PT995799E - Vacinas contra a coccidiose - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ

DESCRIÇÃO "Vacinas contra a coccidiose" A presente invenção refere-se a polipéptidos de Eimeria, fragmentos de ADN que codificam para esses péptidos, moléculas de ADN recombinantes compreendendo estes fragmentos, transportadores recombinantes vivos compreendendo estes fragmentos, ou moléculas, células hospedeiras compreendendo estes fragmentos, moléculas ou transportadores, anticorpos contra o polipéptido e vacinas contra a coccidiose. A invenção também se refere a métodos para a preparação destes anticorpos e vacinas e a métodos para a detecção de parasitas Eimeria e anticorpos contra parasitas Eimeria.

Os protozoários parasiticos pertencentes ao género Eimeria são os agentes causais da coccidiose intestinal, uma enterite que afecta as aves. Esta origina uma perda económica significativa, em especial na indústria de aves de criação. (Para os fins do presente pedido, o termo "aves de criação" significa aves que servem como fontes de ovos ou carne. Inclui, inter alia, galinhas, perus, patos, gansos, galinhas-da-india, faisões, pombos e pavões) . Hoje em dia, a coccidiose é essencialmente controlada utilizando antibióticos na ração. 0 rápido aparecimento de estirpes resistentes a drogas (Chapman H.D. Parasitology Today 9, 159-162 (1993)) e os custos proibitivos do desenvolvimento e registo de uma nova droga levaram a um interesse crescente no desenvolvimento de um método de controlo alternativo. 0 desenvolvimento de vacinas eficazes tem sido assim desejável desde há muitos anos. No entanto, apenas se obteve um sucesso parcial.

As estratégias de vacinação actualmente disponíveis consistem em infecções controladas com parasitas virulentos ou parasitas vivos atenuados (Shirley M.W. In: Proceedings of the VIth. International Coccidiosis Conference (Eds.: J.R. Barta and M.A. Fernando) Moffitt Print Craft Ltd., Guelph. pp. 61-72 (1993)). Por razões de segurança e custo, o método de imunoprofilaxia mais desejável contra a coccidiose parece ser a utilização de uma vacina de subunidades. Embora tenham sido feitas muitas tentativas de imunizar galinhas contra a coccidiose com fracções de material do parasita (Murray P.K., 2 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ

Bhogal B.S., Crane M.S.J. & MacDonald T.T. In: Research in Avian Coccidiosis. Proceedings of the Georgia Coccidiosis Conference (Eds.: L.R. McDougald, Joyner L.P. and P.L. Long) Athens, University of Georgia. pp. 564-573 (1986), McKenzie M.E. & Long P.L. Poultry Science 65, 892-897 (1986)) ou polipéptidos de Eimeria recombinantes (Danforth H.D., Augustine P.C., Ruff M.D., McCandliss R., Strausberg R.L. & Likel M. Poultry Science 68, 1643-1652 (1989), Jenkins M.C.,

Augustine P.C., Danforth H.D. & Barta J.R. Infection and Immunity 59, 4042-4048 (1991)) apenas se conseguiu obter uma protecção limitada contra a infecção de provocação. Pensa-se de um modo geral que as fases do parasita responsáveis pela indução de imunidade protectora são as fases de desenvolvimento assexuadas precoces (Jenkins et al., 1991). Inicialmente, a selecção de antigénios candidatos foi realizada utilizando anticorpos de galinhas imunes mas, tendo em conta o papel fundamental das respostas mediadas por células na imunidade protectora (revisto em Lillehoj H.S. & Trout J.M. Avian Pathology 22, 3-31 (1993), Rose M.E. In:

Poultry Immunology (Ed.: T.F. Davison, T.R. Morris and L.N. Payne), Carfax Publishing Company, Oxfordshire, R.U. pp. 265-299 (1996), a atenção focou-se agora, além dos antigénios indutores de células B, na pesquisa de antigénios quanto à sua capacidade de estimular respostas de células T especificas (Dunn P.P.J., Billington K., Bumstead J.M. & Tomley F.M. Molecular and Biochemical Parasitology 70, 211-215 (1995)).

Constitui um objectivo da presente invenção proporcionar polipéptidos que são capazes de induzir protecção contra os efeitos patogénicos da infecção por Eimeria nas aves de criação.

Verificou-se agora, surpreendentemente, que era possível identificar e isolar 6 polipéptidos diferentes essencialmente isentos de outros polipéptidos de Eimeria, a partir de uma fracção hidrófila de polipéptidos de Eimeria, sendo cada um destes polipéptidos diferentes capaz de induzir uma resposta imunitária contra parasitas Eimeria. Os inventores verificaram que estes polipéptidos podem ser utilizados, quer sozinhos, quer em combinação uns com os outros, para obter uma vacina que confere um grau de protecção significativo às aves (de preferência aves de criação). Por exemplo, pode-se obter 3 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ protecção contra a formação de lesões cecais em aves imunizadas com uma vacina deste tipo, quando submetidas a uma provocação subsequente com parasitas Eimeria.

Uma primeira concretização da invenção refere-se a um polipéptido hidrófilo de Eimeria que na sua forma de comprimento total tem um peso molecular de 25 kD e compreende uma sequência de aminoácidos que partilha pelo menos 70% de homologia com a sequência de aminoácidos

MPFELPPLPYPMDALEPYISKETLEYHYGKHHAAYVNNLNRLVEGKPEASKSLEEIIKT

SSGSVLNNAGQAWNHTFYWKSMRPASAGGPPGAPGGGPPGAPGAPLREELESAFG

GVEKFREAFAAAAAAHFGSGWAWLCFCKKSRSLFLLQTHDGATPFRDNPNCAPLLTC

DLWEHAYYIDRRNDRKSYLDAWWSWNWDFANENLKKAMQGSD (também designada por SEQ ID NO:l) e fragmentos imunogénicos desse polipéptido capazes de induzir uma resposta imunitária contra o referido polipéptido. O polipéptido é funcionalmente relacionado com uma superóxido-dismutase (SOD) encontrada em parasitas que não Eimeria e é portanto caracterizada como sendo do tipo SOD.

Além disso, esta concretização refere-se a um polipéptido hidrófilo de Eimeria que é um polipéptido do tipo peroxidoxina, na sua forma de comprimento total tem um peso molecular de 22 kD e compreende uma sequência de aminoácidos que partilha pelo menos 70% de homologia com a sequência de aminoácidos LGPLALPLLADVR (também designada por SEQ ID NO:2) e fragmentos imunogénicos do polipéptido capazes de induzir uma resposta imunitária contra esse polipéptido.

Um polipéptido hidrófilo de Eimeria que é um polipéptido do tipo peroxidoxina, na sua forma de comprimento total tem um peso molecular de 25 kD e compreende uma sequência de aminoácidos que partilha pelo menos 70% de homologia com a sequência de aminoácidos

MPLNLGDSFPDFQAEALGAEHFRLHEYLGDSWGVMFSHPNDFTPVCTTELAEAVKLQ

DSFTKKNCKLVGFSCNDLQSHREWAKDIMAYAGRSGNLPFPLVCDPNRELAASLGIM

DPAEKDKKGLPLTCRCVFFISPEKKLAASILYPATTGRNFAEILRVLDSLQLTAKFPVAT

PVDWTAGAKCCWPNLAAEEAQRLLPKGHEALQLPSGKPYLRLTPDPRG 4 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ (também designada por SEQ ID NO:3), bem como fragmentos imunogénicos do polipéptido capazes de induzir uma resposta imunitária contra esse polipéptido, também fazem parte desta concretização.

Também faz parte desta concretização um polipéptido hidrófilo de Eimeria que na sua forma de comprimento total tem um peso molecular de 22 kD e compreende uma sequência de aminoácidos que partilha pelo menos 70% de homologia com a sequência de aminoácidos MSPSPAGVAEYLASL (também designada por SEQ ID NO:4) ou um fragmento imunogénico desse polipéptido capaz de induzir uma resposta imunitária contra o referido polipéptido.

Esta concretização também inclui um polipéptido hidrófilo de Eimeria do tipo triosefosfato-isomerase que na sua forma de comprimento total tem um peso molecular de 28 kD e compreende uma sequência de aminoácidos que partilha pelo menos 70% de homologia com a sequência de aminoácidos NHAEFDPSQTEVWFP (também designada por SEQ ID NO:5) ou um fragmento imunogénico desse polipéptido capaz de induzir uma resposta imunitária contra o referido polipéptido.

Por fim, esta concretização refere-se a um polipéptido hidrófilo de Eimeria que na sua forma de comprimento total tem um peso molecular de 28 kD e compreende uma sequência de aminoácidos que partilha pelo menos 70% de homologia com a sequência de aminoácidos VDSFTPSVGCVFAGMPADFR (também designada por SEQ ID NO:6), ou um fragmento imunogénico desse polipéptido capaz de induzir uma resposta imunitária contra o referido polipéptido.

Embora vários grupos tenham descrito proteínas derivadas de Eimeria que podem, eventualmente, ter massas moleculares dentro da gama de 26-30 kDa + 5 kDa descrita acima, estas proteínas são bastantes diferentes dos polipéptidos da presente invenção.

Por exemplo, em EP-A-0231537 (Newman et al.) descreve-se uma proteína de superfície de 25 kDa. No entanto, sob condições redutoras esta divide-se para formar duas bandas em SDS-PAGE, a cerca de 17 e a cerca de 8 kDa, enquanto que os 5 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ polipéptidos da presente invenção têm massas moleculares relativas de pelo menos 21 kDa quando separadas sob condições redutoras.

Bouvier et al. (J. Biol. Chem. (1985) 260(29); ppl5504-15509) ensinam que utilizando extracção com Triton X114 as proteínas anfifilicas (associadas à membrana) são apenas detectadas na fase do detergente e não na fase hidrófila.

Em US-A-4710377 (Schenkel et al.) descrevem-se antigénios com massas moleculares de cerca de 28 e 26 kDa. No entanto, estes são componentes da membrana externa anfifilicos e não estariam portanto presentes na fase hidrófila de um extracto de Triton X-114 que poderia ser utilizado para preparar polipéptidos da presente invenção.

As proteínas de Eimeria que são anfifilicas também estão descritas em WO92/04461 (Jacobson et al.), EP-A-0324648 (Liberator et al.), AU-A-28542/49 (Turner et al.), EP-A-0344808 (Alternburger et al.) e EP-A-0167443 (Murray et al.) .

Deve entender-se que para os polipéptidos hidrófilos particulares aqui abrangidos podem existir variações naturais entre parasitas ou estirpes de Eimeria individuais. Estas variações podem existir em(numa) diferenças de aminoácidos na sequência global, ou por deleções, substituições, inserções, inversões ou adições de um ou mais aminoácidos na referida sequência. Foram descritas substituições de aminoácidos que não alteram essencialmente actividades biológicas e imunológicas, e.g., por Neurath et al. em "The Proteins" Academic Press New York (1979). As substituições de aminoácidos entre aminoácidos relacionados ou substituições que ocorreram frequentemente na evolução são, inter alia, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (veja-se Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, supl. 3). Outras substituições de aminoácidos incluem Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val and Ala/Glu. Com base nesta informação, Lipman e Pearson desenvolveram um método para comparação rápida e sensível de proteínas (Science, 227, 1435-1441, 1985) 6 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ e determinaram a semelhança funcional entre proteínas homólogas. Estas substituições de aminoácidos dos exemplos de concretizações da presente invenção estão no âmbito da invenção, desde que os polipéptidos resultantes retenham a sua imunorreactividade. Assim, as variações naturais que não influenciam essencialmente a imunogenicidade do polipéptido em comparação com o polipéptido do tipo selvagem, são consideradas variantes imunologicamente equivalentes dos polipéptidos de acordo com a invenção.

Deste modo, considera-se que um polipéptido que tem uma sequência de aminoácidos variante que tem pelo menos 70% de homologia com, respectivamente, a sequência de aminoácidos MPFELPPLPYPMDALEPYISKETLEYHYGKHHAAYVNNLNRLVEGKPEASKSLEEIIKT

SSGSVLNNAGQAWNHTFYWKSMRPASAGGPPGAPGGGPPGAPGAPLREELESAFG

GVEKFREAFAAAAAAHFGSGWAWLCFCKKSRSLFLLQTHDGATPFRDNPNCAPLLTC DLWEHAYYIDRRNDRKSYLDAWWSWNWDFANENLKKAMQGSD, LGPLALPLLADVR, MPLNLGDSFPDFQAEALGAEHFRLHEYLGDSWGVMFSHPNDFTPVCTTELAEAVKLQ DSFTKKNCKLVGFSCNDLQSHREWAKDIMAYAGRSGNLPFPLVCDPNRELAASLGIM DPAEKDKKGLPLTCRCVFFISPEKKLAASILYPATTGRNFAEILRVLDSLQLTAKFPVAT PVDWTAGAKCCWPNLAAEEAQRLLPKGHEALQLPSGKPYLRLTPDPRG, MSPSPAGVAEYLASL, NHAEFDPSQTEVWFP and VDSFTPSVGCVFAGMPADFR como apresentado nas SEQ ID NO: 1-6 está também no âmbito da invenção. O nível de homologia é definido pela seguinte fórmula: H = m/n x 100%, em que H é a percentagem de homologia, m é o número de aminoácidos idênticos na sequência e n é o número total de aminoácidos. A sequência de aminoácidos ABCDEEGHIJK, quando comparada com ABCDEFGHIJK, seria então 10/11 x 100% = 90,9% homóloga. A sequência de aminoácidos ABCDEGHIJK seria também 10/11 x 100% = 90,9% homóloga: haveria apenas um intervalo no local em que uma sequência tem o F e a outra sequência não tem.

Quando um polipéptido é utilizado para e.g. fins de vacinação, ou para produzir anticorpos, não é no entanto necessário utilizar o polipéptido inteiro. Também é possível utilizar um fragmento desse polipéptido que é capaz de induzir 7 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ uma resposta imunitária contra esse polipéptido, um designado fragmento imunogénico.

Um "fragmento imunogénico" significa um fragmento da proteína de tamanho total, que ainda retém a sua capacidade para induzir uma resposta imunitária no hospedeiro. Actualmente, estão disponíveis uma variedade de técnicas para identificar facilmente fragmentos antigénicos (determinantes). 0 método descrito por Geysen et al. (pedido de patente WO 84/03564, pedido de patente WO 86/06487, patente US N,° 4833092, Proc. Natl Acad. Sei. 81: 3998-4002 (1984), J. Imm. Meth. 102, 259-274 (1987), o designado método PEPSCAN é um

método rápido e bem estabelecido, fácil de realizar, para a detecção de epítopos; as regiões imunologicamente importantes da proteína, utilizadas em todo o mundo e como tal bem conhecidas do perito na arte. Este método (empírico) é especialmente adequado para a detecção de epítopos de células B. Além disso, tendo em conta a sequência do gene que codifica para qualquer proteína, os algoritmos de computador são capazes de designar fragmentos polipeptídicos específicos como epítopos imunologicamente importantes com base na sua homologia de sequências e/ou estrutural com epítopos que são hoje conhecidos. A determinação destas regiões baseia-se numa combinação dos critérios de hidrofilicidade de acordo com Hopp e Woods (Proc. Natl. Acad. Sei. 78: 38248-3828 (1981)), e os aspectos de estrutura secundária de acordo com Chou e Fasman (Advances in Enzymology 47: 45-148 (1987) e patente US 4554101),

Os epítopos de células T podem igualmente ser previstos a partir da sequência por computador, com o auxílio do critério de anfifilicidade de Berzofsky (Science 235, 1059-1062 (1987) e pedido de patente US NTIS US 07/005885). Pode-se encontrar uma revisão condensada em: Shan Lu sobre princípios comuns: Tibtech 9: 238-242 (1991), Good et al. sobre epítopos de Malária; Science 235: 1059-1062 (1987), Lu para uma revisão; vaccine 10: 3-7 (1992), Berzofsky para epítopos de HIV; The FASEB Journal 5:2412-2418 (1991).

Deste modo, esta concretização da invenção não só se refere a polipéptidos de acordo com a invenção, mas também a fragmentos desses polipéptidos que ainda são capazes de 8 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ induzir uma resposta imunitária contra os polipéptidos (os designados fragmentos imunogénicos).

Numa forma preferida desta concretização, proporciona-se um polipéptido hidrófilo que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80% homóloga à sequência apresentada numa das SEQ ID NO:1-6.

Numa forma mais preferida desta concretização, a sequência de aminoácidos é pelo menos 90% homóloga à sequência apresentada numa das SEQ ID NO:1-6.

Numa forma ainda mais preferida desta concretização, a sequência de aminoácidos é a sequência apresentada numa das SEQ ID NO:1-6.

De preferência, o polipéptido de acordo com a invenção é isolado de Eimeria tenella.

Outra concretização da invenção refere-se a fragmentos de ADN que codificam para um polipéptido da presente invenção, ou seus fragmentos imunogénicos. Uma vez que, pela primeira vez, a sequência de aminoácidos parcial dos polipéptidos de acordo com a invenção é agora proporcionada, os peritos na arte podem (utilizando a tabela de código genético que se pode encontrar em livros de texto de bioquímica, tal como e.g. Lubert Stryer's Biochemistry, Ed. Freeman and Company, New York) preparar facilmente uma sonda de ADN mista e seleccionar o gene que codifica para o polipéptido de acordo com a invenção, a partir de Eimeria.

Poderá haver variações menores na sequência de nucleótidos global do ADN que codifica para os polipéptidos de acordo com a invenção, nas estirpes de Eimeria respectivas. Estas variações podem não ter efeito na sequência de aminoácidos do polipéptido, no caso da modificação ser tal que o tripleto variante codifica para o mesmo aminoácido. Esta causa de variação baseia-se no fenómeno da degenerescência do código genético. Acontece que, e.g., devido a uma mutação natural, a G no tripleto CTG, que codifica para o aminoácido leucina, é substituída por uma C, que também codifica para leucina, ou que a A em GAA que codifica para ácido glutâmico, 9 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ é substituída por uma G, sendo que este tripleto ainda codifica para ácido glutâmico. Esta mutação é uma mutação silenciosa, í.e. não se vê ao nível dos aminoácidos. Estas mutações silenciosas são muito frequentemente encontradas na natureza quando se comparam, e.g., dois isolados de campo de Eimeria diferentes. Este fenómeno é encontrado para todos os aminoácidos, excepto Met e Trp. Assim, é óbvio que os polipéptidos da presente invenção podem ser codificados por uma grande variedade de outras sequências, sendo que todas codificam para o polipéptido idêntico. É portanto desnecessário dizer que também se considera no âmbito da invenção qualquer sequência de ácido nucleico que codifica para um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 70% homóloga à sequência de aminoácidos como apresentado em SEQ ID NO: 1-6 da presente invenção, ou um seu fragmento imunogénico.

Meramente para dar um exemplo, todas as sondas possíveis para detectar o gene que codifica para o polipéptido de Eimeria hidrófilo tipo SOD de 25 kD compreendendo, inter alia, a sequência de aminoácidos YLDAWWSWNWDFANENLK (parte da SEQ ID NO:l) são apresentadas nas SEQ ID NO: 7-38. Nestas SEQ ID, estão enumeradas todas as sequências de ácido nucleico possíveis que codificam para a sequência de aminoácidos VNWDFA de SEQ ID NO:l. Das 32 sondas, uma tem por definição um ajuste perfeito com cada fragmento de ADN compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica para um polipéptido compreendendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l.

Como descrito inter alia em Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. et al. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6) a hibridação de sondas com ADN é feita a 12°C abaixo da Tm, em que Tm = 69,3 + 0,41 x(G+C)% - 650/L (L = comprimento da sonda). Isso significa que sob condições rigorosas (uma temperatura de hibridação entre 38 e 48 graus Celsius) o gene que codifica para um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:l pode sempre ser recolhido de forma selectiva e isento de sinais de hibridação falsos, utilizando as sondas de SEQ ID NO:7-38. Estas sondas mistas podem ser produzidas muito facilmente utilizando procedimentos convencionais em, e.g., um dos muitos sintetizadores de ADN automáticos disponíveis comercialmente. 10 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ

Pelas razões indicadas acima, em especial uma sonda de ADN mista que codifica para toda a sequência de aminoácidos de uma das sequências de aminoácidos indicadas na SEQ ID NO:1-6 podem ser utilizadas para detectar os genes que codificam para os polipéptidos de acordo com a invenção em Eimeria. A identificação e a clonagem dos genes que codificam para os polipéptidos de acordo com a invenção em Eimeria, não só para tenella, mas também para as outras espécies, podem ser facilmente realizadas como se segue: a primeira cadeia de ADNc pode ser hibridada com ambos, uma sonda mista para um dos polipéptidos de acordo com a invenção e uma sonda de oligo-dT. O fragmento de ADN entre ambas as sondas pode então ser multiplicado numa reacção de PCR convencional (as técnicas de PCR estão descritas, e.g. em Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6)). O fragmento de PCR pode então ser clonado num plasmídeo e, e.g., utilizado para sequenciação ou para detecção do gene de comprimento total no genoma de qualquer espécie de Eimeria.

Este método permite uma selecção e sequenciação fáceis e directas de genes que codificam para os polipéptidos de acordo com a invenção, não só de Eimeria tenella, mas também de outras espécies de Eimeria, tais como necatrix, brunetti, mitis ou acervulina.

Assim, noutra concretização, a invenção refere-se a um fragmento de ADN compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica para um polipéptido de acordo com a invenção, ou um seu fragmento imunogénico. O método da sonda mista acima descrito para a detecção dos ADN que codificam para os vários polipéptidos de acordo com a invenção tem, e.g., sido utilizado para obter o ADN que codifica para o polipéptido tipo SOD de 25 kD de acordo com a invenção, em Eimeria tenella. Utilizando o método descrito nos Exemplos, foi possível isolar, clonar e sequenciar um fragmento de ADN que codifica praticamente todo o polipéptido do tipo SOD de 25 kD de Eimeria tenella. Verificou-se que a sequência desse fragmento de ADN era 11 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ

AT GCCGTTCGAACT CCCCCCGCTGCCGTACCCCAT GGACGCCCT CGAGCCGTAC AT C AGC AAAG AG ACT CT CG AGTACCACTAT GGGAAGCACCACGCGGCTTACGT G Α ACAACTTGAACAGACTCGTCGAGGGGAAGCCGGAGGCTTCCAAGAGCCTGGAGG AAATAATAAAGACCTCCTCGGGGTCGGTGCTGAACAACGCGGGCCAGGCGTGGA ACCACACGTT CT ACTGG AAGTCGAT GCGGCCGGCCT CGGCGGGGGGCCCCCCG GGGGCCCCCGGCGGGGGCCCCCCGGGGGCCCCGGGGGCCCCCCTGCGGGAG GAGCTGGAGAGCGCGTTCGGGGGCGTGGAGAAGTTCCGGGAGGCCTTTGCTGCT GCT GCTGCT GCGCACTTCGGCT CGGGCT GGGCCTGGCT CTGCTTCTGCAAGAAG TCCCGCAGCCTCTTTTTGCTGCAGACCCACGACGGGGCCACGCCTTTCAGAGACA ACCCCAACTGCGCGCCGCTGCTCACCTGCGACCTGTGGGAGCACGCCTACTACA TCGACCGCAGAAACGACCGCAAGAGCTACCT CGACGCGTGGT GGTCTGT GGT G Α ATTGGG ACTTCGCGAACG AG AACTTG AAG AAGGC AATGCAGGG AAGCGACTAGG CGCGTGGTGGTCTGTGGTGAATTGGGACTTCGCGAACGAGAACTTGAAGAAGGC AATGCAGGG AAGCGACT AG e será também designada por SEQ ID NO:39.

Deste modo, uma forma preferida desta concretização refere-se a um fragmento de ADN compreendendo uma sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID NO:39. 0 método da sonda mista também foi utilizado para obter o ADN que codifica para o polipéptido do tipo peroxidoxina de 25 kD de acordo com a invenção, em Eimeria tenela. Utilizando o método descrito nos Exemplos, foi possível isolar, clonar e sequenciar um fragmento de ADN que codifica para uma grande parte do polipéptido total tipo peroxidoxina de 25 kD de Eimeria tenella. Além disso, verificou-se que a sequência genómica, i.e., a sequência da parte do gene como encontrado no genoma de Eimeria tenella era

TT CCCGGATTTT CAGGCGGAGGCGCT GGGCGCCGAGCACTTCCGCTT GCACGAG TACTTGGGGGACAGCTGGGGAGTGATGTTCAGgtaagattggcgtaaaaaagccccatttaatcg catttttaattctgtagactctgtgtcgactgctgagcacgaggggggggcctgctgcacgggagagccttgtctcgcgctc aactctgggtttctggcgttgcttgcagCCACCCGAACGACTTCACCCCCGTCTGCACCACCGA

Esta sequência é também designada por SEQ ID NO:40.

As letras maiúsculas indicam a sequência também encontrada no ARNm, as letras minúsculas indicam o intrão no gene. 12 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ

Deste modo, outra forma preferida desta concretização refere-se a um fragmento de ADN compreendendo uma sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID NO:40. O ADNc que codifica para o ARNm para este polipéptido também foi detectado utilizando a abordagem da sonda mista. Este ADNc foi sequenciado e verificou-se que tem a seguinte sequência:

ATGCCGTTGAACTTGGGAGA7TCCTTTCCAGACTTCCAGGCGGAGGCGCTGGGC GCCGAGCACTTCCGCTTGCACGAGTACTTGGGGGACAGCTGGGGAGTGATGTTC AGCCACCCGAACGACTTCACTCCCGTTTGCACAACGGAGCTCGCCGAAGCCGTG AAGCT CCAGGACTCCTTCACGAAGAAGAACT GCAAACTCGTTGGCTT CT CCT GCA ACGACCTGCAGAGCCACAGAGAATGGGCGAAGGATATAATGGCCTATGCAGGCC GATCT GGGAACTTGCCGTTT CCCCT CGTTT GCGACCCCAATAGGGAACT GGCCGC GAGTTTGG G AATTATGG ATCCTGC AG AAAAGG ACAAAAAGGGGCT GCCTTT GACT TGCCGCTGCGTCTTTTTCATAAGTCCAGAGAAGAAGCTCGCGGCCTCTATTTTGTA CCCGGCTACCACCGGGAGAAACTTCGCGGAAATCCTTAGGGTCCTGGACTCTCTG CAGCT CACTGCCAAGTTTCCAGT GGCCACT CCAGTGG ACT GGACCGCT GGG GCC AAATGCTGCGTAGTGCCGAACTTGGCAGCAGAAGAGGCCCAAAGGCTTTTGCCCA AAGGCCACGAGGCGCTGCAGCTGCCTTCGGGGAAGCCTTACCTGCGGCTCACCC CAGACCCCAGGGGCTGA.

Esta sequência também é designada por SEQ ID NO:41.

Assim, ainda outra forma preferida desta concretização refere-se a um fragmento de ADN que compreende uma sequência de nucleótidos como apresentada na SEQ ID NO:41.

Os polipéptidos da presente invenção podem ser isolados de parasitas Eimeria utilizando qualquer procedimento de isolamento convencional, conhecido na arte para isolar polipéptidos de Eimeria. Os polipéptidos são, e.g., obtidos como descrito nos exemplos. Eles podem ser utilizados subsequentemente para e.g., preparação de uma vacina ou para produzir anticorpos.

Alternativamente, um fragmento de ADN de acordo com a invenção pode ser expresso num sistema de expressão in vitro e o produto de expressão, o polipéptido de acordo com a 13 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ invenção, pode ser utilizado e.g., para preparações de vacina ou de anticorpo.

Um requisito essencial para a expressão do fragmento de ADN é um promotor adequado ligado operativamente ao fragmento. É óbvio para os peritos na arte que a escolha de um promotor se estende a qualquer promotor eucariótico, procariótico ou virai capaz de dirigir a transcrição genética em células utilizadas como células hospedeiras para a expressão de proteínas.

Assim, uma forma preferida desta concretização refere-se a fragmentos de ADN recombinantes, i.e. fragmentos de ADN de acordo com a invenção, aos quais se adicionaram sequências reguladoras que permitem a expressão dessa sequência de ácido nucleico, por meio de, e.g., técnicas convencionais de biologia molecular (Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6))

Quando as células hospedeiras são bactérias, as sequências de controlo de expressão úteis que podem ser utilizadas incluem o promotor e operador de Trp (Goeddel, et al., Nucl. Acids Res., 8, 4057, 1980); o promotor e operador lac (Chang, et al., Nature, 275, 615, 1978); o promotor de proteína de membrana externa (Nakamura, K. e Inouge, M., EMBO J., 1, 771-775, 1982); os promotores e operadores do bacteriófago lambda (Remaut, E. et al., Nucl. Acids Res., 11, 4677-4688, 1983); o promotor e operador de a-amilase (B. subtilis), sequências de terminação e outras sequências de aumento e controlo de expressão, compatíveis com a célula hospedeira seleccionada.

Quando a célula hospedeira é levedura, as sequências de controlo da expressão úteis incluem, e.g. o factor de acasalamento-α. Para células de insecto podem-se utilizar os promotores de poli-hedrina ou plO de baculovírus (Smith, G.E. et al., Mol. Cell. Biol. 3, 2156-65, 1983).

Os sistemas de expressão de células de bactérias, leveduras, fungos e insectos são sistemas de expressão celulares utilizados com muita frequência. Estes sistemas são bem conhecidos na arte e podem ser facilmente adquiridos 14 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ comercialmente, e.g., da Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabian Way, Paio Alto, Califórnia 94303-4607, EUA.

Assim, numa forma mais preferida desta concretização, a invenção refere-se a uma molécula de ADN recombinante que codifica para o fragmento de polipéptido sob o controlo de sequências reguladoras que permitem a expressão da proteína codificada pela referida sequência de ácido nucleico.

Outra concretização da invenção refere-se a transportadores recombinantes vivos (LRC - Live Recombinant Carrier) compreendendo um fragmento de ADN ou uma molécula de ADN recombinante de acordo com a invenção que codifica para um polipéptido de acordo com a invenção, ou um seu fragmento imunogénico. Estes transportadores recombinantes vivos são bactérias e vírus. Estes microorganismos LRC são microorganismos em que foi clonada informação genética adicional. Os animais infectados com estes LRC irão produzir uma resposta imunogénica não só contra os imunogénios do LRC, mas também contra as partes imunogénicas do(s) polipéptido(s) para o(s) qual(ais) o código genético é adicionalmente clonado no LRC, e.g., o polipéptido de acordo com a invenção.

Como exemplo de LRC bacterianos, as estirpes de

Salmonella atenuadas conhecidas na arte são atractivas para utilização. Além disso, os vírus LRC podem ser utilizados como um modo de transportar o fragmento de ADN para uma célula alvo.

Os vírus transportadores recombinantes vivos também são designados por vírus vector. O local de integração do ADN que codifica para o polipéptido de acordo com a invenção ou um seu fragmento imunogénico pode ser um local num gene virai que não é essencial para o vírus, ou um local numa região intergénica. Os vírus muitas vezes utilizados como vectores são os vírus vaccinia (Panicali et al.; Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 79: 4927 (1982), herpesvírus (E.P.A. 0473210A2) e retrovírus (Valerio, D. et al.; in Baum, S.J., Dicke, K.A., Lotzova, E. and Pluznik, D.H. (Eds.), Experimental Haematology today -1988. Springer Verlag, New York: pp. 92-99 (1989)). 15 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ

Em especial ο poxvírus de aves, um vírus vaccinia infeccioso para aves de criação e o herpesvírus do peru (HVT) são vírus transportadores recombinantes vivos, muito atractivos para transportar ADN que codifica para um polipéptido da invenção, ou um seu fragmento imunogénico. A invenção também se refere a uma célula hospedeira contendo um fragmento de ADN de acordo com a invenção, a uma célula hospedeira contendo uma molécula de ADN recombinante contendo um fragmento de ADN de acordo com a invenção, sob o controlo de sequências reguladoras que permitem a expressão da proteína codificada pela referida sequência de ácido nucleico e a uma célula hospedeira contendo um microorganismo transportador recombinante vivo (LCR) contendo um fragmento de ADN de acordo com a invenção.

Uma célula hospedeira pode ser uma célula de origem bacteriana, e.g. Escherichia coli, Bacillus subtilis e espécies de Lactobacíllus, em combinação com vectores baseados em bactérias, tais como pBR322, ou vectores de expressão bacteriana, tais como pGEX, ou com bacteriófagos. A célula hospedeira pode também ser de origem eucariótica: as células de levedura em combinação com moléculas de vector específicas de levedura ou células de insecto (Luckow et al; Biotechnology 6: 47-55 (1988)) em combinação com vectores ou baculovírus recombinantes, células de plantas em combinação com, e.g. vectores baseados no plasmídeo-Ti ou vectores virais de plantas (Barton, K.A. et al.; Cell 32: 1033 (1983). A técnica de recombinação homóloga in vivo, bem conhecida na arte, pode ser utilizada para introduzir uma sequência de ácido nucleico recombinante no genoma de uma bactéria, um parasita ou um vírus de escolha, capaz de induzir a expressão do gene inserido no animal hospedeiro.

Outra concretização da invenção refere-se a vacinas capazes de proteger as aves de criação contra os efeitos patogénicos da infecção por Eimeria. As vacinas de acordo com a presente invenção podem ser produzidas, e.g., meramente misturando um polipéptido de acordo com a invenção ou um seu fragmento imunogénico e um transportador farmaceuticamente aceitável. Entende-se que um transportador farmaceuticamente 16 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ aceitável é um composto que não afecta de forma adversa a saúde do animal a ser vacinado, pelo menos não na extensão em que o efeito adverso é pior do que os efeitos observados devido a doença, quando o animal não é vacinado. Um transportador farmaceuticamente aceitável pode ser, e.g., água estéril ou uma solução salina fisiologicamente estéril. Numa forma mais complexa, o transportador pode ser, e.g., um tampão. A vacina de acordo com a presente invenção numa forma de apresentação preferida pode também conter um adjuvante. Os adjuvantes compreendem em geral substâncias que reforçam a resposta imunitária do hospedeiro de um modo não especifico. São conhecidos vários adjuvantes diferentes na arte. Exemplos de adjuvantes são os adjuvantes completo e incompleto de Freund, vitamina E, polímeros de blocos não iónicos e poliaminas, tais como sulfato de dextrano, carbopol e pirano. Também são muito adequadas substâncias tensioactivas, tais como Span, Tween, hexadecilamina, lisolecitina, metoxi-hexadecilglicerol e saponinas tais como Quill A(R). Um adjuvante preferido é Quill A. Este pode ser administrado a um nivel de cerca de 150 pg/dose (por exemplo) . Além disso, são muitas vezes utilizados péptidos, tais como dipéptidos de muramilo, dimetilglicina, tuftsina,. Além destes adjuvantes, podem-se utilizar com vantagem complexos imunoestimulantes (ISCOMS), óleo mineral, e.g. Bayol(R) ou Markol(R), óleos vegetais ou suas emulsões e Diluvac(R) Forte. A vacina pode também compreender um designado "veículo". Um veículo é um composto ao qual o polipéptido adere, sem estar ligado a ele de forma covalente. Compostos veículo muitas vezes utilizados são e.g., hidróxido, fosfato, sulfato ou óxido de alumínio, sílica, caulino e bentonite. Uma forma especial de um veículo deste tipo, em que o antigénio está parcialmente embebido no veículo, é o designado ISCOM (EP109942, EP180564, EP242380). Um adjuvante preferido é o

Quill A. Este pode ser administrado a um nível de cerca de 150 pg/dose (por exemplo).

Muitas vezes a vacina é misturada com estabilizadores, e.g., para proteger os polipéptidos propensos a degradação de serem degradados, para aumentar o tempo de vida em 17 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ armazenamento da vacina, ou para melhorar a eficiência da criodessecagem. Estabilizantes úteis são, inter alia, SPGA (Bovarnik et al.; J. Bacteriology 59: 509 (1950)), leite em pó, gelatina, albumina de soro bovino, hidratos de carbono, e.g. sorbitol, manitol, trealose, amido, sacarose, dextrano ou glucose, proteínas, tais como albumina ou caseina, ou seus produtos de degradação e tampões, tais como fosfatos de metais alcalinos. A criodessecagem é um método eficiente de conservação. O material criodessecado pode ser armazenado e mantido viável durante muitos anos. As temperaturas de armazenamento para o material criodessecado podem ser acima de zero graus, sem que isso seja prejudicial para o material. A criodessecagem pode ser feita de acordo com procedimentos convencionais de criodessecagem, bem conhecidos.

Assim, numa concretização particularmente preferida, a vacina está numa forma criodessecada.

Adicionalmente, a vacina pode ser suspensa num diluente fisiologicamente aceitável. Este diluente pode, e.g., ser tão simples quanto água estéril, ou uma solução salina fisiológica. É desnecessário referir que outros modos de adicionar adjuvantes, adicionar compostos veiculo ou diluentes, emulsionar ou estabilizar um polipéptido também estão incluídos na presente invenção. A vacina de acordo com a invenção pode ser administrada num esquema convencional de imunização activa: administração simples ou repetida de um modo compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade tal que seja profilacticamente eficaz, i.e.f a quantidade de antigénio imunizante ou microorganismo recombinante capaz de expressar o referido antigénio que irá induzir imunidade em aves (em especial aves de criação) contra a provocação com parasitas Eimeria virulentos. Imunidade é definida como a indução de um nível significativo de protecção numa população de aves após vacinação, em comparação com um grupo não vacinado. 18 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ

Uma vacina que compreende o polipéptido da invenção pode reduzir o número de oocistos largados pelos animais infectados. Normalmente, os oocistos largados irão infectar outros animais no bando. Um decréscimo no número de oocistos largados irá assim originar também um decréscimo no número de animais que são subsequentemente infectados e também um decréscimo no número de oocistos largados irá originar uma carga menos infecciosa.

Além disso, mesmo sem efeito no próprio parasita, uma vacina pode diminuir a incidência de doença. Este é especialmente o caso quando os sintomas da doença são causados por produtos libertados pelo parasita. As vacinas dirigidas contra estes produtos aliviam os sintomas sem atacar o parasita.

Em qualquer caso é preferível que uma vacina da presente invenção seja capaz de reduzir o número de lesões cecais numa ave, quando desafiado com uma infecção por Eimeria subsequente.

Para vacinas de vector virai vivo a taxa de dose por galinha pode variar de 103 a 108 pfu (mas mesmo <1000 pfu podem ser suficientes e.g., para HVT) . Uma vacina de subunidades típica de acordo com a invenção compreende 0,1 a 100 pg do polipéptido (ou sua variante ou fragmento) de acordo com a invenção. De preferência, estarão presentes pelo menos 5 pg. Estas vacinas podem ser administradas por via intradérmica, subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, oral ou intranasal. A vacina de acordo com a invenção pode também ser eficazmente misturada com outros componentes antigénicos da mesma e/ou de outra espécie de Eimeria, e/ou com imunogénios adicionais derivados de um vírus ou microorganismo patogénico para aves de criação e/ou de sequências de ácido nucleico que codificam para estes imunogénios.

Uma vacina de combinação deste tipo pode diminuir a carga parasítica num bando de aves e pode aumentar o nível de protecção contra a coccidiose e, adicionalmente, proteger contra outros patogénios de aves de criação. 19 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ

Esses outros imunogénios podem, e.g., ser seleccionados do grupo de vírus ou microorganismos patogénicos para aves de criação que consistem em vírus da doença de Marek (MDV), vírus da doença de Newcastle (NDV), vírus de bronquite infecciosa (IBV), agente de anemia de galinha (CAA), reovírus, retrovírus aviário, adenovírus de ave, vírus de rinotraqueite de peru, Salmoonella spp. ou E. coli. Assim, pode-se obter uma vacina multivalente.

Ainda outra concretização da invenção refere-se a métodos para a preparação de uma vacina.

Estes métodos compreendem misturar um polipéptido de acordo com a invenção ou um seu fragmento imunogénico e um transportador farmaceuticamente aceitável.

Um modo alternativo e eficaz de vacinação é a vacinação directa com ADN que codifica para o antigénio relevante. A vacinação directa com ADN que codifica para polipéptidos tem tido sucesso para muitos polipéptidos diferentes (como revisto em, e.g., Donnelly et al.r The Immunologist 2:20-26 (1993)).

No campo das vacinas anti-parasita, a protecção contra, e.g., Plasmodium yoelii foi obtida com vacinação de ADN com o gene de circunsporozoíto de Plasmodium yoelii (Vaccine 12: 1529- 1533 (1994)). A protecção contra Leishmania major foi obtida com vacinação de ADN com o gene gp63 da glicoproteína de superfície de Leishmania major (Vaccine 12: 1534-1536 (1994)).

Os anticorpos ou seus derivados (e.g., fragmentos tais como Fab, F(ab')2 ou Fv) que são dirigidos contra um polipéptido de acordo com a invenção têm utilidade potencial em imunoterapia passiva, imunoensaios de diagnóstico e na produção de anticorpos anti-idiotípicos. De preferência, estes são específicos para os polipéptidos de Eimeria da presente invenção ou suas variantes/fragmentos. Também se pode proporcionar soro compreendendo anticorpos ou seus derivados.

Os polipéptidos de Eimeria (ou suas variantes ou fragmentos) tal como caracterizados acima podem ser utilizados para produzir anticorpos que podem ser policlonais, monoespecíficos ou monoclonais (ou seus derivados). Quando se pretendem anticorpos policlonais, as técnicas para produzir e 20 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ processar soros policlonais são conhecidas na arte (e.g. Mayer e Walter, eds. ImmunoChemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, Londres, 1987).

Os anticorpos monoclonais reactivos contra os polipéptidos de Eimeria (ou suas variantes ou fragmentos) de acordo com a presente invenção podem ser preparados imunizando ratinhos consanguíneos, por técnicas conhecidas na arte (Kohler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975).

Os anticorpos anti-idiotipicos são imunoglobulinas que transportam uma "imagem interna" do antigénio do patogénio contra o qual se deseja protecção e podem ser utilizados como um imunogénio numa vacina (Dreesman et al., J. Infect. Disease, 151, 761, 1985). As técnicas para produzir anticorpos anti-idiotipicos são conhecidas na arte (MacNamara et al., Science 226, 1325, 1984).

Os anticorpos contra qualquer dos polipéptidos da presente invenção e produzidos, e.g., num dos modos descritos acima, podem ser utilizados, inter alia, para fins de vacinação, em especial em animais imunocomprometidos.

Assim, ainda outra concretização da presente invenção refere-se a anticorpos contra qualquer um dos polipéptidos de acordo com a invenção.

Além disso, a invenção refere-se a métodos para a preparação destes anticorpos. Esses métodos compreendem a administração de um polipéptido de acordo com a invenção a um animal adequado, í.e., um animal capaz de produzir anticorpos contra polipéptidos.

Poderá ser desejável detectar Eimeria como a causa da doença em aves de criação: em especial a detecção precoce da infecção por Eimeria num bando oferece a oportunidade de tomar medidas adequadas para a prevenção da propagação da infecção. A detecção de infecção por Eimeria pode ser feita detectando o parasita Eimeria no hospedeiro ou detectando anticorpos contra Eimeria no hospedeiro. 21 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ A detecção de parasitas Eimeria pode ser feita, e.g., como se segue: o ADN preparado a partir do conteúdo do tracto digestivo de um animal doente pode ser analisado com sondas de fragmentos de adn de acordo com a invenção e submetido a reacção em cadeia com polimerase convencional (PCR). Se está presente ADN de Eimeria, mesmo em quantidades extremamente baixas, isto irá resultar num produto de PCR, visível em geles de agarose convencionais após vários ciclos de PCR. As técnicas de PCR estão descritas, e.g., em Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6).

Deste modo, a invenção ainda noutra concretização refere-se a métodos para a detecção de Eimeria, os quais compreendem a incubação de uma preparação de ADN isolada de aves de criação com um fragmento de ADN de acordo com a invenção.

Alternativamente, podem-se detectar anticorpos contra Eimeria. A detecção de anticorpos pode ser feita, e.g., utilizando um teste ELISA, em que um polipéptido de acordo com a invenção reveste a parede de uma placa ELISA. O primeiro passo deste ELISA pode compreender, e.g., adicionar soro do animal a ser testado à placa de ELISA. Os anticorpos contra Eimeria, se presentes de todo, irão ligar-se ao polipéptido que reveste a parede. A ausência ou presença destes anticorpos pode, num passo seguinte, ser detectada inter alia por incubação com um anticorpo anti-ave doméstica marcado. Se os anticorpos contra Eimeria estavam presentes no soro a ser testado, o anticorpo anti-ave doméstica marcado irá ligar-se a eles e o marcador irá revelar a sua presença. Estas técnicas convencionais estão extensivamente descritas em "Antibodies: a laboratory manual" de Harlow, E. e Lane D. ISBN 0-87969-314-2.

Deste modo, a invenção ainda noutra concretização refere-se a métodos para a detecção de Eimeria, os quais compreendem a detecção de anticorpos anti-Eimeria do hospedeiro contra qualquer um dos polipéptidos de acordo com a presente invenção. 22 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ

EXEMPLOS

Exemplo 1: isolamento de proteínas e sequenciação de proteínas Galinhas

Mantiveram-se galinhas White Leghorn não consanguíneas, de sexo indefinido, criadas sob condições específicas isentas de patogénio em isoladores com acesso livre a alimento e água. As fezes forma monitorizadas semanalmente para assegurar que os animais estavam livres de infecções coccidiais indesejadas. Para infecção utilizaram-se galinhas com 5-7 semanas de idade. Para vacinação, utilizaram-se galinhas de 3 semanas de idade.

Parasitas e purificação de esporozoítos

Utilizou-se a estirpe Weybridge de E. tenella (Shirley M.W. In: Research in Avian Coccidiosis. Proceedings of the Georgia Coccidiosis Conference (Eds.: l.r. McDougald, Joyner L.P. and P.L. Long) Athens, University of Georgia. pp. 13-35 (1986)). Os parasitas foram passados a intervalos regulares através de galinhas isentas de coccidiose. O manuseamento dos oocistos, libertação de esporocistos e esporozoítos a partir dos oocistos esporulados foram realizados como descrito anteriormente (Long P.L., Millard B.J., Joyner L.P. & Norton C.C. Folia Veterinária Latina 6, 201-217 (1976)) utilizando taurocolato a 0,4% (Sigma, St. Louis, MO, USA) em vez de sais biliares (Toyama T. & Kitano N. Japanese Journal of Veterinary Science 45, 139-141 (1983)). Os esporozoítos foram ainda purificados por passagem em lã de nylon (Larsen R.A., Kyle J.E., Whitmire W.M. & Speer C.A. Journal of Parasitology 70, 597-601 (1984)) e armazenados como sedimentos a -70°C.

Fraccionamento de proteínas dos esporozoítos

Extracção com Triton-Xll4

Fez-se uma extracção com Triton X-114 para isolar a fase hidrófila das proteínas totais de esporozoítos (HPS) (Bordier C., Journal of Biological Chemistry 256, 1604-1607 (1981)).

Para isso, suspenderam-se 5 x 109 esporozoítos de E. tenella purificados (2 xl08/ml) em Tris-HCl 10 mM, NaCl 150 mM pH 7,4 23 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ (TBS) suplementado com ADNase (20 pg/ml) e inibidores de protease; fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF, Serva, Heidelberg, Alemanha), aprotinina 5 pg/ml, leupeptina 1 pg/ml e Pepstatina A 1 pg/ml e tratou-se com ultra-sons três vezes durante 20 segundos na posição 7, em gelo (utilizando um aparelho de ultra-sons da Branson, Soest, Holanda). Adicionou-se Triton X-114 (Serva) pré-condensado em TBS à suspensão de esporozoítos, a uma concentração final de 10% (v/v) e misturou-se bem para dissolver as proteinas. O material não solubilizado foi sedimentado por centrifugação (20 min, 12000g a 4°C). O sobrenadante recuperado foi colocado em camadas sobre uma almofada de sacarose a 6% e incubado durante 15 min a 40°C (separação de fases) e centrifugado durante 10 min, 400 g à temperatura ambiente (RT). A extracção da fracção hidrófila foi repetida uma vez em 10% (v/v) e subsequentemente em 20% (v/v) de Triton X-114 pré-condensado. A concentração total de proteína foi determinada utilizando o teste de ácido bicinchónico (BCA) (Pierce Chemicals, Rockford, Illinois, EUA). Esta fase hidrófila foi armazenada a -70°C até posterior utilização.

Fraccionamento em Prep-cell

Todos os procedimentos foram realizados a 4°C. Antes do fraccionamento, a HPS foi concentrada por precipitação com acetona (HPS:acetona + 1,9). Após centrifugação durante 60 minutos a 15000 g e 4°C e secagem ao ar, os sedimentos foram redissolvidos em tampão de amostra redutor (Laemmli 1970) contendo ditiotreitol 30 mg/ml (DTT) e ferveu-se durante 3 min a 100°C. As proteínas hidrófilas foram fraccionadas utilizando um gel de separação (7 cm) de poliacrilamida (PAA) a 12% (p/v) e um gel de empacotamento de PAA a 4% (p/v) no tubo de 37 mm de diâmetro do aparelho de Prep-cell da Bio-Rad (Bio-Rad Labs, Richmond, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. O Prep-cell foi operado a 40 mA, 500 V max. Recolheram-se fracções (+ 3 ml) durante a noite e armazenaram-se a -85°C. As amostras das fracções foram diluídas uma vez em 2 x força tampão de amostra redutor e analisadas por electroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE), utilizando um gel de PAA a 12%(p/v) (Laemmli 1970). Os geles foram corados com prata de acordo com Wray et al. (Wray W., Boulikas T., Wray V.P. & 24 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ

Hannock R. (1981) Silver staining of proteins in polyacrylamide). Analisaram-se cinquenta fracções com base na sua massa molecular relativa e dialisaram-se contra solução salina tamponada com fosfato (PBS) 0,01 M, pH 7,3. As fracções contendo proteínas com um PM entre 26 e 30 kD (+/- 5 kD) foram seleccionadas para posterior análise. A concentração total de proteínas nas fracções foi determinada utilizando o teste de BCA.

Caracterização de antigénios seleccionados e sequenciação de proteínas

As fracções que contêm polipéptidos descritas em fraccionamento em Prep-cell e que variam entre 26-30 kD (+5 kDa, para permitir limitações possíveis nas técnicas de medição utilizadas) foram colocadas em gelo para posterior análise.

Elas foram em seguida fraccionadas num gel de poliacrilamida a 12% (p/v) preparativo, coradas com Coomassie Brilliant Blue e subsequentemente excisadas do gel. As bandas destes geles foram utilizadas para fins de sequenciação, como descrito a seguir:

Os polipéptidos nas fatias de gel foram submetidos a digestão tríptica, como descrito por Rosenfeld et al.r Anal. Biochem. 203: 173-179 (1992).

Em seguida os fragmentos de digestão tríptica foram libertados do gel e pré-purif içados de novo em HPLC preparativa utilizando o sistema de ácido trifluoroacético (TFA), seguido de HPLC preparativa utilizando o sistema de acetato de amónio. Os fragmentos de polipéptido purificados foram sequenciados utilizando o método convencional de Edman, como descrito (Edman, P., Acta Chem. Scand. 10: 761-768 (1956) e Ilse, D. & Edman, P., Aust. J. Chem. 16: 411-416 (1963)).

Exemplo 2: isolamento/clonagem de ADN e sequenciação de ADN

Clonagem e sequenciação de um fragmento do gene que codifica para o polipéptido de 25 kD do tipo SOD. 25 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ

Isolou-se ARNm de trofozoítos de primeira geração de E. tenella (obtidos de células MDBK infectadas com esporozoitos retirados de oocistos, de fresco) às 40-48 horas após infecção, utilizando o reagente de isolamento de ARN total Ultraspec (Biotecx Lab. Inc., Houston, Texas). Sintetizou-se ADNc da Ia cadeia utilizando um iniciador inverso especifico de SOD, de acordo com o código de ambiguidade GCRAARTCCCARTTIACIAC, que foi deduzido a partir de uma parte (wnwdfa) do oligopéptido yldawwswnwdfanenlk que foi isolado e sequenciado como descrito acima e que é parte da sequência apresentada em SEQ ID NO: 1. Ao ARNm adicionaram-se 0,5 pg de iniciador e incubou-se a 70°C, durante 10 min. A síntese de ADNc foi realizada utilizando transcriptase inversa Superscript (kit de síntese de ADNc, Gibco BRL). A reacção foi incubada durante 50 min a 41°C. A síntese de ADNc foi parada arrefecendo rapidamente em gelo. Em seguida, o ADNc foi purificado por extracção com fenol/clorofórmio, seguida de precipitação em etanol de acordo com procedimentos convencionais (Sambrook T, et al.). Este ADNc iniciado com sonda específico foi submetido a PCR utilizando o iniciador inverso e um iniciador de sentido directo específico, de acordo com o código de ambiguidade (CCIGAYGCTYTIGARCCITAYAT), que foi deduzido a partir de uma parte (PDALEPYI) de outro oligopéptido, FSLPPLPYKPDALEPYIS, que foi isolado e sequenciado como descrito acima e que também é parte da sequência apresentada na SEQ ID NO: 1. A reacção foi corrida num sistema de PCR da GeneAmp (Perkin Elmer) que foi programado como se segue: 10 min 94°C - 1 min 94°C; 30 s 55°C; 90 s 68 °C (30 ciclos) - 10 min 68°C; 4°C. Os produtos de PCR obtidos foram corridos num gel de agarose com TAE a 1% contendo brometo de etídio. Os fragmentos de PCR específicos foram visualizados utilizando luz UV e excisados do gel. Os fragmentos foram eluídos do gel por incubação do gel numa quantidade igual de água desionizada, durante a noite. Os fragmentos de PCR foram clonados num vector rombo pCRll-topo {kit de clonagem de PCR Zero Blunt Topo, Invitrogen, Leek, Holanda) de acordo com as especificações do fabricante. Utilizando iniciadores específicos de pCRII-topo o fragmento de PCR inserido foi sequenciado utilizando um analisador genético ABI Prism 310 (Perkin Elmer). 26 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ

Clonagem e sequenciação de um fragmento do gene que codifica para o polipéptido de 25 kD tipo peroxidoxina. 0 procedimento era semelhante ao procedimento descrito acima, no entanto o iniciador inverso (TCIGTIGTRCAIACIGGIGTRAARTC) utilizado para a síntese de ADNc específico foi deduzido a partir de uma parte conservada (DFTPVCTTE) de moléculas de peroxidoxina. Na reacção de PCR este iniciador inverso foi utilizado em combinação com um iniciador de sentido directo (TTYCCIGAYTTYCARGCIGARGC) deduzido a partir de uma parte do oligopéptido isolado (FPDFQAE).

Exemplo 3: Experiências de vacinação

Determinação do potencial de vacina de polipéptidos seleccionados

Imunizaram-se grupos de galinhas com os polipéptidos seleccionados. Os animais receberam uma vacinação de imunização no dia 0 e uma vacinação de reforço no dia 21.

Catorze dias após a vacinação de reforço todos os animais foram desafiados com oocistos esporulados de E. tenella. Sete dias mais tarde, os animais foram sacrificados para determinar a pontuação de lesões no cego. 0 grupo de animais vacinados com os polipéptidos de acordo com a invenção tinha pontuações de lesões cecais reduzidas, em comparação com controlos não vacinados. Esta redução era estatisticamente significativa (P< 0,05) .

Experiências de vacinação

Os volumes de polipéptido seleccionados são reunidos e ajustados para obter 5-10 pg de um polipéptido de acordo com a invenção/dose (0,5 ml), salvo indicação em contrário. A cada dose adicionam-se 150 pg/dose de Quill A (Superfos Biosector, Vedbaek, Dinamarca) como adjuvante. As diferentes preparações de vacina são injectadas subcutaneamente em grupos de + 10 galinhas. O grupo de controlo é injectado com adjuvante em PBS. Após + 3 semanas, as galinhas levam um reforço com a 27 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ mesma preparação que é preparada de fresco a partir da reserva de antigénio congelado.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: (A) NOME: Akzo Nobel N.V. (B) RUA: Velperweg 76 (C) CIDADE: Arnhem (E) PAÍS: Holanda

(F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6824 BM (G) TELEFONE: 0412 666379 (H) TELEFAX: 0412 650592 (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Vacinas contra a Coccidiose (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 41 (iv) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (EPO) (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 214 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: I SEQ ID NO: 1: Met Pro Phe Glu Leu Pro Pro Leu Pro Tyr Pro Met Asp Ala Leu Glu 1 5 10 15 Pro Tyr Ile Ser Lys Glu Thr Leu Glu Tyr His Tyr Gly Lys His His 20 25 30 Ala Ala Tyr Vai Asn Asn Leu Asn Arg Leu Vai Glu Gly Lys Pro Glu 35 40 45 Ala Ser Lys Ser Leu Glu Glu Ile Ile Lys Thr Ser Ser Gly Ser Vai 50 55 60 Leu Asn Asn Ala Gly Gin Ala Trp Asn His Thr Phe Tyr Trp Lys Ser 65 70 75 80

Met Arg Pro Ala Ser Ala Gly Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Gly Gly 28 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ 85 90 95

Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Leu Arg Glu Glu Leu Glu Ser Ala 100 105 110

Phe Gly Gly Vai Glu Lys Phe Arg Glu Ala Phe Ala Ala Ala Ala Ala 115 120 125

Ala His Phe Gly Ser Gly Trp Ala Trp Leu Cvs Phe Cys Lys Lys Ser 130 135 140

Arg Ser Leu Phe Leu Leu Gin Thr His Asp Gly Ala Thr Pro Phe Arg 145 150 155 160

Asp Asn Pro Asn Cys Ala Pro Leu Leu Thr Cys Asp Leu Trp Glu His 165 170 175

Ala Tyr Tyr Ile Asp Arg Arg Asn Asp Arg Lys Ser Tyr Leu Asp Ala 180 185 190

Trp Trp Ser Vai Vai Asn Trp Asp Phe Ala Asn C-lu Asn Leu Lys Lys 195 200 205

Ala Met Gin Gly Ser Asp 210 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2:

Leu Gly Pro Leu Ala Leu Pro Leu Leu Ala Asp Vai Arg 15 10 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 223 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno 29 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

Met Pro Leu Asn Leu Gly Asp Ser Phe Pro Asp Phe Gin Ala Glu Ala 15 10 15

Leu Gly Ala Glu His Phe Arg Leu His Glu Tyr Leu Gly Asp Ser Trp 20 25 30

Gly Vai Met Phe Ser His Pro Asn Asp Phe Thr Pro Vai Cys Thr Thr 35 40 45

Glu Leu Ala Glu Ala Vai Lys Leu Gin Asp Ser Phe Thr Lys Lys Asn 50 55 60

Cys Lys Leu Vai Gly Phe Ser Cys Asn Asp Leu Gin Ser His Arg Glu 65 70 75 80

Trp Ala Lys Asp Ile Met Ala Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Asn Leu Pro 85 90 95

Phe Pro Leu Vai Cys Asp Pro Asn Arg Glu Leu Ala Ala Ser Leu Gly 100 105 110

Ile Met Asp Pro Ala Glu Lys Asp Lys Lys Gly Leu Pro Leu Thr Cys 115 120 125

Arg Cys Vai Phe Phe Ile Ser Pro Glu Lys Lys Leu Ala Ala Ser Ile 130 135 140

Leu Tyr Pro Ala Thr Thr Gly Arg Asn Phe Ala Glu Ile Leu Arg Vai 145 150 155 160

Leu Asp Ser Leu Gin Leu Thr Ala Lys Phe Pro Vai Ala Thr Pro Vai 165 170 175

Asp Trp Thr Ala Gly Ala Lys Cys cys vai vai Pro Asn Leu Ala Ala 180 185 190 «

Glu Glu Ala Gin Arg Leu Leu Pro Lys Gly His Glu Ala Leu Gin Leu 195 200 205

Pro Ser Gly Lys Pro Tyr Leu Arg Leu Thr Pro Asp Pro Arg Gly 210 215 220 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Ser Leu 15

Met Ser Pro Ser Pro Ala Gly Vai Ala Glu Tyr Leu Ala 15 10 30 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

Asn His Ala Glu Phe Asp Pro Ser Gin Thr Glu Vai Vai Vai Phe Pro 15 10 15 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Vai Asp Ser Phe Thr Pro Ser Vai Gly Cvs Vai Phe Ala Gly Met Pro 15 10 15

Ala Asp Phe Arg 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: GTAAATTGGG ACTTCGC 17 31 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: GTAAACTGGG ACTTCGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9: GTAAATTGGG ACTTCGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10 GTAAACTGGG ACTTCGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11 GTTAATTGGG ACTTCGC 17 32 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12 GTTAACTGGG ACTTCGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13: GTTAATTGGG ACTTCGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14 GTTAACTGGG ACTTCGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15 GTGAATTGGG ACTTTGC 17 33 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16 GTGAACTGGG ACTTTGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17 GTGAATTGGG ACTTTGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18 GTGAACTGGG ACTTTGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19 GTCAATTGGG ACTTTGC 17 34 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 20 GTCAACTGGG ACTTTGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 21 GTCAATTGGG ACTTTGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 22 GTCAACTGGG ACTTTGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 23 GTAAATTGGG ATTTCGC 17 35 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 24 GTAAACTGGG ATTTCGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 25 GTAAATTGGG ATTTCGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 26 GTAAACTGGG ATTTCGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 27 GTTAATTGGG ATTTCGC 17 36 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 28 GTTAACTGGG ATTTCGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 29 GTTAATTGGG ATTTCGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 30 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 30 GTTAACTGGG ATTTCGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 31 GTGAATTGGG ATTTTGC 17 37 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 32 GTGAACTGGG ATTTTGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 33 GTGAATTGGG ATTTTGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 34 GTGAACTGGG ATTTTGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 35 GTCAATTGGG ATTTTGC 17 38 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 36: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 36 GTCAACTGGG ATTTTGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 37 GTCAATTGGG ATTTTGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 38 GTCAACTGGG ATTTTGC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 719 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 39 39 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ atg ccg ttc gaa ctc ccc ccg ctg ccg tac ccc atg gac gee ctc gag 48 Met Pro Phe Glu Leu Pro Pro Leu Pro Tyr Pro Met Asp Ala Leu Glu 1 5 10 15 ccg tac ate age aaa gag act ctc gag tac cac tat ggg aag cac cac 96 Pro Tyr Ile Ser Lys Glu Thr Leu Glu Tyr His Tyr Gly Lys His His 20 • 25 30 gcg gct tac gtg aac aac ttg aac aga ctc gtc gag ggg aag ccg gag 144 Ala Ala Tyr Vai Asn Asn Leu Asn Arg Leu Vai Glu Gly Lys Pro Glu 35 40 45 gct tcc aag age ctg gag gaa ata ata aag acc tcc teg ggg teg gtg 192 Ala Ser Lys Ser Leu Glu Glu Ile Ile Lys Thr Ser Ser Gly Ser Vai 50 55 60 ctg aac aac gcg ggc cag gcg tgg aac cac acg ttc tac tgg aag teg 240 Leu Asn Asn Ala Gly Gin Ala Trp Asn His Thr Phe Tyr Trp Lys Ser 65 70 75 80 atg cgg ccg gee teg gcg ggg ggc ccc ccg ggg gee ccc ggc 999 ggc 288 Met Arg Pro Ala Ser Ala Gly Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Gly Gly 85 90 95 ccc ccg ggg gee ccg ggg gee CCC ctg cgg gag gag ctg gag age gcg 336 Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Leu Arg Glu Glu Leu Glu Ser Ala 100 105 110 ttc ggg ggc gtg gag aag ttc cgg gag gee ttt gct gct gct gct gct 384 Phe Gly Gly Vai Glu Lys Phe Arg Glu Ala Phe Ala Ala Ala Ala Ala íis 120 125 gcg cac ttc ggc teg ggc tgg gee tgg ctc tgc ttc tgc aag aag tcc 432 Ala His Phe Gly Ser Gly Trp Ala Trp Leu Cys Phe Cys Lys Lys Ser 130 135 140 ege age ctc ttt ttg ctg cag acc cac gac ggg gee acg cct ttc aga 480 Arg Ser Leu Phe Leu Leu Gin Thr His Asp Gly Ala Thr Pro Phe Arg 145 150 155 160 gac aac ccc aac tgc gcg ccg ctg ctc acc tgc gac ctg tgg gag cac 528 Asp Asn Pro Asn Cys Ala Pro Leu Leu Thr Cys Asp Leu Trp Glu His 165 170 175 gee tac tac ate gac ege aga aac gac ege aag age tac ctc gac gcg 576 Ala Tyr Tyr Ile Asp Arg Arg Asn Asp Arg Lys Ser Tyr Leu Asp Ala 180 185 190 tgg tgg tet gtg gtg aat tgg gac ttc gcg aac gag aac ttg aag aag 624 Trp Trp Ser Vai Vai Asn Trp Asp Phe Ala Asn Glu Asn Leu Lys Lys 195 200 205 gca atg cag gga age gac tag gcgcgtggtg gtctgtggtg aattgggact 675

Ala Met Gin Gly Ser Asp 210 215 tcgcgaacga gaacttgaag aaggcaatgc agggaagcga ctag 719 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 265 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 40 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 40: TTCCCGGATT TTCAGGCGGA GGCGCTGGGC GCCGAGCACT TCCGCTTGCA CGAGTACTTG 60 GGGGACAGCT GGGGAGTGAT GTTCAGGTAA GATTGGCGTA AAAAAGCCCC ATTTAATCGC 120 ATTTTTAATT CTGTAGACTC TGTGTCGACT GCTGAGCACG AGGGGGGGGC CTGCTGCACG 180 GGAGAGCCTT GTCTCGCGCT CAACTCTGGG TTTCTGGCGT TGCTTGCAGC CACCCGAACG 240 ACTTCACCCC CGTCTGCACC ACCGA 265 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 41: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 672 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 41: atg ccg ttg aac ttg gga gat tcc ttt cca gac ttc cag gcg gag gcg 48 Met Pro Leu Asn Leu Gly Asp Ser Phe Pro Asp Phe Gin Ala Glu Ala 1 S 10 15 ctg ggc gcc gag cac ttc cgc ttg cac gag tac ttg ggg gac age tgg 96 Leu Gly Ala Glu HlS Phe Arg Leu His Glu Tyr Leu Gly Asp Ser Trp 20 25 30 gga gtg atg ttc age cac ccg aac gac ttc act ccc gtt tgc aca acg 144 Gly Vai Met Phe Ser His Pro Asn Asp Phe Thr Pro Vai Cys Thr Thr 35 40 45 gag ctc gcc gaa gcc gtg aag ctc cag gac tcc ttc acg aag aag aac 192 Glu Leu Ala Glu Ala Vai Lys Leu Gin Asp Ser Phe Thr Lys Lys Asn 50 55 60 tgo aaa ctc gtt ggc ttc tcc tgc aac gac ctg cag age cac aga gaa 240 Cys Lys Leu Vai Gly Phe Ser Cys Asn Asp Leu Gin Ser His Arg Glu 65 70 75 80 tgg gcg aag gat ata atg gcc tet gea ggc cga tet ggg aac ttg ccg 288 Trp Ala Lys Asp Ile Met Ala Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Asn Leu Pro 85 t 90 95 ttt ccc ctc gtt tgc gac ccc aat agg gaa ctg gcc gcg agt ttg gga 336 Phe Pro Leu Vai Cys Asp Pro Asn Arg Glu Leu Ala Ala Ser Leu Gly 100 105 110 att atg gat cct gea gaa aag gac aaa aag ggg ctg cct ttg act tgc 384 Ile Met Asp Pro Ala Glu Lys Asp Lys Lys Gly Leu Pro Leu Thr Cys 115 120 125 cgc tgc gtc ttt ttc ata agt cca gag aag aag ctc gcg gcc tet att 432 Arg Cys Vai Phe Phe Ile Ser Pro Glu Lys Lvs Leu Ala Ala ser Ile 130 135 140

ttg tac ccg gct acc acc ggg aga aac ttc gcg gaa ato ctt agg gtc Leu Tyr Pro Ala Thr Thr Gly Arg Asn Phe Ala Glu Ile Leu Arg Vai 145 150 155 ISO 480 41 ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ ctg gac tct ctg cag ctc act gcc aag ttt cca gtg gcc act cca gtg 528 Leu Asp Ser Leu Gin Leu Thr Ala Lys Phe Pro Val Ala Thr Pro Val 165 170 175 gac tgg acc gct ggg gcc aaa tgc tgc gta gtg ccg aac ttg gca gca 576 Asp Trp Thr Ala Gly Ala Lys Cys Cys Vai Val Pro Asn Leu Ala Ala 180 185 190 gaa gag gcc caa agg ctt ttg ccc aaa ggc ca c gag gcg ctg cag ctg 624 Glu Glu Ala Gin Arg Leu Leu Pro Lys Gly His Glu Ala Leu Gin Leu 195 200 205 cct tcg ggg aag cct tac ctg cgg ctc acc cca gac ccc agg ggc tga 672 Pro Ser Gly Lys Pro Tyr Leu Arg Leu Thr Pro Asp Pro Arg Gly 210 215 220

Lisboa,

Claims (19)

1. ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido hidrófilo de Eimeria caracterizado por o referido polipéptido ser um polipéptido do tipo peroxidoxina, ter um peso molecular de 25 kD e compreender uma sequência de aminoácidos que partilha pelo menos 70% de homologia com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:3, ou um fragmento imunogénico do referido polipéptido capaz de induzir uma resposta imunitária contra o referido polipéptido.
2. 2. Polipéptido hidrófilo de Eimeria de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a homologia ser de 100%.
3. 3. Polipéptido hidrófilo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a Eimeria ser Eimeria tenella.
4. 4. Fragmento de ADN compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica para um polipéptido hidrófilo, ou um fragmento imunogénico do referido polipéptido, de acordo com as reivindicações 1-3.
5. 5. Fragmento de ADN de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a sequência de nucleótidos ser SEQ ID NO:40, ou um fragmento de SEQ ID NO:40, em que o fragmento de SEQ ID NO: 40 retém a capacidade de codificar para um fragmento imunogénico de um polipéptido de acordo com as reivindicações 1-3.
6. 6. Fragmento de ADN de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a sequência de nucleótidos ser SEQ ID NO:41, ou um fragmento de SEQ ID NO:41, em que o fragmento de SEQ ID NO: 41 retém a capacidade de codificar para um fragmento imunogénico de um polipéptido de acordo com as reivindicações 1-3.
7. 7. Molécula de ADN recombinante compreendendo um fragmento de ADN de acordo com as reivindicações 4-6.
8. 8. Microorganismo transportador recombinante vivo, bacteriano ou virai, compreendendo informação genética adicional, em que a informação genética adicional compreende ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ 2/3 um fragmento de ADN de acordo com as reivindicações 4-6, ou uma molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 7.
9. 9. Célula hospedeira bacteriana, de levedura, de insecto ou de planta, compreendendo um fragmento de ADN de acordo com reivindicações 4-6, uma molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 7, ou um microorganismo transportador recombinante vivo, compreendendo informação genética adicional de acordo com a reivindicação 8.
10. 10. Vacina capaz de proteger aves de criação contra a infecção por Eimeria, caracterizada por a vacina compreender um fragmento de ADN de acordo com as reivindicações 4-6, um fragmento de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 7, um microorganismo transportador recombinante vivo, compreendendo informação genética adicional de acordo com a reivindicação 8, ou uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 9, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
11. 11. Vacina de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por compreender adicionalmente um adjuvante.
12. 12. Vacina de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizada por compreender um imunogénio adicional derivado de um vírus ou microorganismo patogénico para aves de criação.
13. 13. Vacina de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por o imunogénio ser seleccionado do grupo de vírus ou microorganismos patogénicos para aves de criação, consistindo em vírus da doença de Marek, vírus da doença de Newcastle, vírus de bronquite infecciosa, agente de anemia de galinha, reovírus, retrovírus aviário, adenovírus de ave, vírus de rinotraqueite de peru, Salmonella spp. e E. coli.
14. 14. Vacina de acordo com as reivindicações 10-13 caracterizada por estar na forma criodessecada.
15. 15. Anticorpo criado contra um polipéptido de acordo com as reivindicações 1-3. ΕΡ Ο 995 799 /ΡΤ 3/3
16. 16. Método para a preparação de uma vacina para combater infecções por Eimeria, caracterizado por o referido método compreender misturar um polipéptido de acordo com as reivindicações 1-3, um fragmento de ADN de acordo com as reivindicações 4-6, um fragmento de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 7, um microorganismo transportador recombinante vivo, compreendendo informação genética adicional de acordo com a reivindicação 8 ou uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 9, com um transportador farmaceuticamente aceitável.
17. 17. Método para a preparação de uma vacina para combater infecções por Eimeria, caracterizado por o referido método compreender a mistura de anticorpos de acordo com a reivindicação 15, com um transportador farmaceuticamente aceitável.
18. 18. Método para a detecção de parasitas Eimeria em aves de criação, caracterizado por o referido método compreender a incubação de uma preparação de ADN isolada de aves de criação com um fragmento de ADN de acordo com as reivindicações 4-6.
19. 19. Método para a detecção de anticorpos contra parasitas Eimeria no soro de aves de criação, caracterizado por o referido método compreender a incubação do referido soro com o polipéptido hidrófilo de acordo com as reivindicações 1-3. Lisboa,