PT709460E - Vacina para a coccidiose de aves domesticas - Google Patents

Description

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DESCRICÃO “Vacina para a coccidiose de aves domésticas” O presente invento refere-se a uma proteína derivada de uma espécie de Eimeria, em particular Eimeria maxima, que é capaz de estimular linfócitos imunitários. Refere-se também a uma sequência de ácido nucleico que codifica toda ou uma parte antigenicamente significativa desta proteína, um vector recombinante compreendendo tal sequência de ácido nucleico, uma célula ou organismo hospedeiro transformado com tal vector recombinante e uma vacina para a protecção de aves domésticas contra a coccidiose. A coccidiose é uma doença causada por infecção com uma ou mais das muitas espécies de coccídia, parasitas protozoários intracelulares do subfilo Apicomplexa e do género Eimeria. Aves domésticas é aqui definido como aves domesticadas que servem como fonte de ovos ou carne e que incluem tipos comercialmente importantes tais como galinhas, perus, patos, gansos, galinhas-da-índia, faisões, pombos e pavões.

Sabe-se que a coccidiose em aves domésticas é causada por várias espécies diferentes de Eimeria, nomeadamente Eimeria acervulina, E. maxima, E. tenella, E. necatrix, E. brunetti, E. mitis, E. praecox, E. mivati e E. hagani. Algumas pessoas, no entanto, duvidam da verdadeira existência das duas últimas espécies. Infecção de baixo nível com qualquer uma destas espécies de Eimeria resulta numa imunidade protectora a re-infecção.

As espécies diferem no seu efeito patogénico em galinhas, o tipo de galinha desempenhando também um papel; assim, uma galinha para assar estará sujeita a uma grande quantidade de danos por um parasita tal como E. acervulina ou E. maxima porque estes parasitam grandes porções do intestino delgado, onde a digestão da comida desempenha um papel principal. E. maxima é a mais imunogénica das espécies listadas acima, produzindo uma boa protecção natural após infecção. Existem, no entanto, variações de estirpes com pouca ou nenhuma protecção cruzada entre estirpes.

Durante o ciclo de vida, o parasita Eimeria passa por vários estádios. O ciclo de vida começa quando a galinha ingere o estádio infeccioso, conhecido como oócisto em esporulação, durante a alimentação no chão ou por inalação de pó. No caso de E. maxima, o oócisto é anormalmente grande. A parede do oócisto esporulado é rebentada por uma combinação de acção de trituração mecânica e acção química na moela e tracto intestinal,

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ΕΡ 0 709 460/PT resultando na libertação de quatro esporocistos. Os esporocistos passam para o duodeno onde são expostos à bílis e enzimas digestivas resultando na libertação de uma média de dois esporozóides por esporocisto.

Os esporozóides são móveis e procuram células do epitélio adequadas de forma a penetrarem e reproduzirem-se nestas. Após infecção de uma célula do epitélio, o parasita entra na fase de esquizonte do seu ciclo de vida, produzindo de 8 a 16 até >200 merozóides por esquizonte. Uma vez libertados do esquizonte, os merozóides estão livres para infectar outras células do epitélio. Após de dois a cinco destes ciclos de reprodução assexuada, os merozóides intracelulares crescem dando formas sexuadas conhecidas como a feminina ou macrogametócito e a masculina ou microgametócito. Após fertilização do macrogametócito pelos microgâmetas libertados pelo microgametócito, forma-se um zigoto que cria uma parede quística à sua volta. O novo oócisto formado é passado para fora da galinha infectada com os excrementos.

Com as condições ambientais correctas de temperatura e humidade e suficiente oxigénio no ar, o oócisto esporulará para o estádio infeccioso, pronto para infectar um novo hospedeiro e espalhando deste modo a doença. Assim, não é necessário nenhum hospedeiro intermédio para a transferência do parasita de ave para ave. O resultado do parasita Eimeria infectar o tracto digestivo de uma galinha pode ser uma redução no ganho de peso, reduzida conversão dos alimentos, cessação de produção de ovos e, nalguns casos, morte. O aumento na produção intensiva de aves domésticas tem sido acompanhado por graves perdas devido a este parasita; de facto, a coccidiose tomou-se a doença parasítica economicamente mais importante. Na Holanda, as perdas que os criadores de aves domésticas sofrem todos os anos ascendem a milhões de florins. No mesmo ano, uma perda de 300 milhões de dólares foi sofrida nos Estados Unidos.

No passado, vários métodos foram utilizados em tentativas para controlar a coccidiose. Antes do advento dos agentes quimioterapêuticos, o saneamento melhorado utilizando desinfectantes em conjunto com a remoção mecânica de lixo era o principal método empregue; no entanto, normalmente permaneciam suficientes oócistos para transmitir a doença. A introdução de agentes coccidiostáticos na alimentação ou água de beber, em adição a uma boa gestão, resultou nalgum sucesso no controlo da doença. Foi verificado que tais agentes sofriam uma quebra em eficácia ao longo dos anos, devido parcialmente ao desenvolvimento de estirpes de coccídia resistentes à droga. Para além disso, verificou-se 3 86 810

ΕΡ 0 709 460 / PT que vários agentes quimioterapêuticos deixavam resíduos na came, tomando-a inadequada para consumo.

Foram feitas tentativas para controlar a doença imunologicamente administrando a galinhas uma vacina viva consistindo em oócistos de todas as sete espécies de Eimeria, sendo os oócistos administrados de linhas precoces. Tais linhas precoces são obtidas inoculando galinhas com uma população selvagem de uma espécie de Eimeria e recolhendo os primeiríssimos parasitas que são excretados como resultado da infecção. Os parasitas recolhidos são novamente colocados em galinhas e o ciclo é repetido várias vezes. Eventualmente é produzida uma linha precoce de parasita que tem menos ciclos de reprodução assexuada no intestino. Assim, tais linhas mantêm a sua imunogenicidade, produzindo menos parasitas nò intestino o que causa menos danos consequentes à galinha hospedeira. A desvantagem deste tipo de vacina é que é dispendiosa para produzir devido à necessidade de a produzir em galinhas vivas e ao seu baixo potencial reprodutivo. O advento da engenharia genética proporcionou novos métodos para produção de vacinas eficazes. Utilizando estes métodos, o ADN que codifica para as proteínas antigénicas dos mesmos microorganismos patogénicos foi clonado em microorganismos hospedeiros tais como Escherichia coli, com o resultado de que a proteína era expressa a níveis suficientemente elevados de tal forma que podia ser incorporada numa vacina. A vantagem de proteínas produzidas deste modo é a de que estas não são infecciosas e são relativamente baratas para produzir. Desta forma, foram preparadas vacinas contra vários vírus tais como hepatite, herpes simplex e febre aftosa.

Foram feitas tentativas para modificar geneticamente uma vacina para a coccidiose. O pedido de Patente Europeia N° 337589 descreve o isolamento de uma proteína de Eimeria tenella do Grupo B e sua inserção num novo vector de expressão o qual, por sua vez, foi utilizado para transformar hospedeiros apropriados. O pedido de Patente do Tratado de Cooperação WO 92/04461 descreve a construção de um microorganismo que produz uma proteína antigénica utilizando a “via do ARNm” ou a “via do ADN nuclear”. Desta forma, certos antigénios de E. tenella e E. maxima foram preparados e sequenciados. Tomar este tipo de via para preparar antigénios para incorporação numa vacina depende apenas da selecção de antigénios que poderiam induzir anticorpos numa espécie heteróloga. Esta abordagem acaba por não seleccionar necessariamente o antigénio mais protector.

Ko et al. (Mol. and Biochem. Parasitol. 41: 53-64 (1990)) identificaram um anticorpo monoclonal que reage com um merozóide de E. tenella, um polipéptido de

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ΕΡ 0 709 460/PT 4 merozóide de 10-12 kD ou um polipéptido de merozóide de 80 kD, dependendo do tipo de gel utilizado para a análise de peso molecular. Esta proteína de 10-12/80 kD não tem, no entanto, homologia de sequência com a proteína do presente invento.

Foi divulgada uma proteína estimuladora de linfócitos T de Eimeria maxima em EP-A-0653489. Este Pedido refere-se à clonagem e expressão de um gene codificando uma proteína de 70 kD de E. maxima. Um produto de expressão parcial deste gene, compreendendo cerca de 46-48 kD da proteína de 70 kD foi expresso e verificou-se que tinha propriedades estimuladoras de linfócitos T.

Foi agora verificado que ffaccionando parasitas Eimeria e seleccionando proteínas que estimulem linfócitos T imunitários, preparando depois vectores contendo o ácido nucleico que codifica para tais proteínas e subsequentemente preparando uma vacina contendo tais proteínas, pode ser produzida uma vacina para a coccidiose mais eficazmente protectora.

De acordo com um aspecto do presente invento, é proporcionada uma sequência de ácido nucleico codificando toda ou uma parte substancial, em particular a parte imunologicamente activa, de uma proteína estimuladora de linfócitos T de Eimeria purificada. Tal sequência de ácido nucleico pode ser operativamente ligada a sequências de controlo da expressão resultando numa molécula de ácido nucleico recombinante que, quando inserida num vector adequado, resulta num vector recombinante capaz de expressar a sequência de ácido nucleico.

Tal vector recombinante ou sequência de ácido nucleico tal como definido acima, pode ser utilizado para transformar uma célula ou organismo hospedeiro adequado. Tal célula ou organismo hospedeiro transformado pode, por sua vez, ser utilizado para produzir a proteína estimuladora para incorporação numa vacina para a protecção de aves domésticas contra a coccidiose. Altemativamente, a célula ou organismo hospedeiro transformado pode por si próprio ser incorporado numa vacina.

Em geral, o termo “proteína” refere-se a uma cadeia molecular de aminoácidos com actividade biológica. Uma proteína não tem um comprimento específico e pode, se necessário, ser modificada in vivo ou in vitro, através de, por exemplo, glicosilação, amidação, carboxilação ou fosforilação; assim, inter alia, são incluídos na definição péptidos, oligopéptidos e polipéptidos. 5 86 810

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Mais particularmente, o presente invento proporciona proteínas estimuladoras de linfócitos T, ou partes imunogenicamente activas destas, que compreendem a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2 e seus equivalentes ou variantes biologicamente funcionais.

Esta proteína tem um peso molecular de aproximadamente 45 kD. Outra proteína de 45 kD isolada de Eimeria tenella foi descrita por Rhalem et al. (Vet. Immunol. and Immunopath. 38: 327-240 (1993)). Verificou-se no entanto que essa proteína não induzia protecção.

Os equivalentes ou variantes biologicamente funcionais das proteínas especificamente aqui divulgadas são proteínas derivadas das sequências de aminoácidos acima apontadas, através de por exemplo delecções, inserções e/ou substituições de um ou mais aminoácidos, mas mantêm um ou mais determinantes imunogénicos dos antigénios de Eimeria, i.e. as referidas variantes têm um ou mais epítopos capazes de provocar uma resposta imunitária num animal hospedeiro.

Será entendido que, para as proteínas particulares aqui englobadas, podem existir variações naturais entre parasitas Eimeria individuais ou estirpes. Estas variações podem ser demonstradas através de (uma) diferença(s) de aminoácidos na sequência total ou através de delecções, substituições, inserções, inversões ou adições de (um) aminoácido(s) na referida sequência. Substituições de aminoácidos que não alteram essencialmente as actividades biológica e imunológica, foram descritas, e.g. por Neurath et al. em “The Proteins” Academic Press New York (1979). Substituições de aminoácidos entre aminoácidos relacionados ou substituições que ocorreram frequentemente na evolução são, inter alia, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (ver Dayhof, M.D., “Atlas of protein sequence and structure”, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, supl. 3). Outras substituições de aminoácidos incluem Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val e Ala/Glu. Com base nesta informação, Lipman e Pearson desenvolveram um método para comparação rápida e sensível de proteínas (Science, 227, 1435-1441, 1985) e determinação da semelhança funcional entre proteínas homólogas. Tais substituições de aminoácidos das concretizações exemplares do presente invento estão no âmbito do presente invento desde que as proteínas resultantes mantenham a sua imunorreactividade. O presente invento proporciona ainda sequências de ácido nucleico isoladas e purificadas codificando as proteínas acima mencionadas de Eimeria. Tal sequência de ácido nucleico é mostrada em SEQ ED NO: 1. E bem conhecido na arte que a degenerescência do

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,, ΕΡ 0 709 460 / PT 6 código genético permite substituição de bases no codão resultando noutro codão mas codificando ainda para o mesmo aminoácido, e.g. o codão para o aminoácido ácido glutâmico é tanto GAT como GAA. Consequentemente, é claro que, para a expressão de uma proteína com a sequência de aminoácidos mostrada em SEQ DD NO: 2, a sequência de ácido nucleico pode ter uma composição de codões diferente da sequência de ácido nucleico mostrada em SEQ ID NO: 1.

Os parasitas Eimeria maxima foram produzidos através de passagem por galinhas tal como descrito por Long et al. {Folio Vet. Lat., 1976, 6, 201-207). Foram isolados oócistos das fezes das galinhas infectadas, esporulados e depois purificados por flutuação em cloreto de sódio saturado. Os oócistos esporulados foram então utilizados para infectar galinhas de 4 semanas de idade isentas de patogénios. Uma outra dose de oócistos esporulados foi administrada às aves de forma a reforçar a sua resposta imunitária.

Uma preparação de oócistos esporulados purificados por flutuação tal como descrito acima foi sujeita a vibração num desintegrador de forma a libertar esporozóides. Os esporozóides foram tratados com enzimas proteolíticas de forma a libertarem esporozóides os quais foram então lavados e purificados por cromatografia de troca iónica de acordo com o método de Schmatz et al {J. Protozool., 1984, 31, 181-183). Os esporozóides foram suspensos em tampão, fervidos numa banho de água e centrifugados antes de serem carregados num gel de poliacrilamida para SDS-PAGE (electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida). Foram ensaiados no mesmo gel marcadores de massa molecular de forma a extrapolar a massa molecular dos antigénios de Eimeria. O gel foi sujeito a electroforese para um papel de nitrocelulose através do método de Towbin e Gordon, {J. Immunol. Methods., 1984, 72, 313-340). O papel de nitrocelulose foi então lavado e visualizado através de coloração com Aurodye de acordo com as instruções do fabricante.

As bandas proteicas foram recortadas do papel de nitrocelulose, cortadas em pequenos pedaços e transferidas para frascos de vidro, com base no método por Abou-Zeid et al. (J. Imm. Meth. 98, 5-10, 1987). Os pedaços de nitrocelulose foram então solubilizados em dimetilsulfóxido (DMSO) e deixados por um período de tempo para assegurar a solubilização, após o que as partículas de nitrocelulose foram precipitadas através de adição gota a gota de tampão carbonato/bicarbonato com vigorosa agitação por vórtex. As amostras * foram então centrifugadas, os sedimentos de partículas de nitrocelulose foram lavados várias vezes após o que foram ressuspensos e divididos em pequenas alíquotas.

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De forma a determinar se algumas das bandas proteicas do gel de electroforese estimulavam os linfócitos de aves infectadas, foi retirado sangue por punção venosa de galinhas infectadas tal como acima descrito, para utilização num ensaio de proliferação de linfócitos. O sangue foi centrifugado a 600 g, após 10 minutos a suspensão de células por cima dos eritrócitos sedimentados foi removida e centrifugada a 400 g durante mais 10 minutos. As células depositadas após a segunda centrifugação foram lavadas várias vezes e finalmente ressuspensas. As células ressuspensas foram cultivadas em placas de fundo redondo juntamente com as partículas de nitrocelulose ressuspensas diluídas. Foram estabelecidos poços de controlo contendo partículas de nitrocelulose sem proteína.

As culturas de linfócitos foram incubadas durante 96 horas, durante as últimas 16 horas das quais as culturas foram pulsadas com 3H-timidina, após o que as células foram colhidas para filtros de microfibra de vidro. Após secagem, os filtros foram colocados em frascos de cintilação aos quais foi adicionada uma mistura de cintilação líquida (Scintillator 299 [marca registada] Packard, Caversham, U.K.) e a radioactividade foi medida num espectrofotómetro de cintilação. Os resultados foram expressos como um índice de estimulação (IE) obtido utilizando a seguinte fórmula: IE - cpml / cpm2 onde: cpml = contagens médias por minuto de culturas em triplicado incubadas com partículas de NC possuindo proteína cpm2 = contagens médias por minuto de culturas em triplicado incubadas com partículas de NC sem proteína

Através deste método proliferam principalmente linfócitos T.

Os resultados mostraram que embora o índice de estimulação variasse para diferentes aves e diferentes geles, uma banda proteica, com uma massa molecular relativa (Mr) de aproximadamente 45.000, dava uma estimulação consistente de linfócitos de aves imunizadas mas não de controlo.

Após esta descoberta, uma preparação fresca de esporozóides de E. maxima foi * separada por SDS-PAGE e transferida para nitrocelulose tal como descrito acima. Uma banda proteica com uma Mr de 45.000 (p45) foi recortada, solubilizada tal como descrito, lavada em solução salina tamponada com fosfato (PBS) e depois ressuspensa em PBS. Esta suspensão foi inoculada subcutaneamente em coelhos, sendo as injecções repetidas cada 2

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ΕΡ 0 709 460 / PT semanas. Duas semanas após cada injecção os coelhos eram sangrados por punção venosa de uma veia lateral da orelha. Foi obtido soro de coelho anti-p45 após 5 reforços tal como determinado por “Western blotting”.

Foi extraído e purificado de esporozóides de E. maxima ácido ribonucleico total (ARN) por centrifugação através de um gradiente de trifluoroacetato de césio. De forma a separar o ARN mensageiro (ARNm) do ARN não mensageiro, foram utilizadas colunas de oligo dT CELLULOSE (poly[A] Quick, Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. O ARN poli(A)+ ou ARNm foi então eluído da coluna de um dia para o outro utilizando acetato de sódio em etanol absoluto.

Foi sintetizado ácido désoxirribonucleico cópia (ADNc) a partir do ARNm utilizando um estojo de síntese ZAP-cDNA [marca registada] (Stratagene). A primeira cadeia de ADNc foi sintetizada utilizando um molde oligo dT (contendo um local de restrição XhoT) e transcritase reversa do Vírus de Leucemia de Murídeo-Moloney. Os resíduos de citosina na primeira cadeia de ADNc foram metilados de forma a proteger o ADNc de digestão por enzimas de restrição a serem utilizadas mais tarde no protocolo de clonagem. A segunda cadeia de ADNc foi sintetizada utilizando ARNase H e polimerase de ADN I seguido de reparação das extremidades utilizando polimerase de ADN T4. Adaptadores iscoRI foram ligados ao ADNc de extremidades cegas pela ligase de ADN T4. A digestão com Xhol produziu ADNc com uma extremidade 3’ compatível com Xhol e uma extremidade 5’ compatível com íícoRI. O ADNc foi ligado ao vector Uni-ZAP XR digerido com EcoKUXhol e desfosforilado, utilizando a ligase de ADN T4. As bibliotecas primárias resultantes (Emx 8 e Emx 9) foram plaqueadas e amplificadas em células de E. coli SURE. Verificou-se que a biblioteca Emx 8 dava 65% de recombinantes, enquanto que a biblioteca Emx 9 dava 55% de recombinantes.

As duas bibliotecas, Emx 8 e Emx 9, foram pesquisadas utilizando soro de coelho anti-p45, preparado tal como descrito acima. As placas positivas foram picadas e re-pesquisadas até os positivos serem placas puras. O ADNc de clones nas duas bibliotecas, Emx 8 e Emx 9, foi subclonado no plasmídeo pUC19 e analisado através de digestão com endonucleases de restrição. Altemativamente, os ADNc foram sujeitos a resgate plasmídico a partir de lambda Zap utilizando excisão in vivo e subsequentemente analisados por digestão com endonucleases de restrição.

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Desta forma foram identificados vários clones diferentes. Anti-soros seleccionados para dois dos clones reagiram de forma cruzada com diferentes pontos reconhecidos pelos anti-soros anti-p45 em manchas de esporozóides de E. maxima separados por PAGE-2D, sendo estes clones então seleccionados para análise da sequência de ADN. Isto foi efectuado através de subclonagem aleatória e sequenciação utilizando o método de terminação de cadeia didesoxinucleotídica/M13 descrito por Bankier et al. (Techniques in the Life Sciences (Biochemistry) 85: Techniques in Nucleic Acids Biochemistry 1-34,1983).

Uma sequência de ácido nucleico de acordo com o presente invento pode ser isolada a partir de uma determinada estirpe de Eimeria e multiplicada através de técnicas de ADN recombinante incluindo a tecnologia de reacção em cadeia da polimerase (PCR) ou pode ser quimicamente sintetizada in vitro através de técnicas conhecidas na arte.

Uma sequência de ácido nucleico de acordo com o presente invento pode ser ligada a várias sequências de ADN que efectuem replicação com as quais não esteja associada, ou ligada na natureza, resultando no chamado vector recombinante que pode ser utilizado para a transformação de um hospedeiro adequado. Vectores recombinantes adequados são de preferência derivados de plasmídeos, bacteriófagos, cosmídeos ou vírus.

Vectores ou veículos de clonagem específicos que podem ser utilizados para clonar as sequências de ácido nucleico de acordo com o presente invento são conhecidos na arte e incluem inter alia vectores plasmídicos tais como pBR322, os vários pUC, os plasmídeos pGEM e Bluescript; bacteriófagos, p. ex. lambdagt-Wes, Charon 28 e os fagos derivados de M13 ou vectores virais tais como SV40, adenovírus ou vírus do polioma (ver também Rodriquez, R.L. e D.T. Denhardt, ed., “Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses”, Butterworths, 1988; Lenstra, J.A. et al., Arch. Virol., 110, 1-24, 1990). Os métodos a serem utilizados para a construção de um vector recombinante de acordo com o presente invento são conhecidos para os vulgares peritos na arte e são inter alia explicados em Maniatis, T. et al. (“Molecular Cloning A Laboratory Manual”, segunda edição; Cold Spring Harbor Laboratory, 1989).

Por exemplo, a inserção da sequência de ácido nucleico de acordo com o presente invento num vector de clonagem pode ser facilmente alcançada quando ambos os genes e o veículo de clonagem desejado foram cortados com a(s) mesma(s) enzima(s) de restrição uma vez que deste modo são produzidos terminais de ADN complementares.

Altemativamente, pode ser necessário modificar os locais de restrição que são produzidos em extremidades cegas digerindo o ADN de cadeia simples ou preenchendo os 10 86 810

ΕΡ 0 709 460 / PT terminais de cadeia simples com uma polimerase de ADN apropriada. Subsequentemente, pode ser efectuada uma ligação de extremidades cegas com uma enzima tal como a ligase de ADN T4.

Se desejado, qualquer local de restrição pode ser produzido ligando ligadores aos terminais de ADN. Tais ligadores podem compreender sequências oligonucleotídicas específicas que codifiquem sequências de locais de restrição. O vector e sequência de ácido nucleico clivados com enzimas de restrição podem também ser modificados através de adição de cauda homopolimérica. “Transformação”, tal como se utiliza, refere-se à introdução de uma sequência d ácido nucleico heteróloga numa célula hospedeira, independentemente do método utilizado, por exemplo absorção directa ou transdução. A sequência de ácido nucleico heteróloga pode ser mantida através de replicação autónoma ou, altemativamente, pode ser integrada no genoma do hospedeiro. Se desejado, os vectores recombinantes são proporcionados com sequências de controlo apropriadas compatíveis com o designado hospedeiro. Estas sequências podem regular a expressão da sequência de ácido nucleico inserida. Em adição a microorganismos, podem também ser utilizadas como hospedeiros culturas celulares derivadas de organismos multicelulares.

Os vectores recombinantes de acordo com o presente invento contêm de preferência uma ou mais actividades marcadoras que podem ser utilizadas para seleccionar os transformantes desejados, tais como resistência a ampicilina ou tetraciclina em pBR322, resistência a ampicilina e α-péptido da β-galactosidase em pUC8.

Uma célula hospedeira adequada é um microorganismo ou célula que possa ser transformada por uma sequência de ácido nucleico que codifique um polipéptido ou por um vector recombinante compreendendo uma tal sequência de ácido nucleico, e a qual possa, se desejado, ser utilizada para expressar o referido polipéptido codificado pela referida sequência de ácido nucleico. A célula hospedeira pode ser de origem procariótica, e.g. bactérias tais como Escherichia coli, Bacillus subtilis e espécies de Pseudomonas; ou de origem eucariótica tais como leveduras, e.g. Saccharomyces cerevisiae ou células eucarióticas superiores tais como células de insecto, vegetais ou de mamífero, incluindo células HeLa e células de ovário de hamster Chinês (CHO). As células de insecto incluem a linha celular Sf9 de Spodoptera frugiperda (Luckow et al., Biotechnology 6, 47-55, 1988). Informação sobre a clonagem e expressão da sequência de ácido nucleico do presente invento em sistemas de clonagem eucarióticos pode ser encontrada em Esser, K. et al. (“Plasmids of Eukaryotes”, Springer-Verlag, 1986).

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Em geral, são preferidos procariotas para a construção dos vectores recombinantes úteis no presente invento. Estirpes de E. coli Kl2 são particularmente úteis, especialmente as estirpes DH5a ou MC 1061.

Para expressão, sequências de ácido nucleico do presente invento são introduzidas num vector de expressão, i.e. as referidas sequências são operativamente ligadas a sequências de controlo da expressão. Tais sequências de controlo podem compreender promotores, estimuladores, operadores, indutores, locais de ligação a ribossomas, etc. Por isso, o presente invento proporciona um vector recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma proteína de Eimeria acima identificada operativamente ligada a sequências de controlo da expressão, o qual é capaz de expressar as sequências de ADN aí contidas numa célula(s) hospedeira(s) transformada(s).

Claro que deve ser entendido que as sequências nucleotídicas inseridas no local seleccionado do vector de clonagem podem incluir nucleótidos que não façam parte do actual gene estrutural para o polipéptido desejado, ou podem incluir apenas um fragmento do gene estrutural completo para a proteína desejada desde que o hospedeiro transformado produza um polipéptido possuindo pelo menos um ou mais determinantes imunogénicos de um antigénio proteico de Eimeria.

Quando as células hospedeiras são bactérias, as sequências de controlo da expressão úteis que podem ser utilizadas incluem o promotor e operador de Trp (Goeddel, et al., Nucl. Acids Res., 8, 4057, 1980); o promotor e operador lac (Chang, et al., Nature, 275, 615, 1978); o promotor da proteína da membrana externa (Nakamura, K. e Inouge, Μ., EMBO J., 771-775, 1982); os promotores e operadores do bacteriófago lambda (Remaut, E. et al., Nucl. Acids Res., 11, 4677-4688, 1983); o promotor e operador da α-amilase (B. subtilis), sequências de terminação e outras sequências de estimulação e controlo da expressão compatíveis com a célula hospedeira seleccionada. Quando a célula hospedeira é levedura, sequências de controlo da expressão úteis ilustrativas incluem, e.g. o factor de conjugação a. Para células de insecto podem ser utilizados os promotores da polihedrina ou plO de baculovírus (Smith, G.E. et al., Mol. Cell. Biol. 3, 2156-65, 1983). Quando a célula hospedeira é de origem em mamífero sequências de controlo da expressão úteis ilustrativas incluem o promotor SV-40 (Berman, P.W. et al., Science, 222, 524-527, 1983) ou o promotor da metalotioneína (Brinster, R.L., Nature, 296, 39-42, 1982) ou um promotor de choque térmico (Voellmy et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82, 4949-53, 1985). Altemativamente, podem também ser aplicadas sequências de controlo da expressão presentes em Eimeria. Para maximizar a expressão génica, ver também Roberts e Lauer (Methods in Enzymology, 68, 473, 1979). 12 86 810

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Por isso, o presente invento engloba também (uma) célula(s) hospedeira(s) contendo uma sequência de ácido nucleico ou uma molécula de ácido nucleico recombinante ou um vector recombinante descrito acima, capaz de produzir a proteína de Eimeria através de expressão da sequência de ácido nucleico. A imunização de aves domésticas contra infecção por Eimeria pode ser conseguida administrando às aves uma proteína de acordo com o presente invento num contexto imunologicamente relevante tal como uma vacina de subunidade. A vacina de subunidade de acordo com o presente invento pode compreender uma proteína numa forma pura, opcionalmente na presença de um transportador farmaceuticamente aceitável. A proteína pode opcionalmente ser covalentemente ligada a uma proteína não relacionada, a qual pode ser vantajosa na purificação do produto de fusão. Exemplos são a β-galactosidase, proteína A, proquimosina, factor sanguíneo de coagulação Xa, etc.

Nalguns casos a capacidade para aumentar a imunidade protectora utilizando estas proteínas pode per se ser baixa. Pequenos fragmentos são de preferência conjugados com moléculas transportadoras de forma a aumentar a sua imunogenicidade. Transportadores adequados para este fim são macromoléculas, tais como polímeros naturais (proteínas como a hemocianina de lapa, albumina, toxinas), polímeros sintéticos como poliaminoácidos (polilisina, polialanina) ou micelas ou compostos anfifilicos como saponinas. Altemativamente, estes fragmentos podem ser proporcionados como polímeros destes, de preferência polímeros lineares.

Se necessário, as proteínas de acordo com o presente invento que são para serem utilizadas numa vacina podem ser modificadas in vitro ou in vivo, por exemplo através de glicosilação, amidação, carboxilação ou fosforilação.

Uma alternativa a vacinas de subunidade são vacinas vivas. Uma sequência de ácido nucleico de acordo com o presente invento é introduzida através de técnicas de ADN recombinante num microorganismo (e.g. uma bactéria ou vírus) de tal forma que o microorganismo recombinante ainda seja capaz de se replicar, expressando deste modo um polipéptido codificado pela sequência de ácido nucleico inserida e provocando uma resposta imunitária na ave hospedeira infectada.

Uma concretização preferida do presente invento é um vírus vector recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico heteróloga acima descrita, capaz de expressar a sequência de ADN em célula(s) hospedeira(s) ou ave hospedeira infectada com o

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ΕΡ 0 709 460/PT vírus vector recombinante. O termo “heteróloga” indica que a sequência de ácido nucleico de acordo com o presente invento não está normalmente presente na natureza no vírus vector.

Para além disso, o presente invento compreende também célula(s) hospedeira(s) ou cultura celular infectada com o vírus vector recombinante, capaz de produzir a proteína de Eimeria através de expressão da sequência de ácido nucleico.

Por exemplo, a técnica bem conhecida de recombinação homóloga in vivo pode ser utilizada para introduzir uma sequência de ácido nucleico heteróloga de acordo com o presente invento no genoma do vírus vector.

Primeiro, um fragmento de ADN correspondendo a uma região de inserção do genoma do vector, i.e. uma região que possa ser utilizada para a incorporação de uma sequência heteróloga sem destruir funções essenciais do vector tais como as necessárias para infecção ou replicação, é inserido num vector de clonagem de acordo com técnicas padrão de ADNrec. Foram relatadas regiões de inserção para um grande número de microorganismos (e.g. EP 80806, EP 110385, EP 83286, EP 314569, WO 88/02022, WO 88/07088, US 4769330 eUS 4722848).

Segundo, se desejado, pode ser introduzida uma delecção na região de inserção presente na molécula do vector recombinante obtida a partir do primeiro passo. Isto pode ser conseguido por exemplo através de digestão apropriada com exonuclease ΙΠ ou tratamento com enzimas de restrição da molécula do vector recombinante do primeiro passo.

Terceiro, a sequência de ácido nucleico heteróloga é inserida na região de inserção presente no vector recombinante do primeiro passo ou no lugar do ADN deletado do referido vector recombinante. A sequência de ADN da região de inserção deve ter um comprimento apropriado de forma a permitir que ocorra recombinação homóloga com o genoma do vector. Em seguida, células adequadas podem ser infectadas com vírus vector de tipo selvagem ou transformadas com ADN genómico do vector na presença do vector recombinante contendo a inserção flanqueada por sequências de ADN do vector apropriadas pelo que ocorre recombinação entre as regiões correspondentes no vector recombinante e o genoma do vector. Pode agora ser produzida descendência do vector recombinante em cultura celular e pode ser seleccionada por exemplo genotipicamente ou fenotipicamente, e.g. por hibridação, detectando actividade enzimática codificada por um gene co-integrado juntamente com a sequência de ácido nucleico heteróloga, ou detectando imunologicamente o polipéptido heterólogo antigénico expresso pelo vector recombinante. 14 86 810

ΕΡ 0 709 460 / PT A seguir, estes microorganismos recombinantes podem ser administrados a aves domésticas para imunização após o que estes se mantêm durante algum tempo, ou mesmo se replicam no corpo do animal inoculado, expressando in vivo um polipéptido codificado pela sequência de ácido nucleico inserida de acordo com o presente invento resultando na estimulação do sistema imunitário do animal inoculado. Vectores adequados para a incorporação de uma sequência de ácido nucleico de acordo com o presente invento podem ser derivados de vírus tais como vírus da varíola, e.g. vírus vaccínia (ΕΡ 110385, EP 83286, US 4769330 e US 4722848) ou vírus da varíola de galinha (WO 88/02022), vírus de herpes tais como HVT (WO 88/07088) ou vírus da Doença de Marek, adenovírus ou vírus da gripe, ou bactérias tais como E. coli ou espécies específicas de Salmonella. Com microorganismos recombinantes deste tipo, o polipéptido sintetizado no animal hospedeiro pode ser exposto como antigénio de superfície; Neste contexto, é concebível a fusão do polipéptido com proteínas OMP ou proteínas pilus de por exemplo E. coli ou provisão sintética de sequências sinal e âncora que sejam reconhecidas pelo organismo. É também possível que o polipéptido de Eimeria, se desejado como parte de um todo maior, seja libertado dentro do animal a ser imunizado. Em todos estes casos é também possível que um ou mais produtos imunogénicos encontrem expressão que crie protecção contra vários patogénios e/ou contra vários antigénios de um dado patogénio.

Uma vacina de vector de acordo com o presente invento pode ser preparada cultivando uma bactéria recombinante ou uma célula hospedeira infectada com um vector recombinante compreendendo a sequência de ácido nucleico de acordo com o presente invento, após o que as bactérias ou vector recombinante contendo células e/ou vírus vector recombinantes crescidos nas células podem ser recolhidos, opcionalmente numa forma pura, e transformados numa vacina opcionalmente numa forma liofilizada.

Uma vacina de vector pode também ser preparada transfectando outros parasitas protozoários tais como Toxoplasma, Eimeria sp. ou Leishmania com o ADN descrito no presente invento. Mas também pode ser utilizado ADN nu como vacina desde que este seja apresentado num plasmídeo ou em combinação com sequências de promotores eucarióticos adequados tais como os do vírus SV40. Células hospedeiras transformadas com o vector recombinante de acordo com o presente invento podem também ser cultivadas sob condições que sejam favoráveis à expressão de um polipéptido codificado pela referida sequência de ácido nucleico. Podem ser preparadas vacinas utilizando amostras da cultura bruta, lisados de células hospedeiras ou extractos de células hospedeiras, embora noutra concretização polipéptidos mais purificados de acordo com o presente invento sejam transformados numa vacina, dependendo da sua 15 86 810 ΕΡ 0 709 460 / PT utilização pretendida. De forma a purificar os polipéptidos produzidos, as células hospedeiras transformadas com um vector recombinante de acordo com o presente invento são cultivadas num volume adequado e os polipéptidos produzidos são isolados a partir de tais células ou a partir do meio se a proteína for excretada. Os polipéptidos excretados para o meio podem ser isolados e purificados através de técnicas padrão, e.g. fraccionamento salino, centrifugação, ultrafiltração, cromatografia, filtração em gel ou cromatografia de imunoafinidade, enquanto que os polipéptidos intracelulares podem ser isolados recolhendo primeiro as referidas células, rompendo as células, por exemplo por ultra-sons ou por outros meios mecanicamente disruptivos tais como a prensa Francesa, seguido de separação dos polipéptidos dos outros componentes intracelulares e transformando os polipéptidos numa vacina. O rebentamento das células pode também ser alcançado através de meios químicos (e.g. EDTA ou detergentes tais como Triton XI14) ou enzimáticos, tais como digestão com lisozimas.

Anticorpos ou anti-soro dirigidos contra um polipéptido de acordo com o presente invento têm uma potencial utilização em imunoterapia passiva, imunoensaios de diagnóstico e criação de anticorpos anti-idiotípicos.

As proteínas de Eimeria tal como caracterizadas acima podem ser utilizadas para produzir anticorpos, tanto policlonais, monoespecíficos como monoclonais. Se se deseja anticorpos policlonais, as técnicas para produção e processamento de soros policlonais são conhecidas na arte (e.g. Mayer e Walter. eds., “Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology”, Academic Press, Londres, 1987). Anticorpos monoespecíficos para um imunogénio podem ser purificados por afinidade a partir de anti-soros poliespecíficos através de uma modificação do método de Hall et al. (Nature, 311, 379-387, 1984). Anticorpo monoespecífico, tal como aqui se utiliza, é definido como uma única espécie de anticorpo ou múltiplas espécies de anticorpos com características de ligação homogénea para o antigénio relevante. Ligação homogénea, tal como aqui se utiliza, refere-se à capacidade do anticorpo para se ligar a um antigénio ou epítopo específico.

Anticorpos monoclonais, reactivos contra as proteínas de Eimeria de acordo com o presente invento, podem ser preparados imunizando ratinhos consanguíneos através de técnicas conhecidas na arte (Kohler e Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975). Células de hibridoma são seleccionadas por crescimento em hipoxantina, timidina e aminopterina num meio de cultura celular tal como o meio de Eagle modificado por Dulbecco. Os hibridomas que produzem anticorpos são clonados, de preferência utilizando a técnica de agar mole de MacPherson (“Soft Agar Techniques, Tissue Culture Methods and Applications”, Kruse and Paterson, eds., Academic Press, 276,1973). As colónias discretas são transferidas para poços

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ΕΡ 0 709 460 / PT individuais de placas de cultura para cultivo num meio de cultura apropriado. As células que produzem anticorpos são identificadas pesquisando com um imunogénio apropriado. As células de hibridoma positivas para o imunogénio são mantidas através de técnicas conhecidas na arte. São produzidos anticorpos específicos anti-monoclonais cultivando os hibridomas in vitro ou preparando fluído de ascites em ratinhos após injecção de hibridoma através de procedimentos conhecidos na arte.

Anticorpos anti-idiotípicos são imunoglobulinas que transportam uma “imagem interna” do antigénio do patogénio contra o qual se deseja protecção e podem ser utilizados como imunogénio numa vacina (Dreesman et al., J. Infect. Disease, 151, 761, 1985). As técnicas para criar anticorpos anti-idiotípicos são conhecidas na arte (MacNamara et al., Science, 226, 1325, 1984). A vacina de acordo com o presente invento pode ser administrada num esquema de imunização activa convencional: administração única ou repetida de uma forma compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade tal que seja profílacticamente eficaz, i.e. a quantidade de antigénio imunizante ou microorganismo recombinante capaz de expressar o referido antigénio que induzirá imunidade em aves domésticas contra o confronto por parasitas de Eimeria vimlentos. Imunidade é definida como a indução de um nível significativo de protecção numa população de galinhas após vacinação em comparação com um gripo não vacinado.

Para vacinas de vector virai vivas a taxa de dose por galinha pode variar de 10-10 pfu. Uma vacina de subumdade típica de acordo com o presente invento compreende 1 pg-l mg da proteína de acordo com o presente invento. Tais vacinas podem ser administradas intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, oral ou intranasalmente.

Adicionalmente, a vacina pode também conter um meio aquoso ou uma suspensão contendo água, frequentemente misturada com outros constituintes de forma a aumentar a actividade e/ou o tempo de armazenamento. Estes constituintes podem ser sais, tampões de pH, estabilizadores (tais como leite desnatado ou hidrolisado de caseína), emulsionantes, adjuvantes para melhorar a resposta imunitária (e.g. óleos, dipéptido de muramilo, hidróxido de alumínio, saponina, polianiões e substâncias anfipáticas) e conservantes. E claro que uma vacina de acordo com o presente invento pode também conter imunogénios relacionados com outros patogénios de aves domésticas ou pode conter sequências de ácido nucleico codificando estes imunogénios, como antigénios do vírus da

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Doença de Marek (MDV), vírus da Doença de Newcastle (NDV), vírus da Bronquite Infecciosa (EBV), Agente da Anemia de Galinha (CAA), vírus Reo, Retrovírus Avícola, Adenovírus de Galinha, vírus da Rinotraqueíte de Perú, E. coli ou outra espécie de Eimeria para produzir uma vacina polivalente. O presente invento refere-se também a um “reagente imunoquímico”, reagente esse que compreende uma proteína de acordo com o presente invento. O termo “reagente imunoquímico” significa que a proteína de acordo com o presente invento está ligada a um suporte adequado ou é proporcionada com uma substância de marcação.

Os suportes que podem ser utilizados são, por exemplo, a parede interna de um poço de microteste ou uma cuvete, hm tubo ou capilar, uma membrana, filtro, fita de teste ou a superfície de uma partícula tal como, por exemplo, uma partícula de látex, um eritrócito, uma solução coloidal corante, uma solução coloidal metálica ou composto metálico como partícula de solução coloidal.

Substâncias de marcação que podem ser utilizadas são, inter alia, um isótopo radioactivo, um composto fluorescente, uma enzima, uma solução coloidal corante, solução coloidal metálica ou composto metálico como partícula de solução coloidal.

Uma sequência de ácido nucleico de acordo com o presente invento pode também ser utilizada para conceber sondas específicas para experiências de hibridação para a detecção de ácidos nucleicos relacionados com Eimeria em qualquer tipo de tecido. O presente invento compreende também um estojo de teste compreendendo a referida sequência de ácido nucleico útil para o diagnóstico de infecção por Eimeria. O presente invento refere-se também a um estojo de teste a ser utilizado num imunoensaio, contendo este estojo de teste pelo menos um reagente imunoquímico de acordo com o presente invento. A reacção imunoquímica que ocorre utilizando este estojo de teste é de preferência uma reacção em sanduíche, uma reacção de aglutinação, uma reacção de competição ou uma reacção de inibição.

Para efectuar uma reacção em sanduíche, o estojo de teste pode consistir, por exemplo, num polipéptido de acordo com o presente invento ligado a um suporte sólido, por exemplo a parede interna de um poço de microteste, e ou um polipéptido marcado de acordo com o presente invento ou um anti-anticorpo marcado. 18 86 810

ΕΡ 0 709 460 / PT Ο presente invento é ilustrado pelos seguintes exemplos.

Exemplo 1

Preparação de anti génios de esporozóides de E. maxima 1 .a.i. Preparação dos parasitas

Parasitas da estirpe Houghton de Eimeria maxima (E. maxima H) foram passados por galinhas Light Sussex tal como descrito por Long et al. {Folio Vet. Lat., 1976, 6: 201-207). Foram isolados oócistos das fezes, esporulados em dicromato de potássio a 2% a 29°C durante 72 horas, esterilizados à superfície lavando em hipoclorito de sódio a 10% e purificados por flutuação em cloreto de sódio saturado. Os oócistos esporulados foram suspensos em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,6 e quebrados através de vibração. Os esporocistos foram suspensos em PBS pH 7,6 contendo bílis suína a 0,5% p/v (Difco) e tripsina a 0,25% p/v (Difco 1:250) e incubados a 41°C durante 30 minutos. Os esporozóides libertados foram lavados em PBS pH 8,0, purificados em colunas de DE-52 (Whatman) tal como descrito por Schmatz et al. {J. Protozool., 1984, 31: 181-183) e armazenados como sedimentos em tubos de microcentrífuga a -70°C. l.a.ii. Preparação dos antigénios

Os sedimentos de esporozóides (5x107) foram solubilizados através de fervura durante 10 minutos em 100 ml de tampão de amostra (Tris-Cl 50 mM pH 6,8, SDS a 2%, glicerol a 10%, DTT 100 mM e 10 mg/ml de azul de bromofenol) e depois carregados num gel de SDS-poliacrilamida descontínuo. Os geles foram sujeitos a electroforese e os polipéptidos foram transferidos para papel de nitrocelulose (NC) através do método de Towbin e Gordon {J. Immunol. Methods, 1984, 72: 313-340). Após a transferência, o papel de NC foi lavado em PBS pH 7,6 contendo Tween-20 a 0,3% e os polipéptidos foram visualizados através de coloração com ouro coloidal (Aurodye, Cambio, Inglaterra) de acordo com as instruções do fabricante. O papel de NC foi cortado em tiras, cada uma das quais transportando polipéptidos de Eimeria de um espectro limitado de massa molecular. Cada tira foi cortada em pequenos pedaços e os pedaços foram transferidos para frascos de vidro marcados. A cada frasco foram adicionados 400 ml de DMSO e a mistura foi deixada durante 60 minutos para assegurar solubilização e esterilização. As partículas de NC foram precipitadas através da adição gota a gota, com agitação vigorosa por vórtex, de um volume igual de tampão carbonato/bicarbonato (50 mM, pH 9,6). As amostras foram transferidas para tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e centrifugadas a 10000 g durante 5 minutos. As partículas de NC foram lavadas três vezes em meio RPMI 1640 (Gibco Biocult, Paisley, Escócia) e depois

86 810 EP 0 709 460 / PT 19 finalmente suspensas em 1 ml deste meio, divididas em alíquotas de 200 μΐ e armazenadas congeladas a -70°C.

Exemplo 2

Identificação de antigénios linfoestimuladores 2.a. Métodos 2.a.i. Imunização de animais

Para infecções primárias, grupos de galinhas Reaseheath-C (4 semanas de idade, 10 aves por grupo) foram doseadas oralmente com 4000 oócistos esporulados de E. maxima H. Para infecções secundárias, as mesmas aves foram oralmente doseadas com 50000 oócistos esporulados de E. maxima H. Para cada experiência foi mantido separadamente um grupo de controlo com a mesma idade de galinhas Reaseheath-C. 2.a.ii. Preparação de linfócitos de sangue periférico

Amostras de sangue (5 ml) foram retiradas de veias superficiais da asa para seringas de plástico contendo heparina (10 unidades/ml). O sangue foi transferido para tubos (Falcon 2027, Becton-Dickinson) e centrifiigado a 400 rpm durante 15 minutos numa centrífuga Sorvall RC3B. A camada de células acima dos eritrócitos sedimentados foi cuidadosamente removida com uma pipete para tubos novos (Falcon 2059, Becton-Dickinson) e centrifúgada a 2000 rpm durante 10 minutos. As células depositadas foram lavadas três vezes em RPMI 1640 contendo soro fetal de vitelo (FCS, pesquisado quanto a vírus e micoplasma, Gibco Biocult) a 10%, 200 unidades/ml de penicilina e 200 mg/ml de estreptomicina (G. R. Squibb & Sons, Moreton, Inglaterra) e ressuspensas no mesmo meio a 4x106 células/ml. Alíquotas de 100 μΐ de células (4x105) foram pipetadas para poços de fundo redondo de placas de 96 poços (Nunc-Gibco, Paisley, Escócia). A cada poço foram adicionados 100 μΐ de uma amostra preparada. As amostras de teste consistiam em suspensões de partículas de NC preparadas (ver Exemplo l.a.i) diluídas em meio RPMI 1640 contendo FCS a 10%, 200 unidades/ml de penicilina, 200 mg/ml de estreptomicina. Para preparar as diluições as suspensões foram descongeladas de -70°C, diluídas dez vezes com meio e foi depois feita uma série de diluições de duas vezes. As amostras de controlo continham suspensões de partículas de NC sem proteína diluídas de forma idêntica. Uma segunda série de amostras de controlo continha um lisado de esporozóides inteiros (0,5 mg/ml de proteína) preparado *· através de congelação-descongelação e sujeição a ultra-sons dos esporozóides. Cada amostra foi preparada em triplicado para cada preparação celular com réplicas colocadas ao acaso nas placas. As placas foram incubadas durante 96 horas a 41°C em CO2 a 5%, pulsadas durante as últimas 16 horas com 1 mCi de 3H-timidina a 48 Ci/mmol (Amersham U.K.) e depois

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EP 0 709 460 / PT 20 colhidas (Dynatron Macromash Harvester, Dynatech Laboratories Ltd., Sussex, Inglaterra) para filtros de microfibra de vidro (MA781, Dynatron Laboratories Ltd.). Após secagem durante 1 h a 50°C os discos foram colocados em frascos de cintilação, foram adicionados 3,5 ml de mistura de cintilação líquida (Scintillator 299™ Packard, Caversham, U.K.) e a incorporação radioactiva foi medida num espectrofotómetro de cintilação (Beckman Instruments Inc. LS9000). 2.b. Resultados

Os resultados são expressos como um índice de estimulação (IE) calculado para cada amostra com células de cada ave tal como se segue: IE = cpml / cpm2 onde: cpml = contagens médias por minuto de culturas em triplicado incubadas com partículas de NC possuindo proteína cpm2 = contagens médias por minuto de culturas em triplicado incubadas com partículas de NC sem proteína

Verificou-se que as tiras de NC solubilizadas contendo polipéptidos com massas moleculares relativas de aproximadamente 49 kDa/45 kDa (colectivamente chamado 45 kDa) estimulavam a proliferação de linfócitos de aves infectadas (ver Tabela 1). Os linfócitos de aves de controlo não eram estimulados a proliferar. Os IEs variaram de 4 a 9 e os estudos temporais mostraram que linfócitos preparados a partir de aves 4 dias após a infecção secundária proliferavam mais.

Exemplo 3

Criação e pesquisa de anticorpos para antigénios linfoestimuladores 3.a. Métodos 3.a.i. Imunização dos animais

Coelhos isentos de patogénios (Harlan-Olac, Bicester, Inglaterra) foram mantidos sem coccídia. Polipéptidos de sedimentos de esporozóides de E. maxima H foram solubilizados, separados por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida e transferidos para NC tal como descrito no Exemplo 1. As tiras de NC possuindo polipéptidos com massas moleculares de 45 kDa foram cortadas, solubilizadas em DMSO tal como descrito no Exemplo 1, lavadas em PBS pH 7,0 e finalmente suspensas em 1 ml de PBS 7,0. As

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ΕΡ 0 709 460 / PT 21 suspensões foram injectadas subcutaneamente em 4 locais (0,25 ml por local) e as injecções foram repetidas cada 2 semanas utilizando uma tira de NC por coelho de cada vez. O soro de coelho foi preparado 2 semanas após a quarta injecção.

Galinhas Light Sussex (3 semanas de idade) foram mantidas sem coccídia. Polipéptidos de sedimentos de esporozóides de E. maxima H foram solubilizados, separados por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida e o gel foi brevemente corado numa solução aquosa de Azul Brilhante de Coomassie. Uma fatia de poliacrilamida contendo polipéptidos de massas moleculares à volta de 45 kDa foi cortada e desfeita em pequenos pedaços. Os pedaços de gel foram decantados para uma câmara Schleicher & Schuell Biotrap e os polipéptidos foram electroeluídos a 150 V durante 16 horas, de acordo com as instruções do fabricante. A proteína eluída foi dializada extensivamente contra PBS pH 7,6 e depois tratada com resina AG11A8 para remover quaisquer vestígios de SDS que tenham permanecido. O antigénio foi misturado com saponina (Sigma) e injectado subcutaneamente nos pescoços das galinhas (0,5 ml contendo 5 pg de saponina e 1-5 pg de proteína por galinha) e as injecções foram repetidas mais duas vezes com dois intervalos semanais. O soro de galinha foi preparado 2 semanas após a terceira injecção. 3.a.ii. Pesquisa de anti-soros através de “blotting” uni- e bidimensional

Polipéptidos de sedimentos de esporozóides de E. maxima H foram solubilizados e separados por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida tal como descrito no Exemplo 1. Altemativamente, os esporozóides (7xl07) foram suspensos em 500 pl de tampão de lise (Nonidet-P40 a 0,2%, CHAPS 20 mM, ureia 9 M, Biolytes 3-10 (Biorad) a 0,2%, DTT 1 mM), sujeitos a ultra-sons (três rebentamentos de dez segundos a 10 microns, MSE soniprep 50) e sujeitos a três ciclos congelação-descongelação. As amostras foram centrifugadas a 12000 g numa microcentrífuga durante 1 minuto e os polipéptidos foram depois separados por electroforese em gel bidimensional essencialmente tal como descrito por 0’Farrell (J. Biol. Chem., 1975, 2S0: 4007-4021).

Os polipéptidos separados foram transferidos para papel de NC tal como descrito no Exemplo 1. O papel de NC foi imerso em tampão TTN (Tris-HCl 10 mM pH 7,4, NaCl 500 mM, Tween-20 a 0,05%) contendo albumina de soro bovino (BSA) a 3% e incubado à temperatura ambiente, com agitação suave, durante 2 horas. O papel foi passado por água, cortado em tiras e cada tira foi incubada durante 3 horas numa amostra de soro de coelho diluído 1:250 em TTN contendo BSA a 1%. As tiras foram lavadas três vezes em TTN contendo Tween-20 a 0,5% e depois incubadas durante 1 hora em IgG de cabra anti-coelho conjugada com fosfatase alcalina (Promega), diluída 1:7500 em TTN contendo BSA a 1%. As tiras foram lavadas mais três vezes em TTN contendo Tween-20 a 0,5% e uma vez num 22 86 810

ΕΡ 0 709 460 / PT tampão AP (FA) (Tris 100 raM pH 9,5, NaCl 100 mM, MgCl2 10 mM). A ligação do conjugado fosfatase foi detectada incubando as tiras em tampão AP contendo 50 mg/ml de nitroazul-tetrazólio e 50 mg/ml de bromocloroindolil-fosfato. 3. b. Resultados

As especificidades dos soros anti-p45 de coelho e de galinha sondados em “Western blots” unidimensionais de polipéptidos de E. maxima são mostradas na Figura 1. O reconhecimento de pontos em “Western blots” bidimensionais é resumido na Tabela 2.

Exemplo 4

Construção de uma biblioteca de ADNc de esporozóides de E. maxima 4, a. Métodos 4.a.i. Isolamento de ARNm

Foram purificados esporozóides de E. maxima (5xl08) tal como descrito no Exemplo 1. Foi preparado ARN total celular utilizando um estojo de extracção de ARN (Pharmacia) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, os esporozóides foram lisados por incubação em tiocianato de guanidínio tamponado, N-lauril-sarcosina e EDTA, e o ARN foi separado dos outros componentes celulares por ultracentrifugação através de trifluoroacetato de césio tamponado. O sedimento de ARN foi cuidadosamente dissolvido em tampão TE (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM) e armazenado a -70°C como um precipitado em etanol. O ARN mensageiro foi purificado a partir desta preparação de ARN total utilizando colunas de oligo (dT)-celulose (poly(A) Quick, Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o ARN precipitado foi sedimentado por centrifugação a 12000 g durante 30 minutos, seco ao ar e suspenso em 400 μΐ de tampão TE contendo NaCl 500 mM. O ARN foi aplicado ao topo de uma coluna que foi pré-equilibrada no mesmo tampão. O ARN mensageiro foi eluído da coluna com tampão TE que foi pré-aquecido a 65°C e a quantidade de ARNm foi determinada como sendo 2,6 pg medindo a absorvância espectrofotométrica a 260 nm. O ARNm foi precipitado de um dia para o outro a -70°C através da adição de 0,1 volumes de acetato de sódio 3M, pH 5,0, e 2,5 volumes de etanol absoluto. 4.a.ii. Síntese e clonagem de ADNc O ADNc foi sintetizado a partir do ARN mensageiro utilizando um estojo de síntese ZAP-cDNA™ (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante. A população de ADNc variou em tamanho de menos de 200 pb até cerca de 6 kpb tal como julgado por electroforese em gel de agarose e autorradiografia de uma pequena porção do ADNc 23 86 810 ΕΡ 0 709 460/PT sintetizado. O restante ADNc foi reparado nas extremidades utilizando a polimerase de ADN T4 na presença dos quatro dNTPs a 37°C durante 30 minutos. Foram ligados adaptadores EcoRI às extremidades cegas do ADNc utilizando a ligase de ADN T4 a 8°C durante 24 horas. A digestão com Xhol produziu ADNc com locais de restrição Xhol em todas as extremidades 3’ e locais de restrição EcoRI em todas as extremidades 5’. Os oligonucleótidos (adaptadores em excesso e o iniciador-molde digerido com enzimas de restrição) foram removidos centrifugando a amostra através de uma coluna de 1 ml de Sephacryl S-400.

Porções de 100 ng de ADNc foram ligadas a 1 mg de vector Uni-ZAP XR (Stratagene, digerido com EcoRI e Xhol e desfosforilado) de um dia para o outro a 12°C utilizando a ligase de ADN T4; O ADN ligado foi empacotado em cabeças fágicas utilizando o extracto de empacotamento Gigapack II Gold (Stratagene) de acordo com o protocolo do fabricante. As bibliotecas primárias resultantes foram plaqueadas e amplificadas em células de E. coli SURE (Stratagene) e as resultantes bibliotecas amplificadas (Emx8 e Emx9) foram tituladas em células de E. coli XLl-Blue (Stratagene) tudo de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, para todos os plaqueamentos, as células hospedeiras cresceram de um dia para o outro com agitação a 30°C em caldo L (LB) suplementado com maltose a 0,2% (p/v) e MgSC>4 10 mM. As células foram diluídas para DOôoo = 0,5 com MgSC>4 10 mM antes da utilização. O número de recombinantes em cada biblioteca foi determinado plaqueando os fagos na presença de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactósido (Xgal) a 0,4% (p/v) e isopropiltio-p-D-galatósido (IPTG) 2,5 mM (Northumbria Biologicals Ltd.). 4. b. Resultados

Emx8 contém 3xl01 2 3 4 pfii/ml (65% de recombinantes) e Emx9 contém 6xl04 pfij/ml (55% de recombinantes).

Exemplo 5

Identificação de clones de ADNc que codificam para antigénios p45 de E. maxima 1 a. Métodos 2 A imunopesquisa das bibliotecas de ADNc foi feita de acordo com instruções padrão 3 fornecidas pela Stratagene. Os papéis são imersos em soro de coelho anti-p45 diluído 1:100 4 em TTN contendo BSA a 1%. Todos os procedimentos seguintes foram idênticos aos descritos para a revelação de “Western blots” no Exemplo 3A. As placas positivas foram identificadas e após armazenamento de um dia para o outro a +4°C para eluir as partículas de bacteriófago, as placas foram novamente pesquisadas. A nova pesquisa foi continuada até todos os positivos conterem populações puras de placas reactivas ao anticorpo.

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ΕΡ 0 709 460 / PT 24 S.b. Resultados

As vinte e duas placas independentes (pEm45/l a pEm45/22) que reagiram com soro de coelho anti-p45 foram isoladas e purificadas por placa a partir das bibliotecas Emx8 e Emx9.

Exemplo 6

Análise de clones de ADNc que codificam para antigénios p45 de E. maxima 6.a. Métodos 6.a.i. Análise das inserções de ADNc

As partículas de fago lambda foram eluídas das placas purificadas que reagiram com soro de coelho anti-p45. As inserções de ADNc foram recuperadas para o plasmídeo pBluescript através de excisão in vivo do lambda recombinante ΖΑΡΠ de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante (Stratagene). Os plasmídeos pBluescript contendo ADNc foram isolados através de lise alcalina (Bimboim e Doly, 1979, NucleicAcids Res., 7: 1513) e os ADNc foram analisados através de digestão com endonucleases de restrição.

6.a.ii. Determinação da sequência de ADN pEm45/9 foi purificado por centrifugação de equilíbrio em gradientes de CsCl/brometo de etídio e a sequência nucleotídica da inserção de ADN foi determinada directamente a partir do molde de ADN de cadeia dupla utilizando os iniciadores oligonucleotídicos T3 e T7 (Stratagene) e Sequenase versão 2.0 (United States Biochemical) utilizando instruções fornecidas pelos fabricantes. 6-b. Resultados A sequência nucleotídica de pEm45/9 e a sua sequência de aminoácidos deduzida são mostradas em SEQ Π) NOS: 1 e 2. pEm45/9 é um ADNc de 392 pb incluindo uma sequência poli-A a 3’. O ADNc parece ser “aberto” desde o terceiro nucleótido até um codão de terminação opalino (TGA) a 329 pb que antecede a sequência poli-A. A sequência de aminoácidos deduzida codifica uma proteína de 109 aminoácidos ou aproximadamente 12 kilodaltons. O ADNc tem locais de restrição únicos para Bsml (213 pb), HindlU (260 pb) e Sphl (323 pb).

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ΕΡ 0 709 460 / PT 25

Exemplo 7

Expressão da proteína recombinante codificada por pEM45/9 7.a. Métodos 7.a.i. Construção do plasmídeo pGEX3XEM45/9

Foi digerido 1 pg de pEM45/9 com 10 unidades de ΒατηΥΏ. e 10 unidades de Xhol durante 2 horas a 37°C e a inserção de ADNc libertada foi ligada no plasmídeo pRSETB (InVitrogen) digerido com BamUI-Xhól e desfosforilado. O ADN ligado foi transfectado para a estirpe de E. coli JM109, foram identificadas as colónias contendo o plasmídeo recombinante pRSETBEM45/9 e o ADN plasmídico foi isolado através de lise alcalina (Bimboim e Doly, 1979, Nucléic Acids Res., 7: 1513).

Foi digerido 1 pg de pRSETBEM45/9 com 10 unidades de EcóRl e a inserção de ADNc libertada foi ligada no plasmídeo pGEX3X (Pharmacia) digerido com EcóRl e desfosforilado. O ADN ligado foi transfectado para a estirpe de E. coli JM101, foram seleccionadas as bactérias possuindo plasmídeos recombinantes e o ADN plasmídico foi isolado tal como acima. Os ADNs foram analisados por digestão com enzimas de restrição e electroforese em gel de agarose para identificar um plasmídeo, pGEX3XEM45/9 que continha a inserção de ADNc de pEM45/9 na orientação correcta para a expressão da proteína como uma fusão com glutationa-S-transferase. 7.a.ii. Expressão da proteína de fusão Glutationa-S-Transferase (GSTVEM45/9

Colónias bacterianas foram picadas para caldo L (LB) contendo 100 pg/ml de ampicilina e cresceram de um dia para o outro a 37°C com agitação vigorosa. Foram utilizados 50 μΐ da cultura noctuma para semear 5 ml de meio fresco e as culturas foram novamente incubadas até a absorvância (medida a 600 nm) ser aproximadamente 0,3. Foi adicionado IPTG para uma concentração final de 1 mM e as culturas continuaram durante mais 4 a 5 horas. Foram removidas alíquotas das culturas bacterianas a vários tempos durante a incubação e examinadas através de PAGE e “Western blotting”, com anticorpos criados para o antigénio p45 nativo tal como descrito no Exemplo 3.a.ii.

Foram utilizados 2 ml de uma cultura noctuma para semear 200 ml de meio fresco e a cultura cresceu tal como acima. Cinco horas após a adição de IPTG para 1 mM, as células * bacterianas foram colhidas por centrifugação e ressuspensas em 5 ml de PBS contendo

Triton X-100 a 1% v/v. As células foram sujeitas a ultra-sons durante quatro rebentamentos de 30 segundos cada na potência máxima (MSE, Soniprep) e o resultante dos ultra-sons foi 26 86 810

ΕΡ 0 709 460 / PT separado em sobrenadante e sedimento por centrifugação. O sedimento foi solubilizado em ureia 8 M ou em SDS a 2% antes da análise por PAGE e “Western blotting”. 7. b. Resultados A proteína GST-EM45/9 recombinante foi expressa com sucesso em E. coli tal como julgado pela pesquisa de lisados bacterianos sujeitos a “Western blotting” com anti-soros de coelho ou de galinha anti-p45. A proteína de fusão que reagiu especificamente com os soros era de aproximadamente 37 kDa o que é explicado por 26 kDa serem GST e 11 kDa serem EM45/9 (Figura 2, pista 1). A proteína foi produzida na cultura noctuma mas a expressão foi significativamente aumentada através da adição de IPTG (Figura 2, pista 3). Após sujeição a ultra-sons de uma cultura colhida, foi detectada muito pouca proteína recombinante no sobrenadante (Figura 2, pista 4), enquanto que foi encontrada uma elevada concentração no sedimento e este foi solubilizado em SDS a 2% (Figura 2, pista 6). O sedimento era parcialmente solúvel em ureia 8 M (Figura 2, pista 5).

Exemplo 8

Electroforese preparativa da proteína de fusão pGEX3XEM45/9 8. a. Métodos

Duas alíquotas de 1 ml de proteína de fusão solubilizada em SDS, preparada tal como descrito no Exemplo 7.a.ii. foram sujeitas a electroforese, tal como descrito- no Exemplo l.a.ii. Após a electroforese, fatias verticais de 1 cm foram cortadas de cada lado do gel e coradas durante 10 minutos em Azul Brilhante de Coomassie a 0,125% em metanol a 45% v/v, ácido acético a 10% v/v. O restante de cada gel foi incubado em metanol a 45% v/v, ácido acético a 10% v/v. As fatias coradas foram brevemente descoradas e depois todos os geles reunidos num tabuleiro de vidro sobre uma caixa de luz. As regiões contendo a proteína pGEX3XEM45/9 recombinante foram cortadas das secções centrais, não coradas, dos geles e foram finamente cortadas. Os pedaços de gel foram decantados para um saco de diálise num pequeno volume de tampão contendo Tris 25 mM pH 8,3, glicina 192 mM, SDS a 0,1%. O saco selado foi colocado numa câmara de electroforese em agarose cheia com o mesmo tampão e a proteína de fusão foi electro-eluída a 50 V durante 16 horas. O tampão contendo a proteína de fusão foi removido do saco, dializado extensivamente contra PBS, pH 7,6 e depois tratado com resina AG11A8 de acordo com as instruções do fabricante (Biorad) para remover quaisquer vestígios de SDS. As amostras deste antigénio foram analisadas por SDS-PAGE e “Western blotting”. 27 86 810

ΕΡ 0 709 460 / PT 8. b. Resultados

Aproximadamente 200 pg de proteína foram electro-eluídos a partir de duas fatias de gel de acrilamida. O teor deste antigénio foi analisado por SDS-PAGE (Figura 3) e por sondagem de um “Western blot” com soro anti-p45 (Figura 4). Para ambas as figuras, a pista 1 contém uma amostra da cultura bacteriana após quatro a cinco horas de indução com IPTG e a pista 2 contém uma amostra do antigénio electro-eluído utilizado para uma experiência de imunização (Exemplo 9) e para testar num ensaio in vitro de linfoproliferação (Exemplo 10).

Exemplo 9

Imunização de galinhas com a proteína de fusão pGEX3XEM45/9 confere proteccão contra infeccão por confronto com Eimeria maxima 9. a. Métodos 9,a.i. Imunização dos aramais

Trinta e seis aves Light Sussex foram criadas sob condições isentas de coccídia até às três semanas de idade. As aves foram atribuídas ao acaso a dois grupos e foram mantidas individualmente em gaiolas para uma única ave. Foram retiradas amostras de sangue e dezoito aves foram imunizadas através de injecção subcutânea (0,1 ml) de 10 pg de antigénio (preparado tal como descrito no Exemplo 8) e 5 pg de saponina em PBS. As restantes dezoito aves foram imunizadas em falso através de injecção subcutânea (0,1 ml) de 5 pg de saponina em PBS. As imunizações foram repetidas mais duas vezes com dois intervalos semanais e foram retiradas amostras de sangue após cada imunização. 9.a.ii. Confronto dos animais

Duas semanas após a imunização final, foi administrado a todas as aves 100 oócistos esporulados de E. maxima através de entubação oral. As fezes de cada ave foram colhidas através de colheitas diárias para tabuleiros de papel e o número total de oócistos excretados por cada ave 5 a 10 dias após o confronto foi calculado por contagem de amostras misturadas e diluídas de fezes em câmaras de contagem Macmaster. 9.b. Resultados A Tabela 3 mostra o rendimento em oócistos individuais e as médias de grupo dos * dois grupos de aves imunizadas com antigénio ou imunizadas em falso. As aves que receberam antigénio tiveram rendimentos em oócistos 44% mais baixos que o grupo imunizado em falso indicando que o antigénio, tal como descrito no Exemplo 8, pode ser utilizado para proteger galinhas contra infecção por Eimeria maxima.

Exemplo 10 A proteína recombinante pGEX3XEM45/9 é linfoestimuladora 10.a. Métodos

Foram preparados linfócitos de sangue periférico a partir das amostras de sangue retiradas após a terceira imunização no Exemplo 9. O método de preparação foi idêntico ao descrito no Exemplo 2.a.ii. A cada poço, foram adicionados 100 μΐ do antigénio preparado no Exemplo 8, diluído em PBS para uma concentração de 0,2 pg/ml, e o ensaio de linfoestimulação continuou tal como descrito no Exemplo 2.a.ii. lO.b. Resultados A Figura 5 mostra o índice médio de estimulação para células de aves imunizadas com o antigénio em comparação com o índice médio de estimulação para células de aves imunizadas em falso. As aves imunizadas foram estimuladas quatro vezes acima das imunizadas em falso indicando que o antigénio recombinante pGEX3XEM45/9 teve um efeito linfoestimulador específico nas células.

Legendas das figuras

Fig. 1. “Western blot” de polipéptidos de esporozóides de E. maxima sondado com anticorpo de coelho anti-p45.

Fig. 2. “Western blot” da expressão de pGEX3XEM45/9. Pistas: std = marcadores de peso molecular (em kDa), 1 = cultura noctuma de pGEX3XEM45/9, 2 = cultura crescida até uma absorvância (600 nm) de 0,3 (foi adicionado IPTG para uma concentração de 1 mM nesta altura), 3 = cultura 3,5 horas após a adição de IPTG, 4 = lisado solúvel após sujeição a ultra-sons e centrifugação da cultura induzida com IPTG, 5 = sedimento após ultra-sons e centrifugação que era solúvel em ureia 8 M, 6 = sedimento após ultra-sons e centrifugação que era apenas solúvel em SDS a 2%.

Fig. 3. SDS-PAGE da proteína de fusão pGEX3XEM45/9 electro-eluída. Pistas: std = marcadores de peso molecular (em kDa), 1 = cultura de pGEX3XEM45/9 4,5 horas após a adição de IPTG, 2 = proteína de fusão electro-eluída, 3 = 1 μΐ de proteína de fusão electro-eluída concentrada (Centrion contracter, Amicon), 4 = 5 μΐ de [3], 5 = 20 μΐ de [3]. As setas horizontais mostram a proteína reconhecida pelo soro de galinha anti-p45 na Fig. 4.

Fig. 4. “Western blot” da proteína de fusão pGEX3XEM45/9 electro-eluída sondado com soro de galinha anti-p45. Pistas: std = marcadores de peso molecular (em kDa),

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EP 0 709 460 / PT 29 1 = cultura de pGEX3XEM45/9 4,5 horas após a adição de IPTG, 2 = proteína de fusão electro-eluída, 3 = 1 μΐ de proteína de fusão electro-eluída concentrada, 4 = 5 μΐ de [3], 5 = 20 μΐ de [3].

Fig. 5. índice médio de estimulação para células de aves imunizadas com antigénio em comparação com aves imunizadas em falso.

Tabela 1 índices de Estimulação de aves Imunes e de Controlo expostas a antigénios em nitrocelulose de esporozóides de E. maxima. Cada I.E. é a média de dez aves individuais. Número da Tira (Mr) Experiência 1 Aves imunes Experiência 2 Aves imunes Experiência 1 Aves de controlo Experiência 2 Aves de controlo 11 (49 kD) 5,04 4,51 1,12 1,41 12 (45 kD) 2,48 5,12 1,32 1,63

Tabela 2 Análise em gel 2-D de esporozóides de E. maxima H - identificação de pontos que são reconhecidos por soro anti-p45 e são linfoestimuladores.

Ponto n° Reconhecido por soro anti-p45 Linfoestimulador 11 + - 12 + - 17 + + 18 + - 25 + + 26 + + 27 + - 28 + - 29 + - 34 + - 43 + - 54 + -

Tabela 3 Protecção in vivo contra infecção por confronto com E. maxima: rendimento em oócistos de aves imunizadas com a proteína de fusão pGEX3XEM45/9 em comparação com controlos imunizados em falso. Grupo Ave n° Rendimento em oócistos (xlO6) Média DP Imunizado 1 34,2 18,7 11,5 2 46,8 3 13,6 4 37,6 5 11,7 6 26,6 7 , 15,4 8 7,3 9 8,7 11 10,3 12 9,5 13 10,6 14 16,0 15 12,9 16 24,8 17 11,8 18 20,5 ' Imunizado em 19 41,9 33,5 15,1 falso 20 49,1 21 27,1 23 31,2 24 38,1 25 11,4 26 22,1 27 48,5 28 39,3 29 23,3 30 44,4 31 40,5 32 23,0 33 8,5 34 21,0 35 31,3 36 68,2 31 <1 31 <1 i 86 810

EP 0 709 460 / PT

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE:

(A) NOME: Akzo Nobel N.V (B) RUA: Velperweg 76 (C) CIDADE: Amhem (E) PAÍS: Holanda

(F) CÓDIGO POSTAL: 6824 BM (ii) TÍTULO DO INVENTO: Vacina para a coccidiose de aves domésticas (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SUPORTE LÓGICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (EPO) (2) INFORMAÇÃO PARA SEQID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 392 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc para ARNm

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO (vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Eimeria maxima (B) ESTIRPE: Houghton

(C) ESTÁDIO DE DESENVOLVIMENTO: Esporozóide (vii) FONTE IMEDIATA: (A) BIBLIOTECA: ADNc de esporozóide clonado em Lambda ΖΑΡΠ (B) CLONE: Em45-9 (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 3..329 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ Π) NO: 1: CA ACA GCA GAT GCT.TAT TTA ACA AAC GCC TGC TGC TGT CTT AGA TAC Thr Ala Asp Ala Tyr Leu Thr Asn Ala Cys Cys Cys Leu Arg. Tyr 15 10 15 ACG AAC TCT TGC TGC AGC AAG TAT TGC TGC AGC AAG TGT TGC TGC AGC Thr Asn Ser Cys Cys Ser Lys Tyr Cys Cys Ser Lys Cys Cys Cys Ser 20 25 30 AAG TGT TGC TGC AGC AAA TGC TGC TGC AGC ACG TAT TGC TGC AGT ACG Lys Cys Cys Cys Ser Lys Cys Cys Cys Ser Thr Tyr Cys Cys Ser Thr 35 40 45 TTC TGC TGC AGC AAG TGC TGC TGC AGC AAG TTT TGC TGC AAT AGA TTT ?he Cys cys Ser Lys Cys Cys Cys Ser Lys Phe Cys Cys Asn Arg Phe 50 55 60 AGT AAT AGA TTT TGC TGC AGC AGA ATG CTG CTG CAG CAA CTT -TTG CTG Ser Asn Arg Phe Cys Cys Ser Arg Met Leu Leu Gin Gin Leu Leu Leu 65 70 75 CAG CAA GGT TTG CTG CAA CAA GCT TTT GCT GCA GCA TTT GCT GCT GCA Gin Gin Gly Leu Leu Gin Gin Ala Phe Ala Ala Ala Phe Ala Ala Ala 80 85 90 95 GCA GGT GCT GCT GCA GCA AGT GCT GCT GCA GCA TGC ACA GAC Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Cys Thr Asp 100 105

TAGCCTGTAT TACACAGGGA GCCTTAACCT TTCCGCCTGT TGTTAAAAAA AAAAAAAAAA

AAA * 33 4 > 86 810 ΕΡ 0 709 460 / PT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 109 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Thr Ala Asp Ala Tyr Leu Thr Asn Ala Cys Cys Cys Leu Arg Tyr Thr 1 5 io 15

Asn Ser Cys Cys Ser Lys Tyr Cys Cys Ser Lys Cys Cys Cys ser Lys 20 25 30

Cys Cys Cys Ser Lys Cys Cys Cys Ser Thr Tyr Cys Cys Ser Thr Phe 35 40 45

Cys Cys Ser Lys Cys Cys Cys_Ser Lys Phe Cys Cys Asn Arg Phe Ser 50 ____ 55__ 60

Asn Arg Phe Cys Cys Ser Arg Met Leu Leu Gin Gin Leu Leu Leu Gin 65 70 75 30

Gin Gly Leu Leu Gin Gin Ala Phe Ala Ala Ala Phe Ala Ala Ala Ala 85 90 95

Gly Ala Ala Ala Ala Ser Ala Ala Ala Ala Cys Thr Asp 100 105

Lisboa, JlJL 2001

Por AKZONOBELN.V. - O AGENTE OFICIAL -

O^DJUNTO

Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA

Claims (16)

1. 86 810 ΕΡ 0 709 460 / PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de Eimeria estimuladora de linfócitos T, caracterizada por compreender pelo menos uma parte estimuladora de linfócitos T da sequência de aminoácidos mostrada em SEQ ID NO: 2 ou um equivalente funcional desta ainda capaz de induzir uma resposta estimuladora de linfócitos T.
2. 2. Proteína de acordo com a reivindicação 1 em que a espécie de Eimeria é Eimeria maxima.
3. 3. Sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de acordo com as reivindicações 1 ou 2.
4. 4. Sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3 caracterizada por a sequência de ácido nucleico conter a sequência de ADN mostrada em SEQ ID NO: 1 ou uma parte desta que codifica uma proteína de acordo com a reivindicação 1.
5. 5. Molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3 ou 4 operativamente ligada a sequências de controlo da expressão permitindo a expressão da referida sequência de ácido nucleico.
6. 6. Vector recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3 ou 4.
7. 7. Vector recombinante de acordo com a reivindicação 6 caracterizado por a sequência de ácido nucleico estar operativamente ligada a sequências de controlo da expressão.
8. 8. Célula ou organismo não humano hospedeiro transformado com uma sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3 ou 4 ou com uma molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 5 ou com uma molécula de vector recombinante de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7.
9. 9. Processo para expressão da proteína de acordo com a reivindicação 1 ou 2 compreendendo a cultura de uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 8.
10. 10. Vacina para a protecção de aves domésticas contra a coccidiose compreendendo uma proteína de acordo com a reivindicação 1 ou 2, uma molécula de ácido nucleico 86 810 ΕΡ 0 709 460 / PT 2/2 recombinante de acordo com a reivindicação 5, um vector recombinante de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7 ou uma célula ou organismo não humano hospedeiro de acordo com a reivindicação 8 juntamente com um transportador farmaceuticamente aceitável.
11. 11. Processo para a preparação de uma vacina para a coccidiose compreendendo os passos de cultura de uma célula hospedeira infectada de acordo com a reivindicação 8, recolha do vector recombinante e formulação do referido vector recombinante numa preparação veterinária com actividade imunizante.
12. 12. Processo para a preparação de uma vacina para a coccidiose compreendendo a formulação de uma proteína· de acordo com a reivindicação 1 ou 2 ou uma proteína preparada de acordo com o processo da reivindicação 9 numa preparação veterinária com actividade imunizante.
13. 13. Anticorpo ou anti-soro imunorreactivo com uma proteína de acordo com a reivindicação 1 ou 2.
14. 14. Reagente imunoquímico compreendendo uma proteína de acordo com a reivindicação 1 ou 2, sendo o referido reagente ligado a um suporte ou proporcionado com uma substância de marcação.
15. 15. Estojo para o diagnóstico de infecção por Eimeria que compreende uma sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 3 ou 4 ou um anticorpo ou anti-soro de acordo com a reivindicação 13 ou um reagente imunoquímico de acordo com a reivindicação 14.
16. 16. Utilização de uma proteína de acordo com a reivindicação 1 ou 2, uma molécula de ácido nucleico recombinante de acordo com a reivindicação 5, um vector recombinante de acordo com a reivindicação 6 ou reivindicação 7 ou uma célula ou organismo não humano hospedeiro de acordo com a reivindicação 8 para a preparação de uma vacina contra a coccidiose. Lisboa, j:jL ^ Por AKZO NOBEL N.V. - O AGENTE OFICIAL -