KR100378942B1 - 엡스타인-바비루스(ebv)에대한항체의검출용진단시약 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 엡스타인 바 비루스에 대한 항체의 검출용 진단제 및 샘플내에서 엡스타인 바 비루스에 대한 항체를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 진단제는 엡스타인 바 비루스성 구조 단백질, 바람직하게는 엡스타인 바 VCA-단백질 또는 엡스타인 바 MA 단백질의 적어도 일부분 및 엡스타인 바 EBNA 단백질의 적어도 일부분과의 혼합물을 포함한다. 바람직하게 VCA-단백질은 VCA-P 18 단백질, MA-단백질은 MA gp350/220 단백질 및 EBNA-단백질은 EBNA-1 단백질이다.
단일 진단 분석내에서 VCA-단백질 또는 MA-단백질과 EBNA 단백질의 혼합물은 통용하는 방법보다 감도와 정확성이 더 높은 EBV-항체 검출 방법을 제공한다.

Description

엡스타인-바 비루스(EBV)에 대한 항체의 검출용 진단 시약
본 발명은 엡스타인-바 비루스에 대한 항체의 검출용 진단 시약 및 샘플내에서 엡스타인-바 비루스에 대한 항체를 검출하는 방법에 관한 것이다.
EBV는 버키트(Burkitt)의 임파종(BL)의 아프리카(풍토병) 형태와 관련하여 최초로 발견된 도처에 존재하는 인체 헤르페스 비루스이다. 그 후 상기 비루스는 비인두암(NPC)과 관련하여서도 발견되었으며 전염성 단핵세포 증가증(IM)의 원인제로 알려졌다. 일반적으로 감염은 유년기에 나타나 가끔은 가벼운 징후를 동반하는 준임상 징후를 초래한다. 그러나 청소년기 및 성년기중의 감염은 말초내에서 무정형 임파구의 존재로 특징짓는 IM을 초래할 수 있다. 이들 임파구의 대부분은 T 세포 임파구이나, 소수는 EBV에 의해 감염된 B 세포 임파구이다. 또한 B 세포 임파구의 감염은 체외에서 수행될 수도 있다. 그런 세포는 형질전환되고 배양시 무한 증식하여 "무한 증식성", "잠복 감염된" 또는 "형질전환된 성장" 으로 언급되어 왔다. 공지된 바에 한하여, EBV에 감염된 모든 개체는 평생 잠복 감염된 상태이다. 이것은 순환하는 말초 혈액 임파구중 소수의 EBV-게놈 양성인 형질전환된 B-세포의 평생 연속적인 존재 및 구강인두내 비루스의 연속적인 그러나 주기적인 발산으로 인한 것이다.
대다수의 경우에서, EBV 감염은 일시적 쇠약을 야기할 수 있는 임파구 증식성 질병을 초래하지만 항상 양성이며 자기제한적이다. 그러나 어떤 면역억제된 개체에서 상기 결과는 심각한 악성이 될 수 있다. 이것은 의도적으로 면역억제된 개체, 특히 시클로스포린 A 로 처리된 장기를 이식받는 아이에서 발생하거나 또는HIV에 감염된 개체의 경우처럼 기회적으로 또는 XLP(X- 연결된 임파구 증식성 증후군) 유전자를 보유하는 발병된 남성의 경우처럼 유전적으로 발생한다. 이들 경우에 있어서, 생성되는 악성종양은 EBV-감염된 B 세포의 다클론 증식으로부터 유래한다. 또한, 그런 환자에서 비루스의 제어되지 않은 상피 복제는 구강의 털모양의 백반증 병변에서 검출가능하다. 따라서, 면역응답은 EBV 감염의 제어에 증요한 역할을 한다.
세포 또는 조직내 EBV의 존재는 비루스성 게놈을 검출하여 입증하거나 또는 EBV-감염된 세포내에서 일반적으로 발현되는 잠복성과 관련된 유일한 단백질 산물인 EBNA-1 단백질을 검증하여 입증할 수 있다.
상기한 바와 같이 EBV는 헤르페스 비루스의 한 성분이며 하기하는 구조적 특성을 보유한다 :
- EBV 게놈은 선형 2 본쇄 DNA 분자(172,000 염기쌍)로 구성된다.
- 비리온은 코어(단백질 및 DNA), 코어를 둘러싸고 있는 20 면체 캡시드, 및 이 캡시드를 둘러싸고 있는 외막(a membrane envelope)으로 구성된다. 20 면체 캡시드는 6량체 및 5량체 캡소미어로 이루어진다.
외막은 그의 외부표면상에 스파이크(spike)를 갖는 단백질/지질 2 층막으로 구성된다. 캡시드 쉘과 외막사이의 공간은 외피(tegument)라 불리는 무정형 단백질로 충전된다.
- 모든 헤르페스 비루스와 동일하게, EBV는 1 차 감염 결과 숙주내의 잠복성의 평생 감염 상태를 확립할 수 있다. 이 잠복성은 숙주의 면역계에 의해 제어되는EBV와 그것의 인간 숙주 사이의 완벽한 균형을 나타낸다.
지금까지 대부분의 생화학적 및 생물학적 연구는 EBV의 3 가지 원형(prototype) 균주 즉, B95-8(명주원숭이(marmoset) 세포주에서 생성된 형질전환 비루스), P3HR1 (버키트의 임파종 종양세포주에 의해 생성되는 비-형질전환 비루스) 및 Raji (버키트의 임파종 종양 세포주내의 잠복성 비루스)로 수행되어 왔다.
최근 몇년동안 원형 비루스 균주인 B95-8의 전체 DNA 서열이 결정되었다. 이 서열의 분석으로 80개 이상의 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 확인하였다[참조 : Baer 등, 1984, Nature 310, P 207-211].
EBV 생물학은 그 생물학적 특성(잠복성 감염)이 고전적인 비루스 분석에 기여하기 때문에 연구자에게 특별한 문제점을 부여한다. 게다가 그것의 세포 및 숙주 범위는 일반적으로 체외 배양에 적합하지 않은 인체(및 몇몇 고등 영장류) B-세포 임파구 및 상피 세포로 효과적으로 제한된다. 또한, 완전 허용성인 세포유형, 즉 이 비루스를 용균적으로 복제시키는 세포 유형은 이 비루스를 대량 생성하는 능력을 심각하게 제한하였다.
B95-8, P3HR1-분리주 및 Raji-분리주의 DNA 분자는 상세한 제한 엔도 뉴클레아제 지도화를 위한 원형, 에스케리치아 콜리(이. 콜리) 플라스미드 및 박테리오파지 람다내에 클로닝을 위한 원형, 및 뉴클레오티드 서열결정을 위한 원형이 되어 왔다.
EBV-게놈은 특이적으로 직렬로 반복되는 DNA-요소로 이루어진 단일 2 본쇄DNA 분자로 구성되어 있다. DNA 분자의 각각의 말단은 게놈의 공유결합 및 원형화를 일으키는 다수의 말단 서열을 포함한다. 비루스 입자에서 EBV-게놈은 단지 선형으로 검출가능하다. 그 반면에, 잠복 감염된 세포의 핵내에서 상기 게놈은 원형 에피솜으로 존재하며 종종 숙주세포 염색체내에 통합된다.
내부의 반복서열 즉 IR1 내지 IR4는 EBV-게놈을 5개의 특이 영역으로 분리시킨다. U2 및 U3 영역은 상이한 EBV 분리주 사이에서 광범위하게 변화하며 전파는 EBV의 P3HR-1 균주내에서는 거의 완전히 결실되어 있다.
EBV 리딩 프레임의 명명은 비루스 게놈내에서 그들의 위치에 기초한다. 그 이름은 발현이 시작되는 BamHI 또는 EcoRI 제한 단편의 머리글자로 시작된다. 이름의 3 번째 문자는 발현의 방향이 표준지도상에서 왼쪽이냐 오른쪽이냐에 따라 L 또는 R 이다(따라서 BLLF2는 BamHI 제한 단편 L에서 시작하는 제2 좌향 리딩 프레임이다).
EBV의 증식 사이클에서 비루스 항원의 혈청학적 분류는 다른 형광기술에 기초한다.
고정된 잠복 감염된 B-세포(예컨대, Raji-세포)의 핵내에서 항-보체 면역형광기술에 의해 특이적으로 검출된 항원은 엡스타인-바 핵 항원(EBNA)으로 분류된다.
비루스의 유전자 발현이 화학적 또는 비루스성 인자에 의해 활성화되면 초기항원(EA)의 합성이 비루스성 DNA 합성의 저해에 의해 차단되지 않는 임의 부류의 초기항원이 검출된다. 사용된 고정제(메탄올 또는 아세톤)의 유형에 따라 2개의 명백한 EA 세트, 즉 EAR및 EAD가 검출가능하다. EA는 유도된 세포의 세포질 및 핵내에서 간접 면역형광법에 의해 검출가능하다. 비루스성 DNA 합성이 개시된 후(및 그에 따라) 비루스 구조 단백질(막항원(MA) 및 비루스성 캡시드 항원(VCA)을 포함하는)이 합성되는데, 이 단백질은 간접 면역형광법에 의해 검출가능하다. 비루스 생산 세포(예컨대, P3HR1세포)의 세포질 및 핵중에 존재하는 일단의 VCA는 간접 면역형광법에 의해 검출가능하다. 감염된 생존 세포(비루스를 생산하도록 유도된)의 표면에서, 일단의 항원(MA)이 간접 면역형광법으로 검출 가능하다. 이들 항원은 비루스의 외막상에서 발견될 수도 있으며 비루스 중화를 위한 중요한 표적이 된다.
인체 혈청내에서 EBV-특이적인 항체의 검출은 일반적으로 문헌[Henle 및 Henle, Human Pathology, 5,551 ∼ 565, 1974]에 설명된 혈청학적 기술에 의해 수행될 수 있다.
생화학적 및 면역형광 자료에 기초하면 항원분자의 5개의 다른 부류를 구별하는 것이 가능하다. 다른 비루스성 폴리펩티드는 그들의 분자량에 의해 지정되며 그들을 특이적으로 나타내기 위한 모든 EBV-단백질에 대한 통상의 명명법은 확립되지 않았다.
하기하는 5개의 상이한 항원군이 있다 :
A. 잠복상태중에 발현된 항원군(EBNAs 및 LMPs)
B. 게놈 활성화 및 비루스 복제의 최초 유도를 담당하는 항원군(IEA).
C. IEA-유전자 생성물에 의해 유도되고, 비루스 DNA의 복제에 필요한 항원군; 이들 항원은 대부분 비루스성 효소(EA)이다.
D. 비루스 DNA 합성의 개시후 비루스성 복제 싸이클(VCA)의 후반기에 발현되고 비루스성 입자의 구조 요소인 항원군.
E. 감염된 세포의 세포막내에서 발현된 항원군(MA).
D 및 E 군은 소위 "비루스 구조 단백질" 이다.
엡스타인-바 핵 항원(EBNA)
리딩프레임 BKRF1에 암호화된 엡스타인-바 핵 항원 1 (EBNA-1)은 체내 및 체외에서 모든 잠복 감염된 세포 및 종양-관련 세포내에서 일반적으로 발현되는 유일한 EBV-암호화된 단백질이며 DNA-복제 및 유전자 활성화의 메카니즘을 연구하기 위한 중요한 표적 분자를 이룬다.
2개의 EBV-음성 인체 혈청과 비교하여 4개의 EBV-양성 인체 혈청을 이용한 면역블로팅 및 방사성 면역전기영동을 실시한 결과 EBV-양성 세포주에서는 EBNA-1이 확인되었으나, 3개의 EBV-음성 세포주에서는 EBNA-1이 확인되지 않았다. 확인된 항원은 분석된 다른 세포주에서는 분자량이 65,000 내지 73,000 으로 상이하였다. 보체-고정성 항원은 200배 이상 부분적으로 정제되었으며 면역 블로팅에 의해 확인된 65-KDa EBNA와 함께 동시 정제된 것으로 밝혀졌다. EBNA는 항-보체 면역형광법(ACIF)에 의해 정의되었기 때문에 65-KDa 항원이 EBNA의 주성분인 것으로 제안되었다.
EBNA 유전자는 EBV DNA의 클로닝된 BamHI K 제한 효소 단편을 사용하여 생쥐 세포를 형질감염시킴으로써 지도화되었다. 우성형질 선별가능한 마커와 함께 상기단편을 사용한 생쥐 섬유아세포주의 형질감염은 EBNA-양성 인체 혈청을 사용한 ACIF에서 확인된 핵 항원의 안정된 발현을 유도하지만, EBNA-음성 인체 혈청을 사용한 경우는 그러하지 않았다. 후속연구에서. Bam K-형질감염된 세포는 B95-8 세포의 EBNA-1 폴리펩티드와 함께 동시-이동된 78-KDa 폴리펩티드를 발현하는 것으로 밝혀졌다.
더 최근의 연구에서는 일반적으로 p62 또는 p107이라 칭하는 글리신-알라닌이 반복된 영역내에서 면역우성 영역을 밝혀냈는데, 이 영역은 인체 혈청과 강하게 반응한다. 그러나, 이 gly-ala 단편은 보통 인체 단백질내에 포함된 것으로 자가-항체의 표적임이 밝혀졌다. 또한, 추가 연구에 의해 활성 CMV, HSV 또는 톡소플라즈마 감염 환자에게서 얻은 혈청중 특히 IgM 항체가 종종 상기 펩티드와 교차 반응성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 또한, 이.콜리에서 발현된 EBNA-1의 AA 461-641을 암호화하는 28KD의 C-말단 단편은 인체 혈청 항체와 반응성이 있는 것으로 밝혀졌다. 지금까지 추가적인 연구는 진단학에서 완전한 EBNA-1 단백질을 대체하는데 사용할 수 있는 EBNA-1 단백질의 더 작은 단편을 확인하지는 못했다.
비루스성 캡시드 항원(VCA)
이 항원 복합체의 경우 폴리아크릴아미드 겔 시스템, 세포주, 및 사용된 화학적 유도 물질(inducer)과 혈청내의 변이 때문에 다른 연구에서 확인된 EBV 특이적인 단백질의 비교가 어렵다는 것도 고려 대상이다.
Dolyniuk 등(1979)은 정제된 비리온과 관련된 총 33개의 단백질을 설명하였다. 세정제를 사용한 차등 용해는 뉴클레오캡시드가 7개 이상의 단백질로 구성됨을시사한다. VCA 복합체의 중요한 성분은 주요한 캡시드 단백질(MCP)이다. EBV-MCP는 비루스성 게놈의 BcLF1 리딩 프레임내에 암호화되며[참조 : Bear 등의 문헌 1984], pI가 7.5 내지 9.0인 EBV-생산 세포주 내에서 153 내지 160 KDa의 비-글리콜실화된 단백질로 발현된다. 이 단백질은 세포질내에서 가용한 형태로 합성되며 핵으로 수송되어 거기서 캡시드내로 축합되어 더이상 세정제에 의해 용해되지 않는다. 다른 주요한 VCA 성분은 분자량이 125 KDa 이며 글리코실화된다. 이 단백질은 비루스 게놈의 BALF4 리딩 프레임내에 암호화된다. 이 당단백질이 최초에 VCA 성분으로 분류되었음에도 불구하고 최근 발견은 사실 이것이 세포질 및 핵막구조와 관련이 있을 수도 있음을 시사한다.
이전에 설명된 실험[참조 : J.M. Middeldorp 및 P. Herbrink, J. Virol. Meth, 21, 133-146, 1988]은 다른 EBV-질병에 관한 진단적으로 관련된 EBV 마커 단백질의 확인과 특성 분석을 위한 것이다.
이것은 VCA/EA 또는 EA의 발현을 위해 유도된 비루스 생산 세포주HH514-C16 (P3HR1의 추가 유도성 유도체) 및 EBV 음성 세포주 Ramos 와 Bjab 으로부터 제조된 항원을 포함하는 면역블로트 스트립을 사용함으로써 수행하였다. EBV 게놈을 (완전히) 잠복 상태로 보유하는 세포주인 X50-7 및 JC-5는 EBNA/LMP를 특이적으로 연구하기 위해 사용할 수 있다.
EBV 항체 응답의 패턴은 건강한 혈청반응양성 혈액 공여자의 혈청, IM 환자와 양성 IM 환자의 혈청 또는 비인두암 같은 EBV-관련 종양을 가진 환자의 혈청으로 연구하였다. 확인된 EBV-게놈 생성물과 반응하는 다클론 및 단일클론 항체는 이실험 시스템에서 검출된 몇몇 단백질 밴드를 특성 분석하는데 사용할 수 있다. 그러나 이들 연구는 단지 임의의 분자량을 가진 단백질 또는 폴리펩티드를 설명하였다. 이들 단백질에 대한 EBV 게놈상의 암호 서열에 대한 정보를 제공하지는 못했다. 면역블로트 상에서 면역반응성 밴드가 동일한 분자량의 단일 또는 다수의 단백질과의 반응성으로 인한 것인지 여부도 알려지지 않았다.
면역블로트 기술을 사용하여 분자량이 18 KDa인 EBV 항원을 검출하는 것이 가능하다. 이 단백질은 포스포노 아세트산(PAA)을 사용하여 비루스성 DNA-합성을 차단시킬 경우 발현되지 않으며 이 단백질이 VCA-관련 성분임을 나타내는 항-VCA 항체를 포함하는 모든 혈청에 의해 검출된다. 다른 VCA 성분은 분자량이 40 KDa인 단백질이다. 많은 비루스성 캡시드 항원은 핵펠렛과 관련되어 있다.
막 항원(MA)
엡스타인-바 비루스 막 항원(EBV-MA)은 감염된 세포 외막 및 세포내 막 구조상에서 비리온 외막내에 존재한다. 몇개의 당단백질 및 하나의 비-글리코실화 단백질이 MA-복합체를 구성한다고 기재되어 있고, BLLF1 리딩 프레임내에 암호화된 gp 350/220가 가장 많이 연구되어 있다. MA-gp 350/220은 EBV가 세포 수용체 CR2(CD21)에 결합하는데 필수적이고, 비리온상의 gp 350/220에 결합하는 항-gp 350/220 항체는 상기 결합을 방지하여 EBV의 세포 침입을 차단할 수 있다(비루스 중화) 다른 한편, 세포 플라스마 막상의 gp 350/220에 결합하는 항-gp 350/220 항체는 보체의 활성화 또는 T-세포 킬러 임파구에 의해 비루스 감염된 세포의 용해를 중재할 수 있다. 또한 상기 메카니즘에 의해 비루스 에피토프(epitope)를 분열(비루스 분해)시킬 수 있으며, 따라서 비루스의 감염성을 파괴시킨다. gp 350/220 및 기타 MA-복합체 성분에 대해 형성된 인체 혈청내에서 생 EBV-생산 세포상에서의 간접 면역형광법을 사용하거나 또는 이들 단백질을 정제한 형태로 사용하는 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)에 의해 다양한 종류의 항체를 검출하였다.
상기 항체들은 비루스의 침입 및 확산을 방지함으로써 숙주 방어에 중요한 역할을 수행할 수 있다. 따라서 EBV-MA 및 특히 gp 350/220은 EBV-감염증의 예방용 서브유니트 백신을 개발하기 위한 목적을 지닌 광범위한 연구의 주제가 되어 왔다.
이들 접근 방법은 동물 모델에서 실행 가능한 것으로 나타났고 최근에는 중국에서 소규모 시험에 도입되어 명백한 성공을 거둔 바 있다.
최근에 EBV 특이 혈청 진단법이 다소 주관적인 면역 형광 시험법에 의해 달성되었다. 표준 비루스 생산 세포주를 사용하여서는 비루스 항원의 대량 생산 및 정제가 불가능하므로 보다 단순하고도 획일적인 진단(예. ELISA) 방법은 그 진보에 방해를 받고 있다.
이를 달성하기 위한 유일한 한 방법은 대안으로 제조된 EBV 항원(들)을 사용하는 것이다. 이들 EBV 항원은 유전 공학 기법 또는 합성 펩티드 기법에 의해 제조할 수 있다.
EBV 감염의 각종 단계에서 확실하게 진단 가능한 특이적이고도 민감한 방법의 개발을 위하여 면역-우성의 비루스 단백질 및 이들의 에피토프를 동정하는 것이 가장 중요하다.
엡스타인-바 비루스에 대한 항체의 검출에 사용할 수 있는 단백질 및 펩티드는 본원에서 참고 인용된 공동 출원인의 공동-계류중인 하기 출원에 기재되어 있다; 이들 출원 중 하나(유럽 특허 제0 574 048 호)는 EBV-게놈의 BFRF3및 BdRF1 리딩 프레임 내부에 각각 암호화된 VCA-p18 단백질 및 VCA-p40 단백질에 관한 것인 반면, 두번째 출원(유럽 특허 제92202797.4)은 BKRF1 리딩 프레임 내에서 암호화된 EBNA-1 단백질에 관한 것이다.
더우기, 막 항원군으로부터 얻은 일단의 단백질 및 펩티드, 바람직하게는 gp 350/220은 엡스타인-바 비루스에 대한 항체의 검출에 사용할 수 있다.
이들 단백질내의 면역우성 에피토프는 -합성 펩티드 분자와 결합되는 경우-진단 감도를 상실시키지 않고도 진단 과정중에 천연 단백질로 대체할 수 있다.
최근에 EBV-혈청 반응 양성을 평가하기 위한 바람직한 진단 시험법은 (1) 비루스-생산 세포주(예. -P3HR1)에 대한 간접 면역형광분석으로 IgG 항-비루스 구조단백질(비루스성 캡시드 항원 및 막 항원 포함)의 검출 및 (2) 잠복 감염된 세포주(예. Raji)에 대한 항-보체 면역형광법으로 IgG 항-EBNA(엡스타인-바 핵 항원)의 검출법이다. 평가 방법 각각은 감염된 세포내의 단백질 복합체 세트에 대한 항체를 각기 다르게 검출한다. 이들 IgG 항체 유형은 EBV-감염된 모든 인체에 존재하며, 개개인의 각 유형에 따라 90 내지 98%의 감도로 검출될 수 있다.
EBV-혈청 반응 양성인 혈청은 통상적으로 항-비루스 구조 단백질(VCA 및 MA) 및 항-EBNA 항체와 동시 존재하는 특징을 가진다고 최근에 밝혀졌다.
대부분의 경우에, EBV-혈청 반응 양성인 공여자의 혈청은 VCA-p18 및 EBNA-1에 대한 항체를 포함한다. 때때로 EBV-혈청 반응 양성인 공여자는 EBNA-1 항체가 적거나 또는 음의 레벨의 존재하에서 및 그 반대의 경우도 VGA-p18 항체를 갖는다. 이는 진정 EBV-혈청 반응 양성인 공여자를 확인하는 감도 95 내지 98%를 지닌 공지의 VCA 및 EBNA 면역형광 혈청학에 상응한다. 유사하게, 항-MA 항체는 약 90%의 감도로 검출될 수 있다.
정제된 우성 EBV-진단 마커 분자(즉. VCA-p18 또는 MA-gp 350/220) 및 EBNA-1을 단일 진단 분석에 결부시킴으로써 EBV-혈청 반응 양성 혈청의 측정용으로 감도가 보다 높은 분석법을 산출한다. 단일 분석(예컨대, 면역블로트, 엘리자, 스피아, 등)에 있어, VCA-p18 또는 MA-gp 350/220 및 EBNA1 둘다에 대한 항체 반응을 합동으로 평가하면 EBV-혈청 반응 양성인 상태를 측정하는 감도 및 정밀도는 모두 증가한다.
현재의 면역형광법을 기초로 한 진단학의 경우에는 상기와 같은 합동 평가가 불가능하다.
이들 마커 분자는 EBV-감염된 세포로부터 정제된 또는 세포주로부터 정제된 천연 단백질 종이거나 또는 재조합 DNA 기법을 이용하여 이들 단백질을 생산하도록 조작된 미생물중 하나일 수 있다. 대안으로, 이들 단백질 각각의 면역 우성영역(에피토프)을 나타내는 합성 펩티드를 상기 목적에 사용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 VCA-p18(EBV-게놈의 BFRF3 리딩 프레임내에 암호화된), VCA-p40(EBV-게놈의 BdRF1 리딩 프레임내에 암호화된), EBV-MCP(EBV-게놈의BcRF1 리딩 프레임내에 암호화된), gp 125(EBV-게놈의 BALF4 리딩 프레임내에 암호화된)와 같은 VCA 단백질, 또는 gp 350/220(EBV-게놈의 BLLF1 리딩 프레임내에 암호화된)과 같은 MA 단백질의 적어도 일부와 EBNA 단백질의 적어도 일부를 단일의 진단 분석법에 통합시킴으로써, 종래의 방법보다 감도 및 정밀도가 큰 EBV-항체 검출 방법을 산출하는 것이다.
따라서 본 발명은 두개의 상이한 진단 마커 분자를 단일의 진단 분석 포맷에 통합하여 보다 감도가 우수하고 확실한 인체의 엡스타인-바 비루스 혈청반응 양성을 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 엡스타인-바 비루스에 대한 항체의 검출용 진단 시약을 제공하며, 상기 진단 시약은 적어도 일부의 엡스타인-바 비루스 구조 단백질 및 적어도 일부의 엡스타인-바 EBNA 단백질의 배합물을 포함함을 특징으로 한다.
진단 시약으로 사용하기에 특히 적절한 것으로 밝혀진 단백질 및 펩티드는 EBV 핵 항원(EBNA)과의 배합물로, 막 항원 및 비루스성 캡시드 항원을 포함하는 비루스 구조 단백질이다. 막 항원군중에서, MA-gp350/220 단백질이 바람직하다.
따라서 본 발명은 MA-gp350/220 및 EBNA-1에서 유도된 펩티드의 배합물을 포함하는 진단 시약에 관한 것이다.
본 발명의 다른 바람직한 실시 양태는 VCA-p18 및 EBNA-1 유도된 펩티드의 배합물을 포함하는 진단 시약에 관한 것으로, 상기 펩티드는 서열 번호 1(VCA-p18) 또는 서열 번호 5(EBNA-1)로 나타낸 바와 동일한, 적어도 일부의 아미노산 서열을 포함한다.
EBNA-1 유도된 펩티드와의 배합물로 본 발명에 따른 진단 시약의 바람직한 실시 양태에 사용될 수 있는 VCA-p18 단백질에서 유도된 펩티드는 서열 번호 2 내지 4로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. 가장 바람직하게는 서열 번호 4 와 동일한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 사용하는 것으로, 상기 서열은 서열 번호 2 및 3으로 나타낸 VCA-p18 단백질상의 두개의 반응성 영역의 조합이다.
본 발명에 따른 진단 시약에 바람직하게 사용된 EBNA-1 유도된 펩티드는 서열 번호 6 내지 9로 나타낸 바와 동일한 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. 서열 번호 9로 나타낸 바와 동일한 서열을 포함한 펩티드를 사용하는 것이 가장 바람직한데, 이 서열은 서열 번호 6 내지 8로 나타낸 바와 같은 EBNA-1 단백질상의 반응성 영역의 조합이다.
당 분야의 숙련자에게는 상기 폴리펩티드의 보존적 변이체 또한 본 발명의 일부라는 것은 명백할 것이다. 본원에 사용된 용어 "보존적 변이"란 아미노산 잔기를 다른 것, 즉 생물학적으로 유사한 잔기로 대체하는 것을 말한다. 보존적 변이의 예로는 이소루신, 발린, 루신 또는 메티오닌과 같은 하나의 소수성 잔기를 다른 소수성 잔기로 치환하거나, 또는 리신을 아르기닌으로, 아스파르트산을 글루탐산으로, 또는 아스파라긴을 글루타민으로 치환하는 것과 같이 하나의 극성 잔기를 다른 하나의 극성 잔기로 치환하는 것등을 들 수 있다. "보존적 변이"란 치환된 폴리펩티드에 대해 형성된 항체 역시 비치환된 폴리펩티드와 면역 반응한다면 비치환된 모아미노산 대신에 치환된 아미노산을 사용하는 것도 포함한다. 따라서, EBV-관련질병에 걸린 환자에게서 취한 혈청으로 보존적 변이 폴리펩티드를 시험하는 것과같은 상용 검색법을 사용함으로써, 당분야의 숙련가는 변이 폴리펩티드가 과도한 실험을 하지 않고도 본 발명의 폴리펩티드의 필수 생물학적 활성을 가지는 지를 쉽게 결정할 수 있다.
본 발명에 따른 진단 시약은 통상적으로 1개 이상의 펩티드 및 적절한 지지체 또는 표지물질을 포함할 것이다.
사용할 수 있는 지지체의 예로는 마이크로테스트 웰 또는 큐벳의 내벽, 튜브 또는 모세관, 막, 필터, 시험 스트립 또는 입자(예컨대 라텍스 입자)의 표면, 적혈구, 염료 졸, 금속 졸 또는 졸 입자로서의 금속 화합물, 담체 단백질(예컨대 BSA 또는 KLH)을 들 수 있다.
사용할 수 있는 표지 물질은 특히, 방사성 동위원소, 형광 화합물, 효소, 염료 졸, 금속 졸 또는 졸 입자로서의 금속 화합물이다.
시료중의 EBV에 대해 형성된 항체의 검출 방법에서는, 본 발명에 따른 진단 시약을 시료와 접촉시킨다. 시료중의 항체와 펩티드 사이에 형성된 면역 복합체의 존재를 검출하고, 상기 검출에 의해 시료의 EBV 항체의 존재를 알 수 있으며 정랑적으로 측정할 수 있다.
상기 진단 시약의 성질 및 추가의 특징에 따라 발생하는 면역화학적 반응을 소위 샌드위치 반응, 응집 반응, 경쟁 반응 또는 억제 반응이라 한다.
시료내의 EBV를 검출하는 경우, 1개 이상의 펩티드를 포함하는 본 발명에 따른 진단 시약은 시료 및 항-EBV와 접촉시킨 후에, 형성된 면역복합체의 존재를 검출할 수 있고, 이로부터 시료중의 EBV의 존재를 측정할 수 있다.
유사한 방식으로, 샌드위치 포맷을 사용할 수 있는데, 여기서는 시료를 고형 지지체, 예컨대 마이크로테스트 웰의 내벽상에 피복된 1개 이상의 펩티드 및 1개 이상의 표지된 펩티드 또는 표지된 항-항체와 접촉시킨 후에, 고형상에서의 임의의 표지의 존재를 검출할 수 있다.
추가로 본 발명은 시료중의 엡스타인-바 비루스에 대한 항체의 검출 방법에 관한 것으로, 이는 상기 시료를 본 발명에 따른 진단 시약과 접촉시켜 상기 시약과 항체 사이에 형성된 면역 복합체를 검출하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 시험 키트는 전술한 바와 같은 진단 시약을 필수 성분으로서 포함한다. EBV 항체의 검출을 위해 샌드위치 반응을 수행하는 경우, 시험 키트는 예컨대, 고형 지지체(예컨대, 마이크로테스트 웰의 내벽)에 피복된 본 발명에 따른 펩티드를 포함하고, 본 발명에 따른 표지된 펩티드 또는 표지된 항-항체 중 하나를 포함할 수 있다.
경쟁 반응을 수행하는 경우, 시험 키트는 고형 지지체에 피복된 본 발명에 따른 펩티드, 및 EBV에 대해 형성된 표지 항체, 바람직하게는 상기 펩티드에 대해 형성된 단일 클론 항체를 포함할 수 있다.
응집 반응에서 시험 키트는 입자 또는 졸에 피복된 본 발명에 따른 펩티드를 포함할 수 있는 면역화학적 시약을 포함한다.
시험 키트의 또 다른 실시 양태는 예컨대, EBV 항원과의 경쟁 반응에서 면역 화학적 시약으로서 본 발명에 따른 표지된 펩티드를 사용하여 고형 지지체에 피복된 EBV에 대해 유도된 항체상의 결합 위치를 검출하는 시험 키트이다.
지금까지 본 발명을 일반적으로 설명하였다. 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없이 단지 예시의 목적을 지닌 하기하는 구체적 실시예를 참조함으로써 본 발명을 보다 완전히 이해할 수 있다.
실시예 1
EBV-단백질(EBNA+VCA)와 혈청 IgG의 반응성에 대해 시험한 무작위 수집한 건강한 혈액 공여자 샘플의 면역블로트 분석을 실시하였다. 상기 단백질은 하기에 상세히 설명하는 바와 같이, 비루스 생산 세포주 P3HR1-HH514-C16에서 발현시키고, 환원 조건하에 변성용 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 니트로셀룰로스로 옮겼다.
EBV-생산 세포주 HH514.c16(P3HR1-유래)의 핵의 분획으로부터 단백질 추출물을 조제하고, 10% 아크릴아미드 슬랩겔에서 환원 조건하에 변성용 소듐 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)으로 분리하였다. 전기영동에 의한 분리후, 단백질을 니트로셀룰로스 시트로 옮기고, 계속해서 작은(3 mm) 스트립으로 절단하였다.
EBV-단백질을 함유하는 스트립을 주위 온도에서 2 시간 동안 0.05% 트윈-20 (차단용-완충액)을 함유하는 인산염-완충 염수(PBS, pH 7.4)중의 5% 말의 혈청, 4% 건성 우유에 적셨다. 차단용-완충액내에서 1:100 으로 희석된 인체 혈청은 주위 온도에서 1 시간 동안 각각의 스트립과 함께 항온처리한 후, 스트립들을 PBS+0.05%의 트윈-20 으로 4 회 세척하였다. 색체 현상을 위해 퍼옥시다제-표지한 양-항-인체 IgG 항체 및 4-클로로-나프톨을 사용하여, 결합된 항-EBV IgG 를 검출하였다.
상기 절차들은 문헌[J. Virol. Meth 21(1988) 133-146 및 J. Med. Virol. 40(1993) 161-169.]에 상세히 설명되어 있다.
관련 진단용 마커 분자 VCA-p18 및 EBNA-1의 위치는 화살표로 나타내었다.
대조용 혈청은 공지된 EBV-음성(-) 및 강한 EBV-양성(+) 공여자에게서 채혈한 것이었다.
혈청 1 내지 37은 건강한 혈액 공여자에게서 채혈한 무작위 수집된 혈청 시료를 나타낸다.
전술한 면역 블로트 분석 결과를 제1도에 도시하였다.
시판되는 표준 면역 형광계 진단법으로 모든 혈청을 시험한 결과, 혈청 #8(EBV-혈청 반응 음성)을 제외하고는 모두 EBV-혈청 반응 양성이었다.
마커 단백질 VCA-p18 및 EBNA-1을 나타내었다. EBV-특이 항체(예: #8)가 없는 이따금의 EBV-혈청 반응 음성 공여자외에도, EBV-혈청 반응 양성 공여자의 IgG는 다양한 다른 EBV-단백질, 가장 현저하고 빈번하게는 VCA-p18 및 EBNA-1 과 반응하는 것을 알 수 있다(화살표 참조).
혈청 #9, 12, 16, 18, 19, 31은 약한 반응성에서 음의 반응성까지의 항-EBNA-1 반응성을 갖는 항-VCA-p18 양성인 반면, 혈청 #11, 14, 21, 22, 30, 37은 낮거나 음의 항 VCA-p18 반응성을 갖는 항-EBNA-1 양성이다.
실시예 2
제2도는 VCA-p18 또는 EBNA-1의 각각 또는 배합물을 특이적으로 나타내는 정제 시약을 사용한 효소 결합 면역 흡착 분석의 결과를 도시한 것이다. 이 실험에서, VCA-p18 또는 EBNA-1 콤비-펩티드는 단독 또는 1:1 배합물 형태의, 고체상 피복물로서, 0.05 M NaHCO3완충액(pH 9.6)에서 1 ㎍/ml 로 사용하였다. 실시예 1에서 사용한 것과 동일한 혈청 세트(제1도)를 항체 반응성의 평가에 사용하였다. VCA-p18 및 EBNA-1의 데이타의 조합을 분리하여 사용하면 모든 혈청이 EBV-혈청 반응 양성(경계선)으로 나타날 수 있지만, 두 마커를 단일 분석에 통합하면 보다 간단하고 직접적이며 보다 정확한 산정치를 얻을 수 있다.
실시예 3
제3도, 제4도 및 제5도는 단독 또는 배합물 형태의 VCA-p18 또는 EBNA-1을 특이적으로 나타내는 정제 시약을 사용한 효소 결합 면역 흡착 분석의 결과를 도시한 것이다. 이들 실험에서, VCA-p18 또는 EBNA-1 콤비펩티드는 단독 또는 1:1 배합물 형태의, 고체상 피복물로서 0.05 M NaHCO3완충액(pH 9.6)에서 1 ㎍/ml 로 사용하였다.
제3도에서는, 미국의 건강한 혈액 공여자의 혈청 세트를 항체 반응성의 평가에 사용하였다. VCA-p18 및 EBNA-1의 데이타의 조합을 분리하여 사용하면 모든 혈청이 EBV-혈청 반응 양성(경계선)으로 나타날 수 있지만, 두 마커를 단일 분석에 통합하면 보다 간단하고 직접적이며 보다 정확한 산정치를 얻을 수 있다.
제4도에서는, 홍콩의 건강한 혈액 공여자에게서 채혈한 혈청 세트를 항체 반응성의 평가에 사용하였다. VCA-p18 및 및 EBNA-1의 데이타의 조합을 분리하여 사용하면 모든 혈청이 EBV-혈청 반응 양성(경계선)으로 나타날 수 있지만, 두 마커를단일 분석에 통합하면 간단하고 직접적이며 보다 정확한 산정치를 얻을 수 있다.
제5도에서는, 홍콩의 비인두암(NPC) 환자의 인체 혈청 세트를 항체 반응성의 평가에 사용하였다. VCA-p18 및 EBNA-1와 데이타의 조합을 분리하여 사용하면 모든 혈청이 EBV-혈청 반응 양성(경계선)으로 나타날 수 있지만, 두 마커를 단일 분석에 통합하면 보다 간단하고 직접적이며 보다 정확한 산정치를 얻을 수 있다. 특히, VCA-콤비펩티드 단독 형태(제5도의 왼쪽 부분)와, 배합된 VCA 콤비펩티드 및 EBNA-콤비펩티드(제5도의 오른쪽 부분) 사이의 차이는 현저하다.
상기 실험으로부터 상이한 EBV-관련 증상을 가진 상이한 인체 군집(또는 건강한 군집)에서 상기 VCA-콤비펩티드 및 EBNA 콤비펩티드는 두 마커를 단일분석에 통합하면 보다 간단하고 직접적이며 보다 정확한 산정치를 얻을 수 있다는 것을 보여주는 것임을 알 수 있다.
실시예 4
제6도, 제7도 및 제8도는 MA-gp 350/220 또는 EBNA-1의 각각 또는 배합물을 특이적으로 나타나는 정제 시약을 사용한 효소 결합 면역 흡착 분석의 결과를 도시한 것이다. 이 실험에서, 정제된 MA-gp350/220 단백질(Hessing 등의 Journal of Chromatography, 599, 267-272 면(1992)에 따라 정제된 것) 또는 EBNA-1 콤비-펩티드는 단독 또는 1:1 배합물 형태의, 고체상 피복물로서 0.05 M NaHCO3완충액(pH 9.6)에서 1 ㎍/ml 로 사용하였다. 이들 실험에서 사용된 혈청 세트를 상기 도면들(제6도, 제7도 및 제8도)에 나타내었으며, 항체 반응성의 평가에 사용하였다.
MA-gp350/220 및 EBNA-1의 데이타의 조합을 분리하여 사용하면 대부분의 혈청이 EBV-혈청 반응 양성(경계선)으로 나타날 수 있지만, 두 마커를 단일 분석에 통합하면 보다 간단하고 직접적이며 보다 정확한 산정치를 얻을 수 있다.
제6도에서는, 미국의 건강한 혈액 공여자의 혈청 세트를 항체 반응성의 평가에 사용하였다. MA-gp350/220 및 EBNA-1의 데이타의 조합을 분리하여 사용하면 모든 혈청이 EBV-혈청 반응 양성(경계선)으로 나타날 수 있지만, 두 마커를 단일 분석에 통합하면 간단하고 직접적이며 보다 정확한 산정치를 얻을 수 있다.
제7도에서는, 홍콩의 건강한 혈액 공여자에게서 채혈한 혈청 세트를 항체 반응성의 평가에 사용하였다. MA-gp350/220 및 EBNA-1의 데이타의 조합을 분리하여 사용하면 모든 혈청이 EBV-혈청 반응 양성(경계선)으로 나타날 수 있지만, 두 마커를 단일 분석에 통합하면 보다 간단하고 직접적이며 보다 정확한 산정치를 얻을 수 있다.
제8도에서는, 홍콩의 비인두암(NPC) 환자의 인간 혈청 세트를 항체 반응성의 평가에 사용하였다. MA-gp350/220 및 EBNA-1의 데이타의 조합을 분리하여 사용하면 모든 혈청이 EBV-혈청 반응 양성(경계선)으로 나타날 수 있지만, 두 마커를 단일 분석에 통합하면 보다 간단하고 직접적이며 보다 정확한 산정치를 얻을 수 있다.
상기 실험으로부터 상이한 EBV-관련 증상을 가진 상이한 인체 군집(또는 건강한 군집)에서 VCA-단백질의 적어도 일부 또는 MA-단백질의 적어도 일부를 EBNA-단백질의 적어도 일부와 함께 포함하는 진단 시약은 두 마커를 단일 분석에 통합하면 보다 정확한 산정치를 얻을 수 있다는 것을 보여주는 것임을 알 수 있다.
상기 상세한 설명은 당해 분야의 숙련자가 본 발명을 실시하기에 충분한 것이라고 생각된다. 본 명세서에 기술하고 나타낸 사항 이외의 본 발명의 다양한 변형예는 당해 분야의 숙련자에게는 상기 상세한 설명으로부터 명백할 것이고, 첨부하는 특허 청구의 범위에 포함된다.
제1도는 비루스 생산 세포주 P3HR1-HH514-C16에서 발현되는 EBV-단백질 (EBNA + VCA)과 혈청 IgC의 반응성에 대해 시험한 무작위 수집한 건강한 혈액 공여자 샘플의 면역블로트 분석을 도시한 것이다.
제2도는 VCA-p18 및 EBNA-1의 각각 및 배합물에 대한 IgG-반응성을 평가하기 위해 인체 혈청 샘플의 Elisa 반응성(450 nm에서의 광학 밀도)을 도시한 것이다.
◆ 또는 ◇는 VCA-항체 및 EBNA-항체에 대한 표준 혈청 분석에 의한 음성 혈청을 나타낸다.
■또는 □는 VCA-항체 및 EBNA-항체에 대한 표준 혈청 분석에 의한 양성 혈청을 나타낸다.
EBNA-콤비펩티드 :
서열 번호 9에 도시한 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
VCA-콤비펩티드 :
서열 번호 4에 도시한 아미노산 서열을 갖는 펩티드.
EBNA-콤비펩티드 및 VCA-콤비펩티드 :
서열 번호 4 및 9에 도시한 아미노산 서열을 갖는 두 펩티드의 배합물.
제3도는 VCA-p18 및 EBNA-1의 각각 및 배합물에 대한 IgC-반응성을 평가하기 위해 미국의 건강한 혈액 공여자에게서 채혈한 인체 혈청 세트의 Elisa 반응성 (450 nm에서의 광학 밀도)을 도시한 것이다.
제4도는 VCA-p18 및 EBNA-1의 각각 및 배합물에 대한 IgG-반응성을 평가하기 위해 홍콩의 건강한 혈액 공여자에게서 채혈한 인체 혈청 세트의 Elisa 반응성(450 nm에서의 광학 밀도)을 도시한 것이다.
제5도는 VCA-p18 및 EBNA-1의 각각 및 배합물에 대한 IgC-반응성을 평가하기 위해 홍콩의 비인두암(nasopharyngeal carcinoma ; NPC) 환자에게서 채혈한 인체 혈청 세트의 Elisa 반응성(450 nm에서의 광학 밀도)을 도시한 것이다.
제6도는 MA-gp350/220 및 EBNA-1의 각각 및 배합물에 대한 IgG-반응성을 평가하기 위해 미국의 건강한 혈액 공여자(n=38)에게서 채혈한 인체 혈청 세트의 Elisa 반응성(450 nm에서의 광학 밀도)을 도시한 것이다.
제7도는 MA-gp350/220 및 EBNA-1의 각각 및 배합물에 대한 IgG-반응성을 평가하기 위해 홍콩의 건강한 혈액 공여자(n=37)에게서 채혈한 인체 혈청 세트의 Elisa 반응성(450 nm에서의 광학 밀도)을 도시한 것이다.
제8도는 MA-gp350/220 및 EBNA-1의 각각 및 배합물에 대한 IgC-반응성을 평가하기 위해 홍콩의 비인두암(NPC) 환자(n=37)에게서 채혈한 인체 혈청세트의 Elisa 반응성 (450 nm에서의 광학 밀도)을 도시한 것이다.

Claims (9)

  1. 엡스타인-바 비루스(Epstein Barr) 구조 단백질과 엡스타인-바 EBNA 단백질의 배합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 엡스타인-바 비루스에 대한 항체의 검출용 진단 시약.
  2. 제1항에 있어서,
    비루스 구조 단백질은 MA-단백질임을 특징으로 하는 엡스타인-바 비루스에 대한 항체의 검출용 진단 시약.
  3. 제2항에 있어서,
    MA-단백질이 MA-gp350/220 단백질임을 특징으로 하는 엡스타인-바 비루스에 대한 항체의 검출용 진단 시약.
  4. 제1항에 있어서,
    비루스 구조 단백질이 VCA-단백질임을 특징으로 하는 엡스타인-바 비루스에 대한 항체의 검출용 진단 시약.
  5. 제4항에 있어서,
    VCA-단백질이 VCA-p18 단백질임을 특징으로 하는 엡스타인-바 비루스에 대한항체의 검출용 진단 시약.
  6. 제1항에 있어서,
    EBNA 단백질이 EBNA-1 단백질임을 특징으로 하는 엡스타인-바 비루스에 대한 항체의 검출용 진단 시약.
  7. 서열 번호 1,2,3 또는 4중 어느 하나에 도시한 아미노산 서열을 포함하는 엡스타인-바 비루스 구조 단백질 항원과 서열 번호 5,6,7,8 또는 9중 어느 하나에 도시한 아미노산 서열을 포함하는 엡스타인-바 EBNA 단백질 항원의 배합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 엡스타인-바 비루스에 대한 항체의 검출용 진단 시약.
  8. 제7항에 있어서,
    서열 번호 4에 도시된 아미노산 서열을 갖는 항원 및 서열 번호 9에 도시된 아미노산 서열을 갖는 항원을 포함하는 것을 특징으로 하는 엡스타인-바 비루스에 대한 항체의 검출용 진단 시약.
  9. 제1항 내지 제5항 및 제6,7,8항 중 어느 하나의 항에 따른 진단 시약을 포함하는 것을 특징으로 하는, 시료 중의 엡스타인-바 비루스에 대한 항체의 검출용 시험 키트.
KR1019940022989A 1993-09-14 1994-09-13 엡스타인-바비루스(ebv)에대한항체의검출용진단시약 KR100378942B1 (ko)

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