JP2002533474A - エル．インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）の４つのタンパク質の抗原決定基をコードするキメラ遺伝子 - Google Patents
エル．インファンタム（Ｌ．ｉｎｆａｎｔｕｍ）の４つのタンパク質の抗原決定基をコードするキメラ遺伝子Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
- A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
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-
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- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
(57)【要約】
本発明は、ヒトまたは動物のリーシュマニア症を予防および処置するための医薬組成物に関する。医薬組成物は、リーシュマニア インフィンタム(Leishmaniainfantum)の４つのタンパク質の抗原決定基をコードするキメラ遺伝子の産物であるタンパク質キメラＱを含む。
Description
【０００１】 （技術分野） 説明 発明の目的 本明細書は、リーシュマニア症、特にイヌのリーシュマニア症の予防または処
置に有用なエル.インファンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原決定基
をコードするDNA配列から形成されるキメラ遺伝子に関する本発明の応用、なら
びに該キメラ遺伝子によりコードされるタンパク質に関する。この明らかな目的
は、患者の体内に存在しうるリーシュマニア症、特にイヌのリーシュマニア症を
予防または処置するための医薬組成物を、例えばワクチンまたはモノクローナル
抗体調製物として提供するために、遺伝子配列またはキメラ遺伝子から得られる
タンパク質を使用することにある。患者はイヌである必要はなく、免疫抑制が関
与する疾患に罹患しているヒトであることもできる。このために、「特別（ad h oc )」に構築されたキメラ遺伝子の「インビトロ」合成から生成されるキメラ生
成物から成る４つの異なるタンパク質の抗原決定基の５つを含むPQと呼ばれるタ
ンパク質をコードするキメラ遺伝子を生成する。この生成物は、例えばイヌのリ
ーシュマニア症に対する防護免疫反応を生じるように、あるいはイヌのリーシュ
マニア症に対する抗体を調製するために高度に感受性が高く、しかも特異的に形
成されている。
置に有用なエル.インファンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原決定基
をコードするDNA配列から形成されるキメラ遺伝子に関する本発明の応用、なら
びに該キメラ遺伝子によりコードされるタンパク質に関する。この明らかな目的
は、患者の体内に存在しうるリーシュマニア症、特にイヌのリーシュマニア症を
予防または処置するための医薬組成物を、例えばワクチンまたはモノクローナル
抗体調製物として提供するために、遺伝子配列またはキメラ遺伝子から得られる
タンパク質を使用することにある。患者はイヌである必要はなく、免疫抑制が関
与する疾患に罹患しているヒトであることもできる。このために、「特別（ad h oc )」に構築されたキメラ遺伝子の「インビトロ」合成から生成されるキメラ生
成物から成る４つの異なるタンパク質の抗原決定基の５つを含むPQと呼ばれるタ
ンパク質をコードするキメラ遺伝子を生成する。この生成物は、例えばイヌのリ
ーシュマニア症に対する防護免疫反応を生じるように、あるいはイヌのリーシュ
マニア症に対する抗体を調製するために高度に感受性が高く、しかも特異的に形
成されている。
【０００２】 発明の分野 本発明は一般に、医薬品製造を目的とする工業的用途を有する。 発明の背景 リーシュマニア属の寄生性原生動物は、世界中に広く分布し、そして様々な臨
床的症状を現すことが特徴である広い範囲の疾患であるリーシュマニア症を引き
起こす病原体である。
床的症状を現すことが特徴である広い範囲の疾患であるリーシュマニア症を引き
起こす病原体である。
【０００３】 リーシュマニア症の主形態は自然な人獣共通伝染病であり、そしてヒトが２次
宿主であると考えられる。
宿主であると考えられる。
【０００４】 多くの地中海沿岸地域に広く分布しているエル.インファンタム(L.infantum)
と名付けられた種が、ヒトおよびイヌの内蔵リーシュマニア症(LV)の原因である
。
と名付けられた種が、ヒトおよびイヌの内蔵リーシュマニア症(LV)の原因である
。
【０００５】 実際に、エル.インファンタム(L.infantum)に感染したイヌは、特に臨床的症
状が観察できるまでの長い潜伏期間、この寄生生物の主な保因者である。
状が観察できるまでの長い潜伏期間、この寄生生物の主な保因者である。
【０００６】 疫学的データは、イヌのリーシュマニア症の有病率とヒトへの寄生生物の伝播
との間に直接的な相関があることを示している。この理由から、疾患の広がりを
抑えるために行われるキャンペーンの初期に、この疾患または感染を検出するに
とが極めて重要である。
との間に直接的な相関があることを示している。この理由から、疾患の広がりを
抑えるために行われるキャンペーンの初期に、この疾患または感染を検出するに
とが極めて重要である。
【０００７】 寄生生物は「サシチョウバエ科（Phlebotominae)」のハエに噛まれることより
、宿主の脊椎動物に有べん毛のプロマスティゴートとして伝播し、そして寄生生
物は単核ファージの細胞に入り、ここでで分化し、そして食胞融解小体構造内で
無鞭毛型として複製する。
、宿主の脊椎動物に有べん毛のプロマスティゴートとして伝播し、そして寄生生
物は単核ファージの細胞に入り、ここでで分化し、そして食胞融解小体構造内で
無鞭毛型として複製する。
【０００８】 感染した細胞は特定の組織（主に脾臓、肝臓およびリンパ節）中に集まる。１
千500万人の人がリーシュマニア症に感染し、そして世界中で毎年500,000人の新
しい症例が世界中、主に未開発および発展途上の国々に現れていると予測される
。
千500万人の人がリーシュマニア症に感染し、そして世界中で毎年500,000人の新
しい症例が世界中、主に未開発および発展途上の国々に現れていると予測される
。
【０００９】 すでに述べたようにヨーロッパの南西部の国々では、内蔵リーシュマニア症(V
L)はエル.インファンタム(L.infantum)種により引き起こされる人獣共通伝染病
である。疫学的研究から最近導かれたデータでは、この感染が警報を発する発生
数であることを示している。
L)はエル.インファンタム(L.infantum)種により引き起こされる人獣共通伝染病
である。疫学的研究から最近導かれたデータでは、この感染が警報を発する発生
数であることを示している。
【００１０】 イタリアでは、この地域のVLの発生率について報告されたデータは14.4％〜37
％の範囲である。
％の範囲である。
【００１１】 ポルトガルでは、より特にリスボンの周辺の地域で、8.4％の血清陽性率が見
いだされ、そして有病率の別の中心であるフランスのマリティーム アルプス地
方では、3.2％から17.1％の間で変動することが分かった。
いだされ、そして有病率の別の中心であるフランスのマリティーム アルプス地
方では、3.2％から17.1％の間で変動することが分かった。
【００１２】 スペインでは、リーシュマニア症の有病率は研究したゾーンに依存する。カタ
ロニアでは、9.3％の平均発生率が観察されたが、幾つかのホット−スポットで
は最高18％の感染したイヌの有病率が見いだされた。
ロニアでは、9.3％の平均発生率が観察されたが、幾つかのホット−スポットで
は最高18％の感染したイヌの有病率が見いだされた。
【００１３】 マヨルカ島で発生率は14％、そして他の見いだされた有病率は：ムルシアで2.
4％。グラナダで8.8％、サマランカで10〜15％、マドリッド州で5.25％そしてカ
セルスで14％。
4％。グラナダで8.8％、サマランカで10〜15％、マドリッド州で5.25％そしてカ
セルスで14％。
【００１４】 エル.インファンタム(L.infantum)により引き起こされるヒトのVLの症例数は
比較的少ないと考えられるが、リーシュマニア属により感染した免疫抑制患者の
高い割合は、イヌにおけるこの病気の高いレベルと関連させることができた。
比較的少ないと考えられるが、リーシュマニア属により感染した免疫抑制患者の
高い割合は、イヌにおけるこの病気の高いレベルと関連させることができた。
【００１５】 実際にヨーロッパの南部では、リーシュマニア症に感染した50％の成人が、HI
Vウイルスに感染した患者でもある。一方で、このようなリーシュマニア属-HIV
同時-感染のデータに従い、（寄生生物による）感染レベルは多数の検出されな
い感染の存在により、この数よりも１または２オーダーの規模で高くなり得ると
予想された。
Vウイルスに感染した患者でもある。一方で、このようなリーシュマニア属-HIV
同時-感染のデータに従い、（寄生生物による）感染レベルは多数の検出されな
い感染の存在により、この数よりも１または２オーダーの規模で高くなり得ると
予想された。
【００１６】 異なる型のリーシュマニア属感染に共通する特徴は、感染が宿主に強力な体液
性応答を誘導することである。したがって現在、血清学的技術に基づく診断法が
最も広く使用されている。
性応答を誘導することである。したがって現在、血清学的技術に基づく診断法が
最も広く使用されている。
【００１７】 このような抗体は自然な、および実験的感染における疾患の無症状期間中でも
検出されると記載された。
検出されると記載された。
【００１８】 この方法の感度および特異性は、使用する抗原の型、起源および純度に依存す
る。現在、商品化されている免疫学的方法では、完全なプロマスティゴートおよ
びこれらから多少なりとも調製された調製物が抗原の起源として使用されている
。この方法は通常、らい病、結核症、アフリカ トリパノソーマ病、シャガス病
、マラリアおよび他の寄生生物症に罹患している患者からの血清と交差反応を導
く。
る。現在、商品化されている免疫学的方法では、完全なプロマスティゴートおよ
びこれらから多少なりとも調製された調製物が抗原の起源として使用されている
。この方法は通常、らい病、結核症、アフリカ トリパノソーマ病、シャガス病
、マラリアおよび他の寄生生物症に罹患している患者からの血清と交差反応を導
く。
【００１９】 血清学的方法の感度および特異性は、使用する抗原の型、起源および純度に依
存する。過去に多数のリーシュマニア属の抗原が特性決定され、その中にはこの
寄生生物に対して特異的なタンパク質であると考えることができるものもある。
存する。過去に多数のリーシュマニア属の抗原が特性決定され、その中にはこの
寄生生物に対して特異的なタンパク質であると考えることができるものもある。
【００２０】 この寄生生物に対して特異的なタンパク質の中で、表面プロテアーゼGP63、表
面グリコプロテインgp46およびリポホスホグリカンが付随したKMP-11タンパク質
を挙げる価値がある。
面グリコプロテインgp46およびリポホスホグリカンが付随したKMP-11タンパク質
を挙げる価値がある。
【００２１】 リーシュマニア属の抗原のさらなる群は、キネシン、熱で誘導されるタンパク
質、アクチンおよびチューブンリンのような進化的に保存されたタンパク質の形
態である。
質、アクチンおよびチューブンリンのような進化的に保存されたタンパク質の形
態である。
【００２２】 リーシュマニア症のイヌのための特異的な血清学的診断システムを開発するた
めの方法の一部として、活性な内蔵リーシュマニア症のイヌの血清を使用した、
エル.インファンタム(L.infantum)の遺伝子の発現ライブラリーの免疫−検出調
査により、エル.インファンタム(L.infantum)の抗原を同定するための研究室で
のプロジェクトが組まれた。
めの方法の一部として、活性な内蔵リーシュマニア症のイヌの血清を使用した、
エル.インファンタム(L.infantum)の遺伝子の発現ライブラリーの免疫−検出調
査により、エル.インファンタム(L.infantum)の抗原を同定するための研究室で
のプロジェクトが組まれた。
【００２３】 この方法により単離された抗原のほとんどが進化の過程で保存されたタンパク
質のファミリーに属することが観察された。しかしこのような抗原のＢエピトー
プの同定では、すべての場合で抗原決定基がよく保存されない領域に位置したこ
とを示す。
質のファミリーに属することが観察された。しかしこのような抗原のＢエピトー
プの同定では、すべての場合で抗原決定基がよく保存されない領域に位置したこ
とを示す。
【００２４】 特に、酸性リボソームタンパク質LiP2aおよびLiP2bがVL血清の80％以上で認識
される。
される。
【００２５】 このようなタンパク質は疾患に特異的な抗原決定基を含み、そしてフラグメン
トが除去された組換え体タンパク質LiP2aおよびLiP2bはVLとシャガス病との間を
区別することができる特異的な道具として使用することができると確認された。
トが除去された組換え体タンパク質LiP2aおよびLiP2bはVLとシャガス病との間を
区別することができる特異的な道具として使用することができると確認された。
【００２６】 また進化的尺度で大変高度に保存されているエル.インファンタム(L.infantum
)のPOリボソームタンパク質は、高い割合のVLのイヌの血清により認識されるこ
とが示された。さらに抗原決定基はタンパク質のＣ−末端に、すなわち進化的過
程でよく保存されなかった領域中に排他的に見いだされる。
)のPOリボソームタンパク質は、高い割合のVLのイヌの血清により認識されるこ
とが示された。さらに抗原決定基はタンパク質のＣ−末端に、すなわち進化的過
程でよく保存されなかった領域中に排他的に見いだされる。
【００２７】 VLのイヌの血清の78％で、H2Aタンパク質に対する抗体も存在することが観察
され、そして真核生物間のすべてのH2Aタンパク質における配列同一性にもかか
わらず、VL血清中のこのタンパク質に対する体液性応答は、リーシュマニア属の
タンパク質H2Aに対して特異的な決定基により特に誘起される。
され、そして真核生物間のすべてのH2Aタンパク質における配列同一性にもかか
わらず、VL血清中のこのタンパク質に対する体液性応答は、リーシュマニア属の
タンパク質H2Aに対して特異的な決定基により特に誘起される。
【００２８】 VLのイヌの血清により認識される抗原決定基は、H2Aタンパク質の両端でも見
いだされる。
いだされる。
【００２９】 当該技術分野で現在遭遇する問題の明らかな解決法は、抗原決定基が豊富なタ
ンパク質を構築するという観点でタンパク質LiP2a、LiP2b、LiPOおよびH2Aに対
して特異的な抗原決定基をコードするDNA領域を含む合成キメラ遺伝子の集成を
可能とする発明である。
ンパク質を構築するという観点でタンパク質LiP2a、LiP2b、LiPOおよびH2Aに対
して特異的な抗原決定基をコードするDNA領域を含む合成キメラ遺伝子の集成を
可能とする発明である。
【００３０】 しかし出願人が知るかぎりでは、所望の目標に到達する観点に於いて理想とし
て記載される特徴を含む発明は現在のところ無い。この目標は、前述のタンパク
質に特異的な抗原決定基をコードするDNA領域を含むキメラ合成遺伝子の集成体
から生成される抗原決定基が豊富なタンパク質の構築である。 発明の記載 第１の観点では、本発明はイヌのリーシュマニア症を予防または処置するため
に有用なエル.インファンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原決定基を
コードするDNA配列により形成されるキメラ遺伝子に関する。
て記載される特徴を含む発明は現在のところ無い。この目標は、前述のタンパク
質に特異的な抗原決定基をコードするDNA領域を含むキメラ合成遺伝子の集成体
から生成される抗原決定基が豊富なタンパク質の構築である。 発明の記載 第１の観点では、本発明はイヌのリーシュマニア症を予防または処置するため
に有用なエル.インファンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原決定基を
コードするDNA配列により形成されるキメラ遺伝子に関する。
【００３１】 さらなる観点では、本発明はキメラ遺伝子によりコードされるエル.インファ
ンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原決定基の１以上を含む該キメラ遺
伝子によりコードされるタンパク質に関する。
ンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原決定基の１以上を含む該キメラ遺
伝子によりコードされるタンパク質に関する。
【００３２】 本発明はさらに、ヒトまたは動物におけるイヌのリーシュマニア症を予防およ
び／または処置するための方法に関する。この治療的方法では、本発明のキメラ
遺伝子またはそれにコードされるタンパク質を使用することができる。また本発
明のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体、またはエピトー
プのようなそれらの抗原性部分を使用することができる。
び／または処置するための方法に関する。この治療的方法では、本発明のキメラ
遺伝子またはそれにコードされるタンパク質を使用することができる。また本発
明のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体、またはエピトー
プのようなそれらの抗原性部分を使用することができる。
【００３３】 さらなる観点において、本発明はヒトおよび／または動物のリーシュマニア症
を予防および／または処置するための医薬組成物に関し、これは本発明のキメラ
遺伝子および／またはそれによりコードされるタンパク質、またはそれらの部分
から誘導される、またはそれらに対する活性物質を含んで成る。活性物質は好ま
しくは、リーシュマニア症の処置および／または予防のための医薬組成物中で使
用できるものである。
を予防および／または処置するための医薬組成物に関し、これは本発明のキメラ
遺伝子および／またはそれによりコードされるタンパク質、またはそれらの部分
から誘導される、またはそれらに対する活性物質を含んで成る。活性物質は好ま
しくは、リーシュマニア症の処置および／または予防のための医薬組成物中で使
用できるものである。
【００３４】 特に医薬組成物は、本発明のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質、ま
たは本発明のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質の１以上の抗原決定基
を含有するそれらの部分を含有するワクチンの状態である。
たは本発明のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質の１以上の抗原決定基
を含有するそれらの部分を含有するワクチンの状態である。
【００３５】 このようにさらなる観点では、本発明は ａ）被験体（ヒトまたは動物）に投与されるタンパク質キメラＱ、または保存さ
れたアミノ酸の修飾もしくは置換を含むこのタンパク質の変異体により、あるい
は ｂ）単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路による任意の生理
学的アジュバントと組み合わされたタンパク質Ｑにより形成される、ヒトまたは
動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物に関する。
れたアミノ酸の修飾もしくは置換を含むこのタンパク質の変異体により、あるい
は ｂ）単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路による任意の生理
学的アジュバントと組み合わされたタンパク質Ｑにより形成される、ヒトまたは
動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物に関する。
【００３６】 また本発明は、 ａ）被験体（ヒトまたは動物）に投与されるタンパク質キメラＱ、またはタンパ
ク質Ｑとは保存されたアミノ酸が異なるこのタンパク質の変異体により、あるい
は ｂ）単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路による生理学的ア
ジュバントと組み合わされたタンパク質Ｑにより形成される、リーシュマニア属
の寄生生物を認識する抗体の生産を刺激することができるワクチンに関する。
ク質Ｑとは保存されたアミノ酸が異なるこのタンパク質の変異体により、あるい
は ｂ）単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路による生理学的ア
ジュバントと組み合わされたタンパク質Ｑにより形成される、リーシュマニア属
の寄生生物を認識する抗体の生産を刺激することができるワクチンに関する。
【００３７】 さらに本発明は、 ａ）完全なまたは断片化したタンパク質LiHsp70と組み合わさった、被験体（ヒ
トまたは動物）に投与されるタンパク質Ｑ、または保存されたアミノ酸の修飾も
しくは置換を含むこのタンパク質の変異体により、あるいは ｂ）単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路による生理学的ア
ジュバントと組み合わされたタンパク質Ｑにより形成される、ヒトまたは動物の
リーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物に関する。
トまたは動物）に投与されるタンパク質Ｑ、または保存されたアミノ酸の修飾も
しくは置換を含むこのタンパク質の変異体により、あるいは ｂ）単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路による生理学的ア
ジュバントと組み合わされたタンパク質Ｑにより形成される、ヒトまたは動物の
リーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物に関する。
【００３８】 さらに別の観点では、本発明は ａ）被験体（ヒトまたは動物）に投与されるタンパク質キメラＱをコードする配
列、またはその配列の保存されたアミノ酸をコードするヌクレオチドの修飾もし
くは置換を含む変異体を担持する任意のDNAベクターにより、あるいは ｂ）腹腔内、皮下または筋肉内経路により投与される、生理学的アジュバントと
組み合わされたタンパク質Ｑを含むDNAベクターにより形成される、ヒトまたは
動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物に関する。
列、またはその配列の保存されたアミノ酸をコードするヌクレオチドの修飾もし
くは置換を含む変異体を担持する任意のDNAベクターにより、あるいは ｂ）腹腔内、皮下または筋肉内経路により投与される、生理学的アジュバントと
組み合わされたタンパク質Ｑを含むDNAベクターにより形成される、ヒトまたは
動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物に関する。
【００３９】 本発明の別の観点は、 ａ） １）タンパク質キメラＱをコードする配列、またはこの配列の保存されたアミノ
酸をコードするヌクレオチドの修飾もしくは置換を含む変異体、および ２）被験体（ヒトまたは動物）に投与される、タンパク質 LiHsp 70をコードす
るヌクレオチドの配列または保存されたアミノ酸に関して異なるそれらの変異体
、を担持する任意のDNAベクターにより、あるいは ｂ）腹腔内、皮下または筋肉内経路による、生理学的アジュバントと投与された
ａ）で定めたようなタンパク質ＱをコードするDNA配列を含む任意のベクターに
より形成される、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のための
医薬組成物に関する。
酸をコードするヌクレオチドの修飾もしくは置換を含む変異体、および ２）被験体（ヒトまたは動物）に投与される、タンパク質 LiHsp 70をコードす
るヌクレオチドの配列または保存されたアミノ酸に関して異なるそれらの変異体
、を担持する任意のDNAベクターにより、あるいは ｂ）腹腔内、皮下または筋肉内経路による、生理学的アジュバントと投与された
ａ）で定めたようなタンパク質ＱをコードするDNA配列を含む任意のベクターに
より形成される、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のための
医薬組成物に関する。
【００４０】 さらなる態様では、本発明の医薬組成物は本発明のキメラ遺伝子によりコード
されるタンパク質またはそれらの一部に対する抗体を含んで成る。
されるタンパク質またはそれらの一部に対する抗体を含んで成る。
【００４１】 本発明の医薬調製物は、医薬組成物および／またはワクチン用の、それ自体は
既知のすべての既知のアジュバント、溶媒、バッファー等をさらに含んでよい。
既知のすべての既知のアジュバント、溶媒、バッファー等をさらに含んでよい。
【００４２】 さらなる観点では、本発明は本発明による医薬組成物またはワクチン、あるい
は本発明のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体を含んで成
る調製物を使用したリーシュマニア症の処置または予防法に関する。
は本発明のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質に対する抗体を含んで成
る調製物を使用したリーシュマニア症の処置または予防法に関する。
【００４３】 この方法は一般に、キメラ遺伝子またはタンパク質に対する活性物質をヒトま
たはイヌのような動物に、特に医薬的に活性な量で投与することを含んで成る。
たはイヌのような動物に、特に医薬的に活性な量で投与することを含んで成る。
【００４４】 リーシュマニア症の予防にはキメラ遺伝子、すなわち１以上の抗原決定基を含
んで成る該タンパク質の１以上の部分をコードするキメラ遺伝子によりコードさ
れるタンパク質を含んで成るワクチンを、防御免疫反応を誘導するヒトに投与す
る。
んで成る該タンパク質の１以上の部分をコードするキメラ遺伝子によりコードさ
れるタンパク質を含んで成るワクチンを、防御免疫反応を誘導するヒトに投与す
る。
【００４５】 本発明の調製物、抗体および／またはワクチン投与は、経口的に、筋肉内に、
静脈内に、皮下に、（点滴）注入法等によるようなそれ自体は既知の様式で行う
ことができる。好ましくは調製物またはワクチンは注射され、一方抗体調製物で
は、注入が使用され得る。
静脈内に、皮下に、（点滴）注入法等によるようなそれ自体は既知の様式で行う
ことができる。好ましくは調製物またはワクチンは注射され、一方抗体調製物で
は、注入が使用され得る。
【００４６】 本明細書で本発明のキメラ遺伝子について言及する時、この用語は中程度また
は緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、以下に述べる配列とハイブリダイズす
ることができる核酸配列も包含することに注意されたい。
は緊縮ハイブリダイゼーション条件下で、以下に述べる配列とハイブリダイズす
ることができる核酸配列も包含することに注意されたい。
【００４７】 これに関連して、ヘテロロガスなハイブリダイゼーション条件は以下の通りで
あり得る：６×SSC（1000mlあたり20×SSC:175.3gのNaCl、107.1gのクエン酸ナ
トリウム・5H2O、pH 7.0）、0.1％ SDS、0.05％ピロリン酸ナトリウム、５★デン
ハーツ溶液（500mlあたり100×デンハーツ溶液:10gのFicoll-400、10gのポリビ
ニルピロリドン、10gのウシ血清アルブミン(ペンタッタス 画分V))および20μg/
mlの変性したニシン精子DNA中で、56℃で18〜24時間インキューベーション、続
いて30分間ずつ２回、５×SSC、0.1％ SDS中にて56℃で洗浄、そして30分間ずつ
２回、２×SSC、0.1％ SDS中にて56℃で洗浄。
あり得る：６×SSC（1000mlあたり20×SSC:175.3gのNaCl、107.1gのクエン酸ナ
トリウム・5H2O、pH 7.0）、0.1％ SDS、0.05％ピロリン酸ナトリウム、５★デン
ハーツ溶液（500mlあたり100×デンハーツ溶液:10gのFicoll-400、10gのポリビ
ニルピロリドン、10gのウシ血清アルブミン(ペンタッタス 画分V))および20μg/
mlの変性したニシン精子DNA中で、56℃で18〜24時間インキューベーション、続
いて30分間ずつ２回、５×SSC、0.1％ SDS中にて56℃で洗浄、そして30分間ずつ
２回、２×SSC、0.1％ SDS中にて56℃で洗浄。
【００４８】 例えば以下に述べる配列とハイブリダイズすることができる配列には、以下に
述べる配列によりコードされるタンパク質と同じ生物活性を持つタンパク質をコ
ードする突然変異体DNA配列を含む。そのような突然変異体配列は以下に述べる
配列に１以上のヌクレオチド欠失、置換および／または付加を含んで成ることが
できる。好ましくは突然変異体配列は以下に与える配列と少なくとも50％、より
好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは90％以上のヌクレオチド相同
性を有する。
述べる配列によりコードされるタンパク質と同じ生物活性を持つタンパク質をコ
ードする突然変異体DNA配列を含む。そのような突然変異体配列は以下に述べる
配列に１以上のヌクレオチド欠失、置換および／または付加を含んで成ることが
できる。好ましくは突然変異体配列は以下に与える配列と少なくとも50％、より
好ましくは少なくとも70％、さらにより好ましくは90％以上のヌクレオチド相同
性を有する。
【００４９】 本明細書で使用する用語であるキメラ遺伝子は、以下に述べる配列の１以上の
部分を含んで成る核酸配列も包含する。好ましくはそのような配列は、以下に与
えるヌクレオチド配列の少なくとも10％、より好ましくは少なくとも30％、より
好ましくは少なくとも50％を含んで成る。そのような配列は以下に述べる配列の
連続的フラグメント、あるいは１つのDNA配列中に組み合わされた、かつ／また
は取り込まれた以下に与える配列の２以上のフラグメントを含んで成ることがで
きる。
部分を含んで成る核酸配列も包含する。好ましくはそのような配列は、以下に与
えるヌクレオチド配列の少なくとも10％、より好ましくは少なくとも30％、より
好ましくは少なくとも50％を含んで成る。そのような配列は以下に述べる配列の
連続的フラグメント、あるいは１つのDNA配列中に組み合わされた、かつ／また
は取り込まれた以下に与える配列の２以上のフラグメントを含んで成ることがで
きる。
【００５０】 本明細書で本発明のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質について言及
する時、この用語は同じ生物学的機能を未だ本質的に有する突然変異体タンパク
質も含むことに注意されたい。そのような突然変異体タンパク質は、以下に述べ
る配列によりコードされるタンパク質に比べて、１以上のアミノ酸欠失、置換お
よび／または付加を含んで成ることができる。好ましくは突然変異体タンパク質
は以下に与える配列と少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、さらに
より好ましくは90％以上のアミノ酸相同性を有する。
する時、この用語は同じ生物学的機能を未だ本質的に有する突然変異体タンパク
質も含むことに注意されたい。そのような突然変異体タンパク質は、以下に述べ
る配列によりコードされるタンパク質に比べて、１以上のアミノ酸欠失、置換お
よび／または付加を含んで成ることができる。好ましくは突然変異体タンパク質
は以下に与える配列と少なくとも50％、より好ましくは少なくとも70％、さらに
より好ましくは90％以上のアミノ酸相同性を有する。
【００５１】 また用語タンパク質は、本発明のキメラ遺伝子によりコードされるタンパク質
のフラグメントも含む。そのようなフラグメントは、好ましくは完全なタンパク
質の生物活性を未だ表す。好ましくはそのようなタンパク質は完全なタンパク質
のアミノ酸配列の少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％を含んで成る
。または本発明のキメラ遺伝子によりコードされる完全なタンパク質の２以上の
フラグメントを組み合わせて１つのタンパク質を形成してもよい。
のフラグメントも含む。そのようなフラグメントは、好ましくは完全なタンパク
質の生物活性を未だ表す。好ましくはそのようなタンパク質は完全なタンパク質
のアミノ酸配列の少なくとも30％、より好ましくは少なくとも50％を含んで成る
。または本発明のキメラ遺伝子によりコードされる完全なタンパク質の２以上の
フラグメントを組み合わせて１つのタンパク質を形成してもよい。
【００５２】 さらに具体的には本発明は、薬理学的目的、特にリーシュマニア症、特にイヌ
のリーシュマニア症の予防および／または処置のために有用なタンパク質をコー
ドする、エル.インファンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原決定基を
コードするDNA配列により形成されるキメラ遺伝子、および最終生成物または選
択した抗原決定基のすべてを含むポリペプチドをコードするキメラ遺伝子の構築
物を得ることに関し、これはタンパク質rLiPO-Ct-Qを発現するクローンを最初の
ベクターとして使用し、そしてこのベクターに適当な制限部位の使用によりタン
パク質LiP2a-Q、LiP2b-Q、LiH2A-Ct-Q、LiH2A-Nt-QをコードするDNAのフラグメ
ントを連続して加え、そしてクローニングの各段階の後、各々の挿入物の正しい
方向が推定され、そして発現生成物のサイズ、pMalベクター中で発現した最終融
合タンパク質であるpPQVのアミノ酸の完全な推定配列は:
のリーシュマニア症の予防および／または処置のために有用なタンパク質をコー
ドする、エル.インファンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原決定基を
コードするDNA配列により形成されるキメラ遺伝子、および最終生成物または選
択した抗原決定基のすべてを含むポリペプチドをコードするキメラ遺伝子の構築
物を得ることに関し、これはタンパク質rLiPO-Ct-Qを発現するクローンを最初の
ベクターとして使用し、そしてこのベクターに適当な制限部位の使用によりタン
パク質LiP2a-Q、LiP2b-Q、LiH2A-Ct-Q、LiH2A-Nt-QをコードするDNAのフラグメ
ントを連続して加え、そしてクローニングの各段階の後、各々の挿入物の正しい
方向が推定され、そして発現生成物のサイズ、pMalベクター中で発現した最終融
合タンパク質であるpPQVのアミノ酸の完全な推定配列は:
【００５３】
【表２】
【００５４】 であることが特徴である。
【００５５】 また本発明は、 ａ−タンパク質キメラＱ、または被験体（ヒトまたは動物）に投与される保存さ
れたアミノ酸の修飾もしくは置換を含むこのタンパク質の変異体により、あるい
は ｂ−単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路を介する任意の生
理学的アジュバントと一緒に形成される、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の
予防および処置のための医薬組成物に関する。
れたアミノ酸の修飾もしくは置換を含むこのタンパク質の変異体により、あるい
は ｂ−単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路を介する任意の生
理学的アジュバントと一緒に形成される、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の
予防および処置のための医薬組成物に関する。
【００５６】 または本発明は、 ａ−タンパク質キメラＱ、または被験体（ヒトまたは動物）に投与される保存さ
れたアミノ酸がタンパク質Ｑとは異なるこのタンパク質の変異体により、あるい
は ｂ−腹腔内、皮下または筋肉内経路を介して単離された状態で、または生理学的
アジュバントと一緒に形成される、リーシュマニア属の寄生生物を認識する抗体
の生産を刺激することができるワクチン。
れたアミノ酸がタンパク質Ｑとは異なるこのタンパク質の変異体により、あるい
は ｂ−腹腔内、皮下または筋肉内経路を介して単離された状態で、または生理学的
アジュバントと一緒に形成される、リーシュマニア属の寄生生物を認識する抗体
の生産を刺激することができるワクチン。
【００５７】 本発明の別の観点は、 ａ−被験体（ヒトまたは動物）に投与される、完全なまたは断片化したタンパク
質LiHsp70と結合したタンパク質キメラＱ、またはこのタンパク質の保存された
アミノ酸の修飾もしくは置換を含む変異体により、あるいは ｂ−単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路を介する生理学的
アジュバントと一緒に形成される、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防お
よび処置のための医薬組成物を含んで成る。
質LiHsp70と結合したタンパク質キメラＱ、またはこのタンパク質の保存された
アミノ酸の修飾もしくは置換を含む変異体により、あるいは ｂ−単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路を介する生理学的
アジュバントと一緒に形成される、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防お
よび処置のための医薬組成物を含んで成る。
【００５８】 さらに ａ−被験体（ヒトまたは動物）に投与されるタンパク質キメラＱをコードする配
列、またはこの配列の保存されたアミノ酸をコードするヌクレオチドの修飾もし
くは置換を含む変異体を持つ任意のDNAベクターにより、あるいは ｂ）筋肉または皮下経路による、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防およ
び処置のための本発明の医薬組成物が形成され得る。
列、またはこの配列の保存されたアミノ酸をコードするヌクレオチドの修飾もし
くは置換を含む変異体を持つ任意のDNAベクターにより、あるいは ｂ）筋肉または皮下経路による、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防およ
び処置のための本発明の医薬組成物が形成され得る。
【００５９】 別の観点では、本発明は ａ− １−タンパク質キメラＱをコードする配列、または保存されたアミノ酸を
コードするヌクレオチドの修飾もしくは置換を含むこの配列の変異体、および ２−被験体（ヒトまたは動物）に投与された、タンパク質 LiHsp 70をコードす
る配列または保存されたアミノ酸に関して異なるその変異体、 を持つ任意のDNAベクターにより、あるいは ｂ−筋肉内、皮下または腹腔内経路により形成される、ヒトまたは動物のリーシ
ュマニア症の予防および処置のための医薬組成物に関する。
コードするヌクレオチドの修飾もしくは置換を含むこの配列の変異体、および ２−被験体（ヒトまたは動物）に投与された、タンパク質 LiHsp 70をコードす
る配列または保存されたアミノ酸に関して異なるその変異体、 を持つ任意のDNAベクターにより、あるいは ｂ−筋肉内、皮下または腹腔内経路により形成される、ヒトまたは動物のリーシ
ュマニア症の予防および処置のための医薬組成物に関する。
【００６０】 また本発明は、薬理学的目的、特にリーシュマニア症、特にイヌのリーシュマ
ニア症の予防および／または処置に有用なヌクレオチド配列およびタンパク質に
関し、この配列はベクターpQ31で発現される以下に示すようなDNAおよびアミノ
酸配列を有する。アミノ酸配列は、ベクターからのフラグメントを含む（AA1-37
)。アミノ酸配列の残りは、MBP部分および最初の７つのアミノ酸(AA 1-7)を除き
配列番号３のアミノ酸配列と同一であり：
ニア症の予防および／または処置に有用なヌクレオチド配列およびタンパク質に
関し、この配列はベクターpQ31で発現される以下に示すようなDNAおよびアミノ
酸配列を有する。アミノ酸配列は、ベクターからのフラグメントを含む（AA1-37
)。アミノ酸配列の残りは、MBP部分および最初の７つのアミノ酸(AA 1-7)を除き
配列番号３のアミノ酸配列と同一であり：
【００６１】
【表３】
【００６２】
【表４】
【００６３】
【表５】
【００６４】 あるいはリーシュマニア症に対してヒトまたは動物に防御免疫応答を生ぜしめる
ために使用することができるそれらの突然変異体またはフラグメント、ならびリ
ーシュマニア症のヒトおよび動物に防御免疫応答を生じるために使用することが
できるこのタンパク質またはそれらの突然変異体またはフラグメントを含んで成
るヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物。こ
のタンパク質は発現ベクターpQE31中の遺伝子PQVの挿入に由来する。ここで該キ
メラ遺伝子は好ましくは分子量38kDおよび等電点7.37で生成するポリペプチドを
コードする。
ために使用することができるそれらの突然変異体またはフラグメント、ならびリ
ーシュマニア症のヒトおよび動物に防御免疫応答を生じるために使用することが
できるこのタンパク質またはそれらの突然変異体またはフラグメントを含んで成
るヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物。こ
のタンパク質は発現ベクターpQE31中の遺伝子PQVの挿入に由来する。ここで該キ
メラ遺伝子は好ましくは分子量38kDおよび等電点7.37で生成するポリペプチドを
コードする。
【００６５】 また本発明は、上記のタンパク質またはヒトおよび動物においてリーシュマニ
ア症に対する防御免疫反応を生ぜしめるために使用することができるそれらの突
然変異体またはフラグメントを含んで成る、リーシュマニア属の寄生生物を認識
する抗体の生産を刺激することができるワクチンに関する。
ア症に対する防御免疫反応を生ぜしめるために使用することができるそれらの突
然変異体またはフラグメントを含んで成る、リーシュマニア属の寄生生物を認識
する抗体の生産を刺激することができるワクチンに関する。
【００６６】 本発明のさらなる観点は、上記タンパク質またはそれらの突然変異体またはフ
ラグメントに対する抗体を含んで成り、好ましくはエピトープのような１以上の
抗原決定基を含む、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のため
の医薬組成物を包含する。
ラグメントに対する抗体を含んで成り、好ましくはエピトープのような１以上の
抗原決定基を含む、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のため
の医薬組成物を包含する。
【００６７】 本発明はさらに、ヒトまたは動物に上記の医薬組成物を投与することを含んで
成る、ヒトまたは動物におけるリーシュマニア症の予防または処置法、あるいは
ヒトまたは動物に上記のワクチンを投与することを含んで成る、ヒトまたは動物
におけるリーシュマニア症の予防法に関する。
成る、ヒトまたは動物におけるリーシュマニア症の予防または処置法、あるいは
ヒトまたは動物に上記のワクチンを投与することを含んで成る、ヒトまたは動物
におけるリーシュマニア症の予防法に関する。
【００６８】 本発明が提案するリーシュマニア症の予防および／または処置に有用なエル.
インファンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原決定基をコードするDNA
配列により形成されるキメラ遺伝子および得られるタンパク質は、本発明により
本来的にその応用分野において明らかな新規性を構成し、タンパク質LiP2a、LiP
2b、LiPOおよびH2Aに特異的な抗原決定基をコードするDNA領域を含む合成のキメ
ラ遺伝子が集成により得られる時、これは抗原決定基が豊富なタンパク質を構成
する。得られたキメラ遺伝子は、大腸菌（Escherichia.coli）中で発現させ、そ
して産物がその抗原性について分析された。その結果からこのキメラタンパク質
が元のタンパク質のすべての抗原決定基を維持し、そして80％〜93％の間で振れ
る感度および96％〜100％の間の特異性を持つイヌのVLのための関連する医薬的
に有用な要素を構成することが確認される。
インファンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原決定基をコードするDNA
配列により形成されるキメラ遺伝子および得られるタンパク質は、本発明により
本来的にその応用分野において明らかな新規性を構成し、タンパク質LiP2a、LiP
2b、LiPOおよびH2Aに特異的な抗原決定基をコードするDNA領域を含む合成のキメ
ラ遺伝子が集成により得られる時、これは抗原決定基が豊富なタンパク質を構成
する。得られたキメラ遺伝子は、大腸菌（Escherichia.coli）中で発現させ、そ
して産物がその抗原性について分析された。その結果からこのキメラタンパク質
が元のタンパク質のすべての抗原決定基を維持し、そして80％〜93％の間で振れ
る感度および96％〜100％の間の特異性を持つイヌのVLのための関連する医薬的
に有用な要素を構成することが確認される。
【００６９】 より詳細には、エル.インファンタム(L.infantum)の４つのタンパク質の抗原
決定基をコードするDNA配列により形成されるキメラ遺伝子およびそれにコード
されるタンパク質は、イヌのリーシュマニア症の予防および／または処置に有用
であり、そして本発明の目的で得られるタンパク質は、以下の工程により生成さ
れる、すなわち： −キメラ遺伝子の構築。方法論。
決定基をコードするDNA配列により形成されるキメラ遺伝子およびそれにコード
されるタンパク質は、イヌのリーシュマニア症の予防および／または処置に有用
であり、そして本発明の目的で得られるタンパク質は、以下の工程により生成さ
れる、すなわち： −キメラ遺伝子の構築。方法論。
【００７０】 クローニング法 ヒストンのタンパク質H2Aの抗原決定基をコードするDNA配列のクローニング。
【００７１】 rLiP2a-QおよびrLiP2b-Qをコードする配列のクローニング。
【００７２】 配列rLiPO-Qのクローニング。
【００７３】 キメラ遺伝子のクローニング。 −中間産物の構成物からのキメラ遺伝子の構築。
【００７４】 エル．インファンタム（小児リーシュマニア）抗原に特異的なエピトープのク
ローニング −最終産物の構築 すべての選択した抗原決定基を含むポリペプチドをコードするキメラ遺伝子の
構築 −このようにして得られた配列の随意の発現 −最終産物の評価 血清 タンパク質の精製 タンパク質の電気泳動および免疫学的分析 ＦＡＳＴ ＥＬＩＳＡによる測定 −最終産物の評価 抗原的性質 イヌＶＬの血清診断におけるキメラタンパク質ＣＰの感度および特異性 選択された抗原決定基のそれぞれ１個をコードするＤＮＡ配列のクローニング
が後に続く戦略は、すべての場合に同様であり、そして第一段階では、関係する
配列をＰＣＲによりそして最末端で制限酵素の標的を含む特異性オリゴヌクレオ
チドを用いて増幅する。
ローニング −最終産物の構築 すべての選択した抗原決定基を含むポリペプチドをコードするキメラ遺伝子の
構築 −このようにして得られた配列の随意の発現 −最終産物の評価 血清 タンパク質の精製 タンパク質の電気泳動および免疫学的分析 ＦＡＳＴ ＥＬＩＳＡによる測定 −最終産物の評価 抗原的性質 イヌＶＬの血清診断におけるキメラタンパク質ＣＰの感度および特異性 選択された抗原決定基のそれぞれ１個をコードするＤＮＡ配列のクローニング
が後に続く戦略は、すべての場合に同様であり、そして第一段階では、関係する
配列をＰＣＲによりそして最末端で制限酵素の標的を含む特異性オリゴヌクレオ
チドを用いて増幅する。
【００７５】 クローニング段階では、増幅された産物は、適当な制限酵素により指令され、
そしてプラスミドｐＵＣ１８の相当する制限部位内に挿入される。
そしてプラスミドｐＵＣ１８の相当する制限部位内に挿入される。
【００７６】 ＤＮＡを配列決定した後、挿入物を回収しそしてｐＭＡＬ−ｃ２と名付けた変
性プラスミドの相当する制限部位にサブクローニングする。変性は、ｐＭａ１−
ｃ２のポリリンカー内の標的ＨｉｎｄＩＩＩの下流側に終止コドンを挿入して作
製され、得られたプラスミドをｐＭＡＬ−ｃ２’と呼ぶ。
性プラスミドの相当する制限部位にサブクローニングする。変性は、ｐＭａ１−
ｃ２のポリリンカー内の標的ＨｉｎｄＩＩＩの下流側に終止コドンを挿入して作
製され、得られたプラスミドをｐＭＡＬ−ｃ２’と呼ぶ。
【００７７】 ヒストンタンパク質Ｈ２Ａの抗原決定基をコードするＤＮＡ配列のクローニン
グに関して、エル．インファンタムのヒストンＨ２ＡをコードするクローンｃＬ
７１のｃＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型として使用し、そしてヒストンＨ２Ａ、さら
に正確にはｒＬｉＨ２Ａ−Ｎｔ−ＱのＮ−末端領域をコードするＤＮＡの増幅の
ために、下記のオリゴヌクレオチドが使用されることを指摘しなければならない
：センス ５’−ＣＣＴＴＴＡＧＣＴＡＣＴＣＣＴＣＧＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧ−
３’（配列ｃＬ７１の位置８４−１０４）、アンチセンス ５’−ＣＣＴＧＧＧ
ＧＧＣＧＣＣＡＧＡＧＧＣＡＣＣＧＡＴＧＣＧ−３（配列ｃＬ７１の位置２０４
−２２４の逆で相補的）。
グに関して、エル．インファンタムのヒストンＨ２ＡをコードするクローンｃＬ
７１のｃＤＮＡをＰＣＲ反応の鋳型として使用し、そしてヒストンＨ２Ａ、さら
に正確にはｒＬｉＨ２Ａ−Ｎｔ−ＱのＮ−末端領域をコードするＤＮＡの増幅の
ために、下記のオリゴヌクレオチドが使用されることを指摘しなければならない
：センス ５’−ＣＣＴＴＴＡＧＣＴＡＣＴＣＣＴＣＧＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧ−
３’（配列ｃＬ７１の位置８４−１０４）、アンチセンス ５’−ＣＣＴＧＧＧ
ＧＧＣＧＣＣＡＧＡＧＧＣＡＣＣＧＡＴＧＣＧ−３（配列ｃＬ７１の位置２０４
−２２４の逆で相補的）。
【００７８】 クローニングのためのオリゴヌクレオチド内に含まれそして親配列ｃＬ−７１
内には含まれない配列を太字で表す。
内には含まれない配列を太字で表す。
【００７９】 増幅されたＤＮＡ断片は、ｐＭＡＩ−ｃ２’の制限部位ＸｍｎＩから直接クロ
ーニングされる。
ーニングされる。
【００８０】 断片は、イニシエーター＃１２３４ ｍａｌＥを用いて配列決定され。そして
ヒストンＨ２Ａの抗原Ｃ−末端領域、具体的にはｒＬｉＨ２Ａ−Ｃｔ−Ｑは、下
記のオリゴヌクレオチドを用いて増幅される。これらは下記である。 センス ５’−ＧＡＡＴＴＣＴＣＣＧＴＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧ−３’
（配列ｃＬ７１の位置２７６−２９６）、 アンチセンス ５’ＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＧＣＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＧＣＣＴＴ
ＧＣＣ−３’（プラスミドｃＬ７１の位置４５６−４７６の逆で相補的）。
ヒストンＨ２Ａの抗原Ｃ−末端領域、具体的にはｒＬｉＨ２Ａ−Ｃｔ−Ｑは、下
記のオリゴヌクレオチドを用いて増幅される。これらは下記である。 センス ５’−ＧＡＡＴＴＣＴＣＣＧＴＡＡＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＧ−３’
（配列ｃＬ７１の位置２７６−２９６）、 アンチセンス ５’ＧＡＡＴＴＣＧＧＧＣＧＣＧＣＴＣＧＧＴＧＴＣＧＣＣＴＴ
ＧＣＣ−３’（プラスミドｃＬ７１の位置４５６−４７６の逆で相補的）。
【００８１】 プロリンをコードするトリプレット（下線を付した文字の後にＧＧＧとして示
される）が、アンチセンスオリゴヌクレオチド内に含まれ、クローニングのため
の両方のオリゴヌクレオチド内に含まれる制限部位ＥｃｃＲＩを下線で示す。
される）が、アンチセンスオリゴヌクレオチド内に含まれ、クローニングのため
の両方のオリゴヌクレオチド内に含まれる制限部位ＥｃｃＲＩを下線で示す。
【００８２】 ｒＬｉＰ２ａ−Ｑをコードする配列のクローニングに関して、関係する領域は
、ＬｉＰ２ａおよびＬｉＰ２ｂをコードするｃＤＮＡからのＰＣＲにより増幅さ
れることを指摘しなればならない。
、ＬｉＰ２ａおよびＬｉＰ２ｂをコードするｃＤＮＡからのＰＣＲにより増幅さ
れることを指摘しなればならない。
【００８３】 発現クローンＬｉＰ２ａ−Ｑを構築するために使用されるオリゴヌクレオチド
は、下記である。
は、下記である。
【００８４】 センス ５’−ＧＴＣＧＡＣＣＣＣＡＴＧＣＡＧＴＡＣＣＴＣＧＣＣＧＣＧＴ
ＡＣ−３’、 アンチセンス ５’−ＧＴＣＧＡＣＧＧＧＧＣＣＣＡＴＧＴＣＡＴＣＡＴＣＧ
ＧＣＣＴＣ−３’。
ＡＣ−３’、 アンチセンス ５’−ＧＴＣＧＡＣＧＧＧＧＣＣＣＡＴＧＴＣＡＴＣＡＴＣＧ
ＧＣＣＴＣ−３’。
【００８５】 オリゴヌクレオチドの５’最末端に付加されたＳａｌＩ制限部位を下線付けし
たことを指摘しなければならない。
たことを指摘しなければならない。
【００８６】 発現クローンＬｉＰ２ｂ−Ｑを構築する場合に、使用されたオチゴヌクレオチ
ドは下記である。
ドは下記である。
【００８７】 センス５’−ＴＧＴＡＧＡＣＣＣＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣ
ＧＣＣ−３’、 アンチセンス ＴＣＴＡＧＡＧＧＧＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＣＣＴ
Ｃ−３’。
ＧＣＣ−３’、 アンチセンス ＴＣＴＡＧＡＧＧＧＧＣＣＡＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣＧＧＣＣＴ
Ｃ−３’。
【００８８】 オリゴヌクレオチドの５’最末端に酵素ＸｂａＩ（下線部）に対する制限部位
が含まれ、そしてクローニングの必要性から、プロリン残基をコードする追加の
トリプレットが制限部位の下流側に含まれる。
が含まれ、そしてクローニングの必要性から、プロリン残基をコードする追加の
トリプレットが制限部位の下流側に含まれる。
【００８９】 配列ＬｉＰＯ−Ｑのクローニングに関して、エル．インファンタムのタンパク
質ＰＯのＣ−末端領域のＤＮＡ配列のクローニングが、Ｌ２７と呼ばれ、下記の
配列を有するｃＤＮＡのクローンを増幅することにより行われることを指摘しな
ければならない。
質ＰＯのＣ−末端領域のＤＮＡ配列のクローニングが、Ｌ２７と呼ばれ、下記の
配列を有するｃＤＮＡのクローンを増幅することにより行われることを指摘しな
ければならない。
【００９０】 センス５’−ＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＣＣＧＣ
Ｃ−３’（Ｌ２７ｃＤＮＡの位置１−２４）、およびｐＵＣ１８配列のイニシエ
ーター（＃１２１１）、増幅されたＤＮＡは、酵素ＰｓｔＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩに
より指令され、その後プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２内に挿入される。
Ｃ−３’（Ｌ２７ｃＤＮＡの位置１−２４）、およびｐＵＣ１８配列のイニシエ
ーター（＃１２１１）、増幅されたＤＮＡは、酵素ＰｓｔＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩに
より指令され、その後プラスミドｐＭＡＬ−ｃ２内に挿入される。
【００９１】 得られたクローンをｐＰＱＩと呼び、そして制限部位ＰｓｔＩがセンス方向で
ヌクレオチド内に含まれ（下線付き配列）そして制限標的ＨｉｎｄＩＩＩがｃＤ
ＮＡＬ２７内に存在することに注意しなければならない。
ヌクレオチド内に含まれ（下線付き配列）そして制限標的ＨｉｎｄＩＩＩがｃＤ
ＮＡＬ２７内に存在することに注意しなければならない。
【００９２】 キメラ遺伝子のクローニングに関して、５個の抗原決定基をコードするＤＮＡ
配列が一個のキメラ遺伝子に構築され、そしてこの構築はクローンｐＰＱＩ上で
行われ、これに抗原領域ＬｉＰ２ａ−Ｑに対するコード化領域が、３’方向に順
番に（クローニングｐＰＱＩＩの結果の名称）、ＬｉＰ２ｂ−Ｑ（クローンｐＰ
ＱＩＩＩ）、ＬｉＨ２ａ−Ｃｔ−Ｑ（クローンｐＰＱＩＶ）およびＬｉＨ２Ａ−
Ｎｔ−Ｑ（クローンｐＰＱＶ）に付加されることを指摘しなければならない。
配列が一個のキメラ遺伝子に構築され、そしてこの構築はクローンｐＰＱＩ上で
行われ、これに抗原領域ＬｉＰ２ａ−Ｑに対するコード化領域が、３’方向に順
番に（クローニングｐＰＱＩＩの結果の名称）、ＬｉＰ２ｂ−Ｑ（クローンｐＰ
ＱＩＩＩ）、ＬｉＨ２ａ−Ｃｔ−Ｑ（クローンｐＰＱＩＶ）およびＬｉＨ２Ａ−
Ｎｔ−Ｑ（クローンｐＰＱＶ）に付加されることを指摘しなければならない。
【００９３】 最後に、最終クローンｐＰＱＶのＳａｃＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ消化後に得られる
挿入物は、ｐＱＥ３１発現プラスミド内に挿入され、得られたクローンをｐＰＱ
と名付ける。
挿入物は、ｐＱＥ３１発現プラスミド内に挿入され、得られたクローンをｐＰＱ
と名付ける。
【００９４】
イヌリーシュマニア症の血清学的診断のために使用できるエル．インファンタ
ムの４種のタンパク質の抗原決定基をコードするＤＮＡ配列から形成されたキメ
ラ遺伝子および提出する得られたタンパク質は、中間産物の構築物から構成され
る。第一の例では、エル．インファンタムの抗原に特異性のエピトープのクロー
ニングを行い、これはエル．インファンタムの４種のタンパク質抗原（ＬｉＰ２
ａ、ＰｉＰＯ、ＬｉＰ２ｂ、ＬｉＨ２ａ）の抗原性に関する以前の研究に基づい
て構成され、これはこれらのタンパク質に対して特定されるＢエピトープの存在
を許容し、そしてこれはＶＬのイヌ血清により特異的に認識される。
ムの４種のタンパク質の抗原決定基をコードするＤＮＡ配列から形成されたキメ
ラ遺伝子および提出する得られたタンパク質は、中間産物の構築物から構成され
る。第一の例では、エル．インファンタムの抗原に特異性のエピトープのクロー
ニングを行い、これはエル．インファンタムの４種のタンパク質抗原（ＬｉＰ２
ａ、ＰｉＰＯ、ＬｉＰ２ｂ、ＬｉＨ２ａ）の抗原性に関する以前の研究に基づい
て構成され、これはこれらのタンパク質に対して特定されるＢエピトープの存在
を許容し、そしてこれはＶＬのイヌ血清により特異的に認識される。
【００９５】 エル．インファンタムのタンパク質に関するこれらの抗原の抗原的特異性を改
善する観点をもって、特異性抗原決定基をこれらのタンパク質からクローニング
する。これらのタンパク質の一定の領域を除いた後、これらは、ＶＬおよびその
他の種々の疾患のキャリヤーである動物からの血清により認識できる。
善する観点をもって、特異性抗原決定基をこれらのタンパク質からクローニング
する。これらのタンパク質の一定の領域を除いた後、これらは、ＶＬおよびその
他の種々の疾患のキャリヤーである動物からの血清により認識できる。
【００９６】 特異性オリゴヌクレオチドを用いそして遺伝子ＬｉＰ２ａ、ＬｉＰ２ｂ、ＰＯ
およびＨ２Ａに特異性の領域のＰＣＲ増幅により、組換えタンパク質ｒＬｉＰＯ
−Ｃｔ−Ｑ、ｒＬｉＰ２ａ−Ｑ、ｒＬｉＰ２ｂ−Ｑ、ｒＬｉＨ２Ａ−Ｃｔ−Ｑお
よびｒＬｉＨ２Ａ−Ｎｔ−Ｑを発現する数種のクローンが構築され、これらはク
ローニングの詳細が記載されている方法に関する本発明の説明の部分に詳細に記
載されている。
およびＨ２Ａに特異性の領域のＰＣＲ増幅により、組換えタンパク質ｒＬｉＰＯ
−Ｃｔ−Ｑ、ｒＬｉＰ２ａ−Ｑ、ｒＬｉＰ２ｂ−Ｑ、ｒＬｉＨ２Ａ−Ｃｔ−Ｑお
よびｒＬｉＨ２Ａ−Ｎｔ−Ｑを発現する数種のクローンが構築され、これらはク
ローニングの詳細が記載されている方法に関する本発明の説明の部分に詳細に記
載されている。
【００９７】 使用された組換えタンパク質は、下記である。 −ｒＬｉＰＯ−Ｃｔ−Ｑ、これはリボソームタンパク質ＬｉＰＯの３０個のＣ−
末端残基に相当する。 −ｒＬｉＰ２ａ−ＱおよびｒＬｉＰ２ｂ−Ｑ、これらはそれぞれリボソームタン
パク質ＬｉＰ２ａおよびｒＬｉＰ２ｂから誘導される。 −ヒストンＨ２Ａの２個のサブ領域、これらは４６個のＮ−末端残基（ｘＬｉＨ
２Ａ−Ｎｔ−Ｑ）および６７個のＣ−末端残基（残基（ｘＬｉＨ２Ａ−Ｃｔ−Ｑ
））に相当する。
末端残基に相当する。 −ｒＬｉＰ２ａ−ＱおよびｒＬｉＰ２ｂ−Ｑ、これらはそれぞれリボソームタン
パク質ＬｉＰ２ａおよびｒＬｉＰ２ｂから誘導される。 −ヒストンＨ２Ａの２個のサブ領域、これらは４６個のＮ−末端残基（ｘＬｉＨ
２Ａ−Ｎｔ−Ｑ）および６７個のＣ−末端残基（残基（ｘＬｉＨ２Ａ−Ｃｔ−Ｑ
））に相当する。
【００９８】 マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に融合した組換えタンパク質のそれぞれ
は、大腸菌(E. coli) 内で発現され（図１Ａに図示）、そしてこれらはアミロー
スカラムＢ上でアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。精製工程
の後、組換えタンパク質に関して電気泳動を行った（レーン１〜５）。
は、大腸菌(E. coli) 内で発現され（図１Ａに図示）、そしてこれらはアミロー
スカラムＢ上でアフィニティークロマトグラフィーにより精製された。精製工程
の後、組換えタンパク質に関して電気泳動を行った（レーン１〜５）。
【００９９】 組換えタンパク質がＶＬイヌ血清により認識されたかどうかを分析する目的で
、３種のＶＬイヌ血清の混合物内の組換えタンパク質を含むウエスタンブロット
をインキュベーションした。これらのタンパク質すべてが血清により認識された
場合には、親タンパク質中に存在する抗原決定基は、組換えタンパク質（Ｃ）中
に維持されていると結論される。
、３種のＶＬイヌ血清の混合物内の組換えタンパク質を含むウエスタンブロット
をインキュベーションした。これらのタンパク質すべてが血清により認識された
場合には、親タンパク質中に存在する抗原決定基は、組換えタンパク質（Ｃ）中
に維持されていると結論される。
【０１００】 組換えタンパク質の抗原性を、ＦＡＳＴ ＥＬＩＳＡを用いて２６個のＶＬイ
ヌ血清のコレクションに対して試験して、親抗原の抗原決定基と比較し（図１Ｄ
に示す）、そして血清が選択された領域および相当する完全タンパク質の両方に
対して類似した反応性値を示すという事実は、クローニング操作の間に抗原エピ
トープへの改変が起きていないことを確認する。
ヌ血清のコレクションに対して試験して、親抗原の抗原決定基と比較し（図１Ｄ
に示す）、そして血清が選択された領域および相当する完全タンパク質の両方に
対して類似した反応性値を示すという事実は、クローニング操作の間に抗原エピ
トープへの改変が起きていないことを確認する。
【０１０１】 最終産物、さらに正確には選択された抗原決定基すべてを含むポリペプチドを
コードするキメラ遺伝子の構築に関して、クローニング戦略が図２のＡに示され
ていることを指摘しなければならない。プロセスの間に産生した中間産物を示す
。
コードするキメラ遺伝子の構築に関して、クローニング戦略が図２のＡに示され
ていることを指摘しなければならない。プロセスの間に産生した中間産物を示す
。
【０１０２】 タンパク質ｒＬｉＰＯ−Ｃｔ−Ｑ（ｐＰＱＩ）を発現するクローンは、初期ベ
クターとして使用され、そしてタンパク質ｒＬｉＰＯ−Ｃｔ−Ｑ、ｒＬｉＰ２ａ
−Ｑ、ｒＬｉＰ２ｂ−Ｑ、ｒＬｉＨ２Ａ−Ｃｔ−ＱおよびｒＬｉＨ２Ａ−Ｎｔ−
ＱをコードするＤＮＡ断片を適当な制限部位を用いて順番に付加する。
クターとして使用され、そしてタンパク質ｒＬｉＰＯ−Ｃｔ−Ｑ、ｒＬｉＰ２ａ
−Ｑ、ｒＬｉＰ２ｂ−Ｑ、ｒＬｉＨ２Ａ−Ｃｔ−ＱおよびｒＬｉＨ２Ａ−Ｎｔ−
ＱをコードするＤＮＡ断片を適当な制限部位を用いて順番に付加する。
【０１０３】 それぞれのクローニング段階の後に、それぞれ挿入物の正確な方向を発現産物
の大きさから導出し、そして最終的に最終クローンｐＰＱＶの完全ヌクレオチド
配列を決定しそしてアミノ酸配列は図３中に記載した配列から導出する。
の大きさから導出し、そして最終的に最終クローンｐＰＱＶの完全ヌクレオチド
配列を決定しそしてアミノ酸配列は図３中に記載した配列から導出する。
【０１０４】 産生したポリペプチドは、分子量３８ｋＤａ、等電点７．３７を有し、図３で
下線を付したプロリンをコードするスペーサー配列を有する。これを行う目的は
、抗原ドメインを効率的に分離しそして最終産物の安定性および抗原性に妨害と
なる可能性があると考えられる三次構造を避けるためである。
下線を付したプロリンをコードするスペーサー配列を有する。これを行う目的は
、抗原ドメインを効率的に分離しそして最終産物の安定性および抗原性に妨害と
なる可能性があると考えられる三次構造を避けるためである。
【０１０５】 中間産物それぞれの発現および回収を、図４のボックスＡおよびＢに示す。予
想されるように、それぞれの付加の後に、ベクターｐＭＡＬ内の発現産物の大き
さは、８０ｋＤａに達するまで段々と増加し、精製の間にある程度の破壊が観察
される。
想されるように、それぞれの付加の後に、ベクターｐＭＡＬ内の発現産物の大き
さは、８０ｋＤａに達するまで段々と増加し、精製の間にある程度の破壊が観察
される。
【０１０６】 キメラ遺伝子も、最末端のＮ−末端における６ヒスチジンの断片を用いるタン
パク質の発現を許容するベクターであるプラスミドｐＱＥ内にクローニングした
。得られたクローンおよび組換えタンパク質は、それぞれｐＰＱおよびＰＱと呼
ぶ。
パク質の発現を許容するベクターであるプラスミドｐＱＥ内にクローニングした
。得られたクローンおよび組換えタンパク質は、それぞれｐＰＱおよびＰＱと呼
ぶ。
【０１０７】 ｐＰＱプラスミドを用いて形質転換した細菌内のタンパク質の発現のレベルお
よび精製したタンパク質を図４で特にＤと呼ぶ部分に示し、変性した条件でアフ
ィニティクロマトグラフィーにより精製したタンパク質ＰＱは、図４のボックス
Ｄ、レーン２内に示す組換えタンパク質ｐＰＱＶより安定である。
よび精製したタンパク質を図４で特にＤと呼ぶ部分に示し、変性した条件でアフ
ィニティクロマトグラフィーにより精製したタンパク質ＰＱは、図４のボックス
Ｄ、レーン２内に示す組換えタンパク質ｐＰＱＶより安定である。
【０１０８】 最終産物を評価するために、一連の材料および以下に記載する明らかに幾つか
の技術を使用した。
の技術を使用した。
【０１０９】 種々の起源のイヌから得たＶＬの血清を使用した。動物は適切な研究所、一般
的には寄生虫学部において臨床的および解析的に評価し、そしてすべての陽性血
清を間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）により試験した。
的には寄生虫学部において臨床的および解析的に評価し、そしてすべての陽性血
清を間接免疫蛍光法（ＩＩＦ）により試験した。
【０１１０】 これらの動物の寄生虫のアマスチゴートの存在は、膝窩およびプリースカピュ
ラー(pleescapular)リンパ節の直接観察により確認し、そして他の領域に起源す
るＶＬの３３個の血清の第二の群は、寄生虫の全タンパク質抽出物に対するＥＬ
ＩＳＡおよび／またはＩＩＦにより陽性診断が与えられた。
ラー(pleescapular)リンパ節の直接観察により確認し、そして他の領域に起源す
るＶＬの３３個の血清の第二の群は、寄生虫の全タンパク質抽出物に対するＥＬ
ＩＳＡおよび／またはＩＩＦにより陽性診断が与えられた。
【０１１１】 ＶＬではない種々の疾患により冒されたイヌの血清を種々の起源から入手した
。この群の中で、下記の感染からの血清が見いだされた。
。この群の中で、下記の感染からの血清が見いだされた。
【０１１２】 中擬条虫属(Mesocestoides spp.) ディフィリディウム・カニヌム(Dyphylidium caninum) 狭頭鉤虫(Uncinaria stenocephala) イヌ回虫(Toxocara canis) ディペタロネーマ・ドラヌンクロイデス(Dipetalonema dranunculoides) イヌ・ニキビダニ(Demodex canis) イヌ・バベシア(Babesia canis) イヌ・エールリヒア(Ehrlichia canis) リケッチア(Ricketsia ricketsiae) 残りの血清は、いかなる感染過程にも関連がない種々の臨床症状を示すイヌか
ら得て、そして血清対照は、１５頭の注意深く養育した健康な動物から得た。
ら得て、そして血清対照は、１５頭の注意深く養育した健康な動物から得た。
【０１１３】 クローニングしたｐＭＡ１−ｃ２により発現された組換えタンパク質の精製は
、アミロースカラム上のアフィニティクロマトグラフィーにより行い、そしてク
ローンｐＰＱにより発現された組換えタンパク質の精製は、変性条件におけるＮ
ｉ−ＮＴＡ樹脂カラム上で行った（キアジェン(Qiagen)）。
、アミロースカラム上のアフィニティクロマトグラフィーにより行い、そしてク
ローンｐＰＱにより発現された組換えタンパク質の精製は、変性条件におけるＮ
ｉ−ＮＴＡ樹脂カラム上で行った（キアジェン(Qiagen)）。
【０１１４】 タンパク質分析のために、ＳＤＳの存在下での１０％ポリアクリミドゲル上の
電気泳動を標準条件下で行った。電気泳動で分離されたタンパク質の免疫学的分
析は、タンパク質を移行させたニトロセルロース膜上で行った。移行したタンパ
ク質を、０．５％ツイーン(Tween) ２０を含むＰＢＳ緩衝液中の乾燥５％脱脂乳
を用いてブロックした。
電気泳動を標準条件下で行った。電気泳動で分離されたタンパク質の免疫学的分
析は、タンパク質を移行させたニトロセルロース膜上で行った。移行したタンパ
ク質を、０．５％ツイーン(Tween) ２０を含むＰＢＳ緩衝液中の乾燥５％脱脂乳
を用いてブロックした。
【０１１５】 ブロッキング溶液内で一次および二次抗血清にフィルターを順番に接触させ、
そしてペルオキシダーゼで標識した免疫複合体を第二抗体として用い、ＥＣＬシ
ステムを用いて特異性結合を可視化した。図４Ｅはタンパク質ＰＱのウエスタン
ブロットを示す。
そしてペルオキシダーゼで標識した免疫複合体を第二抗体として用い、ＥＣＬシ
ステムを用いて特異性結合を可視化した。図４Ｅはタンパク質ＰＱのウエスタン
ブロットを示す。
【０１１６】 従来のＥＬＩＳＡの代わりにＦａｓｔ−ＥＬＩＳＡを用い、そして抗原の増感
は、１２時間、室温で行った。
は、１２時間、室温で行った。
【０１１７】 すべての場合に濃度が２μｇ／ｍｌである抗原１００μｌを用いて平板を増感
した。
した。
【０１１８】 ウエル増感の後、平板を１時間、ブロッキング溶液（ＰＢＳ−０．５％ツイー
ン２０中に溶かした０．５％脱脂粉乳、そして血清をブロッキング溶液中で３０
０倍に希釈した）と一緒にインキュベーションした。
ン２０中に溶かした０．５％脱脂粉乳、そして血清をブロッキング溶液中で３０
０倍に希釈した）と一緒にインキュベーションした。
【０１１９】 ウエルを血清と一緒に２時間、室温でインキュベーションし、そして抗体に暴
露した後、ウエルをＰＢＳ−ツイーン２０を用いて洗浄した。
露した後、ウエルをＰＢＳ−ツイーン２０を用いて洗浄した。
【０１２０】 ペルオキシダーゼで標識した抗体を希釈度１：２０００で第二抗体として使用
し、そして反応物の色を基質オルトフェニレンジアミンを用いて発色させ、４５
０ｎｍにおける吸光を測定した。
し、そして反応物の色を基質オルトフェニレンジアミンを用いて発色させ、４５
０ｎｍにおける吸光を測定した。
【０１２１】 最終産物の評価に関して、キメラタンパク質に対しておよび「ウエスタンブロ
ット」アッセイにおける中間産物のそれぞれに対してＶＬイヌ血清の反応性の適
切な試験により、抗原性を決定したことを指摘しなければならない。すべての中
間産物が、全クローニングプロセスの間、その抗原性を維持し同様に最終ｐＰＱ
Ｖ産物も維持した（図４Ｃ）。
ット」アッセイにおける中間産物のそれぞれに対してＶＬイヌ血清の反応性の適
切な試験により、抗原性を決定したことを指摘しなければならない。すべての中
間産物が、全クローニングプロセスの間、その抗原性を維持し同様に最終ｐＰＱ
Ｖ産物も維持した（図４Ｃ）。
【０１２２】 ｐＰＱプラスミドにより発現された組換えタンパク質は、ＶＬ血清により認識
されたことも指摘しなければならない。さらに高い精度を有する分析を考慮して
、キメラタンパク質および中間産物の抗原性、ＶＬイヌの各種の反応性の分析は
、組換えタンパク質に対するＦａｓｔ−ＥＬＩＳＡにより行われ、これを図４の
Ｆに示す。クローニングの種々の中間産物の感度は、各付加段階ごとに上昇する
ことが強調できる。タンパク質ｐＱＩが大部分のＶＬ血清により認識され、そし
てタンパク質ＰＱＩＩが同様に大部分の血清により認識されたことも指摘しなけ
ればならない。この比率はタンパク質ＰＱＩＩＩの方が大きく、そしてタンパク
質ＰＱＩＶ、ＰＱＶおよびＰＱは、実際的にすべての血清により認識される。
されたことも指摘しなければならない。さらに高い精度を有する分析を考慮して
、キメラタンパク質および中間産物の抗原性、ＶＬイヌの各種の反応性の分析は
、組換えタンパク質に対するＦａｓｔ−ＥＬＩＳＡにより行われ、これを図４の
Ｆに示す。クローニングの種々の中間産物の感度は、各付加段階ごとに上昇する
ことが強調できる。タンパク質ｐＱＩが大部分のＶＬ血清により認識され、そし
てタンパク質ＰＱＩＩが同様に大部分の血清により認識されたことも指摘しなけ
ればならない。この比率はタンパク質ＰＱＩＩＩの方が大きく、そしてタンパク
質ＰＱＩＶ、ＰＱＶおよびＰＱは、実際的にすべての血清により認識される。
【０１２３】 上記の考察に従って、血清により示された認識の割合は、キメラタンパク質Ｐ
ＱＶおよびＰＱのアッセイの場合と、組換えタンパク質ｒＬｉＰＯ−Ｃｔ−Ｑ、
ｒＬｉＰ２ａ、ｒＬｉＰ２ｂおよびｒＬｉＨ２Ａの混合物をアッセイした両者で
同様であった。５種の選択した抗原領域のそれぞれの抗原性は、ＰＱ発現産物中
に存在し、従ってこの産物は個別に発現した抗原の混合物の代わりに診断に使用
できることが分かった。
ＱＶおよびＰＱのアッセイの場合と、組換えタンパク質ｒＬｉＰＯ−Ｃｔ−Ｑ、
ｒＬｉＰ２ａ、ｒＬｉＰ２ｂおよびｒＬｉＨ２Ａの混合物をアッセイした両者で
同様であった。５種の選択した抗原領域のそれぞれの抗原性は、ＰＱ発現産物中
に存在し、従ってこの産物は個別に発現した抗原の混合物の代わりに診断に使用
できることが分かった。
【０１２４】 キメラタンパク質がイヌＶＬ血清診断に使用できるかどうかを決定する見解に
関し、そしてこのタンパク質に対するイヌ血清の種々の適切な分析に従って、動
物の臨床特性に従ってイヌ血清は３群に分類できることに注意すること。第一の
群は、真のエル．インファンタム感染を有するイヌからの血清から成っていた。
第二の群は、リーシュマニアとは異なる寄生虫に感染したイヌを含み、リーシュ
マニアに感染していないが種々の臨床症状を有するイヌ、およびリーシュマニア
症の間に観察される症状と混同するような臨床症状を示すイヌの血清から成って
いた。
関し、そしてこのタンパク質に対するイヌ血清の種々の適切な分析に従って、動
物の臨床特性に従ってイヌ血清は３群に分類できることに注意すること。第一の
群は、真のエル．インファンタム感染を有するイヌからの血清から成っていた。
第二の群は、リーシュマニアとは異なる寄生虫に感染したイヌを含み、リーシュ
マニアに感染していないが種々の臨床症状を有するイヌ、およびリーシュマニア
症の間に観察される症状と混同するような臨床症状を示すイヌの血清から成って
いた。
【０１２５】 第三の群は、健康な犬を起源とする対照血清から成っていた。
【０１２６】 図５には、反応性の平均値を血清のそれぞれの群に対して示し、ＶＬ血清の反
応性は、０．８の平均反応性値に達している（標準偏差＝０．４）。
応性は、０．８の平均反応性値に達している（標準偏差＝０．４）。
【０１２７】 この群内で、１２個の血清の反応性は、陽性ではあるが０．３５未満であり、
一方１０個の血清の反応性は０．３５〜０．５の間の値に達する。２３個の血清
の反応性は、０．５〜１０の間にあり、そして１４個の血清は１．０を越える反
応性を示すことが観察された。
一方１０個の血清の反応性は０．３５〜０．５の間の値に達する。２３個の血清
の反応性は、０．５〜１０の間にあり、そして１４個の血清は１．０を越える反
応性を示すことが観察された。
【０１２８】 第二の群、すなわち、リーシュマニア寄生虫とは異なる寄生虫に感染している
群の血清の平均吸光値は、０．２（標準偏差＝０．０５）であり、そして対照血
清、すなわち第三群の反応性は、０．１（標準偏差＝０．００３）であった。群
２からの血清２個だけが０．３５〜０．４の反応性を示した。
群の血清の平均吸光値は、０．２（標準偏差＝０．０５）であり、そして対照血
清、すなわち第三群の反応性は、０．１（標準偏差＝０．００３）であった。群
２からの血清２個だけが０．３５〜０．４の反応性を示した。
【０１２９】 上記のデータは、カットオフ値を群２に標準偏差の３倍を加えて平均反応性値
と定義すると（すなわち０．３５）、ＦＡＳＴ ＥＬＩＳＡにおけるキメラタン
パク質ＰＱは、ＶＬ診断に対して８０％の感度を有することを示す。
と定義すると（すなわち０．３５）、ＦＡＳＴ ＥＬＩＳＡにおけるキメラタン
パク質ＰＱは、ＶＬ診断に対して８０％の感度を有することを示す。
【０１３０】 カットオフ値を対照群の反応性値により定義すると、アッセイした群の感度は
９３％に達する。カットオフ値を上記の群２の血清により定義すると、タンパク
質Ｑは、ＶＬ診断に対して特異性９６％を有する。健康なイヌの反応性値を考慮
すると、アッセイの特異性は１００％に達する。
９３％に達する。カットオフ値を上記の群２の血清により定義すると、タンパク
質Ｑは、ＶＬ診断に対して特異性９６％を有する。健康なイヌの反応性値を考慮
すると、アッセイの特異性は１００％に達する。
【０１３１】 使用すべきプロセスは下記である。
【０１３２】 １．− 緩衝液ＰＢＳ−０．５％ツイーン２０−５％脱脂乳（緩衝液Ａ）内に
溶かした抗原の１μｇ／ｍｌを含む溶液のインキュベーションした１００μｌに
よる抗体を用いてマイクロタイター平板を被覆する。
溶かした抗原の１μｇ／ｍｌを含む溶液のインキュベーションした１００μｌに
よる抗体を用いてマイクロタイター平板を被覆する。
【０１３３】 インキュベーションは、１２時間、室温で行い、次いで平板を３回、抗原を含
まない同じ緩衝液を用いて洗浄する。乾燥した抗原平板は室温で保存できる。
まない同じ緩衝液を用いて洗浄する。乾燥した抗原平板は室温で保存できる。
【０１３４】 ２．− ウエルの第一インキュベーションは、緩衝液Ａ内で１／２００に希釈
した動物の血清を用いて行った。インキュベーションは１時間継続する。
した動物の血清を用いて行った。インキュベーションは１時間継続する。
【０１３５】 ３．− １．項記載のようにして、洗浄フラスコを用いて３回、緩衝液Ａを用
いてウエルを洗浄する。
いてウエルを洗浄する。
【０１３６】 ４．− 緩衝液Ａ内で１：２０００に希釈した第二抗体（過酸化物で標識した
ＩｇＧ）を用いてこれらをインキュベーションし、インキュベーションは１時間
行う。
ＩｇＧ）を用いてこれらをインキュベーションし、インキュベーションは１時間
行う。
【０１３７】 ５．− ウエルを、３．項記載のように、すなわち洗浄フラスコを用いて、緩
衝液Ａを用いて再び３回洗浄する。
衝液Ａを用いて再び３回洗浄する。
【０１３８】 ６．− 基質オルト−フェニレンジアミンを用いて反応性を顕在化させ、そし
て４５０ｎｍで吸光を測定する。
て４５０ｎｍで吸光を測定する。
【０１３９】 キメラ遺伝子から抽出された診断のために使用するタンパク質を同定し、そし
て該タンパク質をコードするヌクレオチドは、下記である。
て該タンパク質をコードするヌクレオチドは、下記である。
【０１４０】
【表６】
【０１４１】
【表７】
【０１４２】
【表８】
【０１４３】
【表９】
【０１４４】 当該技術分野の熟練者が本発明の範囲およびこれが提供する利益を理解できる
ようにするためにこの説明をさらに延長する必要はないと考えられる。
ようにするためにこの説明をさらに延長する必要はないと考えられる。
【０１４５】 要素の材料、形状、大きさおよび処理は、本発明の本質を変化させないと考え
られる限り、変化が可能である。
られる限り、変化が可能である。
【０１４６】 この開示が記述された内容は、常にその本質に関して広く解釈されるべきであ
り、そして限定されるものではない。 （リーシュマニアに対するワクチン）
り、そして限定されるものではない。 （リーシュマニアに対するワクチン）
【０１４７】
リーシュマニア属の原生動物の寄生体はリーシュマニア症、本質的に熱帯及び
亜熱帯地域のヒト及び動物に感染する症候複合疾患を引き起こす原因である。ヒ
トの内蔵のリーシュマニア症の新規症例数は５００，０００の数に達する可能性
があり、感染患者は最低数千万人であると算定されている。更に、皮膚及び粘膜
皮膚のリーシュマニア症の患者数は毎年２，０００，０００人の次元である可能
性がある（Ｍｏｄａｂｂｅｒ．，１９９０）。異なる型のリーシュマニア症に罹
る危険性のあるヒトは約３億５千万人と算定できるが無症候性感染の実際の症例
の明白な算定がない事実により、そして潜在性感染の存在のために実際に感染し
た患者数はずっと高い可能性がある。事実、リーシュマニア症は世界的影響をも
つ寄生体疾患の位置付けにおいて第４位と第５位の間に位置する、風土性をもつ
感染症／疾患として地球的範囲内で考えることができる。
亜熱帯地域のヒト及び動物に感染する症候複合疾患を引き起こす原因である。ヒ
トの内蔵のリーシュマニア症の新規症例数は５００，０００の数に達する可能性
があり、感染患者は最低数千万人であると算定されている。更に、皮膚及び粘膜
皮膚のリーシュマニア症の患者数は毎年２，０００，０００人の次元である可能
性がある（Ｍｏｄａｂｂｅｒ．，１９９０）。異なる型のリーシュマニア症に罹
る危険性のあるヒトは約３億５千万人と算定できるが無症候性感染の実際の症例
の明白な算定がない事実により、そして潜在性感染の存在のために実際に感染し
た患者数はずっと高い可能性がある。事実、リーシュマニア症は世界的影響をも
つ寄生体疾患の位置付けにおいて第４位と第５位の間に位置する、風土性をもつ
感染症／疾患として地球的範囲内で考えることができる。
【０１４８】 リーシュマニア症には３種類の主要な形態が区別される、皮膚、粘膜皮膚及び
内臓のもので、それらの特徴は大部分は、寄生体の局在部位、それが属する種及
びそれがもたらす臨床症状による。アジア地域及び地中海地域のある地方に分散
された種は多くの場合自然治癒する局部的潰瘍を伴う皮膚の形態の存在をもたら
す。これらの出現は森林型熱帯リーシュマニア（L．major）及び熱帯リーシュマ
ニア（L．tropica）により誘起される。エチオピアリーシュマニア（L．aethipi
ca）（地中海、アジア、アフリカ）もまた、その発現はより広域であるが、リー
シュマニアの皮膚形態を誘発する。米国ではメキシコリーシュマニア（L．mexic
ana）種が通常自然治癒はしない広域の局在性をもつ皮膚形態をもたらす。ヒト
の疾患の粘膜皮膚形態はブラジルリーシュマニア（L．brasiliensis）により誘
起され、粘膜の破壊をもたらす口鼻及び咽頭領域における皮膚病巣の存在を特徴
とする。米国、欧州、アフリカ及びアジアにおいて、最も頻発する形態のリーシ
ュマニアはシャガシ・リーシュマニア（L．chagasi）、ドノバン・リーシュマニ
ア（L．donovani）及び小児リーシュマニア（l.infantum）により誘起される内
臓形態である。この形態のリーシュマニア症は正当な時期に適切に処置されない
と致死性の熱、貧血及び強度な肝臓／脾臓腫大を伴う臨床症状を特徴とする。疾
患の進行形態においては、宿主は有効な免疫反応を発達させることができない。
これらすべてのリーシュマニアの形態はまた事実寄生体の主要な保有物を形成す
るイヌ類及び幾つかの囓歯類に認められる。地中海沿岸で小児リーシュマニアに
よりもたらされた健康の問題はイヌに感染／疾患の高い発生率があり、ベクター
昆虫が非常に広範であるので深刻である。イヌ類全体の７〜２０％がリーシュマ
ニアに感染しており、地方であるスペインの幾つかの地域では３０％に達すると
計算されている。この事実は、基本的には免疫低下したヒトによる伝染の危険を
更に増加させる深刻な家畜の問題を形成する。欧州においてはリーシュマニアに
よる感染の危険のある約１１百万頭のイヌがいる。
内臓のもので、それらの特徴は大部分は、寄生体の局在部位、それが属する種及
びそれがもたらす臨床症状による。アジア地域及び地中海地域のある地方に分散
された種は多くの場合自然治癒する局部的潰瘍を伴う皮膚の形態の存在をもたら
す。これらの出現は森林型熱帯リーシュマニア（L．major）及び熱帯リーシュマ
ニア（L．tropica）により誘起される。エチオピアリーシュマニア（L．aethipi
ca）（地中海、アジア、アフリカ）もまた、その発現はより広域であるが、リー
シュマニアの皮膚形態を誘発する。米国ではメキシコリーシュマニア（L．mexic
ana）種が通常自然治癒はしない広域の局在性をもつ皮膚形態をもたらす。ヒト
の疾患の粘膜皮膚形態はブラジルリーシュマニア（L．brasiliensis）により誘
起され、粘膜の破壊をもたらす口鼻及び咽頭領域における皮膚病巣の存在を特徴
とする。米国、欧州、アフリカ及びアジアにおいて、最も頻発する形態のリーシ
ュマニアはシャガシ・リーシュマニア（L．chagasi）、ドノバン・リーシュマニ
ア（L．donovani）及び小児リーシュマニア（l.infantum）により誘起される内
臓形態である。この形態のリーシュマニア症は正当な時期に適切に処置されない
と致死性の熱、貧血及び強度な肝臓／脾臓腫大を伴う臨床症状を特徴とする。疾
患の進行形態においては、宿主は有効な免疫反応を発達させることができない。
これらすべてのリーシュマニアの形態はまた事実寄生体の主要な保有物を形成す
るイヌ類及び幾つかの囓歯類に認められる。地中海沿岸で小児リーシュマニアに
よりもたらされた健康の問題はイヌに感染／疾患の高い発生率があり、ベクター
昆虫が非常に広範であるので深刻である。イヌ類全体の７〜２０％がリーシュマ
ニアに感染しており、地方であるスペインの幾つかの地域では３０％に達すると
計算されている。この事実は、基本的には免疫低下したヒトによる伝染の危険を
更に増加させる深刻な家畜の問題を形成する。欧州においてはリーシュマニアに
よる感染の危険のある約１１百万頭のイヌがいる。
【０１４９】 小児リーシュマニアはその属の残りの種と同様に二相性の生物学的サイクルを
有する。中間宿主はチョウバエ科（Psychodidae）、フレボトムス（Phlebotomus
）属の昆虫である。欧州の地中海区域においては、ベクターのパパトシサシチョ
ウバエ（P.papatosi）、フレボトムス・ロンギクスピス（P.longicuspis）及び
フレボトムス・セルゲンチ（P.serugenti）も存在するが、フレボトムス・アリ
アス（P.arias）種及びユウガイサシチョウバエ（P.perniciosus）が主要ベクタ
ーであることが示された。寄生体が脊椎動物の宿主の血液とともにベクターによ
り摂取される時に、それは自身を細胞外形態で腸内に入れて、プロマスティゴー
トに形質転換し、分裂する。感染性形態は咽頭及び鼻の方向に移動し、そこから
それらは新規の脊椎動物の宿主中に植え付けられるであろう。プロマスティゴー
トはそれらが鞭毛及び長さが約１５〜２０μｍの細長い形態をもち、円い前端及
び尖った後方端をもつことを特徴とする。核は中央部に位置しキネトプラストは
後方端に位置する。培養液中では寄生体はある程度の形態の変異性を示す。脊椎
動物の宿主の皮膚におけるプロマスティゴートの植え付け後の感染の樹立又は非
樹立は本質的に２つのファクター、適当な細胞集団−マクロファージ−及び食細
胞の単核系の他の細胞の存在並びにこれらの細胞内部における寄生体の生き残り
及びそれ自体の複製能力、に左右される。
有する。中間宿主はチョウバエ科（Psychodidae）、フレボトムス（Phlebotomus
）属の昆虫である。欧州の地中海区域においては、ベクターのパパトシサシチョ
ウバエ（P.papatosi）、フレボトムス・ロンギクスピス（P.longicuspis）及び
フレボトムス・セルゲンチ（P.serugenti）も存在するが、フレボトムス・アリ
アス（P.arias）種及びユウガイサシチョウバエ（P.perniciosus）が主要ベクタ
ーであることが示された。寄生体が脊椎動物の宿主の血液とともにベクターによ
り摂取される時に、それは自身を細胞外形態で腸内に入れて、プロマスティゴー
トに形質転換し、分裂する。感染性形態は咽頭及び鼻の方向に移動し、そこから
それらは新規の脊椎動物の宿主中に植え付けられるであろう。プロマスティゴー
トはそれらが鞭毛及び長さが約１５〜２０μｍの細長い形態をもち、円い前端及
び尖った後方端をもつことを特徴とする。核は中央部に位置しキネトプラストは
後方端に位置する。培養液中では寄生体はある程度の形態の変異性を示す。脊椎
動物の宿主の皮膚におけるプロマスティゴートの植え付け後の感染の樹立又は非
樹立は本質的に２つのファクター、適当な細胞集団−マクロファージ−及び食細
胞の単核系の他の細胞の存在並びにこれらの細胞内部における寄生体の生き残り
及びそれ自体の複製能力、に左右される。
【０１５０】 リーシュマニアのマクロファージ中への侵入における第１段階は標的細胞の血
漿膜への接近及び付着である。インビトロの研究は、マクロファージ上へのプロ
マスティゴートの直接の走化性引き付けはないことを示すように見える。組織の
環境内では、遊離プロマスティゴーが代替通路により補体を活性化して、画分Ｃ
５ａの濃度勾配の形成をもたらし、それが植え付け部位の方向へマクロファージ
及びその他の炎症性細胞を引き付ける。プロマスティゴートが一旦寄生体運搬（
parasitophorous）小胞内に入ると、リソソームがそれに融合してファゴリソソ
ームを形成する。他の微生物により誘起される感染においてはファゴリソソーム
は毒性の酸素ラジカルの生成のような幾つかの機序による、酸化的代謝過程、加
水分解性リソソーム酵素の作用、カチオン蛋白質及び低いｐＨによる分解及び排
除の原因となる小器官である。ファゴリソソーム中の寄生体の生き残りは前記の
機序に対する抵抗及びそれを回避するその能力の働きである。
漿膜への接近及び付着である。インビトロの研究は、マクロファージ上へのプロ
マスティゴートの直接の走化性引き付けはないことを示すように見える。組織の
環境内では、遊離プロマスティゴーが代替通路により補体を活性化して、画分Ｃ
５ａの濃度勾配の形成をもたらし、それが植え付け部位の方向へマクロファージ
及びその他の炎症性細胞を引き付ける。プロマスティゴートが一旦寄生体運搬（
parasitophorous）小胞内に入ると、リソソームがそれに融合してファゴリソソ
ームを形成する。他の微生物により誘起される感染においてはファゴリソソーム
は毒性の酸素ラジカルの生成のような幾つかの機序による、酸化的代謝過程、加
水分解性リソソーム酵素の作用、カチオン蛋白質及び低いｐＨによる分解及び排
除の原因となる小器官である。ファゴリソソーム中の寄生体の生き残りは前記の
機序に対する抵抗及びそれを回避するその能力の働きである。
【０１５１】 体液性及び細胞性の両方でリーシュマニアによる寄生に対する免疫反応の存在
はその疾患が研究された最初の瞬間から発見され、多数の機会に改定されてきた
。体液反応の種類はリーシュマニア症の形態により異なる。皮膚の形態において
は体液反応は非常に弱く、一方内臓の形態においては高い抗体反応が認められる
。皮膚感染症においては、遅延型過敏症試験（ＤＴＨ）によりインビボで、並び
にリンパ芽球転換試験及びマクロファージ遊走抑制試験によりインビトロでの両
方で検出可能な著明な細胞媒介反応がある。これらの場合には血清抗体の滴定は
通常低く、過程の重症度と直接関連している。一旦無鞭毛体がマクロファージ内
に入ると、感染の消散（resolution）は本質的に細胞媒介免疫機構による。細胞
反応はマクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ−細胞の幾つかの亜集団及びそれらすべてに
より分泌される異なるリンフォカインの総合作用により決定される。寄生された
マクロファージはリーシュマニア抗原を処理し、クラスIIの主要組織適合試験複
合体（ＭＨＣ−II）により仲介される方法によりその表面上にそれらを発現する
。更に、マクロファージはＩＬ−１を分泌し、それがＴ−リンパ球の第２の活性
化信号として働く。ヒトにおいては内臓のリーシュマニア症もしくはカラ−アザ
ール（kala-azar）は遅延過敏症（ＤＴＨ）の不在及び細胞増殖法の両方により
検出可能な弱体化または不在の細胞反応を特徴とする。Ｔ−細胞の増殖の不在は
コンカナベリンＡまたはフィトヘマグルチニンのような分裂促進剤の存在下及び
刺激されたＴ−細胞によるＩＬ−２の生産の阻止下ですら検出される。
はその疾患が研究された最初の瞬間から発見され、多数の機会に改定されてきた
。体液反応の種類はリーシュマニア症の形態により異なる。皮膚の形態において
は体液反応は非常に弱く、一方内臓の形態においては高い抗体反応が認められる
。皮膚感染症においては、遅延型過敏症試験（ＤＴＨ）によりインビボで、並び
にリンパ芽球転換試験及びマクロファージ遊走抑制試験によりインビトロでの両
方で検出可能な著明な細胞媒介反応がある。これらの場合には血清抗体の滴定は
通常低く、過程の重症度と直接関連している。一旦無鞭毛体がマクロファージ内
に入ると、感染の消散（resolution）は本質的に細胞媒介免疫機構による。細胞
反応はマクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ−細胞の幾つかの亜集団及びそれらすべてに
より分泌される異なるリンフォカインの総合作用により決定される。寄生された
マクロファージはリーシュマニア抗原を処理し、クラスIIの主要組織適合試験複
合体（ＭＨＣ−II）により仲介される方法によりその表面上にそれらを発現する
。更に、マクロファージはＩＬ−１を分泌し、それがＴ−リンパ球の第２の活性
化信号として働く。ヒトにおいては内臓のリーシュマニア症もしくはカラ−アザ
ール（kala-azar）は遅延過敏症（ＤＴＨ）の不在及び細胞増殖法の両方により
検出可能な弱体化または不在の細胞反応を特徴とする。Ｔ−細胞の増殖の不在は
コンカナベリンＡまたはフィトヘマグルチニンのような分裂促進剤の存在下及び
刺激されたＴ−細胞によるＩＬ−２の生産の阻止下ですら検出される。
【０１５２】 マウスにおいては、Ｔ−リンパ球（ＣＤ４表現型）の集団は異質性で、それら
が生産するリンフォカインに従って少なくとも２種類の亜集団に分類することが
できる。これらの細胞は皮膚のリーシュマニア（亜集団Ｔｈ−１）に対する防御
免疫の発達に必須であり、そして同時に防御免疫反応（亜集団Ｔｈ−２）の抑制
に関与する。抵抗性マウスＣ５７ＢＬ／６または治癒ＢＡＬＢ／ｃマウスに誘導
されたＴ細胞は主としてＴｈ−１型のものであり、一方治癒しなかったＢＡＬＢ
／ｃマウスの細胞はＴｈ−２型のものである。概してこれらの細胞により分泌さ
れたリンフォカインはそれらを生産する細胞系の発育を好み、他の亜集団の発育
に対して拮抗効果をもつ。このようにＴｈ−２細胞により生産されたＩＬ−４及
びＩＬ−１０は感染の進行に寄与し、この系の発育を好む。更に、それらはその
活性化を許さないことによりマクロファージ上に直接作用することができる。し
かし、ＩＬ−４をコード化する遺伝子の欠乏したリーシュマニア感染に感受性の
マウスにおいては、反対の結果が得られた。幾つかの症例においてはこのサイト
カインの不在が反応を再誘導して、感染に対する抵抗性を増加させ、一方他の場
合には、マウスの感染性の度合に差異は認められないことが発見された。遺伝子
的に抵抗性のマウスにおいてはＩＦＮ−Ｙまたはその受容体、ＣＤ４０またはＣ
Ｄ４０のリガンドの発現の不在が感染に対する感受性を増加することが認められ
た。ＣＤ４０とそのリガンドの相互反応はＴｈ−１に対する反応を方向付けるた
めに必要なサイトカインＩＦＮ−Ｙの生産に必要である。Ｔｈ−１型の反応を発
達させる抵抗性の遺伝子塩基をもつマウスはＴｈ−２型の反応を発達させてＩＬ
−１２の発現に欠陥性である場合は感受性になる。最近のデータによりＩＬ−１
２の生産は反応をＴｈ−１に向けるために重要であり、そしてＩＬ−４の不在は
Ｔｈ−２反応を回避することができることが示唆されている。
が生産するリンフォカインに従って少なくとも２種類の亜集団に分類することが
できる。これらの細胞は皮膚のリーシュマニア（亜集団Ｔｈ−１）に対する防御
免疫の発達に必須であり、そして同時に防御免疫反応（亜集団Ｔｈ−２）の抑制
に関与する。抵抗性マウスＣ５７ＢＬ／６または治癒ＢＡＬＢ／ｃマウスに誘導
されたＴ細胞は主としてＴｈ−１型のものであり、一方治癒しなかったＢＡＬＢ
／ｃマウスの細胞はＴｈ−２型のものである。概してこれらの細胞により分泌さ
れたリンフォカインはそれらを生産する細胞系の発育を好み、他の亜集団の発育
に対して拮抗効果をもつ。このようにＴｈ−２細胞により生産されたＩＬ−４及
びＩＬ−１０は感染の進行に寄与し、この系の発育を好む。更に、それらはその
活性化を許さないことによりマクロファージ上に直接作用することができる。し
かし、ＩＬ−４をコード化する遺伝子の欠乏したリーシュマニア感染に感受性の
マウスにおいては、反対の結果が得られた。幾つかの症例においてはこのサイト
カインの不在が反応を再誘導して、感染に対する抵抗性を増加させ、一方他の場
合には、マウスの感染性の度合に差異は認められないことが発見された。遺伝子
的に抵抗性のマウスにおいてはＩＦＮ−Ｙまたはその受容体、ＣＤ４０またはＣ
Ｄ４０のリガンドの発現の不在が感染に対する感受性を増加することが認められ
た。ＣＤ４０とそのリガンドの相互反応はＴｈ−１に対する反応を方向付けるた
めに必要なサイトカインＩＦＮ−Ｙの生産に必要である。Ｔｈ−１型の反応を発
達させる抵抗性の遺伝子塩基をもつマウスはＴｈ−２型の反応を発達させてＩＬ
−１２の発現に欠陥性である場合は感受性になる。最近のデータによりＩＬ−１
２の生産は反応をＴｈ−１に向けるために重要であり、そしてＩＬ−４の不在は
Ｔｈ−２反応を回避することができることが示唆されている。
【０１５３】 本質的に「ウエスタンブロット（Western Blot）分析法」を特徴とする抗原性
特徴を有する多数のリーシュマニアの蛋白質が存在する。リーシュマニアに感染
した患者及びイヌの血清中には、ｇｐ６３、ｇｐ４６、ＰＳＡ及びＫＰＭ−１１
のような膜蛋白に対する抗体の存在を検知することが可能であった。更に、Ｈｓ
ｐ７０、Ｈｓｐ８３、ＬＩＰ２ａ、ＬＩＰ２ｂ、ＬＩＬＩＰ０、Ｈ２Ａ、Ｈ３及
び、キネシンに関連した蛋白質、リーシュマニア・シャガシ（L．chagasi）のＫ
３９のような細胞質の細胞内に局在の幾つかの抗原が特徴を示された。小児リー
シュマニアにより感染されたイヌの血清中に存在する保存蛋白を認識する抗体の
反応性はこれらの蛋白の保存の最も少ない領域の方向に向けられる。幾つかの膜
蛋白は自然感染に非常に抗原性である。自然感染すべてにおいては、感染過程の
期間中に発育した抗体はその中で非常に制約された区域を認識するので、蛋白に
対する体液反応において著しい制約がある。ＩｇＧのレベルは通常、感染の強度
に対応し、寄生による荷重により決定される抗原性刺激の程度及び期間を反映す
る。Ｔｈ−２型の早期反応をもたらすＣ型キナーゼ受容体（ＬＡＣＫ）に類似の
リーシュマニア抗原が最近説明された。ＬＡＣＫ抗原に形質転換し、感染に感受
性の遺伝的背景をもつのマウスにおいて、この抗原に対する寛容性の誘導が森林
型熱帯リーシュマニア（L．major）による感染に対して防御する。抗リーシュマ
ニア抗体は補体の存在下でインビトロでプロマスチゴートを破壊し、食菌作用を
促進し、そしてプロマスチゴート及び無鞭毛体の表面に対する幾つかの粒子の付
着を誘導することができる。
特徴を有する多数のリーシュマニアの蛋白質が存在する。リーシュマニアに感染
した患者及びイヌの血清中には、ｇｐ６３、ｇｐ４６、ＰＳＡ及びＫＰＭ−１１
のような膜蛋白に対する抗体の存在を検知することが可能であった。更に、Ｈｓ
ｐ７０、Ｈｓｐ８３、ＬＩＰ２ａ、ＬＩＰ２ｂ、ＬＩＬＩＰ０、Ｈ２Ａ、Ｈ３及
び、キネシンに関連した蛋白質、リーシュマニア・シャガシ（L．chagasi）のＫ
３９のような細胞質の細胞内に局在の幾つかの抗原が特徴を示された。小児リー
シュマニアにより感染されたイヌの血清中に存在する保存蛋白を認識する抗体の
反応性はこれらの蛋白の保存の最も少ない領域の方向に向けられる。幾つかの膜
蛋白は自然感染に非常に抗原性である。自然感染すべてにおいては、感染過程の
期間中に発育した抗体はその中で非常に制約された区域を認識するので、蛋白に
対する体液反応において著しい制約がある。ＩｇＧのレベルは通常、感染の強度
に対応し、寄生による荷重により決定される抗原性刺激の程度及び期間を反映す
る。Ｔｈ−２型の早期反応をもたらすＣ型キナーゼ受容体（ＬＡＣＫ）に類似の
リーシュマニア抗原が最近説明された。ＬＡＣＫ抗原に形質転換し、感染に感受
性の遺伝的背景をもつのマウスにおいて、この抗原に対する寛容性の誘導が森林
型熱帯リーシュマニア（L．major）による感染に対して防御する。抗リーシュマ
ニア抗体は補体の存在下でインビトロでプロマスチゴートを破壊し、食菌作用を
促進し、そしてプロマスチゴート及び無鞭毛体の表面に対する幾つかの粒子の付
着を誘導することができる。
【０１５４】 病理学的反応は寄生されたマクロファージの密度と平行して進行するように見
える。内蔵のリーシュマニア症において、マクロファージは概して異なる有機体
組織全体に拡散する方法で分散する。炎症の種類は食細胞の増殖とともにリンパ
球及び血漿細胞の優勢を伴って重要な細胞浸潤物により構成される。炎症は重篤
な全身の変化をもたらす罹患器官の生理学に変化をもたらす。ある場合には、異
なる器官に肉芽腫及び微細肉芽腫の外観を伴う局部的肉芽腫性炎症が起こる。こ
れらの肉芽腫はマクロファージ並びに血漿細胞及びリンパ球に囲まれた繊維球増
殖体（寄生体により感染されようとされまいと）並びにある場合には繊維芽細胞
により形成される。この炎症過程は罹患器官に特徴的な病巣の外観を伴う有機反
応を伴う。何人かの著者は実質的に器官全体にアミロイド物質の沈着を発見した
。何人かの著者は当該疾患によりもたらされた損傷は病因学的物質に直接起因さ
せることはできず有機反応に引金を引かれるという仮説を作成した。 （リーシュマニア症に対するワクチン） 皮膚のリーシュマニア症からの回復に続く強力な免疫が本疾患に対する予防的
ワクチンの開発に大きな影響を与えた。この免疫はマクロファージを活性化し寄
生体を破壊する炎症性サイトカインの生産をそれと関連付けたＴ反応の誘導に由
来する。感染の場合の免疫学的記憶は恐らく、付随する免疫として知られた方法
で宿主中における寄生体の恒常的存在により維持される。
える。内蔵のリーシュマニア症において、マクロファージは概して異なる有機体
組織全体に拡散する方法で分散する。炎症の種類は食細胞の増殖とともにリンパ
球及び血漿細胞の優勢を伴って重要な細胞浸潤物により構成される。炎症は重篤
な全身の変化をもたらす罹患器官の生理学に変化をもたらす。ある場合には、異
なる器官に肉芽腫及び微細肉芽腫の外観を伴う局部的肉芽腫性炎症が起こる。こ
れらの肉芽腫はマクロファージ並びに血漿細胞及びリンパ球に囲まれた繊維球増
殖体（寄生体により感染されようとされまいと）並びにある場合には繊維芽細胞
により形成される。この炎症過程は罹患器官に特徴的な病巣の外観を伴う有機反
応を伴う。何人かの著者は実質的に器官全体にアミロイド物質の沈着を発見した
。何人かの著者は当該疾患によりもたらされた損傷は病因学的物質に直接起因さ
せることはできず有機反応に引金を引かれるという仮説を作成した。 （リーシュマニア症に対するワクチン） 皮膚のリーシュマニア症からの回復に続く強力な免疫が本疾患に対する予防的
ワクチンの開発に大きな影響を与えた。この免疫はマクロファージを活性化し寄
生体を破壊する炎症性サイトカインの生産をそれと関連付けたＴ反応の誘導に由
来する。感染の場合の免疫学的記憶は恐らく、付随する免疫として知られた方法
で宿主中における寄生体の恒常的存在により維持される。
【０１５５】 １９４０年代の１０年間のリーシュマニア症に対するワクチン注射に関する第
１の研究は免疫原として生存寄生体を使用した。これらの研究はその後の再感染
に対する重要な防御をもたらしたワクチンの生産に導いた。しかし、生きた有機
体が本当の感染症をもたらし得るという可能性を知ってこのようなワクチン注射
計画を長い間実施させないで、その反対に、死亡した寄生体を基礎にしたワクチ
ンに関心が集まった。これらの研究は寄生体の接種による有効なワクチンを生産
する可能性に対する第１の証拠を提供した。
１の研究は免疫原として生存寄生体を使用した。これらの研究はその後の再感染
に対する重要な防御をもたらしたワクチンの生産に導いた。しかし、生きた有機
体が本当の感染症をもたらし得るという可能性を知ってこのようなワクチン注射
計画を長い間実施させないで、その反対に、死亡した寄生体を基礎にしたワクチ
ンに関心が集まった。これらの研究は寄生体の接種による有効なワクチンを生産
する可能性に対する第１の証拠を提供した。
【０１５６】 死亡リーシュマニアのプロマスティゴートによる免疫処理を使用した臨床試験
もまた４０年代の１０年間に開始された。これらのワクチンは集団に応じて０〜
８２％の間の可能性がある、ある程度の防御が認められたので著明な成功をもた
らした。これらのワクチンは生存寄生体のワクチンよりも小さい効果を有した。
マウスを感染から防御する森林型熱帯リーシュマニア（L．major）の無毒のクロ
ーンの単離は弱毒化されたワクチンが可能であることをも示した。しかし、無毒
性の喪失及び無毒性の復帰変異体の生産の危険に導く突然変異体の無視がこの種
類のワクチン注射を現在許容できないものにしている。
もまた４０年代の１０年間に開始された。これらのワクチンは集団に応じて０〜
８２％の間の可能性がある、ある程度の防御が認められたので著明な成功をもた
らした。これらのワクチンは生存寄生体のワクチンよりも小さい効果を有した。
マウスを感染から防御する森林型熱帯リーシュマニア（L．major）の無毒のクロ
ーンの単離は弱毒化されたワクチンが可能であることをも示した。しかし、無毒
性の喪失及び無毒性の復帰変異体の生産の危険に導く突然変異体の無視がこの種
類のワクチン注射を現在許容できないものにしている。
【０１５７】 最近、ｇｐ６３、ｇｐ４６／Ｍ６、ＰＳＡ−２として知られる後者の抗原に関
連した表面の抗原及び蛋白質ｄｐ７２及びｇｐ７０−２、ＬＡＣＫ蛋白質及びＫ
ｍｐ１１のような分子として規定された候補のワクチンの同定の方向に重要な進
展があった。特に蛋白質ｇｐ６３中に存在するＴエピトープが同定され、それら
の幾つかのみがＴｈ−１及びＴｈ−２の両方のＴ反応を誘導することができるこ
とが見いだされた。これらの抗原はそれらをアジュバントと一緒に投与するとモ
デル動物に有意な防御を誘導する。リーシュマニアの蛋白質のＰＳＡ−２はＴｈ
−１反応を誘導することにより森林型熱帯リーシュマニアによる感染に対して防
御することができる。ヒトにおけるリーシュマニア症に対するワクチンとしての
この蛋白質の防御機構を評価するためにＴ−細胞増殖を誘導するためのその能力
をリーシュマニア症を罹患しそれから回復した患者で研究した。当該蛋白質はこ
れらの被験体のＴ−細胞の強力な増殖をもたらすことができるが、感染の以前の
病歴のない対照においてはそれをもたらさないことが認められた。その反応はサ
イトカイン誘発パターンにより示されるようなＴｈ−１型のものであった。
連した表面の抗原及び蛋白質ｄｐ７２及びｇｐ７０−２、ＬＡＣＫ蛋白質及びＫ
ｍｐ１１のような分子として規定された候補のワクチンの同定の方向に重要な進
展があった。特に蛋白質ｇｐ６３中に存在するＴエピトープが同定され、それら
の幾つかのみがＴｈ−１及びＴｈ−２の両方のＴ反応を誘導することができるこ
とが見いだされた。これらの抗原はそれらをアジュバントと一緒に投与するとモ
デル動物に有意な防御を誘導する。リーシュマニアの蛋白質のＰＳＡ−２はＴｈ
−１反応を誘導することにより森林型熱帯リーシュマニアによる感染に対して防
御することができる。ヒトにおけるリーシュマニア症に対するワクチンとしての
この蛋白質の防御機構を評価するためにＴ−細胞増殖を誘導するためのその能力
をリーシュマニア症を罹患しそれから回復した患者で研究した。当該蛋白質はこ
れらの被験体のＴ−細胞の強力な増殖をもたらすことができるが、感染の以前の
病歴のない対照においてはそれをもたらさないことが認められた。その反応はサ
イトカイン誘発パターンにより示されるようなＴｈ−１型のものであった。
【０１５８】 サブユニットのワクチンはそれらが同定、単離及びクローン形成が容易である
ので、蛋白質抗原に強力に焦点をあてられた。しかし、必ずしもすべての可能な
ワクチン分子が蛋白質である必要はないことを考慮に入れる必要がある。事実、
リポホスホグリカン（ＬＰＧ）は感染の樹立に本質的な役目を果す。ＬＰＧのワ
クチン注射は森林型熱帯リーシュマニアの感染に対して防御することができる。
Ｔ−細胞は非蛋白性の抗原を認識しないと述べるドグマの存在にもかかわらず、
ＬＰＧ分子は皮膚のランゲルハンス細胞によりＴ−細胞に提供されるように見え
る。更に、微生物の糖脂質及び他の非蛋白質の分子はそれらがＣＤ−１経路を通
って提供される時に、Ｔ−細胞を認識することができることを示した証拠がある
。ＬＰＧと一緒の蛋白質ＫＭＰ１１が防御反応を誘導する明白な証明はないが、
ＬＰＧと一緒の蛋白質様画分がＴ反応及びＬＦＮ−Ｙを誘発することができるが
、蛋白質を伴わないＬＰＧ画分はそれを誘発することができないことは証明され
ている。
ので、蛋白質抗原に強力に焦点をあてられた。しかし、必ずしもすべての可能な
ワクチン分子が蛋白質である必要はないことを考慮に入れる必要がある。事実、
リポホスホグリカン（ＬＰＧ）は感染の樹立に本質的な役目を果す。ＬＰＧのワ
クチン注射は森林型熱帯リーシュマニアの感染に対して防御することができる。
Ｔ−細胞は非蛋白性の抗原を認識しないと述べるドグマの存在にもかかわらず、
ＬＰＧ分子は皮膚のランゲルハンス細胞によりＴ−細胞に提供されるように見え
る。更に、微生物の糖脂質及び他の非蛋白質の分子はそれらがＣＤ−１経路を通
って提供される時に、Ｔ−細胞を認識することができることを示した証拠がある
。ＬＰＧと一緒の蛋白質ＫＭＰ１１が防御反応を誘導する明白な証明はないが、
ＬＰＧと一緒の蛋白質様画分がＴ反応及びＬＦＮ−Ｙを誘発することができるが
、蛋白質を伴わないＬＰＧ画分はそれを誘発することができないことは証明され
ている。
【０１５９】 サブユニットのワクチンは防御性ではあるが、短期の免疫を誘発するのみであ
ることは一般に受け入れられている。この問題は、被験体が自然感染症の原因に
より定期的に増強される（boosted）ことができる地方の領域においては重要で
はないかも知れない。サブユニットの使用における主要な問題は、遺伝的に広範
囲の集団における単一の抗原に対して単一の反応でない可能性がある事実から起
こる可能性がある。Ｂ及びＴ誘導物質を含む抗原の混合物がこの欠点を克服する
ことができる。最近、小児リーシュマニアの膜蛋白質の抽出物を腹腔内注射する
とこの寄生体の無毒のプロマスティゴート形態に対する防御を与えることができ
ること及びその蛋白質を陽性に帯電したリポソーム中に封入するとその防御がよ
り大きいことが発表された。アジュバンティシティ及び防御免疫性が陽性に帯電
されたリポソーム中に封入されたドノバンリーシュマニア（L．donovani）抗原
により与えられた。
ることは一般に受け入れられている。この問題は、被験体が自然感染症の原因に
より定期的に増強される（boosted）ことができる地方の領域においては重要で
はないかも知れない。サブユニットの使用における主要な問題は、遺伝的に広範
囲の集団における単一の抗原に対して単一の反応でない可能性がある事実から起
こる可能性がある。Ｂ及びＴ誘導物質を含む抗原の混合物がこの欠点を克服する
ことができる。最近、小児リーシュマニアの膜蛋白質の抽出物を腹腔内注射する
とこの寄生体の無毒のプロマスティゴート形態に対する防御を与えることができ
ること及びその蛋白質を陽性に帯電したリポソーム中に封入するとその防御がよ
り大きいことが発表された。アジュバンティシティ及び防御免疫性が陽性に帯電
されたリポソーム中に封入されたドノバンリーシュマニア（L．donovani）抗原
により与えられた。
【０１６０】 リーシュマニアの蛋白質をコード化する核酸担持遺伝子のワクチン注射は宿主
に対する寄生体の遺伝的材料の投与に関する。このＤＮＡが細胞により取り込ま
れ、核中に誘導され、そこで転写され、その後細胞質内に翻訳される。この種類
のワクチン注射の利点はＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−II経路により免疫反応を誘導す
ることができる点である。細胞内で生産された抗原は細胞内で処理され、生成さ
れたペプチドはＭＨＣ−Ｉ分子と一緒に細胞表面上に提供される。その結果、こ
れらの分子は細胞毒性のＴ−細胞の誘導を引き起こすであろう。細胞外環境中に
生成された抗原は特別に、特殊な抗原提供細胞により取り込まれ、処理され、Ｍ
ＨＣ−II分子に結合されたそれらの表面上に提供され、ＣＤ４＋細胞の誘導及び
活性化をもたらし、それが免疫系の他の細胞のエフェクターを調節するサイトカ
インを分泌するであろう。
に対する寄生体の遺伝的材料の投与に関する。このＤＮＡが細胞により取り込ま
れ、核中に誘導され、そこで転写され、その後細胞質内に翻訳される。この種類
のワクチン注射の利点はＭＨＣ−Ｉ又はＭＨＣ−II経路により免疫反応を誘導す
ることができる点である。細胞内で生産された抗原は細胞内で処理され、生成さ
れたペプチドはＭＨＣ−Ｉ分子と一緒に細胞表面上に提供される。その結果、こ
れらの分子は細胞毒性のＴ−細胞の誘導を引き起こすであろう。細胞外環境中に
生成された抗原は特別に、特殊な抗原提供細胞により取り込まれ、処理され、Ｍ
ＨＣ−II分子に結合されたそれらの表面上に提供され、ＣＤ４＋細胞の誘導及び
活性化をもたらし、それが免疫系の他の細胞のエフェクターを調節するサイトカ
インを分泌するであろう。
【０１６１】 ワクチンとして投与することができる最初のＤＮＡベクターはｇｐ６３遺伝子
を含んでいた。更に、ＰＳＡ−２遺伝子がプラスミド中に誘導され、そしてそれ
がＴｈ−１反応及び防御の導入をもたらすことが認められた。Ａｇ−２を含むＤ
ＮＡプラスミドのワクチン注射はＴｈ−１反応を誘発し、森林型熱帯リーシュマ
ニア（L．major）による感染に対して防御するが、刺激性免疫複合体中のＡｇ−
２は組み合わせたＴｈ−１及びＴｈ−２反応を誘導しＩＦＮ−Ｙが誘導される事
実にもかかわらず防御しない。同様に、サイトメガロウイルスプロモーターの制
御下で蛋白質を表現する表現ベクター中でＬＡＣＫ蛋白質をコード化している遺
伝子をＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射して、森林型熱帯リーシュマニア（L．maj
or）の感染に対する防御を認めた。粒状ＤＮＡの皮膚内注射もまたそれがより少
量のＤＮＡを要するので探求しなければならないが、ＤＮＡを投与したほとんど
すべての症例で、投与経路は筋肉注射であった。その他の免疫系はサルモネラ、
ＢＣＧまたはワクシニアウイルスのようなベクターを使用する。ＢＣＧ中にｇｐ
６３遺伝子を含むことが森林型熱帯リーシュマニア（L．major）に対する防御を
誘発することができることを認めることは興味深い。
を含んでいた。更に、ＰＳＡ−２遺伝子がプラスミド中に誘導され、そしてそれ
がＴｈ−１反応及び防御の導入をもたらすことが認められた。Ａｇ−２を含むＤ
ＮＡプラスミドのワクチン注射はＴｈ−１反応を誘発し、森林型熱帯リーシュマ
ニア（L．major）による感染に対して防御するが、刺激性免疫複合体中のＡｇ−
２は組み合わせたＴｈ−１及びＴｈ−２反応を誘導しＩＦＮ−Ｙが誘導される事
実にもかかわらず防御しない。同様に、サイトメガロウイルスプロモーターの制
御下で蛋白質を表現する表現ベクター中でＬＡＣＫ蛋白質をコード化している遺
伝子をＢＡＬＢ／ｃマウスに皮下注射して、森林型熱帯リーシュマニア（L．maj
or）の感染に対する防御を認めた。粒状ＤＮＡの皮膚内注射もまたそれがより少
量のＤＮＡを要するので探求しなければならないが、ＤＮＡを投与したほとんど
すべての症例で、投与経路は筋肉注射であった。その他の免疫系はサルモネラ、
ＢＣＧまたはワクシニアウイルスのようなベクターを使用する。ＢＣＧ中にｇｐ
６３遺伝子を含むことが森林型熱帯リーシュマニア（L．major）に対する防御を
誘発することができることを認めることは興味深い。
【０１６２】 蛋白質ｇｐ６３をコード化する遺伝子はまた弱毒化ネズミチフス菌（Salmonel
la typhimurium）中のｒａｃプロモーターの制御下で遺伝子のデルタａｒａＣ中
に導入された。形質転換バクテリアの１×１０9コロニーの経口投与はＴｈ−１
及び、ｇｐ６３を表現する肥満細胞腫細胞に対する細胞毒細胞の両方の範囲内に
Ｔ反応を誘発する。ｇｐ６３−ＩＳＣＯＭｓ複合体の形態の蛋白質ｇｐ６３は炎
症の減少及び病巣の抑制により証明されるようにマウスにおいて防御を誘発する
。血清中には、ＩｇＧ２ａ型の抗体があり、更にＩＬ−２、ＩＦＮ−Ｙ及びＩＬ
−１０の誘導によるＴｈ−１反応を認めることができる。ＤＴＨ反応は認められ
なかった。ｇｐ６３で形質転換されたチフス菌（Salmonella typhi）Ｎｒａｍｐ
１はＩＬ−２及びＩＦＮ−Ｙの誘導によりＴｈ−１反応をもたらし、病巣の強力
な消滅が認められる。Ｐ−４として知られるピファノ・リーシュマニア（L．pif
anoi）の蛋白質はリーシュマニアの感染に対する有意な防御を誘発する。皮膚の
リーシュマニアを患うヒトにおける最近の研究によりこの蛋白質またはそれから
誘導されたペプチドはＴ細胞を増殖させることができることが示されている。Ｉ
ＦＮ−Ｙは誘発されるが、ＩＬ−４の誘発はない。経口投与された、ＩＬ−２、
ＩＦＮ−Ｙ及びＴＮＦ−αで形質転換されたチフス菌のａｒｏ−Ａ及びａｒｏ−
Ｄ突然変異体は森林型熱帯リーシュマニア（L．major）による感染に対する治療
系として働くことができる。これらの患者においてｉＮＯＳのより大きい誘発が
あることを認めることは興味深い。ｇｐ６３遺伝子はまたＡｒｏ−Ａ及びＡｒｏ
−Ｄ突然変異体中でクローン化され、経口投与後に、コード化された蛋白質は森
林型熱帯リーシュマニアの感染に対して有意な防御を誘発することができること
が認められた。この同一蛋白質はサルモネラの特異的変種（ＧＩＤ１０５及びＧ
ＩＤ１０６）中の幾つかのプロモーターに融合させて投与すると防御を誘発させ
ることができる。
la typhimurium）中のｒａｃプロモーターの制御下で遺伝子のデルタａｒａＣ中
に導入された。形質転換バクテリアの１×１０9コロニーの経口投与はＴｈ−１
及び、ｇｐ６３を表現する肥満細胞腫細胞に対する細胞毒細胞の両方の範囲内に
Ｔ反応を誘発する。ｇｐ６３−ＩＳＣＯＭｓ複合体の形態の蛋白質ｇｐ６３は炎
症の減少及び病巣の抑制により証明されるようにマウスにおいて防御を誘発する
。血清中には、ＩｇＧ２ａ型の抗体があり、更にＩＬ−２、ＩＦＮ−Ｙ及びＩＬ
−１０の誘導によるＴｈ−１反応を認めることができる。ＤＴＨ反応は認められ
なかった。ｇｐ６３で形質転換されたチフス菌（Salmonella typhi）Ｎｒａｍｐ
１はＩＬ−２及びＩＦＮ−Ｙの誘導によりＴｈ−１反応をもたらし、病巣の強力
な消滅が認められる。Ｐ−４として知られるピファノ・リーシュマニア（L．pif
anoi）の蛋白質はリーシュマニアの感染に対する有意な防御を誘発する。皮膚の
リーシュマニアを患うヒトにおける最近の研究によりこの蛋白質またはそれから
誘導されたペプチドはＴ細胞を増殖させることができることが示されている。Ｉ
ＦＮ−Ｙは誘発されるが、ＩＬ−４の誘発はない。経口投与された、ＩＬ−２、
ＩＦＮ−Ｙ及びＴＮＦ−αで形質転換されたチフス菌のａｒｏ−Ａ及びａｒｏ−
Ｄ突然変異体は森林型熱帯リーシュマニア（L．major）による感染に対する治療
系として働くことができる。これらの患者においてｉＮＯＳのより大きい誘発が
あることを認めることは興味深い。ｇｐ６３遺伝子はまたＡｒｏ−Ａ及びＡｒｏ
−Ｄ突然変異体中でクローン化され、経口投与後に、コード化された蛋白質は森
林型熱帯リーシュマニアの感染に対して有意な防御を誘発することができること
が認められた。この同一蛋白質はサルモネラの特異的変種（ＧＩＤ１０５及びＧ
ＩＤ１０６）中の幾つかのプロモーターに融合させて投与すると防御を誘発させ
ることができる。
【０１６３】 小児リーシュマニア（L．infantum）の４種の蛋白質（より具体的にはＬｉｐ
２ａ、Ｌｉｐ２ｂ、Ｐ０及びＨ２Ａ）からの幾つかの抗原フラグメントからなり
、抗原として使用された後にイヌのリーシュマニアの診断に対して重要な価値を
有することが判明し、感染されていない対照動物の血清と比較すると９３％の感
受性及び１００％の特異性を伴う、Ｑと名付けられた人工的蛋白質が最近我々の
グループにより説明された。同様に、我々のグループは小児リーシュマニアの蛋
白質ｈｓｐ７０がこの寄生体による感染により誘起された感染症における免疫反
応の重要な標的であることを示した。
２ａ、Ｌｉｐ２ｂ、Ｐ０及びＨ２Ａ）からの幾つかの抗原フラグメントからなり
、抗原として使用された後にイヌのリーシュマニアの診断に対して重要な価値を
有することが判明し、感染されていない対照動物の血清と比較すると９３％の感
受性及び１００％の特異性を伴う、Ｑと名付けられた人工的蛋白質が最近我々の
グループにより説明された。同様に、我々のグループは小児リーシュマニアの蛋
白質ｈｓｐ７０がこの寄生体による感染により誘起された感染症における免疫反
応の重要な標的であることを示した。
【０１６４】 蛋白質Ｑがそれ自体でそしてＨｓｐ７０と組み合わせての両方で、小児リーシ
ュマニアによる感染に対する防御系を計画するために使用することができる可能
性を探求する目的をもって、モデルとしてハムスターを使用して３系列の実験を
計画した。実験は蛋白質Ｑによる免疫処置が短期間の感染に対して動物を防御し
たか否かを検討し、もう１つは免疫処置が長期間においてかれらを防御したか否
かを検討し、そして第３に２種類の蛋白質の一緒の免疫処置後にこの防御効果を
検討するために計画された。その後に短期間分析並びに長期間分析の両方から、
蛋白質Ｑが大部分の免疫処置動物において小児リーシュマニア感染後に肝臓及び
脾臓の両方に寄生体による荷重を減少させる免疫反応を誘発させることができた
こと、及び蛋白質Ｑ＋Ｈｓｐ７０による免疫処置はまた両方の蛋白質に対して有
意な反応を誘発し、大部分の免疫処置動物において寄生体による荷重の有意な減
少をもたらしたことが認められた。
ュマニアによる感染に対する防御系を計画するために使用することができる可能
性を探求する目的をもって、モデルとしてハムスターを使用して３系列の実験を
計画した。実験は蛋白質Ｑによる免疫処置が短期間の感染に対して動物を防御し
たか否かを検討し、もう１つは免疫処置が長期間においてかれらを防御したか否
かを検討し、そして第３に２種類の蛋白質の一緒の免疫処置後にこの防御効果を
検討するために計画された。その後に短期間分析並びに長期間分析の両方から、
蛋白質Ｑが大部分の免疫処置動物において小児リーシュマニア感染後に肝臓及び
脾臓の両方に寄生体による荷重を減少させる免疫反応を誘発させることができた
こと、及び蛋白質Ｑ＋Ｈｓｐ７０による免疫処置はまた両方の蛋白質に対して有
意な反応を誘発し、大部分の免疫処置動物において寄生体による荷重の有意な減
少をもたらしたことが認められた。
【０１６５】 実施例１：タンパク質Ｑによる免疫処置 フロインドのアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ ａｄｊｕｖａｎｔ）４０μＬ
（マイクロリットル）中に溶解した５μｇのタンパク質Ｑを用いて４匹の動物に
免疫処置を施し、タンパク質を含まないＰＢＳ塩水溶液４０μＬで乳化した同量
のアジュバントを用い他の４匹の動物に免疫処置を行なった。最初の免疫処置に
おいては、フロインドの完全アジュバントをタンパク質と組み合わせて使用した
が、２回目以降の免疫処置においては、フロインドの不完全アジュバントをタン
パク質と組み合わせ、タンパク質／アジュバントの比を同じにして使用した。３
回の腹腔内での免疫処置は１５日の間隔で行なった。各免疫処置を行なった後第
２週目から初めて免疫処置の全期間に亙り、血液の試料を採取しエリザ（ＥＬＩ
ＳＡ）検定法においてタンパク質Ｑに対する体液性応答を測定した。１回目の免
疫処置後二週間で既にタンパク質Ｑに対する陽性のＩｇＧ応答が観測され、この
応答は感染後二週間の後に高くなり、免疫処置の時間と共に増加して１／１００
．０００の力価に達した。同様に、タンパク質Ｑに対する免疫応答はこの寄生虫
の感染後も著しくは変更されなかった（図１）。
（マイクロリットル）中に溶解した５μｇのタンパク質Ｑを用いて４匹の動物に
免疫処置を施し、タンパク質を含まないＰＢＳ塩水溶液４０μＬで乳化した同量
のアジュバントを用い他の４匹の動物に免疫処置を行なった。最初の免疫処置に
おいては、フロインドの完全アジュバントをタンパク質と組み合わせて使用した
が、２回目以降の免疫処置においては、フロインドの不完全アジュバントをタン
パク質と組み合わせ、タンパク質／アジュバントの比を同じにして使用した。３
回の腹腔内での免疫処置は１５日の間隔で行なった。各免疫処置を行なった後第
２週目から初めて免疫処置の全期間に亙り、血液の試料を採取しエリザ（ＥＬＩ
ＳＡ）検定法においてタンパク質Ｑに対する体液性応答を測定した。１回目の免
疫処置後二週間で既にタンパク質Ｑに対する陽性のＩｇＧ応答が観測され、この
応答は感染後二週間の後に高くなり、免疫処置の時間と共に増加して１／１００
．０００の力価に達した。同様に、タンパク質Ｑに対する免疫応答はこの寄生虫
の感染後も著しくは変更されなかった（図１）。
【０１６６】 ３回目の免疫処置から１５日して、感染したハムスターに由来する感染性のア
マスティゴート（ａｍａｓｔｉｇｏｔｅ）とは異なったプロマティゴート（ｐｒ
ｏｍａｓｔｉｇｏｔｅ）寄生虫を１０5個投与して動物に感染させた。この接種
材料が感染した動物１００％に対し強い寄生虫血症を引き起こし、寄生虫投与後
４ヶ月間病気を起こさせることを予めチェックしておいた。表１は、対照および
予防接種を行なった動物の肝臓および脾臓の両方の組織１ｍｇ当たりの寄生虫血
症のレベルを示す。予防接種を行なった動物のすべてにおいて、対照の動物に比
べ肝臓における寄生虫の負荷が減少しており、このことは動物の７５％において
極めて顕著に起こっていることが観測できる。脾臓における寄生虫の負荷を調べ
た場合でも、動物の７５％において対照に比べこの負荷は著しく低く、ＲＰＬは
８３〜８６％に達することが観測できる。肝臓においてＲＰＬが２０％の動物は
脾臓においては４８％であった。
マスティゴート（ａｍａｓｔｉｇｏｔｅ）とは異なったプロマティゴート（ｐｒ
ｏｍａｓｔｉｇｏｔｅ）寄生虫を１０5個投与して動物に感染させた。この接種
材料が感染した動物１００％に対し強い寄生虫血症を引き起こし、寄生虫投与後
４ヶ月間病気を起こさせることを予めチェックしておいた。表１は、対照および
予防接種を行なった動物の肝臓および脾臓の両方の組織１ｍｇ当たりの寄生虫血
症のレベルを示す。予防接種を行なった動物のすべてにおいて、対照の動物に比
べ肝臓における寄生虫の負荷が減少しており、このことは動物の７５％において
極めて顕著に起こっていることが観測できる。脾臓における寄生虫の負荷を調べ
た場合でも、動物の７５％において対照に比べこの負荷は著しく低く、ＲＰＬは
８３〜８６％に達することが観測できる。肝臓においてＲＰＬが２０％の動物は
脾臓においては４８％であった。
【０１６７】 表１．腹腔内の経路を介してタンパク質Ｑを予防接種したハムスターの肝臓 および脾臓における寄生虫の負荷。 感染４週間後に限界希釈法（ｌｉｍｉｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）（短期間）により
寄生虫の負荷を測定した。寄生虫の負荷は組織１ｍｇ当たりの寄生虫の数として
表す。ＲＰＬ＝寄生虫の負荷の減少率（％）。
寄生虫の負荷を測定した。寄生虫の負荷は組織１ｍｇ当たりの寄生虫の数として
表す。ＲＰＬ＝寄生虫の負荷の減少率（％）。
【０１６８】
【表１０】
【０１６９】 対照 ４匹のハムスター １４±５ ２９５±３０ 数は４匹の動物の平均を表す。
【０１７０】 実施例２ 長期間に亙る寄生虫の負荷の減少に関し、他の接種経路を用いタンパク質Ｑで
予防接種を行なう効果を証明するために、４０μＬのＰＢＳ中に溶解した５μｇ
のタンパク質Ｑを４０μＬのフロインドのアジュバントと混合して４匹の動物に
皮下注射して投与した。第１回の免疫処置ではフロインドの完全アジュバントを
使用したが、２回目以降の処置では前述のようにフロインドの不完全アジュバン
トを用いた。予防接種は１５日間隔で３回投与した。三回目の免疫処置後１５日
して、１０5個の感染性の寄生虫を接種した。すべての免疫処置の期間および感
染の全期間（５ヶ月）を通じて血液を採取し、タンパク質Ｑに対する体液性応答
および寄生虫の全タンパク質に対する体液性応答の種類を測定した。図２には、
感染してから第２週目において既に、前の場合と同様に３匹のマウスにおいてタ
ンパク質Ｑに対する応答は陽性であり、１回目の免疫処理の２週間後にはこのタ
ンパク質対する応答は非常に高かいことが示されている。この応答は、残りの免
疫処置後も非常に高い値を維持し、第３回目の免疫処置後の週でも力価は１／７
５．０００に達する。動物の中の１匹ではタンパク質Ｑに対する応答は時間と共
に遅くなったが、実験の末期までにこの応答は他の動物のレベルに達した。従っ
て実施例１および実施例２の両方から導かれるデータから、腹腔および皮下の両
方の経路によるこのタンパク質に対する免疫応答の程度は非常に速いが、同じ時
間では腹腔の経路の応答の方が高い力価に達する（１／７５．０００対１／１０
０．０００）と結論することができる。図３は対照の動物におけるタンパク質Ｑ
に対する応答を示す。このタンパク質に対する反応性は感染後１２〜１４週目に
検出されることを観測することができるが、これは潜在的なリーシュマニア症に
起因する最初の症状が感染した動物に検出され始める時である。表２は対照およ
び予防接種した動物の肝臓および脾臓における寄生虫血症のレベルを示す。この
表から分かるように、寄生虫血症の減少率が非常に高かった（８７〜８９％）と
いう意味で、肝臓のレベルにおいては動物の５０％が防御された。動物の中の一
匹は防御されなかったが、他の動物では寄生虫の負荷の減少率は２２％であった
。これに対し、脾臓のレベルにおいては寄生虫の負荷の減少は１００％の動物の
中で９８〜９９％であった。
予防接種を行なう効果を証明するために、４０μＬのＰＢＳ中に溶解した５μｇ
のタンパク質Ｑを４０μＬのフロインドのアジュバントと混合して４匹の動物に
皮下注射して投与した。第１回の免疫処置ではフロインドの完全アジュバントを
使用したが、２回目以降の処置では前述のようにフロインドの不完全アジュバン
トを用いた。予防接種は１５日間隔で３回投与した。三回目の免疫処置後１５日
して、１０5個の感染性の寄生虫を接種した。すべての免疫処置の期間および感
染の全期間（５ヶ月）を通じて血液を採取し、タンパク質Ｑに対する体液性応答
および寄生虫の全タンパク質に対する体液性応答の種類を測定した。図２には、
感染してから第２週目において既に、前の場合と同様に３匹のマウスにおいてタ
ンパク質Ｑに対する応答は陽性であり、１回目の免疫処理の２週間後にはこのタ
ンパク質対する応答は非常に高かいことが示されている。この応答は、残りの免
疫処置後も非常に高い値を維持し、第３回目の免疫処置後の週でも力価は１／７
５．０００に達する。動物の中の１匹ではタンパク質Ｑに対する応答は時間と共
に遅くなったが、実験の末期までにこの応答は他の動物のレベルに達した。従っ
て実施例１および実施例２の両方から導かれるデータから、腹腔および皮下の両
方の経路によるこのタンパク質に対する免疫応答の程度は非常に速いが、同じ時
間では腹腔の経路の応答の方が高い力価に達する（１／７５．０００対１／１０
０．０００）と結論することができる。図３は対照の動物におけるタンパク質Ｑ
に対する応答を示す。このタンパク質に対する反応性は感染後１２〜１４週目に
検出されることを観測することができるが、これは潜在的なリーシュマニア症に
起因する最初の症状が感染した動物に検出され始める時である。表２は対照およ
び予防接種した動物の肝臓および脾臓における寄生虫血症のレベルを示す。この
表から分かるように、寄生虫血症の減少率が非常に高かった（８７〜８９％）と
いう意味で、肝臓のレベルにおいては動物の５０％が防御された。動物の中の一
匹は防御されなかったが、他の動物では寄生虫の負荷の減少率は２２％であった
。これに対し、脾臓のレベルにおいては寄生虫の負荷の減少は１００％の動物の
中で９８〜９９％であった。
【０１７１】 表２．皮下の経路を介してタンパク質Ｑを予防接種したハムスターの肝臓 および脾臓における寄生虫の負荷。 感染２週間後に限界希釈法（長期間）により寄生虫の負荷を測定した。寄生虫の
負荷は組織１ｍｇ当たりの寄生虫の数として表す。ＲＰＬ＝寄生虫の負荷の減少
率（％）。
負荷は組織１ｍｇ当たりの寄生虫の数として表す。ＲＰＬ＝寄生虫の負荷の減少
率（％）。
【０１７２】
【表１１】
【０１７３】 対照 ４匹のハムスター １．８×１０6±１．２×１０5 ５．２×１０8±２．６×１０7 数は４匹の動物の寄生虫負荷の平均を表す。 レーシュマニア・インファンタム（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ
）のタンパク質ＬｉＨｓｐ７０を含む組成物における防御システムを設計するた
めにタンパク質Ｑを使用できるかどうかを試験する目的で、Ｂａｌｂ／ｃマウス
で実験を行なった。免疫処置を行なった後、肝臓および脾臓の両方において寄生
虫負荷は著しく減少し、若干の動物では４桁程度以下（１／１０００以下）にま
で減少した。
）のタンパク質ＬｉＨｓｐ７０を含む組成物における防御システムを設計するた
めにタンパク質Ｑを使用できるかどうかを試験する目的で、Ｂａｌｂ／ｃマウス
で実験を行なった。免疫処置を行なった後、肝臓および脾臓の両方において寄生
虫負荷は著しく減少し、若干の動物では４桁程度以下（１／１０００以下）にま
で減少した。
【０１７４】 実施例３：フロインドのアジュバントの中におけるタンパク質Ｑ＋タンパク
質Ｈｓｐ７０による免疫処置 ４０μＬのＰＢＳ中に５μｇのタンパク質Ｑおよび５μｇのタンパク質ＬｉＨ
ｓｐ７０を溶解し４０μＬのフロインドのアジュバント中で乳化させた液を、４
匹のハムスターのそれぞれに腹腔注射した。上記のように１回目の免疫処置では
フロインドの完全アジュバントを使用したが、２回目以降ではフロインドの不完
全アジュバントを用いた。予防接種は１５日間隔で３回の投与で行なった。
質Ｈｓｐ７０による免疫処置 ４０μＬのＰＢＳ中に５μｇのタンパク質Ｑおよび５μｇのタンパク質ＬｉＨ
ｓｐ７０を溶解し４０μＬのフロインドのアジュバント中で乳化させた液を、４
匹のハムスターのそれぞれに腹腔注射した。上記のように１回目の免疫処置では
フロインドの完全アジュバントを使用したが、２回目以降ではフロインドの不完
全アジュバントを用いた。予防接種は１５日間隔で３回の投与で行なった。
【０１７５】 ３回目の免疫処置の後１５日して、心臓内の経路を介して１０6個の感染性寄
生虫を接種し、２２週目に動物を殺した。すべての免疫処置期間および全感染期
間を通じて２週間毎に動物から血液を採取し、タンパク質Ｑおよびタンパク質Ｌ
ｉＨｓｐ７０に対する体液性応答を測定した。
生虫を接種し、２２週目に動物を殺した。すべての免疫処置期間および全感染期
間を通じて２週間毎に動物から血液を採取し、タンパク質Ｑおよびタンパク質Ｌ
ｉＨｓｐ７０に対する体液性応答を測定した。
【０１７６】 Ｑタンパク質＋ＬｉＨｓｐ７０で免疫処置を行なったマウスの間の相対的な寄
生虫負荷を表３に示す。すべての動物は高度に防御され、その幾つかでは脾臓に
おいて２桁ないし３桁以下に近い減少率が得られた。
生虫負荷を表３に示す。すべての動物は高度に防御され、その幾つかでは脾臓に
おいて２桁ないし３桁以下に近い減少率が得られた。
【０１７７】 表３．感染後４ヶ月でＱ＋ＬｉＨｓｐ７０タンパク質で免疫処置を行なった Ｂａｌｂ／ｃマウスの相対的な寄生虫の負荷
【０１７８】
【表１２】
【０１７９】 対照 ４匹のマウス ５．１×１０4±２×１０3 ３．２×１０6±８×１０4 数は４匹の動物の寄生虫負荷の平均を表す。 表４および５は、実施例１および２のすべての動物が免疫学的にタンパク質Ｑ
に対して応答し、免疫処置後２週間から始まってタンパク質Ｑに対する応答が高
くなり、この応答は第２の免疫処置（４週）後も増加していることを示している
。表６は、実験の全期間を通じタンパク質ＬｉＨｓｐ７０に対する応答も陽性で
あるが、実施例３におけるタンパク質Ｑに対する応答よりも低いことを示してい
る。
に対して応答し、免疫処置後２週間から始まってタンパク質Ｑに対する応答が高
くなり、この応答は第２の免疫処置（４週）後も増加していることを示している
。表６は、実験の全期間を通じタンパク質ＬｉＨｓｐ７０に対する応答も陽性で
あるが、実施例３におけるタンパク質Ｑに対する応答よりも低いことを示してい
る。
【０１８０】 表４および５． タンパク質Ｑを５μｇ腹腔内に注射した４匹のハムスターにおける免疫応答（表
４−実施例１、短期間）、およびタンパク質Ｑを５μｇ皮下注射した４匹のハム
スターに おける免疫応答（表５−実施例２、長期間）
４−実施例１、短期間）、およびタンパク質Ｑを５μｇ皮下注射した４匹のハム
スターに おける免疫応答（表５−実施例２、長期間）
【０１８１】
【表１３】
【０１８２】 表５：実施例２、長期間 Ｑタンパク質で免疫処置を行なったマウス（長期間） Ｑタンパク質に対する免疫応答
【０１８３】
【表１４】
【０１８４】 光学密度３を示す血清（１／２００に希釈）は１／４５．０００よりも高い力価
をもっている。 対照のマウス Ｑタンパク質に対する免疫応答（長期間）
をもっている。 対照のマウス Ｑタンパク質に対する免疫応答（長期間）
【０１８５】
【表１５】
【０１８６】 血清は１／２００に希釈した。
【０１８７】 表６ ５μｇのタンパク質Ｑおよび５μｇのタンパク質ＬｉＨｓｐ７０を腹腔内に注
射した ４匹のハムスターにおける免疫応答（実施例３、長期間） Ｑタンパク質＋Ｈｓｐ７０で免疫処置を行なったマウス Ｑタンパク質に対する免疫応答
射した ４匹のハムスターにおける免疫応答（実施例３、長期間） Ｑタンパク質＋Ｈｓｐ７０で免疫処置を行なったマウス Ｑタンパク質に対する免疫応答
【０１８８】
【表１６】
【０１８９】 血清は１／８００に希釈した。 対照のマウス Ｑタンパク質に対する免疫応答
【０１９０】
【表１７】
【０１９１】 血清は１／２００に希釈した。 Ｑタンパク質＋Ｈｓｐ７０で免疫処置を行なったマウス Ｈｓｐ７０タンパク質に対する免疫応答
【０１９２】
【表１８】
【０１９３】 血清は１／８００に希釈した。 対照のマウス Ｈｓｐ７０タンパク質に対する免疫応答
【０１９４】
【表１９】
【０１９５】 血清は１／２００に希釈した。
【０１９６】 実施例４：Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるタンパク質Ｑ＋ＢＣＧでの免疫処置 ４０μＬのＰＢＳに溶解した５μｇのタンパク質Ｑおよび１０6個ののＢＣＧ
（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）のコロニー形成単位（Ｃ
ＦＵ）をを用い４匹のＢａｌｂ／ｃマウスに対しそれぞれ腹腔内注射を行なった
。免疫処置は１５日の間隔を置いて３回行なった。３回目の免疫処置後１５日し
て心臓内の経路によりエル．インファンタムのＢＣＮ１５０の感染性寄生虫を１
０5個接種した。免疫処置期間および感染した全期間を通じて２週間毎にマウス
から血液試料を採取し、タンパク質Ｑに対する体液応答の程度を試験した。感染
後８週目に動物を殺した。
（ｂａｃｉｌｌｅ Ｃａｌｍｅｔｔｅ Ｇｕｅｒｉｎ）のコロニー形成単位（Ｃ
ＦＵ）をを用い４匹のＢａｌｂ／ｃマウスに対しそれぞれ腹腔内注射を行なった
。免疫処置は１５日の間隔を置いて３回行なった。３回目の免疫処置後１５日し
て心臓内の経路によりエル．インファンタムのＢＣＮ１５０の感染性寄生虫を１
０5個接種した。免疫処置期間および感染した全期間を通じて２週間毎にマウス
から血液試料を採取し、タンパク質Ｑに対する体液応答の程度を試験した。感染
後８週目に動物を殺した。
【０１９７】 表７（ａおよびｂ）は、免疫処置した動物が第２週から始まってタンパク質Ｑ
に対して陽性に応答し、多くの場合この応答は４００，０００の値に達するまで
次第に増加することを示している。表８は、予防接種された動物と対照の動物の
肝臓および脾臓の間における寄生虫負荷の差を示している。
に対して陽性に応答し、多くの場合この応答は４００，０００の値に達するまで
次第に増加することを示している。表８は、予防接種された動物と対照の動物の
肝臓および脾臓の間における寄生虫負荷の差を示している。
【０１９８】 表７； ５μｇのタンパク質Ｑと１０6個のＢＣＧのＣＦＵで免疫処置を行なっ
た Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるタンパク質Ｑに対する免疫応答 マウス １、２、３、４ 免疫処置を施したマウス マウス ５、６、７、８ 免疫処置を施さなかった対照
た Ｂａｌｂ／ｃマウスにおけるタンパク質Ｑに対する免疫応答 マウス １、２、３、４ 免疫処置を施したマウス マウス ５、６、７、８ 免疫処置を施さなかった対照
【０１９９】
【表２０】
【０２００】 数３は測定システムにおけるオーバーフローに相当する。
【０２０１】 指示したそれぞれの週の始めに血清を採取した。
【０２０２】 第１回目の免疫処置は０日目に行ない、２回目は１５日目に、３回目は３０日
目に行なった。
目に行なった。
【０２０３】 表８． タンパク質Ｑ＋１０6個のＢＣＧを皮下に予防接種した Ｂａｌｂ／ｃマウスの肝臓および脾臓における感染後８週目の寄生虫の負荷 寄生虫負荷は７０００個の核をもった細胞を含む種々の部分を測定することによ
り組織の印像（ｔｉｓｓｕｅ ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）を光学顕微鏡により測定
した。寄生虫の負荷は組織１ｍｇ当たりの寄生虫の量として表される。この値は
１０００個の核をもった細胞当たり１個の寄生虫が組織１ｍｇ当たり２１０個の
寄生虫に相当すると予め計算されている。ＲＰＢ＝寄生虫の負荷の減少率（％）
り組織の印像（ｔｉｓｓｕｅ ｉｍｐｒｅｓｓｉｏｎ）を光学顕微鏡により測定
した。寄生虫の負荷は組織１ｍｇ当たりの寄生虫の量として表される。この値は
１０００個の核をもった細胞当たり１個の寄生虫が組織１ｍｇ当たり２１０個の
寄生虫に相当すると予め計算されている。ＲＰＢ＝寄生虫の負荷の減少率（％）
【０２０４】
【表２１】
【０２０５】 対照 ４匹の動物 平均 ４００±１５ ４１５５±３０ ｎ．ｄ．＝５０００個の核をもった細胞中に寄生虫が検出されなかった。
【配列表】
本発明の特徴の理解を助ける目的で行った記載を補完するために、本開示には
、それと一体の部分として、制限的ではない説明的な性質の一組の図面を添付す
る。下記が記載されている。
、それと一体の部分として、制限的ではない説明的な性質の一組の図面を添付す
る。下記が記載されている。
【図１】 図１は、マルトース結合タンパク質に融合した組換えタンパク質のそれぞれに
対する発現（Ａ）、アミロースカラム中の精製（Ｂ）および抗原性（Ｃ：ウエス
タンブロット、Ｄ：ＥＬＩＳＡ）に相当する。Ｄの図は、完全なタンパク質に対
する組換えタンパク質のそれぞれのＥＬＩＳＡ内における反応性も示す。
対する発現（Ａ）、アミロースカラム中の精製（Ｂ）および抗原性（Ｃ：ウエス
タンブロット、Ｄ：ＥＬＩＳＡ）に相当する。Ｄの図は、完全なタンパク質に対
する組換えタンパク質のそれぞれのＥＬＩＳＡ内における反応性も示す。
【図２】 本発明の目的のキメラ遺伝子を得ると考えられる種々のベクターのグラフ図示
であり、これからリーシュマニア症の症状を示す動物またはヒトに対する正確な
診断を行う目的に対して適切なタンパク質が抽出される。
であり、これからリーシュマニア症の症状を示す動物またはヒトに対する正確な
診断を行う目的に対して適切なタンパク質が抽出される。
【図３】 図３は、その調製が図２に示されるＭＢＰタンパク質に融合されたキメラ遺伝
子から得られるタンパク質の同定に相当する。
子から得られるタンパク質の同定に相当する。
【図４】 図４は、マルトース結合タンパク質（ＰＱＩ−ＰＧＶ）に融合した中間体およ
び最終キメラ遺伝子タンパク質の発現（Ａ）、アミロールカラム中の精製（Ｂ）
および抗原性（Ｃ：ウエスタンブロット、Ｆ：ＥＬＩＳＡ）に相当する。この図
は、キメラ遺伝子の発現（Ｄレーン１）、Ｎｉ−Ｎｔアガロースカラム内の精製
（Ｄレーン２）およびＶＬ血清に対する精製タンパク質の抗原性（Ｅ：ウエスタ
ンブロット）および血清のコレクションに対する精製タンパク質の抗原性（Ｆ：
ＥＬＩＳＡ中のＰＱ）も示す。
び最終キメラ遺伝子タンパク質の発現（Ａ）、アミロールカラム中の精製（Ｂ）
および抗原性（Ｃ：ウエスタンブロット、Ｆ：ＥＬＩＳＡ）に相当する。この図
は、キメラ遺伝子の発現（Ｄレーン１）、Ｎｉ−Ｎｔアガロースカラム内の精製
（Ｄレーン２）およびＶＬ血清に対する精製タンパク質の抗原性（Ｅ：ウエスタ
ンブロット）および血清のコレクションに対する精製タンパク質の抗原性（Ｆ：
ＥＬＩＳＡ中のＰＱ）も示す。
【図５】 図５は、最後に、３群に分類した広範な各種のイヌ血清の反応性の集約図であ
る。第一群は、Ｌ．インファンツムによる真の感染を有する動物を含む。第二群
は、種々の臨床症状は有するがリーシュマニアには感染していないイヌから得た
血清を含み、そして第三群は、健康なイヌからの１５個の血清から成っている。
この図は、ＶＬの血清学的診断を行うための本発明の価値を確認する。
る。第一群は、Ｌ．インファンツムによる真の感染を有する動物を含む。第二群
は、種々の臨床症状は有するがリーシュマニアには感染していないイヌから得た
血清を含み、そして第三群は、健康なイヌからの１５個の血清から成っている。
この図は、ＶＬの血清学的診断を行うための本発明の価値を確認する。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１３年２月２７日（２００１．２．２７）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】 配列番号１のアミノ酸配と少なくとも90％のアミノ酸同一性 を表すタンパク質。
【請求項２】 請求項１に記載のタンパク質をコードするヌクレオチド配列 を含んで成るポリヌクレオチド。
【請求項３】 ヌクレオチド配列が配列番号２である、請求項２に記載のポ リヌクレオチド。
【請求項５】 宿主が細菌である、請求項４に記載の形質転換した宿主。
【請求項６】 請求項１に記載のタンパク質の生産法であって、方法が、
ａ）請求項４または５に記載の形質転換した宿主をタンパク質の発現に対して伝 導性の条件下で培養し、そしてｂ）場合によりタンパク質を回収する工程を含ん で成る上記方法。
ａ）請求項４または５に記載の形質転換した宿主をタンパク質の発現に対して伝 導性の条件下で培養し、そしてｂ）場合によりタンパク質を回収する工程を含ん で成る上記方法。
【請求項７】 請求項１に記載のタンパク質を含んで成る組成物。
【請求項８】 請求項２または３に記載のポリヌクレオチドを含んで成る組 成物。
【請求項９】 組成物が医薬組成物である、請求項７または８に記載の組成 物。
【請求項１０】 請求項１に記載のタンパク質を含んで成る、ヒトまたは動 物のリーシュマニア症を予防および処置するための医薬組成物。
【請求項１１】 さらに腹腔内、皮下または筋肉内投与に適する生理学的ア ジュバントを含んで成る、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】 さらに完全なまたは断片化したタンパク質LiHsp70、また
はそれらの変異体を含んで成る、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
はそれらの変異体を含んで成る、請求項１０または１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】 請求項２または３に記載のポリヌクレオチドを含んで成る 、ヒトおよび動物のリーシュマニア症を予防および処置するための医薬組成物。
【請求項１４】 組成物がワクチンである請求項１０ないし１２のいずれか に記載の医薬組成物。
【請求項１５】 ヒトまたは動物被験体のリーシュマニア症の予防または処 置に使用するための請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１６】 ヒトまたは動物被験体のリーシュマニア症の予防または処 置に使用するための請求項２または３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】 ヒトまたは動物被験体のリーシュマニア症を予防または処 置に使用するための請求項１０ないし１２または１４のいずれかに記載の医薬組 成物。
【請求項１８】 免疫応答を生じるために使用する、請求項１に記載のタン パク質。
【請求項１９】 免疫応答を生じるために使用する、請求項１０ないし１２ および１４のいずれかに記載の医薬組成物。
【請求項２０】 請求項１に記載のタンパク質に対する抗体を含んで成る医 薬組成物。
【請求項２１】 請求項１０ないし１２、１４、１７、１９および２０のい ずれかに記載の医薬組成物を投与することを含んで成る、ヒトまたは動物のリー シュマニア症の予防または処置法。
【請求項２２】 請求項１４に記載のワクチンを投与することを含んで成る 、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防法。
【手続補正書】
【提出日】平成１４年４月３０日（２００２．４．３０）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
【表２】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０５】 対照 ４匹の動物 平均 ４００±１５ ４１５５±３０ ｎ．ｄ．＝５０００個の核をもった細胞中に寄生虫が検出されなかった。
【配列表】
【表２２】
【表２３】
【表２４】
【表２５】
【表２６】
【表２７】
【表２８】
【表２９】
【表３０】
【表３１】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ０７Ｋ 19/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 BA80 CA02 CA04 CA07 CA20 DA02 DA03 DA06 EA04 GA11 HA03 HA17 4C084 AA13 CA53 MA02 MA05 MA55 MA56 MA66 NA14 ZB352 4C085 AA03 AA38 BA04 EE01 EE03 EE06 FF20 GG03 GG04 GG06 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 BA41 CA20 DA86 EA20 EA50 FA74 GA26
Claims (11)
- 【請求項１】 ａ）被験体（ヒトまたは動物）に投与されるタンパク質キメ
ラＱ、または保存されたアミノ酸の修飾もしくは置換を含むこのタンパク質の変
異体により、あるいは ｂ）単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路による任意の生理
学的アジュバントと組み合わされたタンパク質Ｑにより形成される、ヒトまたは
動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物。 - 【請求項２】 ａ）被験体（ヒトまたは動物）に投与されるタンパク質キメ
ラＱ、またはタンパク質Ｑとは保存されたアミノ酸が異なるこのタンパク質の変
異体により、あるいは ｂ）単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路による生理学的ア
ジュバントと組み合わされたタンパク質Ｑにより形成される、リーシュマニア属
の寄生生物を認識する抗体の生産を刺激することができるワクチン。 - 【請求項３】 ａ）完全なまたは断片化したタンパク質LiHsp70と組み合わ
さった被験体（ヒトまたは動物）に投与されるタンパク質Ｑ、または保存された
アミノ酸の修飾もしくは置換を含むこのタンパク質の変異体により、あるいは ｂ）単離された状態の、または腹腔内、皮下または筋肉内経路による例えばBCG
のような生理学的アジュバントと組み合わされたタンパク質Ｑにより形成される
、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物。 - 【請求項４】 ａ）被験体（ヒトまたは動物）に投与されるタンパク質キメ
ラＱをコードする配列、または保存されたアミノ酸をコードするヌクレオチドの
修飾もしくは置換を含むその配列の変異体を担持する任意のDNAベクターにより
、あるいは ｂ）腹腔内、皮下または筋肉内経路により投与される、生理学的アジュバントと
組み合わされたタンパク質Ｑを含むDNAベクターにより形成される、ヒトまたは
動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物。 - 【請求項５】 ａ） １）タンパク質キメラＱをコードする配列、またはこの配列の保存されたアミノ
酸をコードするヌクレオチドの修飾もしくは置換を含む変異体、および ２）被験体（ヒトまたは動物）に投与される、タンパク質 LiHsp 70をコードす
るヌクレオチドの配列または保存されたアミノ酸に関して異なるそれらの変異体
、を担持する任意のDNAベクターにより、あるいは ｂ）腹腔内、筋肉内または皮下経路による生理学的アジュバントと投与されたａ
）で定めたようなタンパク質ＱをコードするDNA配列を含む任意のベクターによ
り形成される、ヒトまたは動物のリーシュマニア症の予防および処置のための医
薬組成物。 - 【請求項６】 アミノ酸配列： 【表１】 またはヒトおよび動物においてリーシュマニア症に対する防御免疫反応を生じる
ために使用することができるそれらの突然変異体またはフラグメントを有する、
特にリーシュマニア症、特にイヌのリーシュマニア症を予防および／または処置
における薬理学的目的に有用なタンパク質。 - 【請求項７】 請求項６のタンパク質またはヒトおよび動物においてリーシ
ュマニア症に対する防御免疫反応を生じるために使用することができるそれらの
突然変異体またはフラグメントを含んで成る、ヒトまたは動物のリーシュマニア
症の予防および処置のための医薬組成物。 - 【請求項８】 請求項６のタンパク質またはヒトおよび動物においてリーシ
ュマニア症に対する防御免疫反応を生じるために使用することができるそれらの
突然変異体またはフラグメントを含んで成る、リーシュマニア属の寄生生物を認
識する抗体の生産を刺激することができるワクチン。 - 【請求項９】 請求項６のタンパク質またはヒトおよび動物においてリーシ
ュマニア症に対する防御免疫反応を生じるために使用することができるそれらの
突然変異体またはフラグメントに対する抗体を含んで成る、ヒトまたは動物のリ
ーシュマニア症の予防および処置のための医薬組成物。 - 【請求項１０】 ヒトまたは動物に請求項１、３、４、５、７または９のい
ずれかに記載の医薬組成物を投与することを含んで成る、ヒトまたは動物におけ
るリーシュマニア症の予防または処置法。 - 【請求項１１】 ヒトまたは動物に請求項２または８に記載のワクチンを投
与することを含んで成る、ヒトまたは動物におけるリーシュマニア症の予防法。
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|---|---|---|---|
| US11382598P | 1998-12-23 | 1998-12-23 | |
| CA60/113,825 | 1998-12-23 | ||
| CA2,256,124 | 1998-12-23 | ||
| US60/113,825 | 1998-12-23 | ||
| CA2256124A CA2256124C (en) | 1998-12-23 | 1998-12-23 | Chimeric gene formed of the dna sequences that encode the antigenic determinants of four proteins of l. infantum, and protein encoded by said gene, and pharmaceutical composition useful for preventing and/or treating leishmaniosis in animals or humans |
| PCT/EP1999/010441 WO2000039298A1 (en) | 1998-12-23 | 1999-12-23 | Chimeric gene encoding the antigenic determinants of four proteins of l. infantum |
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|---|---|
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|---|---|---|---|
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