PT1664097E - Vacina de piroplasmida - Google Patents

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PT1664097E
PT1664097E PT04787138T PT04787138T PT1664097E PT 1664097 E PT1664097 E PT 1664097E PT 04787138 T PT04787138 T PT 04787138T PT 04787138 T PT04787138 T PT 04787138T PT 1664097 E PT1664097 E PT 1664097E
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Erik De Vries
Fasilla Razzia Gaffar
Ana Patricia Yatsuda
Theodorus Cornelis Schaap
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Univ Utrecht Holding Bv
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Description

ΕΡ 1 664 097/ΡΤ DESCRIÇÃO "Vacina de Piroplasmida" A invenção refere-se a uma proteína de Piroplasmida ou um fragmento imunogénico da referida proteína, a um ácido nucleico que codifica para a referida proteína de Piroplasmida, ou referido fragmento imunogénico, a fragmentos de ADNc, moléculas de adn recombinantes e transportadores recombinantes vivos que compreendem o referido ácido nucleico, a células hospedeiras que compreendem os referidos fragmentos de ADNc, moléculas de AND recombinantes e transportadores recombinantes vivos, a vacinas que compreendem uma proteína de Piroplasmida ou um fragmento imunogénico da referida proteína, a métodos para a preparação destas vacinas, à utilização destas proteínas ou fragmentos e a testes de diagnóstico. A babesiose é uma doença que tem uma ocorrência focal do ponto de vista geográfico. A razão para isso é o facto de o patogénio ser transmitido por carraças que se alimentam num determinado reservatório de parasitas presente numa população de vertebrados. A babesiose apenas pode ocorrer quando estão presentes as carraças. No equilíbrio, em particular em animais indígenas, o parasita coexiste com o hospedeiro, sem provocar doença significativa. Em muitos casos, a babesiose torna-se um problema devido às actividades do homem através da cruzamento de características genéticas e/ou transporte de animais para ambientes não familiares, onde a babesiose é endémica (Callow, L.L. e Dalgliesh, R.J., 1982, em: "Immunology of Parasitic Infections", Cohen, S. e Warren, K.S. eds., p. 475-526, Blackwell Scientific). A babesiose também representa uma ameaça como agente zoonótico para humanos, não só para humanos imunocomprometidos (Gray et ai., 2002, Int. J. Med. Microbiol., vol. 291, p. 108-11) .
Os sinais de doença na babesiose adquirida naturalmente começam normalmente 7-21 dias após a infecção. Estes sintomas incluem: febre, anorexia, depressão, anemia, hemoglobinúria e fraqueza de evolução rápida. Normalmente ocorre uma maior lacrimação, salivação e tremor muscular. Podem-se desenvolver 2 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ sinais nervosos em infecções terminais e pode ocorrer a morte quando a doença não é tratada. Os distúrbios de coagulação levam a uma maior adesividade dos eritrócitos. Como resultado, a passagem do sangue através da microvasculatura é dificultada, resultando na congestão de órgãos internos e menores volumes de células empacotadas (PCV). Além disso, a ruptura de eritrócitos infectados provoca a perda de grandes números de eritrócitos. Estes efeitos diminuem o fornecimento de oxigénio a vários tecidos e subsequentemente levam a um dano nos tecidos, como resultado de anóxia.
Foram agora detectadas espécies de Babesiidae que infectam a maioria das espécies de mamifero de importância veterinária (Kuttler, K.L., em M. Ristic ed.: "Babesiosis of domestic animais and man". CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1988): vaca (B. divergens, B. bovis, B. bigemina), porco (B. trautmanni, B. perroncitoi), ovelha (B. ovis, B. motasi), cavalo (B. equi, B. cabal 1i), cão (B. canis, B. rossi, B. vogeli), e gato (B. felis, B. cati) . Em todas estas espécies, a morte ou perdas económicas mais ou menos graves (redução em qualidade ou quantidade de carne, leite, lã, ou descendência), ou redução grave do bem-estar são causadas, quer como resultado da infecção por Babesia directamente, quer por facilitar infecções secundárias.
Os parasitas Theileria são proximamente relacionados com os Babesia. Estes também pertencem ao grupo taxonómico Piroplasmida, e apresentam muitas relações biológicas e epidemiológicas com Babesia. São espécies de Theileria de importância veterinária, bem conhecidas, T. parva, T. annulata, e T. sergenti.
Existem medicamentos para curar uma infecção por Babesia ou Theileria estabelecida, por exemplo cães, cavalos e vacas podem ser tratados com dipropionato de imidocarb. No entanto, esta injecção é dolorosa devido a irritação do tecido. Além disso, sofre das desvantagens comuns a estes antiparasitários: impedir a constituição de uma memória imunológica, toxicidade potencial e possivel estabelecimento de resistência.
Verificou-se que a babesiose e teileriose podem ser controladas por vacinação com vacinas vivas (revisto em: 3 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
Jenkins, Μ. 2001, Vet Parasitol., vol. 101, p. 291-310). Estas vacinas são produzidas recolhendo eritrócitos de animais infectados. Para algumas, mas não todas as espécies de Babesia, foram desenvolvidas culturas de eritrócitos in vitro para aumentar o número de parasitas. Os eritrócitos infectados do animal ou de culturas, também conhecidos como "stabilates" ou amostras de organismos preservados vivos, são então utilizados para vacinar animais.
Os "stabilates" para Theileria são produzidos de um modo semelhante. De facto, devido ao facto de a necessidade de uma vacina eficaz ser tão elevada, produziram-se "stabilates" de Theileria a partir de glândulas salivares de carraças infectadas.
As desvantagens gerais destas vacinas parasitárias vivas são que o material de inoculação é grandemente incontrolado, altamente variável na sua composição, biologicamente inseguro e, no global, o processo é não ético devido à utilização de um grande número de animais experimentais. Adicionalmente, os parasitas Piroplasmida são muito instáveis; têm que ser mantidos longe de oxigénio livre ou morrerão rapidamente.
Alternativamente, não se utilizam os próprios eritrócitos infectados com parasitas para vacinação, mas o soro do hospedeiro infectado, ou o sobrenadante de uma cultura in vitro. Estes líquidos que envolvem eritrócitos infectados contêm os referidos antigénios de parasitas solúveis (SPA). Sabe-se pouco acerca da composição destas preparações. Foi sugerido que a actividade protectora é devida à capacidade de imunização dos antigénios do revestimento da superfície do merozoíto no soro ou no meio, uma estrutura que é deixada para trás no processo de invasão do eritrócito (Ristic, M. e Montenegro-James, S., 1988, em: "Babesiosis of Domestic Animais and Man", Ristic, M. ed., p. 163-190, CRC Press). Além disso, durante a cultura in vitro vários parasitas morrem, sendo assim libertados antigénios parasitários (internos) para o meio de cultura.
Estas preparações de SPA são capazes de induzir uma resposta imunitária que, embora não afecte necessariamente o parasita, reduz de forma suficiente as manifestações clínicas 4 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ da infecção (Schetters e Montenegro-James, S., 1995, Parasitology Today, vol. 11, p. 456-462). Por exemplo, o SPA do sobrenadante de cultura de uma cultura in vitro de eritrócitos infectados com o parasita Babesia canis (Pirodog®) induz imunidade contra uma infecção por desafio homólogo (mas não heterólogo).
Em geral, as vacinas baseadas em SPA têm as mesmas desvantagens que as vacinas de parasitas vivos, na medida em que são essencialmente não caracterizadas, altamente variáveis e requerem muitas precauções para ser biologicamente seguras. Adicionalmente, a produção destas vacinas é muito difícil de escalonar, dado que requer a infecção, agrupamento e recolha de amostras de animais experimentais para se obterem parasitas, eritrócitos e/ou soro. 0 documento publicado como WO 90/11776 descreve proteínas de Babesia bovis, que são expressas na superfície do merozoíto de Babesia bovis. Estas proteínas, que são diferentes das da presente invenção, são descritas para utilização em vacinação e diagnóstico.
Constitui um objecto da invenção proporcionar proteínas e seus fragmentos que podem ser utilizados em vacinas eficazes para a prevenção ou melhoria da infecção com um organismo Piroplasmida, que sejam bem definidas, seguras, estáveis e com uma produção que seja fácil de escalonar.
Verificou-se, surpreendentemente, que uma vacina que compreende uma proteína de Piroplasmida nova incorpora todas estas características vantajosas.
Muitas desvantagens das vacinas vivas de parasita e SPA podem agora ser ultrapassadas utilizando esta proteína de Piroplasmida ou um fragmento imunogénico da referida proteína em vacinas. Esta proteína é altamente definida, biologicamente segura, o produto pode ser muito mais bem estabilizado do que os parasitas vivos totais e a sua produção pode ser facilmente escalonada.
Verificou-se surpreendentemente que os anticorpos produzidos contra as proteínas de Piroplasmida ou fragmentos 5 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ imunogénicos das referidas proteínas, inibiram efectivamente a invasão de parasitas nas células hospedeiras e interferiram, assim, no ciclo de infecção dos parasitas. Deste modo, as proteínas são designadas por: antigénio inibidor de invasão (HA) . 0 processo da invasão por um parasita Piroplasmida da sua célula hospedeira é um dos passos críticos para estabelecer a infecção parasitária. Ao interferir a este nível através da indução de anticorpos que interferem com este passo, a entrada inicial dos parasitas nas células do hospedeiro é inibida. Isto impede, ou pelo menos diminui, o nível de infecção ou os sinais clínicos da doença num hospedeiro e, consequentemente, a gravidade da doença. Além disso, a propagação da doença no meio ambiente é impedida ou diminuída pois menos carraças se tornarão transportadores quando se alimentam de hospedeiros vacinados, pelo que a pressão de infecção no meio ambiente diminui.
Os IIA de Piroplasmida que podem induzir respostas imunitárias protectoras que levam à produção de anticorpos que inibem a invasão por parasitas Piroplasmida podem ser detectados em parasitas Piroplasmida, em cultura de parasitas proliferantes e em células infectadas, por anti-soros específicos. Estes anti-soros específicos reconhecem estes IIA também em transferências de Western 1-D e 2-D (2 dimensões) de lisados de células infectadas, de parasitas, ou das suas culturas.
Os IIA de Piroplasmida podem ser expressos num sistema de expressão. As proteínas, ou seus fragmentos, expressos deste modo, podem ser utilizados para formular uma vacina que protege mamíferos da doença, ou dos seus sinais clínicos por infecção por um organismo Piroplasmida, através da indução de anticorpos específicos ou linfócitos específicos para o antigénio.
Deste modo, a invenção proporciona uma proteína de Piroplasmida caracterizada por a referida proteína compreender uma sequência de aminoácidos com uma semelhança de pelo menos 70%, de preferência 75%, mais preferencialmente 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100% de semelhança, por esta 6 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ ordem de preferência, com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2, ou um fragmento antigénico da referida proteína, contendo um epítopo.
Um exemplo típico da proteína de Piroplasmida é: - HA de Piroplasmida número 1 de Babesia bovis (BIIA1) cuja sequência de aminoácidos é apresentada na SEQ ID NO: 2;
No termo "proteína" pretende-se incluir uma cadeia molecular de aminoácidos. Uma proteína não tem um comprimento, estrutura ou forma específicos e pode, se necessário, ser modificada in vivo ou in vitro, por, e.g. glicosilação, amidação, carboxilação, fosforilação ou alterações na dobragem espacial. Inter alia, incluem-se péptidos, oligopéptidos e polipéptidos na definição de proteína. Uma proteína pode ser de origem biológica e/ou de origem sintética.
Uma "proteína de Piroplasmida" de acordo com a invenção é uma proteína que pode ser obtida a partir de um organismo Piroplasmida.
De preferência, a proteína de Piroplasmida pode ser obtida a partir de um organismo seleccionado do grupo constituído pelas espécies Babesia divergens, B. bovis, B. motasi, B. caballi, B. equi, B. canis, B. rossi, B. vogeli, B. felís, B. cati, B. ovis, B. trautmanni, B. bigemina, B. microti e B. gibsoni.
Mais preferencialmente, a proteína de Piroplasmida pode ser obtida a partir de um organismo seleccionado do grupo constituído pelas espécies Babesia bovis, B. caballi, B. equi, B. canis, B. rossi e B. bigemina.
Muito preferencialmente, a proteína de Piroplasmida pode ser obtida a partir de Babesia bovis.
Em relação à classificação taxonómica actual, o perito na arte entenderá que esta pode variar ao longo do tempo, à medida que novas perspectivas levam à reclassificação em novos, ou outros grupos taxonómicos. No entanto, uma vez que isto não altera o repertório de proteínas do organismo 7 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ envolvido, apenas a sua classificação, considera-se que estes organismos reclassifiçados estão no âmbito da invenção. Isto é especialmente relevante para famílias proximamente relacionadas, como Babesiidae e Theileriidae. Por exemplo: a Babesia equi foi recentemente classificada como Theileria equi.
De modo a ser antigénico, um fragmento de uma proteína tem que ter um determinado comprimento; fragmentos demasiado pequenos não serão processados pelas células que apresentam antigénio em fragmentos que são capazes como tal de se associar com moléculas do MHC, associação essa que é necessária para uma apresentação adequada do antigénio aos linfócitos. Para um receptor do MHC I, a ligação de um fragmento de antigénio que inclui o epítopo consiste em pelo menos 8-11 aminoácidos e para um receptor do MHC II a ligação de pelo menos 11-15 aminoácidos (revisto e.g. por R.N. Germain & D.H. Margulies, 1993, Annu. Rev. Immunol., vol. 11, p. 403-450, em: "The biochemistry and cell biology of antigen Processing and presentation"). Os fragmentos de proteínas mais curtos do que isto poderão não ser antigénicos como tal: têm que ser acoplados a um transportador, tal como KLH, BSA ou semelhante, utilizando técnicas conhecidas na arte. Quando acoplados, estes fragmentos curtos podem ser capazes de induzir uma resposta imunitária que está no âmbito da invenção.
Na invenção, um "epítopo" é a parte de uma molécula antigénica que reage com o receptor do antigénio de um linfócito T e/ou B. Um epítopo de acordo com a invenção irá, portanto, induzir e/ou activar células T e/ou B específicas, de modo que estas células irão originar uma reacção imunitária que interfere com a progressão de uma infecção ou doença. Deste modo, através destes epítopos, uma proteína pode induzir anticorpos e/ou produzir uma resposta imunitária.
Entende-se que um fragmento "imunogénico" é um fragmento antigénico contendo um epítopo de uma proteína de Piroplasmida que tem a capacidade de induzir respostas imunitárias dirigidas contra estas proteínas de Piroplasmida, com a condição de estes anticorpos serem capazes de interferir com o 8 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ processo de invasão. Será explicado a seguir o modo como estes fragmentos imunogénicos podem ser encontrados.
Um fragmento imunogénico de uma proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção compreende pelo menos 10 aminoácidos recolhidos da sequência de aminoácidos de uma proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção.
De preferência, um fragmento deste tipo compreende 12, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, ou 300 aminoácidos, por essa ordem de preferência, retirados da sequência de aminoácidos de uma proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção.
Por exemplo, um fragmento imunogénico de uma proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção é formado por uma parte da proteína que não possui a sequência de sinal N-terminal e/ou a sequência de sinal C-terminal. Outros fragmentos são, por exemplo, os que compreendem um epítopo específico de uma proteína de Piroplasmida IIA. Estes epítopos podem ser determinados pelos métodos a seguir descritos. Todos os fragmentos imunogénicos estão no âmbito da invenção. A identificação de fragmentos imunogénicos e/ou epítopos de uma proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção pode ser facilmente realizada por uma variedade de técnicas lineares, por exemplo, pelo designado método PEPSCAN, ou por algoritmos de computador que fazem comparações com fragmentos e/ou epítopos conhecidos. O método PEPSCAN (WO 84/03564, e WO 86/06487, e H. Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1984, vol. 81, p. 3998-4002, e J. of Immunol. Meth. 1987, vol. 102, p. 259-274), é um método fácil de realizar, rápido e bem estabelecido, para a detecção de determinantes imunológicos de uma proteína. Compreende a síntese de uma série de fragmentos peptídicos que se sobrepõem progressivamente a proteína em estudo e o teste subsequente destes polipéptidos com anticorpos específicos para a proteína, para identificar quais destes são capazes de se ligar ao receptor do antigénio de linfócitos T e/ou B. Estes anticorpos contra as proteínas de acordo com a invenção 9 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ podem ser obtidos produzindo anticorpos monoclonais ou policlonais, utilizando técnicas bem conhecidas na arte. A utilização de algoritmos de computador para designar quais os fragmentos de proteina específicos que são os epítopos imunologicamente importantes com base na sua concordância de sequência e/ou estrutura com epítopos que são conhecidos, também é uma técnica bem conhecida. A determinação destas regiões pode basear-se numa combinação dos critérios de hidrofilicidade de acordo com Hopp e Woods (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1981, vol. 78, p. 3824-3828), e os aspectos da estrutura secundária de acordo com Chou e Fasman (Advances in Enzymology 1987, vol. 47, p. 45-148, e patente US 4554101). Os epítopos imunogénicos podem igualmente ser previstos por computador a partir da sequência de aminoácidos da proteína, com o auxílio dos critérios de anfifilicidade de Berzofsky (Science 1987, vol. 235, p. 1059-1062 e pedido de patente US NTIS US 07/005,885). Uma revisão condensada sobre a utilização destes métodos pode ser encontrada em Shan Lu (princípios comuns: Tibtech 1991, vol. 9, p. 238-242), Lu (revisão: Vaccine 1992, vol. 10, p. 3-7), e Berzofsky (epítopos de VIH; 1991, The FASEB Journal, vol. 5, p. 2412-2418).
Uma ilustração da eficácia de se utilizarem estes métodos foi publicada por H. Margalit et al. (J. of Immunol. 1987, vol. 138, p. 2213-2229) que descreve taxas de sucesso de 75% na previsão de epítopos de células T utilizando estes métodos. Outra prova é a previsão bem sucedida de 3 péptidos antigénicos de BIIA1, como descrito no Exemplo 1, secção 1.1.5.
Subsequentemente, terá que se determinar se um epítopo encontrado utilizando os métodos descritos acima é, de facto, capaz de interferir com o processo de invasão. Isto pode, no entanto, ser feito de forma muito rápida e fácil numa simples experiência de invasão in vitro. Esta experiência está descrita no Exemplo 1.1.11. A percentagem de semelhança de uma sequência de aminoácidos com uma proteína de acordo com a invenção deve ser determinada pelo alinhamento de aminoácidos com a sequência de 10 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ aminoácidos de comprimento total de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 ou 10. A percentagem de semelhança com uma proteína de acordo com a invenção deve ser determinada com o programa de computador "BLAST 2 SEQUENCES" seleccionando o subprograma: "BlastP" (T. Tatusova & T. Madden, 1999, FEMS Microbiol. Letters, vol. 174, p. 247-250), que pode ser encontrado em www.ncbi.nlm.nih.goviblast/bl2seq/bl2.htmi. A matriz de comparação que é utilizada é: "Blosum62", com os parâmetros por defeito: penalidade de intervalo aberto: 11; penalidade de intervalo de extensão: 1; e intervalo x_dropoff: 50.
Este programa lista a percentagem de aminoácidos que são idênticos como "identidades" ("Identities"), e a percentagem de aminoácidos que são semelhantes como "positivos" ("Positives"). Aminoácidos "semelhantes" ("Similar") são os aminoácidos que são idênticos mais os que são equivalentes; aminoácidos "equivalentes" são descritos a seguir.
Deve entender-se que, para uma proteina de Piroplasmida particular existem variações naturais entre as proteínas associadas com estirpes ou espécies individuais de Piroplasmida. Estas variações podem ser demonstradas por (uma) diferença(s) de aminoácido na sequência global, ou por eliminações, substituições, inserções, inversões ou adições de (um) aminoácido(s) na referida sequência. Foram descritas substituições de aminoácidos que não alteram essencialmente as actividades biológicas e imunológicas, e.g. por Neurath et al. (1979, em: "The Proteins", Academic Press New York) . As substituições de aminoácidos entre aminoácidos relacionados ou substituições que ocorreram frequentemente na evolução são, i.a. Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val (ver Dayhof, M.D., 1978, "Atlas of protein sequence and structure". Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C. vol. 5, suppl. 3). Outras substituições de aminoácidos comuns incluem Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Ile, Leu/Val e Ala/Glu. Estes aminoácidos relacionados e substituídos de forma comum são designados por "equivalentes". Com base nesta informação, Lipman e Pearson desenvolveram um método para uma comparação rápida e sensível de proteínas (Science 1985, vol. 227, p. 1435-1441) e para determinar a 11 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ semelhança funcional entre proteínas. Estas substituições de aminoácidos de exemplos de concretizações da invenção, bem como variações com eliminações e/ou inserções, estão no âmbito da invenção, desde que as proteínas resultantes retenham a capacidade de induzir respostas imunitárias que inibem a proliferação de parasitas Piroplasmida, por exemplo, anticorpos que inibem a invasão por parasitas Piroplasmida. Estas variações na sequência de aminoácidos de uma determinada proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção são consideradas como "homólogos biológicos ou funcionais" e estão todas no âmbito da invenção.
Isto explica porque uma proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção, quando isolada a partir de espécies de Piroplasmida diferentes, pode ter uma semelhança de até 70% com, por exemplo, as sequências de aminoácido apresentadas na SEQ ID NO:2, continuando a representar a mesma proteína com as mesmas características no exemplo apresentado: ser capaz de induzir anticorpos que inibem a invasão de parasitas de Piroplasmida.
Quando se comparam proteínas de Piroplasmida de acordo com a invenção entre elas, as proteínas de Piroplasmida de acordo com a invenção obtidas de diferentes organismos de Piroplasmida têm tipicamente mais de 50% de semelhança de aminoácidos; quando obtidas de diferentes espécies de Babesia, estas proteínas têm tipicamente mais de 85% de semelhança de aminoácidos e quando obtidas a partir de isolados diferentes de B. bovis, estas proteínas têm tipicamente mais de 95% de semelhança de aminoácidos. A forma preferida para produzir as proteínas de Piroplasmida de acordo com a invenção é utilizar técnicas de engenharia genética e sistemas de expressão recombinantes. Estes podem compreender utilizar ácidos nucleicos, fragmentos de ADNc, moléculas de ADN recombinantes, transportadores recombinantes vivos e/ou células hospedeiras.
Deste modo, outro aspecto da invenção refere-se a um ácido nucleico, caracterizado por o referido ácido nucleico codificar para uma proteína de Piroplasmida de acordo com a 12 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ invenção, ou um fragmento antigénico contendo o epítopo da referida proteína.
Numa concretização, o ácido nucleico de acordo com a invenção compreende a sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO:1. 0 termo "ácido nucleico" incorpora uma cadeia molecular de ácidos desoxirribonucleicos ou ribonucleicos. Um ácido nucleico não tem um comprimento específico, pelo que polinucleótidos, genes, quadros de leitura aberta (ORF), sondas, iniciadores, ligantes, espaçadores e adaptadores que consistem em ADN e/ou ARN, estão incluídos na definição de ácido nucleico. Um ácido nucleico pode ser de origem biológica e/ou sintética. 0 ácido nucleico pode ser na forma de cadeia simples ou dupla. A cadeia simples pode ser na orientação directa ou inversa. Também se incluem na definição ARN ou ADN modificados. Podem-se fazer modificações nas bases do ácido nucleico e podem-se incorporar bases, como inosina. Outras modificações podem envolver, por exemplo, modificações do esqueleto. 0 termo "codifica" incorpora: proporcionar a possibilidade de expressão da proteína, í.a. através da transcrição e/ou tradução quando no contexto correcto.
Um ácido nucleico de acordo com a invenção codifica para uma proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção ou codifica para um fragmento imunogénico da referida proteína.
Um ácido nucleico de acordo com a invenção tem um comprimento mínimo de 30 nucleótidos. De preferência, um ácido nucleico de acordo com a invenção compreende 40, 50, 100, 250, 500, 1000, ou 1500 nucleótidos, por essa ordem de preferência.
Um ácido nucleico de acordo com a invenção, por exemplo, é um ácido nucleico que codifica para uma proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção, que não possui a sequência de sinal N-terminal e/ou a sequência C-terminal. Outros ácidos nucleicos podem compreender uma sequência que codifica para um epítopo específico de uma proteína de 13 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
Piroplâsmidâ. Estes ácidos nucleicos estão no âmbito da invenção.
Excluem-se dos ácidos nucleicos de acordo com a invenção as seguintes sequências: • Em relação a BIIAl (SEQ ID N0:1), as sequências EST: o B_bovis-lle05.plc o B_bovis-344e09.qlc o B_bovis-384f06.qlc o B_bovis-261d05.qlc o B_bovis-5e5.plc o B_bovis-373g01.qlc o B_bovis-418b06.qlc o B_bovis-375d02.qlc o B_bovis-407d03.qlc o B_bovis-284-f07.qlc • Em relação a BIIAl (SEQ ID NO:l), os "contig" montados: o Bbovis.CONTIG.1029 O Bbovis.CONTIG.227
As sequências EST e "contig" referentes a BIIAl estão disponíveis na página da Internet: www.sanqer.ac.uk/proiects/b bovis/. A percentagem de identidade entre ácidos nucleicos de acordo com a invenção é determinada com o programa de computador "BLAST 2 SEQUENCES" seleccionando o subprograma: "BlastN" (T. Tatusova & T. Madden, 1999, FEMS Microbiol. Letters, vol. 174, p. 247-250), que pode ser encontrado em www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html. Os parâmetros utilizados são os parâmetros por defeito: recompensa para uma correspondência: +1; penalidade para uma não correspondência: -2; penalidade de intervalo aberto: 5; penalidade de intervalo de extensão: 2; e intervalo x_dropoff: 50. Ao contrário do resultado do programa BlastP descrito acima, o programa BlastN não enumera semelhanças, apenas identidades: a percentagem de nucleótidos que são idênticos como "identidades" ("Identities") . É bem conhecido na arte que muitos ácidos nucleicos diferentes podem codificar para uma e a mesma proteína. Isto é o resultado do que é conhecido em biologia molecular como 14 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ "redundância" ("wobble"), ou "degenerescência do código genético", em que vários codões ou tripletos de ARNm irão fazer com que o mesmo aminoácido se ligue à cadeia de aminoácidos que cresce no ribossoma durante a tradução. É particularmente prevalecente na segunda e, em especial, na terceira base de cada tripleto que codifica para um aminoácido. Este fenómeno pode resultar num carácter heterólogo de cerca de 30% para dois ácidos nucleicos diferentes que ainda codificam para a mesma proteina. Deste modo, dois ácidos nucleicos que têm uma identidade de sequência de nucleótidos de cerca de 70% podem ainda codificar para a mesma proteina.
Outra abordagem para decidir se uma determinada sequência de ácido nucleico é ou não uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção refere-se à questão de saber se essa sequência de ácido nucleico híbrida sob condições rigorosas com as sequências de ácido nucleico apresentadas na SEQ ID NO: 1.
Se uma sequência de ácido nucleico híbrida sob condições rigorosas com a sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO:l, é considerada uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção. A definição de condições rigorosas provém da fórmula para a temperatura de fusão Tf de Meinkoth e Wahl (1984, Anal. Biochem., vol. 138, p. 267-284):
Dn = [81,5-C + 16,6(log M) + 0,41(%GC) - 0,61(% de formamida) - 500/L] - l^C/1% não correspondência
Nesta fórmula, M é molaridade de catiões monovalentes; %GC é a percentagem de nucleótidos de guanosina e citosina no ADN; L é o comprimento do híbrido em pares de bases; e não correspondência é a ausência de uma correspondência idêntica.
Condições rigorosas são as condições nas quais as sequências de ácido nucleico ou seus fragmentos ainda hibridam, se tiverem uma não correspondência de 30% (í.e. se apenas são 70% idênticas) à sequência de ácido nucleico, como apresentado na SEQ ID NO:l. 15 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
Os ácidos nucleicos que codificam para as proteínas de Piroplasmida de acordo com a invenção podem ser obtidos a partir de espécies membros de Piroplasmida.
No entanto, numa concretização mais preferida, o ácido nucleico que codifica para uma proteína de Piroplasmida ou os fragmentos imunogénicos da referida proteína de acordo com a invenção são caracterizados por poderem ser obtidos a partir de um organismo seleccionado do grupo que consiste nas espécies Babesia divergens, B. bovis, B. motasi, B. caballi, B. equi, B. canis, B. rossi, B. vogeli, B. felis, B. cati, B. ovis, B. trautmanni, B. bigemina, B. microti e B. gibsoni.
Mais preferencialmente, os ácidos nucleicos podem ser obtidos de um organismo seleccionado do grupo que consiste nas espécies Babesia bovis, B. caballi, B. equi, B. canis, B. rossi e B. bigemina. A possibilidade da espécie ser taxonomicamente reclassifiçada ou descrita como espécie nova, foi discutida acima. Dado que isso não altera o genoma do organismo, estes organismos reclassifiçados também estão no âmbito da invenção.
Também está no âmbito da invenção as proteínas de
Piroplasmida, fragmentos imunogénicos das referidas proteínas e ácidos nucleicos que codificam para estas proteínas de Piroplasmida ou seus fragmentos, de Piroplasmida que não de mamíferos, devido a uma conservação elevada dos genes e proteínas da proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção. Estas proteínas relacionadas, ou os seus genes, podem ser designados por parálogos ou ortólogos.
Os ácidos nucleicos que codificam para uma proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção podem ser obtidos e expressos por técnicas de biologia molecular que são bem conhecidas do perito na arte e estão explicadas em detalhe em livros de texto convencionais, como Sambrook & Russell: "Molecular cloning: a laboratory manual" (2001, Cold Spring Harbour Laboratory Press; ISBN: 0879695773). Um destes tipos de manipulação é a síntese de um fragmento de ADNc a partir de ARN, de preferência a partir de ARNm, que pode ser isolado a 16 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ partir de parasitas, ou células ou organismos infectados com parasitas, por técnicas conhecidas na arte.
Deste modo, noutro aspecto, a invenção refere-se a um fragmento de ADNc de acordo com a invenção. O método preferido para obter um fragmento de ADNc por transcrição inversa é através de uma técnica de reacção em cadeia com polimerase (PCR). As técnicas e protocolos
convencionais para realizar PCR estão extensivamente descritos, por exemplo, em C. Dieffenbach & G. Dveksler: "PCR primers: a laboratory manual" (1995, CSHL Press, ISBN 879694473).
Numa concretização preferida, a invenção refere-se a uma molécula de ADN recombinante compreendendo um ácido nucleico de acordo com a invenção, estando o referido ácido nucleico ou referido fragmento de ADNc sob o controlo de um promotor ligado funcionalmente.
Para construir uma molécula de ADN recombinante de acordo com a invenção, utilizam-se de preferência plasmideos de ADN. Estes plasmideos são úteis, e.g. para melhorar a quantidade de inserção de ADN, como uma sonda, e como uma ferramenta para posterior manipulação. Exemplos destes plasmideo para clonagem são plasmideos da série pBR, pUC, e pGEM; todos estes estão disponíveis de vários fornecedores comerciais. 0 ácido nucleico que codifica para uma proteina de Piroplasmida de acordo com a invenção, ou um fragmento imunogénico da referida proteina, pode ser clonado em plasmideos separados e ser modificado para se obter a conformação desejada, utilizando técnicas bem conhecidas na arte. No entanto, ele pode também ser combinado numa construção para uma clonagem melhorada, ou para fins de expressão.
As modificações de sequências codificantes que codificam para uma proteina de Piroplasmida de acordo com a invenção ou um seu fragmento imunogénico podem ser realizadas, e.g. utilizando digestão com enzimas de restrição, por mutações 17 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ dirigidas, ou por técnicas de reacção em cadeia com polimerase (PCR).
Para os fins de purificação, ou detecção de proteína, ou melhoria do nível de expressão, podem-se adicionar outros ácidos nucleicos. Isto pode ter como resultado que o ácido nucleico final compreendido no fragmento de ADNc, ou na molécula de ADN recombinante é maior do que as sequências necessária para codificar para uma proteína de Piroplasmida. Quando estes elementos adicionais são inseridos em fase de leitura, eles tornam-se uma parte integral da proteína de Piroplasmida que é expressa. Estas proteínas fundidas também estão no âmbito da invenção. Um requisito essencial para a expressão de um ácido nucleico, fragmento de ADNc, ou molécula de ADN recombinante é que estes podem ser operativamente ligados a uma sequência reguladora da transcrição, de modo que é capaz de controlar a transcrição do ácido nucleico, ADNc, ou ADN recombinante. As sequências reguladoras da transcrição são bem conhecidas na arte e compreendem i.a. promotores e potenciadores. É óbvio para os peritos na arte que a escolha de um promotor se estende a qualquer promotor eucariótico, procariótico ou virai capaz de dirigir a transcrição de genes, desde que o promotor seja funcional no sistema de expressão utilizado.
Numa concretização mais preferida, a invenção refere-se a um microorganismo transportador recombinante que compreende um ácido nucleico de acordo com a invenção, estando o referido ácido nucleico ou o referido fragmento de ADNc sob o controlo de um promotor ligado funcionalmente, ou uma molécula de ADN recombinante de acordo com a invenção.
Estes transportadores recombinantes vivos (LRC, do inglês " live recombinant carriers") são e.g. microorganismos, tais como bactérias, parasitas e vírus nos quais foi clonada informação genética adicional, neste caso um ácido nucleico, um ADNc, ou uma molécula de ADN recombinante que codifica para uma proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção, ou um seu fragmento imunogénico. Os mamíferos alvo inoculados com estes LRC irão produzir uma resposta imunogénica, não só contra os imunogénios do transportador, mas também contra a(s) proteínas heterólogas ou fragmento(s) imunogénicos para os 18 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ quais ο código genético é adicionalmente clonado no LRC, e.g. uma sequência que codifica para uma proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção, ou um seu fragmento imunogénico.
Como exemplo de LRC bacterianos, podem-se utilizar as estirpes de Salmonella atenuadas conhecidas na arte.
Alternativamente, foram descritos parasitas transportadores, recombinantes, vivos, i.a. por vermeulen, A. N. (Int. Journ. Parasitol. 1998, vol. 28, p. 1121-1130).
Os virus LRC podem ser utilizados como um modo de transportar um ácido nucleico para uma célula alvo. Os virus transportadores recombinantes também são designados por virus vectores. Os virus frequentemente utilizados são os virus vacínia (Panicali et al. 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, vol. 79, p. 4927), virus de herpes (ΕΡ 0473210-A2), e Retrovirus (Valerio, D. et al. 1989, em: Baum, S.J., Dicke, K.A., Lotzova, E. e Pluznik, D.H. (Eds.), "Experimental
Haematology today", Springer Verlag, Nova Iorque: pp. 92-99).
Pode-se utilizar a técnica de recombinação homóloga in vivo, bem conhecida na arte, para introduzir um ácido nucleico recombinante de acordo com a invenção no genoma de uma bactéria LRC, parasita ou virus de escolha, capaz de induzir a expressão do ácido nucleico de interesse, ADNc ou ADN recombinante de acordo com a invenção, no animal hospedeiro.
Os sistemas de expressão de bactérias, leveduras, fungos, insectos e células de vertebrados são utilizados muito frequentemente como células hospedeiras para fins de expressão. Estes sistemas de expressão são bem conhecidos na arte e estão geralmente disponíveis, e.g. comercialmente, através da Invitrogen (Holanda).
Deste modo, numa concretização ainda mais preferida, a invenção refere-se a uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico de acordo com a invenção, um fragmento de ADNc de acordo com a invenção, estando o referido ácido nucleico ou o referido fragmento de ácido nucleico sob o controlo de um promotor ligado funcionalmente, uma molécula de ADN 19 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ recombinante de acordo com a invenção, ou um microorganismo transportador recombinante, vivo, de acordo com a invenção.
Uma célula hospedeira para ser utilizada para expressão de uma proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção pode ser uma célula de origem bacteriana, e.g. de Escherichía coli, Bacillus subtilis, Lactobacillus sp. ou Caulobacter crescentus, em combinação com a utilização de plasmídeos derivados de bactérias ou bacteriófagos para expressar a sequência que codifica para uma proteína de Piroplasmida. A célula hospedeira pode também ser de origem eucariótica, e.g. células de levedura em combinação com moléculas vectores específicas de levedura, ou células de eucariotas superiores, como células de insecto (Luckow et ai., 1988, Bio-technology, vol. 6, p. 47-55) em combinação com vectores ou baculovírus recombinantes; células de planta em combinação com e.g. vectores baseados em plasmídeo Ti ou vectores virais de plantas (Barton, K.A. et ai., 1983, Cell, vol. 32, p. 1033); ou células de mamífero como células Hela, células de ovário de hamster chinês ou células de rim de felino Crandell-Rees, também com vectores adequados ou vírus recombinantes.
Em comparação com estes sistemas de expressão, as células de planta ou sistemas de expressão baseados em parasitas são sistemas de expressão com interesse. Os sistemas de expressão de parasitas estão descritos e.g. no pedido de patente francesa, publicação número 2 714 074, e na publicação US NTIS n.° US 08/043109 (Hoffman, S. & Rogers, W., 1993). Os sistemas de expressão de células de plantas para polipéptidos para aplicação biológica são e.g. discutidos em R. Fischer et al. (Eur. J. of Biochem. 1999, vol. 262, p. 810-816), e J. Larrick et al. (Biomol. Engin. 2001, vol. 18, p. 87-94). A expressão também pode ser realizada nos designados sistemas de expressão isentos de células. Estes sistemas compreendem todos os factores essenciais para a expressão de um ácido nucleico recombinante adequado, ligado operativamente a um promotor que irá funcionar nesse sistema particular. Exemplos são os sistemas de lisado de E. coli (Roche, Basel, Suíça), ou o sistema de lisado de reticulócitos de coelho (Promega corp., Madison, EUA). 20 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ A proteína de Píroplasmida de acordo com a invenção ou fragmentos imunogénicos da referida proteína são bastante adequados para a produção de uma vacina. Estas proteínas ou fragmentos podem ser obtidos a partir de parasitas, ou de animais ou células infectadas com parasitas de Píroplasmida. No entanto, é muito mais conveniente a utilização de ácidos nucleicos que codificam para a proteína de Píroplasmida de acordo com a invenção, ou um fragmento imunogénico da referida proteína, num sistema de expressão, isto é seguido de recolha das proteínas ou fragmentos produzidos e formulando os mesmos numa vacina de subunidade de proteína, e.g. misturando uma proteína de Píroplasmida de acordo com a invenção, ou um fragmento imunogénico da referida proteína, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
Deste modo, ainda outro aspecto da invenção refere-se a uma vacina que compreende uma proteína de acordo com a invenção, ou um fragmento antigénico da referida proteína, contendo um epítopo, um ácido nucleico, um fragmento de ADNc, uma molécula de ADN recombinante, um microorganismo transportador recombinante, vivo, ou uma célula hospedeira de acordo com a invenção, ou uma sua combinação e um transportador farmaceuticamente aceitável.
Como descrito acima, uma proteína de Píroplasmida, ou um fragmento imunogénico da referida proteína pode ser utilizado, com vantagem, para vacinação. É utilizado quer para interferir com a proliferação de parasitas de Píroplasmida {e.g. inibição da invasão de células hospedeiras), ou irá induzir respostas imunitárias protectoras (e.g. anticorpos específicos ou linfócitos activados) que interferem com a proliferação de parasitas, ou os sinais clínicos que estes produzem.
Se estas proteínas ou fragmentos não produzem a resposta desejada por si só, elas podem ser acopladas a um transportador, tal como KLH, BSA ou semelhantes, utilizando técnicas conhecidas na arte. O acoplamento da proteína ou seus fragmentos também pode ser feito para aumentar ou modificar a resposta imunitária induzida. Por exemplo, é prática comum acoplar (fragmentos de)proteínas ao toxóide do tétano para aumentar a resposta de 21 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ células Τ. Também se podem adicionar moléculas efectoras específicas tais como uma toxina, para melhorar a morte das células alvo.
Estes acoplamentos podem ser realizados - quimicamente, por acoplamento, conjugação ou reticulação, através da desidratação, esterificação, etc., das sequências de aminoácidos, quer directamente, quer através de uma estrutura intermédia; - fisicamente, acoplando através da captura na, ou sobre a estrutura macromolecular, ou, de preferência; - por fusão biológica molecular, através da combinação de moléculas de ácido nucleico recombinantes que compreendem fragmentos de ácido nucleico capazes de codificar cada um dos dois, tal que no final se produz um único produto de expressão contínuo. Estas técnicas de manipulação molecular são preferidas.
Um modo de vacinação alternativa e eficaz é a vacinação directa com ADN que codifica para o antigénio ou epítopo relevante. A vacinação directa com proteínas que codificam para ADN tem sido bem sucedida para muitas proteínas diferentes, como revisto em e.g. Donnelly et al. (The Immunologist 1993, vol. 2, p. 20-26). Por exemplo, no campo de vacinas antiparasitárias, obteve-se protecção contra e.g. Plasmodium yoelii com vacinação de ADN com o gene de circunsporozoíto de P. yoelii (Hoffman, S. et al. 1994, Vaccine, vol. 12, p. 1529-1533), e obteve-se protecção contra Leishmania major com vacinação de ADN com o gene gp63 de glicoproteína de superfície de L. major (Xu & Liew 1994, Vaccine, vol. 12, p. 1534-1536).
Esta vacinação com ADN pode ser realizada com um ácido nucleico, um fragmento de ADNc, ou de preferência com uma molécula de ADN recombinante de acordo com a invenção.
Deste modo, uma concretização preferida refere-se a uma vacina de acordo com a invenção, caracterizada por compreender um ácido nucleico, um fragmento de ADNc, ou uma molécula de ADN recombinante de acordo com a invenção. 22 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
Alternativamente, uma vacina de acordo com a invenção pode compreender transportadores recombinantes vivos, como descrito acima, capazes de expressar a proteína de
Piroplasmida de acordo com a invenção, ou fragmentos imunogénicos da referida proteína. Estas vacinas, e.g. baseadas numa bactéria, um transportador parasitário ou virai, ou vector, têm a vantagem em relação às vacinas de subunidade de mimetizar melhor o modo de infecção natural por
Piroplasmida. Além disso, a apresentação dos antigénios por células infectadas com os transportadores assemelha-se à via pela qual uma proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção, ou fragmentos imunogénicos da referida proteína são apresentados ao sistema imunitário numa infecção natural. Além disso, a sua auto-propagação é uma vantagem, uma vez que apenas são necessárias pequenas quantidades do transportador recombinante para imunização.
Deste modo, outra concretização preferida refere-se a uma vacina de acordo com a invenção, que compreende um microorganismo transportador recombinante e um transportador farmaceuticamente aceitável.
As células hospedeiras como descrito acima podem ser utilizadas para expressar uma proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção, ou um fragmento imunogénico da referida proteína como um sistema de expressão. Após expressão, o produto proteico pode ser recolhido, mas alternativamente o meio de cultura ou as células hospedeiras completas podem ser utilizadas numa vacina. Isto tem o beneficio de omitir os passos de purificação, mas requer obviamente alguma tolerância por parte dos mamíferos alvo para os componentes do meio e/ou componentes das células de hospedeiro.
Também está no âmbito da invenção uma vacina de acordo com a invenção que compreende uma combinação de dois ou mais tipos de moléculas da proteina de Piroplasmida de acordo com a invenção, ou um fragmento imunogénico da referida proteína, ou um ácido nucleico, ADNc, molécula recombinante, transportador recombinante vivo, ou células hospedeiras de acordo com a invenção. Para estas vacinas de acordo com a invenção, os componentes podem ser combinados numa única dose ou em doses 23 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ separadas e estes podem ser dados ao mesmo tempo, ou sequencialmente.
Por exemplo, pode-se utilizar, com vantagem, uma combinação de vacinação de uma imunização inicial com um plasmideo de ADN recombinante que transporta a sequência codificante de uma proteína de Piroplasmida, seguido algum tempo depois de uma vacinação de reforço com uma proteína de Piroplasmida.
As vacinas de acordo com a invenção podem ser administradas em quantidades que contêm entre 0,1 e 1000 yg de uma proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção, ou um fragmento imunogénico da referida proteína, por mamífero alvo. Podem-se utilizar, em princípio, doses menores ou maiores; de preferência, utiliza-se uma dose entre 50 e 200 yg de uma proteína de Piroplasmida, ou um seu fragmento imunogénico.
Para vacinas de vector virai vivas a taxa de dose por animal pode variar entre 1 a 1010 pfu, de preferência utiliza-se 10 - 105 pfu.
Entende-se que um transportador farmaceuticamente aceitável é um composto que não afecta de forma adversa a saúde do animal a ser vacinado, pelo menos não na medida em que o efeito adverso é pior do que os efeitos observados quando o animal não é vacinado. Um transportador farmaceuticamente aceitável pode ser, e.g. água estéril ou solução salina fisiológica, estéril. Numa forma mais complexa, o transportador pode e.g. ser um tampão.
Muitas vezes, uma vacina é misturada com estabilizantes, e.g. para proteger componentes propensos a degradação contra a degradação, para aumentar o tempo de vida em armazenamento da vacina, ou para melhorar a eficiência da liofilização. São estabilizantes úteis, í.a. SPGA (Bovarnik et al. 1950, J.
Bacteriology, vol. 59, p. 509), leite em pó desnatado, gelatina, albumina de soro bovino, hidratos de carbono, e.g. sorbitol, manitol, trealose, amido, sacarose, dextrano ou glucose, proteínas, tais como albumina ou caseína, ou seus produtos de degradação, e tampões, tais como fosfatos de metais alcalinos. 24 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ A vacina de acordo com a invenção pode compreender adicionalmente um designado "veiculo". Um veiculo é um composto ao qual as proteínas, fragmentos de proteína, ácidos nucleicos ou suas partes, ADNc, moléculas recombinantes, transportadores recombinantes vivos e/ou células hospedeiras de acordo com a invenção aderem, sem estar covalentemente ligados. Estes veículos são i.a. bio-microcápsulas, micro-alginatos, lipossomas, macrossóis, hidróxido, fosfato, sulfato ou óxido de alumínio, sílica, Kaolin®, e Bentonite®, sendo todos conhecidos na arte.
Um exemplo é um veículo em que o antigénio está parcialmente embebido num complexo imuno-estimulador, o designado ISCOM® (EP 109.942, EP 180.564, EP 242.380).
Adicionalmente, a vacina de acordo com a invenção pode compreender um ou mais compostos tensioactivos, ou emulsionantes adequados, e.g. Span® ou Tween®.
Os indivíduos alvo para a vacina de acordo com a invenção são de preferência mamíferos, e.g. humanos ou animais mamíferos de importância veterinária. O alvo pode ser saudável ou doente e pode ser seropositivo ou seronegativo para parasitas Piroplasmida ou para anticorpos contra parasitas Piroplasmida. O indivíduo alvo pode ser de qualquer idade à qual seja susceptível à vacinação.
Os mamíferos alvo mais preferidos para a vacina de acordo com a invenção são bovinos, equinos, caninos e felinos. A vacina de acordo com a invenção pode igualmente ser utilizada como tratamento profiláctico e terapêutico e interfere com o estabelecimento e/ou com a progressão de uma infecção, ou os seus sintomas clínicos de doença.
Assim, um aspecto da invenção refere-se à utilização de uma sequência de ácido nucleico de acordo com a invenção, um fragmento de ADNc de acordo com a invenção, uma molécula de ADN recombinante de acordo com a invenção, um microorganismo transportador recombinante, vivo, de acordo com a invenção, ou uma célula hospedeira de acordo com a invenção, para o fabrico 25 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ de uma vacina para o tratamento profiláctico ou terapêutico de uma infecção, ou dos seus sinais clínicos causados por um organismo Piroplasmida.
Uma vacina de acordo com a invenção previne ou reduz a propagação da infecção por Piroplasmida na população ou no meio ambiente. A vacina de acordo com a invenção pode ser de várias formas, e.gum liquido, um gel, um unguento, um pó, um comprimido, ou uma cápsula, dependendo do método desejado de aplicação ao alvo.
De preferência, a vacina é na forma de um liquido injectável. A vacina de acordo com a invenção pode ser administrada ao alvo mamífero de acordo com métodos conhecidos na arte. Por exemplo, por aplicação parentérica, tal como através de qualquer via de injecção, na ou através da pele: e.g. intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, intradérmica, submucosa ou subcutânea. As vias de aplicação alternativas que são aplicáveis são a aplicação tópica como gotas, pulverização, gel ou unguento no epitélio da mucosa do olho, nariz, boca, ânus ou vagina, ou na epiderme da pele exterior, em qualquer parte do corpo; por pulverização, como aerossol, ou pó. Alternativamente, a aplicação pode ser pela via alimentar, combinando com os alimentos, ração, ou água de beber e.g. como um pó, um líquido, ou comprimido, ou por administração directamente na boca como um líquido, um gel, um comprimido ou uma cápsula, ou no ânus, como um supositório. A via de aplicação preferida é por injecção intramuscular ou subcutânea. Como é óbvio, a via de aplicação óptima dependerá de particularidades específicas da infecção parasitária ou doença clínica que se pretende prevenir ou melhorar, das características da formulação de vacina que é utilizada e de características particulares da espécie alvo. 0 esquema de aplicação da vacina de acordo com a invenção ao mamífero alvo pode ser em doses simples ou múltiplas, que podem ser dadas ao mesmo tempo, ou sequencialmente, de um modo 26 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ compatível com a dosagem e formulação e numa quantidade que seja imunologicamente eficaz.
As vacinas da invenção são aplicadas, com vantagem, numa única dose anual.
Numa concretização preferida, a vacina de acordo com a invenção caracteriza-se por compreender um adjuvante.
Um adjuvante em geral é uma substância que reforça a resposta imunitária do alvo, de um modo não específico. São conhecidos na arte muitos adjuvantes diferentes. Exemplos de adjuvantes são o adjuvante de Freund completo e incompleto, vitamina E, polímeros de bloco não iónicos e poliaminas, tais como sulfato de dextrano, carbopol e pirano. Também são bastante adequadas as saponinas, que são os adjuvantes preferidos. As saponinas são de preferência adicionadas à vacina, a um nível entre 10 e 10.000 pg/ml. No grupo das saponinas, a saponina Quil A® é o adjuvante mais preferido. A saponina e componentes de vacina podem ser combinados num ISCOMS® (EP 109942, EP 180564, EP 242380).
Além disso, os péptidos, tais como os péptidos de muramidilo, dimetilglicina, tuftsina, são muitas vezes utilizados como adjuvante e o óleo mineral, e.g. Bayol® ou Markol®, óleos vegetais ou suas emulsões e o DiluvacForte® podem ser utilizados, com vantagem.
Como será evidente, outras vias de adjuvação, adição de compostos veículo ou diluentes, emulsionantes ou estabilizantes de vacinas também estão no âmbito da invenção. Estas adições estão, por exemplo, descritas em livros de referência bem conhecidos, tais como: "Remington: the Science and practice of pharmacy" (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472), e: "Veterinary vaccinology" (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdão, ISBN 0444819681). A vacina de acordo com a invenção pode, com vantagem, ser combinada com outro antigénio, ou com um componente imunorreactivo. Isto também pode ser adicionado na forma do seu ácido nucleico codificante. 27 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
Deste modo, numa concretização mais preferida, a vacina de acordo com a invenção caracteriza-se por compreender um componente imunorreactivo adicional, ou um ácido nucleico que codifica para o referido componente imunoactivo, adicional. 0(s) componente(s) imunoactivo(s) adicional(ais) pode(m) ser um antigénio, uma substância imunopotenciadora e/ou uma vacina; podendo cada um destes compreender um adjuvante. 0(s) componente(s) imunoactivo(s) adicional(ais) quando na forma de um antigénio pode(m) consistir em qualquer componente antigénico de importância humana, ou veterinária. Podem, por exemplo, compreender uma molécula biológica ou sintética, tal como uma proteína, um hidrato de carbono, um lipopolissacárido, um ácido nucleico que codifica para um antigénio proteico, ou uma molécula de ácido nucleico recombinante contendo este ácido nucleico ligado de forma operacional a uma sequência reguladora da transcrição. Além disso, uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico deste tipo, uma molécula de ácido nucleico recombinante, ou um LRC contendo este ácido nucleico pode ser um modo de fornecer o ácido nucleico ou o componente imunoactivo adicional. Alternativamente, pode compreender um microorganismo fraccionado ou morto, tal como um parasita, bactéria ou vírus. 0(s) componente(s) imunoactivo(s) adicional(ais) pode(m) estar na forma de uma substância imunopotenciadora e.g. uma quimiocina, ou um ácido nucleico imunoestimulador, e.g. um motivo CpG. Alternativamente, a vacina de acordo com a invenção pode, ela própria, ser adicionada a uma vacina.
Por exemplo, uma vacina de acordo com a invenção pode ser combinada com uma preparação de uma proteína de vacina de subunidade de Babesia, que não seja uma proteína de
Piroplasmida de acordo com a invenção, ou um fragmento imunogénico da referida proteína, para formar uma vacina de subunidade de combinação contra a infecção por Piroplasmida, ou sinais clínicos da doença, associados.
Alternativamente, a vacina de acordo com a invenção pode ser, com vantagem, combinada com um componente farmacêutico, 28 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ tal como um antibiótico, uma hormona, ou um fármaco anti-inflamatório.
Numa concretização ainda mais preferida, a vacina de acordo com a invenção caracteriza-se por o referido componente imunoactivo adicional, ou ácido nucleico que codifica para o referido componente imunoactivo adicional ser obtido de um organismo infeccioso, para: caninos: Ehrlichia canis, Babesia gibsoni, B. vogeli, B. rossi, Leishmania donovani-complex, parvovirus canino, virus de cinomose canina, Leptospira interrogans serovars canicola, icterohaemorrhagiae, pomona, grippotyphosa, bratislava, virus de hepatite canina, virus de parainfluenza canina, virus da raiva, Hepatozoon canis e Borrelia burgdorferi; bovinos: virus de herpes bovino, virus de diarreia virai de bovino, virus de parainfluenza tipo 3, paramixovirus de bovino, doença dos pés e das mãos, Pasteurella haemolytica, vírus sincicial respiratório de bovino, Theileria sp., Babesia sp., Trypanosoma sp., Anaplasma sp., Neospora caninum, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Mycoplasma, E. coli, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, Cryptosporidium, Salmonella e Streptococcus dysgalactiae; e equinos: Streptococcus equi, Streptococcus zooepidemicus, Rhodococcus equi, Corynebacterium pseudotuberculosis, Pseudomonas mallei, Actinobacillus equili e Pasteurella multocida. Agente da febre de Potomac, Clostridium tetanii, Mycobacterium pseudomallei, vírus de estomatite vesicular, vírus da doença Borna, vírus de influenza equina, vírus da doença do cavalo africano, vírus de arterite equina, vírus de herpes equino 1-4, vírus de anemia infecciosa, vírus de encefalomielite equina e vírus de encefalite japonesa B. A proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção, ou o fragmento imunogénico de acordo com a referida proteína, o ácido nucleico, ADNc, molécula recombinante, transportador recombinante vivo, e/ou as células hospedeiras de acordo com a invenção permitem, pela primeira vez, a produção eficaz de anticorpos específicos contra uma proteína de Piroplasmida, ou um fragmento imunogénico da referida proteína. Isto torna a vacina de acordo com a invenção adequada como vacina marcadora, uma vez que permite a diferenciação entre mamíferos 29 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ alvo infectados com parasita e vacinados, através de métodos conhecidos na arte.
Alternativamente, estes anticorpos específicos podem ser eles próprios utilizados como vacinas, para a designada "vacinação passiva".
Deste modo, um outro aspecto da invenção refere-se a uma vacina, caracterizada por compreender um anticorpo contra uma proteína de acordo com a invenção, ou um anticorpo contra um fragmento antigénico da referida proteína contendo epítopos, ou uma sua combinação, e um transportador farmaceuticamente aceitável. 0 anticorpo pode ser de origem natural ou sintética. 0 anticorpo pode ser na forma de um anti-soro, ou um anticorpo purificado. Estes anticorpos purificados podem ser obtidos, com vantagem, a partir de um sistema de expressão.
Também são conhecidos na arte métodos para a produção de anticorpos em grande escala. Estes métodos baseiam-se na clonagem, de (fragmentos de) informação genética que codifica para a proteína de acordo com a invenção num fago filamentoso, para apresentação em fagos. Estas técnicas estão descritas l.a. no "Antibody Engineering Page" sob o título "filamentous phage display" em http://aximtl.imt.uni-marburg.de/-rek/aepphage.html., e em artigos de revisão de Cortese, R. et al., (1994) em Trends in Biotechn., vol. 12, p. 262-267; de
Clarckson, T. & Wells, J.A. (1994) em Trends in Biotechn., vol. 12, p. 173-183; Marks, J.D. et al., (1992) J. Biol. Chem., vol. 267, p. 16007-16010; Winter, G. et al., (1994) Annu. Rev. Immunol., vol. 12, p. 433-455, e em Little, M. et al., (1994) Biotechn. Adv., vol. 12, p. 539-555.
Os fagos são subsequentemente utilizados para pesquisar bibliotecas de expressão em camelídeos que expressam anticorpos de cadeia pesada de camelídeos. (Muyldermans, S. e Lauwereys, M., Journ. Molec. Recogn., vol. 12, 131-140 (1999) e Ghahroudi, M.A. et al., FEBS Letters, vol. 414, p. 512-526 (1997)). As células da biblioteca que expressam os anticorpos desejados podem ser replicadas e subsequentemente utilizadas para expressão de anticorpos em grande escala. 30 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
Uma combinação numa vacina de um antigénio "carregado" com anticorpos contra o antigénio é conhecida na arte como vacina "complexa". Estas vacinas de acordo com a invenção podem ser utilizadas, com vantagem.
Por motivos e.g. de estabilidade ou económicos, a proteína de Piroplasmida de acordo com a invenção, ou fragmentos imunogénicos da referida proteína, ou ácidos nucleicos, ADNc, moléculas recombinantes, transportadores recombinantes vivos, células hospedeiras ou vacinas de acordo com a invenção podem ser liofilizados. Em geral, isto irá permitir o armazenamento prolongado a temperaturas acima de 0°C, e.g. a 4°C.
Os procedimentos para a liofilização são conhecidos dos peritos na arte; o equipamento para liofilização a diferentes escalas está disponível comercialmente.
Deste modo, numa concretização muito preferida, as vacinas de acordo com a invenção caracterizam-se por as referidas vacinas estarem na forma liofilizada.
Para reconstituir uma vacina liofilizada, esta pode ser suspensa num diluente fisiologicamente aceitável. Este diluente pode, e.g. ser tão simples como água estéril, ou uma solução salina fisiológica. Numa forma mais complexa, pode ser suspenso numa emulsão, como descrito em PCT/EP99/10178.
Ainda outro aspecto da invenção refere-se a um método para a preparação de uma vacina de acordo com a invenção, em que o referido método compreende misturar uma proteína de acordo com a invenção, ou um fragmento antigénico contendo um epítopo da referida proteína, um ácido nucleico, um fragmento de ADNc, uma molécula de ADN recombinante, um microorganismo transportador recombinante, vivo, ou uma célula hospedeira de acordo com a invenção, ou uma sua combinação, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
Ainda outro aspecto da invenção refere-se a um método para a preparação de uma vacina de acordo com a invenção, em que o referido método compreende misturar um anticorpo contra 31 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ uma proteína de acordo com a invenção, ou um anticorpo contra um fragmento antigénico da referida proteína, contendo um epítopo, ou uma sua combinação e um transportador farmaceuticamente aceitável.
Como descrito acima, uma vacina que pode ser obtida pelos métodos de acordo com a invenção pode ser igualmente utilizada como tratamento profilático, bem como terapêutico e irá interferir quer com o estabelecimento, e/ou progressão de uma infecção, ou os seus sinais clínicos de doença.
Deste modo, um outro aspecto da invenção refere-se à utilização de uma proteína de acordo com a invenção, ou um fragmento antigénico da referida proteína contendo um epítopo, para o fabrico de uma vacina para o tratamento profiláctico ou terapêutico de uma infecção, ou dos seus sinais clínicos, causados por um organismo de Piroplasmida.
Ainda outro aspecto da invenção refere-se a um teste de diagnóstico para a detecção de um ácido nucleico associado com um organismo Piroplasmida, caracterizado por o teste compreender um ácido nucleico, o referido ácido nucleico ter pelo menos 70%, de preferência 75%, mais preferencialmente 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%, por essa ordem de preferência, semelhante à sequência de ácido nucleico apresentada na SEQ ID NO:l, ou um ácido nucleico que é complementar ao referido ácido nucleico, em que qualquer dos ácidos nucleicos têm um comprimento de pelo menos 15 nucleótidos, de preferência 17, mais preferencialmente 18, 19, 20, 24, 28, 32, 35 ou 40 nucleótidos, por essa ordem de preferência.
Ainda outro aspecto da invenção refere-se a um teste de diagnóstico para a detecção de anticorpos contra um organismo Piroplasmida, caracterizado por o referido teste compreender uma proteína de acordo com a invenção, ou um fragmento antigénico da referida proteína contendo um epítopo, ou uma sua combinação.
Por exemplo, o BIIAl ou um seu fragmento imunogénico é acoplado a um transportador de fase sólida que é incubado com uma amostra a ser testada, é lavado e a presença de anticorpos 32 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ ligados é detectada. 0 método de diagnóstico preferido é por ELISA.
Ainda outro aspecto da invenção refere-se a um teste de diagnóstico para a detecção de material antigénico a partir de um organismo Piroplasmida, caracterizado por o referido teste compreender um anticorpo contra uma proteína de acordo com a invenção, ou um anticorpo contra um fragmento antigénico da referida proteina contendo um epítopo, ou uma sua combinação.
Por exemplo, os anticorpos contra BIIAl, ou um seu fragmento imunogénico são acoplados a um transportador de fase sólida, este é incubado com uma amostra a ser testada, é lavado e a presença de proteina ligada é detectada. 0 método de diagnóstico preferido é por ELISA.
EXEMPLOS EXEMPLO I
1.1. TÉCNICAS UTILIZADAS 1.1.1. Cultura in vitro de B. bovis
Cultivou-se um isolado de B. bovis Israel (linha clonal C61411) in vitro, como anteriormente descrito (Levy & Ristic 1980, Science, vol. 207, p. 1218-1220). Em resumo, mantiveram-se culturas de B. bovis em placas de 24 poços (volume total de 1,2 ml) ou em garrafas de 25 cm2 (volume total de 15 ml) contendo meio M199 (Cambrex Bioscience, Bélgica), com soro bovino a 40% (de uma vaca dadora adulta), Gentamicina 50 pgml-1 (Gibco BRL), bicarbonato de sódio 25 mM e eritrócitos de bovino a um volume de células empacotadas de 5% (PCV) . As culturas foram incubadas a 37°C, 5% CO2 no ar, e a parasitemia foi mantida entre 1% e 12% por diluição diária. O isolado de B. bovis México (linha clonal C9.1) foi cultivado de acordo com o mesmo protocolo utilizado para a linha clonal C61411 (isolado Israel) excepto que as culturas foram mantidas a 90% N2, 5% C02, 5% 02 em vez de 5% C02 no ar. 33 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ 1.1.2. Construção da biblioteca genómica e de ADNc de B. bovis
Construiu-se uma biblioteca de ADNc a partir de 5 pg de ARNm de B. bovis utilizando o kit de síntese ÀZAP-cDNA® (Stratagene), de acordo com as instruções do fabricante. Recolheram-se fragmentos de ADNc de 0,5 a 4 kb por filtração em gel, numa coluna de Sepharose CL4B e ligaram-se no local FcoRI I Xhol do vector de expressão λ uniZAP-XR. Utilizou-se Giga pack III Gold para empacotar em partículas de fago, seguido de transformação de células de Escherichia coli XL-1 Blue MRF'. Obtiveram-se 1,2 χ 106 placas a partir das quais se construiu uma biblioteca amplificada.
As corridas de sequência de passagem única foram realizadas em 15000 clones de ADNc que foram automaticamente recolhidos ao acaso, a partir da biblioteca de ADNc plaqueada, para estabelecer um conjunto de dados EST. A partir deste conjunto de dados EST construiu-se uma base de dados que consiste de 12892 sequências de qualidade elevada (comprimento médio de 476 pb).
Para construir a biblioteca genómica, digeriram-se parcialmente 600 pg de ADN de B. bovis com EcoRI (150 unidades ou 250 unidades) durante 1 h, a 37°C. O ADN digerido foi fraccionado por tamanho numa coluna de Sepharose CL-4B. Ligaram-se fragmentos de 0,5 kb a 8 kb no local EcoRI de λ-ZAPll-Express, empacotados utilizando extracto de empacotamento Gigapack III Gold e transformou-se em células E. coli XLl-Blue MRF' competentes. Obtiveram-se 2,5 χ 106 placas, das quais se construiu uma biblioteca amplificada.
As bibliotecas de ADNc foram pesquisadas com uma sonda produzida por PCR com iniciadores específicos para BiiAl ou para ΒΙΙΑ2. 1.1.3. Pesquisa da biblioteca genómica e de ADNc de B. bovis quanto a genes para BIIAl e BIIA2
As bibliotecas genómica e de ADNc de B. bovis foram pesquisadas para isolar clones para os genes BIIAl e BIIA2 com uma sonda específica construída por PCR. Os iniciadores específicos utilizados foram: 34 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ para ο gene ΒΙΙΑ1: iniciador 1: 5'-CCACGGCTCTGGAATCTATGTC-3' (SEQ ID NO:11) iniciador 2: 5'-CAAAAGGATACCTATATTTGGTAC-3' (SEQ ID NO:12), e para o gene BIIA2: iniciador 3: 5'-TGTGGTAGATGAATCTGCTAGTATATC-3' (SEQ ID NO:13) iniciador 4: 5'-CTATGCCACGGCATTCAGCAACATTTA-3' (SEQ ID NO:14)
Ambos os pares de iniciadores foram utilizados para amplificar um fragmento a partir de um clone da base de dados de EST de B. bovis, por PCR num volume de 50 μΐ contendo dNTP 0,2 mM, 20 pmol/μΐ de cada iniciador, 100 ng de ADN genómico total de B. bovis e 0,5 U de ADN-polimerase Taq em tampão convencional (Promega). A amplificação foi realizada durante 30 ciclos com as condições para a sonda BIIA1 a: 92°C durante 30 s, 58°C durante 30 s, e 72°C durante 30 s, e para a sonda BIIA2 a: 95°C durante 1 min, 58°C durante 1 min, e 72°C durante 10 min. Estes ciclos foram precedidos por uma desnaturação inicial durante 3 min a 95°C e um alongamento final a 72°C, durante 10 min.
Ambas as sondas foram purificadas a partir do gel de agarose e marcadas com 50 pCi 32P-dATP (3000 Ci/mmol), utilizando um kit de marcação de iniciador aleatório (Roche). No total, pesquisaram-se 4xl06 placas de biblioteca de ADNc e 4xl05 de biblioteca de ADN genómico, por procedimentos convencionais (Sambrook & Russell, supra) para clonagem de ADNc de BIIA1; tendo-se pesquisado 5xl05 placas da biblioteca de ADNc e um número igual de placas da biblioteca de ADN genómico para clonagem de ADNc de BIIA2. Após 2 ciclos de purificação de placas, todos os clones foram excisados in vivo para isolamento das inserções de fagemideo, como descrito nas instruções do fabricante (Stratagene) e sequenciados em ambas as cadeias, utilizando sequenciação de ciclo com o método de terminador de corante (kit de terminador de corante ABI PRISM®, Pharmacia).
Para obter os ADNc de BIIAl e BIIA2 de tamanho total, as extremidades 5' não codificantes foram identificadas com 5'-RACE (kit GeneRacer™, Invitrogen; L1502-01, de acordo com as instruções do fabricante). Os clones de tamanho total 35 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ obtidos foram inseridos em plasmideos de clonagem pCR2.1 e sequenciados em ambas as cadeias, com descrito acima. As sequências resultantes são apresentadas na SEQ ID N0:1 (BIIA1) e SEQ ID NO:5 (BIIA2). 1.1.4. Expressão de BIIA1 recombinante em E. coli
Os clones de BIIA1 e BIIA2 foram subclonados por PCR a partir dos plasmideos de clonagem pCR2.1.
Os iniciadores utilizados para subclonagem de BIIA1 foram: iniciador 5: 5'-CCCGGATCCATGCAGTTACATAACAAA-3' (SEQ ID NO:15) iniciador 6: 5'-GGGAAGCTTCTGAGCAAAGGAAATAGG-3' (SEQ ID NO:16)
Estes iniciadores para BIIA1 introduziram um local para a enzima de restrição BamHI antes da base 1 (numerada desde a primeira base do codão de iniciação) e um local Hindin após a base 1504.
Os iniciadores utilizados para subclonagem de BIIA2 foram: iniciador 7: 5'-CCCGAATTCGTGGTAGATGAATCTGCT-3' (SEQ ID NO:17) iniciador 8: 5'-CCCGTCGACTGCCTCGCCCCAAATGTTGT-3' (SEQ ID NO:18)
Estes iniciadores para BIIA2 introduziram um local EcoRI e um local Sall.
Após PCR (30 ciclos de 1 min 94°C, 1 min 55°C, 1 min 72°C), os fragmentos foram purificados em gel, fundidos a um vector pET-32a e utilizados para transformação na estirpe E. coli NovaBlue®. Os plasmideos que contêm a inserção adequada foram utilizados para transformação em estirpes hospedeiras, BL21 (DE3). As proteínas de fusão com tioredoxina foram obtidas com um rendimento máximo, após indução com 1 mM de isopropil^-D-tiogalactosidase (IPTG) durante 4 h, a 37°C, como se verifica por análise de amostras de células totais, a 0 e 4 h após indução. Os sedimentos bacterianos foram fervidos a 95°C em tampão de amostra de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) contendo 2% (v/v) de β-mercaptoetanol, corrido em minigéis de 36 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ SDS-PAGE a 10% e corados com Coomassie Brilliant Blue para confirmar a expressão (Figuras 1 e 2). 1.1.5. Selecção de péptidos e produção de anti-soro monoespecífico
Após os genes BIIAl e BIIA2 serem completamente sequenciados, seleccionaram-se péptidos de sequências traduzidas em computador, para indução de anticorpos policlonais específicos, através da imunização de animais de teste.
Utilizou-se o programa de analise de sequências Protean da DNA Star® para seleccionar regiões de péptido que têm uma boa probabilidade de superfície e continham regiões anfifáticas alfa, carregadas.
Os péptidos seleccionados péptido 1: aa números 46-60: Péptido 2: aa números 395-409: péptido 3: aa números 453-467:
Os péptidos seleccionados Péptido 4: aa números 255-269: Péptido 5: aa números 424-439: Péptido 6: aa números 547-561: de BIIAl (SEQ ID NO:2) foram: C1S t ei na-AF HKEPNNRRLTKRS, CÍSteina-RGVGMNWATYDKDSG, CÍSteina-YVEPRAKNTNKYLDV. de BIIA2 (SEQ ID NO:6) foram: císteina -PGKRTRALLDLRMIE , císteina -rvgntdeehnhrkdmd, císteina -VYDDHPEESENTGIN.
Após a síntese dos péptidos, estes foram acoplados a uma proteína transportadora: hemocianina de lapa Fissurella (KLH) activada com maleimida (Pierce; 77605) de acordo com as instruções do fabricante. O conjugado péptido-transportador foi utilizado para produzir anti-soros policlonais de coelho.
Para esse fim, três grupos de coelhos-NZW (cada grupo continha 2 coelhos) foram imunizados cinco vezes, subcutaneamente, com um intervalo de 3 semanas entre imunizações consecutivas. Antes da imunização, recolheu-se o soro do sangue de cada Coelho que foi utilizado com controlo negativo. Cada coelho foi injectado com 250 pg de péptido acoplado a KLH, que foi recolhido num volume igual de 37 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ adjuvante Stimune® (ID-DLO, Lelystad, Holanda). O volume total injectado em cada coelho era de 1000 μΐ. Os soros foram testados periodicamente quanto a reactividade, por ELISA.
Fez-se plasmaférese uma semana após a última imunização e recolheram-se os soros.
1.1.6. ELISA A resposta de anticorpos foi avaliada por ELISA. Revestiram-se placas de microtítulo de noventa e seis poços com 150 ng quer de péptido 1, quer de péptido 2, por poço, incubou-se durante 30 min, a 37°C, bloqueou-se durante 1 h com PBS/BSA. Incubaram-se diluições consecutivas (1:50 a 1:50 000) de soros de coelho, individuais, durante 1 h, a 37°C. As placas foram lavadas e incubou-se anticorpo secundário anti-coelho, de porco conjugado com HRP, diluído 1:2000, durante 1 h. As placas foram lavadas e desenvolvidas durante 45 min com ABTS [ácido 2,2'-azinobis(3-etilbenzotiazolinossulfónico)]-substrato de peroxidase (Roche biochemicals). A DO405 foi registada e calcularam-se os títulos de ELISA comparativos. 1.1.7. Ensaio de imunofluorescência O reconhecimento de merozoítos de B. bovis por anti-soros contra péptidos de BIIAl e BIIA2 foi testado por ensaio de imunofluorescência indirecta (IFA). Fixaram-se esfregaços de sangue de baixa espessura com metanol arrefecido. A incubação primária com anti-BIIAl policlonal de Coelho (1:40), ou anti-BIIAl policlonal de ratinho (1:5 a 1:160) durante 30 min foi seguida por três passos de lavagem de 5 min. As lâminas foram incubadas com anticorpos imunoglobulina G anti-coelho, de cabra marcados com isotiocianato de fluoresceína a 1:80 (igG) (Nordic), durante 30 min. As lâminas foram lavadas mais uma vez e aplicou-se solução de Vectashield® (laboratórios Vector), os objectos foram tapados com uma lamela e visualizados num microscópio de fluorescência de UV com filtros FITC (450-480/ 515-565 nm) . Os títulos de IFA foram determinados como a última diluição de soro com reconhecimento positivo de parasitas, em comparação com o soro pré-imune negativo, diluído 1:5. 38 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ 1.1.8. Preparação de extractos totais de proteína de merozoíto e proteínas solubilizadas aquando da invasão
Amostras de 800 μΐ de merozoítos, preparadas como descrito acima para invasão in vitro foram parcialmente separadas de preparações de membrana de eritrócito por filtração em pré-filtros de polipropileno 1,2 μΜ (Millipore, AN1202500). Os merozoítos filtrados foram reunidos e lavados duas vezes em 20 volumes de pbs contendo bicarbonato de sódio 25 mM (pH 8,0) seguido de centrifugação a 2000 g durante 20 min, a 4°C. Após a segunda lavagem, o sedimento foi ressuspenso num volume igual de PBS (pH 8,0) e dividido em alíquotas de 200 μΐ que foram centrifugadas (10 OOOxg, 5 min a 4°C) e armazenadas como sedimentos celulares de 100 μΐ (2χ109 merozoítos) a -20°C após remoção do sobrenadante. Os sedimentos de merozoítos congelados foram descongelados antes de utilização e lisados, reduzidos e alquilados utilizando um kit de extracção de membrana Proteoprep® (Sigma), de acordo com as instruções do fabricante e por fim obtidos em 1,7 ml de tampão compatível com a aplicação directa em geles de SDS-poliacrilamida ou tiras de isoelectrofocagem (IEF) . O material insolúvel foi removido por centrifugação a 16 OOOxg durante 3 min, a 4°C. A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford (Anal. Biochem. 1976, vol. 72, p. 248-254). Dado que os extractos continham quantidades consideráveis de proteínas de eritrócito, os extractos controlo foram preparados do mesmo modo, mas começando com uma cultura de eritrócitos não infectados.
As proteínas solubilizadas por invasão foram obtidas removendo cuidadosamente o tampão da camada superior, 1 h de invasão in vitro, como descrito acima. As amostras foram centrifugadas (2000xg, 10 min, 4 °C) após o que se desprezou o sedimento (que era invisível) e o sobrenadante foi
centrifugado mais uma vez a velocidade elevada, para remoção de fragmentos de membrana (20 min, 12 OOOx, 4°C) . O sobrenadante final foi dialisado (Pierce; Snakeskin® tubagem de diálise pregueada, 68035) durante a noite, contra KHP04 10 mM, pH 7,5. A hemoglobina residual foi removida em lotes por incubação de 50 ml do sobrenadante dialisado com 6,5 ml de DEAE Sepharose de fluxo rápido (Amersham Biosciences) equilibrado em tampão de diálise durante 90 min, a 4°C numa 39 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ plataforma rotativa. A suspensão foi centrifugada durante 5 min a 3000xg, a 4°C após o que a DEAE Sepharose foi lavada 4 vezes por adição de 50 ml de tampão de diálise, seguido de centrifugação durante 5 min a 3000xg, a 4°C. As proteínas ligadas foram eluídas por adição de 6 ml de tampão de eluição (350 mM KC1, 10 mM KHPO4, pH 7,5) e incubação durante 5 min, seguido de centrifugação durante 5 min, a 3000xg, a 4°C. O sobrenadante foi concentrado e dessalinizado em filtros de 10 kDa (YM-10, Millipore). 1.1.9. Electroforese em SDS-poliacrilamida e transferência de Western
As proteínas foram resolvidas na presença ou ausência de β-mercaptoetanol e foram separadas em SDS-PAGE a 10% e transferidas electroforeticamente para uma membrana lmmobilon™-P (Millipore). A porção transferida foi bloqueada com leite em pó desnatado a 5%, diluído em Tween® 20 a 0,5% contendo solução salina tamponada com fosfato (pbst), durante 1 h, a 37°C. Incubou-se uma diluição adequada (1:500) de anticorpo primário em leite desnatado a 2% em PBST, durante 1 h, durante a noite. A transferência foi lavada com PBST e em seguida incubada com uma diluição 1:10.000 de anticorpo secundário anti-coelho, conjugado com peroxidase de rábano (HRP) (DAKO), durante 1 h, a 37°C.
Após ser lavada com PBST, a transferência foi desenvolvida com o kit de substrato TMB MB (Lucron Bioproducts BV; KPL 50-77-00) ou quimioluminescência aumentada (ECL)+ (Amersham; RPN2132). 1.1.10. Focagem isoeléctrica O extracto total de merozoíto, o sobrenadante de invasão e amostras de proteína BIIA1 foram ressuspensos em solução de re-hidratação (ureia 7 M, tioureia 2 M, CHAPS a 4%, 2% de mistura de anfólitos transportadores pH 4-7NL (tampão IPG e DTT 20 mM). Separaram-se amostras de proteína BIIA2 na primeira dimensão utilizando mistura de anfólitos transportadores, pH 3-10NL. O aparelho de IEF, geles IPG e reagentes utilizados eram da Amersham Biosciences, salvo indicação em contrário. Carregaram-se 35 pg de proteína total 40 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ de merozoíto, ou 35 pg de sobrenadante de invasão com inibidor de protease (Completo, Roche) em tiras de 7 cm (pH 4-7NL) . Para tiras de 13 cm, carregaram-se 150 pg de proteínas totais de merozoíto, ou 150 pg de sobrenadante de invasão. As tiras forma re-hidratadas (10-14 h) e fez-se a focagem durante a noite (14-17 h) numa corrida automática (1 min 300 V, 90 min durante os quais a voltagem subiu para 3500 V, seguido de focagem contínua a 3500 V, num total de 35-40 KVh, em IPGPhor”) .
Após focagem isoeléctrica, as proteínas foram reduzidas e ligadas a SDS equilibrando cada tira durante 15 min em 10 ml de tampão de equilíbrio de SDS (Tris 50mM, ureia 6M, SDS a 2%, glicerol a 30%, pH 8,8) contendo DTT 30 mM DTT (adicionado fresco, antes de utilização) . Fez-se um segundo passo de equilíbrio em tampão de equilíbrio de SDS contendo iodoacetamida a 2,5% (também adicionada fresca), em vez de ditiotreitol, de modo a impedir a reoxidação de proteínas e a minimizar as reacções de resíduos de cisteína. A segunda dimensão do gel de electroforese em SDS foi realizada num sistema Hoefer SE600. A coloração com prata foi utilizada para visualizar proteínas após electroforese 2-D. Adquiriram-se imagens dos geles utilizando o programa LabScan® v3.0 num aparelho de varrimento de leito plano Umax e analisaram-se utilizando o programa ImageMaster® 2D v3.01 (Amersham Biotech). Para transferência imunitária, as proteínas em tiras de 7 cm foram separadas num gel de SDS-PAGE a 10%, ou separaram-se tiras de 13 cm num gel de proteínas 2-D e transferiram-se para uma membrana Immobilon™-P (Millipore; IPVH00010). O procedimento seguido para transferências bidimensionais foi o mesmo que para as transferências 1-D. 1.1.11. Teste de invasão de B. bovis in vltro A invasão foi realizada como descrito anteriormente (Fransen et al. 2003, Microbes Infect. vol. 5, p. 365-372), com ligeiras modificações. Centrifugaram-se glóbulos vermelhos infectados com B. bovis a uma parasitemia de 6 a 8%, a 2000xg, 10 min, 15°C, e ressuspenderam-se num volume igual de tampão VyMs (Vega & Martinez, ver Fransen, supra). Submeteram-se amostras de 800 pl a cinco pulsos de voltagem elevada, 41 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ intermitentes (10 segundos, a 0°C entre pulsos) (2.5 kV, 200Ω, 25 pF) em cuvetes BioRad de 4 mm (165-2088) utilizando um BioRad Gene Pulser® com controlador de pulso.
Adicionaram-se 8 ml de PBS contendo carbonato de sódio 25 mM (pH 8,0, 20°C) a cada amostra de 800 μΐ, seguido de centrifugação (1800xg) durante 10 min, a 15°C. Fez-se uma segunda lavagem idêntica, excepto que a centrifugação foi realizada a 1300xg, após o que se ressuspendeu o sedimento de merozoito em 800 μΐ de PBS contendo bicarbonato de sódio 25 mM (pH 8,0, 20°C). A invasão foi iniciada por adição de 1 volume de merozoitos ressuspensos, a 9 volumes de eritrócitos de bovino suspensos (5,5% PCV em PBS pH 8,0 contendo bicarbonato de sódio 25 mM, pré-incubado durante 30 min a 37°C, em CO2 no ar) e foi realizada em placas de 24 poços (volume final 1,2 ml), em frascos de 25-cm2 (15 ml), ou em frascos de 80 cm2 (50 ml), a 37°C, 5% C02 no ar. As lâminas coradas com Giemsa foram preparadas após lhe contaram-se os eritrócitos com parasitas, num total de 5000 eritrócitos. 1.1.12. Inibição in vitro da invasão por anti-soros policlonais de coelho
Incubaram-se 200 μΐ de merozoitos de B. bovis, libertados por pulsos de voltagem elevada e ressuspensos em PBS contendo bicarbonato de sódio 25 mM (pH 8,0) como descrito acima, com 40 μΐ de anti-soros de coelho, durante 1 h, a 20°C. Após 1 h, adicionaram-se 960 μΐ de eritrócitos de bovino suspensos (6,25% PCV em PBS pH 8,0, contendo bicarbonato de sódio 25 mM, pré-incubados durante 30 min, a 37°C em CO2 no ar), seguido de 1 h de incubação após o que se prepararam e se contaram lâminas coradas com Giemsa, para determinar o nível de invasão. Os anti-soros de coelho utilizados foram produzidos contra péptidos sintéticos derivados da sequência de aminoácidos de BIIA1 e BIA2 e um soro de controlo produzido contra um péptido de controlo não relacionado (YAGRLF SKRTAATAYKLQ). Os péptidos tinham sido ligados a hemocianina de lapa Fissurella (KLH) antes de imunização. Os soros pré-imunes também foram incluídos no teste. 42 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ 1.2. Resultados do Exemplo 1 1.2.1. Identificação e clonagem de um ADNc de tamanho total que codifica para BIIA1 e BIIA2 A sondagem com bibliotecas de ADNc de B. bovis com sondas de PCR (350 pb para BIIA1 e 450 pb para BIIA2), resultou na clonagem e sequenciação de um ADNc de 2181 pb para BIIAl e de 2385 pb para BIIA2. Ambos continham uma sequência de leitura aberta e uma região não codificante 3' que termina numa cauda poli-A. Para determinar a extremidade protegida 5' dos ARNm de tamanho total, o ARNm total foi desfosforilado, após o que se removeram as protecções 5', que são deixadas intactas, por pirofosfatase ácida de tabaco, seguido de ligação de um oligonucleótido de ARN especifico. Subsequentemente, a nested PCR na primeira cadeia de ADNc permitiu a clonagem e sequenciação de um fragmento que representa a extremidade 5' do ARNm de B. bovis para BIIAl e para BIIA2. A tradução por computador da ORF de 1815 pb de BIIAl previa uma proteina de 67,2 kDa; a tradução da ORF de 1965 pb para BIIA2 previa uma proteina de 65,6 kDa. 1.2.2. Reconhecimento de BIIAl e BIIA2 recombinante por anti-soros contra péptidos derivados.
Para permitir outros estudos sobre proteínas BUA, os coelhos foram imunizados com péptidos sintéticos ligados a KLH 1-6 {supra). Todos os anti-soros reconheceram especificamente um produto de fusão de tioredoxina recombinante e a parte das proteínas BIIA que foi expressa em células E. coli BL21 (Figuras 1 e 2) . A electroforese em gel de poliacrilamida de lisados de células totais obtidas antes (coluna 1) e depois (coluna 2) da indução com IPTG identificou o produto de fusão recombinante para BIIAl e para BIIA2. 0 BIIAl e BIIA2 Rec são ambos reconhecidos por todos os três soros imunes (colunas 5, 8, 11) e não pelo soro pré-imune (colunas 6, 9, 12) em imunotransferências. O reconhecimento imune era especifico para a parte de BIIA do produto de fusão, como proteina controlo, um produto de fusão recombinante de B. bovis rab5 (coluna 3, Asp-5 a Lys-208, GenBank n.° de acesso: 324137.1) expresso em PET32a não foi reconhecido (colunas 7, 10, 13) por 43 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ estes soros. Além disso, o reconhecimento imune era específico do péptido e não devido a anticorpos induzidos pela proteína transportadora KLH utilizada para imunização, uma vez que anti-soros produzidos contra um péptido sintético ligado a KLH, não relacionado com BIIAl ou BIIA2 não reconheceram o produto de fusão recombinante de BIIAl (coluna 13). 1.2.3. Microscopia de imunofluorescência
Para localizar as proteínas BIIA no parasita, fizeram-se estudos de imunofluorescência utilizando anti-soros de coelho contra os seis péptidos de BIIAl e BIIA2 ligados a KLH, em culturas de B. bovis in vitro aderidas a lâminas de vidro por fixação com metanol (Figuras 3 e 4) . A incubação com soros pré-imunes (painéis A, C, E) não resultou em nenhuma coloração específica de parasitas acima de um sinal de ruído de fundo de fluorescência fraca, derivada de eritrócitos infectados, bem como não infectados. Pelo contrário, os soros imunes resultaram numa coloração específica de parasitas em qualquer campo de microscópio analisado (painéis B, D, F). Os parasitas fluorescentes eram detectáveis com anti-soros contra todos os três péptidos, a uma diluição de 1:5. Embora os parasitas de B. bovis intraeritrocitários e merozoítos livres sejam pequenos (± 1 por 2 pm), uma ampliação máxima permitiu uma visualização clara do padrão de coloração. 1.2.4. Inibição da invasão in vitro por anti-soros específicos de péptido
Utilizou-se um teste de invasão in vitro de B. bovis que permitiu o estudo da invasão de eritrócitos por merozoítos livres, num tampão isento de proteínas, num intervalo de tempo de 1 h, para determinar o efeito de anti-soros dirigidos contra os 6 péptidos derivados de diferentes domínios de BIIAl e BIIA2. Os merozoítos livres foram pré-incubados durante 1 h a 20°C, com anti-soros anti-péptido e com o soro controlo dirigido contra um péptido não relacionado, iniciando-se em seguida a invasão por adição de eritrócitos. Todos os anti-soros contra os péptidos BIIA originaram uma inibição significativa da invasão, enquanto que os soros pré-imunes e anti-soros de controlo não tiveram nenhum efeito significativo na eficácia da invasão (Figuras 5 e 6) . Para BIIAl, o efeito mais forte de 65 ± 10 % de inibição da invasão foi observado 44 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ pelo anti-soro dirigido contra o péptido 1; para BIIA2, o efeito mais forte de 70 ± 10 % de inibição da invasão foi observado pelo anti-soro dirigido contra o péptido 4.
1.2.5. Mapeamento de proteínas BIIA em geles 2-D
Para determinar se o BIIAl e BIIA2 ficam expostos no meio como proteínas solúveis durante a invasão de eritrócitos, constituindo assim parte do SPA mencionado acima, fez-se a imunotransferência de sobrenadantes de invasão. O BIIAl e BIIA2 foram localizados em imunotransferências bidimensionais. Separaram-se 50 pg de sobrenadante de invasão concentrado por isoelectrofocagem, seguido de electroforese em geles de SDS-poliacrilamida. As proteínas foram transferidas em membranas de PVDF. As partes excisadas das membranas (45 a 90 kDa) foram incubadas com anti-soros anti-péptido BIIAl contra os péptidos 1 ou 3 (Figura 7, painéis A e C, respectivamente) bem como com anti-soros anti-péptido BIIA2 contra os péptidos 4 e 6 (Figura 8, painéis A e C respectivamente). Para ambas as proteínas, os anticorpos contra os péptidos 1 e 4, foram ligados às mesmas manchas específicas (setas) em adição à coloração a-específica de proteínas que também estavam presentes em manchas de controlo. Estas tinham sido preparadas a partir de sobrenadantes de glóbulos vermelhos não infectados (RBC), preparados sob condições idênticas, mas na ausência de merozoítos (Figura 7 e 8, painéis B e D) . Fez-se subsequentemente a correspondência das manchas localizadas por imunotransferência com um gel de proteína 2D corado com prata, de uma amostra semelhante que foi obtida a partir de uma experiência paralela, em que se utilizaram parasitas que foram marcados metabolicamente com 35S-Met antes da invasão. A Figura 9 apresenta o padrão obtido após exposição a película, mostrando exclusivamente proteínas de B. bovis, uma vez que as proteínas de eritrócito não incorporaram o marcador. Utilizando um programa de imagem, fez-se a correspondência das manchas detectadas por imunotransferência com anti-soros anti-péptido BIIAl com uma linha de manchas de ± 70 kDa na autorradiografia e no gel corado com prata (ver setas na Figura 9). Ο BIIA2 é representado pelas manchas de menor intensidade, indicando uma menor abundância da proteína nativa. 45 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ exemplo li: Clonagem, expressão e caracterização de ΒΙΙΆ3 O ADN total amplificado da biblioteca de ADNc descrita no § 1.1.2 foi pesquisado quanto ao gene BIIA3 com os seguintes iniciadores: iniciador 9: 5'-CCCGAATTCCATGATGGTGAAGTTCCACAC-3' (SEQ ID NO:19) iniciador 10: 5'-CCCGTCGACGTTGGCCCCCTTTCGGTGAT-3' (SEQ ID NO:20) A PCR foi realizada como descrito no § 1.1.3. O fragmento de PCR foi sequenciado directamente; a sequência resultante é apresentada na SEQ ID NO:9 (BIIA3). O fragmento de PCR do ADNc de BIIA3 foi clonado no vector de expressão pET-32a, como descrito no § 1.1.4. Os iniciadores 9 e 10 forneceram os locais de restrição de Eco RI e Sal I. A sequência traduzida por computador da proteína BIIA3 é apresentada na SEQ ID NO:10. A ORF de 1635 nucleótidos no ADNc de BIIA3 codifica para uma proteína de 61,0 kDa.
Os péptidos foram previstos a partir desta proteína para indução de anticorpos específicos em animais de teste, como descrito no § 1.1.5.
Os péptidos seleccionados a partir da proteína BIIA3 são: péptido 7: aa números 122 -136 cisteína - GELKKLSDNIPTKMP, péptido 8: aa números 385 - 399 cisteína - SGSARVETSLESSVP.
Os péptidos foram acoplados a KLH, e utilizados para produzir anticorpos policlonais de coelho, como descrito no §1.1.5. Os soros de coelho foram avaliados por ELISA, como descrito no §1.1.6.
Os anti-soros policlonais de coelho anti-péptido eram para detectar BIIA3rec (E. coll expressou a proteína BIIA3 fundida com tioredoxina) na transferência de Western 1-D. Os resultados são apresentados na Figura 10, painel A: Ο BIIA3 Rec foi reconhecido pelos anti-soros contra ambos os péptidos 7 e 8, enquanto que os soros pré-imunes não reconheceram BIIA3 Rec. 46 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ Ο anti-soro policlonal contra ΒΙΙΑ3 (e contra BIIAl e BIIA2) foi produzido em gado, como descrito no Exemplo III.
Este anti-soro de bovino também foi utilizado numa transferência de Western 1-D em BIIA3rec. Os resultados são apresentados na Figura 10, painel B: o soro de dois animais reconheceu BIIA3rec, enquanto que o soro bovino pré-imune, não. O anti-soro de bovino contra BIIA3rec também foi utilizado num gel 2-D de proteína de B. bovis nativas, como descrito no § 1.1.8 e 1.1.9. Os resultados são apresentados na Figura 11. O soro de bovino pré-imune reagiu com várias manchas provenientes de glóbulos vermelhos (painel A) . Para o painel B, utilizou-se uma coluna de Sepharose com BIIA3rec-IgG imune, purificada. Isto reconheceu especificamente (grupos) manchas de ~95 kDa, ~75 kDa e ~30 kDa (ver setas) . Aparentemente, as formas processadas e multiméricas de BIIA3 nativo também são reconhecidas.
Demonstrou-se que o anti-soro policlonal de coelho contra o péptido 7 tem propriedades de inibição da invasão, ver Figura 12. A IgG purificada em Sepharose G foi utilizada em três concentrações diferentes, levando a uma inibição máxima de 65%. A IgG não imune e o PBS não resultaram em inibição (coluna de controlo). O anti-soro policlonal de coelho contra o péptido 7 também foi utilizado para determinar a localização subcelular de BIIA3 em merozoitos de B. bovis no eritrócito infectado, por imunofluorescência indirecta. A detecção foi por microscopia de multifotões.
Fixaram-se esfregaços de sangue de baixa espessura em acetona, durante 10 min e secaram-se ao ar. A incubação primária com soro de coelho anti-péptido 7 (1:20) durante 30 min foi seguida por três passos de lavagem de 5 min, com PBS. As lâminas foram em seguida incubadas com IgG anti-coelho, de cabra, conjugada com Alexa 488 (20 pg/ml, Molecular Probes Inc., Eugene, EUA) durante 30 min e lavadas com PBS. Subsequentemente, para marcação dupla, as lâminas foram 47 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ incubadas com DAPI (0,5 μΜ, Molecular Probes Inc.) durante 20 min e lavadas. A solução FluorSave® foi aplicada e as lâminas foram deixadas durante a noite à temperatura ambiente, tapadas, numa posição horizontal.
Os sinais fluorescentes foram visualizados utilizando um sistema confocal e de multifotões, Bio-Rad Radiance 2100MP equipado com um microscópio invertido Nikon TE300. A excitação das sondas DAPI foi conseguida por excitação de multifotões a 780 nm, utilizando um laser de titânio-safira com bloqueio dos modos de funcionamento (Tsunami, Spectra-Physics) bombeado por um laser de estado sólido de 10 W (Milennia Xs, Spectra-Physics), enquanto que a sonda Alexa 488 foi excitada por um laser de árgon a 488 nm.
Os resultados de IFT de multifotões mostraram que estava presente uma coloração especifica de BIIA3 na região apical do parasita Babesia. EXEMPLO III: Produção e utilização de anti-soros de bovino contra BIIAl, BIIA2, e BIIA3 recombinante
Os produtos de expressão recombinante de BIIAl, BIIA2, e BIIA3 foram produzidos em E. coli como descrito na secção 1.1.4. As bactérias foram sedimentadas e solubilizadas em Guanidínio HC1 6M. O lisado celular total foi centrifugado a 9000 rpm durante 10 min e o lisado solúvel foi ligado a uma suspensão de Ni-NTA agarose, em GuHCL.
As pérolas foram lavadas três vezes com ureia 8M e o antigénio específico foi subsequentemente eluído com imidazole 250 mM em ureia 3M.
Cada dose de vacina continha 100 pg de antigénio BIIArec purificado e formulado com adjuvante de saponina numa dose final de 2 ml. As vacinas foram aplicadas intramuscularmente no pescoço de gado imunologicamente competente, cada grupo com um total de 5 animais. 5 semanas após a imunização deu-se uma vacinação de reforço com a mesma formulação. 3 semanas após o reforço, o sangue foi recolhido e preparou-se soro para análise. 48 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ A purificação de IgG especifica de bovino foi realizada incubando 5 ml de anti-soro com 2 ml de GammaBind Plus® Sepharose (Amersham-biosciences) durante 1 h a 20 °C em tampão de ligação (fosfato de sódio 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, edta 0,01 M) . A coluna foi lavada com tampão de ligação e a IgG foi eluida com 5 ml de NaAc 0,5 M pH 3,0, e imediatamente neutralizada com Tris-HCl pH 9,0. A IgG foi concentrada e dialisada contra PBS pH 7,4. A inibição da invasão in vitro por IgG total purificada de anti-soros de bovino produzidos contra BIIA1, BIIA2 e BIIA3 recombinante (clonados a partir da estirpe Israel) foi realizada como descrito para anti-soros policlonais de coelho (§ 1.1.11 e 1.2.4) utilizando concentrações de IgG de bovino finais de 0,15 pg/μΐ ou 0,75 pg/μΐ, durante a pré-incubação. Todos os testes foram realizados duas vezes, utilizando anticorpos de dois animais diferentes para cada antigénio. Os resultados apresentados na Figura 13 apresentam os dados combinados dos anti-soros individuais por antigénio. O desvio padrão é indicado. Para mostrar que a inibição é também eficaz na invasão de uma estirpe de Babesia heteróloga, testou-se uma linha clonal (C9.1) derivada de um isolado Mexicano (M07) de B. bovis. A eficácia da inibição da invasão de eritrócitos por ambas as estirpes de Babesia é comparável. A eficácia de BIIA1 e BIIA2 (entre 3 e 12 %) parecia ainda mais elevada do que a de BIIA3 (23 - 25 %).
LEGENDA DAS FIGURAS
Figura 1:
Coluna 1: pET-BIIAl antes de indução com IPTG.
Coluna 2: pET-BIIAl 4 h após indução com IPTG.
Coluna 3: pET-Rab5 4 h após indução.
Colunas 4, 5, 6 incubado com anti-péptido 1;
Colunas 7, 8, 9 incubado com anti-péptido 2;
Colunas 10, 11, 12 incubado com anti-péptido 3.
Colunas 4, 7, 10 contêm pET-BIIAl 4 h após indução, incubado com soro pré-imune;
Colunas 5, 8, 11 o mesmo que nas colunas 4, 7, e 10, mas incubado com soro imune. 49 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
Colunas 6, 9, 12 contêm pET-Rab5 4 h após indução, incubado com soro imune.
Coluna 13: pET-BIIAl 4h após indução e incubado com anti-soro contra péptido ligado a klh, não relacionado com B. bovis.
Figura 2:
Coluna 1: pET-BIIA2 antes de indução com IPTG.
Coluna 2: pET-BIIA2 4 h após indução com IPTG.
Coluna 3: pET-Rab5 4 h após indução.
Colunas 4, 5, 6 incubado com anti-péptido 4;
Colunas 7, 8, 9 incubado com anti-péptido 5;
Colunas 10, 11, 12 incubado com anti-péptido 6.
Colunas 4, 7, 10 contêm pET-BHA2 4 h após indução, incubado com soro pré-imune de coelho;
Colunas 5, 8, 11 o mesmo que nas colunas 4, 7, e 10, mas incubado com soro imune.
Colunas 6, 9, 12 contêm pET-Rab5 4 h após indução, incubado com soro imune.
Coluna 13 contêm pET-BIIA2 4h após indução e incubado com anti-soro contra péptido ligado a klh, não relacionado com B. bovis.
Figura 3:
Os painéis A, C e E mostram culturas de B. bovis in vitro fixas em metanol incubadas com anti-soro pré-imune de coelho, contra os péptidos 1, 2 e 3 de BIIAl respectivamente. Os painéis B, D, F são semelhantes a A, C e E mas incubados com os soros imunes correspondentes. Para fins reprodutivos, as cores foram invertidas.
Figura 4:
Os painéis A, C e E mostram culturas de B. bovis in vitro fixas em metanol incubadas com soro pré-imune de coelho, contra os péptidos 4, 5 e 6 de BIIA2 respectivamente. Os painéis B, D, F são semelhantes a A, C e E, mas incubados com os soros imunes correspondentes. Para fins reprodutivos, as cores foram invertidas.
Figura 5:
As colunas de controlo representam uma pré-incubação com anti-soro contra um péptido não relacionado que não originou 50 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ inibição. Os anti-soros (barras abertas), bem como soros de coelho pré-imune (barras a preto) contra os péptidos 1, 2 e 3 de BIIAl foram testados duas vezes, em triplicado.
Figura 6:
As colunas de controlo representam uma pré-incubação com anti-soro contra um péptido não relacionado que não originou inibição. Os anti-soros (barras abertas) bem como soros de coelho pré-imune (barras a preto) contra os péptidos 4, 5 e 6 de BIIAl foram testados duas vezes, em triplicado.
Figura 7:
Painéis A e C: imunotransferências 2-D com soro imune contra os péptidos 1 e 3 de BIIAl, respectivamente. Painéis B e D: imunotransferências-2-D com soro pré-imune de coelhos imunizados com péptidos 1 e 3 de BIIAl, respectivamente. As setas indicam manchas especificas para anti-soros contra o péptido 1, bem como o péptido 3.
Figura 8:
Painéis A a C: imunotransferências 2-D com soro imune contra os péptidos 4 e 6 de BIIAl, respectivamente. Painéis B e D: imunotransferências-2-D com soro pré-imune de coelhos imunizados com péptidos 4 e 6 de BIIAl, respectivamente. As setas indicam manchas especificas para anti-soros contra o péptido 4, bem como o péptido 6.
Figura 9:
Autorradiografia de um gel 2-D, tal como utilizado para as imunotransferências apresentadas nas figuras 7 e 8, apresentando apenas proteínas derivadas de B. bovis que foram marcadas com 35S-Met por marcação metabólica, antes da invasão. As setas indicam as manchas que foram identificadas como BIIAl fazendo a correspondência com imunotransferências apresentadas na figura 7, utilizando um programa de imagem.
Figura 10:
Transferências de Western 1-D de BllA3rec expressa em E. coli, reconhecida por anti-soros policlonais de coelho produzidos contra os péptidos 7 e 8. 51 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
Painel A: anti-soros de coelho anti-péptido: coluna 1: anti-péptido 7; coluna 3: anti-péptido 8; ambos em diluição sérica 1:2000.
Colunas 2 e 4: soro pré-imune de ambos os dadores de anti-soro de péptido, de coelho.
Painel B: anti-soro anti-BHA3rec de bovino: colunas 1, e 2: IgG imune purificada em 1: 200.000 de dois animais; coluna 3, soro de bovino pré-imune.
Figure 11:
Transferência de Western 2-D de proteínas de B. bovis nativas reconhecidas por anti-soro policlonal de bovino dirigido contra BIIA3rec.
Painel A: soro de bovino pré-imune.
Painel B: IgG imune purificada em Sepharose G, a 0,8 pg/ml. As setas indicam reconhecimento de anticorpo especifico para BIIA3.
Figura 12:
Ensaio de inibição da invasão de IgG imune policlonal de coelho, anti-péptido 7, que inibe a invasão do isolado de B. bovis Israel em eritrócitos de bovino. A inibição pelo controlo (soro pré-imune) foi estabelecida como 100 %.
Eixo horizontal: concentração de IgG imune purificada; eixo vertical: % relativa de eficácia de inibição da invasão com desvio padrão (n=3).
Figura 13:
Ensaio de inibição da invasão de IgG imune policlonal de bovino contra BIIAlrec, BIIA2rec, e BIIA3rec expressos em E. coli, inibindo a invasão de isolados de B. bovis de Israel e do México, em eritrócitos de bovino. A inibição pelo controlo (soro pré-imune) foi estabelecida como 100%.
Eixo horizontal: concentração de IgG final em pg/pl; 52 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
Eixo vertical: % relativa de eficácia de inibição da invasão com desvio padrão (n=2 x 2).
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Universiteit Utrecht Holding B.V. <120> Vacina de Piroplasmida < 130> 2003-010 <160> 20 <170> Patentln version 3.2
<210> 1 <211> 1818 <212> ADN <213> Babesia bovis < 2 2 0 >
<221> CDS <222> (1) .. (1818) < 4 0 0 > 1 atg cag tta cat aac aaa atg cag tea act tet ctc aaa tat aac tac 48 Met Gin Leu His Asn Lys Met Gin Ser Thr Ser Leu Lys Tyr Asn Tyr 1 5 10 15 aag cgc atg ctt tgt atg gct ctt gta cca gtt ate tta teg tea ttt 96 Lys Arg Met Leu Cys Met Ala Leu Vai Pro Vai Ile Leu Ser Ser Phe 20 25 30 ttt gcg gaa gat gct tta gct tcc aac tcc a cg ctt ttc gct ttc cac 144 Phe Ala Glu Asp Ala Leu Ala Ser Asn Ser Thr Leu Phe Ala Phe His 35 40 45 aag gaa cca aac aat cgt agg ctt acc aaa agg tet tea aga gga cag 192 Lys Glu Pro Asn Asn Arg Arg Leu Thr Lys Arg Ser Ser Arg Gly Gin 50 55 60 ttg ctc aac tea agg agg ggt teg gat gat gcg tcc gaa tet tcc gat 240 Leu Leu Asn Ser Arg Arg Gly Ser Asp Asp Ala Ser Glu Ser Ser Asp 65 70 75 80 aga tac cca ggt agg teg ggt ggc tet aag aat teg age caa tcc ccc 288 Arg Tyr Pro Gly Arg Ser Gly Gly Ser Lys Asn Ser Ser Gin Ser Pro 85 90 95 tgg ate aag tat atg caa aag ttc gac att ccc cgt aac cac ggc tet 336 Trp Ile Lys Tyr Met Gin Lys Phe Asp Ile Pro Arg Asn His Gly Ser 100 105 110 gga ate tat gtc gat ctt gga gga tat gaa tcc gtt ggt tea aaa agt 384 Gly Ile Tyr Vai Asp Leu Gly Gly Tyr Glu Ser Vai Gly Ser Lys Ser 115 120 125 tat cgt atg ccc gtt ggt aag tgc cca gta gtc ggt aaa att ata gac 432 Tyr Arg Met Pro Vai Gly Lys Cys Pro Vai Vai Gly Lys Ile Ile Asp 130 135 140 ctt gga aat ggt gee gac ttc ctc gat ccc att tea tea gac gac cca 480 Leu Gly Asn Gly Ala Asp Phe Leu Asp Pro Ile Ser Ser Asp Asp Pro 53 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
14S ISO 155 ISO agt tac cgt ggt ttg gca ttc ccc gag act gct gtg gac tct aat att 528
Ser Tyr Arg Gly Leu Ala Phe Pro Glu Thr Ala Vai Asp Ser Asn lie 165 170 175 ccc aca caa cca aag aca cgt ggt tct tca tca gca tct gcg gcc aaa 576
Pro Thr Gin Pro Lys Thr Arg Gly Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ala Lys 1B0 185 190 tta tct cct gtt tcg gcg aaa gat ctg aga cgt tgg gga tat gaa ggt 624
Leu Ser Pro Vai Ser Ala Lys Asp Leu Arg Arg Trp Gly Tyr Glu Gly 195 200 205 aat gat gta gcg aat tgc tca gaa tat gct agt aac ctc att ccc gca 672
Asn Asp Vai Ala Asn Cys Ser Glu Tyr Ala Ser Asn Leu Ile Pro Ala 210 215 220 tca gac agg agt acc aaa tat agg tat cct ttt gtt ttt gac agt gat 720
Ser Asp Arg Ser Thr Lys Tyr Arg Tyr Pro Phe Vai Phe Asp Ser Asp 225 230 235 240 aac cag atg tgt tac ata ctg tac tct gcc ata caa tac aac caa gga 768
Asn Gin Met Cys Tyr Ile Leu Tyr Ser Ala Ile Gin Tyr Asn Gin Gly 245 250 255 aat agg tat tgt gac aac gat ggt age tcc gaa gat ggt aca age tct 816
Asn Arg Tyr Cys Asp Asn Asp Gly Ser Ser Glu Asp Gly Thr Ser Ser 260 265 270 ttg ctt tgc atg aaa cct tac aag age gct gag gat gca cac tta tac 864
Leu Leu Cys Met Lys Pro Tyr Lys Ser Ala Glu Asp Ala His Leu Tyr 275 280 285 tac ggt tct gcg aaa gtt gac ccc gat tgg gaa gaa aat tgt ccc atg 912
Tyr Gly Ser Ala Lys Vai Asp Pro Asp Trp Glu Glu Asn Cys Pro Met 290 295 300 cac ceg gta agg gat gcc att ttt ggt aaa tgg tct ggt ggc tct tgt 960
His Pro Vai Arg Asp Ala Ile Phe Gly Lys Trp Ser Gly Gly Ser Cys 305 310 315 320 gtt gcc att gct cct gca ttc caa gaa tat gcc aac age act gaa gac 1008
Vai Ala Ile Ala Pro Ala Phe Gin Glu Tyr Ala Asn Ser Thr Glu Asp 325 330 335 tgt gca gcc att tta ttc gat aac tct gca act gac ttg aat ate gaa 1055
Cys Ala Ala Ile Leu Phe Asp Asn Ser Ala Thr Asp Leu Asn Ile Glu 340 345 350 gct gtt aac gaa gat ttt aat gaa ctt aaa gaa ttg acc gat ggg ctt 1104
Ala Vai Asn Glu Asp Phe Asn Glu Leu Lys Glu Leu Thr Asp Gly Leu 355 360 365 aaa aga ttg aac atg tcg aag gtt gca aac gct att ttt tct ccc ctc 1152
Lys Arg Leu Asn Met Ser Lys Vai Ala Asn Ala Ile Phe Ser Pro Leu 370 375 380 tcc aat gtt gca ggt acc agt cga att tca cgt ggt gtg ggt atg aac
Ser Asn Vai Ala Gly Thr Ser Arg Ile Ser Arg Gly Vai Gly Met Asn 1200 54 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ tgg gct aca tac gat aaa gat tet ggt atg tgt gct etc att aac gaa 1248 Trp Ala Thr Tyr Asp Lys Asp Ser Gly Met Cys Ala Leu Ile Asn Glu 405 410 415 aca cet aac tgc ttg ate ttg aac gcg gga age att gct etc acg gct 1296 Thr Pro Asn Cys Leu Ile Leu Asn Ala Gly Ser Ile Ala Leu Thr Ala 420 425 43 0 ata ggt tea cct etc gag tat gac gct gtt aac tat cct tgc cac ate 1344 Ile Glv Ser Pro Leu Glu Tyr Asp Ala Vai Asn Tyr Pro Cys His Ile 435 440 445 gac acc aat ggt tac gtt gag cca cgt gea aag aat acc aac aaa tac 1392 Asp Thr Asn Gly Tyr Vai Glu Pro Arg Ala Lys Asn Thr Asn Lys Tyr 450 455 460 ctt gat gtt cct ttc gag gtc aca act gct ttg age atg aag aca cta 1440 Leu Asp Vai Pro Phe Glu Vai Thr Thr Ala Leu Ser Met Lys Thr Leu 465 470 475 480 aaa tgc gat gee tat gtt cac acc aag tac tet gac agt tgt ggt acc 1488 Lys Cys Asp Ala Tyr Vai His Thr Lys Tyr Ser Asp Ser Cys Gly Thr 485 490 495 tat ttc ctt tgc tea gac gtc aaa cct aac tgg ttc att agg ttc tta 1536 Tyr Phe Leu Cys Ser Asp Vai Lys Pro Asn Trp Phe Ile Arg Phe Leu 500 505 510 cac atg ate gga etc tac aac aca aag cgt ate gta ata ttc gtg tgc 1584 His Met Ile Gly Leu Tyr Asn Thr Lys Arg Ile Vai Ile Phe Vai Cys 515 520 525 tgt acc act acc gee ate gtt etc act ate tgg ata tgg aaa cga ttc 1632 Cys Thr Thr Thr Ala Ile Vai Leu Thr Ile Trp Ile Trp Lys Arg Phe 530 535 540 ate aag gct aag aaa gag ccg gee cct cca agt ttc gac aaa tac cta 1680 Ile Lys Ala Lys Lys Glu Pro Ala Pro Pro Ser Phe Asp Lys Tyr Leu 545 550 555 560 age aac tat gat tat gat aca acc cta gat gee gac aac gaa acg gaa 1728 Ser Asn Tyr Asp Tyr Asp Thr Thr Leu Asp Ala Asp Asn Glu Thr Glu 565 570 575 cag cgt ttg gat tcc tet gct tat age tgg gga gag gct gta caa aga 1776 Gin Arg Leu Asp Ser Ser Ala Tyr Ser Trp Gly Glu Ala Vai Gin Arg 580 585 590 cca agt gat gtc acc cct gta aaa etc tet aaa ate aac taa 1818 Pro Ser Asp Vai Thr Pro Vai Lys Leu Ser Lys Ile Asn 595 600 605
<210> 2 <211> 605 < 212 > PRT <213> Babesia bovis 55
ΕΡ 1 664 097/PT < 4 0 0 > 2
Met Gin Leu His Asn Lys Met Gin Ser Thr Ser Leu Lys Tyr Asn Tyr 15 10 15
Lys Arg Met Leu Cys Met Ala Leu Vai Pro Vai Ile Leu Ser Ser Phe 20 25 30
Phe Ala Glu Asp Ala Leu Ala Ser Asn Ser Thr Leu Phe Ala Phe His 35 40 45
Lys Glu Pro Asn Asn Arg Arg Leu Thr Lys Arg Ser Ser Arg Gly Gin 50 55 60
Leu Leu Asn Ser Arg Arg Gly Ser Asp Asp Ala Ser Glu Ser Ser Asp 65 70 75 80
Arg Tyr Pro Gly Arg Ser Gly Gly Ser Lys Asn Ser Ser Gin Ser Pro 85 90 95
Trp Ile Lys Tyr Met Gin Lys Phe Asp Ile Pro Arg Asn His Gly Ser 100 105 110
Gly Ile Tyr Vai Asp Leu Gly Gly Tyr Glu Ser Vai Gly Ser Lys Ser 115 120 125
Tyr Arg Met Pro Vai Gly Lys Cys Pro Vai Vai Gly Lys Ile Ile Asp 130 135 140
Leu Gly Asn Gly Ala Asp Phe Leu Asp Pro Ile Ser Ser Asp Asp Pro 145 150 155 160
Ser Tyr Arg Gly Leu Ala Phe Pro Glu Thr Ala Vai Asp Ser Asn Ile 165 170 175
Pro Thr Gin Pro Lys Thr Arg Gly Ser Ser Ser Ala Ser Ala Ala Lys 1B0 185 190
Leu Ser Pro Vai Ser Ala Lys Asp Leu Arg Arg Trp Gly Tyr Glu Gly 195 200 205
Asn Asp Vai Ala Asn Cys Ser Glu Tyr Ala Ser Asn Leu Ile Pro Ala 210 215 220
Ser Asp Arg Ser Thr Lys Tyr Arg Tyr Pro Phe Vai Phe Asp Ser Asp 225 230 235 240 56 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
Asn Gin Met Cys Tyr He Leu Tyr Ser Ala Ile Gin Tyr Asn Gin Gly 245 250 255
Asn Arg Tyr Cys Asp Asn Asp Gly Ser Ser Glu Asp Gly Thr Ser Ser 250 265 270
Leu Leu Cys Met Lys Pro Tyr Ays Ser Ala Glu Asp Ala His Leu Tyr 275 280 285
Tyr Gly Ser Ala Lys Vai Asp Pro Asp Trp Glu Glu Asn Cys Pro Met 290 295 300
His Pro Vai Arg Asp Ala Ile Phe Gly Lys Trp Ser Gly Gly Ser Cys 305 ' 310 315 320
Vai Ala Ile Ala Pro Ala Phe Gin Glu Tyr Ala Asn Ser Thr Glu Asp 325 330 335
Cys Ala Ala Ile Leu Phe Asp Asn Ser Ala Thr Asp Leu Asn Ile Glu 340 345 350
Ala Vai Asn Glu Asp Phe Asn Glu Leu Lys Glu Leu Thr Asp Gly Leu 355 360 365
Lys Arg Leu Asn Met Ser Lys Vai Ala Asn. Ala Ile Phe Ser Pro Leu 370 375 380
Ser Asn Vai Ala Gly Thr Ser Arg Ile Ser Arg Gly Vai Gly Met Asn 385 390 395 400
Trp Ala Thr Tyr Asp Lys Asp Ser Gly Met Cys Ala Leu Ile Asn Glu 405 410 415
Thr Pro Asn Cys Leu Ile Leu Asn Ala Gly Ser Ile Ala Leu Thr Ala 420 ’ 425 430
Ile Gly Ser Pro Leu Glu Tyr Asp Ala Vai Asn Tyr Pro Cys His Ile 435 440 445
Asp Thr Asn Gly Tyr Vai Glu Pro Arg Ala Lys Asn Thr Asn Lys Tyr 450 455 460
Leu Asp Vai Pro Phe Glu Vai Thr Thr Ala Leu Ser Met Lys Thr Leu 465 470 475 480
Lys Cys Asp Ala Tyr Vai His Thr Lys Tyr Ser Asp Ser Cys Gly Thr 57 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ 485
Tyr Phe Leu Cys Ser Asp Vai Lys 500
His Met Ile Gly Leu Tyr Asn Thr 515 520
Cys Thr Thr Thr Ala Ile Vai Leu 530 535
Ile Lys Ala Lys Lys Glu Pro Ala 545 550 490 495
Pro Asn Trp Phe Ile Arg Phe Leu 505 510
Lys Arg Ile Vai Ile Phe Vai Cys 525
Thr Ile Trp Ile Trp Lys Arg Phe 540
Pro Pro Ser Phe Asp Lys Tyr Leu 555 560
Ser Asn Tyr Asp Tyr Asp Thr Thr Leu Asp Ala Asp Asn Glu Thr Glu 565 570 575
Gin Arg Leu Asp Ser Ser Ala Tyr Ser Trp Gly Glu Ala Vai Gin Arg 580 585 590
Pro Ser Asp Vai Thr Pro Vai Lys Leu Ser Lys Ile Asn 595 600 605
<210> 3 <211> 2349 <212> ADN <213> Theileria annulata < 2 2 0 > <221> CDS <222> (1)..(2349) < 4 0 0 > 3 atg aaa aaa ata gga ctt aaa att agg gea caa aag gat aaa tta aat Met Lys Lys Ile Gly Leu Lys Ile Arg Ala Gin Lys Asp Lys Leu Asn 1 5 10 15 cct gtg tta gga age aac tet gac cct teg gaa gag tat gat tea ttc Pro Vai Leu Gly Ser Asn Ser Asp Pro Ser Glu Glu Tyr Asp Ser Phe 20 25 30 cag caa aat gtt ttc act cat caa cca acc caa cta cac aaa tet cat Gin Gin Asn Vai Phe Thr His Gin Pro Thr Gin Leu His Lys Ser His 35 40 45 cac tac att aca cac cag aaa aaa acc age caa cac ate gac gat tta His Tyr Ile Thr His Gin Lys Lys Thr Ser Gin His Ile Asp Asp Leu 50 55 60 aat ttt tat aat gga aaa ttt aat caa aag age aga att ggt cca ggg Asn Phe Tyr Asn Gly Lys Phe Asn Gin Lys Ser Arg Ile Gly Pro Gly 48 96 144 192 240 58 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ 65 70 75 80 aag gta gta aat aac agt agg aat ctg gta gaa ggt gaa aca cta tct 288 Lys Vai Vai Asn Asn Ser Arg Asn Leu Vai Glu Gly Glu Thr Leu Ser 85 90 95 aag gat gac aat aaa aca aaa tct aaa ata aag tca aaa aca gca tca 336 Lys Asp Asp Asn Lys Thr Lys Ser Lys Ile Lys Ser Lys Thr Ala Ser 100 105 110 att tta cct aga ctt tta aaa tct tta tca ttt tta gct gtt tta ggg 384 Ile Leu Pro Arg Leu Leu Lys Ser Leu Ser Phe Leu Ala Vai Leu Gly 115 120 125 tca att aat tca ttt tca tta gca tta gag gaa cct ttt act caa cac 432 Ser Ile Asn Ser Phe Ser Leu Ala Leu Glu Glu Pro Phe Thr Gin His 130 135 140 act tct aac cga acg ccc ttt gaa gta tca tta att caa age aac age 480 Thr Ser Asn Arg Thr Pro Phe Glu Vai Ser Leu Ile Gin Ser Asn Ser 145 ISO 155 160 agt tta tcg cct att cat aat tct tca act caa aat tca agt cat cac 528 Ser Leu Ser Pro Ile His Asn Ser Ser Thr Gin Asn Ser Ser His His 165 170 175 aac ggt ttt agt ggt agt acc gtt aat aat acc tca tta ata gag aca 576 Asn Gly Phe Ser Gly Ser Thr Vai Asn Asn Thr Ser Leu Ile Glu Thr 180 185 190 agg aat aac gta tta aac aga aca cta ggt aga ttc gga tca ttt ttg 624 Arg Asn Asn Vai Leu Asn Arg Thr Leu Gly Arg Phe Gly Ser Phe Leu 195 200 205 caa tca gga ttg ata age agt aga gca gac aaa aag aag cgg tct ggt 672 Gin Ser Gly Leu Ile Ser Ser Arg Ala Asp Lys Lys Lys Arg Ser Gly 210 215 220 atg aat aga aga ggc cct aag ggg aag aaa ggg aag gga gga gaa gac 720 Met Asn Arg Arg Gly Pro Lys Gly Lys Lys Gly Lys Gly Gly Glu Asp 225 230 235 240 gaa gaa aag agg aac aag tgg acc gat ttc atg gca aag ttt gat ate 768 Glu Glu Lys Arg Asn Lys Trp Thr Asp Phe Met Ala Lys Phe Asp Ile 245 250 255 gct aag gtc cac ggt tca ggg gtt tac gta gat ttg ggt gaa tct gee 816 Ala Lys Vai His Gly Ser Gly Vai Tyr Vai Asp Leu Gly Glu Ser Ala 260 265 270 acc gtt ggc agt tat gac tac agg atg cct ata gga aaa tgt cca gtt 864 Thr Vai Gly Ser Tyr Asp Tyr Arg Met Pro Ile Gly Lys Cys Pro Vai 275 280 285 gta ggt aag gca ate ata ctc gag aat gga gct gat ttt ttg age age 912 Vai Gly Lys Ala Ile Ile Leu Glu Asn Gly Ala Asp Phe Leu Ser Ser 290 295 300 ata acc cat cat gac ccc aag gag aga ggg ctg ggg ttc cct gct aca 960 Ile Thr His His Asp Pro Lys Glu Arg Gly Leu Gly Phe Pro Ala Thr 305 310 315 320 59 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ aaa gtt gee tca aat tca tca aaa ctg gac atg gag aac cag ctc tta 1008 Lys Vai Ala Ser Asn Ser Ser Lys Leu Asp Met Glu Asn Gin Leu Leu 325 330 335 tca cca att agt gct cag gtc cta agg age tgg aat tat aaa cac gaa 1056 Ser Pro ile Ser Ala Gin Vai Leu Arg Ser Trp Asn Tyr Lys His Glu 340 345 350 tca gat tta agt aat tgt gct gag tat teg aga aac att gtt ccg ggc 1104 Ser Asp Leu Ser Asn Cys Ala Glu Tyr Ser Arg Asn ile val Pro Gly 355 360 365 agt aat cgt aat tca aag tat cgt tac ccg ttt gta tat gat gag tet 1152 Ser Asn Arg Asn Ser Lys Tyr Arg Tyr Pro Phe Vai Tyr Asp Glu Ser 370 375 380 gag aag ctt tgt tat att tta tat agt ccc atg caa tat aat cag ggc 1200 Glu Lys Leu Cys Tyr Ile Leu Tyr Ser Pro Met Gin Tyr Asn Gin Gly 385 390 395 400 gta aag tac tgt gac caa gac tet ccg gac gaa gga act age agt tta 1248 Vai Lys Tyr Cys Asp Gin Asp Ser Pro Asp Glu Gly Thr Ser Ser Leu 405 410 415 gct tgt atg tac ccg gat aag age aag gag gat tca cac cta ttt tac 1296 Ala Cys Met Tyr Pro Asp Lys Ser Lys Glu Asp Ser His Leu Phe Tyr 420 425 430 gga acc age ggt ctt cac atg gac tgg cct gta gtt tgc cca gtt tac 1344 Gly Thr Ser Gly Leu His Met Asp Trp Pro Vai Vai Cys Pro Val Tyr 435 440 445 cct att aga gat teg att ttt gga tcc tac gac gac caa aag gac gaa 1392 Pro Ile Arg Asp Ser Ile Phe Gly Ser Tyr Asp Asp Gin Lys Asp Glu 450 455 460 tgt gtt cca att gag ccg ata ttt gag gag gag gct gaa gat tat gag 1440 Cys Vai Pro Ile Glu Pro Ile Phe Glu Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Glu 455 470 475 480 gca tgt gee aag ata att ttc gag tat tet cca agt gat gtt gat att 1488 Ala Cys Ala Lys Ile Ile Phe Glu Tyr Ser Pro Ser Asp Val Asp Ile 485 490 495 age aca aat aac cag aag ctt tca gac gtc gac ctt tac aag gag gcg 1536 Ser Thr Asn Asn Gin Lys Leu Ser Asp Vai Asp Leu Tyr Lys Glu Ala 500 505 510 atg aat aat gga aag ctg age act gct ctt tca att atg ttt gct cct 1584 Met Asn Asn Gly Lys Leu Ser Thr Ala Leu Ser Ile Met Phe Ala Pro 515 520 525 a99 tac tet gag gat cgt ccg ate tat act aaa ggt gtc ggt ata aac . 1632 Arg Tyr Ser Glu Asp Arg Pro Ile Tyr Thr Lys Gly val Gly Ile Asn 530 535 540 tgg gct aca tac tec gtc gag gaa aag aaa tgt aac att ctc gac gtt 1680 Trp Ala Thr Tyr Ser Vai Glu Glu Lys Lys Cys Asn Ile Leu Asp Val 545 550 555 560 60 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ gtt ccc age tgt ctt att ata agt aac ggc cac tat gee ctt aca agt 1728 Vai Pro Ser Cys Leu Ile Ile Ser Asn Gly His Tyr Ala Leu Thr Ser 565 570 575 ctc age tea ccc aat gaa gag gat gct ata aat tac ccc tgc gat ate 1776 Leu Ser Ser Pro Asn Glu Glu Asp Ala Ile Asn Tyr Pro Cys Asp Ile 580 585 590 gtt cag ggc aag ggg ttt ttg aag aac cca aac ggt gga aaa aag aat 1824 Vai Gin Gly Lys Gly Phe Leu Lys Asn Pro Asn Gly Gly Lys Lys Asn 595 600 605 gct cag gaa ccg ccc aag gaa cct gaa cct gaa gaa cct aag aag gag 1872 Ala Gin Glu Pro Pro Lys Glu Pro Glu Pro Glu Glu Pro Lys Lys Glu 610 615 620 ggt gct gaa aac aaa ccc aaa gag aaa ggt aaa tet gag aaa aag aat 1920 Gly Ala Glu Asn Lys Pro Lys Glu Lys Gly Lys Ser Glu Lys Lys Asn 525 630 635 640 gaa aaa tet atg cct tea gga cca ttc a cg cca tac act age ttg aag 1968 Glu Lys Ser Met Pro Ser Gly Pro Phe Thr Pro Tyr Thr Ser Leu Lys 645 650 655 aag gag ggt ttc gag tgc agt aaa tac act gtt gag cgg gtg aac aaa 2016 Lys Glu Gly Phe Glu Cys Ser Lys Tyr Thr Vai Glu Arg Val Asn Lys 660 665 670 age tgc ggc gtt tac tat gaa tgc tea gaa a cg cct gta tta ttt acc 2064 Ser Cys Gly Vai Tyr Tyr Glu Cys Ser Glu Thr Pro Vai Leu Phe Thr 675 680 685 aag aag aat agg att tat cta tac ate ata ttg gea gta teg ctt gta 2112 Lys Lys Asn Arg Ile Tyr Leu Tyr Ile Ile Leu Ala Val Ser Leu Val 690 695 700 gta ctg gee gtc tta gee tac ttt gga tac agg tac tac agt aag aat 2160 Vai Leu Ala Vai Leu Ala Tyr Phe Gly Tyr Arg Tyr Tyr Ser Lys Asn 705 710 715 720 cac ttg aaa aaa cac aat tcc cag ata tat gaa gat gat aac gtg aac 2208 His Leu Lys Lys His Asn Ser Gin Ile Tyr Glu Asp Asp Asn Val Asn 725 730 735 aac tac tac aat gag gac ttt gat gac gaa caa gat cgg gat gaa tac 2256 Asn Tyr Tyr Asn Glu Asp Phe Asp Asp Glu Gin Asp Arg Asp Glu Tyr 740 745 750 gct teg aat gtt aga ggt gat caa ate tgg age aga cac act cca gac 2304 Ala Ser Asn Vai Arg Gly Asp Gin Ile Trp Ser Arg His Thr Pro Asp 755 760 765 aga tet gaa gtt act cca gtc aga ate tet agg tta aac cat taa 2349 Arg Ser Glu Vai Thr Pro Vai Arg Ile Ser Arg Leu Asn His 770 775 780 <210> 4 <211> 782 <212> PRT <213> Theileria 61
ΕΡ 1 664 097/PT < 4 0 0 > 4
Met Lys Lys Ile Gly Leu Lys Ile Arg Ala Gin Lys Asp Lys Leu Asn 15 10 15
Pro Vai Leu Gly Ser Asn Ser Asp Pro Ser Glu Glu Tyr Asp Ser Phe 20 25 30
Gin Gin Asn Vai Phe Thr His Gin Pro Thr Gin Leu His Lys Ser His 35 40 45
His Tyr Ile Thr His Gin Lys Lys Thr Ser Gin His Ile Asp Asp Leu 50 55 60
Asn Phe Tyr Asn Gly Lys Phe Asn Gin Lys Ser Arg IIe Gly Pro Gly 65 70 75 80
Lys Vai Vai Asn Asn Ser Arg Asn Leu Vai Glu Gly Glu Thr Leu Ser 85 90 95
Lys Asp Asp Asn Lys Thr Lys Ser Lys Ile Lys Ser Lys Thr Ala Ser 100 105 110
Ile Leu Pro Arg Leu Leu Lys Ser Leu Ser Phe Leu Ala Vai Leu Gly 115 120 125
Ser lie Asn Ser Phe Ser Leu Ala Leu Glu Glu Pro Phe Thr Gin His 130 135 140
Thr Ser Asn Arg Thr Pro Phe Glu Vai Ser Leu Ile Gin Ser Asn Ser 145 150 155 160
Ser Leu Ser Pro Ile His Asn Ser Ser Thr Gin Asn Ser Ser His His 165 170 175
Asn Gly Phe Ser Gly Ser Thr Vai Asn Asn Thr Ser Leu Ile Glu Thr 180 185 190
Arg Asn Asn Vai Leu Asn Arg Thr Leu Gly Arg Phe Gly Ser Phe Leu 195 200 205
Gin Ser Gly Leu Ile Ser Ser Arg Ala Asp Lys Lys Lys Arg Ser Gly 210 215 220
Met Asn Arg Arg Gly Pro Lys Gly Lys Lys Gly Lys Gly Gly Glu Asp 62 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ 225 230 235 240
Glu Glu Lys Arg Asn Lys Trp Thr Asp Phe Met Ala Lys Phe Asp lie 245 250 255
Ala Lys Vai His Gly Ser Gly Vai Tyr Vai Asp Leu Gly Glu Ser Ala 250 265 270
Thr Vai Gly Ser Tyr Asp Tyr Arg Met Pro Ile Gly Lys Cys Pro Vai 275 280 2B5
Vai Gly Lys Ala Ile Ile Leu Glu Asn Gly Ala Asp Phe Leu Ser Ser 290 295 300
Ile Thr His His Asp Pro Lys Glu Arg Gly Leu Gly Phe Pro Ala Thr 305 310 315 320
Lys Vai Ala Ser Asn Ser Ser Lys Leu Asp Met Glu Asn Gin Leu Leu 325 330 335
Ser Pro Ile Ser Ala Gin Vai Leu Arg Ser Trp Asn Tyr Lys His Glu 340 345 350
Ser Asp Leu Ser Asn Cys Ala Glu Tyr Ser Arg Asn Ile vai Pro Gly 355 360 365
Ser Asn Arg Asn Ser Lys Tyr Arg Tyr Pro Phe Vai Tyr Asp Glu Ser 370 375 380
Glu Lys Leu Cys Tyr Ile Leu Tyr Ser Pro Met Gin Tyr Asn Gin Gly 385 390 395 400
Vai Lys Tyr Cys Asp Gin Asp Ser Pro Asp Glu Gly Thr Ser Ser Leu 405 410 415
Ala Cys Met Tyr Pro Asp Lys Ser Lys Glu Asp Ser His Leu Phe Tyr 420 425 430
Gly Thr Ser Gly Leu His Met Asp Trp Pro Vai Vai Cys Pro Vai Tyr 435 440 445
Pro Ile Arg Asp Ser Ile Phe Gly Ser Tyr Asp Asp Gin Lys Asp Glu 450 455 460
Cys Vai Pro Ile Glu Pro Ile Phe Glu Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Glu 465 47D 475 480 63 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
Tyr Ser Pro Ser Asp Vai Asp Ile 490 495 Asp Vai Asp Leu Tyr Lys Glu Ala 505 510 Ala Leu Ser Ile Met Phe Ala Pro 525 Tyr Thr Lys Gly Vai Gly Ile Asn 540 Lys Lys Cys Asn Ile Leu Asp Vai 555 560 Asn Gly His Tyr Ala Leu Thr Ser 570 575 Ala Ile Asn Tyr Pro Cys Asp Ile 585 590 Asn Pro Asn Gly Gly Lys Lys Asn 605 Glu Pro Glu Glu Pro Lys Lys Glu 620 Lys Gly Lys Ser Glu Lys Lys Asn 635 640 Phe Thr Pro Tyr Thr Ser Leu Lys 650 655 Tyr Thr Vai Glu Arg Vai Asn Lys 665 670 Ser Glu Thr Pro Vai Leu Phe Thr 685 Ile Ile Leu Ala Vai Ser Leu Vai 700
Ala Cys Ala Lys Ile lie Phe Glu 485
Ser Thr Asn Asn Gin Lys Leu Ser 500
Met Asn Asn Gly Lys Leu Ser Thr 515 520
Arg Tyr Ser Glu Asp Arg Pro Ile 530 535
Trp Ala Thr Tyr Ser Vai Glu Glu 545 550
Vai Pro Ser Cys Leu Ile Ile Ser 565
Leu Ser Ser Pro Asn Glu Glu Asp 580
Vai Gin Gly Lys Gly Phe Leu Lys 595 600
Ala Gin Glu Pro Pro Lys Glu Pro 610 615
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Glu Lys Ser Met Pro Ser Gly Pro 645
Lys Glu Gly Phe Glu Cys Ser Lys 660
Ser Cys Gly Vai Tyr Tyr Glu Cys 675 680
Lys Lys Asn Arg Ile Tyr Leu Tyr 690 695
Vai Leu Ala Vai Leu Ala Tyr 705 710
Phe Gly Tyr Arg Tyr Tyr Ser Lys Asn 715 720 64 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
His Leu Lys Lys His Asn Ser Gin Ile Tyr Glu Asp Asp Asn Vai Asn 725 730 735
Asn Tyr Tyr Asn Glu Asp Phe Asp Asp Glu Gin Asp Arg Asp Glu Tyr 740 745 750
Ala Ser Asn Vai Arg Gly Asp Gin Ile Trp Ser Arg His Thr Pro Asp 755 760 765
Arg Ser Glu Vai Thr Pro Vai Arg Ile Ser Arg Leu Asn His 770 775 780
<210> 5 <211> 1968 <212> ADN <213> Babesia bovis < 2 2 0 > <221> CDS <222> (1)..(1968) < 4 0 0 > 5 atg ate ggt tac ate aag att ctg gcc tet gtg ccc ctg tta agt tta 48 Met Ile Gly Tyr Ile Lys Ile Leu Ala Ser vai Pro Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 gcc ttt tta gct aca acg ggg ata cat gct ttt gcg gac aaa ggt att 96 Ala Phe Leu Ala Thr Thr Gly Ile His Ala Phe Ala Asp Lys Gly Ile 20 25 30 ggt tea cca aag ggg aaa caa tgc aag aag caa ctt gac ttt teg att 144 Gly Ser Pro Lys Gly Lys Gin Cys Lys Lys Gin Leu Asp Phe Ser Ile 35 40 45 gtg gta gat gaa tet gct agt ata teg gat gat caa tgg gag ggt cag 192 Vai Vai Asp Glu Ser Ala Ser Ile Ser Asp Asp Gin Trp Glu Gly Gin 50 55 60 atg att cca ttt ttg agg aat ttg att cat acc gtt gac ctt gac aac 240 Met Ile Pro Phe Leu Arg Asn Leu Ile His Thr Vai Asp Leu Asp Asn 65 70 75 80 act gac ata cgt ctt teg ctt acc act tac tea act cca act ege cag 288 Thr Asp Ile Arg Leu Ser Leu Thr Thr Tyr Ser Thr Pro Thr Arg Gin 85 90 95 ata ttt acg ttt ttg gat gct gct gea age agt acc agg ctc gea ctc 336 Ile Phe Thr Phe Leu Asp Ala Ala Ala Ser Ser Thr Arg Leu Ala Leu 100 105 110 a cg aaa ctt gat tgg atg aac ggt acc aaa gct agg tat ggt atg acc 384 Thr Lys Leu Asp Trp Met Asn Gly Thr Lys Ala Arg Tyr Gly Met Thr 115 120 125 65 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ tac act ggc agg gct ctg aac tac gtt cgt aag gct ata cta cca tat 432 Tyr Thr Gly Arg Ala Leu Asn Tyr Vai Arg Lys Ala He Leu Pro Tyr 130 135 140 ggt cgc aag aat gta ccc aag gea ctg tta ctg ate act gat gga gta 480 Gly Arg Lys Asn Vai Pro Lys Ala Leu Leu Leu Ile Thr Asp Gly Val 145 150 155 160 tct tcg gat gga agt tac act gea cag gtt gcg gct atg ctt cgt gat 528 Ser Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Ala Gin Vai Ala Ala Met Leu Arg Asp 165 170 175 gaa ggt gta aat gta atg gtt att ggt gtc ggt gat gta aat gtt gct 576 Glu Gly Vai Asn Vai Met Vai Ile Gly Vai Gly Asp Vai Asn Val Ala 180 185 190 gaa tgc cgt ggc ata gta gga tgt gat gga ata atg gat tgt cct atg 624 Glu Cys Arg Gly Ile Vai Gly Cys Asp Gly Ile Met Asp Cys Pro Met 195 200 205 ttc aag cag acc aac tgg aag gat ate atg ggc ctc ttt aac agt tta 672 Phe Lys Gin Thr Asn Trp Lys Asp Ile Met Gly Leu Phe Asn Ser Leu 210 215 220 atg aag gag gta tgt gat att tta cct cag gac gct gtt tgt gag cct 720 Met Lys Glu Vai Cys Asp Ile Leu Pro Gin Asp Ala Val Cys Glu Pro 225 230 235 240 gta tgg gea gaa tgg tca tct tgt aac ggg gaa tgt ggc gtt cct ggt 758 Vai Trp Ala Glu Trp Ser Ser Cys Asn Gly Glu Cys Gly Val Pro Gly 245 250 255 aaa cga act cgt gct ctt ttg gac ctc cga atg att gaa aag CCC gta 816 Lys Arg Thr Arg Ala Leu Leu Asp Leu Arg Met Ile Glu Lys Pro Val 260 265 270 aat ggc tcg aat gga caa ccg ggt aaa tca tgt gag gat cag aag atg 864 Asn Gly Ser Asn Gly Gin Pro Gly Lys Ser Cys Glu Asp Gin Lys Met 275 280 285 aac ttc tta ccc caa tca gag aca tgc acc ata gaa tgc aat cat gag 912 Asn Phe Leu Pro Gin Ser Glu Thr Cys Thr Ile Glu Cys Asn His Glu 230 295 300 cct gtg cca age tcg ccg gaa cct gta tca gat gat atg gat cac cca 960 Pro Vai Pro Ser Ser Pro Glu Pro Vai Ser Asp Asp Met Asp His Pro 305 310 315 320 gaa cca act cct gtt aca ccg gaa ggt gac atg gat aaa tct cat tcc 1008 Glu Pro Thr Pro Vai Thr Pro Glu Gly Asp Met Asp Lys Ser His Ser 325 330 335 cat tcg age att cca tcc acc cct gat atg cca tca agt cac agt gat 1056 His Ser Ser Ile Pro Ser Thr Pro Asp Met Pro Ser Ser His Ser Asp 340 345 350 atg tca tca age cct act gat atg tca tca age cct act gac atg tca 1104 Met Ser Ser Ser Pro Thr Asp Met Ser Ser Ser Pro Thr Asp Met Ser 355 360 365 tca age cct act gac atg tca tca agt cac agt gac atg cca tca act 1152 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ 6 6
Ser Ser Pro Thr Asp Met Ser Ser Ser His Ser Asp Met Pro Ser Thr 370 375 380 cct act ggc atg tca tca agt cac agt gat atg cca tca agt cac agt 1200 Pro Thr Gly Met Ser Ser Ser His Ser Asp Met Pro Ser Ser His Ser 385 390 395 400 gat atg cca tca age cac agt gat atg tca tca age cct act gac atg 1248 Asp Met Pro Ser Ser His ser Asp Met Ser Ser Ser Pro Thr Asp Met 405 410 415 tca tca agt cac gct gat act cgt gta gga aat acc gat gaa gaa cat 1296 Ser Ser Ser His Ala Asp Thr Arg Val Gly Asn Thr Asp Glu Glu His 420 425 430 aae cac agg aaa gat atg gat gtc aag ttc ccc gaa aat atg gat gat 1344 Asn His Arg Lys Asp Met Asp Val Lys Phe Pro Glu Asn Met Asp Asp 435 440 445 ate cca gtc gag gat aat cct ata ccc aca gat cct aga cat ggc gtc 1392 Ile Pro Vai Glu Asp Asn Pro Ile Pro Thr Asp Pro Arg His Gly Val 450 455 460 gaa cca teg cct tet gat gtg ate cct gag gat gac caa ctt cgt agg 1440 Glu Pro Ser Pro Ser Asp Val Ile Pro Glu Asp Asp Gin Leu Arg Arg 465 470 475 480 acg ctt gaa atg cag ege gaa gag gac cta aag aag gaa ttg atg ctc 1488 Thr Leu Glu Met Gin Arg Glu Glu Asp Leu Lys Lys Glu Leu Met Leu 485 490 495 caa cat gaa ctg aag Ctt cag gaa gaa aag gaa agg gea gct att tta 1536 Gin His Glu Leu Lys Leu Gin Glu Glu Lys Glu Arg Ala Ala Ile Leu 500 505 510 gag aat aac act cct tat gga tcc gee act tcc gtg teg caa gac ggt 1584 Glu Asn Asn Thr Pro Tyr Gly Ser Ala Thr Ser Val Ser Gin Asp Gly 515 520 525 gaa tet cca act ggc gta ccc caa agt age gag acc gat gea ata cgt 1632 Glu Ser Pro Thr Gly Vai Pro Gin Ser Ser Glu Thr Asp Ala Ile Arg 530 535 54 0 cac gag gtg tat gac gat cac ccc gag gaa tet gaa aac acc ggg att 1680 His Glu Vai Tyr Asp Asp His Pro Glu Glu Ser Glu Asn Thr Gly Ile 545 550 555 560 aat gct gat gtg acc gaa tet gag gac tat gag ggt gaa aaa caa aag 1728 Asn Ala Asp Vai Thr Glu Ser Glu Asp Tyr Glu Gly Glu Lys Gin Lys 555 570 575 gac gaa tca aat gaa cgt teg acc age aac act act aag att gee ggc 1776 Asp Glu Ser Asn Glu Arg Ser Thr Ser Asn Thr Thr Lys Ile Ala Gly 580 585 590 ggt gct cta cta ggt ctt ctt ctc ctt ggt gac ggt ggt gga tac gct 1824 Gly Ala Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Gly Ala Gly Gly Gly Tyr Ala 555 600 605 atg tac aaa aag aac aag aca cct act gtt gag aca ggt tca ggt gat 1872 Met Tyr Lys Lys Asn Lys Thr Pro Thr Val Glu Thr Gly Ser Gly Asp 610 615 620 tac act ggg gee gac gag agt tca gaa ccc atg aag gag ggt gac aca 1920 Tyr Thr Gly Ala Asp Glu Ser Ser Glu Pro Met Lys Glu Gly Asp Thr 625 630 635 640 tac acc gtc act gag ttt gac aac aac att tgg ggc gag gea gcg taa 1968 Tyr Thr val Thr Glu Phe Asp Asn Asn Ile Trp Gly Glu Ala Ala 645 650 655 EP 1 6 64 097/PT <210> 6 <211> 655 <212> PRT <213> Babesia bovis < 4 0 0 > 6
Met He Gly Tyr Ile Lys Ile Leu Ala Ser Vai Pro Leu Leu Ser Leu 15 10 15
Ala Phe Leu Ala Thr Thr Gly Ile His Ala Phe Ala Asp Lys Gly Ile 20 25 30
Gly Ser Pro Lys Gly Lys Gin Cys Lys Lys Gin Leu Asp Phe Ser Ile 35 40 45
Vai Vai Asp Glu Ser Ala Ser Ile Ser Asp Asp Gin Trp Glu Gly Gin SO 55 60
Met Ile Pro Phe Leu Arg Asn Leu Ile His Thr Vai Asp Leu Asp Asn 65 70 75 80
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Thr Lys Leu Asp Trp Met Asn Gly Thr Lys Ala Arg Tyr Gly Met Thr 115 120 125
Tyr Thr Gly Arg Ala Leu Asn Tyr Vai Arg Lys Ala Ile Leu Pro Tyr 130 135 140
Gly Arg Lys Asn Vai Pro Lys Ala Leu Leu Leu Ile Thr Asp Gly Vai 145 150 155 160
Ser Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Ala Gin Vai Ala Ala Met Leu Arg Asp 165 170 175 68 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
Glu Gly Vai Asn Vai Met Vai Ile Gly Vai Gly Asp Vai Asn Vai Ala 180 185 190
Glu Cys Arg Gly Ile Vai Gly Cys Asp Gly Ile Met Asp Cys Pro Met 195 200 205
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Vai Trp Ala Glu Trp Ser Ser Cys Asn Gly Glu Cys Gly Vai Pro Gly 245 250 255
Lys Arg Thr Arg Ala Leu Leu Asp Leu Arg Met Ile Glu Lys Pro Vai 260 265 270
Asn Gly Ser Asn Gly Gin Pro Gly Lys Ser Cys Glu Asp Gin Lys Met 275 280 285
Asn Phe Leu Pro Gin Ser Glu Thr Cys Thr Ile Glu Cys Asn His Glu 290 295 300
Pro Vai Pro Ser Ser Pro Glu Pro Vai Ser Asp Asp Met Asp His Pro 305 310 315 320
Glu Pro Thr Pro Vai Thr Pro Glu Gly Asp Met Asp Lys Ser His Ser 325 330 335
His Ser Ser Ile Pro Ser Thr Pro Asp Met Pro Ser Ser His Ser Asp 340 345 350
Met Ser Ser Ser Pro Thr Asp Met Ser Ser Ser Pro Thr Asp Met Ser 355 360 365
Ser Ser Pro Thr Asp Met Ser Ser Ser His Ser Asp Met Pro Ser Thr 370 375 380
Pro Thr Gly Met Ser Ser Ser His Ser Asp Met Pro Ser Ser His Ser 385 390 395 400
Asp Met Pro Ser Ser His Ser Asp Met Ser Ser Ser Pro Thr Asp Met 405 410 415 69 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
Ser Ser Ser His Ala Asp Thr Arg Vai Gly Asn Thr Asp Glu Glu His 420 425 430
Asn His Arg Lys Asp Met Asp Vai Lys Phe Pro Glu Asn Met Asp Asp 435 440 445
Ile Pro Vai Glu Asp Asn Pro Ile Pro Thr Asp Pro Arg His Gly Vai 450 455 460
Glu Pro Ser Pro Ser Asp Vai Ile Pro Glu Asp Asp Gin Leu Arg Arg 465 470 475 480
Thr Leu Glu Met Gin Arg Glu Glu Asp Leu Lys Lys Glu Leu Met Leu 485 490 495
Gin His Glu Leu Lys Leu Gin Glu Glu Lys Glu Arg Ala Ala Ile Leu 500 505 510
Glu Asn Asn Thr Pro Tyr Gly Ser Ala Thr Ser Vai Ser Gin Asp Gly 515 520 525
Glu Ser Pro Thr Gly Vai Pro Gin Ser Ser Glu Thr Asp Ala Ile Arg 530 535 540
His Glu Vai Tyr Asp Asp His Pro Glu Glu Ser Glu Asn Thr Gly Ile 545 550 555 560
Asn Ala Asp Vai Thr Glu Ser Glu Asp Tyr Glu Gly Glu Lys Gin Lys 565 570 575
Asp Glu Ser Asn Glu Arg Ser Thr Ser Asn Thr Thr Lys Ile Ala Gly 580 585 590
Gly Ala Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Gly Ala Gly Gly Gly Tyr Ala 595 600 605
Met Tyr Lys Lys Asn Lys Thr Pro Thr Vai Glu Tnr Gly Ser Gly Asp 610 615 620
Tyr Thr Gly Ala Asp Glu Ser Ser Glu Pro Met Lys Glu Gly Asp Thr 625 630 635 640
Tyr Thr Vai Thr Glu Phe Asp Asn Asn Ile Trp Gly Glu Ala Ala 645 650 655
<210> 7 <211> 1047 <212> ADN <213> Theileria annulata < 2 2 0 > <221> CDS <222> (1)..(1047) 48 70 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ < 4 0 0 > 7 gat aag ggg cta tat cct gac ggt ata aag aaa ccg age tcc tac tgc Asp Lys Gly Leu Tyr Pro Asp Gly Ile Lys Lys Pro Ser Ser Tyr Cys 1 5 10 15 cac agg gaa ttg gac tta aca ata tta gtc gat gaa tcc teg agt ate Ηίε Arg Glu Leu Asp Leu Thr Ile Leu Val Asp Glu Ser Ser Ser Ile 20 25 30 tat att gaa gag tgg aac aaa ctc att cca ttt ctt aaa tea ctg gtg Tyr Ile Glu Glu Trp Asn Lys Leu Ile Pro Phe Leu Lys Ser Leu val 35 40 45 aga tea ata aat ata agt cca aat tat gtg cac ttg tea atg gtc acc Arg Ser Ile Asn Ile Ser Pro Asn Tyr Val His Leu Ser Met Val Thr 50 55 60 ttt tcc act tea att cgg tgg tta ata tea ttt ctc gac cca gee tct Phe Ser Thr Ser Ile Arg Trp Leu Ile Ser Phe Leu Asp Pro Ala Ser 65 70 75 80 aag gat gag caa ttg gee ctt gct gtt ctg gac aag ctg aag aac agt Lys Asp Glu Gin Leu Ala Leu Ala Val Leu Asp Lys Leu Lys Asn Ser 85 90 95 aag cct gtg ttt ggg tac aca ttc act gga cag gea ctt aac ttt att Lys Pro Vai Phe Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Gin Ala Leu Asn Phe Ile 100 105 110 tct gag gct gtt tat atg ttt ggt gct agg cgt aac tct cca aag ggc Ser Glu Ala Val Tyr Met Phe Gly Ala Arg Arg Asn Ser Pro Lys Gly 115 120 125 ate att ate ate acc gac gga tcc tct act cag aca aac gtt act tct Ile Ile Ile Ile Thr Asp Gly Ser Ser Thr Gin Thr Asn Val Thr Ser 130 135 140 cag gcg teg gct cta cta agg gat gct ggt gta aca att cta gtt gtt Gin Ala Ser Ala Leu Leu Arg Asp Ala Gly Val Thr Ile Leu Val Val 145 150 155 160 gga gtt ggg aag gct aaa gaa age gag tgt aga ggt ata gtt ggt tgt Gly Vai Gly Lys Ala Lys Glu Ser Glu Cys Arg Gly Ile Val Gly Cys 165 170 175 tct acc aaa gga gag tgc ccc ctt ttc ttt atg acc aac tgg gat gaa Ser Thr Lys Gly Glu Cys Pro Leu Phe Phe Met Thr Asn Trp Asp Glu 180 185 190 att ate agg aag gtt ggg gag ttg atg gct gag gtt tgt gag acc att Ile Ile Arg Lys Val Gly Glu Leu Met Ala Glu Val- Cys Glu Thr Ile 96 144 192 240 238 336 384 432 480 528 576 624 71 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ 195 200 205 cct aag gac gcc gta tgt aag ccg ate tgg tct gat tgg tct aag tgt 672 Pro Lys Asp Ala Val Cys Lys Pro Ile Trp Ser Asp Trp Ser Lys Cys 210 215 220 gac gco aag tgc ggc att 999 acg agg tac caa aag ttg atg gga gtt 720 Asp Ala Lys Cys Gly Ile Gly Thr Arg Tyr Gin Lys Leu Met Gly Val 225 230 235 240 act aca att tct gag cca act gtc gga acg aac ggc aag tcc ggg agg 768 Thr Thr Ile Ser Glu Pro Thr Val Gly Thr Asn Gly Lys Ser Gly Arg 245 250 255 aca tgt gag atg att tat gag aac gtc gag gtt cca aag gag gag tgc 816 Thr Cys Glu Met Ile Tyr Glu Asn Val Glu Val Pro Lys Glu Glu Cys 260 265 270 tcc gtt gag tct aag att gct gga gga gtg gct cta gca ctg tta atg 864 Ser Vai Glu Ser Lys Ile Ala Gly Gly Val Ala Leu Ala Leu Leu Met 275 280 285 ott gca ggc gga ggt ggt tac aca tac tac aaa aag tac ggt tta tct 912 Leu Ala Gly Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser 290 295 300 aga gtg agt gaa act a cg aat ttg gat gag gat ttt gca gat tct agt 960 Arg Vai Ser Glu Thr Thr Asn Leu Asp Glu Asp Phe Ala Asp Ser Ser 305 310 315 320 939 aac cgt ggt gta agg gag agt gtg ggt gaa gct tac aca gta act 1008 Gly Asn Arg Gly Val Arg Glu Ser Val Gly Glu Ala Tyr Thr Val Thr 325 330 335 gat tta gat gat gga ctc tgg age caa tcc aat caa taa 1047 Asp Leu Asp Asp Gly Leu Trp Ser Gin Ser Asn Gin 340 345
<210> 8 <211> 348 <212> PRT <213> Theileria annulata < 4 0 0 > 8
Asp Lys Gly Leu Tyr Pro Asp Gly Ile Lys Lys Pro Ser Ser Tyr Cys 15 10 15
His Arg Glu Leu Asp Leu Thr Ile Leu Vai Asp Glu Ser Ser Ser Ile 20 25 30
Tyr Ile Glu Glu Trp Asn Lys Leu Ile Pro Phe Leu Lys Ser Leu Vai 35 40 45
Arg Ser Ile Asn Ile Ser Pro Asn Tyr Vai His Leu Ser Met Vai Thr 50 55 60 72
ΕΡ 1 664 097/PT
Phe Ser Thr Ser Ile Arg Trp Leu Ile Ser Phe teu Asp Pro Ala Ser 65 70 75 80
Lys Asp Glu Gin teu Ala Leu Ala Vai Leu Asp Lys Leu Lys Asn Ser 85 90 95
Lys Pro Vai Phe Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Gin Ala Leu Asn Phe Ile 100 105 110
Ser Glu Ala Vai Tyr Met Phe Gly Ala Arg Arg Asn Ser Pro Lys Gly 115 120 125
Ile Ile Ile Ile Thr Asp Gly Ser Ser Thr Gin Thr Asn Vai Thr Ser 130 135 140
Gin Ala Ser Ala Leu Leu Arg Asp Ala Gly Vai Thr Ile Leu Vai Vai 145 150 155 160
Gly Vai Gly Lys Ala Lys Glu Ser Glu Cys Arg Gly Ile Vai Gly Cys 165 170 175
Ser Thr Lys Gly Glu Cys Pro Leu Phe Phe Met Thr Asn Trp Asp Glu 180 185 190
Ile Ile Arg Lys Vai Gly Glu Leu Met Ala Glu Vai Cys Glu Thr Ile 195 200 205
Pro Lys Asp Ala Vai Cys Lys Pro Ile Trp Ser Asp Trp Ser Lys Cys 210 215 220
Asp Ala Lys Cys Gly Ile Gly Thr Arg Tyr Gin Lys Leu Met Gly Vai 225 230 235 240
Thr Thr Ile Ser Glu Pro Thr Vai Gly Thr Asn Gly Lys Ser Gly Arg 245 250 255
Thr Cys Glu Met Ile Tyr Glu Asn Vai Glu Vai Pro Lys Glu Glu Cys 260 265 270
Ser Vai Glu Ser Lys Ile Ala Gly Gly Vai Ala Leu Ala Leu Leu Met 275 280 285
Leu Ala Gly Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Lys Lys Tyr Gly Leu Ser 290 295 300
Arg Vai Ser Glu Thr Thr Asn Leu Asp Glu Asp Phe Ala Asp Ser Ser 305 310 315 320
Gly Asn Arg Gly Vai Arg Glu Ser Vai Gly Glu Ala Tyr Thr Vai Thr 325 330 335
Asp Leu Asp Asp Gly Leu Trp Ser Gin Ser Asn Gin 340 345 73
ΕΡ 1 664 097/PT
<210> 9 <211> 2259 <212> ADN <213> Babesia bovís <22 0>
<221> CDS <222> (552) . . (2189) < 4 0 0 > 9 ataagatgta gcactgatgt gtgtactcgg actctgacac tggagtatag gctaccagaa 60 ctgggogcaa ctccctaatg gagtgccgct cccaggaggc cacagaacaa tggagtacaa 120 cgctcaaaac cgcagtgaat gttagctaca atatgtacat attgtcatgg agttcgtaat 180 cctaacaaag gccattgtat cgtcaatgtg gtctaccagt ggacgtcgct tgtggaggcc 240 agggtacatc aaatccctga gaacacctat cgtccggtgt tacggtggta atgggttact 300 ataaaagcaa atttaattgt agatattgta aaaaaactgt aaaattggtt agtgcttgca 360 ccgtcctggt cccgcgattt ggataccgct gtgctacgct ttgcacggaa tcacgacgtc 420 gtgcataacg ctgtgcttat gacttcgtac acatcaaacg actttaactg ccgttggttt 480 atatacgttg gcgttaggtt gttttgggtg ttattgtact gtggaatcat acacattcta 540 cacgtgtcat g atg gtg aag ttc cac aca tta tcg gtt gca gcc ate ctg 590
Met Vai Lys Phe His Thr Leu Ser Vai Ala Ala Ile Leu 15 10 gcg att gct tea tcc aat act att ttt gct aca ttt aga tea aat gga 638
Ala Ile Ala Ser Ser Asn Thr Ile Phe Ala Thr Phe Arg Ser Asn Gly 15 20 25 aaa acc ttc gga gat gaa tet gtt age ctt cta gaa cat gaa agt acc 686
Lys Thr Phe Gly Asp Glu Ser Vai Ser Leu Leu Glu His Glu Ser Thr 30 35 40 45 agt ttg tet cgt ggt eet aga cca acc gaa gat caa ate agt cag tta 734
Ser Leu Ser Arg Gly Pro Arg Pro Thr Glu Asp Gin lie Ser Gin Leu 50 55 60 cca aaa aat gtt ttc ttt cta ttg gat aac age att gat atg tet att 782
Pro Lys Asn Vai Phe Phe Leu Leu Asp Asn Ser Ile Asp Met Ser Ile 65 70 75 74 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ gaa act gga gaa 9a9 aat cgt cat ttc ctc tcc gag ttt ttt aaa ttg 830 Glu Thr Gly Glu Glu Asn Arg His Phe Leu Ser Glu Phe Phe Lys Leu 30 85 90 tta aaa aaa tat gaa gga ata aat gtt tea cta ata agg tac aat agt 878 Leu Lys Lys Tyr Glu Gly Ile Asn Val Ser Leu Ile Arg Tyr Asn Ser 95 100 105 gaa gaa ccg tta ggt tcg acg aaa gca tta acc aac ggg gag ttg aaa 926 Glu Glu Pro Leu Gly Ser Thr Lys Ala Leu Thr Asn Gly Glu Leu Lys 110 115 120 125 aaa cta tcc gat aat att cct act aaa atg cct ttt gac att ggc gtt 974 Lys Leu Ser Asp Asn Ile Pro Thr Lys Met Pro Phe Asp Ile Gly Val 130 135 14 0 gtt cct act ggt ata gga gct gcc ctc aaa cag ata aaa aca ttg tac 1022 Val Pro Thr Gly Ile Gly Ala Ala Leu Lys Gin Ile Lys Thr Leu Tyr 145 150 155 cct gat cac gaa aag ttc ctt gtt 9gg aac acc att act gag ttg gat 1070 Pro Asp His Glu Lys Phe Leu Val Gly Asn Thr Ile Thr Glu Leu Asp 160 165 170 tat tct aaa gca ttg ggt aag gat att gtt gta ate gtg ttt act act 1118 Tyr Ser Lys Ala Leu Gly Lys Asp Ile Val Val Ile Val Phe Thr Thr 175 180 185 ggc cac gtc att gat cca tat tta gca tat gat gag gca ttt gat gcc 1166 Gly His Val Ile Asp Pro Tyr Leu Ala Tyr Asp Glu Ala Phe Asp Ala 190 195 200 205 cgc cgt aat ggt gta aga ttt tac gtt att aat agg gga gga aag gca 1214 Arg Arg Asn Gly Val Arg Phe Tyr Val Ile Asn Arg Gly Gly Lys Ala 210 215 220 aaa aac tat tgg act cag cta ttg gga tgc cac tac aat act tgt ttg 1262 Lys Asn Tyr Trp Thr Gin Leu Leu Gly Cys His Tyr Asn Thr Cys Leu 225 230 235 agt tat att ogg gcc aaa ata aca agg cct tea cta tat ctc gat gtt 1310 Ser Tyr Ile Arg Ala Lys Ile Thr Arg Pro Ser Leu Tyr Leu Asp Val 240 245 250 ttg gtg aac agg att gtg tct aaa cgc gcg aaa gat gcc gtt tgt ttg 1358 Leu Val Asn Arg Ile Val Ser Lys Arg Ala Lys Asp Ala Val Cys Leu 255 260 265 gaa gtg tgg acg gat tat aaa cct aac act gaa aaa tcg gat gtg agg 1406 Glu Val Trp Thr Asp Tyr Lys Pro Asn Thr Glu Lys Ser Asp Val Arg 270 275 280 285 att atg act tct acg ttg aaa tta tac aaa acc ctt ctt act gga age 1454 Ile Met Thr Ser Thr Leu Lys Leu Tyr Lys Thr Leu Leu Thr Gly Ser 290 295 300 ttt gcg gag ara aac ate aaa ggt ctc aca tgt gat gag cag cta aag 1502 Phe Ala Glu Xaa Asn Ile Lys Gly Leu Thr Cys Asp Glu Gin Leu Lys 3 05 310 315 gat atg cag aaa aga caa ata ttt tgc tac tea aat aag tgt gct ccc 1550 75 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
Asp Met Gin Lys Arg Gin Ile Phe Cys Tyr Ser Asn Lys Cys Ala Pro 320 325 330 acg ate tat tea aga tct tat gtt gac tta gct att caa cgt ctt aat 1598 Thr Ile Tyr Ser Arg Ser Tyr Val Asp Leu Ala Ile Gin Arg Leu Asn 335 340 345 gca aaa gat ttt aaa gag gta cta gat gag tea tct tac aga tea ege 1646 Ala Lys Asp Phe Lys Glu Val Leu Asp Glu Ser Ser Tyr Arg Ser Arg 350 3S5 360 365 agt ttg caa tea gtg gag aaa cat aat gag caa caa aca ggt tct caa 1694 Ser Leu Gin Ser Val Glu Lys His Asn Glu Gin Gin Thr Gly Ser Gin 370 375 380 gaa acg ctt tct gga age gee cgt gta gaa aca age tta gaa .age tea 1742 Glu Thr Leu Ser Gly Ser Ala Arg Val Glu Thr Ser Leu Glu Ser Ser 385 390 395 gta cet tea tcc tat gtg gca gaa ttg gga gaa agt gat aca gaa aca 1790 Vai Pr o Ser Ser Tyr Val Ala Glu Leu Gly Glu Ser Asp Thr Glu Thr 400 405 410 tac aaa cag ttg gag tac ata gat aaa aat ggc gtc act gtc ttc aac 1838 Tyr Lys Gin Leu Glu Tyr Ile Asp Lys Asn Gly Val Thr Val Phe Asn 415 420 425 gat gag ccc act gtt gtt gtc gat act ccc gag tac gta caa aag gtg 1886 Asp Glu Pro Thr Val val Val Asp Thr Pro Glu Tyr Val Gin Lys Val 430 435 440 445 cat gaa aga gaa atg cag ttt gat gaa gaa tcc acc cat ctt ccc aac 1934 His Glu Arg Glu Met Gin Phe Asp Glu Glu Ser Thr His Leu Pro Asn 450 455 460 tct ggt aac cac cat cca cct cat cac cga aag ggg gee aac gga tcc 1982 Ser Gly Asn Hls His Pro Pro His His Arg Lys Gly Ala Asn Gly Ser 465 470 475 ggt aaa aag acc acg ate gtc gtt ggt att ata tgc ctt gta gta ata 2030 Gly Lys Lys Thr Thr Ile Val Val Gly Ile Ile Cys Leu Val Val Ile 480 485 490 tgc gee gtc ata gee ggc gee tac cta tcc ctt tea cag caa gag tct 2078 Cys Ala Vai Ile Ala Gly Ala Tyr Leu Ser Leu Ser Gin Gin Glu Ser 495 500 505 gtg gaa etc acc tct gaa gag ggt gac ttc ttg aac gac act acg ggt 2126 Vai Glu Leu Thr Ser Glu Glu Gly Asp Phe Leu Asn Asp Thr Thr Gly 510 515 520 525 ggt caa cct gag gta ctc gaa aca caa cag gtt gtg gat gca gag aac 2174 Gly Gin Pro Glu Val Leu Glu Thr Gin Gin Val Val Asp Ala Glu Asn 530 535 540 aaa aca tgg ttg taa gacacgaaac gggttgtcac agccaacata tacaaatgca 2229 Lys Thr Trp Leu 545 gtttaaatta agtcactagt taaaaaaaaa 2259
<210> 10 <211> 545 <212> PRT <213> Babesia bovis < 2 2 0 > <221> misc_feature <222> (305) . .(305) <223> O 'Xaa' na localização 305 representa Arg ou Lys. 76 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ < 4 Ο Ο > 10
Met Vai Lys Phe Hia Thr Leu Ser Vai Ala Ala Ile Leu Ala Ile Ala 15 10 15
Ser Ser Asn Thr Ile Phe Ala Thr Phe Arg Ser Asn Gly Lys Thr Phe 20 25 30
Gly Asp Glu Ser Vai Ser Leu Leu Glu His Glu Ser Thr Ser Leu Ser 35 40 45
Arg Gly Pro Arg Pro Thr Glu Asp Gin Ile Ser Gin Leu Pro Lys Asn 50 55 60
Vai Phe Phe Leu Leu Asp Asn Ser Ile Asp Met Ser Ile Glu Thr Gly 65 70 75 80
Glu Glu Asn Arg His Phe Leu Ser Glu Phe Phe Lys Leu Leu Lys Lys 85 90 95
Tyr Glu Gly Ile Asn Vai Ser Leu Ile Arg Tyr Asn Ser Glu Glu Pro 100 105 110
Leu Gly Ser Thr Lys Ala Leu Thr Asn Gly Glu Leu Lys Lys Leu Ser 115 120 125
Asp Asn Ile Pro Thr Lys Met Pro Phe Asp Ile Gly Vai Vai Pro Thr 130 135 140
Gly Ile Gly Ala Ala Leu Lys Gin Ile Lys Thr Leu Tyr Pro Asp His 145 150 155 160
Glu Lys Phe Leu Vai Gly Asn Thr Ile Thr Glu Leu Asp Tyr Ser Lys 165 170 175
Ala Leu Gly Lys Asp Ile Vai Vai Ile Vai Phe Thr Thr Gly His Vai 180 185 190 77 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ
Ile Asp Pro Tyr Leu Ala Tyr Asp Glu Ala Phe Asp Ala Arg Arg Asn 195 200 205
Gly Vai Arg Phe Tyr Vai Ile Asn Arg Gly Gly Lys Ala Lys Asn Tyr 210 215 220
Trp Thr Gin Leu Leu Gly Cys His Tyr Asn Thr Cys Leu Ser Tyr Ile 225 230 235 240
Arg Ala Lys Ile Thr Arg Pro Ser Leu Tyr Leu Asp Vai Leu Vai Asn 245 250 255
Arg Ile Vai Ser Lys Arg Ala Lys Asp Ala Vai Cys Leu Glu Vai Trp 260 265 270
Thr Asp Tyr Lys Pro Asn Thr Glu Lys Ser Asp Vai Arg Ile Met Thr 275 280 285
Ser Thr Leu Lys Leu Tyr Lys Thr Leu Leu Thr Gly Ser Phe Ala Glu 290 295 300
Xaa Asn Ile Lys Gly Leu Thr Cys Asp Glu Gin Leu Lys Asp Met Gin 305 310 315 320
Lys Arg Gin Ile Phe Cys Tyr Ser Asn Lys Cys Ala Pro Thr Ile Tyr 325 330 335
Ser Arg Ser Tyr Vai Asp Leu Ala Ile Gin Arg Leu Asn Ala Lys Asp 340 345 350
Phe Lys Glu Vai Leu Asp Glu Ser Ser Tyr Arg Ser Arg Ser Leu Gin 355 360 365
Ser Vai Glu Lys His Asn Glu Gin Gin Thr Gly Ser Gin Glu Thr Leu 370 375 380
Ser Gly Ser Ala Arg Vai Glu Thr Ser Leu Glu Ser Ser Vai Pro Ser 385 390 395 400
Ser Tyr Vai Ala Glu Leu Gly Glu Ser Asp Thr Glu Thr Tyr Lys Gin 405 410 415
Leu Glu Tyr Ile Asp Lys Asn Gly Vai Thr Vai Phe Asn Asp Glu Pro 420 425 430
Thr Vai Vai Vai Asp Thr Pro Glu Tyr Vai Gin Lys Vai His Glu Arg 78 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ 435 440 445
Glu Met Gin Phe Asp Glu Glu Ser Thr His Leu Pro Asn Ser Gly Asn 450 455 460
His His Pro Pro His His Arg Lys Gly Ala Asn Gly Ser Gly Lys Lys 465 470 475 480
Thr Thr Ile Vai Vai Gly Ile Ile Cys Leu Vai Vai Ile Cys Ala Vai 485 490 495
Ile Ala Gly Ala Tyr Leu Ser Leu Ser Gin Gin Glu Ser Vai Glu Leu 500 505 510
Thr Ser Glu Glu Gly Asp Phe Leu Asn Asp Thr Thr Gly Gly Gin Pro 515 520 525
Glu Vai Leu Glu Thr Gin Gin Vai Vai Asp Ala Glu Asn Lys Thr Trp 530 535 540
Leu 545 <210> 11 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial < 2 2 0 > <223> iniciador 1 < 4 0 0 > 11 ccacggctct ggaatctatg tc 22 <210> 12 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial < 2 2 0 > <223> iniciador 2 < 4 0 0 > 12 caaaaggata cctatatttg gtac 24 <210> 13 <211> 27 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador 3 < 4 0 0 > 13 tgtggtagat gaatctgcta gtatatc 27 79 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ <210> <211> <212> <213> 14 27 ADN Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador 4 <400> 14 ctatgccacg gcattcagca acattta 27 <210> <211> <212> <213> 15 27 ADN Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador 5 < 4 0 0 > 15 cccggatcca tgcagttaca taacaaa 27 <210> <211> <212> <213> 16 27 ADN Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador 6 < 4 0 0 > 16 gggaagcttc tgagcaaagg aaatagg 27 <210> <211> <212> <213> 17 27 ADN Artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador 7 < 4 0 0 > 17 cccgaattcg tggtagatga atctgct 27 <210> <211> <212> <213> 18 29 ADN Artificial <22 0> <223> Iniciador 8 < 4 0 0 > 18 cccgtcgact gcctcgcccc aaatgttgt 29 <210> <211> <212> <213> 19 30 ADN Artificial 80 ΕΡ 1 664 097/ΡΤ <22 0> <223> Iniciador 9 < 4 0 0 > 19 cccgaattcc atgatggtga agttccacac 30 <210> 20 <211> 29 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Iniciador 10 <400> 20 cccgtcgacg ttggccccct ttcggtgat 29
Lisboa, 2010-02-10

Claims (16)

  1. ΕΡ 1 664 097/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Proteína de Piroplasmida caracterizada por a referida proteína compreender uma sequência de aminoácidos com uma semelhança de pelo menos 70% com a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO:2, ou um fragmento antigénico contendo um epítopo, da referida proteína.
  2. 2. Ácido nucleico, caracterizado por o referido ácido nucleico codificar para uma proteína de acordo com a reivindicação 1, ou um fragmento antigénico contendo um epítopo, da referida proteína.
  3. 3. Fragmento de ADNc compreendendo um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2.
  4. 4. Molécula de ADN recombinante que compreende um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2, ou fragmento de ADNc de acordo com a reivindicação 3, estando o referido ácido nucleico, ou o referido fragmento de ADNc, sob o controlo de um promotor ligado funcionalmente.
  5. 5. Microorganismo transportador recombinante, vivo, compreendendo um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2 ou um fragmento de ADNc de acordo com a reivindicação 3, estando o referido ácido nucleico, ou o referido fragmento de ADNc, sob o controlo de um promotor ligado funcionalmente, ou uma molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 4.
  6. 6. Célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2 ou um fragmento de ADNc de acordo com a reivindicação 3, estando o referido ácido nucleico, ou o referido fragmento de ADNc, sob o controlo de um promotor ligado funcionalmente, uma molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 4, ou um microorganismo transportador recombinante, vivo, de acordo com a reivindicação 5.
  7. 7. Vacina que compreende uma proteína de acordo com a reivindicação 1, ou um fragmento antigénico contendo um epítopo da referida proteína, um ácido nucleico de acordo com ΕΡ 1 664 097/ΡΤ 2/3 a reivindicação 2 ou um fragmento de ADNc de acordo com a reivindicação 3, uma molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 4, um microorganismo transportador recombinante, vivo, de acordo com a reivindicação 5, ou uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 6, ou uma sua combinação, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
  8. 8. Vacina de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a referida vacina compreender um adjuvante.
  9. 9. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 7-8, caracterizada por a referida vacina compreender um componente imunoactivo adicional, ou um ácido nucleico que codifica para o referido componente imunoactivo adicional.
  10. 10. Vacina, caracterizada por a referida vacina compreender um anticorpo contra uma proteína de acordo com a reivindicação 1, ou um anticorpo contra um fragmento antigénico contendo um epítopo, da referida proteína, ou uma sua combinação, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
  11. 11. Método para a preparação de uma vacina de acordo com a reivindicação 7, em que o referido método compreende misturar uma proteína de acordo com a reivindicação 1, ou um fragmento antigénico contendo um epítopo, da referida proteína, um ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2, um fragmento de ADNc de acordo com a reivindicação 3, uma molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 4, um microorganismo transportador recombinante, vivo, de acordo com a reivindicação 5, ou uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 6, ou uma sua combinação, e um transportador farmaceuticamente aceitável.
  12. 12. Utilização de uma proteína de acordo com a reivindicação 1, ou um fragmento antigénico contendo um epítopo, da referida proteína, para o fabrico de uma vacina para o tratamento profiláctico ou terapêutico de uma infecção, ou dos seus sinais clínicos, causada por um organismo Piroplasmida. ΕΡ 1 664 097/ΡΤ 3/3
  13. 13. Utilização de uma sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 2, um fragmento de ADNc de acordo com a reivindicação 3, uma molécula de ADN recombinante de acordo com a reivindicação 4, um microorganismo transportador recombinante, vivo, de acordo com a reivindicação 5, ou uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 6, para o fabrico de uma vacina para o tratamento profiláctico ou terapêutico de uma infecção, ou dos seus sinais clinicos, causada por um organismo Piroplasmida.
  14. 14. Teste de diagnóstico in vitro para a detecção de um ácido nucleico associado com um organismo Piroplasmida, caracterizado por o teste compreender um ácido nucleico, sendo o referido ácido nucleico pelo menos 70% semelhante à sequência de ácido nucleico representada em SEQ ID NO:l, ou um ácido nucleico que é complementar ao referido ácido nucleico, em que o ácido nucleico tem um comprimento de pelo menos 15 nucleótidos.
  15. 15. Teste de diagnóstico in vitro para a detecção de anticorpos contra um organismo Piroplasmida, caracterizado por o referido teste compreender uma proteina de acordo com a reivindicação 1, ou um fragmento antigénico contendo um epitopo, da referida proteina, ou uma sua combinação.
  16. 16. Teste de diagnóstico in vitro para a detecção de material antigénico de um organismo Piroplasmida, caracterizado por o referido teste compreender um anticorpo contra uma proteina de acordo com a reivindicação 1, ou um anticorpo contra um fragmento antigénico contendo um epitopo, da referida proteina, ou uma sua combinação. Lisboa, 2010-02-10
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