウス抗体の結合はペルオキシダーゼでラベル化したヒツジ抗マウスIgG抗体を使用して測定し、一方、ウサギ抗体の結合はペルオキシダーゼでラベル化したヒツジ抗ウサギ抗体を使用して測定した。
A.EBVに潜伏感染しているX50−7細胞を12ウエルのガラス製スライド板上に、アセトン−メタノール(1:1)で固定し、1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むリン酸緩衝塩水、pH7.4(PBS)中の2μg/mlのEBNA.OT1x抗体で、37℃で1時間染色した。PBSで4度洗浄した後、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)でラベル化したウサギ抗マウスIgG抗体を添加し、PBS+1%BSAで希釈し、更に、37℃において1時間インキュベートした。更にPBSで4度洗浄した後、FITCでラベル化したヤギ抗ウサギ抗体を添加し、先と同様にインキュベートした。最後に、PBSで4度洗浄した後、このスライド板を固定液(50%グリセロール、pH9.0)で被覆し、更に、カバーグラスで密閉した。
EBV−陰性ヒトT−細胞(Jurkat)、EBV−陽性ヒト・バーキットリンパ腫細胞(Daudi)、ポリクローナルEBV−形質転換ヒトB−リンパ球、樹立型クローン化B−細胞系、あるいは、EBV−血清学的陰性ドナーからの末梢血リンパ球をBFA−法に従って固定し、更に、4℃において、2×106/mlの細胞濃度で、1%のBSAを含むPBS中のEBNA.OT1x(1μg/ml)と共にインキュベートした。PBSで3度洗浄した後、細胞を、PBS−BSAで適切に希釈したFITCでラベル化したヤギ抗マウスIgG−F(ab)2抗体と共にインキュベートした。再度洗浄段階を行った後、104個の細胞を流動血球計数器(FACSCAN、Becton−Dickinson社)を使用して分析した。陰性対照として、各実験を、無関係なモノクローナル抗体(抗HIV−p24抗体、IgG)との同一細胞の独立したインキュベーションも並行して行った。
イムノブロット染色の手法による変成させたEBNA−1の検出、及び、本発明に記載のEBNA.OT1x抗体を使用する異なるEBV単離物のEBNO−タイピングへのその応用を、以下に説明する。
Claims (14)
- エプスタイン−バールウイルスに対する抗体と免疫化学的に反応し、配列番号:1に示されるアミノ酸配列の少なくとも一部を含むペプチド。
- 配列番号:2から6に示されるアミノ酸配列の一つもしくは複数を含む、請求の範囲項1に記載のペプチド。
- 請求項1もしくは請求項2に記載のペプチドに対する抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項3に記載の抗体。
- 受託番号92071613として、Porton Down (英国)のEuropean Collection of Animal Cell Cultures (ECACC)に寄託してあるハイブリドーマ細胞系により産生されるモノクローナル抗体と同一の、EBNA−1に対する反応性を有するモノクローナル抗体。
- 請求項5に記載のモノクローナル抗体を産生することが可能な不死化細胞系。
- 受託番号92071613として、Porton Down (英国)のEuropean Collection of Animal Cell Cultures (ECACC)に寄託してある不死化細胞系。
- 請求項3から5のいずれか一項に記載の抗体に対して反応性を示す抗イディオタイプ抗体。
- 適切な担体もしくはラベル化物に結合している、請求項1もしくは請求項2に記載のペプチドを含む免疫化学的試薬。
- 適切な担体もしくはラベル化物に結合してある、請求項3から5のいずれか一項に記載の抗体を含む免疫化学的試薬。
- 試料中のEBVの検出のための方法であって、請求項3から5のいずれか一項に記載の抗体と当該試料を接触させ、その後、形成される免疫複合体の存在を検出し、更に、これにより試料中に含まれるEBVの存在を決定する前記方法。
- 検査液中の、エプスタイン−バールウイルスに対する抗体の検出のための方法であって、請求項9に記載の免疫化学的試薬を検査液と接触させ、更に、検査液中において形成される免疫複合体の存在を検出することを特徴とする前記方法。
- 検査液中の、エプスタイン−バールウイルスに対する抗体の検出のための方法であって、請求項9に記載の免疫化学的試薬を検査液及びエプスタイン−バールウイルスに対する抗体とに接触させ、その後、形成される免疫複合体を検出し、更に、これにより検査液中のエプスタイン−バールウイルスの存在を検出することを特徴とする前記方法。
- 請求項11から13のいずれか一項に記載の方法を実施するための検査キット。
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