FI113298B - Diagnostinen reagenssi, menetelmä ja testitarvikesarja EBV:n vasta-aineiden detektoimiseksi - Google Patents

Description

113298

Diagnostinen reagenssi, menetelmä ja testitarvikesarja EBV:n vasta-aineiden detektoimiseksi Tämä keksintö koskee diagnostisia reagensseja, 5 joilla voidaan havaita Epstein-Barr-virusta vastaan suunnattuja vasta-aineita, ja menetelmää ja testitarvikesarjaa, joilla voidaan havaita Epstein-Barr-virusta vastaan suunnattuja vasta-aineita näytteessä.

EBV on kaikkialla läsnä oleva ihmisen herpesvirus, 10 joka havaittiin ensiksi Burkittin lymfooman (BL) afrikkalaisen muodon (endeeminen tai e) yhteydessä. Tämän jälkeen virus havaittiin myös nenä-nielusyövän (NPC) yhteydessä ja sen osoitettiin olevan tarttuvan mononukleoosin (IM) aiheuttava agenssi. Infektio tapahtuu yleensä varhaislapsuudes-15 sa ja johtaa yleensä subkliiniseen ilmenemismuotoon, satunnaisesti vähäisillä oireilla. Infektio nuoruus- tai aikuisiässä voi kuitenkin aiheuttaa IM:n, jonka piirteenä ovat epätyypilliset lymfosyytit elimistön perifeerisissä osissa. Valtaosa näistä lymfosyyteistä on T-lymfosyyttejä; 20 niihin lukeutuu kuitenkin pieni populaatio B-lymfosyyttejä, jotka ovat infektoituneet EBV:llä. B-lymfosyyttien infek- · toituminen voidaan saada aikaan myös in vitro. Sellaiset ί solut transformoituvat ja lisääntyvät rajattomasti viljel- ; j mässä, ja niihin on viitattu nimellä "kuolemattomiksi muut- 25 tuneet", "latentisti infektoituneet" tai "kasvun suhteen transformoituneet". Sikäli kuin tiedetään, kaikki yksilöt, t·;' jotka infektoituvat EBVrllä, pysyvät latentisti infektoitu- * * · neina loppuelämänsä. Tätä heijastaa se, että EBV-genomin , suhteen positiivisia, transformoituneita B-soluja on pieni- • ** 30 nä määrinä läpi elämän läsnä verenkierrossa perifeerisen • · '··.* veren lymfosyyttien joukossa, ja virusta irtautuu jatkuvas- ;’· · ti mutta ajoittain suunielussa.

• ·

Hyvin suuressa valtaosassa tapauksista EBV-infektio johtaa lymfoproliferatiiviseen sairauteen, joka voi ol-: " 35 la tilapäisesti heikentävä, mutta se on aina hyvänlaatuinen ·' · ja itsensä rajoittava. Tietyissä immunosuppressoiduissa yk- 113298 2 siioissa tulos voi kuitenkin olla täysimittainen pahanlaatuinen tila. Tämä tapahtuu yksilöillä, jotka on tietoisesti immunosuppressoitu, erityisesti lapsilla, jotka saavat elinsiirrännäisiä ja joita hoidetaan syklosporiini A:lla, 5 tai opportunistisesti, kuten niiden yksilöiden tapauksessa joilla on HIV-infektio, tai geneettisesti, kuten taudin kohtaamilla miespuolisilla ihmisillä, joilla on XLP.-n (X:ään kytkeytynyt proliferatiivinen syndrooma) geeni. Näissä tapauksissa tuloksena olevat pahanlaatuiset tilat 10 johtuvat EBV-infektoituneiden B-solujen polyklonaalisesta lisääntymisestä. Lisäksi sellaisissa potilaissa on havaittavissa viruksen kontrolloimatonta, epiteelissä tapahtuvaa lisääntymistä suuontelon karvaisen leukoplakian leesioissa. Täten immuunivasteella on keskeinen rooli EBV-infektion 15 kontrolloimisessa.

EBV:n läsnäolo soluissa tai kudoksissa voidaan osoittaa detektoimalla virusgenomi tai osoittamalla EBNA-1-proteiini, ainoa latenssiin liittyvä proteiinituote, joka ekspressoidaan universaalisti EBV-infektoituneissa soluis-20 sa.

Kuten edellä mainitaan, EBV kuuluu herpesviruksiin.

• · ·* ‘ Sillä on seuraavat rakenneominaisuudet: * · ·. i - EBV-genomi koostuu lineaarisesta, kaksijuostei- « · · sesta DNA-molekyylistä (172 000 emäsparia).

:* 25 - Virioni koostuu ytimestä (proteiinit ja DNA) , jo- ·;'* ta ympäröi ikosahedraalinen kapsidi, ja membraanivaipasta, • « « » :*j*; joka sulkee kapsidin sisäänsä. Ikosahedraalinen kapsidi koostuu heksameerisistä ja pentameerisistä kapsomeereistä. Membraanivaippa koostuu kaksikerroksisesta proteiini- • · *..! 30 lipidikalvosta, jonka ulkopinnalla on piikkejä. Kapsidikuo- • · *1* ren ja vaipan välillä olevan tilan täyttää amorfinen prote- « · :.*‘i iini, jota kutsutaan tegumentiksi.

- Kaikkien herpesvirusten tavoin EBV kykenee saa- :·] maan aikaan latentin elinikäisen infektion isännässään pri- » »· 35 määri-infektion jälkeen. Tämä latenssi edustaa EBV:n ja sen

< · · i · J

• · 113298 3 ihmisisännän välistä täydellistä tasapainotilaa, jota isännän immuunijärjestelmä kontrolloi.

Tähän saakka suurin osa biokemiallisista ja biologisista tutkimuksista on suoritettu kolmella EBV-proto-5 tyyppikannalla, jotka ovat B95-8 (silkkiapinan solulinjassa tuotettu transformoiva virus), P3HR1 (ei-transformoiva virus, jota tuottaa Burkittin lymfooma-syöpäsolulinja) ja Ra-ji (latentti virus Burkittin lymfooma-syöpäsolulinjassa).

Viimeisten vuosien aikana prototyyppiviruskannan 10 B95-8 koko DNA-sekvenssi on määritetty. Tämän sekvenssin analysointi on johtanut yli 80:n avoimen lukukehyksen tunnistamiseen (Baer ym. , 1984, Nature 310, s. 207 - 211).

EBV:n biologia asettaa tutkijoille erityisen ongelman, koska sen biologiset piirteet (latentti infektio) ei-15 vät ole soveliaita klassista virusanalyysiä varten. Lisäksi sen solu- ja isäntäspektri ovat tehokkaasti rajoittuneita ihmisen (ja joidenkin korkeampien kädellisten) B-lymfo-syytteihin ja epiteelisoluihin, jotka eivät yleensä ole soveliaita in vitro -viljelyyn. Lisäksi täysin permissiivisen 20 solutyypin, jossa virus replikoituu lyyttisesti, poissaolo on rajoittanut voimakkaasti kykyä tuottaa suuria määriä vi-: rusta.

S/·· B95-8-, P3HR1- ja Raji-isolaattien DNA-molekyylit ovat olleet prototyyppejä ajatellen yksityiskohtaista re-;· 25 striktioendonukleaasikartoitusta ja kloonausta Escherichia

t f I

colin (E. coli) plasmideihin ja bakteriofaagi lambdaan, ja .· ·, nukleotidisekvensointia.

EBV-genomi koostuu yhdestä kaksijuosteisesta DNA- ,,. molekyylistä, joka on rakentunut ainutlaatuisista ja tande- * » · > · 30 minä toistuvista DNA-elementeistä. Kukin DNA-molekyylin pää ’;·* sisältää moninkertaisia terminaalisia sekvenssejä, jotka mahdollistavat genomin kovalenttisen yhteenliittymisen ja ;·· sen muuttumisen rengasmuotoiseksi . Viruspartikkeleissa EBV- genomi on havaittavissa vain lineaarisessa muodossa. Se ‘ , 35 esiintyy sitävastoin rengasmaisena episomina latentisti in- • o 113298 4 fektoituneiden solujen tuman sisällä, ja integroituu satunnaisesti isäntäsolun kromosomeihin.

Sisäiset toistosekvenssit, IR1 - IR4, erottavat EBV-genomin viideksi ainutkertaiseksi alueeksi. U2- ja U3-5 alueet vaihtelevat suuresti eri EBV-isolaattien kesken, ja jälkimmäinen on lähes täysin deletoitunut EBV:n P3HR-1-kannassa.

EBV:n lukukehysten nimistö perustuu niiden sijaintiin virusgenomissa. Nimet alkavat sen BamHI- tai EcoRI- 10 restriktiofragmentin alkukirjaimilla, jossa ekspressio alkaa. Kolmas kirjain nimessä on L tai R, siitä riippuen onko ekspressio vasempaan vai oikeaan suuntaan standardikartas-sa. (Niinpä BLLF2 on toinen vasemmalle menevä lukukehys, joka alkaa BamHI-restriktiofragmentista L).

15 Virusantigeenien serologinen luokittelu EBV:n pro duktiivisessa syklissä perustuu erilaisiin fluoresenssitek-niikoihin.

Antigeenit, jotka havaitaan spesifisesti komple-menttivasta-aineisiin perustuvalla immunofluoresenssitek- 20 nilkalla latentisti infektoituneiden, kestävöityjen B-solujen (esim. Raji-solujen) tumassa, luokitellaan Epstein-' ϊ Barr-tuma-antigeeneiksi (EBNA).

", :* Kun virusgeenien ekspressio aktivoituu kemiallisten * · ·· tai virusperäisten tekijöiden vaikutuksesta, havaitaan var- :* 25 haisten antigeenien (EA) luokka, jonka synteesiä virus- ;· DNA:n synteesin inhibitio ei estä. Riippuen siitä mitä kes- • ( * jt'. tävöintiainetta käytetään (metanolia vai asetonia), on ha vaittavissa kaksi eri Ea-luokkaa, EAR ja EAd. EA on havait-tavissa epäsuoralla immunofluoresenssilla indusoitujen so- k · 3 0 lujen sytoplasmassa ja tumassa. Sen jälkeen kun viruksen • · ‘h DNA-synteesi on alkanut (ja siitä riippuen), syntetisoidaan viruksen rakenneproteiineja (jotka käsittävät membraanian-'1·': tigeenit (MA) ja viruskapsidiantigeenit (VCA) ) , jotka ovat -·[ havaittavissa epäsuoralla immunofluoresenssilla. Virusta t »· 35 tuottavien solujen (esim. P3HR1-solujen) sytoplasmassa ja k · tumassa on havaittavissa epäsuoralla immunofluoresenssilla 5 113298 joukko VCA:ita. Virusta tuottamaan indusoitujen, elinkelpoisten infektoitujen solujen pinnalla on havaittavissa epäsuoralla immunofluoresenssilla joukko antigeenejä (MA) . Nämä antigeenit voidaan havaita myös viruksen vaipassa ja 5 ne ovat tärkeitä kohteita viruksen neutralisaatiossa.

EBV-spesifisten vasta-aineiden havaitseminen ihmis-seerumeissa voidaan suorittaa rutiininomaisesti serologisilla tekniikoilla, kuten ovat kuvanneet Henle ja Henle (Human Pathology, 5, 551 - 565, 1974) .

10 Biokemiallisiin ja immunofluoresenssituloksiin pe rustuen on mahdollista erottaa viisi erilaista antigeenimo-lekyyliluokkaa. Eri viruspolypeptidit nimetään niiden mole-kyylipainon perusteella, eikä kaikille EBV-proteiineille ole saatu aikaan yhteistä nimistöä, mikä mahdollistaisi 15 niiden ainutkertaisen kuvaamisen.

Viisi eri antigeeniryhmää ovat: A. Niiden antigeenien ryhmä, jotka ekspressoituvat latenssitilan aikana (EBNA:t ja LMP:t).

B. Niiden antigeenien ryhmä, jotka ovat vastuussa 20 genomin aktivoimisesta ja viruksen replikaation alkuinduk- tiosta (IEA).

• · • » tl C. Niiden antigeenien ryhmä, jotka ovat IEA- ·. ·* geenituotteiden indusoimia ja jotka vaaditaan viruksen ·, Ί DNA:n replikaatiota varten; nämä antigeenit ovat lähinnä ;· 25 viruksen entsyymejä (EA) .

* * · '· D. Niiden antigeenien ryhmä, jotka ovat viruspar- tikkelin rakennekomponentteja ja jotka ekspressoituvat myöhään viruksen replikaatiosyklissä (VCA) viruksen DNA- .. . synteesin alkamisen jälkeen.

* · 30 E. Niiden antigeenien ryhmä, jotka ekspressoituvat infektoidun solun solumembraanilla (MA) . ί '.ί Epstein-Barr-tuma-antigeenit (EBNA) ·,*’·; Epstein-Barr-tuma-antigeeni 1 (EBNA-1) , jota koodi - tetaan BKRF1-lukukehyksessä, on ainoa EBV:n koodittama pro- » 11 ’ , 35 teiini jota ekspressoidaan universaalisti kaikissa laten-

IIMI

tisti infektoituneissa ja kasvaimiin liittyneissä soluissa 113298 6 in vivo ja in vitro, ja se muodostaa tärkeän kohdemolekyy-lin, jolla voidaan tutkia DNA-repiikaation ja geeniaktivaa-tion mekanismeja.

EBNA-1 tunnistettiin immunologisella blottauksella 5 ja radioimmunoelektroforeesilla EBV-positiivisissa mutta ei kolmessa EBV-negatiivisessa solulinjassa, kun käytettiin hyödyksi neljää EBV-positiivista ihmisseerumia ja vertailtiin kahteen EBV-negatiiviseen ihmisseerumiin. Tunnistetuilla antigeeneillä oli eri analysoiduissa solulinjoissa 10 eri molekyylipainot, jotka olivat välillä 65 000 - 73 000. Komplementtia fiksoiva antigeeni oli puhdistettu osittain yli 200-kertaisesti ja sen havaittiin puhdistuvan yhtaikaa 65 kDa:n EBNA:n kanssa, joka tunnistettiin immunoblottauksella. Koska EBNA määritetään anti-komplementti-15 immunofluoresenssilla (ACIF), ehdotettiin että 65 kDa:n antigeeni oli EBNA:n pääkomponentti.

EBNA-geeni kartoitettiin transfektoimalla hiiren solut EBV-DNA:n kloonatulla BamHI-K-restriktioentsyymi-fragmentilla. Hiiren fibroblastilinjan transfektoiminen 20 tällä fragmentilla yhdessä dominantin selektoitavissa olevan markkerin kanssa johti sellaisen tuma-antigeenin sta-! : hiiliin ekspressoitumiseen, joka tunnistettiin ACIF:ssä EB- : *· NA-positiivisilla mutta ei EBNA-negatiivisilla ihmisseeru-

j meillä. Myöhemmässä tutkimuksessa havaittiin, että Bam K

i* 25 -transfektoidut solut ekspressoivat 78 kDa:n polypeptidin, ·· joka liikkui samalla nopeudella kuin B95-8-solujen EBNA-1- polypeptidi.

Tuoreemmat tutkimukset ovat paljastaneet immunodo-• ^ minantin alueen glysiini-alaniini-toistoalueen sisällä, jo- 30 hon viitataan tavallisesti nimellä p62 tai pl07, joka on ’;* vahvasti reaktiivinen ihmisseerumeiden kanssa. Tämän gly- ala-fragmentin havaittiin kuitenkin sisältyvän normaaleihin ihmisen proteiineihin ja sen havaittiin olevan itseä vas-taan suunnattujen vasta-aineiden ("auto-vasta-aineiden") 35 kohde. Lisäksi jatkotutkimukset ovat paljastaneet, että * » · i · sellaisten potilaiden seerumeissa, joilla on aktiivisia 113298 7 CMV-, HSV- tai toksoplasmainfektioita, IgM-vasta-aineet osoittautuvat satunnaisesti ristireagoiviksi tämän peptidin kanssa. Lisäksi E. colissa ekspressoidun 28 kDa:n C-termi-naalisen fragmentin, joka koodittaa EBNA-l:n aminohappoja 5 461 - 641, osoitettiin olevan reaktiivinen ihmisseerumin vasta-aineiden kanssa. Lisätutkimukset eivät tähän mennessä ole onnistuneet tunnistamaan EBNA-proteiinin pienempiä fragmentteja, joita voidaan käyttää korvaamaan ehjä EBNA-1-proteiini diagnostiikassa.

10 EBV:n viruskapsidiantigeenit (VCA) Tätä antigeeni kompleksi a koskee myös se, että eri tutkimuksissa tunnistettujen EBV-spesifisten proteiinien vertailu on vaikeaa käytettyjen polyakryyliamidigeelijär-jestelmien, solulinjojen ja kemiallisten induktoreiden ja 15 seerumien vaihtelujen vuoksi.

Dolyniuk ym. (1979) kuvasivat kaikkiaan 33 proteiinia, jotka olivat liittyneinä puhdistettuihin virioneihin. Erittelysolubilisaatio ("differential solubilisation") de-tergentteihin viittaa siihen, että nukleokapsidi koostuu 20 ainakin seitsemästä proteiinista. VCA-kompleksin tärkeä komponentti on pääkapsidiproteiini (MCP). EBV-MCP:n koodi : : sijaitsee virusgenomin BcLFl-lukukehyksen sisällä (Bear ·. · ym., 1984) ja EBV-tuottajasolulinjoissa se ekspressoituu | 153 - 160 kDa:n ei-glykosyloituna proteiinina, jonka pl on ;· 25 7,5-9,0. Tämä proteiini syntetisoidaan sytoplasmassa liu- « » * ;· koisessa muodossa ja sitten se siirretään tumaan, jossa se kondensoituu kapsideiksi eikä sitä enää voi saattaa liukoiseen muotoon detergenteillä. Toisella VCA-pääkomponentilla ..(.t on 125 kDa:n molekyylipaino ja se on glykosyloitunut. Tämän • · 30 proteiinia kooditetaan virusgenomin BALF4 - lukukehyksen si-säilä. Vaikkakin tämä glykoproteiini luokiteltiin alun pe- * · ·/·· rin VCA-komponentiksi, viimeaikaiset tutkimukset viittaavat *:*'! siihen, että se saattaisi itse asiassa olla liittyneenä sy- toplasmisiin ja tumamembraanin rakenteisiin.

I » · 35 Aikaisemmin kuvatut kokeet (J. M. Middeldorp ja P.

Herbrink, J. Virol. Meth., 21, 133 - 146, 1988) tähtäsivät 113298 8 diagnostisesti relevanttien EBV-markkeriproteiinien tunnistamiseen ja karakterisointiin eri EBV-tauteihin liittyen.

Tämä tehtiin käyttämällä immunoblottausliuskoja, jotka sisältävät antigeenejä, jotka oli valmistettu virusta 5 tuottavasta solulinjasta HH514-C16 (P3HRl:n superindusoita-vissa oleva johdannainen), joka oli indusoitu VCA/EA:n tai EA:n ekspressiota silmälläpitäen, ja EBV-negatiivisista so-lulinjoista Ramos ja Bjab. Solulinjoja X50-7 ja JC-5, jotka sisältävät EBV-genomin (täysin) latentissa tilassa, voidaan 10 käyttää tutkittaessa EBNA/LMP:tä spesifisesti.

EBV-vasta-ainevastemalleja tutkittiin terveiden se-ropositiivisten verenluovuttajien seerumeista, IM-potilai-den seerumeista ja kroonisten IM-potilaiden seerumeista tai sellaisten potilaiden seerumeista, joilla on EBV:hen liit-15 tyviä kasvaimia kuten nenä-nielusyöpä. Kun halutaan karakterisoida joitakin proteiinijuovia, jotka havaitaan tällä kokeellisella järjestelmällä, voidaan käyttää polyklonaali-sia ja monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat reaktiivisia määrättyjen EBV-genomituotteiden kanssa. Nämä tutkimuk-20 set kuvasivat kuitenkin vain proteiineja tai polypeptidejä, joilla on tietty molekyylipaino. Mitään sellaista tietoa ei , : ollut saatavilla, joka olisi koskenut näitä proteiineja .· koodittavaa sekvenssiä EBV-genomissa. Ei liioin tiedetty, • · johtuivatko immunoreaktiiviset juovat immunobloteissa reak-;· 25 tiivisuudesta yhden proteiinin kanssa vai monen proteiinin ·· kanssa, joilla oli sama molekyylipaino.

Immunoblottaustekniikalla on mahdollista havaita EBV-antigeeni, jonka molekyylipaino on 18 kDa. Tätä prote- .. . iinia ei ekspressoida, kun fosfonoetikkahappoa (PAA) käyte- • · ‘..1 30 tään viruksen DNA-synteesin estämiseksi, ja se havaitaan • · "·’ kaikilla seerumeilla, jotka sisältävät VCA-vasta-aineita, mikä viittaa siihen että se on VCA:han liittyvä komponent- ti. Toinen VCA-komponentti on proteiini, jonka molekyyli- ./ paino on 40 kDa. Monet viruksen kapsidiantigeeneista ovat * · · ‘ . 35 tumasakkaan liittyviä.

t » · i · * · 9 113298

Menibraaniantigeenit (MA)

Epstein-Barr-viruksen membraaniantigeenit (EBV-MA) ovat läsnä virionin vaipassa, infektoituneen solun ulkomem-braaneilla ja solunsisäisissä membraanirakenteissa. Useiden 5 glykoproteiinien ja yhden ei-glykosyloidun proteiinin on kuvattu käsittävän MA-kompleksin, joista eniten tutkittu on gp350/220, jota kooditetaan BLLF1-lukukehyksessä. MA-gp350/220 on välttämätön EBV:n sitoutumiselle soluresepto-riin CR2 (CD21) , ja gp350/220:tä vastaan suunnatut vasta-10 aineet voivat estää tämän sitoutumisen estämällä EBV:n menon soluun (viruksen neutralisaatio). Toisaalta gp350/220:tä vastaan suunnatut vasta-aineet, jotka sitoutuvat gp350/220:een solun plasmamembraanilla, voivat välittää virusinfektoitujen solujen hajoamista aktivoimalla komple-15 mentin tai T-tappajalymfosyytit. Tällä mekanismilla myös virusepitoopit voivat hajota (virolyysi), mikä tuhoaa näin viruksen infektiivisyyden. Ihmisseerumeissa on havaittu eri luokkiin kuuluvia, gp350/220:tä ja muita MA-kompleksin rakenneosia vastaan suunnattuja vasta-aineita, kun elävien 20 EBV-tuottajasolujen pintaa on tutkittu epäsuoralla immuno-fluoresenssilla, tai käyttämällä entsyymiin kytkettyä immu- » · : :: nologista määritystä (ELISA), jossa näitä proteiineja käy- ,'·· tetään puhtaassa muodossa.

: Sellaisilla vasta-aineilla voi olla tärkeä rooli * · ·· 25 isännän suojauksessa, sikäli että ne estävät viruksen si-

) I

· säänmenoa ja leviämistä. Niinpä EBV-MA ja erityisesti . ;·. gp350/220 on ollut kohteena laajoissa tutkimuksissa, joiden tavoite on alayksikkörokotteen kehittäminen EBV-infektion .. . estämiseksi.

* « · • · 30 Tämä lähestymistapa on osoittautunut soveliaaksi • · eläinmallissa ja se on hiljattain tuotu pieniin kenttäkö-

• I

:/·: keisiin Kiinassa ilmeisellä menestyksellä.

•:··: Tällä hetkellä EBV-spesifinen serodiagnoosi saadaan aikaan varsin subjektiivisilla immunofluoresenssitesteillä.

» » · 35 Yksinkertaisempaa ja yhtäläisempää diagnoosia (esim. ELISA) 1**11 kohti eteneminen on hidasta, koska virusantigeenien massa- 113298 10 tuotanto ja puhdistus eivät ole mahdollisia standardinomai-sia virustuotantosolulinjoja käyttämällä.

Ainoa tapa saada tämä aikaan olisi käyttää vaihtoehtoisesti valmistettu(j)a EBV-antigeeniä/antigeenejä. Nämä 5 EBV-antigeenit voitaisiin valmistaa joko geeniteknologisin menetelmin tai synteettisiä peptidejä käyttävin menetelmin.

Immunodominanttien virusproteiinien ja niiden epi-tooppien tunnistaminen on hyvin tärkeää, jotta voitaisiin kehittää spesifinen ja herkkä menetelmä, joka mahdollistai-10 si luotettavan diagnoosin tekemisen EBV-infektion eri vaiheissa.

Proteiineja ja peptidejä, joita voidaan käyttää Ep-stein-Barr-virusta vastaan suunnattujen vasta-aineiden havaitsemiseen, on kuvattu kahdessa samaan aikaan vireillä 15 olevassa, hakijan toisessa patenttihakemuksessa, joiden sisällöt liitetään tähän viitteenä: ensimmäinen näistä pa tenttihakemuksista käsittää VCA-pl8-proteiinit ja VCA-p40-proteiinit, jotka kooditetaan EBV-genomin lukukehysten BFRF3 ja vastaavasti BdRFl:n sisällä (EP 0 574 048), kun 20 taas toinen patenttihakemus (EP 92 202 794.4) koskee EBNA- . . 1-proteiinia, jota kooditetaan BKRF-1-lukukehyksessä.

* · Ί j Lisäksi membraaniantigeenien ryhmästä peräisin ole- i · '· '·* vaa proteiinien ja peptidien joukkoa, edullisesti • * l gp350/220:aa, voidaan käyttää Epstein-Barr-virusta vastaan 2 5 suunnattujen vasta-aineiden havaitsemista varten. n 1' Näiden proteiinien sisällä on paikannettu immunodo- minantteja epitooppeja jotka - yhdistettyinä synteettisiin peptidimolekyyleihin - voivat korvata ehjät proteiinit ’.V. diagnostiikassa ilman että diagnostista herkkyyttä menetet-

I I

30 täisiin.

t t ’·' Tämänhetkiset edulliset diagnostiset testit EBV- * « : seropositiivisuuden arvioimista varten pohjautuvat siihen, '“· että havaitaan 1) viruksen rakenneproteiineja (mukaan luki- » en viruksen kapsidiantigeenit ja membraaniantigeenit) vas-35 taan suunnatut IgG-vasta-aineet epäsuoralla immunof luore-senssianalyysillä käyttämällä virusta tuottavia soluiinjoja 113298 11 (esim. P3HR1) ja 2) EBNA:aa (Epstein-Barr-tuma-antigeenia) vastaan suunnatut IgG-vasta-aineet käyttämällä anti-komplementti -immunofluoresenssia latentisti infektoituneissa solulinjoissa (esim. Raji). Kukin määritys detektoi 5 erikseen vasta-aineita monimutkaisessa proteiinijoukossa infektoituneessa solussa. Nämä IgG-vasta-ainetyypit ovat läsnä kaikissa EBV-infektoituneissa ihmisissä, sillä rajoituksella että kukin yksilöllinen tyyppi voidaan havaita herkkyydellä 90 - 98 %.

10 Nyt on havaittu, että EBV-seropositiivisten seeru- meiden piirteenä on yleensä viruksen rakenneproteiineja (VCA ja MA) ja EBNA:aa vastaan suunnattujen vasta-aineiden samanaikainen läsnäolo.

Useimmissa tapauksissa EBV-seropositiivisista luo-15 vuttajista saadut seerumit sisältävät vasta-aineita VCA-pl8:lle ja EBNA-1:lie. EBV-seropositiivisilla luovuttajilla on satunnaisesti VCA-pl8-vasta-aineita niin että EBNA-1-vasta-aineiden tasot ovat alhaiset tai negatiiviset, ja päinvastoin. Tämä vastaa tunnettua VCA- ja EBNA-immuno-20 fluoresenssiserologiaa, joista kumpikin tunnistaa 95 -98 %:n herkkyydellä todellisia EBV-seropositiivisia luovut-i tajia. Samalla tavoin MA:ta vastaan suunnatut vasta-aineet • voidaan havaita noin 90 %:n herkkyydellä.

Puhdistettujen dominanttien EBV-diagnostisten mark- 25 kerimolekyylien, se on: VCA-pl8:n tai MA-gp350/220:n ja EB- '· NA-l:n, yhdistäminen yksittäiseksi diagnostiseksi määrityk- seksi tuottaa herkemmän määrityksen EBV-seropositiivisuuden määrittämiseksi. Sekä VCA-pl8:ta tai MA-gp350/ 220:tä ja .. . EBNA-1:tä vastaan suunnattujen vasta-ainevasteiden yhdis- • » 30 tetty arviointi yksittäisessä määrityksessä (esimerkiksi •y’ immunoblottauksella, ELISA:11a, Spia:lla) lisää sekä herk- • » kyyttä että tarkkuutta EBV-seropositiivisuusstatuksen mää-rittämisessä.

..j Sellainen yhdistelmä ei ole mahdollinen nykyisellä • · · 35 immunofluoresenssiin perustuvalla diagnostiikalla.

1 · i2 113298 Nämä markkerimolekyylit voivat olla joko ehjiä pro-teiinilajeja, jotka on puhdistettu EBV-infektoituneista soluista, tai ne voidaan puhdistaa solulinjoista tai mikro-organismeista, jotka on manipuloitu yhdistelmä-DNA-5 tekniikoita käyttämällä tuottamaan näitä proteiineja. Tähän tarkoitukseen voidaan vaihtoehtoisesti käyttää synteettisiä peptidejä, jotka edustavat immunodominantteja alueita (epi-tooppeja) kussakin näissä proteiineissa.

Niinpä tämän keksinnön tavoite on, että yksittäistä 10 diagnostista määritystä varten tehty yhdistelmä, jossa on ainakin VCA-proteiinin osa, kuten VCA-pl8 (jota kooditetaan EBV-genomin BFRF3-lukukehyksen sisällä), VCA-p40 (jota kooditetaan EBV-genomin BdRFl-lukukehyksen sisällä), EBV-MCP (jota kooditetaan EBV-genomin BcRFl-lukukehyksen sisällä), 15 gpl25 (jota kooditetaan EBV-genomin BALF4-lukukehyksen sisällä) tai MA-proteiini, kuten gp350/220 (jota kooditetaan EBV-genomin BLLF1-lukukehyksen sisällä) ja ainakin osa EB-NA-proteiinista, tuottaa EBV-vasta-aineen havaitsemismene-telmän, jolla on suurempi herkkyys ja tarkkuus kuin nykyi-20 sillä menetelmillä.

Keksintö koskee näin ollen kahden erillisen dia- » I % : gnostisen markkerimolekyylin yhdistämistä yksittäiseksi * » * * » 113298 13 ydinantigeenien kanssa (EBNA). Membraaniantigeenien ryhmästä MA-gp350/220-proteiinit ovat edullisia.

Keksintö koskee näin ollen diagnostisia reagensse-ja, jotka käsittävät MA-gp350/220- ja EBNA-l-peräisten pep-5 tidien yhdistelmän.

Toinen tämän keksinnön edullinen suoritusmuoto koskee diagnostisia reagensseja, jotka käsittävät VCA-pl8- ja EBNA-l-peräisten peptidien yhdistelmän, jolloin mainitut peptidit käsittävät ainakin osan aminohapposekvenssistä, 10 kuten esitetään SEQ ID nro l:ssä (VCA-pl8) tai SEQ ID nro 5:ssä (EBNA-1).

VCA-pl8-proteiineista peräisin olevat peptidit, joita voidaan käyttää keksinnön mukaisen diagnostisen rea-genssin edullisessa suoritusmuodossa, yhdistelmänä EBNA-1-15 peräisten peptidien kanssa, ovat peptidejä jotka käsittävät aminohapposekvenssit, jotka ovat SEQ ID nro 2 - 4:n mukaisia. Edullisimmin käytetään peptidiä, joka käsittää SEQ ID nro 4:n mukaisen aminohapposekvenssin, jolloin tämä sekvenssi on yhdistelmä VCA-pl8-proteiinin kahdesta reaktiivi-20 sesta osasta, jotka ovat SEQ ID nro 2:n ja 3:n mukaisia.

, , EBNA-l-peräiset peptidit, joita käytetään edulli- '; j sesti keksinnön mukaisessa diagnostisessa reagenssissa,

’· 1 ovat peptidejä jotka käsittävät yhden tai useamman SEQ ID

: nro 6-9 mukaisen aminohapposekvenssin. Edullisimmin käy- 25 tetään peptidiä, jolla on SEQ ID nro 9:n mukainen sekvens-iti’/ si, jolloin tämä sekvenssi on yhdistelmä EBNA-1-proteiinin ; · : reaktiivisista osista, jotka ovat SEQ ID nro 6 - 8:n mukai sia.

Kenelle tahansa ammattimiehelle on selvää, että » · » | .···, 30 mainittujen polypeptidien konservatiiviset variaatiot ovat ” myös osa tätä keksintöä. Termi "konservatiivinen variaatio" • · \ *: tässä käytettynä tarkoittaa aminohappotähteen korvaamista toisella, biologisesti samanlaisella tähteellä. Esimerkkei- :·. hin konservatiivisista variaatioista kuuluvat yhden hydro- • »·

Mii; 35 fobisen tähteen, kuten isoleusiinin, valiinin, leusiinin

* I

tai metioniinin, substituutio toisella, tai yhden polaari- 113298 14 sen tähteen substituutio toisella, kuten arginiinin substituutio lysiinillä, glutamiinihappojen asparagiinihapoilla, tai glutamiinin asparagiinilla, ja vastaavat. Termi "konservatiivinen variaatio" käsittää myös substituoidun amino-5 hapon käytön substituoimattoman lähtöaminohapon paikalla, edellyttäen että substituoitua polypeptidiä vastaan aikaansaadut vasta-aineet reagoivat immunologisesti myös substituoimattoman polypeptidin kanssa. Niinpä kun käytetään rutiininomaista seulontamenetelmää, kuten konservatiivisen 10 varianttipolypeptidin testaamista seerumeilla, jotka ovat peräisin potilaalta jolla on EBV-assosioitunut sairaus, ammattimies voi helposti määrittää onko varianttipolypepti-dillä keksinnön mukainen vaadittava polypeptidin biologinen aktiivisuus ilman että pitäisi turvautua tarpeettomaan ko-15 keiluun.

Keksinnön mukainen diagnostinen reagenssi käsittää yleensä yhden tai useamman peptidin ja soveliaan kantajan tai leimausaineen.

Käyttökelpoisia kantajia ovat esimerkiksi mikrotes-20 tikuopan sisäseinä tai kyvetti, putki tai kapillaari, mem-braani, suodatin, testiliuska tai sellaisen partikkelin ; : pinta kuten esimerkiksi lateksipartikkeli, erytrosyytti, : · värisooli, metallisooli tai metalliyhdiste soolipartikkeli- . j na, kantajaproteiini kuten BSA tai KLH.

;· 25 Käyttökelpoisia leimausaineita ovat muun muassa ra- ;· dioaktiivinen isotooppi, fluoresoiva yhdiste, entsyymi, vä risooli, metallisooli tai metalliyhdiste soolipartikkelina.

Menetelmässä jolla voidaan havaita EBV:tä vastaan . . suunnattuja vasta-aineita näytteessä, keksinnön mukainen 30 diagnostinen reagenssi saatetaan kontaktiin näytteen kans- > · ·; sa. Peptidin ja näytteessä olevien vasta-aineiden välillä !t’.j muodostuneiden immunokompleksien läsnäolo havaitaan ja tä- män havaitsemisen nojalla EBV-vasta-aineiden läsnäolo näyt-teessä tiedetään ja se voidaan määrittää kvantitatiivises-35 ti.

MMI • » 113298 15

Reagenssin luonteesta ja muista piirteistä riippuen tapahtuva immunokemiailinen reaktio on niin kutsuttu ker-rosreaktio, agglutinaatioreaktio, kompetitioreaktio tai in-hibitioreaktio.

5 EBV:n havaitsemiseksi näytteessä keksinnön mukainen diagnostinen reagenssi, joka sisältää yhden tai useamman peptidin, voidaan saattaa kontaktiin näytteen ja EBV-vasta-aineen kanssa, minkä jälkeen voidaan havaita muodostuneiden immunokompleksien läsnäolo ja tämän pohjalta määrittää 10 EBV:n läsnäolo näytteessä.

Samoin voidaan käyttää kerrosformaattia, jossa näyte saatetaan kontaktiin yhden tai useamman peptidin kanssa, jotka on päällystetty kiinteän kantajan pintaan, esimerkiksi mikrotestikuopan sisäseinään, ja yhden tai useamman lei-15 matun peptidin tai leimatun anti-vasta-aineen kanssa, minkä jälkeen minkä tahansa leiman läsnäolo kiinteässä faasissa voidaan havaita.

Keksintö koskee lisäksi menetelmää, jolla voidaan havaita Epstein-Barr-virusta vastaan suunnattuja vasta- 20 aineita näytteessä, ja jolle on tunnusomaista, että näyte • saatetaan kontaktiin keksinnön mukaisen diagnostisen rea- V ! genssin kanssa, ja mainitun reagenssin ja vasta-aineiden ; ] välillä muodostuneet immunokompleksit havaitaan.

« · · '· Keksinnön mukainen testitarvikesarj a käsittää 2 5 oleellisena ainesosana edellä kuvatun diagnostisen reagens-.,!!* sin. Kun kerrosreaktio suoritetaan, testitarvikesarj a voi : käsittää EBV-vasta-aineiden havaitsemista varten esimerkik si keksinnön mukaisen peptidin, joka on päällystetty kiin-teän kantajan pintaan, esimerkiksi mikrotestikuopan sisä-30 seinään, ja joko keksinnön mukaisen leimatun peptidin tai ,· _ leimatun anti-vasta-aineen.

'· ” Kompetitioreaktion suorittamista varten testitarvi- ‘ ' kesarja voi käsittää keksinnön mukaisen peptidin, joka on t päällystetty kiinteän kantajan pintaan, ja leimatun vasta-35 aineen, joka on suunnattu EBV:tä vastaan, edullisesti mono- 113298 16 klonaalisen vasta-aineen, joka on suunnattu mainittua peptidiä vastaan.

Agglutinaatioreaktiossa testitarvikesarja käsittää immunokemiallisen reagenssin, joka voi käsittää keksinnön 5 mukaisen peptidin, joka on päällystetty partikkeleihin tai sooleihin.

Toinen testitarvikesarjan suoritusmuoto on esimerkiksi keksinnön mukaisen leimatun peptidin käyttö immunoke-miallisena reagenssina kompetitioreaktiossa, jossa se kil- 10 pailee havaittavan EBV-antigeenin kanssa kiinteän kantajan pintaan sidotun, EBV:tä vastaan suunnatun vasta-aineen pinnalla olevasta sitoutumiskohdasta.

Edellä oleva esitys kuvaa yleisesti tätä keksintöä. Täydellisempi ymmärrys voidaan saada aikaan viittaamalla 15 seuraaviin spesifisiin esimerkkeihin, jotka tarjotaan yksinomaan havainnollistamistarkoituksia varten ja joiden ei ole tarkoitus rajoittaa keksinnön suojapiiriä.

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio 1: 20 Immunoblottausanalyysi satunnaisesti kerätyistä terveiden verenluovuttajien näytteistä, jotka testattiin silmälläpitäen seerumin IgG:n reaktiivisuutta EBV-• proteiinien kanssa (EBNA + VCA), jotka ekspressoitiin vi- : -j rustuottajasolulinjassa P3HRi - HH514 - C16.

* 25 Kuvio 2: f· Elisa-reaktiivisuus (optinen tiheys 450 nm:n alu- . eella) ihmisen seeruminäytteistä, silmällä pitäen IgG- reaktiivisuutta VCA-pl8:ta ja EBNA-l:tä vastaan yksinään ja yhdistelmänä.

• · 30 ♦ tai 0 osoittaa seerumeita, jotka ovat negatiivi- * * *;* siä standardinomaisessa serologisessa analyysissä sekä VCA- ·“/·! että EBNA-vasta-aineiden suhteen.

tai □ osoittaa seerumeita, jotka ovat positiivi- ;·* siä standardinomaisessa serologisessa analyysissä sekä VCA- * »· 35 että EBNA-vasta-aineiden suhteen.

• > I) I

EBNA-yhdistelmäpeptidi: 113298 17

Peptidi, jonka aminohapposekvenssi on SEQ ID nro 9:n mukainen.

VCA-yhdistelmäpeptidi:

Peptidi, jonka aminohapposekvenssi on SEQ ID nro 5 4:n mukainen.

EBNA- ja VCA-yhdistelmäpeptidi:

Yhdistelmä kahdesta peptidistä, joiden aminohapposekvenssit ovat SEQ ID nro 4:n ja 9:n mukaiset.

Kuvio 3: 10 ELISA-reaktiivisuus (optinen tiheys 450 nm) joukosta ihmisseerumeita, jotka on hankittu terveiltä veren luovuttajilta Amerikan Yhdysvalloista, silmälläpitäen IgG-reaktiivisuutta VCA-pl8:ta ja EBNA-l:tä vastaan yksin ja yhdistelmänä.

15 Kuvio 4: ELISA-reaktiivisuus (optinen tiheys 450 nm) joukosta ihmisseerumeita, jotka on hankittu terveiltä veren luovuttajilta Hong Kongista, silmälläpitäen IgG-reaktii-visuutta VCA-pl8:ta ja EBNA-l:tä vastaan yksin ja yhdistel- 2 0 mänä.

Kuvio 5: : ELISA-reaktiivisuus (optinen tiheys 450 nm) joukos- • ta ihmisseerumeita, jotka on hankittu potilailta Hong Kon- [ gista, jotka kärsivät nenä-nielusyövästä (NPC), silmällä :* 25 pitäen IgG-reaktiivisuutta VCA-pl8:ta ja EBNA-l:tä vastaan ·· yksin ja yhdistelmänä.

. c. Kuvio 6: ELISA-reaktiivisuus (optinen tiheys 450 nm) joukos-ta ihmisseerumeita, jotka on hankittu terveiltä veren- • » 30 luovuttajilta Amerikan Yhdysvalloista (n = 38), silmällä y pitäen IgG-reaktiivisuutta MA-gp350/220:tä ja EBNA-l:tä vastaan yksin ja yhdistelmänä.

*:**: Kuvio 7: ELISA-reaktiivisuus (optinen tiheys 450 nm) joukos- ] . 35 ta ihmisseerumeita, jotka on hankittu terveiltä veren- » luovuttajilta Hong Kongista (n=37), silmälläpitäen IgG- 113298 18 reaktiivisuutta MA-gp350/220:tä ja EBNA-l:tä vastaan yksin ja yhdistelmänä.

Kuvio 8: ELISA-reaktiivisuus (optinen tiheys 450 nm) joukos-5 ta ihmisseerumeita, jotka on hankittu potilailta Hong Kongista, jotka kärsivät nenä-nielusyövästä (NPC), silmällä pitäen IgG-reaktiivisuutta MA-gp350/220:tä ja EBNA-l:tä vastaan yksin ja yhdistelmänä.

Esimerkki 1 10 Suoritettiin immunoblottausanalyysi satunnaisesti kerätyistä terveistä verenluovuttajanäytteistä, jotka testattiin silmällä pitäen seerumin IgG:n reaktiivisuutta EBV-proteiinien (EBNA + VCA) suhteen. Proteiinit ekspressoitiin virustuottajasolulinjassa P3HR1-HH514-CI6, erotettiin dena- 15 turoivassa SDS-PAGEssa pelkistävissä olosuhteissa ja siirrettiin nitroselluloosalle kuten jäljempänä yksityiskohtaisesti kerrotaan:

Proteiiniuutteet valmistettiin EBV-tuottajasolu-linjan HH514.C16 (P3HRi6-peräinen) tumafraktiosta, joka oli 20 erotettu denaturoivassa natriumdodekyylisulfaatti (SDS) -polyakryyliamidigeelielektroforeesissa (PAGE) pelkistävis-: sä olosuhteissa 10-prosenttisissa akryyliamidilevygeeleis- : j sä. Elektroforeettisen erottamisen jälkeen proteiinit siir- I j rettiin nitroselluloosa-arkeille, jotka leikattiin sittem- ;· 25 min pieniksi (3 mm:n) liuskoiksi.

:'· EBV-proteiinit sisältäviä liuskoja liotettiin fos- faattipuskuroidussa suolaliuoksessa, pH 7,4 (PBS) , joka oli 4-prosenttinen maitojauheliuoksen ja 5-prosenttinen hevosen ;v# seerumin suhteen ja sisälsi 0,05 % Tween-20:tä (tukkimis- » · 30 puskuri) , 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Ihmisseerumei- • · ”* ta, jotka oli laimennettu 1:100 tukkimispuskurissa, inku- ϊ/.ί boitiin yksittäisten liuskojen kanssa 1 tunnin ajan huo- ·:··: neenlämpöt ilassa, minkä jälkeen liuskat pestiin 4 kertaa PBS:llä, joka oli 0,05-prosenttinen Tween-20:n suhteen. Si- » · » 35 toutunut, EBV:tä vastaan suunnattu IgG havaittiin käyttämällä ihmisen IgG:tä vastaan suunnattuja peroksidaasilei- 113298 19 mattuja lampaan vasta-aineita ja 4-kloronaftolia värinkehi-tykseen.

Nämä menetelmät kuvataan yksityiskohtaisesti artikkeleissa J. Virol. Meth 21 (1988) ja J. Med. Virol. 40 5 (1993) 161 - 169.

Asiaankuuluvien diagnostisten markkerimolekyylien VCA-pl8 ja EBNA-1 sijainti osoitetaan nuolella.

Kontrolliseerumit olivat peräisin tunnetusta EBV-negatiivisesta (-) ja vahvasti EBV-positiivisesta (+) luo- 10 vuttajasta.

Seerumit 1-37 edustavat satunnaisesti kerättyjä seeruminäytteitä terveiltä verenluovuttajilta.

Edellä kuvatun immunoblottausanalyysin tulokset esitetään kuviossa 1.

15 Kaikki seerumit testattiin EBV-seropositiivisiksi standardinomaisilla kaupallisesti saatavilla olevalla immu-nofluoresenssiin perustuvalla diagnostiikalla, lukuun ottamatta seerumia nro 8, joka oli EBV-seronegatiivinen.

Markkeriproteiinit VCA-pl8 ja EBNA-1 osoitetaan.

20 Lukuun ottamatta satunnaisia EBV-seronegatiivisia luovutta- ; jia, joilta EBV-spesifiset vasta-aineet puuttuvat (esim.

! nro 8), EBV-seropositiivisilta luovuttajilta peräisin ole- | van IgG:n havaitaan reagoivan monien erilaisten EBV- ’ ’1 proteiinien kanssa, selkeimmin ja useimmin VCA-pl8:n ja EB- * 1 ί 25 ΝΑ-1:n kanssa (katso nuolet).

,, i’ Seerumit nro 9, 12, 16, 18, 19, 31 ovat VCA-pl8- V · vasta-aineen suhteen positiivisia ja niillä on heikko - ne gatiivinen EBNA-1-vasta-ainereaktiivisuus, kun taas seeru-mit nro 11, 14, 21, 22, 30, 37 ovat EBNA-1-vasta-aineen 1 » 30 suhteen positiivisia ja niillä on matala tai negatiivinen I I · ,· . VCA-pl8-vasta-ainereaktiivisuus.

· Esimerkki 2 * 1 1 « · ‘ 1 Kuvio 2 esittää tulokset entsyymiin kytketystä im- , munosorbenttimäärityksestä, jossa käytettiin puhdistettuja 35 reagensseja, jotka edustivat spesifisesti joko VCA-pl8:aa tai EBNA-1:tä yksinään tai yhdistelmänä. Tässä kokeessa 113298 20

VCA-pl8 tai EBNA-l-yhdistelmäpeptidejä käytettiin konsent-raationa 1 Mg/ml 0,05-molaarisessa NaHC03-puskurissa, pH

9,6, päällysteenä kiinteän faasin pinnalla joko yksinään tai yhdessä 1:1-yhdistelmänä. Samaa seerumijoukkoa, jota 5 käytettiin esimerkissä 1 (kuvio 1) , käytettiin tarkkailtaessa vasta-aineen reaktiivisuutta. Vaikka kaikkien seerumien voidaankin osoittaa olevan (rajalla) EBV-positiivisia, kun käytetään VCA-pl8:sta ja EBNA-l:stä erikseen saatujen tulosten yhdistelmää, voidaan tehdä yksinkertaisempi suora 10 ja tarkempi arvio, joka perustuu kahden markkerin yhdistämiseen yksittäiseksi määritykseksi.

Esimerkki 3

Kuvio 3, 4 ja 5 osoittavat tulokset entsyymiin kytketystä immunosorbenttimäärityksestä, jossa käytettiin puh-15 distettuja reagensseja, jotka spesifisesti edustivat joko VCA-pl8:aa tai EBNA-l:tä yksinään tai yhdistelmänä. Näissä kokeissa VCA-pl8- tai EBNA-l-yhdistelmäpeptidejä käytettiin konsentraationa 1 μ9/ηι1 0,05-molaarisessa NaHCC>3-puskurissa, pH 9,6, päällysteenä kiinteän faasin pinnalla 20 joko yksinään tai yhdessä 1:1-yhdistelmänä.

Kuviossa 3 joukkoa terveiltä verenluovuttajilta ’ Amerikan Yhdysvalloista saatuja seerumeita käytettiin arvi- • oltaessa vasta-aineen reaktiivisuutta. Vaikka kaikkien see- '· rumien voidaankin osoittaa olevan (rajalla) EBV- ♦ : 25 positiivisia, kun käytetään VCA-pl8:sta ja EBNA-l:stä erik- t ·* seen saatujen tulosten yhdistelmää, voidaan tehdä yksinker- V · taisempi suora ja tarkempi arvio, joka perustuu kahden markkerin yhdistämiseen yksittäiseksi määritykseksi.

·*·’. Kuviossa 4 joukkoa terveiltä verenluovuttajilta • » .**·. 3 0 Hong Kongista saatuja seerumeita käytettiin arvioitaessa • · » • vasta-aineen reaktiivisuutta. Vaikka kaikkien seerumien • · • « * '· "· voidaankin osoittaa olevan (rajalla) EBV-positiivisia, kun ‘ ' käytetään VCA-pl8:sta ja EBNA-l:stä erikseen saatujen tu- losten yhdistelmää, voidaan tehdä paljon yksinkertaisempi 3 5 suora ja tarkempi arvio, joka perustuu kahden markkerin yh distämiseen yksittäiseksi määritykseksi.

113298 21

Kuviossa 5 Hong Kongista peräisin olevilta, nenä-nielusyövästä (NPC) kärsiviltä potilailta saatuja seerumeita käytettiin arvioitaessa vasta-aineen reaktiivisuutta. Vaikka kaikkien seerumien voidaankin osoittaa olevan (ra-5 jalla) EBV-positiivisia, kun käytetään VCA-pl8:sta ja ΕΒΝΆ-l:stä erikseen saatujen tulosten yhdistelmää, voidaan tehdä yksinkertaisempi suora ja tarkempi arvio, joka perustuu kahden markkerin yhdistämiseen yksittäiseksi määritykseksi. Pelkän VCA-yhdistelmäpeptidin (kuvion vasen osa) ja yhdis-10 tetyn VCA- ja EBNA-yhdistelmäpeptidin (kuvion oikea osa) välinen ero on erityisen huomattava.

Edellä esitetyt kokeet osoittavat, että eri ihmispopulaatioissa, joissa EBV:hen liittyvät oireet ovat erilaisia (tai terveissä ihmispopulaatioissa) VCA- ja EBNA-15 yhdistelmäpeptidi osoittaa, että voidaan tehdä yksinkertaisempi suora ja tarkempi arvio, joka perustuu kahden markkerin yhdistämiseen yksittäiseksi määritykseksi.

Esimerkki 4

Kuviot 6, 7 ja 8 osoittavat tulokset entsyymiin 20 kytketystä immunosorbenttimäärityksestä, jossa käytettiin • ^ puhdistettuja reagensseja, jotka spesifisesti edustivat jo- • » ! ko MA-gp350/220:tä tai EBNA-l:tä yksinään tai yhdistelmänä.

i « ; ; Tässä kokeessa puhdistettua MA-gp350/220-proteiinia (puh- t * · ' '* distettu Hessingin ym. artikkelin mukaisesti, Journal of : 25 Chromatography, 599, s. 267 - 272, (1992)) tai EBNA-1- yhdistelmäpept idej ä käytettiin konsentraationa 1 Mg/ml V · 0,05-molaarisessa NaHCCh-puskurissa, pH 9,6, päällysteenä kiinteän faasin pinnalla joko yksinään tai yhdessä 1:1-yhdistelmänä. Näissä kokeissa käytetty seerumi joukko osoi-30 tetaan kuvioissa (kuvio 6, 7 ja 8) ja sitä käytettiin arvi- < * · ,· , oltaessa vasta-aineen reaktiivisuutta. Vaikka useimpien » · * seerumien voidaan osoittaa olevan (rajalla) EBV- <<111 ' · seropositiivisia kun käytetään MA-gp350/220:stä ja EBNA- 1: stä erikseen saatujen tulosten yhdistelmää, voidaan tehdä 3 5 yksinkertaisempi, suora ja tarkempi arvio joka perustuu kahden markkerin yhdistämiseen yksittäiseksi määritykseksi.

22 1 13298

Kuviossa 6 joukkoa terveiltä verenluovuttajilta Amerikan Yhdysvalloista saatuja seerumeita käytettiin arvioitaessa vasta-aineen reaktiivisuutta. Vaikka kaikkien seerumien voidaankin osoittaa olevan (rajalla) EBV-5 seropositiivisia, kun käytetään MA-gp350/220:stä ja EBNA-1:stä erikseen saatujen tulosten yhdistelmää, voidaan tehdä yksinkertaisempi suora ja tarkempi arvio, joka perustuu kahden markkerin yhdistämiseen yksittäiseksi määritykseksi.

Kuviossa 7 joukkoa terveiltä verenluovuttajilta 10 Hong Kongista saatuja seerumeita käytettiin arvioitaessa vasta-aineen reaktiivisuutta. Vaikka kaikkien seerumien voidaankin osoittaa olevan (rajalla) EBV-seropositiivisia, kun käytetään MA-gp350/220:stä ja EBNA-l:stä erikseen saatujen tulosten yhdistelmää, voidaan tehdä yksinkertaisempi 15 suora ja tarkempi arvio, joka perustuu kahden markkerin yhdistämiseen yksittäiseksi määritykseksi.

Kuviossa 8 Hong Kongista peräisin olevilta, nenä-nielusyövästä (NPC) kärsiviltä potilailta saatuja seerumeita käytettiin arvioitaessa vasta-aineen reaktiivisuutta.

20 Vaikka kaikkien seerumien voidaankin osoittaa olevan (ra- , . jalla) EBV-seropositiivisia, kun käytetään MA-gp350/220:stä » · ; ja EBNA-1:stä erikseen saatujen tulosten yhdistelmää, voi- » · ' “· daan tehdä yksinkertaisempi suora ja tarkempi arvio, joka 'Ϊ perustuu kahden markkerin yhdistämiseen yksittäiseksi mää- 2 5 ritykseksi.

t 1' Edellä esitetyt kokeet osoittavat, että eri ihmis- : Λ* populaatioissa, joissa EBV:hen liittyvät oireet ovat eri laisia (tai terveissä ihmispopulaatioissa), diagnostinen ;\\ reagenssi, joka käsittää ainakin osan VCA-proteiinista tai ,*··. 3 0 ainakin osan MA-proteiinista yhdistelmänä ainakin EBNA- proteiinin osan kanssa, osoittaa, että voidaan tehdä yksin-kertaisempi suora ja tarkempi arvio, joka perustuu kahden markkerin yhdistämiseen yksittäiseksi määritykseksi.

:*. Edellä olevan kirjoitetun patenttihakemuksen aja- 3 5 teilaan olevan riittävä antamaan ammattimiehelle kyvyn kek sinnön suorittamiseen. Keksintöön voidaan tehdä lukuisia 113298 23 modifikaatioita tässä esitettyjen ja kuvattujen lisäksi, ja ne tulevat ammattimiehille ilmeisiksi edellä olevasta kuvauksesta ja ne kuuluvat liitteenä olevien patenttivaatimusten suojapiiriin.

5 i · » * · • t k · t 9 9 ' · • · * * » 9 • » 9 » * · * * 9 9 9 II»» • t • · 9 MM» » » 24 113298

Sekvenssilista: (1) GENERAL INFORMATION: (i) APPLICANT: (A) NAME: Akzo Nobel N.V.

(B) STREET: Velperweg 76 (C) CITY: Arnhem (E) COUNTRY: The Netherlands

(F) POSTAL CODE (ZIP): 6824 BM

(ii) TITLE OF INVENTION: Diagnostic reagents for the detection of antibodies to EBV.

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 9 (iv) COMPUTER READABLE FORM: (A) MEDIUM TYPE: Floppy disk (B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS/MS-DOS

; (D) SOFTWARE: Patentin Release #1.0, : Version #1.25 (EPO) • j* (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 176 amino acids ,···, (B) TYPE: amino acid 'I’ (C) STRANDEDNESS: single ”\'i (D) TOPOLOGY: linear 1 I t i t t MOLECULE TYPE: peptide 113298 25 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 1:

Met Ala Arg Arg Leu Pro Lys Pro Thr Leu 15 10

Gin Gly Arg Leu Glu Ala Asp Phe Pro Asp 15 20

Ser Pro Leu Leu Pro Lys Phe Gin Glu Leu 25 30

Asn Gin Asn Asn Leu Pro Asn Asp Val Phe 35 40

Arg Glu Ala Gin Arg Ser Tyr Leu Val Phe 45 50

Leu Thr Ser Gin Phe Cys Tyr Glu Glu Tyr 55 60

Val Gin Arg Thr Phe Gly Val Pro Arg Arg 65 70

Gin Arg Ala lie Asp Lys Arg Gin Arg Ala 75 80

Ser Val Ala Gly Ala Gly Ala His Ala His -85 90

Leu Gly Gly Ser Ser Ala Thr Pro Val Gin i 95 100 , * Gin Ala Gin Ala Ala Ala Ser Ala Gly Thr . ·; 105 110 I* Gly Ala Leu Ala Ser Ser Ala Pro Ser Thr ·· 115 120

Ala Val Ala Gin Ser Ala Thr Pro Ser Val 125 130

Ser Ser Ser lie Ser Ser Leu Arg Ala Ala \.l* 135 140

Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala Ser Ala '·.*·; 145 150 ·:**: Ala Ala Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly ;/ 155 160

Gly Gly Gin Pro His Asp Thr Ala Pro Arg * · * · * 165 170 113298 26

Gly Ala Arg Lys Lys Gin 175 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 2:

Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Gly 15 10

Gin Pro His Asp Thr Ala Pro Arg Gly Ala 15 20 ; · Arg Lys Lys Gin » * _ ;· (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 3: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 30 amino acids ;v. (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear 1 MOLECULE TYPE: peptide 113298 27 (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 3:

Ser Thr Ala Val Ala Gin Ser Ala Thr Pro 15 10

Ser Val Ser Ser Ser lie Ser Ser Leu Arg 15 20

Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala 25 30 (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 4: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 56 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 4:

Ser Thr Ala Val Ala Gin Ser Ala Thr Pro 15 10 !*' Ser Val Ser Ser Ser lie Ser Ser Leu Arg Γ 15 20

Ala Ala Thr Ser Gly Ala Thr Ala Ala Ala 25 30 ; ,·. Cys Cys Ala Val Asp Thr Gly Ser Gly Gly !···, 35 40 ’·’ Gly Gly Gin Pro His Asp Thr Ala Pro Arg :.’·ί 45 50

Gly Ala Arg Lys Lys Gin 55 * · (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 5: 28 1 13 2 9 8 (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 123 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 5:

Gly Gly Ser Gly Gly Arg Arg Gly Arg Gly 15 10

Arg Glu Arg Ala Arg Gly Gly Ser Arg Glu 15 20

Arg Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly 25 30

Glu Lys Arg Pro Arg Ser Pro Ser Ser Gin 35 40

Ser Ser Ser Ser Gly Ser Pro Pro Arg Arg : i 45 50 ·. Pro Pro Pro Gly Arg Arg Pro Phe Phe His 55 60 :* Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr Phe Glu Tyr ;· 65 70 . His Gin Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro 75 80 ;v> Asp Val Pro Pro Gly Ala lie Glu Gin Gly 85 90

Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser 95 100

Thr Gly Pro Arg Gly Gin Gly Asp Gly Gly 105 110

Arg Arg Lys Lys Gly Gly Trp Phe Gly Lys 115 120 113298 29

His Arg Gly (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 6: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 24 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 6:

Arg Ala Arg Gly Arg Gly Arg Gly Arg Gly 15 10

Glu Lys Arg Pro Arg Ser Pro Ser Ser Gin 15 20

Ser Ser Ser Ser * * · M i · • I ·

! I

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 7: ;· (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 31 amino acids t (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single ' (D) TOPOLOGY: linear j (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 7: 30 113298

Pro Arg Arg Pro Pro Pro Gly Arg Arg Pro 15 10

Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp Tyr 15 20

Phe Glu Tyr His Gin Glu Gly Gly Pro Asp 25 30

Gly (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 8: (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 31 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide ; (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 8: * * t

• I

Gin Glu Gly Gly Pro Asp Gly Glu Pro Asp 15 10 *:· Val Pro Pro Gly Ala lie Glu Gin Gly Pro 15 20

Ala Asp Asp Pro Gly Glu Gly Pro Ser Thr 25 30

Gly F·! (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 9: _ . (i) SEQUENCE CHARACTERISTICS: (A) LENGTH: 58 amino acids 31 113298 (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS: single (D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: peptide (xi) SEQUENCE DESCRIPTION: SEQ ID NO: 9:

Pro Pro Arg Arg Pro Pro Pro Gly Arg Arg 15 10

Pro Phe Phe His Pro Val Gly Glu Ala Asp 15 20

Tyr Phe Glu Tyr His Gin Glu Cys Cys Asp 25 30

Gly Glu Pro Asp Val Pro Pro Gly Ala lie 35 40

Glu Gin Gly Pro Ala Asp Asp Pro Gly Glu 45 50

Gly Pro Ser Thr Gly Pro Arg Gly 55 * · * t • · • 1 · • · • « · • 1 ·

Claims (14)

113298

1. Diagnostinen reagenssi Epstein-Barr-virusta vastaan suunnattujen vasta-aineiden havaitsemista varten, 5 tunnettu siitä, että reagenssi käsittää yhdistelmän, jossa on ainakin osa Epstein-Barr-viruksen puhdistetusta rakenneproteiinista ja ainakin osa Epstein-Barr-viruksen puhdistetusta EBNA-proteiinista.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen diagnostinen rea-10 genssi, tunnettu siitä, että viruksen rakennepro- teiini on MA-proteiini.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen diagnostinen reagenssi, tunnettu siitä, että MA-proteiini on MA-gp350/220-proteiini.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen diagnostinen rea genssi, tunnettu siitä, että viruksen rakennepro-teiini on VCA-proteiini.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen diagnostinen reagenssi, tunnettu siitä, että VCA-proteiini on VCA- 20 pl8-proteiini.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen diagnostinen rea- * · : ; ·* genssi, tunnettu siitä, että mainittu reagenssi 1 käsittää peptidin, joka mainittu peptidi käsittää ainakin osan SEQ ID nro l:n mukaisesta aminohapposekvenssistä. , ·’ 25

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen diagnostinen rea- 1 i* genssi, tunnettu siitä, että mainittu peptidi kä- sittää SEQ ID nro 2:n, 3 :n tai 4:n mukaisen aminohappose- i kvenssin. ,’V.

8. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-7 mukainen » t ,··, 3 0 diagnostinen reagenssi, tunnettu siitä, että EBNA- • · proteiini on EBNA-1-proteiini.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen diagnostinen rea-'·"· genssi, tunnettu siitä, että mainittu reagenssi käsittää peptidin, joka käsittää ainakin osan SEQ ID nro t s » » 35 5:n mukaisesta aminohapposekvenssistä. • · „ 113298

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen diagnostinen reagenssi, tunnettu siitä, että mainittu peptidi käsittää SEQ ID nro 6-.n, 7-.n, 8:n tai 9-.n mukaisen aminohapposekvenssin.

11. Patenttivaatimuksen 4 mukainen diagnostinen reagenssi, tunnettu siitä, että siinä on peptidi jolla on SEQ ID nro 4:n mukainen aminohapposekvenssi ja peptidi, jolla on SEQ ID nro 9:n mukainen aminohapposekvenssi .

12. Patenttivaatimuksen 3 mukainen diagnostinen reagenssi, tunnettu siitä, että mainittu reagenssi käsittää peptidin jolla on SEQ ID nro 9:n mukainen aminohapposekvenssi.

13. Menetelmä Epstein-Barr-virusta vastaan suunnat- 15 tujen vasta-aineiden havaitsemiseksi näytteessä, tun nettu siitä, että mainittu näyte saatetaan kontaktiin minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-12 mukaisen diagnostisen reagenssin kanssa, ja mainitun reagenssin ja vasta-aineiden välillä muodostuneet immunokompleksit havaitaan.

14. Testitarvikesarja Epstein-Barr-virusta vastaan . suunnattujen vasta-aineiden havaitsemiseksi näytteessä, • j tunnettu siitä, että mainittu testitarvikesarja kä- • · '· sittää minkä tahansa patenttivaatimuksen 1-12 mukaisen i · *. *: diagnostisen reagenssin. • » · * · · * » * » * · » » • * < I I ***** • · I » I ***** * · 113298