JPH08127593A - 家禽コクシジウム症ワクチン - Google Patents
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/455—Eimeria
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
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- A—HUMAN NECESSITIES
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- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 家禽に投与することによりコクシジウム症に
対してトリを防御できる蛋白質を提供する。また、コク
シジウム症に対するベクターワクチンの調製のために使
用できる前記蛋白質をコードするＤＮＡを提供する。 【解決手段】 配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも
一部またはその生物的な機能の等価物を含むEimeria の
Ｔリンパ球刺激蛋白質。この蛋白質をコードする核酸配
列。
対してトリを防御できる蛋白質を提供する。また、コク
シジウム症に対するベクターワクチンの調製のために使
用できる前記蛋白質をコードするＤＮＡを提供する。 【解決手段】 配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも
一部またはその生物的な機能の等価物を含むEimeria の
Ｔリンパ球刺激蛋白質。この蛋白質をコードする核酸配
列。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、エイメリア属の
種、特にエイメリア・マクシマ( Eimeria maxim a)由来
で、免疫リンパ球を刺激できる蛋白質に係わる。本発明
はまた、この蛋白質の全体または抗原的に重要な部分を
コードする核酸配列、このような核酸配列を含む組換え
ベクター、このような組換えベクターで形質転換された
宿主細胞または宿主生物、及びコクシジウム症に対して
家禽を防御するためのワクチンに係わる。
種、特にエイメリア・マクシマ( Eimeria maxim a)由来
で、免疫リンパ球を刺激できる蛋白質に係わる。本発明
はまた、この蛋白質の全体または抗原的に重要な部分を
コードする核酸配列、このような核酸配列を含む組換え
ベクター、このような組換えベクターで形質転換された
宿主細胞または宿主生物、及びコクシジウム症に対して
家禽を防御するためのワクチンに係わる。
【０００２】
【従来の技術】コクシジウム症は、Apicomplexa 亜門Ei
meria 属の細胞内原生動物の寄生虫である多様なコクシ
ジウムの１つ以上の感染が原因となる疾病である。家禽
は本明細書で、卵または肉の供給源として役立ち、ニワ
トリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウ、キ
ジ、ハト、クジャクのような商業的に重要な種類を含む
家畜の鳥と定義する。
meria 属の細胞内原生動物の寄生虫である多様なコクシ
ジウムの１つ以上の感染が原因となる疾病である。家禽
は本明細書で、卵または肉の供給源として役立ち、ニワ
トリ、七面鳥、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウ、キ
ジ、ハト、クジャクのような商業的に重要な種類を含む
家畜の鳥と定義する。
【０００３】ニワトリのコクシジウム症は、Eimeria の
幾つかの異なる種、即ち Eimeria acervulina 、E.maxi
ma、E.tenella 、 E.necatrix 、E.brunetti、E.mitis
、E.pra ecox 、E.mivati、E.haganiが原因になること
が知られている。しかし、最後の２つの種の存在を疑う
人もいる。これらのEimeria の種のいずれでも低レベル
の感染によって再感染に対する防御的な免疫を生ずる。
幾つかの異なる種、即ち Eimeria acervulina 、E.maxi
ma、E.tenella 、 E.necatrix 、E.brunetti、E.mitis
、E.pra ecox 、E.mivati、E.haganiが原因になること
が知られている。しかし、最後の２つの種の存在を疑う
人もいる。これらのEimeria の種のいずれでも低レベル
の感染によって再感染に対する防御的な免疫を生ずる。
【０００４】各種の種はニワトリに対して病原効果が異
なり、ニワトリのタイプはまた重要な役割を担う。E.ac
ervulinaまたはE.maximaのような寄生虫は、食物消化が
主要な役割である小腸の大部分に寄生するので、ブロイ
ラーニワトリは、これらの寄生虫によって大きな打撃を
被る。
なり、ニワトリのタイプはまた重要な役割を担う。E.ac
ervulinaまたはE.maximaのような寄生虫は、食物消化が
主要な役割である小腸の大部分に寄生するので、ブロイ
ラーニワトリは、これらの寄生虫によって大きな打撃を
被る。
【０００５】E.maximaは上述した種のなかで最強の免疫
原であり、感染後の良好な自然の防御を生じさせる。し
かし、株間で交差した保護をほとんど、または全く示さ
ない変異株もある。
原であり、感染後の良好な自然の防御を生じさせる。し
かし、株間で交差した保護をほとんど、または全く示さ
ない変異株もある。
【０００６】Eimeria 寄生虫は、生活環のなかで多数の
段階を経過する。胞子形成性オーシスト(oocyst)として
知られる感染段階のものを、地面から餌をとったり、ほ
こりを吸入したりする間に、ニワトリが摂取すると寄生
虫の生活環が始まる。E.maximaの場合には、オーシスト
は異常に大きい。胞子を形成したオーシストの細胞壁
は、砂のうと腸管での機械的な粉砕と化学作用で破壊さ
れ、４つのスポロシスト(sporocyst) を放出する。スポ
ロシストは、胆汁および消化酵素にさらされる十二指腸
を通過し、スポロシスト当たり平均２つのスポロゾイト
(sporozoite)を放出する。
段階を経過する。胞子形成性オーシスト(oocyst)として
知られる感染段階のものを、地面から餌をとったり、ほ
こりを吸入したりする間に、ニワトリが摂取すると寄生
虫の生活環が始まる。E.maximaの場合には、オーシスト
は異常に大きい。胞子を形成したオーシストの細胞壁
は、砂のうと腸管での機械的な粉砕と化学作用で破壊さ
れ、４つのスポロシスト(sporocyst) を放出する。スポ
ロシストは、胆汁および消化酵素にさらされる十二指腸
を通過し、スポロシスト当たり平均２つのスポロゾイト
(sporozoite)を放出する。
【０００７】スポロゾイトは可動性であり、侵入し増殖
するために適切な宿主の上皮細胞を探す。上皮細胞に感
染した後、寄生虫は生活環のスキゾント（繁殖体）(sch
izont)期に入り、スキゾント１個当たり8 個から16ない
し200 個を越えるメロゾイト(merozoite) を生じる。ス
キゾントから解放されるとすぐ、メロゾイトは別の上皮
細胞に容易に感染する。
するために適切な宿主の上皮細胞を探す。上皮細胞に感
染した後、寄生虫は生活環のスキゾント（繁殖体）(sch
izont)期に入り、スキゾント１個当たり8 個から16ない
し200 個を越えるメロゾイト(merozoite) を生じる。ス
キゾントから解放されるとすぐ、メロゾイトは別の上皮
細胞に容易に感染する。
【０００８】これらの無性生殖環の２ないし５サイクル
の後、細胞内メロゾイトは雌性または大配偶子母細胞(m
acrogametocyte) 、および雄性または小配偶子母細胞(m
icrogametocyte) として知られる有性生殖形態に入る。
小配偶子母細胞から放出された小配偶子(microgamete)
による大配偶子母細胞の受精の後、回りにシスト(cyst)
壁を形成する接合子(zygote)を生じる。新しく形成した
オーシストは、糞と共に感染ニワトリから外に出る。
の後、細胞内メロゾイトは雌性または大配偶子母細胞(m
acrogametocyte) 、および雄性または小配偶子母細胞(m
icrogametocyte) として知られる有性生殖形態に入る。
小配偶子母細胞から放出された小配偶子(microgamete)
による大配偶子母細胞の受精の後、回りにシスト(cyst)
壁を形成する接合子(zygote)を生じる。新しく形成した
オーシストは、糞と共に感染ニワトリから外に出る。
【０００９】温度、湿度、空気中の十分な酸素といった
適切な環境条件で、オーシストは胞子となり、新しい宿
主に感染する準備ができ、疾病を広げる感染段階に入
る。それ故、トリからトリへ寄生虫が移るのに中間の宿
主は必要ない。
適切な環境条件で、オーシストは胞子となり、新しい宿
主に感染する準備ができ、疾病を広げる感染段階に入
る。それ故、トリからトリへ寄生虫が移るのに中間の宿
主は必要ない。
【００１０】ニワトリの消化器官にEimeria 寄生虫が感
染すると、体重増加の減少、食物転換の減少、卵生産の
停止が起こりうるし、幾つかの場合では死に至る。家禽
の集中的な生産の増加は、この寄生虫による深刻な損失
を伴う。実際、コクシジウム症は経済的に最重要な寄生
虫病になってきた。オランダでは、家禽飼育業者が毎年
被る損失は何百万ギルダーになる。1986年には損失は13
00万ギルダーであった。同年、３億ドルの損失が米国で
あった。
染すると、体重増加の減少、食物転換の減少、卵生産の
停止が起こりうるし、幾つかの場合では死に至る。家禽
の集中的な生産の増加は、この寄生虫による深刻な損失
を伴う。実際、コクシジウム症は経済的に最重要な寄生
虫病になってきた。オランダでは、家禽飼育業者が毎年
被る損失は何百万ギルダーになる。1986年には損失は13
00万ギルダーであった。同年、３億ドルの損失が米国で
あった。
【００１１】過去において、コクシジウム症を制御する
試みにおいて幾つかの方法が使われた。化学療法剤の出
現の前には、散らかったごみの機械的な除去と共に消毒
剤を用いた改良衛生法が、使われた主要な方法であっ
た。しかし、たいてい、疾病が伝染するのに十分量のオ
ーシストが残った。
試みにおいて幾つかの方法が使われた。化学療法剤の出
現の前には、散らかったごみの機械的な除去と共に消毒
剤を用いた改良衛生法が、使われた主要な方法であっ
た。しかし、たいてい、疾病が伝染するのに十分量のオ
ーシストが残った。
【００１２】良好な管理に加えて、餌または飲料水にコ
クシジウム増殖阻止剤を入れることにより、疾病の制御
にある程度は成功した。コクシジウムの薬剤耐性株の出
現に一部起因して、このような薬剤は何年かにわたって
有効性が減少することが分かってきた。更に、幾つかの
化学療法剤は肉に残留し、肉を消費のために不適切なも
のとすることが分かってきた。
クシジウム増殖阻止剤を入れることにより、疾病の制御
にある程度は成功した。コクシジウムの薬剤耐性株の出
現に一部起因して、このような薬剤は何年かにわたって
有効性が減少することが分かってきた。更に、幾つかの
化学療法剤は肉に残留し、肉を消費のために不適切なも
のとすることが分かってきた。
【００１３】Eimeria の全ての７種由来のオーシストを
含む生ワクチンをニワトリに投与するによって、免疫的
に病気を制御する試みがなされた。この際、投与された
オーシストは早熟株(precocious lime) であった。この
ような早熟株を獲得するには、Eimeria の種の野生株の
集団をニワトリに接種し、感染の結果として排泄される
最初の寄生虫を集める。集めた寄生虫をニワトリに戻
し、サイクルを数回繰り返した。結果として、腸におけ
る無性生殖のサイクル数が少ない寄生虫の早熟株が産生
する。このような株は免疫原性を保持し、一方腸におい
てより少ない寄生虫を産生し、結果として宿主のニワト
リへのダメージはより少ない。生きたニワトリで生産す
る必要性と生殖能力の低さ故に、生産するのが高価であ
るというのが、このタイプのワクチンの欠点である。
含む生ワクチンをニワトリに投与するによって、免疫的
に病気を制御する試みがなされた。この際、投与された
オーシストは早熟株(precocious lime) であった。この
ような早熟株を獲得するには、Eimeria の種の野生株の
集団をニワトリに接種し、感染の結果として排泄される
最初の寄生虫を集める。集めた寄生虫をニワトリに戻
し、サイクルを数回繰り返した。結果として、腸におけ
る無性生殖のサイクル数が少ない寄生虫の早熟株が産生
する。このような株は免疫原性を保持し、一方腸におい
てより少ない寄生虫を産生し、結果として宿主のニワト
リへのダメージはより少ない。生きたニワトリで生産す
る必要性と生殖能力の低さ故に、生産するのが高価であ
るというのが、このタイプのワクチンの欠点である。
【００１４】遺伝子工学の出現によって、効果的なワク
チンの生産の新方法が可能となった。これらの方法を使
用して、いくつかの病原性微生物の抗原蛋白質をコード
するＤＮＡがEscherichia coliのような宿主の微生物に
クローンされた。結果として、ワクチンに入れられるほ
ど十分に高いレベルで蛋白質が発現された。この方法で
生産される蛋白質の長所は、非感染性で、生産するのが
比較的安価であるということである。このように、肝
炎、単純疱疹、口蹄疫のような多数のウイルスに対して
ワクチンが調製された。
チンの生産の新方法が可能となった。これらの方法を使
用して、いくつかの病原性微生物の抗原蛋白質をコード
するＤＮＡがEscherichia coliのような宿主の微生物に
クローンされた。結果として、ワクチンに入れられるほ
ど十分に高いレベルで蛋白質が発現された。この方法で
生産される蛋白質の長所は、非感染性で、生産するのが
比較的安価であるということである。このように、肝
炎、単純疱疹、口蹄疫のような多数のウイルスに対して
ワクチンが調製された。
【００１５】コクシジウム症ワクチンを遺伝子工学的に
調製する試みがなされた。欧州特許出願第337589号明細
書には、Ｂ群Eimeri a tenella 蛋白質を単離し、新規な
発現ベクターへ挿入し、これを用いて適当な宿主を形質
転換することが記載されている。国際公開第ＷＯ92/044
61号パンフレットは“mRNAルート”または“核DNA ルー
ト”を使用して抗原性蛋白質を産生する微生物の構築を
述べている。このようにして、E.tenella およびE.maxi
maからのいくつかの抗原が調製され、配列決定された。
このタイプのルートを使って、ワクチンに組み込むため
の抗原を調製することは、ひとえに、異種の株で抗体を
誘導できる抗原を選択することにかかっている。このア
プローチでは必ずしも最も防御的な抗原を選択すること
にならない。
調製する試みがなされた。欧州特許出願第337589号明細
書には、Ｂ群Eimeri a tenella 蛋白質を単離し、新規な
発現ベクターへ挿入し、これを用いて適当な宿主を形質
転換することが記載されている。国際公開第ＷＯ92/044
61号パンフレットは“mRNAルート”または“核DNA ルー
ト”を使用して抗原性蛋白質を産生する微生物の構築を
述べている。このようにして、E.tenella およびE.maxi
maからのいくつかの抗原が調製され、配列決定された。
このタイプのルートを使って、ワクチンに組み込むため
の抗原を調製することは、ひとえに、異種の株で抗体を
誘導できる抗原を選択することにかかっている。このア
プローチでは必ずしも最も防御的な抗原を選択すること
にならない。
【００１６】
【発明が解決しようとする課題および課題を解決するた
めの手段】Eimeria 寄生虫を分画し、免疫Ｔリンパ球を
刺激する蛋白質を選択し、このような蛋白質をコードす
る核酸を含むベクターを調製し、次にこのような蛋白質
を含むワクチンを調製することにより、より効果的なコ
クシジウム症防御ワクチンが生産されうることが見出だ
された。
めの手段】Eimeria 寄生虫を分画し、免疫Ｔリンパ球を
刺激する蛋白質を選択し、このような蛋白質をコードす
る核酸を含むベクターを調製し、次にこのような蛋白質
を含むワクチンを調製することにより、より効果的なコ
クシジウム症防御ワクチンが生産されうることが見出だ
された。
【００１７】本発明の一面によると、精製されたEimeri
a のＴ−リンパ球刺激蛋白質の全部または実質的な一
部、特に免疫的に活性な部分をコードする核酸配列を提
供する。このような核酸配列は、機能するようにして発
現制御配列に結合され、組換え核酸分子を産生すること
ができる。この組換え核酸分子は、適当なベクターに挿
入された時、核酸配列を発現できる組換えベクターを形
成する。
a のＴ−リンパ球刺激蛋白質の全部または実質的な一
部、特に免疫的に活性な部分をコードする核酸配列を提
供する。このような核酸配列は、機能するようにして発
現制御配列に結合され、組換え核酸分子を産生すること
ができる。この組換え核酸分子は、適当なベクターに挿
入された時、核酸配列を発現できる組換えベクターを形
成する。
【００１８】上述した組換えベクターまたは核酸配列は
適当な宿主細胞または宿主生物を形質転換するために使
用できる。このような形質転換宿主細胞または生物はコ
クシジウム症に対する家禽の防御ワクチンに組み込むた
めの刺激蛋白質を生産するために使用できる。あるい
は、形質転換した宿主細胞または宿主生物はそれ自体を
ワクチンに組み込んでもよい。
適当な宿主細胞または宿主生物を形質転換するために使
用できる。このような形質転換宿主細胞または生物はコ
クシジウム症に対する家禽の防御ワクチンに組み込むた
めの刺激蛋白質を生産するために使用できる。あるい
は、形質転換した宿主細胞または宿主生物はそれ自体を
ワクチンに組み込んでもよい。
【００１９】一般的に“蛋白質”なる用語は生物活性を
有するアミノ酸の分子鎖を指す。蛋白質なるものは特定
の長さではなく、所望により in vivoまたは in vitro
で修飾されうる。例えば、グリコシル化、アミド化、カ
ルボキシル化、リン酸化を挙げることができる。なかん
ずく、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドは本定
義に含まれる。
有するアミノ酸の分子鎖を指す。蛋白質なるものは特定
の長さではなく、所望により in vivoまたは in vitro
で修飾されうる。例えば、グリコシル化、アミド化、カ
ルボキシル化、リン酸化を挙げることができる。なかん
ずく、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチドは本定
義に含まれる。
【００２０】より詳細には、本発明は配列番号２で示さ
れるアミノ酸配列からなるＴリンパ球刺激蛋白質または
その免疫活性部分およびそれらの生物学的に機能性の等
価物または変異物を提供する。
れるアミノ酸配列からなるＴリンパ球刺激蛋白質または
その免疫活性部分およびそれらの生物学的に機能性の等
価物または変異物を提供する。
【００２１】特に本願明細書で開示する蛋白質の生物学
的に機能性の等価物または変異物は、例えば一つ以上の
アミノ酸の欠損、挿入および／または置換により、上述
したアミノ酸配列から派生した蛋白質であるが、Eimeri
a 抗原の一つ以上の免疫決定基を保持する。すなわち、
上記変異物は宿主動物に免疫反応を誘発できる一つ以上
のエピトープを有する。
的に機能性の等価物または変異物は、例えば一つ以上の
アミノ酸の欠損、挿入および／または置換により、上述
したアミノ酸配列から派生した蛋白質であるが、Eimeri
a 抗原の一つ以上の免疫決定基を保持する。すなわち、
上記変異物は宿主動物に免疫反応を誘発できる一つ以上
のエピトープを有する。
【００２２】本発明に含まれる特定の蛋白質に於いて、
個々のEimeria 寄生虫または株間で自然の変異が存在し
うることが理解できよう。これらの変異は配列全体に於
ける１個以上のアミノ酸の差異、即ち上記配列に於ける
１個以上のアミノ酸の欠損、置換、挿入、付加でありう
る。本質的に生物的および免疫的活性を変更しないアミ
ノ酸置換は、例えば Neurathらの“The Proteins”Acad
emic Press New York(1979) に記述されている。関連ア
ミノ酸間のアミノ酸置換、または進化の過程でしばしば
起こる置換はとりわけ、Ser/Ala,Ser/Gly,Asp/Gly,Asp/
Asn,Ile/Val である（Dayhof,M.D. のAtlas of protein
sequence and structure, Nat. Biomed. Res.Found.,
Washington D.C., 1978, vol.5, suppl.3 を参照）。他
のアミノ酸置換は、Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,
Ser/Asn,Ala/Val,Thr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Leu/Ile,Le
u/Val,Ala/Glu を含む。この情報に基いて、LipmanとPe
arson は迅速で高感度の蛋白質比較の方法を開発し（Sc
ience,227 ,1435-1441,1985）、相同蛋白質間の機能的類
似性を決定する方法を開発した。本願明細書の具体例に
於けるこのようなアミノ酸置換は、得られる蛋白質が免
疫反応性を保持している限り本発明の範囲内である。
個々のEimeria 寄生虫または株間で自然の変異が存在し
うることが理解できよう。これらの変異は配列全体に於
ける１個以上のアミノ酸の差異、即ち上記配列に於ける
１個以上のアミノ酸の欠損、置換、挿入、付加でありう
る。本質的に生物的および免疫的活性を変更しないアミ
ノ酸置換は、例えば Neurathらの“The Proteins”Acad
emic Press New York(1979) に記述されている。関連ア
ミノ酸間のアミノ酸置換、または進化の過程でしばしば
起こる置換はとりわけ、Ser/Ala,Ser/Gly,Asp/Gly,Asp/
Asn,Ile/Val である（Dayhof,M.D. のAtlas of protein
sequence and structure, Nat. Biomed. Res.Found.,
Washington D.C., 1978, vol.5, suppl.3 を参照）。他
のアミノ酸置換は、Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,
Ser/Asn,Ala/Val,Thr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Leu/Ile,Le
u/Val,Ala/Glu を含む。この情報に基いて、LipmanとPe
arson は迅速で高感度の蛋白質比較の方法を開発し（Sc
ience,227 ,1435-1441,1985）、相同蛋白質間の機能的類
似性を決定する方法を開発した。本願明細書の具体例に
於けるこのようなアミノ酸置換は、得られる蛋白質が免
疫反応性を保持している限り本発明の範囲内である。
【００２３】本願発明は更に、Eimeria の上述した蛋白
質をコードする単離精製した核酸配列を提供する。この
ような核酸配列は配列番号１で示される。遺伝暗号の縮
重によってコドン内の塩基の置換が可能でありそのよう
な置換によって別のコドンにはなるが同じアミノ酸をコ
ードするコドンがあり、例えばアミノ酸であるグルタミ
ン酸のコドンはＧＡＴおよびＧＡＡであることが当業界
でよく知られている。結果として、配列番号２で示され
るアミノ酸配列をもつ蛋白質の発現のための核酸配列
が、配列番号１で示される核酸配列とは異なるコドン組
成を持ちうることは明白である。
質をコードする単離精製した核酸配列を提供する。この
ような核酸配列は配列番号１で示される。遺伝暗号の縮
重によってコドン内の塩基の置換が可能でありそのよう
な置換によって別のコドンにはなるが同じアミノ酸をコ
ードするコドンがあり、例えばアミノ酸であるグルタミ
ン酸のコドンはＧＡＴおよびＧＡＡであることが当業界
でよく知られている。結果として、配列番号２で示され
るアミノ酸配列をもつ蛋白質の発現のための核酸配列
が、配列番号１で示される核酸配列とは異なるコドン組
成を持ちうることは明白である。
【００２４】
【発明の実施の形態】Eimeria maxima寄生虫はLongら
（Folio Vet. Lat.,1976, 6 ,201-207）によって記述さ
れたようにニワトリを通すことによって産生した。感染
ニワトリの排泄物からオーシストを分離し、胞子を形成
させ、飽和食塩水でのフローテーション(floatation)で
精製した。次に胞子を形成したオーシストを用いて病原
体を持っていない４週令のニワトリに感染させた。免疫
反応を強めるためにトリに更に胞子化オーシストを追加
投与した。
（Folio Vet. Lat.,1976, 6 ,201-207）によって記述さ
れたようにニワトリを通すことによって産生した。感染
ニワトリの排泄物からオーシストを分離し、胞子を形成
させ、飽和食塩水でのフローテーション(floatation)で
精製した。次に胞子を形成したオーシストを用いて病原
体を持っていない４週令のニワトリに感染させた。免疫
反応を強めるためにトリに更に胞子化オーシストを追加
投与した。
【００２５】上述したようにフローテーションで精製し
た胞子化オーシストの調製物を、スポロゾイトを放出さ
せるために破砕機での震盪に供した。スポロゾイトを放
出させるために、スポロゾイトを蛋白質分解酵素で処理
し、それからスポロゾイトを洗い、Schmatz らの方法
（J.Protozool.,1984,31,181-183）に従って、イオン交
換クロマトグラフィーで精製した。スポロゾイトを緩衝
液に懸濁し、水浴中で沸騰させ、遠心し、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥのポリアクリルアミドゲル（ドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に載せた。Eime
ria 抗原の分子量を推定するために、同一のゲルで分子
量マーカーを泳動させた。TowbinとGordonの方法（J.Im
munol.Methods.,1984,72,313-340）で、ゲルをニトロセ
ルロース紙に電気泳動させた。それからニトロセルロー
ス紙を洗い、製造業者の指示に従って金染色(Aurodye s
taining)によって可視化した。
た胞子化オーシストの調製物を、スポロゾイトを放出さ
せるために破砕機での震盪に供した。スポロゾイトを放
出させるために、スポロゾイトを蛋白質分解酵素で処理
し、それからスポロゾイトを洗い、Schmatz らの方法
（J.Protozool.,1984,31,181-183）に従って、イオン交
換クロマトグラフィーで精製した。スポロゾイトを緩衝
液に懸濁し、水浴中で沸騰させ、遠心し、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥのポリアクリルアミドゲル（ドデシル硫酸ナトリウ
ム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）に載せた。Eime
ria 抗原の分子量を推定するために、同一のゲルで分子
量マーカーを泳動させた。TowbinとGordonの方法（J.Im
munol.Methods.,1984,72,313-340）で、ゲルをニトロセ
ルロース紙に電気泳動させた。それからニトロセルロー
ス紙を洗い、製造業者の指示に従って金染色(Aurodye s
taining)によって可視化した。
【００２６】Abou-Zeid らの方法（J.Imm.Meth. 98,5-1
0,1987）に基いて、蛋白質バンドをニトロセルロース紙
から切り出し、小断片に切断し、ガラスのバイアルに移
した。それから、ニトロセルロース断片をジメチルスル
フォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、十分に溶解させるた
めに一定時間放置した。その後、炭酸塩／重炭酸塩緩衝
液の滴下のもと、激しく震盪させてニトロセルロース粒
子を沈殿させた。サンプルを遠心し、ニトロセルロース
粒子のペレットを数回洗い、その後、再けん濁し小分注
液に分けた。
0,1987）に基いて、蛋白質バンドをニトロセルロース紙
から切り出し、小断片に切断し、ガラスのバイアルに移
した。それから、ニトロセルロース断片をジメチルスル
フォキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、十分に溶解させるた
めに一定時間放置した。その後、炭酸塩／重炭酸塩緩衝
液の滴下のもと、激しく震盪させてニトロセルロース粒
子を沈殿させた。サンプルを遠心し、ニトロセルロース
粒子のペレットを数回洗い、その後、再けん濁し小分注
液に分けた。
【００２７】電気泳動ゲルのどの蛋白質バンドが、感染
したトリのリンパ球を刺激するかを決定するために、リ
ンパ球増殖アッセイでの使用のために、上述の感染トリ
から静脈穿刺によって血液を取り出した。血液を 600g
で遠心し、10分後沈降した赤血球の上の細胞のけん濁液
を取り出し、さらに10分間400gで遠心した。二番目の遠
心の後、沈殿した細胞を数回洗い、最終的に再懸濁し
た。再懸濁した細胞を、再懸濁し希釈したニトロセルロ
ース粒子と共に丸底のプレートで培養した。対照のウエ
ルは、蛋白質の無いニトロセルロース粒子を含むよう設
定した。
したトリのリンパ球を刺激するかを決定するために、リ
ンパ球増殖アッセイでの使用のために、上述の感染トリ
から静脈穿刺によって血液を取り出した。血液を 600g
で遠心し、10分後沈降した赤血球の上の細胞のけん濁液
を取り出し、さらに10分間400gで遠心した。二番目の遠
心の後、沈殿した細胞を数回洗い、最終的に再懸濁し
た。再懸濁した細胞を、再懸濁し希釈したニトロセルロ
ース粒子と共に丸底のプレートで培養した。対照のウエ
ルは、蛋白質の無いニトロセルロース粒子を含むよう設
定した。
【００２８】リンパ球培養液を96時間インキュベート
し、最後の16時間培養液を 3Ｈ−チミジンでパルスし、
その後細胞をガラスミクロファイバーフィルター上に回
収した。乾燥後、液体シンチレーションカクテル(Scint
illator 299 （登録商標）Packard,Caversham,U.K.) を
加えたシンチレーションバイアルへフィルターを入れ、
放射能をシンチレーションスペクトロフォトメーターで
測定した。結果は次式を使用して得た刺激指数（ＳＩ）
として表した。
し、最後の16時間培養液を 3Ｈ−チミジンでパルスし、
その後細胞をガラスミクロファイバーフィルター上に回
収した。乾燥後、液体シンチレーションカクテル(Scint
illator 299 （登録商標）Packard,Caversham,U.K.) を
加えたシンチレーションバイアルへフィルターを入れ、
放射能をシンチレーションスペクトロフォトメーターで
測定した。結果は次式を使用して得た刺激指数（ＳＩ）
として表した。
【００２９】ＳＩ＝cpm1/cpm2 式中、cpm1= 蛋白質を有するニトロセルロース（ＮＣ）
粒子でインキュベートした３体の培養液の分当りの平均
カウント数。
粒子でインキュベートした３体の培養液の分当りの平均
カウント数。
【００３０】cpm2= 蛋白質の無いニトロセルロース粒子
でインキュベートした３体の培養液の分当りの平均カウ
ント数。
でインキュベートした３体の培養液の分当りの平均カウ
ント数。
【００３１】この方法で、通常Ｔリンパ球は増殖してい
る。
る。
【００３２】その結果から、トリごと、ゲルごとで刺激
指数は異なるが、約 45,000 の相対的な分子量（Ｍｒ）
を有する蛋白質バンドが対照のトリではなく免疫のトリ
からのリンパ球を一貫して刺激した。
指数は異なるが、約 45,000 の相対的な分子量（Ｍｒ）
を有する蛋白質バンドが対照のトリではなく免疫のトリ
からのリンパ球を一貫して刺激した。
【００３３】この発見の後、E.maximaのスポロゾイトの
新鮮な調製物を上述したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
離し、ニトロセルロースに転移した。分子量 45,000 を
有する蛋白質バンド（ｐ４５）を上述したように、切り
出し、溶解させた。更にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）で洗い、ＰＢＳに再けん濁した。このけん濁液をウ
サギに皮下注射した。注射は２週ごとに繰り返した。各
注射の２週後、ウサギの耳の側面の静脈の穿刺から血を
取った。５回のブースターの後、ウエスタンブロッテン
グの決定により、ウサギ抗ｐ４５血清を得た。
新鮮な調製物を上述したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分
離し、ニトロセルロースに転移した。分子量 45,000 を
有する蛋白質バンド（ｐ４５）を上述したように、切り
出し、溶解させた。更にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢ
Ｓ）で洗い、ＰＢＳに再けん濁した。このけん濁液をウ
サギに皮下注射した。注射は２週ごとに繰り返した。各
注射の２週後、ウサギの耳の側面の静脈の穿刺から血を
取った。５回のブースターの後、ウエスタンブロッテン
グの決定により、ウサギ抗ｐ４５血清を得た。
【００３４】E.maximaのスポロゾイトから、全リボ核酸
（ＲＮＡ）を抽出し、セシウム トリフルオルアセテー
トの勾配遠心によって精製した。非ｍＲＮＡからｍＲＮ
Ａを分離するためにオリゴｄＴセルロース（poly〔Ａ〕
Quik,Stratagene)のカラムを製造業者の指示に従って使
用した。それから、poly（Ａ）+ ＲＮＡまたはｍＲＮＡ
を純粋エタノール中の酢酸ナトリウムを使用して一晩か
けてカラムから溶出した。
（ＲＮＡ）を抽出し、セシウム トリフルオルアセテー
トの勾配遠心によって精製した。非ｍＲＮＡからｍＲＮ
Ａを分離するためにオリゴｄＴセルロース（poly〔Ａ〕
Quik,Stratagene)のカラムを製造業者の指示に従って使
用した。それから、poly（Ａ）+ ＲＮＡまたはｍＲＮＡ
を純粋エタノール中の酢酸ナトリウムを使用して一晩か
けてカラムから溶出した。
【００３５】コピーのデオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）
を、ZAP-cDNA（登録商標）合成キット(Stratagene)を使
用して、ｍＲＮＡから合成した。オリゴｄＴ鋳型（Ｘｈ
ｏＩ制限部位を含む）および Moloney-Murine 白血病ウ
イルス逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡの第１鎖を合成
した。後にクローニングプロトコルで使用する制限酵素
による消化からｃＤＮＡを保護するために、ｃＤＮＡの
第１鎖のシトシン残基をメチル化した。ｃＤＮＡの第２
鎖をＲＮＡｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼＩを使用し
て合成し、続いてＴ４ＤＮＡポリメラーゼを使用して末
端修復を行った。ＥｃｏＲＩアダプターをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼによって、ｃＤＮＡの平滑末端に連結した。Ｘｈ
ｏＩによる消化によりＸｈｏＩ適合性３´末端およびＥ
ｃｏＲＩ適合性５´末端を有するｃＤＮＡが産生した。
を、ZAP-cDNA（登録商標）合成キット(Stratagene)を使
用して、ｍＲＮＡから合成した。オリゴｄＴ鋳型（Ｘｈ
ｏＩ制限部位を含む）および Moloney-Murine 白血病ウ
イルス逆転写酵素を使用して、ｃＤＮＡの第１鎖を合成
した。後にクローニングプロトコルで使用する制限酵素
による消化からｃＤＮＡを保護するために、ｃＤＮＡの
第１鎖のシトシン残基をメチル化した。ｃＤＮＡの第２
鎖をＲＮＡｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼＩを使用し
て合成し、続いてＴ４ＤＮＡポリメラーゼを使用して末
端修復を行った。ＥｃｏＲＩアダプターをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼによって、ｃＤＮＡの平滑末端に連結した。Ｘｈ
ｏＩによる消化によりＸｈｏＩ適合性３´末端およびＥ
ｃｏＲＩ適合性５´末端を有するｃＤＮＡが産生した。
【００３６】Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって、ＥｃｏＲＩ
／ＸｈｏＩで消化し脱リン酸化したUni-ZAP XRベクター
にｃＤＮＡを連結した。得られた第１次のライブラリー
(Emx8およびEmx 9)をE.coli SURE 細胞にプレートし、
増幅した。Emx 8 ライブラリーは65％の組換え体を与
え、Emx 9 ライブラリーは55％の組換え体を与えること
が分かった。
／ＸｈｏＩで消化し脱リン酸化したUni-ZAP XRベクター
にｃＤＮＡを連結した。得られた第１次のライブラリー
(Emx8およびEmx 9)をE.coli SURE 細胞にプレートし、
増幅した。Emx 8 ライブラリーは65％の組換え体を与
え、Emx 9 ライブラリーは55％の組換え体を与えること
が分かった。
【００３７】上述したように調製したウサギ抗ｐ４５血
清を使用して、Emx 8 およびEmx 9の２つのライブラリ
ーをスクリーニングした。陽性プラークをピックアップ
し、陽性プラークが純粋になるまで再スクリーニングし
た。
清を使用して、Emx 8 およびEmx 9の２つのライブラリ
ーをスクリーニングした。陽性プラークをピックアップ
し、陽性プラークが純粋になるまで再スクリーニングし
た。
【００３８】２つのライブラリー、Emx8とEmx9に於ける
クローンからのｃＤＮＡをプラスミドpUC19 にサブクロ
ーンし、制限エンドヌクレアーゼによる消化で分析し
た。あるいは、in vivo 切り出しを使用してラムダZap
からのプラスミドレスキューにｃＤＮＡを供し、次に制
限エンドヌクレアーゼによる消化で分析した。
クローンからのｃＤＮＡをプラスミドpUC19 にサブクロ
ーンし、制限エンドヌクレアーゼによる消化で分析し
た。あるいは、in vivo 切り出しを使用してラムダZap
からのプラスミドレスキューにｃＤＮＡを供し、次に制
限エンドヌクレアーゼによる消化で分析した。
【００３９】このようにして、数個の異なるクローンを
同定した。クローンのうち２つに対して選択した抗血清
は、２次元ＰＡＧＥによって分離された E.maxima スポ
ロゾイトのブロットに対する抗ｐ４５血清によって認識
された異なるスポットと交差反応した。それからこれら
のクローンをＤＮＡ配列分析のために選択した。ＤＮＡ
配列決定を、Bankier ら（Techniques in the Life Sci
ences (Biochemistry)85:techniques in Nucleic Acids
Biochemistry 1-34,1983)によって述べられたＭ１３／
ジデオキシヌクレオチド チェーン ターミネーション
法を使用して、ランダムサブクローンおよび配列決定に
よって行った。
同定した。クローンのうち２つに対して選択した抗血清
は、２次元ＰＡＧＥによって分離された E.maxima スポ
ロゾイトのブロットに対する抗ｐ４５血清によって認識
された異なるスポットと交差反応した。それからこれら
のクローンをＤＮＡ配列分析のために選択した。ＤＮＡ
配列決定を、Bankier ら（Techniques in the Life Sci
ences (Biochemistry)85:techniques in Nucleic Acids
Biochemistry 1-34,1983)によって述べられたＭ１３／
ジデオキシヌクレオチド チェーン ターミネーション
法を使用して、ランダムサブクローンおよび配列決定に
よって行った。
【００４０】本発明の核酸配列は特定の Eimeria株から
分離され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を含む
組換えＤＮＡ技術によって増幅されうるし、または当業
界で公知の技術により in vitro 化学合成されうる。
分離され、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を含む
組換えＤＮＡ技術によって増幅されうるし、または当業
界で公知の技術により in vitro 化学合成されうる。
【００４１】本発明の核酸配列は、自然界で連関、ある
いは連結していない種々の複製作用のあるＤＮＡ配列へ
連結することができ、その結果適当な宿主の形質転換の
ために使用できるいわゆる組換えベクターを産生でき
る。有用な組換えベクターは、好ましくはプラスミド、
バクテリオファージ、コスミド、ウイルス由来である。
いは連結していない種々の複製作用のあるＤＮＡ配列へ
連結することができ、その結果適当な宿主の形質転換の
ために使用できるいわゆる組換えベクターを産生でき
る。有用な組換えベクターは、好ましくはプラスミド、
バクテリオファージ、コスミド、ウイルス由来である。
【００４２】本発明の核酸配列をクローンするために使
用できる特定のベクターまたはクローニングベヒクルは
当業界で公知であり、とりわけ pBR322 、種々の pUC、
pGEM、ブルースクリプトプラスミドのようなプラスミ
ド、例えばラムダgt-Wes、Charon28およびM13 由来のフ
ァージのようなバクテリオファージ、あるいはSV40、ア
デノウイルス、ポリオーマウイルスのようなウイルスベ
クターを含む（Rodriquez,R.L.およびD.T.Denhardt編、
Vectors:A survey of molecular cloning vectors and
their uses, Butterworths, 1988; Lenstra,J.A.ら、Ar
ch .Virol.110,1-24,1990) 。本発明の組換えベクターの
構築のために使用される方法は当業者に公知であり、と
りわけ Maniatis,T.らの書物（Molecular Cloning A La
boratory Manual,第２版；Cold Spring Harbor Laborat
ory,1989) に記述されている。
用できる特定のベクターまたはクローニングベヒクルは
当業界で公知であり、とりわけ pBR322 、種々の pUC、
pGEM、ブルースクリプトプラスミドのようなプラスミ
ド、例えばラムダgt-Wes、Charon28およびM13 由来のフ
ァージのようなバクテリオファージ、あるいはSV40、ア
デノウイルス、ポリオーマウイルスのようなウイルスベ
クターを含む（Rodriquez,R.L.およびD.T.Denhardt編、
Vectors:A survey of molecular cloning vectors and
their uses, Butterworths, 1988; Lenstra,J.A.ら、Ar
ch .Virol.110,1-24,1990) 。本発明の組換えベクターの
構築のために使用される方法は当業者に公知であり、と
りわけ Maniatis,T.らの書物（Molecular Cloning A La
boratory Manual,第２版；Cold Spring Harbor Laborat
ory,1989) に記述されている。
【００４３】例えば本発明の核酸配列のクローニングベ
クターへの挿入は、遺伝子と所望のクローニングベヒク
ルの両者を同一の制限酵素で切断すると相補的ＤＮＡ末
端を生じるので容易に達成できる。
クターへの挿入は、遺伝子と所望のクローニングベヒク
ルの両者を同一の制限酵素で切断すると相補的ＤＮＡ末
端を生じるので容易に達成できる。
【００４４】あるいは１本鎖ＤＮＡを消化することによ
って、または適当なＤＮＡポリメラーゼで１本鎖末端を
充填することによって、平滑末端が産生されるように制
限部位を修飾することが必要であるかもしれない。続い
て、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのような酵素による平滑末端の
連結が行われうる。
って、または適当なＤＮＡポリメラーゼで１本鎖末端を
充填することによって、平滑末端が産生されるように制
限部位を修飾することが必要であるかもしれない。続い
て、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのような酵素による平滑末端の
連結が行われうる。
【００４５】所望ならば、いかなる制限部位をも、ＤＮ
Ａ末端にリンカーを連結することによって産生できる。
このようなリンカーは、制限部位配列をコードする特定
のオリゴヌクレオチド配列を含むことができる。制限酵
素によって切断されたベクターおよび核酸配列はまた、
ホモポリマーのテーリングによって修飾できる。
Ａ末端にリンカーを連結することによって産生できる。
このようなリンカーは、制限部位配列をコードする特定
のオリゴヌクレオチド配列を含むことができる。制限酵
素によって切断されたベクターおよび核酸配列はまた、
ホモポリマーのテーリングによって修飾できる。
【００４６】本明細書で使われる“形質転換(transform
ation)”は、使用する方法に関係なく例えば直接取り込
み(direct uptake) または形質導入(transduction)のよ
うに宿主細胞に異種の核酸配列を導入することを指す。
異種の核酸配列は、自律的な複製中で維持されることが
でき、または宿主ゲノムに組み込まれることができる。
所望ならば、組換えベクターは、指定の宿主と適合性の
ある適当な制御配列とともに提供される。これらの配列
は挿入された核酸配列の発現を制御できる。微生物に加
えて、多細胞生物由来の細胞培養物も宿主として使用で
きる。
ation)”は、使用する方法に関係なく例えば直接取り込
み(direct uptake) または形質導入(transduction)のよ
うに宿主細胞に異種の核酸配列を導入することを指す。
異種の核酸配列は、自律的な複製中で維持されることが
でき、または宿主ゲノムに組み込まれることができる。
所望ならば、組換えベクターは、指定の宿主と適合性の
ある適当な制御配列とともに提供される。これらの配列
は挿入された核酸配列の発現を制御できる。微生物に加
えて、多細胞生物由来の細胞培養物も宿主として使用で
きる。
【００４７】本発明の組換えベクターは好ましくは、所
望の形質転換体を選択するために使用できる１つ以上の
マーカー活性（例えば pBR322 に於けるアンピシリンお
よびテトラサイクリン耐性、 pUC8 に於けるアンピシリ
ン耐性およびβ−ガラクトシダーゼのα−ペプチド）を
含む。
望の形質転換体を選択するために使用できる１つ以上の
マーカー活性（例えば pBR322 に於けるアンピシリンお
よびテトラサイクリン耐性、 pUC8 に於けるアンピシリ
ン耐性およびβ−ガラクトシダーゼのα−ペプチド）を
含む。
【００４８】適切な宿主細胞は、ポリペプチドをコード
する核酸配列またはこのような核酸配列を含む組換えベ
クターによって形質転換できる微生物または細胞であ
る。宿主細胞は、所望ならば上記核酸配列でコードされ
る上記ポリペプチドを発現するために使用できる。宿主
細胞は、原核細胞起源（Escheric hia coli, Bacillus s
ubtilis, Pseudomonas speciesのような細菌）でもよい
し、真核細胞起源（例えば Saccharomyces cerevisiae
のような酵母、昆虫、植物、哺乳類の細胞のようなより
高等な真核細胞、このより高等な真核細胞はヒーラ細
胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO) を含む）で
もよい。昆虫細胞は、Spodoptera frugiperda のSf9 細
胞系列（Luckowら、Biotechnology 6,47-55,1988) を含
む。真核細胞クローニングシステムに於ける本発明の核
酸配列のクローニングおよび発現に関する情報はEsser,
K.らの書物（Plasmids of Eukaryotes, Springer-Verla
g, 1986)で見出だすことができる。
する核酸配列またはこのような核酸配列を含む組換えベ
クターによって形質転換できる微生物または細胞であ
る。宿主細胞は、所望ならば上記核酸配列でコードされ
る上記ポリペプチドを発現するために使用できる。宿主
細胞は、原核細胞起源（Escheric hia coli, Bacillus s
ubtilis, Pseudomonas speciesのような細菌）でもよい
し、真核細胞起源（例えば Saccharomyces cerevisiae
のような酵母、昆虫、植物、哺乳類の細胞のようなより
高等な真核細胞、このより高等な真核細胞はヒーラ細
胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO) を含む）で
もよい。昆虫細胞は、Spodoptera frugiperda のSf9 細
胞系列（Luckowら、Biotechnology 6,47-55,1988) を含
む。真核細胞クローニングシステムに於ける本発明の核
酸配列のクローニングおよび発現に関する情報はEsser,
K.らの書物（Plasmids of Eukaryotes, Springer-Verla
g, 1986)で見出だすことができる。
【００４９】一般的に、原核生物が、本発明に於ける有
用な組換えベクターの構築のために好ましい。E.coli K
12株が特に有用であり、そのうちDH5aまたはMC1061株が
とりわけそうである。
用な組換えベクターの構築のために好ましい。E.coli K
12株が特に有用であり、そのうちDH5aまたはMC1061株が
とりわけそうである。
【００５０】発現のために本発明の核酸配列は発現ベク
ターに導入される。即ち上記配列を機能するように発現
制御配列に結合する。このような制御配列には、プロモ
ーター、エンハンサー、オペレーター、インデューサ
ー、リボソーム結合部位等が含まれる。それ故、本発明
は、上記のように同定され発現制御配列に結合した、Ei
meria 蛋白質をコードする核酸配列を含む組換えベクタ
ーを提供する。その組換えベクターは、自身が含有する
ＤＮＡ配列を形質転換した宿主細胞中で発現できる。
ターに導入される。即ち上記配列を機能するように発現
制御配列に結合する。このような制御配列には、プロモ
ーター、エンハンサー、オペレーター、インデューサ
ー、リボソーム結合部位等が含まれる。それ故、本発明
は、上記のように同定され発現制御配列に結合した、Ei
meria 蛋白質をコードする核酸配列を含む組換えベクタ
ーを提供する。その組換えベクターは、自身が含有する
ＤＮＡ配列を形質転換した宿主細胞中で発現できる。
【００５１】形質転換した宿主が、Eimeria 蛋白質抗原
の少なくとも１つ以上の免疫的な決定基を有するポリペ
プチドを産生するかぎりは、クローニングベクターの選
択された部位に挿入された核酸配列は、所望のポリペプ
チドの実際の構造遺伝子の部分ではないヌクレオチドを
含むことができるし、あるいは所望の蛋白質の完全な構
造遺伝子の断片のみを含むことができるということを、
勿論理解すべきである。
の少なくとも１つ以上の免疫的な決定基を有するポリペ
プチドを産生するかぎりは、クローニングベクターの選
択された部位に挿入された核酸配列は、所望のポリペプ
チドの実際の構造遺伝子の部分ではないヌクレオチドを
含むことができるし、あるいは所望の蛋白質の完全な構
造遺伝子の断片のみを含むことができるということを、
勿論理解すべきである。
【００５２】宿主細胞が細菌であるときには、使用でき
る有用な発現制御配列にはＴｒｐプロモーター・オペレ
ーター（Goeddel ら、Nucl.Acids Res. 8,,4057,198
0）、ｌａｃプロモーター・オペレーター（Chang ら、N
ature,275,615,1978 ）、外膜蛋白質プロモーター（Nak
amura,K. とInouge,M.,EMBO J.,1,771-775,1982）、バ
クテリオファージ ラムダプロモーター・オペレーター
（Remaut,E. ら、Nucl.Acids Res.11,4677-4688,198
3）、α−アミラーゼ(B.subtilis)プロモーター・オペ
レーター、選択された宿主細胞と適合性のある終了配
列、他の発現エンハンスメント、制御配列が含まれる。
宿主細胞が酵母であるときには、例となる有用な発現制
御配列には例えばα−接合因子が含まれる。昆虫細胞の
ために、baculovirus のポリヘドリン(polyhedrin)また
はp10 のプロモーターが使用できる（Smith,G.E.ら、Mo
l.Cell.Bi ol.3,2156-65,1983）。宿主細胞が哺乳類起源
であるときには、例となる有用な発現制御配列にはSV-4
0 プロモーター（Berman,P.W. ら、Science,222,524-52
7,1983）、メタロチオネインプロモーター（Brinster,
R.L.,Nature,296,39-42,1982 ）、ヒートショックプロ
モーター（Voellmy ら、Proc.Natl. Acad.Sci. USA,82,4
949-53,1985 ）が含まれる。あるいは、Eimeria に存在
する発現制御配列も適用できる。遺伝子発現を最大にす
るためには、Roberts とLauer （Methods in Enzymolog
y,68,473,1979 ）をも参照せよ。
る有用な発現制御配列にはＴｒｐプロモーター・オペレ
ーター（Goeddel ら、Nucl.Acids Res. 8,,4057,198
0）、ｌａｃプロモーター・オペレーター（Chang ら、N
ature,275,615,1978 ）、外膜蛋白質プロモーター（Nak
amura,K. とInouge,M.,EMBO J.,1,771-775,1982）、バ
クテリオファージ ラムダプロモーター・オペレーター
（Remaut,E. ら、Nucl.Acids Res.11,4677-4688,198
3）、α−アミラーゼ(B.subtilis)プロモーター・オペ
レーター、選択された宿主細胞と適合性のある終了配
列、他の発現エンハンスメント、制御配列が含まれる。
宿主細胞が酵母であるときには、例となる有用な発現制
御配列には例えばα−接合因子が含まれる。昆虫細胞の
ために、baculovirus のポリヘドリン(polyhedrin)また
はp10 のプロモーターが使用できる（Smith,G.E.ら、Mo
l.Cell.Bi ol.3,2156-65,1983）。宿主細胞が哺乳類起源
であるときには、例となる有用な発現制御配列にはSV-4
0 プロモーター（Berman,P.W. ら、Science,222,524-52
7,1983）、メタロチオネインプロモーター（Brinster,
R.L.,Nature,296,39-42,1982 ）、ヒートショックプロ
モーター（Voellmy ら、Proc.Natl. Acad.Sci. USA,82,4
949-53,1985 ）が含まれる。あるいは、Eimeria に存在
する発現制御配列も適用できる。遺伝子発現を最大にす
るためには、Roberts とLauer （Methods in Enzymolog
y,68,473,1979 ）をも参照せよ。
【００５３】それ故、核酸配列の発現によってEimeria
蛋白質を産生できる、上述した核酸配列または組換え核
酸分子または組換えベクターを含む宿主細胞をまた、本
発明は含む。
蛋白質を産生できる、上述した核酸配列または組換え核
酸分子または組換えベクターを含む宿主細胞をまた、本
発明は含む。
【００５４】Eimeria 感染に対する家禽の免疫化は、い
わゆるサブユニットワクチンとして、本発明の蛋白質を
トリに投与することで達成できる。本発明のサブユニッ
トワクチンは、純粋の形態で、所望により薬物的に許容
できる担体の存在下で蛋白質を含むことができる。所望
により、蛋白質を関連のない蛋白質に共有結合で結合さ
せることができる。それは融合蛋白質の精製という点で
長所を持つ。例としてはβ−ガラクトシダーゼ、プロテ
インＡ、プロキモシン、血液凝固因子Ｘａなどが挙げら
れる。
わゆるサブユニットワクチンとして、本発明の蛋白質を
トリに投与することで達成できる。本発明のサブユニッ
トワクチンは、純粋の形態で、所望により薬物的に許容
できる担体の存在下で蛋白質を含むことができる。所望
により、蛋白質を関連のない蛋白質に共有結合で結合さ
せることができる。それは融合蛋白質の精製という点で
長所を持つ。例としてはβ−ガラクトシダーゼ、プロテ
インＡ、プロキモシン、血液凝固因子Ｘａなどが挙げら
れる。
【００５５】これらの蛋白質自体を使用して防御免疫を
上げる能力は、ある場合には本質的に低いかも知れな
い。免疫原性を上げるためには、小断片を担体分子に結
合させるのが好ましい。この目的のための適切な担体は
天然のポリマー（key hole limpet のヘモシアニン、ア
ルブミン、毒素のような蛋白質）、ポリアミノ酸（ポリ
リシン、ポリアラニン）のような合成ポリマーなどの高
分子、またはサポニンのような両親媒性化合物のミセル
である。あるいはこれらの断片はそのポリマー、好まし
くは線状ポリマーとして提供されることができる。
上げる能力は、ある場合には本質的に低いかも知れな
い。免疫原性を上げるためには、小断片を担体分子に結
合させるのが好ましい。この目的のための適切な担体は
天然のポリマー（key hole limpet のヘモシアニン、ア
ルブミン、毒素のような蛋白質）、ポリアミノ酸（ポリ
リシン、ポリアラニン）のような合成ポリマーなどの高
分子、またはサポニンのような両親媒性化合物のミセル
である。あるいはこれらの断片はそのポリマー、好まし
くは線状ポリマーとして提供されることができる。
【００５６】必要があれば、ワクチンで使用される本発
明の蛋白質はin vitroまたはin vivo で修飾できる。例
えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン
酸化が挙げられる。
明の蛋白質はin vitroまたはin vivo で修飾できる。例
えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン
酸化が挙げられる。
【００５７】サブユニットワクチンの代替は生ワクチン
である。組換え微生物がいぜん複製できるように、本発
明の核酸配列が組換えＤＮＡ技術によって微生物（例え
ば細菌またはウイルス）に導入され、挿入された核酸配
列によってコードされるポリペプチドを発現し、感染し
た宿主のトリに免疫反応を誘起する。
である。組換え微生物がいぜん複製できるように、本発
明の核酸配列が組換えＤＮＡ技術によって微生物（例え
ば細菌またはウイルス）に導入され、挿入された核酸配
列によってコードされるポリペプチドを発現し、感染し
た宿主のトリに免疫反応を誘起する。
【００５８】本発明の好ましい具体例は、組換えベクタ
ーウイルスに感染した宿主細胞または宿主トリでＤＮＡ
配列を発現できる、上述した異種核酸配列を含む組換え
ベクターウイルスである。“異種”という用語は本発明
の核酸配列が通常は天然にはベクターウイルスに存在し
ないことを指す。
ーウイルスに感染した宿主細胞または宿主トリでＤＮＡ
配列を発現できる、上述した異種核酸配列を含む組換え
ベクターウイルスである。“異種”という用語は本発明
の核酸配列が通常は天然にはベクターウイルスに存在し
ないことを指す。
【００５９】さらに、本発明は、核酸配列の発現によっ
て、Eimeria 蛋白質を産生できる、組換えベクターウイ
ルスに感染した宿主細胞または細胞培養物をも含む。
て、Eimeria 蛋白質を産生できる、組換えベクターウイ
ルスに感染した宿主細胞または細胞培養物をも含む。
【００６０】例えば、in vivo 相同的組換えの公知の技
術は、本発明の異種核酸配列をベクターウイルスのゲノ
ムに導入するために使用できる。
術は、本発明の異種核酸配列をベクターウイルスのゲノ
ムに導入するために使用できる。
【００６１】最初に、ベクターゲノムの挿入領域、即ち
感染または複製に必要な機能などのベクターの必須の機
能を破壊することなしに異種の配列の挿入のために使用
できる領域に対応するＤＮＡ断片が、標準ｒｅｃＤＮＡ
技術に従ってクローニングベクターに挿入される。挿入
領域は多数の微生物で報告されている（例えば、EP 80,
806, EP 110,385, EP 83,286, EP 314,569, WO 88/0202
2, WO 88/07088,US 4,769,330, US 4,722,848 ）。
感染または複製に必要な機能などのベクターの必須の機
能を破壊することなしに異種の配列の挿入のために使用
できる領域に対応するＤＮＡ断片が、標準ｒｅｃＤＮＡ
技術に従ってクローニングベクターに挿入される。挿入
領域は多数の微生物で報告されている（例えば、EP 80,
806, EP 110,385, EP 83,286, EP 314,569, WO 88/0202
2, WO 88/07088,US 4,769,330, US 4,722,848 ）。
【００６２】第２に、所望により、第１のステップから
得られた組換えベクター分子に存在する挿入領域に欠損
を導入できる。第１のステップから得られた組換えベク
ター分子の、例えば適当なエキソヌクレアーゼIII 消化
または制限酵素処理によって、これを達成できる。
得られた組換えベクター分子に存在する挿入領域に欠損
を導入できる。第１のステップから得られた組換えベク
ター分子の、例えば適当なエキソヌクレアーゼIII 消化
または制限酵素処理によって、これを達成できる。
【００６３】第３に、異種核酸配列が、第１のステップ
の組換えベクターに存在する挿入領域または組換えベク
ターから欠損したＤＮＡの場所に挿入される。挿入領域
ＤＮＡ配列は、ベクターゲノムとの相同的組換えがおこ
るように適切な長さであるべきである。その後、適当な
細胞を、適当なベクターＤＮＡ配列に隣接した挿入物を
含む組換えベクターの存在下、野生型ベクターウイルス
で感染でき、またはベクターゲノムＤＮＡで形質転換す
ることができる。その結果、組換えベクターとベクター
ゲノムに於ける対応領域の間で組換えが起こる。組換え
ベクターの子孫が細胞培養で産生されることができ、例
えば遺伝的に、または表現形質的に、例えばハイブリダ
イゼーションによって、異種核酸配列と共に組み込まれ
た遺伝子にコードされた酵素活性を検出することによっ
て、または組換えベクターによって発現された抗原性の
ある異種ポリペプチドを免疫的に検出することによっ
て、選択できる。
の組換えベクターに存在する挿入領域または組換えベク
ターから欠損したＤＮＡの場所に挿入される。挿入領域
ＤＮＡ配列は、ベクターゲノムとの相同的組換えがおこ
るように適切な長さであるべきである。その後、適当な
細胞を、適当なベクターＤＮＡ配列に隣接した挿入物を
含む組換えベクターの存在下、野生型ベクターウイルス
で感染でき、またはベクターゲノムＤＮＡで形質転換す
ることができる。その結果、組換えベクターとベクター
ゲノムに於ける対応領域の間で組換えが起こる。組換え
ベクターの子孫が細胞培養で産生されることができ、例
えば遺伝的に、または表現形質的に、例えばハイブリダ
イゼーションによって、異種核酸配列と共に組み込まれ
た遺伝子にコードされた酵素活性を検出することによっ
て、または組換えベクターによって発現された抗原性の
ある異種ポリペプチドを免疫的に検出することによっ
て、選択できる。
【００６４】次に、この組換え微生物を、免疫のために
家禽に投与できる。その後、暫くこの組換え微生物は、
接種動物の体内で生きて、または複製さえし、本発明の
挿入核酸配列によってコードされたポリペプチドをin v
ivo で発現し、接種された動物の免疫システムの刺激を
起こす。本発明の核酸配列の挿入のための適切なベクタ
ーは、例えばワクシニアウイルス（EP 110,385, EP 83,
286, US 4,769,330, US 4,722,848 ）または家禽ポック
スウイルス（WO 88/02022)などのポックスウイルス、HV
T(WO 88/07088)などのヘルペスウイルス、マレック病ウ
イルス、アデノウイルスまたはインフルエンザウイルス
のようなウイルス、またはE.coliまたは特定のSalmonel
la種などの細菌由来であることができる。このタイプの
組換え微生物によって、宿主動物の体内で合成されたポ
リペプチドは表面抗原として晒されうる。それ故、生物
によって認識される、例えばE.coliのOMP 蛋白質あるい
は線毛蛋白質、またはシグナルおよびアンカー配列の合
成品とポリペプチドの融合が考えられる。Eimeria ポリ
ペプチドが、それを全体の一部として所望ならば、免疫
されるべき動物の体内で放出されることも可能である。
これらの場合の全てに於いて、種々の病原体および／ま
たは一定の病原体の種々の抗原に対して、防御可能とす
る１つ以上の免疫原産物を発現させることも可能であ
る。
家禽に投与できる。その後、暫くこの組換え微生物は、
接種動物の体内で生きて、または複製さえし、本発明の
挿入核酸配列によってコードされたポリペプチドをin v
ivo で発現し、接種された動物の免疫システムの刺激を
起こす。本発明の核酸配列の挿入のための適切なベクタ
ーは、例えばワクシニアウイルス（EP 110,385, EP 83,
286, US 4,769,330, US 4,722,848 ）または家禽ポック
スウイルス（WO 88/02022)などのポックスウイルス、HV
T(WO 88/07088)などのヘルペスウイルス、マレック病ウ
イルス、アデノウイルスまたはインフルエンザウイルス
のようなウイルス、またはE.coliまたは特定のSalmonel
la種などの細菌由来であることができる。このタイプの
組換え微生物によって、宿主動物の体内で合成されたポ
リペプチドは表面抗原として晒されうる。それ故、生物
によって認識される、例えばE.coliのOMP 蛋白質あるい
は線毛蛋白質、またはシグナルおよびアンカー配列の合
成品とポリペプチドの融合が考えられる。Eimeria ポリ
ペプチドが、それを全体の一部として所望ならば、免疫
されるべき動物の体内で放出されることも可能である。
これらの場合の全てに於いて、種々の病原体および／ま
たは一定の病原体の種々の抗原に対して、防御可能とす
る１つ以上の免疫原産物を発現させることも可能であ
る。
【００６５】本発明のベクターワクチンは、本発明の核
酸配列を含む組換えベクターで感染された組換え細菌ま
たは宿主細胞を培養することで、調製されることができ
る。その後、組換え細菌またはベクター含有細胞および
／または細胞中で生育した組換えベクターウイルスを、
所望により純粋の形態で集められることができ、所望に
より凍結乾燥形態でワクチンに形成されることもでき
る。
酸配列を含む組換えベクターで感染された組換え細菌ま
たは宿主細胞を培養することで、調製されることができ
る。その後、組換え細菌またはベクター含有細胞および
／または細胞中で生育した組換えベクターウイルスを、
所望により純粋の形態で集められることができ、所望に
より凍結乾燥形態でワクチンに形成されることもでき
る。
【００６６】本発明で記述されたＤＮＡをToxoplasma,E
imeria spp.,Leishmaniawithなどの他の原生動物の寄生
虫にトランスフェクトすることにより、ベクターワクチ
ンをまた、調製することができる。
imeria spp.,Leishmaniawithなどの他の原生動物の寄生
虫にトランスフェクトすることにより、ベクターワクチ
ンをまた、調製することができる。
【００６７】しかし、裸のＤＮＡもまた、それがプラス
ミドに存在しているか、またはSV40ウイルスのプロモー
ター配列などの適切な真核生物のプロモーター配列との
組み合わせで存在しているならば、ワクチンとして使用
されることができる。
ミドに存在しているか、またはSV40ウイルスのプロモー
ター配列などの適切な真核生物のプロモーター配列との
組み合わせで存在しているならば、ワクチンとして使用
されることができる。
【００６８】本発明の組換えベクターで形質転換された
宿主細胞をまた、核酸配列でコードされたポリペプチド
の発現に好ましい条件下で培養できる。ワクチンは、粗
培養物、宿主細胞溶解物、または宿主細胞抽出物のサン
プルを使用して調製できる。別の具体例では、本発明の
ポリペプチドが、その意図した使用に応じて、より精製
した形態でワクチンに形成される。生産されたポリペプ
チドを精製するために、本発明の組換えベクターで形質
転換した宿主細胞は適当な容量で培養され、産生された
ポリペプチドをこのような細胞から、もし蛋白質が分泌
されるのならば培地から単離される。培地に分泌された
ポリペプチドは標準的技術で単離精製されることができ
る。標準的技術とは例えば、塩分画、遠心、限外濾過、
クロマトグラフィー、ゲル濾過、免疫アフィニティーク
ロマトグラフィーである。一方、細胞内ポリペプチド
は、初めに細胞を集め、例えば超音波またはフレンチプ
レスなどの他の機械的破砕手段によって細胞を破砕し、
続いて他の細胞内成分からポリペプチドを分離し、ポリ
ペプチドをワクチンに形成することができる。細胞破砕
はまた、化学的手段（例えばEDTAまたはTriton X114 な
どの界面活性剤）またはリゾチーム消化などの酵素的手
段によって達成されることができる。
宿主細胞をまた、核酸配列でコードされたポリペプチド
の発現に好ましい条件下で培養できる。ワクチンは、粗
培養物、宿主細胞溶解物、または宿主細胞抽出物のサン
プルを使用して調製できる。別の具体例では、本発明の
ポリペプチドが、その意図した使用に応じて、より精製
した形態でワクチンに形成される。生産されたポリペプ
チドを精製するために、本発明の組換えベクターで形質
転換した宿主細胞は適当な容量で培養され、産生された
ポリペプチドをこのような細胞から、もし蛋白質が分泌
されるのならば培地から単離される。培地に分泌された
ポリペプチドは標準的技術で単離精製されることができ
る。標準的技術とは例えば、塩分画、遠心、限外濾過、
クロマトグラフィー、ゲル濾過、免疫アフィニティーク
ロマトグラフィーである。一方、細胞内ポリペプチド
は、初めに細胞を集め、例えば超音波またはフレンチプ
レスなどの他の機械的破砕手段によって細胞を破砕し、
続いて他の細胞内成分からポリペプチドを分離し、ポリ
ペプチドをワクチンに形成することができる。細胞破砕
はまた、化学的手段（例えばEDTAまたはTriton X114 な
どの界面活性剤）またはリゾチーム消化などの酵素的手
段によって達成されることができる。
【００６９】本発明のポリペプチドに対する抗体または
抗血清は、受動免疫療法、診断免疫アッセイおよび抗イ
デオタイプ抗体の産生に於いて強力に使用できる。
抗血清は、受動免疫療法、診断免疫アッセイおよび抗イ
デオタイプ抗体の産生に於いて強力に使用できる。
【００７０】上述のように特徴づけられたEimeria 蛋白
質を、ポリクローナル、単一特異性(monospecific)およ
びモノクローナルの抗体を産生させるために使用でき
る。もしポリクローナル抗体を望むのならば、ポリクロ
ーナル血清を産生させる技術は当業界で公知である（例
えば、Mayer とWalter編、Immunochemical Methods inC
ell and Molecular Biology, Academic Press, London,
1987 ）。免疫原に対する単一特異性抗体は、Hallらの
方法（Na ture,311,379-387,1984 ）の変法によって、多
重特異性(polispecific)抗血清からアフィニティ精製さ
れることができる。本明細書で使用する単一特異性抗体
とは、単一抗体種または対象の抗原に対する同種の結合
特性を有する多重抗体種として定義される。本明細書で
使用する同種の結合とは、特定の抗原またはエピトープ
に結合する抗体種の能力を指す。
質を、ポリクローナル、単一特異性(monospecific)およ
びモノクローナルの抗体を産生させるために使用でき
る。もしポリクローナル抗体を望むのならば、ポリクロ
ーナル血清を産生させる技術は当業界で公知である（例
えば、Mayer とWalter編、Immunochemical Methods inC
ell and Molecular Biology, Academic Press, London,
1987 ）。免疫原に対する単一特異性抗体は、Hallらの
方法（Na ture,311,379-387,1984 ）の変法によって、多
重特異性(polispecific)抗血清からアフィニティ精製さ
れることができる。本明細書で使用する単一特異性抗体
とは、単一抗体種または対象の抗原に対する同種の結合
特性を有する多重抗体種として定義される。本明細書で
使用する同種の結合とは、特定の抗原またはエピトープ
に結合する抗体種の能力を指す。
【００７１】本発明のEimeria 蛋白質に対して活性のあ
るモノクローナル抗体は、当業界で公知の技術によって
同種のマウスを免疫することによって調製されることが
できる（KohlerとMilstein,Nature,256,495-497,1975)
。ハイブリドーマ細胞は、Dulbecco修飾Eagle 培地な
どの適当な細胞培養培地に於けるヒポキサンチン、チミ
ジンおよびアミノプテリン中での培養によって選択され
る。抗体産生ハイブリドーマは、好ましくはMacPherson
のソフトアガー技術（Soft Agar Techniques,Tissue Cu
lture Methods and Applications, Kruse and Paterson
編、AcademicPress,276,1973 ）を使用してクローンさ
れる。個々のコロニーを、適当な培養培地に於いて培養
のために培養プレートの個々のウエルに移転する。抗体
産生細胞は適当な免疫原でのスクリーニングによって同
定される。免疫原に陽性のハイブリドーマ細胞は、当業
界で公知の技術によって維持される。特異的モノクロー
ナル抗体は、in vitroでハイブリドーマを培養すること
によって、または当業界で公知の方法によってハイブリ
ドーマ注入の後のマウスの腹水を調製することによって
産生される。
るモノクローナル抗体は、当業界で公知の技術によって
同種のマウスを免疫することによって調製されることが
できる（KohlerとMilstein,Nature,256,495-497,1975)
。ハイブリドーマ細胞は、Dulbecco修飾Eagle 培地な
どの適当な細胞培養培地に於けるヒポキサンチン、チミ
ジンおよびアミノプテリン中での培養によって選択され
る。抗体産生ハイブリドーマは、好ましくはMacPherson
のソフトアガー技術（Soft Agar Techniques,Tissue Cu
lture Methods and Applications, Kruse and Paterson
編、AcademicPress,276,1973 ）を使用してクローンさ
れる。個々のコロニーを、適当な培養培地に於いて培養
のために培養プレートの個々のウエルに移転する。抗体
産生細胞は適当な免疫原でのスクリーニングによって同
定される。免疫原に陽性のハイブリドーマ細胞は、当業
界で公知の技術によって維持される。特異的モノクロー
ナル抗体は、in vitroでハイブリドーマを培養すること
によって、または当業界で公知の方法によってハイブリ
ドーマ注入の後のマウスの腹水を調製することによって
産生される。
【００７２】抗イデオタイプ抗体は、防御が望まれる、
そしてワクチンに於いて免疫原として使用できる病原体
の抗原の“インターナルイメージ”を担う免疫グロブリ
ンである（Dreesmanら、J.Infect. Disease,151,761,198
5 ）。抗イデオタイプ抗体の産生を増加させる技術は当
業界で公知である（MacNamara ら、Science,226,1325,1
984 ）。
そしてワクチンに於いて免疫原として使用できる病原体
の抗原の“インターナルイメージ”を担う免疫グロブリ
ンである（Dreesmanら、J.Infect. Disease,151,761,198
5 ）。抗イデオタイプ抗体の産生を増加させる技術は当
業界で公知である（MacNamara ら、Science,226,1325,1
984 ）。
【００７３】本発明のワクチンは、慣用の能動免疫計画
に従って投与されることができる。投与形態と適合性の
ある方法での単一または複数の投与、および予防に効果
的な量、即ち毒性のあるEimeria 寄生虫による攻撃に対
して家禽に於いて免疫を誘起する抗原を発現できる免疫
抗原または組換え微生物の量で投与されることができ
る。免疫化は、非ワクチン接種群に比較してワクチン接
種後、ニワトリの集団での防御のかなりのレベルの誘導
として定義される。
に従って投与されることができる。投与形態と適合性の
ある方法での単一または複数の投与、および予防に効果
的な量、即ち毒性のあるEimeria 寄生虫による攻撃に対
して家禽に於いて免疫を誘起する抗原を発現できる免疫
抗原または組換え微生物の量で投与されることができ
る。免疫化は、非ワクチン接種群に比較してワクチン接
種後、ニワトリの集団での防御のかなりのレベルの誘導
として定義される。
【００７４】生ウイルスベクターワクチンのために、ニ
ワトリ１羽当り105 −108 PFU の投与量であることがで
きる。本発明の典型的なサブユニットワクチンは、本発
明の蛋白質を 1μg-1mg を含む。このようなワクチン
は、皮膚内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹膜内注射、
静脈内注射、経口投与、経鼻投与で投与されることがで
きる。
ワトリ１羽当り105 −108 PFU の投与量であることがで
きる。本発明の典型的なサブユニットワクチンは、本発
明の蛋白質を 1μg-1mg を含む。このようなワクチン
は、皮膚内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹膜内注射、
静脈内注射、経口投与、経鼻投与で投与されることがで
きる。
【００７５】更に、ワクチンはまた、活性および／また
は有効期間を増加させるために、水溶性媒質、またはし
ばしば他の成分と混合した水を含む懸濁液を含有しても
良い。これらの成分は塩、pH緩衝液、安定剤（スキムミ
ルクまたはカゼイン加水分解物など）、乳化剤、免疫反
応を上げるアジュバント（例えば、油、ムラミルジペプ
チド、水酸化アルミニウム、サポニン、ポリアニオン、
両親媒性物質）および保存剤でありうる。
は有効期間を増加させるために、水溶性媒質、またはし
ばしば他の成分と混合した水を含む懸濁液を含有しても
良い。これらの成分は塩、pH緩衝液、安定剤（スキムミ
ルクまたはカゼイン加水分解物など）、乳化剤、免疫反
応を上げるアジュバント（例えば、油、ムラミルジペプ
チド、水酸化アルミニウム、サポニン、ポリアニオン、
両親媒性物質）および保存剤でありうる。
【００７６】本発明のワクチンは、多価ワクチンを産生
するために、家禽の他の病原体に関連する免疫原または
これらの免疫原をコードする核酸配列をまた含有しても
よい。これらはマレック病ウイルス(MDV) 、ニューカッ
スル病ウイルス(NDV) 、感染性気管支炎ウイルス(IBV)
、ニワトリ貧血エージェント(Chicken Anemia Agent)
(CAA) 、レオウイルス、トリレトロウイルス、トリアデ
ノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、E.co l
i、他のEimeria 種などである。
するために、家禽の他の病原体に関連する免疫原または
これらの免疫原をコードする核酸配列をまた含有しても
よい。これらはマレック病ウイルス(MDV) 、ニューカッ
スル病ウイルス(NDV) 、感染性気管支炎ウイルス(IBV)
、ニワトリ貧血エージェント(Chicken Anemia Agent)
(CAA) 、レオウイルス、トリレトロウイルス、トリアデ
ノウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス、E.co l
i、他のEimeria 種などである。
【００７７】本発明はまた、本発明の蛋白質を含有する
免疫化学試薬に関する。“免疫化学試薬”という用語
は、本発明の蛋白質が適当な支持体に結合しているか、
または標識物質で標識されていることを意味する。
免疫化学試薬に関する。“免疫化学試薬”という用語
は、本発明の蛋白質が適当な支持体に結合しているか、
または標識物質で標識されていることを意味する。
【００７８】使用できる支持体は、例えばミクロテスト
ウエルまたはキュベットの内部壁、チューブまたはキャ
ピラリー、メンブラン、フィルター、試験紙または粒子
の表面（例えばラテックス粒子、赤血球、ゾル粒子とし
ての色素ゾル、金属ゾルもしくは金属化合物などの粒子
の表面）である。
ウエルまたはキュベットの内部壁、チューブまたはキャ
ピラリー、メンブラン、フィルター、試験紙または粒子
の表面（例えばラテックス粒子、赤血球、ゾル粒子とし
ての色素ゾル、金属ゾルもしくは金属化合物などの粒子
の表面）である。
【００７９】使用できる標識物質は、とりわけ放射性活
性アイソトープ、蛍光化合物、酵素、ゾル粒子としての
色素ゾル、金属ゾルもしくは金属化合物である。
性アイソトープ、蛍光化合物、酵素、ゾル粒子としての
色素ゾル、金属ゾルもしくは金属化合物である。
【００８０】本発明の核酸配列は、いかなる種類の組織
でもEimeria 関連核酸の検出のためのハイブリダイゼー
ション実験の特異的プローブを設計するのにも使用でき
る。本発明はまた、Eimeria 感染の診断のために有用な
核酸配列を含有するテストキットを含む。
でもEimeria 関連核酸の検出のためのハイブリダイゼー
ション実験の特異的プローブを設計するのにも使用でき
る。本発明はまた、Eimeria 感染の診断のために有用な
核酸配列を含有するテストキットを含む。
【００８１】本発明はまた、免疫アッセイで使用され
る、本発明の少なくとも１つの免疫化学試薬を含むテス
トキットに関する。このテストキットを使用して行われ
る免疫化学反応は好ましくは、サンドイッチ反応、凝集
反応、競合反応または阻害反応である。
る、本発明の少なくとも１つの免疫化学試薬を含むテス
トキットに関する。このテストキットを使用して行われ
る免疫化学反応は好ましくは、サンドイッチ反応、凝集
反応、競合反応または阻害反応である。
【００８２】サンドイッチ反応を行うために、テストキ
ットは、例えば固層（例えばミクロテストウエルの内部
壁）に結合した本発明のポリペプチド、および本発明の
標識ポリペプチドあるいは標識抗−抗体を含有する。
ットは、例えば固層（例えばミクロテストウエルの内部
壁）に結合した本発明のポリペプチド、および本発明の
標識ポリペプチドあるいは標識抗−抗体を含有する。
【００８３】本発明を以下の実施例で説明する。
【００８４】
【実施例】実施例１ Ｅ． ｍａｘｉｍａ胞子小体（スポロゾイト）の抗原の
調製 １．ａ．ｉ． 寄生虫の調製Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ Ｈｏｕｇｈｔｏｎ株
（Ｅ． ｍａｘｉｍａＨ）寄生虫をＬｉｇｈｔ Ｓｕｓ
ｓｅｘニワトリで、Ｌｏｎｇ等が述べている（Ｆｏｌｉ
ｏ Ｖｅｔ． Ｌａｔ． ６， ｐｐ．２０１−２０
７， １９７６）ように継代させた。オーシストを糞か
ら単離し、２％二クロム酸カリウム中で２９℃で７２時
間胞子形成させ、１０％次亜塩素酸ナトリウムでの洗浄
によって表面を滅菌し、飽和塩化ナトリウムでの浮選に
よって精製した。胞子形成したオーシストをｐＨ７．６
のリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中に懸濁させ、振動によ
って破壊した。スポロシストを、０．５％ ｗ／ｖのブ
タ胆汁（Ｄｉｆｃｏ）及び０．２５％ ｗ／ｖのトリプ
シン（Ｄｉｆｃｏ； １：２５０）を含有するｐＨ７．
６のＰＢＳ中に懸濁させ、４１℃で３０分間インキュベ
ートした。放出された胞子小体をｐＨ８．０のＰＢＳで
洗浄し、カラムＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）上でＳｃ
ｈｍａｔｚ等が述べている（Ｊ． Ｐｒｏｔｏｚｏｏ
ｌ． ３１， ｐｐ．１８１−１８３， １９８４）よ
うに精製し、ペレットとしてエッペンドルフ管内に−７
０℃で貯蔵した。
調製 １．ａ．ｉ． 寄生虫の調製Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ Ｈｏｕｇｈｔｏｎ株
（Ｅ． ｍａｘｉｍａＨ）寄生虫をＬｉｇｈｔ Ｓｕｓ
ｓｅｘニワトリで、Ｌｏｎｇ等が述べている（Ｆｏｌｉ
ｏ Ｖｅｔ． Ｌａｔ． ６， ｐｐ．２０１−２０
７， １９７６）ように継代させた。オーシストを糞か
ら単離し、２％二クロム酸カリウム中で２９℃で７２時
間胞子形成させ、１０％次亜塩素酸ナトリウムでの洗浄
によって表面を滅菌し、飽和塩化ナトリウムでの浮選に
よって精製した。胞子形成したオーシストをｐＨ７．６
のリン酸緩衝食塩液（ＰＢＳ）中に懸濁させ、振動によ
って破壊した。スポロシストを、０．５％ ｗ／ｖのブ
タ胆汁（Ｄｉｆｃｏ）及び０．２５％ ｗ／ｖのトリプ
シン（Ｄｉｆｃｏ； １：２５０）を含有するｐＨ７．
６のＰＢＳ中に懸濁させ、４１℃で３０分間インキュベ
ートした。放出された胞子小体をｐＨ８．０のＰＢＳで
洗浄し、カラムＤＥ−５２（Ｗｈａｔｍａｎ）上でＳｃ
ｈｍａｔｚ等が述べている（Ｊ． Ｐｒｏｔｏｚｏｏ
ｌ． ３１， ｐｐ．１８１−１８３， １９８４）よ
うに精製し、ペレットとしてエッペンドルフ管内に−７
０℃で貯蔵した。
【００８５】１，ａ．ｉｉ． 抗原の調製 胞子小体ペレット（５×１０7 個）を、１００ｍｌの試
料緩衝液（ｐＨ６．８の５０ｍＭトリス−Ｃｌ、２％
ＳＤＳ、１０％グリセロール、１００ｍＭ ＤＴＴ及び
１０ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）中で１０分間
煮沸することによって可溶化し、次いで不連続ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲルに載置した。ゲルを電気泳動に
掛け、ポリペプチドをＴｏｗｂｉｎ及びＧｏｒｄｏｎの
方法（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ７
２， ｐｐ．３１３−３４０， １９８４）によってニ
トロセルロース（ＮＣ）紙に移転した。移転後、０．３
％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するｐＨ７．６のＰＢＳで
ＮＣ紙を濯ぎ、ポリペプチドを、コロイド金（Ａｕｒｏ
ｄｙｅ； Ｃａｍｂｉｏ， Ｅｎｇｌａｎｄ）で製造元
の指示どおりに染色することによって可視化した。
料緩衝液（ｐＨ６．８の５０ｍＭトリス−Ｃｌ、２％
ＳＤＳ、１０％グリセロール、１００ｍＭ ＤＴＴ及び
１０ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）中で１０分間
煮沸することによって可溶化し、次いで不連続ＳＤＳ−
ポリアクリルアミドゲルに載置した。ゲルを電気泳動に
掛け、ポリペプチドをＴｏｗｂｉｎ及びＧｏｒｄｏｎの
方法（Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ７
２， ｐｐ．３１３−３４０， １９８４）によってニ
トロセルロース（ＮＣ）紙に移転した。移転後、０．３
％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するｐＨ７．６のＰＢＳで
ＮＣ紙を濯ぎ、ポリペプチドを、コロイド金（Ａｕｒｏ
ｄｙｅ； Ｃａｍｂｉｏ， Ｅｎｇｌａｎｄ）で製造元
の指示どおりに染色することによって可視化した。
【００８６】ＮＣ紙を、それぞれ限られた範囲内の分子
量のＥｉｍｅｒｉａポリペプチドを支持するストリップ
に切断した。各ストリップを小片に刻み、これらの小片
をラベル付きのガラスバイアルに移した。各バイアルに
４００ｍｌのＤＭＳＯを添加し、混合物を６０分間放置
して可溶化及び滅菌を確実とした。激しく攪拌しながら
等量の炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（５０ｍＭ； ｐＨ９．
６）を滴下し加えることによってＮＣ粒子を沈澱させ
た。試料を１．５ｍｌ容のマイクロ遠心管に移し、１
０，０００×ｇで５分間遠心した。ＮＣ粒子をＲＰＭＩ
１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ Ｂｉｏｃｕｌｔ， Ｐａ
ｉｓｌｅｙ， Ｓｃｏｔｌａｎｄ）で３回洗浄し、その
後１ｍｌの前記培地中に懸濁させ、２００ｍｌアリコー
トに分割し、−７０℃で冷凍貯蔵した。
量のＥｉｍｅｒｉａポリペプチドを支持するストリップ
に切断した。各ストリップを小片に刻み、これらの小片
をラベル付きのガラスバイアルに移した。各バイアルに
４００ｍｌのＤＭＳＯを添加し、混合物を６０分間放置
して可溶化及び滅菌を確実とした。激しく攪拌しながら
等量の炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（５０ｍＭ； ｐＨ９．
６）を滴下し加えることによってＮＣ粒子を沈澱させ
た。試料を１．５ｍｌ容のマイクロ遠心管に移し、１
０，０００×ｇで５分間遠心した。ＮＣ粒子をＲＰＭＩ
１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ Ｂｉｏｃｕｌｔ， Ｐａ
ｉｓｌｅｙ， Ｓｃｏｔｌａｎｄ）で３回洗浄し、その
後１ｍｌの前記培地中に懸濁させ、２００ｍｌアリコー
トに分割し、−７０℃で冷凍貯蔵した。
【００８７】実施例２ リンパ刺激性抗原の同定 ２．ａ． 方法 ２．ａ．ｉ． 動物の免疫感作 一次感染のため、複数グループのＲｅａｓｅｈｅａｔｈ
−Ｃニワトリ（４週齢； １グループ当たり１０羽）に
Ｅ． ｍａｘｉｍａ Ｈの胞子形成オーシスト４０００
個を経口投与した。二次感染のためには同じ鳥に、Ｅ．
ｍａｘｉｍａＨの胞子形成オーシスト５０，０００個
を経口投与した。各実験用に、Ｒｅａｓｅｈｅａｔｈ−
Ｃニワトリの同齢（ａｇｅ−ｍａｔｃｈｅｄ）対照グル
ープを別に飼育した。
−Ｃニワトリ（４週齢； １グループ当たり１０羽）に
Ｅ． ｍａｘｉｍａ Ｈの胞子形成オーシスト４０００
個を経口投与した。二次感染のためには同じ鳥に、Ｅ．
ｍａｘｉｍａＨの胞子形成オーシスト５０，０００個
を経口投与した。各実験用に、Ｒｅａｓｅｈｅａｔｈ−
Ｃニワトリの同齢（ａｇｅ−ｍａｔｃｈｅｄ）対照グル
ープを別に飼育した。
【００８８】２．ａ．ｉｉ． 末梢血リンパ球の調製 血液試料（５ｍｌ）を表在翼静脈から、ヘパリン（１０
単位／ｍｌ）を収容したプラスチック製注射器内に抜き
取った。血液を管（Ｆａｌｃｏｎ ２０２７；Ｂｅｃｔ
ｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に移し、Ｓｏｒｖａｌｌ
ＲＣ３Ｂ遠心機において４００ｒｐｍで１５分間遠心し
た。沈降した赤血球の上方に位置する細胞の層をピペッ
トで注意深く取り出して新しい管（Ｆａｌｃｏｎ ２０
５９；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）内に移し、
２０００ｒｐｍで１０分間遠心した。沈降した細胞を、
１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ； ウイルス及びマイコ
プラズマに関してスクリーニング済み； Ｇｉｂｃｏ
Ｂｉｏｃｕｌｔ）、２００単位／ｍｌのペニシリン及び
２００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇ．Ｒ． Ｓ
ｑｕｉｂｂ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｍｏｒｅｔｏｎ， Ｅｎ
ｇｌａｎｄ）を含有するＲＰＭＩ １６４０で３回洗浄
し、かつ前記と同じ培地中に４×１０6 細胞／ｍｌの濃
度で再懸濁させた。細胞（４×１０5 個）の１００ｍｌ
アリコートをピペットに取り、９６ウェルプレート（Ｎ
ｕｎｃ−Ｇｉｂｃｏ， Ｐａｉｓｌｅｙ， Ｓｃｏｔｌ
ａｎｄ）の丸底ウェルに入れた。各ウェルに１００μｌ
の調製試料を添加した。試験試料は、先に調製したＮＣ
粒子懸濁液（実施例１の１．ａ．ｉｉ．参照）を、１０
％のＦＣＳ、２００単位／ｍｌのペニシリン及び２００
ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ
１６４０培地で稀釈したものとした。稀釈液を製造する
べく、懸濁液を−７０℃から解凍して培地で１０倍に稀
釈し、その後２倍連続稀釈液を製造した。タンパク質に
欠けるＮＣ粒子懸濁液を含有する対照試料も同様に稀釈
した。第二の対照試料群は、胞子小体の凍結−解凍及び
音波処理によって調製した全胞子小体の溶解物（タンパ
ク質０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有した。いずれの試料も各
細胞調製物用に同じものを三つずつ製造し、これらの同
等試料をプレート全体に任意に分配した。プレートを５
％ ＣＯ2 下に４１℃で９６時間インキュベートし、最
後の１６時間は１ｍＣｉの3 Ｈ−チミジンで４８Ｃｉ／
ｍｍｏｌにパルス標識し（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．
Ｋ．）、その後ガラス微細繊維フィルター（ＭＡ７８
１； Ｄｙｎａｔｒｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
Ｌｔｄ．）上に収穫した（ＤｙｎａｔｒｏｎＭａｃｒｏ
ｍａｓｈ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ； Ｄｙｎａｔｅｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．， Ｓｕｓｓｅ
ｘ， Ｅｎｇｌａｎｄ）。５０℃で１時間乾燥後、ディ
スクをシンチレーションバイアルに入れ、３．５ｍｌの
液体シンチレーション混合物（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｏ
ｒ ２９９TM； Ｐａｃｋａｒｄ， Ｃａｖｅｒｓｈａ
ｍ， Ｕ．Ｋ．）を添加し、放射性成分をシンチレーシ
ョン分光光度計（ＬＳ９０００； Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＩｎｃ．）で測定した。
単位／ｍｌ）を収容したプラスチック製注射器内に抜き
取った。血液を管（Ｆａｌｃｏｎ ２０２７；Ｂｅｃｔ
ｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に移し、Ｓｏｒｖａｌｌ
ＲＣ３Ｂ遠心機において４００ｒｐｍで１５分間遠心し
た。沈降した赤血球の上方に位置する細胞の層をピペッ
トで注意深く取り出して新しい管（Ｆａｌｃｏｎ ２０
５９；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）内に移し、
２０００ｒｐｍで１０分間遠心した。沈降した細胞を、
１０％のウシ胎児血清（ＦＣＳ； ウイルス及びマイコ
プラズマに関してスクリーニング済み； Ｇｉｂｃｏ
Ｂｉｏｃｕｌｔ）、２００単位／ｍｌのペニシリン及び
２００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇ．Ｒ． Ｓ
ｑｕｉｂｂ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｍｏｒｅｔｏｎ， Ｅｎ
ｇｌａｎｄ）を含有するＲＰＭＩ １６４０で３回洗浄
し、かつ前記と同じ培地中に４×１０6 細胞／ｍｌの濃
度で再懸濁させた。細胞（４×１０5 個）の１００ｍｌ
アリコートをピペットに取り、９６ウェルプレート（Ｎ
ｕｎｃ−Ｇｉｂｃｏ， Ｐａｉｓｌｅｙ， Ｓｃｏｔｌ
ａｎｄ）の丸底ウェルに入れた。各ウェルに１００μｌ
の調製試料を添加した。試験試料は、先に調製したＮＣ
粒子懸濁液（実施例１の１．ａ．ｉｉ．参照）を、１０
％のＦＣＳ、２００単位／ｍｌのペニシリン及び２００
ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ
１６４０培地で稀釈したものとした。稀釈液を製造する
べく、懸濁液を−７０℃から解凍して培地で１０倍に稀
釈し、その後２倍連続稀釈液を製造した。タンパク質に
欠けるＮＣ粒子懸濁液を含有する対照試料も同様に稀釈
した。第二の対照試料群は、胞子小体の凍結−解凍及び
音波処理によって調製した全胞子小体の溶解物（タンパ
ク質０．５ｍｇ／ｍｌ）を含有した。いずれの試料も各
細胞調製物用に同じものを三つずつ製造し、これらの同
等試料をプレート全体に任意に分配した。プレートを５
％ ＣＯ2 下に４１℃で９６時間インキュベートし、最
後の１６時間は１ｍＣｉの3 Ｈ−チミジンで４８Ｃｉ／
ｍｍｏｌにパルス標識し（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｕ．
Ｋ．）、その後ガラス微細繊維フィルター（ＭＡ７８
１； Ｄｙｎａｔｒｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
Ｌｔｄ．）上に収穫した（ＤｙｎａｔｒｏｎＭａｃｒｏ
ｍａｓｈ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ； Ｄｙｎａｔｅｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｔｄ．， Ｓｕｓｓｅ
ｘ， Ｅｎｇｌａｎｄ）。５０℃で１時間乾燥後、ディ
スクをシンチレーションバイアルに入れ、３．５ｍｌの
液体シンチレーション混合物（Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｏ
ｒ ２９９TM； Ｐａｃｋａｒｄ， Ｃａｖｅｒｓｈａ
ｍ， Ｕ．Ｋ．）を添加し、放射性成分をシンチレーシ
ョン分光光度計（ＬＳ９０００； Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＩｎｃ．）で測定した。
【００８９】２．ｂ．結果 結果を、各鳥に由来する細胞を用いた各試料に関して ＳＩ＝ｃｐｍ１／ｃｐｍ２ 〔式中ｃｐｍ１はタンパク質を支持するＮＣ粒子と共に
インキュベートした三重培養物の平均毎分カウントであ
り、ｃｐｍ２はタンパク質を支持しないＮＣ粒子と共に
インキュベートした三重培養物の平均毎分カウントであ
る〕のように計算した刺激指数（ＳＩ）として表わす。
インキュベートした三重培養物の平均毎分カウントであ
り、ｃｐｍ２はタンパク質を支持しないＮＣ粒子と共に
インキュベートした三重培養物の平均毎分カウントであ
る〕のように計算した刺激指数（ＳＩ）として表わす。
【００９０】（集合的に４５ｋＤａと呼称する）相対分
子量約４９ｋＤａ／４５ｋＤａのポリペプチドを支持す
る可溶ＮＣストリップは感染鳥由来のリンパ球の増殖を
刺激することが判明した（表１参照）。対照鳥由来のリ
ンパ球は増殖を刺激されなかった。ＳＩは４から９まで
様々となり、経時試験は二次感染から４日後の鳥から調
製したリンパ球が最も盛んに増殖することを示した。
子量約４９ｋＤａ／４５ｋＤａのポリペプチドを支持す
る可溶ＮＣストリップは感染鳥由来のリンパ球の増殖を
刺激することが判明した（表１参照）。対照鳥由来のリ
ンパ球は増殖を刺激されなかった。ＳＩは４から９まで
様々となり、経時試験は二次感染から４日後の鳥から調
製したリンパ球が最も盛んに増殖することを示した。
【００９１】実施例３ リンパ刺激性抗原に対する抗体の作製及びスクリーニン
グ ３．ａ． 方法 ３．ａ．ｉ． 動物の免疫感作 健康（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）なウサギ（Ｈａｒ
ｌａｎ−Ｏｌａｃ，Ｂｉｃｅｓｔｅｒ， Ｅｎｇｌａｎ
ｄ）をコクシジウムに感染しないように維持した。Ｅ．
ｍａｘｉｍａ Ｈ胞子小体ペレットのポリペプチドを、
実施例１に述べたように可溶化し、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって分離し、ＮＣに移した。
４５ｋＤａの分子量を有するポリペプチドを支持するＮ
Ｃストリップを切り取り、実施例１に述べたようにＤＭ
ＳＯ中で可溶化し、ｐＨ７．０のＰＢＳで洗浄し、最後
に１ｍｌのｐＨ７．０のＰＢＳ中に懸濁させた。懸濁液
を４部位に皮下注射し（１部位当たり０．２５ｍｌ）、
この注射は毎回ウサギ１匹当たり１個のＮＣストリップ
を用いて２週間おきに繰り返した。４回目の注射の２週
間後にウサギ血清を調製した。
グ ３．ａ． 方法 ３．ａ．ｉ． 動物の免疫感作 健康（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ）なウサギ（Ｈａｒ
ｌａｎ−Ｏｌａｃ，Ｂｉｃｅｓｔｅｒ， Ｅｎｇｌａｎ
ｄ）をコクシジウムに感染しないように維持した。Ｅ．
ｍａｘｉｍａ Ｈ胞子小体ペレットのポリペプチドを、
実施例１に述べたように可溶化し、ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動によって分離し、ＮＣに移した。
４５ｋＤａの分子量を有するポリペプチドを支持するＮ
Ｃストリップを切り取り、実施例１に述べたようにＤＭ
ＳＯ中で可溶化し、ｐＨ７．０のＰＢＳで洗浄し、最後
に１ｍｌのｐＨ７．０のＰＢＳ中に懸濁させた。懸濁液
を４部位に皮下注射し（１部位当たり０．２５ｍｌ）、
この注射は毎回ウサギ１匹当たり１個のＮＣストリップ
を用いて２週間おきに繰り返した。４回目の注射の２週
間後にウサギ血清を調製した。
【００９２】Ｌｉｇｈｔ Ｓｕｓｓｅｘニワトリ（３週
齢）をコクシジウムに感染しないように維持した。Ｅ．
ｍａｘｉｍａ Ｈ胞子小体ペレットのポリペプチドを
可溶化し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって分離し、前記ゲルをクーマシーブリリアントブル
ーの水溶液で簡単に染色した。分子量４５ｋＤａ前後の
ポリペプチドを含むポリアクリルアミド切片を切り取
り、これを小片に刻んだ。ゲル小片をデカンテーション
によってＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ
Ｂｉｏｔｒａｐチャンバー内に移し、ポリペプチドを１
５０Ｖで１６時間、製造元の指示どおりに電気溶離（ｅ
ｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅ）した。溶離したタンパク質を
ｐＨ７．６のＰＢＳに対して十分透析し、その後ＡＧ１
１Ａ８樹脂で処理して、ＳＤＳが痕跡量でも残留してい
ればそれを除去した。抗原をサポニン（Ｓｉｇｍａ）と
混合してニワトリの首に皮下注射し（ニワトリ１羽当た
り５μｇのサポニン及び１〜５μｇのタンパク質を含有
する０．５ｍｌの注射液）、このような注射を更に２
回、２週間おきに繰り返した。３回目の注射の２週間後
にニワトリ血清を調製した。
齢）をコクシジウムに感染しないように維持した。Ｅ．
ｍａｘｉｍａ Ｈ胞子小体ペレットのポリペプチドを
可溶化し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よって分離し、前記ゲルをクーマシーブリリアントブル
ーの水溶液で簡単に染色した。分子量４５ｋＤａ前後の
ポリペプチドを含むポリアクリルアミド切片を切り取
り、これを小片に刻んだ。ゲル小片をデカンテーション
によってＳｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ
Ｂｉｏｔｒａｐチャンバー内に移し、ポリペプチドを１
５０Ｖで１６時間、製造元の指示どおりに電気溶離（ｅ
ｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｅ）した。溶離したタンパク質を
ｐＨ７．６のＰＢＳに対して十分透析し、その後ＡＧ１
１Ａ８樹脂で処理して、ＳＤＳが痕跡量でも残留してい
ればそれを除去した。抗原をサポニン（Ｓｉｇｍａ）と
混合してニワトリの首に皮下注射し（ニワトリ１羽当た
り５μｇのサポニン及び１〜５μｇのタンパク質を含有
する０．５ｍｌの注射液）、このような注射を更に２
回、２週間おきに繰り返した。３回目の注射の２週間後
にニワトリ血清を調製した。
【００９３】３．ａ．ｉｉ． 一次元及び二次元ブロッ
ティングによる抗血清のスクリーニングＥ． ｍａｘｉｍａ Ｈ胞子小体ペレットのポリペプチ
ドを、実施例１に述べたように可溶化し、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。あるい
は他の場合には、胞子小体（７×１０7 個）を５００μ
ｌの溶解緩衝液［０．２％ Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、
２０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、９Ｍ尿素、０．２％ Ｂｉｏｌ
ｙｔｅｓ ３−１０（Ｂｉｏｒａｄ）、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ］中に懸濁させ、音波処理し（１０ミクロンでの１０
秒発射３回； ＭＳＥ Ｓｏｎｉｐｒｅｐ ５０）、３
サイクルの凍結−解凍を施した。試料をマイクロ遠心機
において１２，０００×ｇで１分間遠心し、その後、実
質的にＯ’Ｆａｒｒｅｌｌが述べている（Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ． ２５０， ｐｐ．４００７−４０２
１， １９７５）ような二次元ゲル電気泳動によってポ
リペプチドを分離した。
ティングによる抗血清のスクリーニングＥ． ｍａｘｉｍａ Ｈ胞子小体ペレットのポリペプチ
ドを、実施例１に述べたように可溶化し、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動によって分離した。あるい
は他の場合には、胞子小体（７×１０7 個）を５００μ
ｌの溶解緩衝液［０．２％ Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、
２０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、９Ｍ尿素、０．２％ Ｂｉｏｌ
ｙｔｅｓ ３−１０（Ｂｉｏｒａｄ）、１ｍＭ ＤＴ
Ｔ］中に懸濁させ、音波処理し（１０ミクロンでの１０
秒発射３回； ＭＳＥ Ｓｏｎｉｐｒｅｐ ５０）、３
サイクルの凍結−解凍を施した。試料をマイクロ遠心機
において１２，０００×ｇで１分間遠心し、その後、実
質的にＯ’Ｆａｒｒｅｌｌが述べている（Ｊ． Ｂｉｏ
ｌ． Ｃｈｅｍ． ２５０， ｐｐ．４００７−４０２
１， １９７５）ような二次元ゲル電気泳動によってポ
リペプチドを分離した。
【００９４】分離したポリペプチドを、実施例１に述べ
たようにＮＣ紙に移した。ＮＣ紙を３％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）を含有するＴＴＮ緩衝液（ｐＨ７．４の
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．
０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）に浸漬し、穏やかに揺動さ
せながら室温で２時間インキュベートした。ＮＣ紙を水
で濯ぎ、ストリップに切断し、各ストリップを、１％
ＢＳＡを含有するＴＴＮで１：２５０に稀釈したウサギ
血清の試料中で３時間インキュベートした。ストリップ
を０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＴＮで３回
洗浄し、その後、１％ ＢＳＡを含有するＴＴＮで１：
７，５００に稀釈した、アルカリホスファターゼ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）に結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ中で１時
間インキュベートした。ストリップを０．５％ Ｔｗｅ
ｅｎ−２０を含有するＴＴＮで更に３回洗浄し、かつＡ
Ｐ緩衝液（ｐＨ９．５の１００ｍＭトリス、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ）で１回洗浄した。５
０ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム及び５０ｍ
ｇ／ｍｌのブロモクロロインドリルホスフェートを含有
するＡＰ緩衝液中でストリップをインキュベートするこ
とにより、ホスファターゼ結合体の結合を検出した。
たようにＮＣ紙に移した。ＮＣ紙を３％ウシ血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）を含有するＴＴＮ緩衝液（ｐＨ７．４の
１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、５００ｍＭ ＮａＣｌ、０．
０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）に浸漬し、穏やかに揺動さ
せながら室温で２時間インキュベートした。ＮＣ紙を水
で濯ぎ、ストリップに切断し、各ストリップを、１％
ＢＳＡを含有するＴＴＮで１：２５０に稀釈したウサギ
血清の試料中で３時間インキュベートした。ストリップ
を０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＴＴＮで３回
洗浄し、その後、１％ ＢＳＡを含有するＴＴＮで１：
７，５００に稀釈した、アルカリホスファターゼ（Ｐｒ
ｏｍｅｇａ）に結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧ中で１時
間インキュベートした。ストリップを０．５％ Ｔｗｅ
ｅｎ−２０を含有するＴＴＮで更に３回洗浄し、かつＡ
Ｐ緩衝液（ｐＨ９．５の１００ｍＭトリス、１００ｍＭ
ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 ）で１回洗浄した。５
０ｍｇ／ｍｌのニトロブルーテトラゾリウム及び５０ｍ
ｇ／ｍｌのブロモクロロインドリルホスフェートを含有
するＡＰ緩衝液中でストリップをインキュベートするこ
とにより、ホスファターゼ結合体の結合を検出した。
【００９５】３．ｂ． 結果Ｅ． ｍａｘｉｍａ のポリペプチドの一次元ウェスタン
ブロットを検出したウサギ及びニワトリ抗ｐ４５血清の
特異性を図１に示す。二次元ウェスタンブロットにおけ
るスポットの識別は表２にまとめる。
ブロットを検出したウサギ及びニワトリ抗ｐ４５血清の
特異性を図１に示す。二次元ウェスタンブロットにおけ
るスポットの識別は表２にまとめる。
【００９６】実施例４ Ｅ． ｍａｘｉｍａ胞子小体ｃＤＮＡライブラリーの構
築 ４．ａ． 方法 ４．ａ．ｉ． ｍＲＮＡの単離Ｅ． ｍａｘｉｍａ 胞子小体（５×１０8 個）を実施例
１に述べたように精製した。ＲＮＡ抽出キット（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）を製造元の指示どおりに用いて全細胞Ｒ
ＮＡを調製した。手短に言えば、緩衝グアニジニウム液
（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔ
ｅ）、Ｎ−ラウリルサルコシン及びＥＤＴＡ中でのイン
キュベーションによって胞子小体を溶解させ、緩衝トリ
フルオロ酢酸セシウムを用いる超遠心によってＲＮＡを
他の細胞成分から分離した。ＲＮＡペレットをＴＥ緩衝
液（ｐＨ７．５の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）に注意深く溶解させ、エタノール沈澱物として
−７０℃で貯蔵した。この全ＲＮＡ調製物からメッセン
ジャーＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）セルロースのカラム
［ポリ（Ａ） Ｑｕｉｋ； Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ］を
製造元の指示どおりに用いて精製した。手短に言えば、
沈澱したＲＮＡを１２，０００×ｇでの３０分間の遠心
によってペレット化し、自然乾燥し、５００ｍＭのＮａ
Ｃｌを含有する４００μｌのＴＥ緩衝液中に懸濁させ
た。ＲＮＡを、同じ緩衝液で予め平衡させたカラムの頂
部に適用した。６５℃に予め加温したＴＥ緩衝液でカラ
ムからメッセンジャーＲＮＡを溶離し、２６０ｎｍでの
分光吸光度を測定することによりｍＲＮＡの量を２．６
μｇと決定した。ｐＨ５．０の３Ｍ酢酸ナトリウム０．
１体積部と無水エタノール２．５体積部とを添加するこ
とにより、ｍＲＮＡを−７０℃で一晩沈澱させた。
築 ４．ａ． 方法 ４．ａ．ｉ． ｍＲＮＡの単離Ｅ． ｍａｘｉｍａ 胞子小体（５×１０8 個）を実施例
１に述べたように精製した。ＲＮＡ抽出キット（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ）を製造元の指示どおりに用いて全細胞Ｒ
ＮＡを調製した。手短に言えば、緩衝グアニジニウム液
（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔ
ｅ）、Ｎ−ラウリルサルコシン及びＥＤＴＡ中でのイン
キュベーションによって胞子小体を溶解させ、緩衝トリ
フルオロ酢酸セシウムを用いる超遠心によってＲＮＡを
他の細胞成分から分離した。ＲＮＡペレットをＴＥ緩衝
液（ｐＨ７．５の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ）に注意深く溶解させ、エタノール沈澱物として
−７０℃で貯蔵した。この全ＲＮＡ調製物からメッセン
ジャーＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）セルロースのカラム
［ポリ（Ａ） Ｑｕｉｋ； Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ］を
製造元の指示どおりに用いて精製した。手短に言えば、
沈澱したＲＮＡを１２，０００×ｇでの３０分間の遠心
によってペレット化し、自然乾燥し、５００ｍＭのＮａ
Ｃｌを含有する４００μｌのＴＥ緩衝液中に懸濁させ
た。ＲＮＡを、同じ緩衝液で予め平衡させたカラムの頂
部に適用した。６５℃に予め加温したＴＥ緩衝液でカラ
ムからメッセンジャーＲＮＡを溶離し、２６０ｎｍでの
分光吸光度を測定することによりｍＲＮＡの量を２．６
μｇと決定した。ｐＨ５．０の３Ｍ酢酸ナトリウム０．
１体積部と無水エタノール２．５体積部とを添加するこ
とにより、ｍＲＮＡを−７０℃で一晩沈澱させた。
【００９７】４．ａ．ｉｉ． ｃＤＮＡの合成及びクロ
ーニング メッセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡを、ＺＡＰ−ｃＤＮ
ＡTM合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造元の指
示どおりに用いて合成した。集団を構成するｃＤＮＡの
大きさは、合成したｃＤＮＡの一部のアガロースゲル電
気泳動及びオートラジオグラフィーから判定して２００
ｂｐ未満から約６ｋｂｐまでであった。残りのｃＤＮＡ
を、４種全部のｄＮＴＰの存在下に３７℃で３０分間Ｔ
４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端修復した。Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを８℃で２４時間用いて、ｃＤＮＡの平
滑末端にＥｃｏＲＩアダプターを連結させた。ＸｈｏＩ
での消化によって、総ての３′末端にＸｈｏＩ制限部位
を有し、総ての５′末端にＥｃｏＲＩ制限部位を有する
ｃＤＮＡを生成させた。１ｍｌ容のＳｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ−４００カラムを用いて試料を遠心することによ
り、オリゴヌクレオチド（余分なアダプター、及び制限
酵素で消化したプライマー−鋳型）を除去した。
ーニング メッセンジャーＲＮＡからｃＤＮＡを、ＺＡＰ−ｃＤＮ
ＡTM合成キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造元の指
示どおりに用いて合成した。集団を構成するｃＤＮＡの
大きさは、合成したｃＤＮＡの一部のアガロースゲル電
気泳動及びオートラジオグラフィーから判定して２００
ｂｐ未満から約６ｋｂｐまでであった。残りのｃＤＮＡ
を、４種全部のｄＮＴＰの存在下に３７℃で３０分間Ｔ
４ ＤＮＡポリメラーゼを用いて末端修復した。Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを８℃で２４時間用いて、ｃＤＮＡの平
滑末端にＥｃｏＲＩアダプターを連結させた。ＸｈｏＩ
での消化によって、総ての３′末端にＸｈｏＩ制限部位
を有し、総ての５′末端にＥｃｏＲＩ制限部位を有する
ｃＤＮＡを生成させた。１ｍｌ容のＳｅｐｈａｃｒｙｌ
Ｓ−４００カラムを用いて試料を遠心することによ
り、オリゴヌクレオチド（余分なアダプター、及び制限
酵素で消化したプライマー−鋳型）を除去した。
【００９８】ｃＤＮＡの１００ｎｇ部分を１ｍｇのＵｎ
ｉ−ＺＡＰ ＸＲベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；
ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、かつ脱リン酸化した
もの）に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１２℃で一晩
掛けて連結させた。連結したＤＮＡをファージ頭部内
へ、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩ Ｇｏｌｄ再構成抽出物
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造元の指示どおりに用い
て再構成した。得られた一次ライブラリーを大腸菌ＳＵ
ＲＥ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に植え込んで増幅さ
せ、得られた増幅ライブラリー（Ｅｍｘ８及びＥｍｘ
９）を大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）に関して滴定した。これらの操作はいずれも製造
元の指示どおりに行なった。手短に言えば、総ての植え
込みについて宿主細胞を、０．２％（ｗ／ｖ）のマルト
ース及び１０ｍＭのＭｇＳＯ4 を補充したＬブイヨン中
で振盪下に３０℃で一晩増殖させた。細胞は使用前に１
０ｍＭＭｇＳＯ4 でＯＤ600 ＝０．５に稀釈した。０．
４％（ｗ／ｖ）の５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘｇａｌ）及び２．５ｍ
Ｍのイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴ
Ｇ）（Ｎｏｒｔｈｕｍｂｒｉａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｓ Ｌｔｄ．）の存在下にファージを植え込むことによ
り、各ライブラリー中の組み換え体の数を測定した。
ｉ−ＺＡＰ ＸＲベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ；
ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩで消化し、かつ脱リン酸化した
もの）に、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて１２℃で一晩
掛けて連結させた。連結したＤＮＡをファージ頭部内
へ、Ｇｉｇａｐａｃｋ ＩＩ Ｇｏｌｄ再構成抽出物
（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造元の指示どおりに用い
て再構成した。得られた一次ライブラリーを大腸菌ＳＵ
ＲＥ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に植え込んで増幅さ
せ、得られた増幅ライブラリー（Ｅｍｘ８及びＥｍｘ
９）を大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅ
ｎｅ）に関して滴定した。これらの操作はいずれも製造
元の指示どおりに行なった。手短に言えば、総ての植え
込みについて宿主細胞を、０．２％（ｗ／ｖ）のマルト
ース及び１０ｍＭのＭｇＳＯ4 を補充したＬブイヨン中
で振盪下に３０℃で一晩増殖させた。細胞は使用前に１
０ｍＭＭｇＳＯ4 でＯＤ600 ＝０．５に稀釈した。０．
４％（ｗ／ｖ）の５−ブロモ−４−クロロ−３−インド
リル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘｇａｌ）及び２．５ｍ
Ｍのイソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴ
Ｇ）（Ｎｏｒｔｈｕｍｂｒｉａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｓ Ｌｔｄ．）の存在下にファージを植え込むことによ
り、各ライブラリー中の組み換え体の数を測定した。
【００９９】４．ｂ． 結果 Ｅｍｘ８は３×１０8 ｐｆｕ／ｍｌ（組み換え体６５
％）を有し、Ｅｍｘ９は６×１０8 ｐｆｕ／ｍｌ（組み
換え体５５％）を有する。
％）を有し、Ｅｍｘ９は６×１０8 ｐｆｕ／ｍｌ（組み
換え体５５％）を有する。
【０１００】実施例５ Ｅ． ｍａｘｉｍａ ｐ４５抗原をコードするｃＤＮＡ
クローンの同定 ５．ａ． 方法 ｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニングを、Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅが提示する標準的な指示どおりに行なっ
た。紙を、１％ ＢＳＡを含有するＴＴＮで１：１００
に稀釈したウサギ抗ｐ４５血清に浸漬した。これ以外の
操作は総て、実施例３の３．ａ．でウェスタンブロット
の展開に関して述べた操作と同じとした。陽性プラーク
を同定し、＋４℃で一晩貯蔵してバクテリオファージ粒
子を溶離した後プラークを再スクリーニングした。総て
の陽性プラークが抗体反応性プラークの純粋な集団を有
するようになるまで再スクリーニングを継続した。
クローンの同定 ５．ａ． 方法 ｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニングを、Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅが提示する標準的な指示どおりに行なっ
た。紙を、１％ ＢＳＡを含有するＴＴＮで１：１００
に稀釈したウサギ抗ｐ４５血清に浸漬した。これ以外の
操作は総て、実施例３の３．ａ．でウェスタンブロット
の展開に関して述べた操作と同じとした。陽性プラーク
を同定し、＋４℃で一晩貯蔵してバクテリオファージ粒
子を溶離した後プラークを再スクリーニングした。総て
の陽性プラークが抗体反応性プラークの純粋な集団を有
するようになるまで再スクリーニングを継続した。
【０１０１】５．ｂ． 結果 ライブラリーＥｍｘ８及びＥｍｘ９から、ウサギ抗ｐ４
５血清と反応する２２の独立プラーク（ｐＥｍ４５／１
〜ｐＥｍ４５／２２）を単離し、プラークを精製した。
５血清と反応する２２の独立プラーク（ｐＥｍ４５／１
〜ｐＥｍ４５／２２）を単離し、プラークを精製した。
【０１０２】実施例６ Ｅ． ｍａｘｉｍａ ｐ４５抗原をコードするｃＤＮＡ
クローンの解析 ６．ａ． 方法 ６．ａ．ｉ． ｃＤＮＡ挿入部の解析 ウサギ抗ｐ４５血清と反応した精製プラークからλファ
ージ粒子を溶離した。製造元（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
の提示する指示に従い組み換え体λ ＺＡＰＩＩからｉ
ｎ ｖｉｖｏで切り出すことによってｃＤＮＡ挿入部を
取り出し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に組み
込んだ。ｃＤＮＡを組み込んだｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
プラスミドをアルカリ溶解（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏ
ｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ７，
ｐ．１５１３， １９７９）によって単離し、ｃＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼでの消化によって解析した。
クローンの解析 ６．ａ． 方法 ６．ａ．ｉ． ｃＤＮＡ挿入部の解析 ウサギ抗ｐ４５血清と反応した精製プラークからλファ
ージ粒子を溶離した。製造元（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
の提示する指示に従い組み換え体λ ＺＡＰＩＩからｉ
ｎ ｖｉｖｏで切り出すことによってｃＤＮＡ挿入部を
取り出し、プラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中に組み
込んだ。ｃＤＮＡを組み込んだｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
プラスミドをアルカリ溶解（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ及びＤｏ
ｌｙ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ７，
ｐ．１５１３， １９７９）によって単離し、ｃＤＮＡ
を制限エンドヌクレアーゼでの消化によって解析した。
【０１０３】６．ａ．ｉｉ． ＤＮＡ配列決定 ｐＥｍ４５／９を、濃度勾配を付けたＣｓＣｌ／エチジ
ウムブロミド中での平衡遠心によって精製し、ｃＤＮＡ
挿入部のヌクレオチド配列を、Ｔ３及びＴ７オリゴヌク
レオチドプライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）並びにＳ
ｅｑｕｅｎａｓｅ２．０型（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ
ｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用い、かつこれらの製
造元の提示する指示を用いて２本鎖ＤＮＡ鋳型から直接
決定した。
ウムブロミド中での平衡遠心によって精製し、ｃＤＮＡ
挿入部のヌクレオチド配列を、Ｔ３及びＴ７オリゴヌク
レオチドプライマー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）並びにＳ
ｅｑｕｅｎａｓｅ２．０型（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅ
ｓ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を用い、かつこれらの製
造元の提示する指示を用いて２本鎖ＤＮＡ鋳型から直接
決定した。
【０１０４】６．ｂ． 結果 ｐＥｍ４５／９のヌクレオチド配列及び該配列から推定
されるアミノ酸配列を、配列番号１及び２を付して示
す。ｐＥｍ４５／９は、３′ポリ（Ａ）配列を含む３９
２ｂｐのｃＤＮＡである。このｃＤＮＡは３番目のヌク
レオチドから、ポリ（Ａ）配列手前の３２９番目の塩基
対の位置のオパール終結コドン（ＴＧＡ）までが“オー
プン”であると考えられる。推定アミノ酸配列は１０９
個のアミノ酸から成るタンパク質もしくは約１２ｋＤａ
のタンパク質をコードする。このｃＤＮＡは、ＢｓｍＩ
制限酵素部位（２１３ｂｐ）、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素
部位（２６０ｂｐ）及びＳｐｈＩ制限酵素部位（３２３
ｂｐ）をただ１個ずつ有する。
されるアミノ酸配列を、配列番号１及び２を付して示
す。ｐＥｍ４５／９は、３′ポリ（Ａ）配列を含む３９
２ｂｐのｃＤＮＡである。このｃＤＮＡは３番目のヌク
レオチドから、ポリ（Ａ）配列手前の３２９番目の塩基
対の位置のオパール終結コドン（ＴＧＡ）までが“オー
プン”であると考えられる。推定アミノ酸配列は１０９
個のアミノ酸から成るタンパク質もしくは約１２ｋＤａ
のタンパク質をコードする。このｃＤＮＡは、ＢｓｍＩ
制限酵素部位（２１３ｂｐ）、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素
部位（２６０ｂｐ）及びＳｐｈＩ制限酵素部位（３２３
ｂｐ）をただ１個ずつ有する。
【０１０５】実施例７ ｐＥｍ４５／９によってコードされた組み換え体タンパ
ク質の発現 ７．ａ． 方法 ７．ａ．ｉ． プラスミドｐＧＥＸ３ＸＥｍ４５／９の
構築 １μｇのｐＥｍ４５／９を３７℃で２時間、１０単位の
ＢａｍＨＩ及び１０単位のＸｈｏＩで消化し、放出され
たｃＤＮＡ挿入部を、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩで消化し、
かつ脱リン酸化したプラスミドｐＲＳＥＴＢ（ＩｎＶｉ
ｔｒｏｇｅｎ）中に連結した。連結ＤＮＡで大腸菌株Ｊ
Ｍ１０９をトランスフェクトし、組み換え体プラスミド
ｐＲＳＥＴＢＥｍ４５／９を含有するコロニーを同定
し、プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解（Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ及びＤｏｌｙ， ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ． ７， ｐ．１５１３， １９７９）によって単離
した。
ク質の発現 ７．ａ． 方法 ７．ａ．ｉ． プラスミドｐＧＥＸ３ＸＥｍ４５／９の
構築 １μｇのｐＥｍ４５／９を３７℃で２時間、１０単位の
ＢａｍＨＩ及び１０単位のＸｈｏＩで消化し、放出され
たｃＤＮＡ挿入部を、ＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩで消化し、
かつ脱リン酸化したプラスミドｐＲＳＥＴＢ（ＩｎＶｉ
ｔｒｏｇｅｎ）中に連結した。連結ＤＮＡで大腸菌株Ｊ
Ｍ１０９をトランスフェクトし、組み換え体プラスミド
ｐＲＳＥＴＢＥｍ４５／９を含有するコロニーを同定
し、プラスミドＤＮＡをアルカリ溶解（Ｂｉｒｎｂｏｉ
ｍ及びＤｏｌｙ， ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ． ７， ｐ．１５１３， １９７９）によって単離
した。
【０１０６】１μｇのｐＲＳＥＴＢＥｍ４５／９を１０
単位のＥｃｏＲＩで消化し、放出されたｃＤＮＡ挿入部
を、ＥｃｏＲＩで消化し、かつ脱リン酸化したプラスミ
ドｐＧＥＸ３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中に連結した。
連結ＤＮＡで大腸菌株ＪＭ１０１をトランスフェクト
し、組み換え体プラスミドを有する細菌を選択し、プラ
スミドＤＮＡを上記と同様にして単離した。制限酵素消
化及びアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを解析し
て、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合体と
してのタンパク質発現に適正な向きでｐＥｍ４５／９の
ｃＤＮＡ挿入部を含むプラスミドｐＧＥＸ３ＸＥｍ４５
／９を同定した。
単位のＥｃｏＲＩで消化し、放出されたｃＤＮＡ挿入部
を、ＥｃｏＲＩで消化し、かつ脱リン酸化したプラスミ
ドｐＧＥＸ３Ｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）中に連結した。
連結ＤＮＡで大腸菌株ＪＭ１０１をトランスフェクト
し、組み換え体プラスミドを有する細菌を選択し、プラ
スミドＤＮＡを上記と同様にして単離した。制限酵素消
化及びアガロースゲル電気泳動によりＤＮＡを解析し
て、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼとの融合体と
してのタンパク質発現に適正な向きでｐＥｍ４５／９の
ｃＤＮＡ挿入部を含むプラスミドｐＧＥＸ３ＸＥｍ４５
／９を同定した。
【０１０７】７．ａ．ｉｉ． グルタチオンＳ−トラン
スフェラーゼ（ＧＳＴ）−Ｅｍ４５／９融合タンパク質
の発現 細菌コロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
有するＬブイヨン中に取り、激しく振盪しつつ３７℃で
一晩増殖させた。５０μｌの一晩培養物を用いて５ｍｌ
の新しい培地に播種し、培養物を（６００ｎｍにおいて
測定される）吸光度が約０．３となるまで再インキュベ
ートした。ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭとなるように添
加し、培養物を更に４〜５時間維持した。細菌培養物の
アリコートをインキュベーションの間中の様々な時点に
取り出し、ＰＡＧＥ及び実施例３の３．ａ．ｉｉ．に述
べたような、天然ｐ４５抗原に対して作製した抗体を用
いるウェスタンブロッティングによって試験した。
スフェラーゼ（ＧＳＴ）−Ｅｍ４５／９融合タンパク質
の発現 細菌コロニーを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含
有するＬブイヨン中に取り、激しく振盪しつつ３７℃で
一晩増殖させた。５０μｌの一晩培養物を用いて５ｍｌ
の新しい培地に播種し、培養物を（６００ｎｍにおいて
測定される）吸光度が約０．３となるまで再インキュベ
ートした。ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭとなるように添
加し、培養物を更に４〜５時間維持した。細菌培養物の
アリコートをインキュベーションの間中の様々な時点に
取り出し、ＰＡＧＥ及び実施例３の３．ａ．ｉｉ．に述
べたような、天然ｐ４５抗原に対して作製した抗体を用
いるウェスタンブロッティングによって試験した。
【０１０８】２ｍｌの一晩培養物を用いて２００ｍｌの
新しい培地に播種し、培養物を上記のように増殖させ
た。ＩＰＴＧを濃度１ｍＭとなるように添加した５時間
後、細菌細胞を遠心によって収穫し、１％ ｖ／ｖのＴ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する５ｍｌのＰＢＳに再
懸濁させた。細胞を、最高出力での３０秒発射を４回行
なって音波処理し（ＭＳＥ Ｓｏｎｉｐｒｅｐ）、音波
処理物を遠心によって上清とペレットとに分離した。ペ
レットを、８Ｍ尿素または２％ ＳＤＳ中で可溶化して
からＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによって試
験した。
新しい培地に播種し、培養物を上記のように増殖させ
た。ＩＰＴＧを濃度１ｍＭとなるように添加した５時間
後、細菌細胞を遠心によって収穫し、１％ ｖ／ｖのＴ
ｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含有する５ｍｌのＰＢＳに再
懸濁させた。細胞を、最高出力での３０秒発射を４回行
なって音波処理し（ＭＳＥ Ｓｏｎｉｐｒｅｐ）、音波
処理物を遠心によって上清とペレットとに分離した。ペ
レットを、８Ｍ尿素または２％ ＳＤＳ中で可溶化して
からＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによって試
験した。
【０１０９】７．ｂ． 結果 ウェスタンブロッティングを施した細菌溶解物をウサギ
またはニワトリ抗ｐ４５抗血清でスクリーニングするこ
とによって判定したところ、組み換え体ＧＳＴ−Ｅｍ４
５／９タンパク質は大腸菌において首尾よく発現され
た。上記血清と特異的に反応した融合タンパク質は約３
７ｋＤａであったが、これは２６ｋＤａがＧＳＴで１１
ｋＤａがＥｍ４５／９であると説明される（図２のレー
ン１）。タンパク質は一晩培養物において産生された
が、ＩＰＴＧの添加によって発現が著しく促進された
（図２のレーン３）。収穫した培養物の音波処理後、上
清中には組み換え体タンパク質はきわめて僅かしか検出
されなかった（図２のレーン４）が、２％ ＳＤＳ中で
可溶化したペレット中には高濃度に見出された（図２の
レーン６）。ペレットは８Ｍ尿素中では部分的に可溶性
となった（図２のレーン５）。
またはニワトリ抗ｐ４５抗血清でスクリーニングするこ
とによって判定したところ、組み換え体ＧＳＴ−Ｅｍ４
５／９タンパク質は大腸菌において首尾よく発現され
た。上記血清と特異的に反応した融合タンパク質は約３
７ｋＤａであったが、これは２６ｋＤａがＧＳＴで１１
ｋＤａがＥｍ４５／９であると説明される（図２のレー
ン１）。タンパク質は一晩培養物において産生された
が、ＩＰＴＧの添加によって発現が著しく促進された
（図２のレーン３）。収穫した培養物の音波処理後、上
清中には組み換え体タンパク質はきわめて僅かしか検出
されなかった（図２のレーン４）が、２％ ＳＤＳ中で
可溶化したペレット中には高濃度に見出された（図２の
レーン６）。ペレットは８Ｍ尿素中では部分的に可溶性
となった（図２のレーン５）。
【０１１０】実施例８ ｐＧＥＸ３ＸＥｍ４５／９融合タンパク質の分取電気泳
動 ８．ａ． 方法 実施例７の７．ａ．ｉｉ．に述べたように調製したＳＤ
Ｓ可溶化融合タンパク質の二つの１ｍｌアリコートを、
実施例１の１．ａ．ｉｉ．に述べたような電気泳動に掛
けた。電気泳動後、ゲルの各側部から１ｃｍ厚の垂直方
向切片を切り取り、これらを４５％ ｖ／ｖメタノー
ル、１０％ ｖ／ｖ酢酸中の０．１２５％クーマシーブ
リリアントブルーで１０分間染色した。各ゲルの残りを
４５％ ｖ／ｖメタノール、１０％ ｖ／ｖ酢酸中でイ
ンキュベートした。染色した切片を簡単に脱色し、その
後全部のゲルを、ライトボックス上に配置したガラスト
レイ上で再び一つに合わせた。組み換え体ｐＧＥＸ３Ｘ
Ｅｍ４５／９タンパク質を含む領域を中央部から切り出
し、脱色し、ゲル切断片を微細に刻んだ。ゲル小片をデ
カンテーションによって、ｐＨ８．３の２５ｍＭトリ
ス、１９２ｍＭグリシン、０．１％ ＳＤＳを含有する
少量の緩衝液を収容した透析バッグ内に移した。封止し
たバッグを、上記と同じ緩衝液で満たしたアガロース電
気泳動チャンバーに入れ、融合タンパク質を５０Ｖで１
６時間電気溶離した。融合タンパク質を含有する緩衝液
をバッグから取り出し、ｐＨ７．６のＰＢＳに対して十
分透析し、その後ＡＧ１１Ａ８樹脂で製造元（Ｂｉｏｒ
ａｄ）の指示どおりに処理して、ＳＤＳが痕跡量でも残
留していればそれを除去した。この抗原の試料をＳＤＳ
−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによって解析
した。
動 ８．ａ． 方法 実施例７の７．ａ．ｉｉ．に述べたように調製したＳＤ
Ｓ可溶化融合タンパク質の二つの１ｍｌアリコートを、
実施例１の１．ａ．ｉｉ．に述べたような電気泳動に掛
けた。電気泳動後、ゲルの各側部から１ｃｍ厚の垂直方
向切片を切り取り、これらを４５％ ｖ／ｖメタノー
ル、１０％ ｖ／ｖ酢酸中の０．１２５％クーマシーブ
リリアントブルーで１０分間染色した。各ゲルの残りを
４５％ ｖ／ｖメタノール、１０％ ｖ／ｖ酢酸中でイ
ンキュベートした。染色した切片を簡単に脱色し、その
後全部のゲルを、ライトボックス上に配置したガラスト
レイ上で再び一つに合わせた。組み換え体ｐＧＥＸ３Ｘ
Ｅｍ４５／９タンパク質を含む領域を中央部から切り出
し、脱色し、ゲル切断片を微細に刻んだ。ゲル小片をデ
カンテーションによって、ｐＨ８．３の２５ｍＭトリ
ス、１９２ｍＭグリシン、０．１％ ＳＤＳを含有する
少量の緩衝液を収容した透析バッグ内に移した。封止し
たバッグを、上記と同じ緩衝液で満たしたアガロース電
気泳動チャンバーに入れ、融合タンパク質を５０Ｖで１
６時間電気溶離した。融合タンパク質を含有する緩衝液
をバッグから取り出し、ｐＨ７．６のＰＢＳに対して十
分透析し、その後ＡＧ１１Ａ８樹脂で製造元（Ｂｉｏｒ
ａｄ）の指示どおりに処理して、ＳＤＳが痕跡量でも残
留していればそれを除去した。この抗原の試料をＳＤＳ
−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングによって解析
した。
【０１１１】８．ｂ． 結果 ２個のアクリルアミドゲル切片から約２００μｇのタン
パク質を電気溶離した。この抗原の内容をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（図３）と、抗ｐ４５血清でのウェスタンブロット
の検出（図４）とによって解析した。図３及び図４の両
方において、レーン１はＩＰＴＧでの誘導から４〜５時
間後の細菌培養物の試料を含み、レーン２は免疫感作実
験（実施例９）及びｉｎ ｖｉｔｒｏリンパ増殖アッセ
イでの試験（実施例１０）に用いた、電気溶離した抗原
の試料を含む。
パク質を電気溶離した。この抗原の内容をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ（図３）と、抗ｐ４５血清でのウェスタンブロット
の検出（図４）とによって解析した。図３及び図４の両
方において、レーン１はＩＰＴＧでの誘導から４〜５時
間後の細菌培養物の試料を含み、レーン２は免疫感作実
験（実施例９）及びｉｎ ｖｉｔｒｏリンパ増殖アッセ
イでの試験（実施例１０）に用いた、電気溶離した抗原
の試料を含む。
【０１１２】実施例９ 融合タンパク質ｐＧＥＸ３ＸＥｍ４５／９での免疫感作
によるニワトリのＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ攻撃感
染からの防御 ９．ａ． 方法 ９．ａ．ｉ． 動物の免疫感作 ３６羽のＬｉｇｈｔ Ｓｕｓｓｅｘニワトリを３週齢ま
で、コクシジウム不在条件下に飼育した。鳥を二つのグ
ループに任意に分割し、１羽用ケージに個別に収容し
た。血液試料を採取し、１０μｇの抗原（実施例８に述
べたように調製）及びＰＢＳ中の５μｇのサポニンの皮
下注射（０．１ｍｌ）によって１８羽を免疫感作した。
残りの１８羽はＰＢＳ中の５μｇのサポニンの皮下注射
（０．１ｍｌ）によって擬似免疫感作（ｍｏｃｋ−ｉｍ
ｍｕｎｉｓｅ）した。免疫感作を２週間置きに更に２回
繰り返し、各免疫感作後に血液試料を採取した。
によるニワトリのＥｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ攻撃感
染からの防御 ９．ａ． 方法 ９．ａ．ｉ． 動物の免疫感作 ３６羽のＬｉｇｈｔ Ｓｕｓｓｅｘニワトリを３週齢ま
で、コクシジウム不在条件下に飼育した。鳥を二つのグ
ループに任意に分割し、１羽用ケージに個別に収容し
た。血液試料を採取し、１０μｇの抗原（実施例８に述
べたように調製）及びＰＢＳ中の５μｇのサポニンの皮
下注射（０．１ｍｌ）によって１８羽を免疫感作した。
残りの１８羽はＰＢＳ中の５μｇのサポニンの皮下注射
（０．１ｍｌ）によって擬似免疫感作（ｍｏｃｋ−ｉｍ
ｍｕｎｉｓｅ）した。免疫感作を２週間置きに更に２回
繰り返し、各免疫感作後に血液試料を採取した。
【０１１３】９．ａ．ｉｉ． 動物の攻撃 最後の免疫感作の２週間後、総ての鳥にＥ． ｍａｘｉ
ｍａの胞子形成したオーシスト１００個を経口挿管によ
って与えた。各鳥の糞を、紙で覆ったトレイ上に毎日集
めることによって採取し、混合及び稀釈した糞試料をＭ
ａｃｍａｓｔｅｒ計数チャンバーで計数することによっ
て、各鳥が攻撃の５日後から１０日後までに排出したオ
ーシストの総数を算出した。
ｍａの胞子形成したオーシスト１００個を経口挿管によ
って与えた。各鳥の糞を、紙で覆ったトレイ上に毎日集
めることによって採取し、混合及び稀釈した糞試料をＭ
ａｃｍａｓｔｅｒ計数チャンバーで計数することによっ
て、各鳥が攻撃の５日後から１０日後までに排出したオ
ーシストの総数を算出した。
【０１１４】９．ｂ． 結果 表３に、一方は抗原で免疫感作し、他方は擬似免疫感作
した二つの鳥のグループの、個々の鳥のオーシスト排出
個数及びグループ平均排出個数を示す。抗原を受容した
鳥のオーシスト排出個数は擬似免疫感作したグループの
排出個数より４４％少なく、このことは、Ｅｉｍｅｒｉ
ａ ｍａｘｉｍａへの感染からニワトリを防御するのに
実施例８に述べた抗原を用い得ることを示している。
した二つの鳥のグループの、個々の鳥のオーシスト排出
個数及びグループ平均排出個数を示す。抗原を受容した
鳥のオーシスト排出個数は擬似免疫感作したグループの
排出個数より４４％少なく、このことは、Ｅｉｍｅｒｉ
ａ ｍａｘｉｍａへの感染からニワトリを防御するのに
実施例８に述べた抗原を用い得ることを示している。
【０１１５】実施例１０ 組み換え体タンパク質ｐＧＥＸ３ＸＥｍ４５／９のリン
パ刺激性 １０．ａ． 方法 実施例９において３回目の免疫感作後に採取した血液試
料から、末梢血リンパ球を調製した。調製方法は実施例
２の２．ａ．ｉｉ．に述べた方法と同じとした。各ウェ
ルに、実施例８で調製した抗原をＰＢＳで濃度０．２μ
ｇ／ｍｌに稀釈したもの１００μｌを添加し、リンパ刺
激アッセイを実施例２の２．ａ．ｉｉ．に述べたように
継続した。
パ刺激性 １０．ａ． 方法 実施例９において３回目の免疫感作後に採取した血液試
料から、末梢血リンパ球を調製した。調製方法は実施例
２の２．ａ．ｉｉ．に述べた方法と同じとした。各ウェ
ルに、実施例８で調製した抗原をＰＢＳで濃度０．２μ
ｇ／ｍｌに稀釈したもの１００μｌを添加し、リンパ刺
激アッセイを実施例２の２．ａ．ｉｉ．に述べたように
継続した。
【０１１６】１０．ｂ． 結果 図５に、抗原で免疫感作した鳥に由来する細胞に関する
平均刺激指数を擬似免疫感作した鳥に由来する細胞に関
する平均刺激指数と比較して示す。免疫感作した鳥は擬
似免疫感作した鳥の４倍刺激されており、このことは組
み換え体抗原ｐＧＥＸ３ＸＥｍ４５／９が細胞に対して
特別のリンパ刺激作用を有したことを示している。
平均刺激指数を擬似免疫感作した鳥に由来する細胞に関
する平均刺激指数と比較して示す。免疫感作した鳥は擬
似免疫感作した鳥の４倍刺激されており、このことは組
み換え体抗原ｐＧＥＸ３ＸＥｍ４５／９が細胞に対して
特別のリンパ刺激作用を有したことを示している。
【０１１７】
【表１】ニトロセルロースに支持させたE. maxima 胞子
小体抗原に暴露した、免疫感作した鳥及び対照鳥の刺激
指数（SI値はいずれも鳥10個体の平均値） ストリップ 実験1 実験2 実験1 実験2 番号(Mr) 免疫鳥 免疫鳥 対照鳥 対照鳥 11 (49kD) 5.04 4.51 1.12 1.41 12 (45kD) 2.48 5.12 1.32 1.63
小体抗原に暴露した、免疫感作した鳥及び対照鳥の刺激
指数（SI値はいずれも鳥10個体の平均値） ストリップ 実験1 実験2 実験1 実験2 番号(Mr) 免疫鳥 免疫鳥 対照鳥 対照鳥 11 (49kD) 5.04 4.51 1.12 1.41 12 (45kD) 2.48 5.12 1.32 1.63
【０１１８】
【表２】E. maxima H胞子小体の二次元ゲル解析―抗45k
Da 血清によって識別され、かつリンパ刺激性であるス
ポットの同定 スポット番号 抗p45 血清により識別 リンパ刺激性 11 ＋ − 12 ＋ − 17 ＋ ＋ 18 ＋ − 25 ＋ ＋ 26 ＋ ＋ 27 ＋ − 28 ＋ − 29 ＋ − 34 ＋ − 43 ＋ − 54 ＋ −
Da 血清によって識別され、かつリンパ刺激性であるス
ポットの同定 スポット番号 抗p45 血清により識別 リンパ刺激性 11 ＋ − 12 ＋ − 17 ＋ ＋ 18 ＋ − 25 ＋ ＋ 26 ＋ ＋ 27 ＋ − 28 ＋ − 29 ＋ − 34 ＋ − 43 ＋ − 54 ＋ −
【０１１９】
【表３】E. maxima 攻撃感染からのin vivo 防御―融合
タンパク質pGEX3XEm45/9で免疫感作した鳥と擬似免疫感
作した対照とのオーシスト排出個数比較 鳥番号 オーシスト排出個数（×106 ) 平均 SD 免疫感作グループ 18.7 11.5 1 34.2 2 46.8 3 13.6 4 37.6 5 11.7 6 26.6 7 15.4 8 7.3 9 8.7 11 10.3 12 9.5 13 10.6 14 16.0 15 12.9 16 24.8 17 11.8 18 20.5 擬似免疫感作グループ 33.5 15.1 19 41.9 20 49.1 21 27.1 23 31.2 24 38.1 25 11.4 26 22.1 27 48.5 28 39.3 29 23.3 30 44.4 31 40.5 32 23.0 33 8.5 34 21.0 35 31.3 36 68.2
タンパク質pGEX3XEm45/9で免疫感作した鳥と擬似免疫感
作した対照とのオーシスト排出個数比較 鳥番号 オーシスト排出個数（×106 ) 平均 SD 免疫感作グループ 18.7 11.5 1 34.2 2 46.8 3 13.6 4 37.6 5 11.7 6 26.6 7 15.4 8 7.3 9 8.7 11 10.3 12 9.5 13 10.6 14 16.0 15 12.9 16 24.8 17 11.8 18 20.5 擬似免疫感作グループ 33.5 15.1 19 41.9 20 49.1 21 27.1 23 31.2 24 38.1 25 11.4 26 22.1 27 48.5 28 39.3 29 23.3 30 44.4 31 40.5 32 23.0 33 8.5 34 21.0 35 31.3 36 68.2
【０１２０】
配列番号：１ 配列の長さ：３９２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ ハイポセティカル：ＮＯ アンチセンス：ＮＯ 生物源(1) 生物：Eimeria maxima (2) 株：Houghton (3) 発生段階：スポロゾイト ライブラリー：ラムダZAP IIにクローンされたスポロゾ
イトｃＤＮＡ クローン：Em45-9 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３．．３２９ 配列
イトｃＤＮＡ クローン：Em45-9 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：３．．３２９ 配列
【０１２１】
【化１】
【０１２２】配列番号：２ 配列の長さ：１０９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列
【０１２３】
【化２】
【図１】Ｅ． ｍａｘｉｍａ胞子小体ポリペプチドの、
ウサギ抗ｐ４５抗体で検出したウェスタンブロットを示
す説明図である。
ウサギ抗ｐ４５抗体で検出したウェスタンブロットを示
す説明図である。
【図２】ｐＧＥＸ３ＸＥｍ４５／９発現のウェスタンブ
ロットを示す説明図である。図中、記号ｓｔｄは分子量
の指標（単位ｋＤａ）である。レーン１＝ｐＧＥＸ３Ｘ
Ｅｍ４５／９の一晩培養物。レーン２＝（６００ｎｍで
の）吸光度が０．３となるまで増殖させた培養物（この
時点でＩＰＴＧを濃度１ｍＭとなるように添加）。レー
ン３＝ＩＰＴＧ添加から３．５時間後の培養物。レーン
４＝ＩＰＴＧ誘導培養物を音波処理及び遠心して得られ
た可溶性溶解物。レーン５＝音波処理及び遠心後に得ら
れた、８Ｍ尿素中で可溶性であったペレット。レーン６
＝音波処理及び遠心後に得られた、２％ ＳＤＳ中での
み可溶性であったペレット。
ロットを示す説明図である。図中、記号ｓｔｄは分子量
の指標（単位ｋＤａ）である。レーン１＝ｐＧＥＸ３Ｘ
Ｅｍ４５／９の一晩培養物。レーン２＝（６００ｎｍで
の）吸光度が０．３となるまで増殖させた培養物（この
時点でＩＰＴＧを濃度１ｍＭとなるように添加）。レー
ン３＝ＩＰＴＧ添加から３．５時間後の培養物。レーン
４＝ＩＰＴＧ誘導培養物を音波処理及び遠心して得られ
た可溶性溶解物。レーン５＝音波処理及び遠心後に得ら
れた、８Ｍ尿素中で可溶性であったペレット。レーン６
＝音波処理及び遠心後に得られた、２％ ＳＤＳ中での
み可溶性であったペレット。
【図３】電気溶離したｐＧＥＸ３ＸＥｍ４５／９融合タ
ンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す説明図であ
る。図中、記号ｓｔｄは分子量の指標（単位ｋＤａ）で
ある。レーン１＝ＩＰＴＧ添加から４．５時間後のｐＧ
ＥＸ３ＸＥｍ４５／９の培養物。レーン２＝電気溶離し
た融合タンパク質。レーン３＝１μｌの、（Ａｍｉｃｏ
ｎのＣｅｎｔｒｉｏｎコントラクターで）濃縮した電気
溶離融合タンパク質。レーン４＝５μｌの［３］。レー
ン５＝２０μｌの［３］。水平方向の矢印は図４に示し
た、ニワトリ抗ｐ４５血清によって識別されるタンパク
質を示す。
ンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す説明図であ
る。図中、記号ｓｔｄは分子量の指標（単位ｋＤａ）で
ある。レーン１＝ＩＰＴＧ添加から４．５時間後のｐＧ
ＥＸ３ＸＥｍ４５／９の培養物。レーン２＝電気溶離し
た融合タンパク質。レーン３＝１μｌの、（Ａｍｉｃｏ
ｎのＣｅｎｔｒｉｏｎコントラクターで）濃縮した電気
溶離融合タンパク質。レーン４＝５μｌの［３］。レー
ン５＝２０μｌの［３］。水平方向の矢印は図４に示し
た、ニワトリ抗ｐ４５血清によって識別されるタンパク
質を示す。
【図４】電気溶離したｐＧＥＸ３ＸＥｍ４５／９融合タ
ンパク質の、ニワトリ抗ｐ４５血清で検出したウェスタ
ンブロットを示す説明図である。図中、記号ｓｔｄは分
子量の指標（単位ｋＤａ）である。レーン１＝ＩＰＴＧ
添加から４．５時間後のｐＧＥＸ３ＸＥｍ４５／９の培
養物。レーン２＝電気溶離した融合タンパク質。レーン
３＝１μｌの濃縮した電気溶離融合タンパク質。レーン
４＝５μｌの［３］。レーン５＝２０μｌの［３］。
ンパク質の、ニワトリ抗ｐ４５血清で検出したウェスタ
ンブロットを示す説明図である。図中、記号ｓｔｄは分
子量の指標（単位ｋＤａ）である。レーン１＝ＩＰＴＧ
添加から４．５時間後のｐＧＥＸ３ＸＥｍ４５／９の培
養物。レーン２＝電気溶離した融合タンパク質。レーン
３＝１μｌの濃縮した電気溶離融合タンパク質。レーン
４＝５μｌの［３］。レーン５＝２０μｌの［３］。
【図５】抗原で免疫感作した鳥に由来する細胞に関する
平均刺激指数を擬似免疫感作した鳥に由来する細胞に関
するものと比較して示すグラフである。
平均刺激指数を擬似免疫感作した鳥に由来する細胞に関
するものと比較して示すグラフである。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ポール・パトリツク・ジエイムズ・ダン イギリス国、オツクスフオードシヤー・オ ー・エツクス・44・７・テイー・エル、セ イント・メアリーズ・クローズ・チヤルグ ローブ・２ (72)発明者 ジエンヌ・マリリン・バムステツド イギリス国、オツクスフオードシヤー・オ ー・エツクス・12・９・エイ・エス、ウオ ンテイジ・ベルモント・８ (72)発明者 アルノルドウス・ニコラース・フエルムー レン オランダ国、5431・ハー・ハー・キユーイ ク、コールホエンデールフエルト・34
Claims (16)
- 【請求項１】 配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも
一部を含むことを特徴とするEimeria のＴリンパ球刺激
蛋白質、またはその生物学的に機能性の等価物。 - 【請求項２】 Eimeria の種がEimeria maximaであるこ
とを特徴とする請求項１に記載の蛋白質。 - 【請求項３】 請求項１または２に記載の蛋白質をコー
ドする核酸配列。 - 【請求項４】 核酸配列が配列番号１に記載のＤＮＡ配
列の少なくとも一部を含むことを特徴とする請求項３に
記載の核酸配列。 - 【請求項５】 核酸配列の発現を可能とする発現制御配
列に結合させた請求項３または４に記載の核酸配列を含
む組換え核酸分子。 - 【請求項６】 請求項３または４記載の核酸配列を含む
組換えベクター。 - 【請求項７】 核酸配列が発現制御配列に結合している
ことを特徴とする請求項６に記載の組換えベクター。 - 【請求項８】 請求項３もしくは４に記載の核酸配列、
または請求項５記載の組換え核酸分子、または請求項６
もしくは７に記載の組換えベクター分子で形質転換した
宿主細胞もしくは宿主生物。 - 【請求項９】 請求項８に記載の宿主細胞を培養するこ
とを特徴とする請求項１または２に記載の蛋白質の発現
方法。 - 【請求項１０】 薬物的に許容できる担体と共に、請求
項１または２に記載の蛋白質、請求項５に記載の組換え
核酸分子、請求項６または７に記載の組換えベクター、
あるいは請求項８に記載の宿主細胞または宿主生物を含
むことを特徴とするコクシジウム症に対する家禽の防御
のためのワクチン。 - 【請求項１１】 請求項８に記載の形質転換した宿主細
胞を培養する段階、組換えベクターを集める段階、およ
び組換えベクターを配合することにより免疫活性を有す
る獣医用調製物を形成する段階を含むコクシジウム症ワ
クチンを調製する方法。 - 【請求項１２】 請求項１または２に記載の蛋白質ある
いは請求項９の方法に基づいて調製された蛋白質を配合
することにより免疫活性を有する獣医用調製物を形成す
ることを特徴とするコクシジウム症ワクチンを調製する
方法。 - 【請求項１３】 請求項１または２に記載の蛋白質と免
疫反応性を有する抗体または抗血清。 - 【請求項１４】 免疫化学試薬が支持体に結合している
か、または標識物質と結合していることを特徴とする請
求項１または２に記載の蛋白質を含む免疫化学試薬。 - 【請求項１５】 請求項３または４に記載の核酸配列、
請求項１３に記載の抗体または抗血清、あるいは請求項
１４に記載の免疫化学試薬を含むことを特徴とするEime
ria 感染の診断のためのテストキット。 - 【請求項１６】 請求項１０に記載のワクチンをトリに
投与することを特徴とするコクシジウム症に対する家禽
の防御方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL94202676.6 | 1994-09-16 | ||
| EP94202676 | 1994-09-16 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08127593A true JPH08127593A (ja) | 1996-05-21 |
Family
ID=8217203
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7238902A Pending JPH08127593A (ja) | 1994-09-16 | 1995-09-18 | 家禽コクシジウム症ワクチン |
Country Status (14)
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