JPH09502091A

JPH09502091A - 特異的に発現するリーシュマニア遺伝子及び蛋白質

Info

Publication number: JPH09502091A
Application number: JP7507851A
Authority: JP
Inventors: マトラシェウスキー、グレゴリー; チャーレスト、ユーグス
Original assignee: マックギルユニヴァーシティー
Priority date: 1993-09-03
Filing date: 1994-09-01
Publication date: 1997-03-04
Also published as: US5827671A; ES2198420T3; PT716697E; US5780591A; EP0716697B1; EP0716697A1; DE69432417T2; ATE236252T1; WO1995006729A1; US6133017A; US5733778A; AU7529194A; DE69432417D1

Abstract

(57)【要約】特異的に発現するリーシュマニアの遺伝子及び蛋白質が記載されている。特異的発現遺伝子（Ａ２）は、自由なプロマスティゴートの段階に比べて、該リーシュマニアのライフサイクルにおいてマクロファージ中にある時のアマスティゴートの段階で非常に高められたレベル（約１０倍以上高い）で発現した。このＡ２遺伝子は２２ｋＤの蛋白質（Ａ２蛋白質）をコードし、これはカラーアザール回復期血清により認識され、プラスモディウム・ファルシパルム・ヴィエトナミーゼ単離体ＶＩのＳ抗原と相同のアミノ酸配列を有する。これら特異的に発現するリーシュマニアの遺伝子及び蛋白質の用途としては、ワクチン、診断薬、免疫学的試薬や弱毒化したリーシュマニアの変異体を生成するための道具としての用途がある。

Description

【発明の詳細な説明】発明の名称特異的に発現するリーシュマニア遺伝子及び蛋白質技術分野本発明は、リーシュマニア（Leishmania）遺伝子の分子クローニング、特にリーシュマニアドノヴァニ（L．donovani）から特異的に発現する細胞内無鞭毛体（amastigote）遺伝子のクローニングに関する。背景技術リーシュマニア原虫は、自己治癒する皮膚潰瘍から致命的な内蔵感染までの範囲の疾病のスペクトルを含むヒトリーシュマニア症の原因となる因子である。ヒト−リーシュマニア症は、リーシュマニア属の寄生体の少なくとも１３の異なる種及び亜種に起因している。リーシュマニア症は、約８０の国から報告されており、おそらく４０万の新しいケースが毎年起こっている。近年、世界保健機構（ＷＨＯ）は１２００万人が感染していることを報告している（引用文献１−その引用文献は開示の最後に挙げられている。）。 L．donovani は内蔵リーシュマニア症を引き起こし、またカラアザールとして知られている。ブラジルリーシュマニア（L．brasiliensis）は皮膚粘膜リーシュマニア症を引き起こし、メジャーリーシュマニア（ L．major）は皮膚リーシュマニア症を引き起こす。未治療の内蔵リーシュマニア症は大抵致命的であり、皮膚粘膜リーシュマニア症は鼻咽頭口腔の破壊による切断を引き起こし、時として死に至る。加えて、多くの健康問題は高度感染の領域で血液が輸血目的のために収集された場合に発生している。血液は寄生体のキャリアであるため、感染した個体からの血液は知らぬ間に健康体に転移するかもしれない。リーシュマニア原虫は、スナバエの消化器官中に奔放な状態で細胞外有鞭毛のプロマスティゴートとして存在し、そして昆虫ベクターの刺し傷を介してほ乳類寄主に転移する。一度入り込むと、プロマスティゴートはマクロファージによって取り上げられ、すぐに非鞭毛アマスティゴートに分化し、食細胞室内にて増殖を開始する。感染した細胞が破裂すると、アマスティゴートはすぐに他のマクロファージに感染し、リーシュマニア症に関連する様々な症状を引き起こす（引用文献１及び２）。この形式では、ヒトの病状の原因となるのは寄生体のアマスティゴート形態である。機能的には無発病性である、昆虫の中腸において新たに変異したプロマスティゴートは、連続的に感染能力を獲得し、口腔部に移住する（引用文献３）。この過程は、真性環状世代交番（metacyclogenesis）と呼ばれており、プロマスティゴートにおいてのみ起こるものであるが、プロマスティゴートの消化器官中の移住をもたらし、血清環境に対する器官を用意する多くの表面グリコ接合の特異的発現と共に発生する（引用文献４および５）。対照的に、プロマスティゴートのアマスティゴートへの細胞分化は深遠な形態学であり、生理的な変態である。プロマスティゴートのアマスティゴートへの分化の間、寄生体はその鞭毛を失い、丸くなり、そのグリコ接合被覆へ変化し（引用文献６、７及び８）、低ｐＨで新陳代謝酵素最適活性のセットを発現する。マクロファージ食細胞内部での寄生体の生存は、酸素代謝産物を介在した殺傷性、及び細胞に存在する有効な抗原として作用するマクロファージの能力を含んでおり、その寄主細胞の多くの効果物及び付属物の機能を下方調整する可能性に関連する（例えば、引用文献９を参照）。リーシュマニア症は、それ故、深刻な疾病であり、その疾病に対する様々なタイプのワクチンが開発されており、活性寄生体、培地からの冷凍プロマスティゴート、高周波音分解（sonicated）されたプロマスティゴート、ガンマ線照射活性プロマスティゴート及びグルカンで処理されたフォルマリン破壊されたプロマスティゴートが挙げられる（例えば引用文献１０を参照）。しかしながら、これらの試みのいずれも満足な結果を提供していなかった。プロマスティゴート−アマスティゴート分化は感染の立証に重要である。アマスティゴートがマクロファージ中にあるとき特異的に発現する遺伝子及び遺伝子生成物を確認することが望ましいだろう。ジョシ（Joshi ）らはL．donovani 遺伝子が、プロマスティゴートに比較して試験管内（in vitro）で発生し保持された”アマスティゴート”を約２倍高く発現することを記載している（引用文献１１）。発明の開示本発明は、リーシュマニア有機体がマクロファージ中に存在する時のアマスティゴート段階で特異的に発現するリーシュマニア蛋白質及び特異的に発現する蛋白質をコードする遺伝子の提供に関する。アマスティゴートを特異的に発現する遺伝子及び蛋白質はリーシュマニアに起因する疾病に対するワクチンの調製、リーシュマニアによる感染の診断に対して、また免疫学的試薬の生成及び弱毒化したリーシュマニアの変異体を生成するための道具として有用である。本発明の一つの態様は、リーシュマニアにおいて特異的に発現する遺伝子をコードする部分を少なくとも含み、該特異的に発現する遺伝子は、マクロファージ中に該リーシュマニア有機体の細胞内無鞭毛体（アマスティゴート体）が存在する時に増加したレベルで発現するものである、該リーシュマニアの精製及び単離されたＤＮＡ分子を提供することにある。増加したレベルでの発現は、少なくとも約１０倍の発現における増加である。本発明の一実施態様において、特異的に発現する遺伝子は、リーシュマニア有機体のビルレンス遺伝子であってもよく、リーシュマニア有機体のアマスティゴート体によって感染の維持が要求されてもよい。本発明の別の態様では、特異的に発現するビルレンス遺伝子は、例えば、欠失や、挿入変異誘発などの変異誘発によって機能的に無力化し、例えば、活性ワクチンとして使用するため弱毒化されたリーシュマニア有機体を生成する。簡単には、特異的に発現する遺伝子が単離されたリーシュマニアの人工変種はリーシュマニアドノヴァリを含んでいる。本発明の更なる態様として、特異的に発現する遺伝子によってコードされる蛋白質、ワクチン化及び診断におけるその蛋白質の使用が挙げられる。本発明の追加的態様として、ビルレンス遺伝子が無力化したリーシュマニアの弱毒化された人工変種及びそれを含有してなるワクチンが挙げられる。図面の簡単な説明図１は、無鞭毛体（amastigote）ｃＤＮＡのライブラリー構造並びに無鞭毛体特異性ｃＤＮＡプローブおよび有鞭毛体（promastigote）特異性ｃＤＮＡプローブによる特異形態選抜（differential screening）の概要を示す。無鞭毛体特異性ｃＤＮＡクローンの一例を、コロニー交雑の放射能写真上で矢印をもって指示した。図２は、制限酵素およびリーシュマニア・ドノバニ（Leishmania donovani ）無鞭毛体特異性ｃＤＮＡクローンのサイズ分析を示す。図３は、リーシュマニア・ドノバニ無鞭毛体特異性ｃＤＮＡクローンのサザーンブロット（Southern blot）分析結果を示す。図４は、Ａ−２特異性写し（transcript）が、無鞭毛体汚染マクロファージには存在するが、有鞭毛体の場合には存在しないことを示すノーザンブロット（No rthern blot）分析結果である。図５は、Ａ−２写しが多遺伝子族によって符号化されることを明らかにするサザーンブロット分析結果である。図６は、リーシュマニア・ドノバニＡ２遺伝子を含有するプラスミドｐＧＥＣＯ９０の制限遺伝学的地図を示す。図７は、Ａ２遺伝子のゲノムクローン制限地図と、そのＡ２関連ｃＤＮＡ類との関係を示す。図８は、リーシュマニア・ドノバニＡ２遺伝子の読解開放枠II（open reading frame II ：ＯＲＦ II）のヌクレオチド連鎖（ＳＥＱＩＤＮｏ．１）および導き出されたアミノ酸連鎖（ＳＥＱＩＤＮｏ．２）を示す。図９は、リーシュマニア・ドノバニＡ２蛋白質（ＳＥＱＩＤＮｏ．２）とプラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodium falciparum ）Ｓ抗原（ＳＥＱＩＤＮｏ．３）との、これら蛋白質のサブユニット中における相同関係を示す。図１０は、Ａ２蛋白質形質発現のためのプラスミドＰＥＴ１６ｂ／ＯＲＦ II⁺ の構造を示す。図１１は、黒熱病免疫血清中におけるＡ２融合蛋白質に対する抗体の存在を、沈澱法によって示すものである。図１２は、黒熱病血清によるＡ２蛋白質の特異的認識をウエスターンブロット分析によって示したものである。図１３は、リーシュマニア属の異なる種および亜種について、その分離染色体をサザーンブロット分析した結果を示す。発明の概略説明図１には、ライフサイクルのアマスティゴート（amastigote）段階の間に特異的に発現するリーシュマニア属の遺伝子を単離するために用いられる方法が示されている。この方法は次の複数のステップを含んでいる。（ａ）ライフサイクルのアマスティゴート段階のリーシュマニア属有機体からｃＤＮＡライブラリーを作る。（ｂ）ライフサイクルのアマスティゴート段階に特異的なｃＤＮＡプローブの第１混合物を作製する。（ｃ）ライフサイクルのプロマスティゴート段階に特異的なｃＤＮＡプローブの第２混合物を作製する。（ｄ）ｃＤＮＡプローブのプロマスティゴート混合物ではなくｃＤＮＡプローブのアマスティゴート混合物によって認識されるｃＤＮＡクローンを同定するため、アマスティゴート及びプロマスティゴート特異性（amastigote and promastig ote-specific）ｃＤＮＡプローブでｃＤＮＡライブラリーを別々に調べる。（ｅ）ステップ（ｄ）で同定されたｃＤＮＡクローンを単離する。上記の手順で同定されたアマスティゴート特異性（amastigote-specific ）ｃＤＮＡクローンは、制限酵素分析、及びサザン交雑研究（Southern hybridizati on studies）によって決定されたそれらの関係によってさらに特徴付けることができる。上記の手続きによって同定されたｃＤＮＡクローンが、リーシュマニア属有機体のアマスティゴートの形態がマクロファージ内に存在するときにさらに高いレベル（約１０倍以上高い）で発現したアマスティゴート特異性クーロン（ amastigote-specific clones）に相当するかどうかを決定するため、マクロファージはアマスティゴートで感染され、特異的に発現する遺伝子の転写体はノーザンブロット分析（Northern blot analysis）によって検出された。本発明の具体例において、特異的に発現するリーシュマニア属の遺伝子はドノヴァニ（L．donovani）遺伝子であり、この遺伝子は、リーシュマニア属有機体のアマスティゴートの形態がマクロファージ内に存在しているときに増加したレベルで発現したものである。マクロファージの細胞内の環境は、例えば約４．５の酸性ｐＨを有する。その特異的に発現する遺伝子は、例えば、図８で示されたＤＮＡ配列（ＳＥＱＩＤＮｏ．１）又はその相補鎖、及び厳格な条件下でそのようなＤＮＡ配列へ交雑したＤＮＡ配列などの配列を有する遺伝子を包含する。そのような特異的に発現する遺伝子の配列は、図８に示されるＤＮＡ配列を有するドノヴァニのＡ２遺伝子を包含し、そしてその発明は図８に示されるＡ２遺伝子をコードするｃＤＮＡクローンを包含し、そのクローンは、プラスミドの形態、特にｐＧＥＣＯ９０（図６）で示される形態であると考えられ、ＡＴＣＣアクセション番号（accession number）ＡＴＣＣ７５５１０を有する。その特異的に発現する遺伝子は、例えば、２２ｋＤＡ２タンパク質（ＳＥＱＩＤＮｏ．２）等のタンパク質をコードでき、Ａ２遺伝子のロンゲストオープンリーディングフレーム（longest open reading frame）（ＯＲＦII）によってコードされる。予測されるＡ２タンパク質のほとんどは、１９回繰り返された１０個のアミノ酸のストレッチ（stretch）からなる反復的な配列から構成される（図８）。この繰り返し単位のそれぞれは、２つのセリン、２つのバリン、２つのロイシン及び２つのプロリンを含み、これらが残りの５つ（five residues）によって互いに分けられており、そのため、繰り返し部分は、３８回繰り返された５個のアミノ酸のストレッチ（stretch）としてもみなすことができる。図９に示されるように、Ａ２タンパク質のアミノ酸配列は、プラスモジウム・ファルシパルム（Plasmodi um falciparum）Ｓ抗原（ＳＥＱＩＤＮｏ．３）と相同関係を有する。ドノヴァニＡ２タンパク質とのように、ファルシパルム・ビトナミーズ（P．falcipa rum Vietnamese）分離物VIのＳ抗原のカルボキシ末端部分は、１９回繰り返された１１個のアミノ酸のストレッチ（stretch）からなる。両方のタンパク質の繰り返し単位は、５０％同一で、８０％共同関係にある。ライフサイクル段階特異性のリーシュマニア属からの遺伝子は本発明において単離されうる。これらの遺伝子のいくつかは、ライフサイクル段階間の遷移に必要とされ、そして、リーシュマニア属の寄生体のビルレンス遺伝子、例えば、リーシュマニア属有機体のアマスティゴートの形態による感染の維持に必要とされるビルレンス遺伝子を含む。これらのビルレンス遺伝子は、例えば、欠失（dele tion）や変異によって機能的に作業不能となりえ、挿入的な変異誘発（insertio nal mutagenesis）を含み、そしてさらに、そのワイルドタイプ（wild-type）のリーシュマニア属の遺伝子は、機能的に作業不能とされた遺伝子に置き換えられる。そのビルレンス遺伝子は、例えば、５’−及び３’−ノンコーディング（no n-coding）ＤＮＡ配列でフランク（flank）された抗性の抵抗遺伝子を含むＤＮＡのフラグメントを伴ったリーシュマニア属有機体の転換に続く共同組織（homo logous recombination）によりＡ２遺伝子を選択可能な抗性の抵抗遺伝子と取り替えることによって機能的に作業不能となり得る。このプロセスは、リーシュマニア属の弱毒された変異体を発生させるために使用でき、弱毒された変異体の残りの病原性はマウスやハムスターや豚において評価可能である。人間の宿主の環境（リーシュマニア属有機体がマクロファージ細胞内にあるとき）において選択的に発生した遺伝子の欠失（deletion）は、人間の中では生存できないが防衛的免疫反応を起こす弱毒された菌株（strain）を生じさせるであろう。リーシュマニア属の弱毒された菌株（strain）は、本発明の点で、リーシュマニア属及びそのような弱毒された菌株（strain）形態により引き起こされた疾病に対する生ワクチンとして有益であろう。ここに表される具体例によって代表されるリーシュマニア属の特異的に発現する遺伝子およびタンパク質は以下のものとして有益である。 − リーシュマニア属によって引き起こされる疾病に対するワクチンのための抗原。 − 交雑プローブ（hybridization probes）を含む診断試薬、抗原、及び、例えばリーシュマニア属による感染を発見するための特異的抗血清を作製する方法。 − 弱毒されたリーシュマニア属変異体（variants）の発生のための機能的作業不能に対するターゲット遺伝子。特異的に発現する遺伝子によってコードされたタンパク質またはリーシュマニア属の弱毒された菌株の効果的な量を含むワクチン、及び生理学的に受容可能なキャリヤーは、それゆえ、アジュバントをキャリヤーとして利用でき、そしてそのタンパク質は、ＩＳＣＯＭ又はリポソームと共同して、ホストの免疫システムへもたらされる。そのワクチンは、ホストへ疾病に対する免疫性を与えるため、経鼻または経口により、注入可能な形態でホストへ投与されるために製剤化され得る。微生物の寄託ここに記述しそして参照するプラスミドｐＧＥＣＯ９０は、１９９３年６月２８日のブタペスト条約に従ってこの出願前にＵＳＡ，メリーランド州，ロックビルにあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託し、加入番号７５５１０に指定された。このプラスミドのダイアグラムは図６に示されている。このプラスミドは、ここに記述したL．donovani のＡ２ジェーンを含んでいる。このプラスミドは、このＵＳ特許出願に基づく特許が与えられるとおおやけに利用できるようになる。ここに述べ、クレームする発明は、寄託された物質によって態様が限定されるものではない、なぜなら寄託された具体物はたんにこの発明の実例にすぎないからである。どんな同等な物質もこの発明の範囲内にある。実施例上述の開示は本発明の概要である。さらに完全な理解が以下の特別な実施例を参照することによって得られるであろう。これらの実施例はたんに実例をあげることを目的とするもので、本願の態様を限定しようとするものではない。形を変えたり同等物で置き換えたりすることは、状況により適宜なし得ることである。ここでは特別の語句が使われているが、これらの語句は記述的な意味で用いられていて、制限の目的はない。この開示およびこれらの実施例で使われてはいるが明確に記述されていない分子遺伝学の方法や蛋白質の生化学は科学文献に詳しく報告されていて、当業者の充分理解できる範囲のものである。実施例１この実施例はLeishmaniaオルガニズムスの培養と分離について述べる。 L．donovani Ethiopian ＬＶ９ストレインのアマスティゴート（amastigotes ）が感染したメスのゴールドシミアンハムスターの脾臓から採取され前述のように精製された（参考文献１２）。略述すれば、ホモゲナイザーを用いて組織から寄生虫を放出し、その混合物を、細胞の破片を除くために１００Ｇで３回遠心分離し、アマスティゴートを１５００Ｇでペレット化した。このペレットを、汚染している赤血細胞を溶解させるために、０．１７Ｍの酢酸ソーダに再懸濁し、アマスティゴートを１５００Ｇで遠心分離で回収した。コンプリートＰＲＭＩメディウム（エンドトキシンフリーの熱で不活性化されたＦＢＳ１０％，ｐＨ７．３の１Ｍヒーペス１０ｍｌ，ｍｌ当り１００Ｕのペニシリンおよび１００Ｕのストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ１６４０）に、オルガニズムを、ＲＮＡ抽出に先立って、３７℃で１８時間インキュベートした。インキュベーションと多数回の洗滌の期間の後も、アマスティゴート調製物はなお生理学的に活性があり、ホストセルの汚染は比較的フリーである。プロマスティゴートを得るために、ＬＶ９ストレーンアマスティゴートをコンプリートＲＰＭＩメディウム中で２６℃でディファレンシェートし、使用前に少なくとも７日間同じメディウム中で培養する（参考文献１２）。 L．donovani スーダニーズストレーン１Ｓ２ＤのプロマスティゴートはコンプリートＲＰＭＩメディウム中で２６℃で培養されパッセージされる。１Ｓ２Ｄストレーンのアマスティゴート様のオルガニズムは、Doyle らによって記述されているようにして培養された（参考文献１３）。スーダニーズストレーン１Ｓ２Ｄおよび１Ｓ２Ｄ（ｗｔ）は、ＵＳＡ，ケンタッキー大学のDr．S．Turcoより得た。１Ｓ２Ｄ（ｗｔ）プロマスティゴートはアクセニック条件（axenic conditions ）下で生育するよう適合され、感染性のプロマスティゴートに変質する能力を失っていた。実施例２この実施例はLeishmania ｃＤＮＡライブラリーの調製とスクリーニングを述べる。そのオルガニズムのライフサイクル中のアマスティゴートステージの間に差別的に示されるLeishmaniaのジェーンの分離を図１に示す。アマスティゴートおよびプロマスティゴートの全ＲＮＡは“ＲＮＡｚｏｌ”（テキサス州，フレンズウッドのCinna/biotex ラボラトリーズインターナショナル株式会社の商標）を用いてグアニジニウムイソチオシアネート法によって調製され、ポリＡ’ＲＮＡはSambrookら（参考文献１４）による記述のように、オリゴｄＴセルローズクロマトグラフィー（グレード７：ファーマシア（ Pharmacia ）社）によって選別された。１０⁶クローンのＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩユニダイレクショナルｃＤＮＡライブラリーを“λ ＺＡＰ II”ベクター（Stratagene社の商標）中で組み立てるために、合計１０μｇのアマスティゴートｍＲＮＡが使われた。ヘミーメチル化ｃＤＮＡはその製造業者の試薬とプロトコールを使って製造された。プライマリーライブラリーの、約４０，０００のアマスティゴートおよびプロマスティゴート−スペシフィックのクローンがアマスティゴートおよびプロマスティゴートステージ−スペシフィックジーンプローブとともにディファレンシャルに選別された。ｃＤＮＡプローブは、オリゴｄＴ_12-18 プライマー（Pharmaci製）およびＭ−ＭＬＶレバーストランスシプターゼ（ＢＲＬ）を用い、前に述べた（参考文献１５）に書かれているプロトコールに従って調製された。対のフィルターが各プローブと、４２℃で１８時間、５０％のフォルムアミド，６ＸのＳＳＣ，５ＸのDenhardtの溶液，５％の硫酸デキストラン中で雑種を作らされた。それから膜を室温で１ＸＳＳＣ中で２０分２回洗滌し、５５℃で１ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で２回洗滌し、“Ｘ−ＯＭＡＴ”フィルム（Kodak 社の商標）に、１８ないし７２時間かけてインテンスファイイングスクリーンでオートラジオグラフした。このような洗滌操作は雑種作成の厳重な条件に相当する。推定される、関心のあるクーロンを含むプレート上の面積を拾い上げ、スクリーニングの第二ラウンドをそのファージプールに受けさせる。アマスティゴートスペシフィックｃＤＮＡクローンは図１のプラークハイブリダイゼイションオートラジオグラム上に矢印で示した。プロマスティゴートスペシフィック転写を示すｃＤＮＡクローンがアマスティゴートスペシフィック転写を示すクローンよりもより多かったが、アマスティゴートスペシフィックプローブとだけ雑種を作った７つの独立のｃＤＮＡクローンが分離され、２，３，５，６，８，９，１１と名づけられた。分離された各ｃＤＮＡクローンに対して、ヘルパーファージ４０８を用いてｉｎｖｉｖｏでブルースクリプトプラスミド誘導体がλＺＡＰIIリコムビナントファージから切除された。実施例３この実施例にはアマスティゴートに特異性のｃＤＮＡクローンの特性が記述される。アマスティゴートに特異性のｃＤＮＡクローンに対応するBluescriptプラスミドの各々のインサートのサイズは限定酵素消化とアガロースゲル電気泳動（Ｆｉｇ．２）により決定された。組換えプラスミド（Ａ２，Ａ３，Ａ５，Ａ６，Ａ８，Ａ９およびＡ１１）はＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで、ｃＤＮＡインサートをはたらかせるために消化された。フラグメントは１％のアガロースゲル上で分離され、エチディウムブロマイドで色付けした。ｃＤＮＡインサートは０．５Ｋｂ（Ａ５）から１．８Ｋｂまで変化し、Ａ８は内部のＥｃｏＲＩサイトを含有した。アマスティゴートに特異性のｃＤＮＡクローンが共通の配列を含むかを決定するために、アマスティゴートに特異性のｃＤＮＡクローンに対応するBluesc riptプラスミドのサザーンブロットハイブリダイゼーション分析がクローンＡ２およびクローンＡ６に特異性のプローブを用いて実施された（Ｆｉｇ．３）。サザーンブロットハイブリダイゼーション分析のために全ＤＮＡ１０μｇが限定酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで完全にカットされ、１％アガロースゲル上で分離された。制限フラグメントは標準操作（ｒｅｆ．１６）を用いてナイロン膜に転写され、デュプリケートは、ｃＤＮＡクローンＡ２（０．９ｋｂ）またはＡ６（０．６ｋｂ）のインサートを表わすα−³²ＰｄＣＴＰニック−トランスレーテッドプローブ（nick-translated probe ）と交雑した。Ａ２プローブは５つのｃＤＮＡ（Ａ２，Ａ３，Ａ８，Ａ９およびＡ１１）を認めた。Ａ６はそれ自身に交雑しているのみであった。したがって、このサザーンブロット分析は、ｃＤＮＡクローンＡ２，Ａ３，Ａ８，Ａ９およびＡ１１は相同の配列を含有するが、Ａ５とＡ６とは関連のないアマスティゴートに特異性の写しのクローンであることを示した。Ａ２シリーズのクローンが、Leishmania組織がマクロファージ中に存在するとき、自由生活性プロマスティゴート中での発現に比較して特異的に発現されるLe ishmania 遺伝子を表わすことを確かめるために、ノーザンブロット分析（Northe rn blot analysis）が実施された。全ＲＮＡは骨髄からのマクロファージ（ＢＭＭ）、L．donovani ＬＶ９−感染ＢＭＭ（ＩＢＭＭ）およびL．donovani ＬＶ９プロマスティゴート（ＰＲＯ）から抽出された。ネズミの骨髄からのマクロファージの培養およびL．donov ani アマスティゴートのインヴィトロの感染は前記（ｒｅｆ．１２）のとおり実施された。ＲＮＡスピーシーズ（１５μｇ）はアガロースゲル上で分離され、転写に先立ってエチディウムブロマイドで着色された（Ｆｉｇ．４、右のパネル）。ＲＮＡはグリオキザール処理により変性され、ナイロン膜に転写された。ノーザンブロットはラベルされたｃＤＮＡＡ２（０．９ｋｂ）フラグメントと前記（ｒｅｆ．１２）（Ｆｉｇ．４、左のパネル）したように交雑された。このプローブはアマスティゴート感染マクロファージ中に存在する３．５ｋｂの写しを特に認めたが、プロマスティゴートまたは非感染マクロファージ中のものは認めなかった。この分析は、Ａ２の遺伝子が、アマスティゴートがマクロファージ中に存在している場合、自由生活性生物に比べてアマスティゴート中において増大したレベルで発現すること、および発現の増大は少なくとも１０倍の増大であることを示した。実施例４本実施例は、ゲノムの組換え及びリーシュマニア・ドノヴァニ（Leishmania d onovani ）のアマスティゴート（amastigote：細胞内無鞭毛体）に特異的なＡ２遺伝子の配列決定を記載するものである。トリパノソーマ科における転写制御は、特異的な遺伝学的特性の一つである。１つの遺伝子の複数のコピーまたは複数の関連遺伝子は、しばしば、同一染色体上に直列に複合化されてクラスターを形成しており、単一のプロモーター領域がこのクラスターの発現を制御している。転写は、多数のシストロンを含むＲＮＡ分子の合成を誘導し、このＲＮＡは、翻訳に先だってトランススプライシング（ trans-splicing）によって個々の単位に切断される。これが多遺伝子ファミリーを代表するものかどうかを決定するために、このＡ２関連遺伝子におけるゲノムの組換えについての検討をサザンブトット分析によって行った。全ＤＮＡが複数の制限酵素（Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｓ：ＳａｌＩ、Ｘ：ＸｂａＩ、Ｃ：ＣｌａＩ、Ｐ：Ｐｖｕ II）によって完全に消化された。その際、二重消化処理のために、このＤＮＡを最初にＣｌａＩとＰｖｕ IIで完全消化させ、沈澱させ、さらに再懸濁させてから、適合する緩衝液中で２回目の消化を行った。切断された断片は、０．７％アガロースゲス上で分離され、ナイロン膜に転写され、α −³²ｐｄＣＴＰニックトランスレーションされたＡ２ｃＤＮＡ挿入断片を有する０．５ｋｂＰｓｔＩ／ＸｈｏＩ断片とハイブリダイズされた。各消化処理ごとに、一連の異なる強度の複数のバンドがハイブリダイゼーションパターンに現れ、これによって、上記遺伝子の複数のコピーがゲノム中に存在することが示された（図５）。更に、ＥｃｏＲＩ、ＸｂａＩ及びＳａｌＩでの消化における約６〜８ｋｂの位置での共通のバンドの存在は、直列配列での組換えを示唆していた。しかし、各レーンにおける少なくとも２つのそれ以外のバンドの存在は、２以上のクラスターが存在すること、そして各クラスターは異なるサイズで制限酵素により切断される断片を介して存在することが示唆された。あるいは、クラスターが、種々のサイズの非関連遺伝子または遺伝子間領域の複数のコピーを有している可能性がある。Ａ２の蛋白質をコードする領域を特定するために、Ａ２遺伝子の配列を含むゲノムのクローンが単離された。６〜１０ｋｂＥｃｏＲＩ断片を含む部分的なゲノムライブラリーが、ラムダＺＡＰ II ベクター（ストラタジエン社製）中に構築された。２，０００を超えるクローンが実施例２に記載された処理方法及びハイブリダイゼーションの条件を用いて、Ａ２ｃＤＮＡで調製されたプローブによって２つのフィルター上のそれぞれにおいてスクリーニングされた。８つのクローンが単位、精製された。ｃＤＮＡクローンについては、組換えラムダファージからブルースクリプト（bluescript）プラスミド誘導体が取り除かれた。Ａ２ブルースクリプトクローンの１．９ｋｂＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ挿入断片は、配列決定のために、ブルースクリプトファージミド（phagemid）ＫＳ⁺ とＫＳ^- にサブクローン化された。Ｅｘｏ III エクソヌクレアーゼ及びＳ１ヌクレアーゼを用いて、両方のプラスミド上での一括削除を行った。配列決定のための反応は、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを用い、更に、デアザ（Deaza ）Ｇ／Ａ配列決定用ミックス（ファルマシア社製）及びｄ³⁵ＡＴＰまたはｄ³⁵ＣＴＰラジオアイソトープを用いて、公開されている操作（参考文献１７）に従って、一本鎖ＤＮＡ鋳型上で行われた。６％の変成ゲル上で反応を分析した。ゲノムクローン中へ挿入された部分は、複数の制限酵素によって地図化され、いくつかのものが他のものよりも長かった以外は、似たようなパターンが現れた。これらのクローンの一つであるｐＧＥＣＯ９０が、図６に示すように、次の特性分析のために選択された。図７には、ｐＧＥＣＯ９０に挿入された断片の制限酵素地図と、これがＡ２関連ｃＤＮＡとどのような関連があるかが示されている。図７に示された制限酵素は、Ｓ：ＳａｌＩ、Ｐ：ＰｓｔＩ、Ｏ：ＸｈｏＩ、Ｘ：ＸｂａＩ、Ｅ：ＥｃｏＲＩ、Ｍ：ＳｍａＩである。プラスミドｐＧＥＣＯ９０は、唯一のＳａｌＩ及びＸｂａＩ切断部位を含むが、ＣｌａＩ切断部位は持たず、そして、このことは、図５に示すサザンブロット分析と一致した。このゲノムクローンのＥｃｏＲＩ切断部位の隣にあるＤＮＡ配列が決定され、Ａ８ｃＤＮＡの関連部分に正確に一致するものであることが示され、そして、この断片が直列配列の一つの単位であることが確認された。３．５ｋｂＡ２転写物に相当するｐＧＥＣＯ９０ゲノムクローンの１．９ｋｂＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片のＤＮＡ配列が決定され（図８）、上記ｃＤＮＡの配列と比較された。最も長いオープンリーディングフレーム（暗号解読枠）（ＯＲＦ II）が見いだされ、これは１．１ｋｂＸｈｏＩ／ＸｂａＩ断片に含まれており、２２ｋＤ蛋白質生産物（Ａ２蛋白質）を潜在的にコードしていた。終了コドンは、開始ＡＴＧよりも上流の２つの他のフレームに見られた。この予測されたＡ２蛋白質のほとんどは、直列の１０個のアミノ酸の１９回の繰り返しからなる反復的配列からなるものであった。この繰り返しの各単位は、２個のセリン、２個のバリン、２個のロイシン及び２個のプロリンを含み、５個の残基を介して、各々が分割されている。そして、この繰り返し領域も、直列した５個のアミノ酸の３８回の繰り返しと考えられる。アミノ（Ｎ）−ターミナル部分に、単一の疎水性ドメインが位置し、これはシグナルペプチドに相当するものといえる。この予想されたアミノ酸配列は、ファスタアルゴリズム（Fasta algorithum）を用いたスイス−プロットデータベースヴァージョン（Swiss- Prot database version ）（カナダインスティティュートフォーサイエンティフィックアンドテクニカルインフォメーション：サイエンティフィックニュメリックデータベースサービス）に報告されている蛋白質と比較された。最も著しい一致は、プラスモディウム・ファルシパルム・ヴェトナミーゼ（Plasmodium falciparum Vietnamese）単離体VIのＳ−抗原との間に見られた。図９に、Ａ２蛋白質の配列（Ａ２）と、P．falciparum 単離体VIのＳ−抗原アミノ（Ｎ）−ターミナル部分とを並列したものが示されている。一致する残基は、ダッシュで示されており、相同のアミノ酸はドットで示されている。L．donovan i Ａ２蛋白質との場合については、このP．falciparum Vietnamese単離体IV抗原のカルボキシ（Ｃ）−ターミナル部分は直列した１１アミノ酸の１９回の繰り返しからなっていた。これらの両方の蛋白質における繰り返し単位は、５０％の同一性と８０％の相同性を有していた。このプラスモディウムのＣＳ−抗原としてのＳ−抗原は、ステージ（時期）特異的で、哺乳動物中で発現し、昆虫中では発現しない蛋白質である。従って、関連性のないヒト感染性原生動物からのＡ２遺伝子とＳ−抗原遺伝子が、哺乳動物において特異的に発現し、類似の蛋白質をコードするものであった。すなわち、これらＡ２蛋白質及びＳ−抗原蛋白質は似たような機能を発揮する可能性があり、おそらくこれらの原生動物がヒトにおいて生残を可能とするのに必要とされるものである。また、L．donovani 中でのＡ２配列の機能の無力化から、リーシュマニア症のための弱毒化された生ワクチンとして有用な非感染性のプロマスティゴートを得ることが期待できる。実施例５この例はLeishmaniaで差動的に表わされた遺伝子の機能的無能化について記述する。 Leishmaniaの稀釈種の展開のための１つの試みとして同族再結合法を用いることによりLeishmaniaゲノムからamastigote−特異遺伝子（Ａ２遺伝子のような）を機能的に無能化するために行なわれる。原生動物類（Leishmaniaのような）からの遺伝子の欠失が記述されている（文献１８）。この方法はＡ２遺伝子にＤＮＡ断片５’−および３’をクローニングすることを含み、ネオマイシン抵抗遺伝子をサンドイッチングするこれらのフランキングＤＮＡ配列を含むプラスミドベクターをも含む。このＤＮＡ５’−ネオ３’−断片は、L-donovani-promastigot o をＧ４１８抵抗に変えるために用いられた。L-donovaniは二量体でありＧ４１８抵抗種族のようなＡ２遺伝子の１つの対立の欠失はＡ２特定プローブを使用するSouthen ブロットのハイブリッド化によって決定することができる。それから、第２のＡ２対立はヒグロマイシン抵抗遺伝子をサンドイッチングする５’−および３’−Ａ２フランキングシーケンスを含む第２の欠失を構成することによって欠失させることができる。次いで変質コロニイはＧ４１８およびヒグロマイシンを含む媒体上で選択される。Ａ２遺伝子の両方のコピーの欠失は、Southen ブロットのハイブリッド化によって確認することができる。実施例６この実施例は、L.donovani amastigote −特異Ａ２遺伝子の発現およびkara-a zer 免疫性血精によるＡ２遺伝子生成物の認知について記述する。不均一系でのＡ２蛋白を生産するために、開始ＡＴＧからＸｂａＩ限定サイト（図８参照）へのコーディング領域はＨＩＳ−ＴＡＧ（図１０）でフレーム中ｐＥＴ１６Ｂ発現ベクター中にサブクローンされる。２７ｋＤのＡ２溶解蛋白は、ｐＥＴ１６ｂ／ＯＲＦIIプラスミドおよびネガティブコントロールpBluescrip t ／ｐ５３プラスミドを用い、人ｐ５３蛋白をコードするｉｎｖｉｔｒｏ転写 −ほん訳アッセイ（ＴＮＴ系、Promega ）で生産された。ｉｎｖｉｔｒｏでほん訳されたＨＩＳ−ＴＡＧ／Ａ２³⁶Ｓ−ラベルされた蛋白は、kara-azar 免疫血精で免疫沈降させられ、ポリアクリルアミド−Ｎａドデシル硫酸塩電気泳動法（図１１）によって分析された。kala-azer は、L.donovaniによって病原菌を記述するために用いた用語である。kara-azar は内臓のleishmania症にかかった患者から得たものであり、ＥＬＩＳＡのL.donovani抗原に対して強く反応したものである。図１１中でレーン１および２はラベルされた蛋白Ａ２およびｐ５３が免疫沈降に先立ってそれぞれ含まれている。レーン３および４は、蛋白Ａ２およびｐ５３をそれぞれ含み、kala-azar 血精（Ｌ１）で免疫沈降されており、レーン５および６は蛋白Ａ２およびｐ５３をそれぞれ含み、標準人血精（ＴＸＣ）で免疫沈降されている。kara-azar 血精は、ネガティブコントロール蛋白人ｐ５３に対して反応しないが、Ａ２遺伝子生成物に対して免疫沈降する。どちらの蛋白も標準人免疫血精によって免疫沈降しない。この分析で、L.donovaniＡ２遺伝子の生成物がkara-azar 免疫血精によって特異的に確認された。免疫反応の特異性を確認するために、再結合Ａ２溶融蛋白に対してｐＥＴ１６ｂ／ＯＲＦIIプラスミドをコードし、ネガティブコントロールプラスミドｐＥＴをインサートすることなくＥ．ｃｏｌｉに導入した。発現はＩＰＴＧで誘導し、再結合Ｅ．ｃｏｌｉセルはＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、上記したkara-azar 免疫血精を用いて分析した（図１２参照）。図１２でレーン１はＥ．ｃｏｌｉ／ｐＥＴ１６ｂセルを含み、レーン２にはＥ．ｃｏｌｉ／ｐＥＴ１６ｂ／ＯＲＦIIセルを含む。kara-azar 血精は、ｐＥＴ１６ｂ／ＯＲＦII プラスミド（レーン２）を含むセルの分解物中で２７．５および２５ＫＤの蛋白生成物と特異的に反応した。Ａ２シークエンスは、それ自体開始ＡＴＧを含むので、おそらくＨＩＳ−ＴＡＧではなくＡ２蛋白に相当する。血精は標準ｐＥＴ１６プラスミド（レーン１）を含むＥ．ｃｏｌｉ分解物から蛋白との特異的反応はない。これらの結果は、L.donovani蛋白（Ａ２）がコードされたＡ２遺伝子のＯＲＦIIが内臓のleishmania症の患者における抗原であることを確認している。実施例７この例は異なったリーシュマニアの種および亜種の単離された染色体のSouthe rn blot 分析を述べる。リーシュマニア（Leishmania）菌株はAmerican type culture collection（Rock ville，Maryland ）から入手し、それらは以下の取得番号で特定されている。試料ブロックは最初に下記のようにしてリーシュマニア（Leishmania）菌株から調製した。１）プロマスティゴートセルをHepes-Nacl緩衝液（２１ｍＭ：ＨＥＰＥＳ、ｐＨ：７．５、１３７ｍＭ：Ｎａｃｌ、５ｍＭ：Ｋｃｌ、０．７ｍＭ：Ｎａ₂ＰＯ₄及び６ｍＭグルコース）で一度洗浄し、同じ緩衝中に密度５×１０⁸で再懸濁させた。２）セルは１％の低融点寒天の１容量で薄めて、１００μｌの試料を試料容器中で４℃に冷却した。３）ブロックをLaysis緩衝液（０．５Ｍ：ＥＤＴＡ、ｐＨ：９．５、１％ラウリルサルコシルナトリウム、２ｍｇ／ｍｌのタンパク分解酵素Ｋ）中に移し、５０ ℃で１８時間保持した。４）ブロックを０ｍ．５ＥＤＴＡ中で４℃に保持した。次いで、菌株は試料ブロックからGeneline II システム（beckman 計器）を用いたTransvers Alternating Field Electrophoresis （ＴＡＦＥ）によって次の条件で分離した。 −１％寒天ゲルは１ＸＴＡＦＥ中（２０ＸＴＡＦＥ緩衝液は０．４５Ｍトリス−ボレート、０．０１ＭＥＤＴＡよりなる）で調製した。電気泳動は１５℃ 、３５０ｍＡで３６時間行った。 −電気泳動の条件は第１段階：１２時間パルス時間４０ｓ第２段階：１２時間パルス時間１００ｓ第３段階：１２時間パルス時間１６０ｓ Southern blot は次の手順書によって菌株ＤＮＡから調製した。１）ゲルはＤＮＡの部分浄化のため０．２５ＭのＨｃｌに浸した。２）ＤＮＡはアルカリ処理で変性した。（ゲルは０．５ＮＮａＯＨ、１．５ＭＮａｃｌに浸して振とうした）３）ゲルを０．５Ｍのトリス−ｃｌ、ｐＨ７．０、３ＭＮａｃｌ中で４５分間振とうして中和した。４）ＤＮＡはVacugene XL(Pharmacia-LKB)を用いたナイロンメンブランに移し、１０ＸＳＳＣ（１ＸＳＳＣは０．１５Ｍ−Ｎａｃｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムよりなる）中で６０ｍｂａｒ、２時間保持した。次いで、混成（Hybridization ）は次のように行った。 −ナイロンメンブランは１Ｍ−ＮａＣｌ、１％ソヂウムドデシルサルフェト（ＳＤＳ）、１０％デキストランサルフェト中で６５℃で２時間予備混成した。 −変性プローブは混成緩衝液に直接加えて、ブロットを６５℃で１８時間保持した。 −メンブランは２ＸＳＳＣで、０．１％ＳＤＳで室温で２０分間２回、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで２０分間２回洗浄した。 −メンブランは１８時間増感スクリーン付きのコダックＸ−ＯＭＡＴフィルム上に曝した。使用したＤＮＡプローブは精製寒天ゲルで精製され、ニックトランスレーションによって³²Ｐ−ｄＣＰＴ（ＩＣＮ；３０００ｃｉ／ｍＭｏｌ）で高度に特異性にラベルされたｐＥＴ１６ｂ／ＯＲＦII １．１ｋｂＢａｍＨＩフラグメントからなる。このフラグメントはL．donovani のＡ２領域のコードされた完全なＡ２プロテイン領域を含んでいた。得られたSouthern blotsを図１３に示す。図１３で得られたデータは、L．donovani のＡ２領域はL．donovani で試験された全ての３つの種とL．mexicana の２つの亜種に存在することが示されている。しかしながら、登録された配列Ａ２はL．tropica、L．major、L．braziliensi s 、L．astiopicaには見つからなかった。これ等の結果からL．donovani Ａ２遺伝子ＤＮＡはLeishmania種のなかでL．donovani とL．mexicana を特異的に検出するprobe として有用であることが明らかである。 L．donovani とL．mexicana 種は通常広く異なった地球上の場所で見いだされ、それでprove は地球上の特定の存在する種による感染に特異的である。開示の要約この開示の要約において、本発明は特異的に表わされた遺伝子とLeishmaniaのプロテインを供給し、そしてそれはLeishmania組織がmacrophages に存在する時、promastigote段階よりもライフサイクルのamastigote段階において、有意に高いレベルで表れるＡ２遺伝子を含む。本発明のスコープの範囲内での修正も可能である。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年８月２２日【補正内容】請求の範囲１．リーシュマニアにおいて特異的に発現する遺伝子をコードする部分を少なくとも含み、該特異的に発現する遺伝子は、マクロファージ中に該リーシュマニアが細胞内無鞭毛体（アマスティゴート体）として存在する時に、該リーシュマニアの有鞭毛レプトモナス体（プロマスティゴート体）と比べて少なくとも約１０倍増加したレベルで発現するものである単離及び精製された染色体ＤＮＡ分子。２．前記特異的に発現する遺伝子が、リーシュマニアのビルレンス遺伝子である請求項１のＤＮＡ分子。３．前記ビルレンス遺伝子に、アマスティゴート体での感染の維持が要求されるリーシュマニアの請求項２のＤＮＡ分子。４．前記特異的に発現する遺伝子が蛋白質をコードする請求項１のＤＮＡ分子。５．前記リーシュマニアが、リーシュマニア・ドノヴァニである請求項１のＤＮＡ分子。６．前記特異的に発現する遺伝子が図８に記載の配列をコードするＤＮＡまたはその相補鎖であるか、あるいは厳格な条件下で該遺伝子とハイブリダイズするリーシュマニアにおいて特異的に発現する遺伝子をコードするＤＮＡ分子である請求項１のＤＮＡ分子。７．以下のヌクレオチド配列を有する単離及び精製されたＤＮＡ断片：（配列番号１）、またはその相補鎖、あるいは厳格な条件下で上記配列とハイブリダイズするリーシュマニアにおいて特異的に発現する遺伝子をコードするＤＮＡ分子。８．以下のヌレクオチド配列を有する単離及び精製されたＤＮＡ断片：（配列番号２）、またはその相補鎖、あるいは厳格な条件下で上記配列とハイブリダイズするリーシュマニアにおいて特異的に発現する遺伝子をコードするＤＮＡ分子。９．以下のアミノ酸配列をコードする単離及び精製されたＤＮＡ分子：（配列番号３）、またはその相補鎖、あるいは厳格な条件下で上記配列とハイブリダイズするリーシュマニアにおいて特異的に発現する遺伝子をコードするＤＮＡ分子。１０．微生物宿主の形質転換用に適合させた組換えプラスミドであって、プラスミドベクターと、該ベクター中に挿入された請求項１〜９のいずれか１つの単離及び精製されたＤＮＡ分子を含むＤＮＡ部分を有する組換えプラスミド。１１．ＡＴＣＣ７５５１０のｐＧＥＣＯ９０である請求項１０の組換えプラスミド。１２．リーシュマニアにおいて特異的に発現する遺伝子によってコードされた精製蛋白質であって、該特異的に発現する遺伝子は、マクロファージ中に該リーシュマニアの細胞内無鞭毛体（アマスティゴート体）として存在する時に、該リーシュマニアの有鞭毛レプトモナス体（プロマスティゴート体）と比べて少なくとも約１０倍増加したレベルで発現するものである精製蛋白質。１３．前記特異的に発現する遺伝子がリーシュマニア有機体のビルレンス遺伝子である請求項１２の蛋白質。１４．前記ビルレンス遺伝子にリーシュマニア有機体のアマスティゴート体での感染の維持が要求される請求項１３の蛋白質。１５．前記特異的に発現する遺伝子が図８に記載のＤＮＡ配列またはその相補鎖を有するか、あるいは厳格な条件下で該遺伝子とハイブリダイズするリーシュマニア有機体の特異的に発現する遺伝子をコードするＤＮＡ配列を有する請求項１２の蛋白質。１６．前記リーシュマニア有機体がリーシュマニア・ドノヴァニである請求項１２の蛋白質。１７．ビルレンス遺伝子が削除によりもしくは該遺伝子の変異誘導により機能的に無力化されたものであるリーシュマニアの弱毒化されたストレイン。１８．前記ビルレンス遺伝子が植え込み変異誘導により機能的に無力化された請求項１７の弱毒化されたストレイン。１９．特異的に発現するビルレンス遺伝子が図８に記載のＤＮＡ配列またはその相補鎖を有するか、あるいは厳格な条件下で該遺伝子とハイブリダイズするリーシュマニア有機体の特異的に発現する遺伝子をコードするＤＮＡ配列を有する請求項１７の弱毒化されたストレイン。２０．請求項１２記載の蛋白質の有効量と、それに対する生理学的に許容しうる担体とを含有する、リーシュマニア有機体により惹起された疾病に対して宿主に防衛的免疫を提供するためのワクチン。２１．前記担体がアジュバントよりなる請求項２０のワクチン。２２．前記蛋白質がＩＳＣＯＭもしくはリポソームと共に、宿主の免疫系に対して供せられる請求項２０のワクチン。２３．ビルレンス遺伝子が機能的に無力化されているリーシュマニアの弱毒化されたストレインの有効量と、それに対する生理学的に許容し得る担体とを含有する、リーシュマニア有機体により惹起される疾病に対して宿主に防衛的免疫を提供するためのライブワクチン。２４．鼻腔内もしくは口内に、注入可能な形態で供与できるようにフォーミュレートされた、請求項２０または２３のワクチン。２５．請求項２０または２３のワクチンの有効量を宿主に供与することよりなる、リーシュマニア有機体により惹起された疾病に対して宿主に免疫性を与える方法。２６．請求項１２の蛋白質に対して生成した抗体。【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年９月２１日【補正内容】１７．請求項３のビルレンス遺伝子が削除によりもしくは該遺伝子の変異誘導により機能的に無力化されたものであるリーシュマニアの弱毒化されたストレイン。２３．請求項１７のリーシュマニアの弱毒化されたストレインの有効量と、それに対する生理学的に許容し得る担体とを含有する、リーシュマニア有機体により惹起される疾病に対して宿主に防衛的免疫を提供するためのライブワクチン。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 9358−4ＢＣ１２Ｐ 21/08 // Ａ６１Ｋ 39/395 9284−4ＣＡ６１Ｋ 39/395 ＤＣ０７Ｋ 16/20 8517−4ＨＣ０７Ｋ 16/20 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:90） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．リーシュマニアにおいて特異的に発現する遺伝子をコードする部分を少なくとも含み、該特異的に発現する遺伝子は、マクロファージ中に該リーシュマニアが細胞内無鞭毛体（アマスティゴート体）として存在する時に、該リーシュマニアの有鞭毛レプトモナス体（プロマスティゴート体）と比べて増加したレベルで発現するものである単離及び精製された染色体ＤＮＡ分子。２．前記増加したレベルが少なくとも約１０倍の増加である請求項１記載のＤＮＡ分子。３．前記特異的に発現する遺伝子が、リーシュマニアのビルレンス遺伝子である請求項１のＤＮＡ分子。４．前記ビルレンス遺伝子に、アマスティゴート体での感染の維持が要求されるリーシュマニアの請求項３のＤＮＡ分子。５．前記特異的に発現する遺伝子が蛋白質をコードする請求項１のＤＮＡ分子。６．前記リーシュマニアが、リーシュマニア・ドノヴァニである請求項１のＤＮＡ分子。７．前記特異的に発現する遺伝子が図８に記載の配列をコードするＤＮＡまたはその相補鎖であるか、あるいは厳格な条件下で該遺伝子とハイブリダイズするリーシュマニアにおいて特異的に発現する遺伝子をコードするＤＮＡ分子である請求項１のＤＮＡ分子。８．以下のヌクレオチド配列を有する単離及び精製されたＤＮＡ断片：（配列番号１）、またはその相補鎖、あるいは厳格な条件下で上記配列とハイブリダイズするリーシュマニアにおいて特異的に発現する遺伝子をコードするＤＮＡ分子。９．以下のヌレクオチド配列を有する単離及び精製されたＤＮＡ断片：（配列番号２）、またはその相補鎖、あるいは厳格な条件下で上記配列とハイブリダイズするリーシュマニアにおいて特異的に発現する遺伝子をコードするＤＮＡ分子。１０．以下のアミノ酸配列をコードする単離及び精製されたＤＮＡ分子：（配列番号３）、またはその相補鎖、あるいは厳格な条件下で上記配列とハイブリダイズするリーシュマニアにおいて特異的に発現する遺伝子をコードするＤＮＡ分子。１１．微生物宿主の形質転換用に適合させた組換えプラスミドであって、プラスミドベクターと、該ベクター中に挿入された請求項１〜１０のいずれか１つの単離及び精製されたＤＮＡ分子を含むＤＮＡ部分を有する組換えプラスミド。１２．ＡＴＣＣ７５５１０のｐＧＥＣＯ９０である請求項１１の組換えプラスミド。１３．リーシュマニアにおいて特異的に発現する遺伝子によってコードされた精製蛋白質であって、該特異的に発現する遺伝子は、マクロファージ中に該リーシュマニアの細胞内無鞭毛体（アマスティゴート体）として存在する時に、該リーシュマニアの有鞭毛レプトモナス体（プロマスティゴート体）と比べて増加したレベルで発現するものである精製蛋白質。１４．前記増加したレベルが少なくとも約１０倍の増加である請求項１３の精製蛋白質。１５．前記特異的に発現する遺伝子がリーシュマニア有機体のビルレンス遺伝子である請求項１３の蛋白質。１６．前記ビルレンス遺伝子にリーシュマニア有機体のアマスティゴート体での感染の維持が要求される請求項１５の蛋白質。１７．前記特異的に発現する遺伝子が図８に記載のＤＮＡ配列またはその相補鎖を有するか、あるいは厳格な条件下で該遺伝子とハイブリダイズするリーシュマニア有機体の特異的に発現する遺伝子をコードするＤＮＡ配列を有する請求項１３の蛋白質。１８．前記リーシュマニア有機体がリーシュマニア・ドノヴァニである請求項１３の蛋白質。１９．ビルレンス遺伝子が機能的に無力化されたものであるリーシュマニアの弱毒化されたストレイン。２０．前記ビルレンス遺伝子が削除により機能的に無力化された請求項１９の弱毒化されたストレイン。２１．前記ビルレンス遺伝子が該遺伝子の変異誘導により機能的に無力化された請求項１９の弱毒化されたストレイン。２２．前記ビルレンス遺伝子が植え込み変異誘導により機能的に無力化された請求項２１の弱毒化されたストレイン。２３．特異的に発現するビルレンス遺伝子が図８に記載のＤＮＡ配列またはその相補鎖を有するか、あるいは厳格な条件下で該遺伝子とハイブリダイズするリーシュマニア有機体の特異的に発現する遺伝子をコードするＤＮＡ配列を有する請求項１９の弱毒化されたストレイン。２４．請求項１３記載の蛋白質の有効量と、それに対する生理学的に許容しうる担体とを含有する、リーシュマニア有機体により惹起された疾病に対して宿主に防衛的免疫を提供するためのワクチン。２５．前記担体がアジュバントよりなる請求項２４のワクチン。２６．前記蛋白質がＩＳＣＯＭもしくはリポソームと共に、宿主の免疫系に対して供せられる請求項２４のワクチン。２７．ビルレンス遺伝子が機能的に無力化されているリーシュマニアの弱毒化されたストレインの有効量と、それに対する生理学的に許容し得る担体とを含有する、リーシュマニア有機体により惹起される疾病に対して宿主に防衛的免疫を提供するためのライブワクチン。２８．鼻腔内もしくは口内に、注入可能な形態で供与できるようにフォーミュレートされた、請求項２４または２７のワクチン。２９．請求項２４または２７のワクチンの有効量を宿主に供与することよりなる、リーシュマニア有機体により惹起された疾病に対して宿主に免疫性を与える方法。３０．請求項１３の蛋白質に対して生成した抗体。