MX2011006409A - Metodos y composiciones para uso de una vacuna de coccidiosis. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una vacuna de coccidiosis para proteger aves de corral contra la infección por Eimeria, que comprende un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende dentro del marco un promotor (heterólogo) enlazado a una secuencia de señal hidrofóbica para el anclaje de membrana, o ligado a una señal de secreción hidrofóbica y un sitio de escisión para permitir la secreción; un sitio de donación múltiple para la inserción dentro del marco de un ORF de antígeno de Eimeria tal como se deriva de los antígenos r56, 82 kDa y/o TFP25O; una señal de poliadenilación; y un genoma de adenovirus aviar.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA USO DE UNA VACUNA DE COCCIDIOSIS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos y composiciones para la vacunación de aves.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La coccidiosis es una enfermedad extremadamente importante de los pollos a nivel mundial. Da por resultado pérdidas estimadas a la industria de pollos para la producción de carne sola de más de 1,000 millones de dólares por año. La coccidiosis es causada por infección con siete especies del parásito protozoario apicomple o Eimeria. De estas siete especies, la E. tenella, E. máxima y E. acervulina son consideradas que son las más problemáticas. Los síntomas de la coccidiosis incluyen languidez, anemia, diarrea acuosa o con sangre- (dependiendo de la especie infecciosa) , pérdida de peso e índices de conversión alimenticia deficientes.

El crecimiento y propagación de los parásitos Eimeria es particularmente prevalente en pollos debido a que estas aves son criadas típicamente bajo condiciones de hacinamiento lo cual hace extremadamente difícil mantener un control sanitario. El uso de fármacos coccidiostáticos bajo estas condiciones no es efectivo debido al desarrollo de resistencia y debido a dificultades en la administración sostenida de estos fármacos en entornos reducidos de alimentación. Adicionalmente, los coccidiostáticos también tienen efectos antibacterianos y se considera indeseable el uso de antibióticos en la alimentación.

El Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) ha reconocido que la industria de pollos para la producción de carne de los Estados Unidos y mundial depende en gran medida del uso de fármacos anti-coccidiales , los cuales se agregan a la alimentación de aves de corral y previenen el desarrollo intracelular de etapas de Eimeria dentro de los intestinos del pollo. Los fármacos son removidos de la alimentación aproximadamente 1 semana antes de que los pollos comiencen a enviarse al mercado como una forma de prevenir los residuos, de fármacos en el producto de carne. Mientras que los fármacos anti-coccidiales continúan siendo el medio primario de prevenir la coccidiosis aviar, el USDA ha establecido que la capacidad de los parásitos Eimeria de llegar a ser resistentes a estos fármacos requiere el desarrollo de medidas de control alternativas.

Una solución alternativa de combatir la coccidiosis seria desarrollar una vacuna efectiva. Mientras que se ha contemplado la administración de una mezcla de dosis bajas de ooquistes de especies de Eimeria virulentas o atenuadas queda por probarse como una intervención efectiva en realidad. Debido a que los pollos desarrollan inmunidad al Eimeria, están siendo agotados esfuerzos sustanciales para desarrollar vacunas "de subunidades" contra la coccidiosis. Estas vacunas utilizarían, tecnología de ingeniería genética para producir componentes proteínicos de parásitos Eimeria. La razón detrás de este procedimiento es que se pueden usar cepas de bacterias de laboratorio, inofensivas para producir proteínas "recombinantes" que se pueden usar para inmunizar pollos ya sea en ovo (en el huevo) o en la incubación. Si se tiene éxito, los pollos serán resistentes a una infección de Eimeria subsecuente debido a que se han inmunizado con una proteína que está normalmente presente sobre la superficie del parásito. Sin embargo, de ¦ acuerdo con el USDA, los esfuerzos hasta la fecha no han logrado llegar a un buen término y, hasta ahora, no hay vacunas de subunidades comerciales disponibles para prevenir la coccidiosis aviar.

El CoxAbicMR es una vacuna que gana alguna aceptación en la industria y se basa en el uso de tres antígenos nativos de longitud completa, purificados por afinidad principales (de 56kDa, 82kDa y 230kDa) aislados de la etapa de macrogametocito (sexual femenina) del desarrollo de Eimeria para vacunar gallinas ponedoras justo antes del inicio de su periodo de puesta. El CoxAbicMR induce inmunidad cruzada contra las especies coccidiales que afectan los pollos para la producción de carne incluyendo inmunidad contra E. acervulina, máxima, y tenella. Se usa para inmunizar pollas antes del punto de puesta. Los criadores inmunológicos transfieren anticuerpos específicos a los pollos para la producción de carne a través de la yema de huevo y los protegen durante la vida temprana después de salir del cascarón mientras que se exponen naturalmente a la coccidia en la granja. Esta exposición produce una inmunidad durante la protección materna y la transfiere a los pollos para la producción de carne para la edad temprana del ciclo de vida del pollo para producción de carne. Los anticuerpos maternos protectores se transfieren por la vía de la yema de huevo a los pollitos descendientes, los cuales salen del cascarón con concentraciones altas de anticuerpo materno. Estos anticuerpos maternos actúan para reducir la diseminación de ooquistes para las primeras 2-3 semanas del período de crecimiento de los pollos. Esto, a su vez, conduce a una disminución de 60-80% de los conteos pico de ooquistes en las heces. Los cuales usualmente suceden en las 3-5 semanas de edad.

No obstante, a .pesar del hecho de que esta vacuna es una que es capaz de transferir inmunidad materna a los pollos para la producción de carne, y los pollos para la producción de carne se pueden criar sin coccidiostáticos en su alimentación, la inmunidad es una inmunidad directa en que se transfiere de la madre a los pollos para la producción de carne en una etapa temprana en su ciclo de vida. No hay mecanismo para asegurar que los pollos para la producción de carne retengan la inmunidad y no existen actualmente vacunas disponibles que se puedan administrar directamente a los pollos para la producción de carne o pollitos después de la salida del cascarón. Esto deja la posibilidad de propagación de coccidiosis en los pollos para la producción de carne que no han recibido adecuadamente inmunidad de la madre o de pollos para la producción de carne más viejos que tienen perdida la inmunidad y necesitan un refuerzo de inmunidad. De hecho, los fabricantes de CoxAbicMR indican que el CoxAbicMR se usa para vacunar criadores y proteger sus pollos para la producción de carne únicamente. La inmunidad materna dura aproximadamente 14 días o un poco más de tiempo como es determinado por los métodos ELISA. Si las aves se exponen a varias especies de Eimeria en etapas posteriores en el ciclo de vida, la inmunidad materna ya no existe y las aves más viejas permanecen sin protección.- La vacuna CoxAbicMR también sufre de la desventaja adicional de que se administra por inyección a los pollos para la producción de carne. En el programa de vacunación para CoxAbicMR las pollas se deben inyectar con la vacuna dos veces durante su crianza con por lo menos un intervalo de 4 semanas entre las dos inyecciones. La primera inyección se puede hacer en la etapa de 12 a 15 semanas; la segunda inyección de 18 a 21 semanas de edad. De esta manera, el modo de administración de esta vacuna ya no es fácilmente adaptable para la administración directa a grandes poblaciones de pollos para la producción de carne.

Como se observa anteriormente, existe un incentivo comercial principal de obtener una vacuna para el tratamiento de pollos para la producción de carne. Una vacuna que se debe inyectar en los pollos no es práctica para la administración a grandes poblaciones de pollos. Por lo tanto existe una necesidad por una vacuna que se pueda administrar fácilmente a los pollos para la producción de carne para efectuar protección contra los efectos per udiciales de la coccidiosis .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En. ciertos aspectos, la presente invención atiende la necesidad de una vacuna de coccidiosis al proporcionar una vacuna de coccidiosis para la protección de aves de corral contra la infección por Eimeria, la vacuna que comprende un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende un promotor ligado operablemente a una secuencia de señal hidrofóbica que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de anclaje de membrana, un sitio de clonación múltiple para la inserción de un marco abierto de lectura (ORF) para permitir la inserción de un ORF dentro del marco con la secuencia de señal hidrofóbica, una señal de poliadenilación; y un genoma de adenovirus aviar.

En modalidades especificas, el ORF de interés codifica un antigeno r56 truncado de Ei eria máxima. En otras modalidades, el ORF de interés codifica un antigeno TFP250 truncado de Eimeria máxima. En aún modalidades adicionales, el ORF de interés codifica un antigeno de 82kDa truncado de Eimeria máxima. En ciertas otras modalidades ejemplares, el sitio de clonación múltiple contiene un ORF que codifica un antigeno r56 truncado de Eimeria máxima, en combinación con un antigeno TFP250 truncado de Eimeria máxima y/o un antigeno de 82kDa truncado de Eimeria máxima.

La vacuna de coccidiosis se puede preparar a partir de cualquier virus. De manera preferible, la vacuna de coccidiosis emplea un genoma de adenovirus aviar seleccionado del grupo que consiste de genoma de FAV 1, FAV 2, FAV 3, FAV 4, FAV 5, FAV 6, FAV 7, FAV 8, FAV 9, FAV 10, FAV 11 y FAV 12. En modalidades especificas, el genoma de adenovirus aviar es un genoma de FAV 8.

El vector de adenovirus aviar recombinante puede comprender además una secuencia de escisión inmediatamente cadena arriba del sitio de clonación para la inserción del ORF de interés, en donde el producto de expresión del vector produce un producto soluble.

En modalidades ejemplares, el ácido nucleico que codifica un r56 truncado comprende la secuencia de nucleótidos 70-1035 de la secuencia r56 de longitud completa mostrada en SEQ ID NO: 14 pero no codifica la secuencia de proteínas r56 completa mostrada en SEQ ID NO: 2. La secuencia de nucleótidos codificada por los residuos 70-1035 se muestra en SEQ ID NO: 13. La secuencia de codificación R56 de Eimeria máxima de longitud completa también se muestra en SEQ ID NO: 14, la secuencia que está contenida dentro de la secuencia de SEQ ID N0:1, donde el . sitio de partida atg se observa en los residuos 103-106. En aún otras modalidades, el ácido nucleico que codifica un r56 truncado codifica el fragmento r56 truncado que consiste de los aminoácidos 24-345 de SEQ ID NO: 2 o un fragmento de aminoácidos 24-345 de SEQ ID NO: 2. En modalidades alternativas específicas, el ácido nucleico que codifica un TFP250 truncado comprende la secuencia de nucleótidos 6448-7083 de la secuencia TFP250 de longitud completa mostrada en SEQ ID NO: 16 pero no codifica en la secuencia de proteínas TFP250' completa mostrada en SEQ ID NO: . Más particularmente, el ácido nucleico que codifica un TFP250 truncado consiste de la secuencia de ácidos nucleicos de los nucleótidos 6448-7083 de SEQ ID NO: 16. La secuencia de nucleótidos codificada por los residuos 6448-7083 se muestra en SEQ ID NO: 15. La secuencia de codificación TFP250 de Eimeria máxima de longitud completa también se muestra en SEQ ID NO: 16, la secuencia que está contenida dentro de la secuencia de SEQ ID NO: 3, donde el sito de partida atg se observa en los residuos 231-233.

También se contemplan composiciones y métodos de uso de una vacuna de coccidiosis para la protección de aves de corral contra la infección por Eimeria , la vacuna que comprende un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende un promotor ligado operablemente a una secuencia de señal hidrofóbica que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de .anclaje de membrana, y un ácido nucleico que codifica un r56 truncado que consiste de aminoácidos 24-345 de SEQ ID NO: 2 o un fragmento de aminoácidos 24-345 de SEQ ID NO:2 insertados dentro del marco con la secuencia de señal hidrofóbica, una señal de poliadenilación; y un genoma de adenovirus aviar.

Otra modalidad enseña la preparación y uso de una vacuna de coccidiosis para la protección de aves de corral contra la infección por Eimeria , la vacuna que comprende un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende un promotor ligado operablemente a una secuencia de señal hidrofóbica que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de anclaje de membrana, y un ácido nucleico que codifica un TFP250 truncado que consiste de la secuencia de ácido nucleicos de nucleótidos 6448-7083 de SEQ ID NO: 16 insertada dentro del marco con la secuencia de señal hidrofóbica, una señal de poliadenilación ; y un genoma de adenovirus aviar.

Una modalidad adicional se refiere a composiciones y métodos de uso de una vacuna de coccidiosis para la protección de aves de corral contra la infección por Eimeria, la vacuna que comprende un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende un promotor ligado operablemente a una secuencia de señal hidrofóbica que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de anclaje de membrana, y un ácido nucleico que codifica un antigeno de 82kDa truncado de Eimeria máxima insertado dentro del marco con la secuencia de señal hidrofóbica, una señal de poliadenilación; y un genoma de adenovirus aviar.

La invención también contempla preparaciones de vacuna de coccidiosis' multivalentes que comprenden combinaciones de las composiciones de vacuna de coccidiosis anteriores .

Además las preparaciones de vacuna de coccidiosis multivalentes . pueden comprender además un inmunógeno seleccionado del grupo que- consiste de virus de enfermedad de Marek (MDV) , virus de Enfermedad de Newcastle (NDV) , virus de Bronquitis Infecciosa (IBV), virus de Anemia del Pollo (CAV) , Virus de enfermedad de bursitis infecciosa (IBDV), Influenza Aviar (AI), virus Reo,. Retrovirus aviar, adenovirus aviar, virus de Rinotraqueitis de pavo, Salmonella spp. y E. coli.

Los métodos ejemplares de la invención se refieren a inmunizar un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria máxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix , Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti , que comprenden la etapa de administrar al sujeto una vacuna de la presente invención. En modalidades especificas, la administración induce un nivel aumentado de inmunidad como es comparado con la inmunidad observada cuando el sujeto se inmuniza con un vector de FAV que comprende un r56 de longitud completa o un antigeno TFP 250 de longitud completa o un antígeno de 82kDa de longitud completa.

Los métodos se usan de manera preferible para el tratamiento de una especie aviar seleccionada del grupo que consiste de pollos, pavos, gansos', patos, gallinillas enanas, codornices y pichones. De manera preferible, la especie aviar son los pollos. En modalidades especificas, los pollos son pollos adultos para la producción de carne.

La administración puede ser a través de cualquier vía de administración convencional incluyendo por ejemplo, rociar al sujeto con la vacuna, alimentar al sujeto con la vacuna en el alimento, y proporcionar la vacuna en el suministro de bebida del sujeto.

Otro método de la invención comprende una terapia de vacunación de combinación para proporcionar inmunidad protectora contra Eimeria tenella, Eimeria máxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti , a una población de pollos que comprende la etapa de administrar al sujeto una vacuna de cualquiera de la presente invención y administrar el CoxAbicMR a la población de pollos.

La terapia de combinación es tal que el CoxAbicMR se administra a gallinas reproductoras para conferir inmunidad a los pollitos en la salida del cascarón y la vacuna de la invención se administra a los pollitos en el día 1 después de la salida del cascarón y después a las gallinas adultas para producción de carne de la población.

Otros aspectos de la invención describen un vector de adenovirus aviar que comprende un genoma de adenovirus aviar que comprende un promotor heterólogo, una secuencia de señal hidrofóbica heteróloga, un sitio de clonación múltiple, y una secuencia de poliadenilación, en donde el promotor y la secuencia de señal hidrofóbica se localizan cadena arriba de un sitio de clonación múltiple, en donde la inserción de un ORF de interés en el sito de clonación múltiple dará por resultado un vector de expresión capaz de expresar el ORF de interés bajo el control el promotor y dentro del marco con la secuencia de señal.

En modalidades especificas, la secuencia de señal hidrofóbica comprende un sitio de escisión para permitir la secreción del producto de expresión del ORF de interés de la célula hospedera en la cual se expresa. En otras modalidades, la secuencia de señal no contiene un sitio de escisión dando por resultado en consecuencia la expresión de un producto de expresión fusionado del ORF de interés que se ancla a la superficie celular de la célula hospedera.

También se contempla un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende un promotor ligado operablemente a una secuencia de señal hidrofóbica que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de anclaje de membrana, un sitio de clonación múltiple para la inserción de un ORF de interés para permitir la inserción de un ORF de interés dentro del marco con la secuencia de señal hidrofóbica, una señal de poliadenilación; y un.genoma de adenovirus aviar. El vector, en algunas modalidades, puede comprender además una secuencia de escisión inmediatamente cadena arriba del sitio de clonación para la inserción del ORF de interés, en donde el producto de expresión del vector produce un producto de ORF soluble.

También se da a conocer un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende un promotor ligado operablemente a una · secuencia de señal de secreción hidrofóbica y sitio de escisión, un ácido nucleico que codifica una proteína r56 truncada de Eimeria máxima, un señal de poliadenilación y un genoma de adenovirus aviar.

Otra modalidad se refiere a un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende un promotor ligado operablemente a una secuencia de señal de secreción hidrofóbica y sitio de escisión, un ácido nucleico que codifica una proteína TFP250 truncada de Eimeria máxima, una señal de poliadenilación y un genoma de adenovirus aviar.

Todavía una modalidad adicional se refiere a un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende un promotor ligado operablemente a una secuencia de señal de secreción hidrofóbica y sitio de escisión, un ácido nucleico que codifica una proteína 82kDa truncada de Eimeria máxima, una señal de poliadenilación y un genoma de adenovirus aviar.

Aún una modalidad adicional se refiere a un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende un promotor ligado operablemente a una secuencia de señal que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de anclaje de membrana, un ácido nucleico que codifica una proteina r56 truncada de Eimeria máxima, una señal de poliadenilación y un genoma de adenovirus aviar.

Todavía las modalidades adicionales describen un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende un promotor ligado operablemente a una secuencia de señal que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de anclaje de membrana, un' ácido nucleico que codifica una proteína TFP250 truncada de Eimeria máxima, una señal de poliadenilación y un genoma de adenovirus aviar.

También se contempla un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende un- promotor ligado operablemente a una secuencia de señal que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de anclaje de membrana, un ácido nucleico que codifica una proteína de 82kDa truncada de Eimeria máxima, una señal de poliadenilación y un genoma de adenovirus aviar.

En las vacunas descritas anteriormente, el ácido nucleico que codifica un r56 truncado comprende la secuencia de nucleótidos 70-1035 de la secuencia r56 de longitud completa mostrada en SEQ ID NO: 14 pero no codifica la secuencia de proteínas r56 completa mostrada en SEQ ID NO: 2. Más particularmente, el ácido nucleico que codifica un r56 truncado consiste de la secuencia de ácidos nucleicos de los nucleótidos 70-1035 de SEQ ID NO: 14, o un fragmento de nucleótidos 70-1035 de . SEQ ID NO: 14. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica un r56 truncado codifica el fragmento r56 truncado que consiste de aminoácidos 24-345 de SEQ ID NO:2 o un fragmento de aminoácidos 24-345 de SEQ ID NO:2.

En otras modalidades, el ácido nucleico que codifica un TFP250 truncado comprende la secuencia de nucleótidos 6448-7083 de la secuencia TFP250 de longitud completa mostrada en SEQ ID NO: 3 pero no codifica la secuencia de proteínas TFP250 completa mostrada en SEQ ID NO: 4. Más particularmente, el ácido nucleico que codifica un TFP250 truncado consiste de la secuencia de ácidos nucleicos de los nucleótidos 6448-7083 de SEQ ID NO: 16.

El vector de adenovirus aviar recombinante que produce productos .secretados puede comprender cualquier secuencia de señal de secreción. En modalidades específicas, ¦ la secuencia de señal de secreción se selecciona del grupo que consiste de la secuencia de señal de secreción de interferón gamma de pollo, interferón gamma porcino, y H1N2 de Influenza Humana.

El vector de adenovirus aviar recombinante que produce productos anclados puede comprender cualquier secuencia de señal de anclaje de membrana. En modalidades especificas, la secuencia de señal de anclaje de membrana se selecciona del grupo que consiste de la secuencia de señal de secreción de un antigeno de HA de influenza aviar.

Cualquiera de los vectores de expresión descritos se puede formular fácilmente en- vacunas para el uso en los métodos descritos en este documento.

Los métodos ejemplares comprenden métodos para inducir una respuesta, inmunitaria en una población aviar que comprende administrar a la población esta vacuna.

Los métodos preferidos para vacunar una población aviar contra la coccidiosis comprende administrar una vacuna que comprende un vector de adenovirus aviar recombinante de la presente invención, en donde la administración de la vacuna induce una respuesta inmunitaria incrementada en comparación con la administración de una vacuna que comprende r56 de longitud completa o TFP250 de longitud completa.

También se contemplan células aisladas que comprenden vectores de adenovirus aviar recombinantes descritos en este documento.

Cualquiera de los . vectores de adenovirus aviar recombinantes se pueden combinar ventajosamente con un excipiente adecuado para producir una formulación farmacéutica para el tratamiento de animales y en particular, aves.

BREVE DESCRIPCIÓN DE DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una representación esquemática de los vectores basados en FAV de la invención.

La Figura 2 muestra el análisis de la técnica Western blot de varios constructos de FAV que comprenden la proteina r56 en cualquier forma anclada o secretada de membrana, nativa.

La Figura 3 muestra el análisis de la técnica Western blot de varios constructos de FAV que comprenden la proteina TFP250 en cualquier forma anclada y secretada de membrana, nativa.

Las Figuras 4A-4B muestran una recolección de secuencia de señal eucarióticas reproducidas de la Figura 1 de Heijne Eur. J. Biochem 133, 17-21 (1983). Las secuencias se alinean con base en sus sitios de escisión conocidos o predichos, los cuales son indicados por un asterisco (*). Las secuencias mostradas en este documento son SEQ ID NO: 35-124.

La Figura 5 muestra el esquema para la síntesis química de los casetes de expresión.

La Figura 6 muestra el esquema para la amplificación por PCR para preparar constructos.

La Figura 7 muestra el esquema para el uso de - sitio de clonación múltiple para la inserción de secuencias.

La Figura 8 muestra la estructura de plásmido de CMVP-TFP250-pA/1054 (FAV RHE) con la señal de secreción del interferón gamma, mostrado previamente en el anexo como "pl232_entire" . La secuencia completa es representada como SEQ ID NO: 17 en este documento. En esa secuencia, la secuencia de señal de secreción se codifica por SEQ ID NO: 18 la cual se localiza en los nucleótidos 5629..5712 de SEQ ID NO: 17 y se traduce en la proteina de SEQ ID NO: 19. El inserto TFP250 truncado se codifica por la secuencia de SEQ ID NO: 20 la cual está localizada en los nucleótidos 5713 a 6348 de SEQ ID NO: 17 y se traduce a la secuencia de SEQ ID NO: 21. El plásmido tiene una secuencia promotora C V en la ubicación 4965...5623. La información representada en esta figura y la información de la secuencia asociada se presentó previamente en el anexo de la solicitud de prioridad, Solicitud de Patente Provisional de E.U.A. No. 61/122,596, la cual se presentó el 15 de Diciembre del 2008 (incorporada en este documento a manera de referencia en su totalidad) .

La Figura 9 muestra la estructura de plásmido de MLP-R56-pA-pA/1054 (FAV RHE) con la señal de secreción del interferón gamma, mostrado previamente en el anexo como "pl223_entire" . La secuencia completa es representada como SEQ ID NO: 22 en este documento. En esa secuencia, la secuencia de señal de secreción se codifica por SEQ ID NO: 23 la cual está localizada en los nucleótidos de 5381..5461 de SEQ ID NO: 22 y se traduce en la proteina de SEQ ID NO: 6. El inserto R56 truncado se codifica por la secuencia de SEQ ID NO:24 la cual está localizada en los nucleótidos 5462 a 6430 de SEQ ID NO: 22 y se traduce a la secuencia de SEQ ID NO: 25. El plásmido tiene una secuencia MLP en los nucleótidos 5381...5461. La información representada en esta figura y la información de secuencia asociada se presentó previamente en el anexo de. la Solicitud de Prioridad, Solicitud de Patente Provisional de E.U.A No. 61/122,596, la cual se presentó el 15 de Diciembre de 2008 (incorporada en este documento a manera de referencia en su totalidad) .

Las Figuras 10A-10C muestran la secuencia de la proteina 82kDa de E. máxima. Las secuencias mostradas en esta figura son SEQ ID NO: 26 (hebra superior); SEQ ID NO: 27 (hebra inferior) y SEQ ID NO:28 (secuencia de proteínas).

La Figura 11 muestra una comparación de la secuencia R56 de E. máxima. (SEQ ID NO:2), la secuencia R56 de E. tenella (SEQ ID NO:29). La secuencia de un R56 truncado que carece de la secuencia de señal (SEQ ID NO: 30) también se representa. La porción inferior de la figura muestra una alineación de un R56 de E . tenella (SEQ ID NO: 31) con un R56 truncado de E. máxima (SEQ ID NO:32). Esta figura de información de secuencia se presentó previamente en el anexo de la solicitud de la prioridad, Solicitud De Patente Provisional de E.U.A. No. 61/122,596, la cual se presentó el 15 de Diciembre de 2008 (incorporada en este documento a manera de referencia en- su totalidad) .

La Figura 12 muestra las versiones cortas de R56 de E. máxima (SEQ ID NO:33) y E. tenella (SEQ ID NO:34). Esta figura de información de secuencia se presentó previamente en el anexo de la solicitud de prioridad, Solicitud de Patente Provisional de E.U.A. No. 61/122,596, la cual se presentó el 15 de Diciembre de 2008 ' (incorporada en este documento a manera de referencia en su totalidad) .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente ¦ invención se refiere a métodos de preparación y uso de composiciones de vacuna virales recombinantes que se pueden administrar a una población de pollos para la producción de carne para inmunidad protectora de estas aves contra la coccidiosis. Esta vacuna se puede administrar a las aves después de que salen del cascarón y no requieren administración por inyección pero en cambio se pueden administrar oralmente, a través del suministro de alimento, el suministro de bebida o aún como un rocío de aerosol. Una ventaja de los constructos de vacuna de la invención es que dirigen la expresión del inmunogeno que se administra a un sitio extracelula'r en la célula infectada antes que la expresión interna del inmunogeno. En el caso de las vacunas descritas en este documento, el inmunogeno se administra de esta manera a la superficie exterior de las células de la mucosa (por ejemplo, células de la mucosa en los pasajes nasales, ' el tracto respiratorio, el tracto gastrointestinal, la mucosa intestinal y similares) presentando en consecuencia el inmunogeno en un sitio donde una respuesta inmunitaria se puede montar rápidamente como es opuesta a la expresión del inmunogeno administrado dentro de las células donde no puede entrar en contacto eficientemente con la maquinaria de respuesta inmunitaria apropiada.

Las vacunas existentes no cumplen la necesidad largamente anhelada en la técnica por una vacuna de coccidiosis efectiva para una variedad de razones. En primer lugar, la vacuna CoxAbicMR actualmente disponible para tratar coccidiosis confiere solamente inmunidad a la madre y depende de la transferencia de esa inmunidad a la población de pollos para la producción de carne a través de la yema de huevo. La inmunidad materna dura durante un periodo relativamente corto de aproximadamente los primeros 14 días después de que se abre el huevo. De esta manera no es una vacuna efectiva para inducir una respuesta a largo plazo específicamente en pollos para la producción de carne. Por otra parte, la vacuna se administra por la vía de inyección. Nuevamente, esto vuelve la vacuna ineficaz para tratar grandes poblaciones de aves más viejas.

Para combatir los problemas con los tratamientos existentes para la coccidiosis, los presentes inventores han desarrollado una nueva vacuna para conferir inmunidad protectora a los pollos para la producción de carne. La vacuna se basa en un sistema de expresión de adenovirus aviar que permite la expresión de un antígeno de Eimeria en una vacuna de subunidad. El antíg no se expresa dentro del marco con una secuencia de señal hidrofóbica y se presenta ya sea sobre la superficie celular de las células infectadas con virus en el pollo al cual la vacuna se ha administrado o se secreta alternativamente dentro del dominio extracelular en estos pollos infectados en caso de que el vector de expresión sea uno en el cual la secuencia de señal hidrofóbica también comprenda una señal de escisión. Estas características y métodos y composiciones para usar vacunas de coccidiosis de adenovirus aviar recombinantes se describan con detalle adicional en este documento a continuación.

En términos generales., la vacuna de la presente invención está comprendida de un vector de expresión que se hace de un genoma de adenovirus aviar y es reconocida como se muestra en la Figura 1. Los adenovirus aviar o de ave (FAV) son bien conocidos por aquellas personas de experiencia en el campo y se han caracterizado extensivamente. Por ejemplo, se ha descrito un adenovirus aviar, llamado cepa de tipo 1 de adenovirus aviar CELO (para embrión de pollo letal huérfano) , (Chiocca, S. y colaboradores, J. Virol. 70:2939-49 (1996); Li, P. y colaboradores, J. Gen. Virol. 65 (Pt 10) : 1817-25 (1984); May, J. T. y colaboradores, Virology 68:483-9 (1975); Lehrmann, H., Cotton, M . , J. Virol. 73:6517-25 (1999); Chiocca, S. y colaboradores, J. Virol. 71:3168-77 (1997)). El uso y métodos para manipular el CELO para formar vectores para la terapia génica y para el uso en vacunas contra enfermedades infecciosas en humanos y animales y particularmente aves también se ha descrito extensivamente en por ejemplo, la Patente de E.U.A. No. 6,335,016. La secuencia de genoma completa de CELO (FAV 1 o FAV A) se puede encontrar en el Acceso de Genbank Nos. U46933; NC_001720, y AC_000014.

En modalidades especificas, el vector de adenovirus aviar usado en los métodos y composiciones descritas en este documento es un vector adenovirus aviar (FAV), tal como se describe en los documentos de E.U.A. Nos. Ser. 08/448,617 y 09/272,032, los contenidos de las cuales se incorporan en este documento a manera de referencia. En una modalidad particularmente preferida, el vector comprende el extremo derecho del serotipo 8 FAV (a partir de ahora " FAV8") . La secuencia de nucleótidos completa de FAV8 se expone en este documento' como SEQ ID NO: 5. La secuencia de nucleótidos completa del vector de expresión de FAV8 también está contenida en el Acceso de GenBank No. AF155911. El método para el aislamiento y producción de FAV 8 se describe en la Patente de E.U.A. No 6,296,852 (incorporada en este documento a manera de referencia en su totalidad) .

El FAV 9 (también referido como FAV D) se describe por Cao y colaboradores, J. Gen. Virol. 79 (Pt 10), 2507-2516 (1998) y el genoma completo del mismo se muestra en los números de Acceso de GenBank Nos. AF083975 y NC_000899.

Dadas las enseñanzas de las secuencias de FAVs conocidas por aquellas personas de experiencia en la técnica, las vacunas de la presente invención se pueden preparar fácilmente usando FAV 1, FAV 2, FAV 3, FAV 4, FAV 5, FAV 6, FAV 7, FAV 8, FAV 9, FAV 10, FAV 11, FAV 12 o cualquier serotipo subsecuentemente aislado de adenovirus aviar (véase Monreal, G. Adenoviruses and adeno-associated viruses of Poultry. Poultry Science Rev. 4, p. 1-27 (1992) para la clasificación del virus) . Como se describe en la Patente de E.U.A. No. 6,296,852, FAV CFA20 (el cual es un serotipo FAV 10), CFA15 (serotipo 10) y CFA 40 y CFA 44 (ambos serotipos 8) y FAV CFA15 y CFA19 (serotipo 9) pueden ser particularmente útiles para la producción de vacunas.

En las vacunas preparadas en este documento el promotor usado puede ser cualquier promotor que pueda conducir la expresión de una región de codificación heteróloga de interés en un constructo de FAV. Estos promotores incluyen pero- no se limitan a promotor tardío principal adenoviral aviar (MLP) , CMVp, PGK-, El-, promotor-temprano SV40 (SVG2), promotor tardío SV40, promotor temprano inmediato SV-40, promotor tardío T4, y promotor del gen HSV-I TK (timidina cinasa tipo 1 del virus del herpes) , el promotor del gen RSV (Virus de Sarcoma de Rous) LTR (repetición terminal prolongada) y el PGK ( fosfoglicerato cinasa) . La secuencia de ADN del FAV MLP se muestra en Figura 5 de la patente de E.U.A. No. 6,296,852. Muchos otros promotores de mamífero o de aves son conocidos por aquellas personas de experiencia en la técnica y también se pueden usar.

El promotor usado en las vacunas descritas en este documento conduce la expresión de una fusión dentro del marco de una secuencia de señal hidrofóbica enlazada dentro del marco con una secuencia de- ácidos nucleicos de un marco abierto de lectura o región de codificación de interés. La secuencia de señal hidrofóbica puede ser cualquier secuencia que se pueda usar para fijar como objetivo o dirigir específicamente la expresión del marco abierto de lectura o región de codificación de interés a la membrana exterior de la célula hospedera que se infecta con el vector de expresión adenoviral aviar. En la presente invención el vector de expresión basado en FAV se propone para infectar pollos. El FAV infecta típicamente las células de la mucosa, hígado y epiteliales del pollo las cuales se pueden encontrar por ejemplo en el tracto intestinal, el tracto respiratorio o el tracto gastrointestinal del pollo. De esta manera, la secuencia de señal hidrofóbica es una que hace circular la expresión del marco abierto de lectura o región de codificación de interés sobre la superficie celular es de estas células de la mucosa. De esta manera, al presentar el marco abierto de lectura o región de codificación de interés en la superficie celular de las células de la mucosa en el animal, la vacuna de la invención es capaz de administrar efectivamente el antígeno al sitio interno donde una respuesta inmunitaria se puede montar efectivamente como es opuesta a la expresión dentro de la célula de animal donde puede ser menos efectiva en facilitar el montaje de una respuesta inmunitaria. Esta secreción extracelular de los productos de expresión a través del uso de las vacunas actualmente descritas conduce a una mayor respuesta inmunitaria de anticuerpos y la producción de anticuerpos que se observa cuando la vacuna se prepara con los inmunógenos de tipo natural.

En las células eucarióticas , las proteínas secretoras se fijan como objetivo a la membrana del retículo endoplásmico por las' secuencias de señal hidrofóbicas . La presente invención usa esta propiedad para emplear secuencias de señal hidrofóbicas heterólogas para dirigir la expresión de una proteína dada en la vacuna a la superficie celular.

Los vectores virales empleados en este documento son vectores recombinantes en que comprenden un constructo de polinucleótido que contiene ácido nucleico que codifica un ORF modificado en el cual el producto de expresión del ORF permite la secreción (de la célula infectada) de la proteína ORF truncada en la expresión o expresa directamente la proteína sobre la superficie de la célula infectada. Por ejemplo, el ORF de interés se expresa dentro del marco con la secuencia de señal del interferón gamma de pollo, interferón gamma porcino o la proteína HA del virus de influenza. Otras secuencias señal que se pueden usar incluyen, por ejemplo, la secuencia de señal de la secuencia de señal de fosfoproteína de suero; glicoproteína' acida or-1; a-tirotropina ; insulina de mixino; insulina de pejesapo; insulina humana; insulina de rata I o II; ß-caseína de ovino; x-caseína de ovino; a-lactalbúmina de ovino; ß-lactoglobulina de ovino; caseína a- si de ovino y caseína a-s2 de ovino; glicoproteína de virus VS; VLDL-11 de gallito; melitina de abeja; lactina de rata; lactógeno de placenta humana; ß-coriogonadotropina humana; a-coriogonadotropina humana; uteroglobina de rata; hormona de crecimiento de rata; hormona de crecimiento humana; hormona de crecimiento de bovino; hormona de la paratiroides de bovino; relaxina de rata; albúmina de suero de rata; albúmina de suero humana; albúmina de hígado de rata; tropoelastina B de pollo; de pollo; lisozima de pollo; conalbúmina de pollo; antitripsina a-1 humana; proteína de enlace prostática de rata; proteína de enlace prostática de rata c2; glicoproteína de virus AD; apolipoproteína Al de rata; glicoproteína de virus de rabia; hemaglutinina Victoria de influenza humana; hemaglutinina Jap de influenza humana; hemaglutinina FPV de influenza aviar; interferón de leucocito humano; interferón inmune humano; interferón¦ de fibroblasto humano; x-inmunoglobulina de ratón; ?-inmunoglobulina de ratón; x-inmunoglobulina de ratón; inmunoglobulina de cadena H de ratón; VH-inmunoglobulina embriónica de ratón; inmunoglobulina de cadena H de ratón; tripsinógeno 1 canino; tripsinógeno 2 + 3 de canino; quimotripsinógeno 2 de canino; carboxipeptidasa Al canina; amilasa canina; amilasa de ratón; amilasa de rata; a-lactalbumina de conejo; a-lactalbumina porcina; carboxipeptidasa A de rata; precursor ????-ß-?,?? bovino; precursor ????-ß-??? porcino; precursor ????-ß-??? humano; gastrina porcina; renina de ratón; glicoproteina de tripanosoma; somatostatina de pez gato; somatostatina de pejesapo; calcitonina de rata; y glucagones de pejesapo. Cara una de estas secuencias señal se muestra en la Figura 1 de von Heijne y colaboradores Eur. J. Biochem 133 17-21 (1983) y se' pueden adaptar fácilmente para el uso en este documento. La secuencia de señal de la Figura 1 de la referencia mencionada anteriormente se reproducen en la Figura 4 en este documento.

Estos y otros sitios de pépt'ido de señal para una proteina dada se pueden determinar fácilmente usando métodos conocidos por aquellas personas de experiencia en la técnica. Por ejemplo, el sitio de péptido de señal se puede predecir usando el servidor SignalP 3.0 (Bendtsen, J. D. , Nielsen, H., von Heijne, G. & Brunak, S. (2004) predicción mejorada de péptido señal: SignalP 3.0. J. Mol. Biol. 340, 783-795). Adicionalmente, existen sitios de la red disponibles para facilitar la determinación de la secuencia de señal véase por ejemplo, http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/. La identidad exacta de la secuencia de señal usada no es importante siempre y cuando sea una secuencia hidrofóbica que sea capaz de hacer circular el producto expresado a la superficie celular.

En modalidades preferidas, la secuencia de señal contiene un sitio de escisión que permite que la secuencia de señal se escinda y permite que la proteina unida sea el espacio extracelular secretado de estas células. En modalidades particularmente preferidas, este aspecto de la invención se muestra usando las secuencias señal de gamma IFN de pollo que contiene la secuencia: MTCQTYNLFVLSVIMIYYGHTASSLNL (SEQ ID NO: 6) codificada por la secuencia de ADN de ATG ACT TGC CAG ACT TAC AAC TTG TTT GTT CTG TCT GTC ATC ATG ATT TAT TAT GGA CAT ACT GCA AGT AGT CTA AAT CTT (SEQ ID NO:7), una secuencia de señal hidrofóbica para el gamma IFN porcino es: MSYTTYFLAFQLCVTLCFSGSYC (SEQ ID NO:8), la cual se codifica por la secuencia de ADN de ATG AGT TAT ACA ACT TAT TTC TTA GCT TTT CAG CTT TGC GTG ACT TTG TGT TTT TCT GGC TCT TAC TGC (SEQ ID NO: 9), una secuencia de señal hidrofóbica para el virus de influenza humana H1N2 es: MKVKLLI LLCTFTATYADTI (SEQ ID NO: 10) codificado por una secuencia de: atg aaa gta aaa eta ctg ate ctg tta tgt acá ttt acá get acá tat gca ' gac acá ata (SEQ ID NO: 11) . Cada una de estas secuencias ejemplares también contiene un sitio de escisión en el cual una peptidasa de señal actúa y da por resultado la liberación del ORF expresado.

Además del promotor y la secuencia de señal hidrofóbica, las cuales pueden o no contener un sitio de escisión, el vector de expresión comprende además una secuencia de poliadenilación . La cola de polyA protege la molécula de ARNm por la degradación de las exonucleasas en el citoplasma y ayuda en la terminación de la transcripción, la exportación del ARNm del núcleo, y la traducción. Casi todos los ARNms eucarióticos están poliadenilados . Aquellas personas expertas en la técnica agregan rutinariamente una secuencia de cola de polyA para la expresión recombinante de proteínas .

El ORF u otras secuencias exógenas insertadas en los vectores de la presente . invención pueden ser cualquier ORF u otras secuencias exógenas que se desea que se expresen a través del uso de un vector FAV descrito en este documento. Estas otras secuencias exógenas pueden consistir de uno o más ORFs o productos de expresión de interés u otras secuencias de nucleótidos que no son genes pero tienen otras funciones de interés terapéutico.

Sin embargo, en modalidades específicas, la presente invención describe vectores que se van a usar como vacunas de subunidades para la vacunación de pollos contra la coccidiosis. En este contexto el ORF de interés es uno que codifica un antígeno del parásito protozoario apic'omplejo Eimeria. Más específicamente, el ORF se selecciona del grupo que consiste de antígenos de 56kDa, 82kDa y 230kDa como se describe en la Patente de E.U.A. No. 7,423,137 (incorporada en este documento a manera de referencia) . Más particularmente, se ha descubierto por los presentes inventores que la incorporación de la secuencia de longitud completa del antigeno 56kDa (alternativamente referido en este documento como r56) o el 230kDa (alternativamente referido en este documento como TPF250) dentro del FAV no produce una vacuna efectiva. Sin embargo, cuando se usa una secuencia r56 truncada la vacuna es efectiva en inducir una respuesta inmunitaria. La secuencia de aminoácidos de longitud completa de r56 se muestra en SEQ ID NO: 2, esta secuencia de proteina se codifica por una secuencia de SEQ ID NO:l, la r56 que codifica el gen de longitud completa también se representa en SEQ ID NO: 14.. Además, un plásmido que codifica el antigeno 56 kDa es públicamente disponible de los Laboratorios Analíticos del Gobierno Australiano, Pymble, Australia, bajo el No. de Acceso NM01/22400. La célula bacteriana transformada con el antígeno 56 kDa también es disponible del mismo depósito bajo el No. de Acceso NM01/22401. En modalidades específicas, por lo tanto un r56 truncado se usa para la preparación de una vacuna de coccidiosis. La secuencia de r56 es una que comprende - los aminoácidos 24-345 de SEQ ID NO: 2 los cuales se pueden codificar por una secuencia de 70-1035 de SEQ ID NO: 14. En una vacuna de coccidiosis preferida de la invención, la secuencia truncada de r56 está dentro del marco con una secuencia de señal hidrofóbica que ancla el r56 truncado a la superficie celular de la célula infectada. En otra vacuna de coccidiosis preferida de la invención, la secuencia truncada de r56 está dentro del marco con una secuencia de señal hidrofóbica que comprende un sitio de escisión tal que en el tráfico al lado extracelular de la membrana, el r56 truncado se libera dentro del espacio extracelular de la célula. En modalidades especificas, se proporciona una vacuna de coccidiosis en la cual ' la proteina r56 anclada se ancla a la superficie de las células a través de una secuencia de señal hidrofóbica de un antigeno HA de influenza aviar. En aún otras modalidades especificas, se proporciona una vacuna de coccidiosis en la cual la secuencia de señal hidrofóbica que contiene un sitio de escisión se selecciona del grupo que consiste de gamma interferón de pollo, gamma interferón porcino, y virus de influenza humana H1N2. En ciertas modalidades, se puede preparar una composición de vacuna de coccidiosis que comprende ambos tipos de vacunas, es decir, una vacuna que permite ' la expresión de la superficie celular del r56 truncado y una vacuna que libera el r56 expresado dentro del espacio extracelular.

En todavía otras modalidades ejemplares, se usa un TFP250 truncado para la preparación de una vacuna de coccidiosis. La secuencia de longitud completa de TFP250 se muestra en SEQ ID NO: 4 y se codifica por SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 16. Un plásmido que codifica el antigeno 250 kDa es públicamente disponible de los Laboratorios Analíticos del Gobierno Australiano, Pymble,. Australia bajo el No. de Acceso NM01/22396. Una célula bacteriana transformada con este antígeno es disponible del mismo depósito bajo el No. de Acceso NM01/22397. La secuencia de TFP250 usada en las vacunas preferidas en este documento es una que comprende los aminoácidos 2149-2361 o aminoácidos 2150-2361 de SEQ ID NO: 4 que se pueden codificar por una secuencia de 6444-7083 y 2149-2361, respectivamente de SEQ ID NO: 16. En una vacuna de coccidiosis diferida de la invención, la secuencia truncada de TFP250 está dentro del marco con una secuencia de señal hidrofóbica que ancla el TFP250 truncado a la superficie celular de la célula infectada. En otra vacuna de coccidiosis preferida de la invención, la secuencia truncada de TFP250 está dentro del marco con una secuencia de señal hidrofóbica que comprende un sitio de escisión tal que en el tráfico al lado extracelular de la membrana, el TFP250 truncado se libera dentro del espacio extracelular de la célula. En modalidades específicas, se proporciona una vacuna de coccidiosis en la cual la proteína r56 anclada se ancla a las superficies de las células a través de una secuencia de señal hidrofóbica de un antigeno HA de influenza aviar. En aún otras modalidades especificas, se proporciona una vacuna de coccidiosis en. la cual la secuencia de señal hidrofóbica que contiene un sito de escisión se selecciona del grupo que consiste de gamma interferón de pollo, gamma interferén porcino y virus de influenza humana H1N2. En ciertas modalidades, se puede preparar una composición de vacuna de coccidiosis que comprende ambos tipos de vacunas, es decir, una vacuna que permite la . expresión de la superficie celular del TFP250 truncado y una vacuna que libera el TFP250 expresado dentro el espacio extracelular.

De la misma manera, también se contempla que las vacunas también se puedan reparar en conjunto con las vacunas que expresan el antigeno de 82kDa de Eimeria. El antigeno de 82kDa (también referido en este documento como gam82) está públicamente disponible de los Laboratorios Analíticos del Gobierno Australiano, Pymble, Australia bajo el No. de Acceso NM01/22398 y una célula bacteriana transformada con el antígeno 82 kDa es disponible del mismo depósito en el No. de Acceso NM01/22399 (y se muestra en el anexo en este documento) . Cualquiera de las vacunas de la presente invención se puede usar en combinación con protocolos de vacunación existentes. .Por ejemplo, las vacunas descritas en este documento se pueden usar en combinación con CoxAbicMR para producir inmunidad protectora en criadores, pollos y en pollos más viejos.

Mientras que muchos de los ejemplos descritos en este documento se relacionan con las vacunas preparadas de antigenos de Eimeria máxima, será fácilmente evidente que la persona experta puede preparar estas vacunas usando secuencias homologas de otras especies Eimeria. La persona experta puede identificar fácilmente estas secuencias de ADN apropiadas por la via de la homología a las secuencias anteriores de los marcos de lectura abiertos de Eimeria máxima usando técnicas de biología molecular convencionales. De esta manera, los homólogos de ORFs de r56, TFP25 y 82kDa de Eimeria máxima de otras especies de Eimeria, por ejemplo, Eimeria tenella, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti se contemplan específicamente para la preparación de vacunas de coccidiosis descritas en este documento. En este aspecto, SEQ ID NO: 12 proporciona la secuencia de r56 de Eimeria tenella. Dado que la secuencia r56 de Eimeria tenella y Eimeria máxima se muestran por ser efectivas, la persona experta será fácilmente capaz de identificar los homólogos de r56 de otras especies de Eimeria para el uso en los métodos y composiciones descritos en este documento.

En modalidades preferidas, las vacunas de la invención se usan para proporcionar un método para inmunizar un sujeto contra la infección por Eiweria tenella, Eimeria máxima, Eimeria acervulina, Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti , o un microorganismo que expresa un antigeno inmunológicamente de reacción cruzada que comprende la etapa de administrar al sujeto la vacuna de la invención objeto. En modalidades particularmente preferidas, el sujeto es una especie aviar que incluye pero no se limita a una especie aviar seleccionada del grupo que consiste de pollos, pavos, gansos, patos, gallinillas enanas, codornices y pichones. En modalidades particularmente preferidas, las especies aviares son pollos, y más específicamente pollos para la producción de carne.

La vacuna se puede administrar a través de cualquier vía empelada típicamente para vacunación incluyendo pero no limitado a, sistémica (por ejemplo, intravenosa, intratraqueal , intravascular , intrapulmonar, intraperitoneal, intranasal, parenteral, entérica, intramuscular, subcutánea, intratumoral o intracranealmente ) , mediante la administración oral, por aerosolización o instilación intrapulmonar. La administración puede tomar lugar en una sola dosis o en dosis repetidas una o más veces después de ciertos intervalos de tiempo. La vía de administración apropiada y dosis variarán de acuerdo con la situación (por ejemplo, el individuo que se rata, el desorden que se trata o el ORF o fragmento del polipéptido de interés), pero se puede determinar por una persona de experiencia ordinaria en la técnica.

La vacuna se puede administrar de acuerdo con un régimen de administración convencional, por ejemplo, como una sola administración o administración repetida de una manera compatible con la formulación de dosificación, y en tal cantidad como será profilácticamente efectiva, es decir la cantidad de antigeno de inmunización o microorganismo recombinante capaz de expresar el antigeno que inducirá la inmunidad en aves (especialmente aves de corral) contra el refuerzo para los parásitos de Eimeria virulentos. La inmunidad se define como la inducción de un nivel significativo de protección en una población de aves después de la vacunación comparada con un grupo no vacunado. En modalidades especificas, la inmunidad conferida es una inmunidad aumentada en donde las vacunas de la invención inducen un nivel de protección en una población de aves después de la vacunación que es más efectiva que la protección observada cuando las aves se vacunan con un vector de FAV de subunidad que comprende un r56 de longitud completa o un antigeno TFP 250 de longitud completa o un antigeno de 82kDa de longitud completa. Se observa que esta vacunación es más efectiva debido a que las vacunas de subunidades actuales tienen una mayor estabilidad que las vacunas de subunidades preparadas de las secuencias de longitud completa.

Una vacuna de la invención puede reducir el número de ooquistes diseminados por los animales infectados. Normalmente, los ooquistes diseminados infectarán otros animales en la parvada. Una disminución en el número de ooquistes diseminados luego también proporcionará una disminución en el número de. animales los cuales se infecta subsecuentemente y también una disminución en el número de ooquistes diseminados dará origen a una carga infecciosa menor. En modalidades especificas, las vacunas de la presente invención reducen el número de lesiones cecales en un ave cuando se refuerza con una infección de Eimeria subsecuente.

Típicamente, en las vacunas de vector viral vivo, la proporción de dosis por pollo puede variar de 102 a 1010 pfu (pero incluso <1000 pfu podrían ser suficientes por ejemplo para HVT) .

Las vacunas de la invención también se pueden mezclar efectivamente con otros componentes antigénicos de la misma y/u otra especie de Eimeria, y/o con inmunógenos adicionales derivados de un virus o microorganismo' patogénico de aves de corral y/o secuencias de ácido nucleico que codifican estos inmunógenos . Esta vacuna de combinación puede disminuir la carga parasítica en una parvada de aves y puede incrementar el nivel de protección contra la coccidiosis, y además de protegerlas con otros patógenos de aves de corral. Estos otros inmunógenos pueden incluir por ejemplo ser seleccionados del grupo del virus o microorganismos patogénicos de aves de corral que consisten de virus de Enfermedad de Marek (MDV) , virus de Enfermedad de Newcastle (NDV) , virus de Bronquitis Infecciosa (IBV), Agente de Anemia del Pollo (CM) , virus Reo, Retrovirus aviar, Adenovirus Aviar, virus de Rinotraqueitis de Pavo, especies Salmonella o E. Coli. De esta manera, las vacunas multivalentes se contemplan por la presente invención. Las vacunas multivalentes particularmente preferidas son aquellas vacunas de coccidiosis de la presente invención que están comprendidas de los vectores que expresan r56 descritos anteriormente en combinación con los vectores de adenovirus aviares que expresan TFP250 descritos anteriormente y/o en combinación con los vectores de adenovirus aviares que expresan el antígeno de 82kDa descritos anteriormente.

Una ventaja particular de las vacunas de la presente invención que se preparan de antígenos truncados de Eimeria máxima expresados en las vacunas de subunidades basadas en FAV es que - se pueden administrar a través de un rocío de aerosol o a través de gotas para los ojos o aún ser administradas en el agua para beber, en ovo, o en la alimentación de aves de las aves para producción de carne o formuladas como una matriz de gel que se ingiere por las aves haciendo en consecuencia que estas vacunas sean aplicables a una vacunación a gran escala de aves para producción de carne aún bajo condiciones de sobrehacinamiento típicas. De esta manera de manera preferible, la vacuna se puede preparar con excipientes que facilitan el rocío de la vacua para lograr la administración de la misma.

Estas vacunas de la invención se pueden rociar sobre o alimentar a pollitos recientemente nacidos y se pueden rociar del mismo modo y alimentar a aves más viejas.

Las vacunas de la invención son capaces de proteger las aves de corral contra los efectos patogénicos de la infección de Eimeria de una manera que crea una respuesta inmunitaria más pronunciada y confiere mejor inmunidad que una vacua similar creada con una secuencia de longitud completa de r56 o una secuencia de longitud completa de TFP250.

Las vacunas de acuerdo con la presente invención se pueden hacer por ejemplo al mezclar simplemente los vectores de adenovirus aviar descritos anteriormente con un portador farmacéuticamente aceptable. Un portador farmacéuticamente aceptable se entiende que s un compuesto que no afecta adversamente la salud del animal , que se vacuna, por lo menos al grado en que el efecto adverso es peor que los efectos observados debido a la enfermedad cuando el animal no se vacuna. Un portador farmacéuticamente aceptable puede ser por ejemplo agua estéril o una solución de sal fisiológica estéril. En una forma más compleja, el portador puede ser por ejemplo una solución amortiguadora.

Alternativamente, las vacunas de coccidiosis de la presente invención también pueden contener un adyuvante. Los adyuvantes comprenden en general sustancias que refuerzan la respuesta inmunitaria del hospedero de una manera no especifica. Son conocidos en la técnica una variedad de adyuvantes diferentes. Ejemplos de adyuvantes son adyuvante completo o incompleto de Freund, vitamina E, polímeros de bloque no iónicos y poliaminas tal como sulfato de dextrano, carbopol y pirano. También son muy adecuadas las sustancias activas superficiales tal como Span, Tween, hexadecilamina , lisolecitina, metoxihexadecilglicerol y saponinas tal como Quill AMR. Adicionalmente, los péptidos tales como muramildipéptidos , dimetilglicina , tuftsina, se usan frecuentemente. Junto, a estos ¦ adyuvantes, los Complejos Inmunoestimulantes (ISCO S), por ejemplo aceite mineral BayolMR o MarkolMR, aceites vegetales o emulsiones de los mismos y DiluvacMR Forte se pueden usar ventajosamente. La vacuna también puede comprender un "vehículo". Un vehículo es un compuesto al cual el polipéptido se adhiere, sin ser enlazado covalentemente al mismo. Los compuestos de vehículos frecuentemente usados son por ejemplo hidróxido de aluminio, -fosfato, sulfato u óxido, sílice, caolín y bentonita. Una forma especial de este vehículo, en el cual el antígeno se incrusta parcialmente en el vehículo, es el así llamado ISCOM (EP 109,942, EP 180,564, EP 242,380).

La composición de vacuna puede comprender adicionalmente estabilizantes, por ejemplo para proteger los polipéptidos propensos a degradación de ser degradados, para aumentar la vida de anaguel de la vacuna, o para mejorar la eficiencia de deshidratación por congelación. Los estabilizantes útiles incluyen leche descremada, gelatina, albúmina de suero bovino, carbohidratos por ejemplo sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa, proteínas tal como albúmina o caseína, o productos de degradación de las mismas y soluciones amortiguadoras, tal como fosfatos de metal alcalino.

El material deshidratado por congelación se puede almacenar y mantener viable por muchos años. Las temperaturas de almacenamiento para el material deshidratado por congelación pueden estar muy por arriba de cero grados, sin ser perjudiciales al material. En ciertos aspectos, las vacunas se deshidratan por congelación.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos muestran la producción de vacunas de acuerdo con la presente invención. En estos ejemplos, se usó el serotipo 8 de adenovirus aviar (FAV8) . Un mayor beneficio del uso de este sistema de administración depende de su capacidad de usar FAV8 atenuado como un vector para la administración de la vacuna de subunidad al tejido objetivo apropiado (en este caso la mucosa intestinal).

Ejemplo 1 : Preparación y Análisis de los Constructos En el presente ejemplo, una de las proteínas más inmunogénicas de la etapa de macrogametocito de los parásitos Eimeria, la proteína recombinante - r56, se clonó en un vector de FAV8. Además, otra proteína inmunogénica de la etapa de merogonia de Eimeria, la proteína recombinante -TFP250, se clonó separadamente dentro de otro vector de FAV8. Este TFP250 ORF codifica una porción de una proteína de micronema (un organelo implicado en la invasión parasítica), que en estudios previos se mostró que también induce inmunidad protectora parcial contra una infección de estimulación con Eimeria.

Los constructos de expresión formados se muestran las siguientes dos Tablas Porciones del gen R56 como se usa en los constructos de Coccidiosis : Constructo Inserto de ácido Aminoácido R56 nucleico que codificado codifica R56 1222 CMVp-R56-pA nucleótidos 70-1035 aminoácidos 24-345 secretado de SEQ ID NO: 14 de SEQ ID NO: 2 1224 C Vp-R56-pA nucleótidos 73-1035 aminoácidos 25-345 de membrana de SEQ ID NO: 14 de SEQ ID N0:2 1228 C Vp-R56-pA nucleótidos 70-1035 aminoácidos 24-345 nativo de SEQ ID NO: 14 de SEQ ID NO: 2 1223 MLP-R56-pA nucleótidos 70-1035 aminoácidos 24-345 secretado de SEQ ID NO: 14 de SEQ ID NO: 2 1225 MLP-R56-pA nucleótidos 73-1035 aminoácidos 25-345 de membrana de SEQ ID NO: 14 de SEQ ID NO : 2 1229 MLP-R56-pA nucleótidos 70-1035 aminoácidos 24-345 nativo de SEQ ID NO: 14 de SEQ ID NO: 2 Porciones del gen TFP250 como se usa en los constructos de Coccidiosis : Constructo Inserto de ácido Aminoácido TFP250 nucleico que codif cado codifica TFP250 1230 CMVp-TFP250- nucleótidos 6436- aminoácidos 2146-pA nativo 7083. de SEQ ID 2361 de SEQ ID NO: 16 NO: 4 1232 CMVp-TFP250- nucleótidos 6444- aminoácidos 2149- pA secretado 7083 de SEQ ID 2361 de SEQ ID NO: 16 NO: 4 1234 CMVp-TFP250- nucleótidos 6448- aminoácidos 2150- pA de membrana 7083 de SEQ ID 2361 de SEQ ID NO: 16 NO: 4 1231 MLP-TFP250- nucleótidos 6436- aminoácidos 2146- pA 7083 de SEQ ID 2361 de SEQ ID nativo NO-: 16 NO: 4 1233 MLP-TFP250- nucleótidos 6444- aminoácidos 2149- pA 7083 de SEQ ID 2361 de SEQ ID secretado NO: 16 NO: 4 1235 MLP-TFP250- nucleótidos 6448- aminoácidos 2150- pA 7083 de SEQ ID 2361 de SEQ ID de membrana NO:16 NO: 4 A fin de maximizar la respuesta inmunitaria en pollos que usan este sistema de vector, cada ORF que codifica estas dos proteínas se clonó separadamente en tres constructos de expresión FAV8 que conducen a la expresión de ya sea la proteína nativa, una versión anclada a la membrana de la proteína y la forma secretada del antígeno. Los últimos dos constructos FAV8 se lograron por la fusión de una secuencia de señal apropiada cadena arriba al ORF de interés.

El uso del FAV8 como un vector de suministro proporciona un producto final que tiene el potencial de ser introducido a los mercados de pollos para la producción de carne mucho más grandes, debido a que la vacuna será capaz de ser administrada en forma rentable a gran escala.

Sorprendentemente, se descubrió que cuando el r56 de longitud completa se clonó en un vector FAV8 fue inestable en el vector y como tal podría no proporcionar una inmunidad protectora apropiada cuando se administre con una vacuna de subunidad. Sin embargo, cuando las versiones truncadas del antígeno se usaron, la inmunidad se demostró claramente.

Se produjeron tres versiones de r56 y tres versiones de TFP250. La versión 1 es el ORF nativo suministrado por UTS y no modificado separado de la inserción de su región de codificación en el cásete de expresión FAV. La versión 2 es la adición de una secuencia de señal de modo que el r56 o TFP250 se secreta de la célula. La versión 3 también tiene una secuencia de señal unida pero esta es para dirigir el r56 o TFP250 a la membrana celular.

La siguiente Tabla resume los resultados de los primeros estudios: *FAV8 "CONFIRMACIÓN "CONFIRMACIÓN CONFIRMA_ RECOMBINANTE POR PCR DEL DE SECUENCIA CIÓN DE LA REDUCIDO ADN DE INTERÉS DEL ADN EXPRESIÓN INSERTADO PROTEÍNICA r56-Vl + + + + (nativo) r56-V2 + + + + (secretado) r56-V3 + . + + + (de membrana) TF250-V1 + + + + (nativo) TF250-V2 + + + + (secretado) TF250-V3 + + + (de membrana ) Para la confirmación de que se obtuvo un virus recombinante el virus se aisló y la placa se purificó usando un medio convencional. Además, se usó PCR para conformar la amplificación de ADN de r56 o TFP250 insertado completo y el polyA se aisló del FAV ADB recombinante asi como también cada sección (promotor, r56 o TFP250 y polyA) . El ADN aislado del FAV recombinante que contiene el cásete de expresión insertado, completo que consiste del promotor, AD de r56 o TFP250 y polyA también se secuenció en ambas direcciones para confirmar la fidelidad del inserto de secuencia. Se confirmó la expresión proteinica usando sueros anti-r56 o anti-TFP250.

Las Figuras 2 y 3 muestran el análisis de proteínas del r56 y TFP250 de los diversos constructos . Se realizaron experimentos de expresión proteinica mediante infección de líneas de células LMH con los diferentes constructos FAV8. Estos constructos se diseñaron con todas las versiones de expresión proteinica (nativa, secretada y ancla de membrana) y bajo control de diferentes promotores (MLP, o CMVp) . Como controles negativos, se usaron células LMH no infectadas y células que se infectaron con el vector FA V8 solo. El antígeno r56 se detectó usando antisueros policlonales creados para el 56 recdmbinante y se detectó el TFP250 usando antisueros de ratón para el péptido recombinante . Se presentaron las bandas de proteina en su peso molecular apropiado con base en el tamaño esperado de los péptidos predichos de los fragmentos del gen parcial que se clonaron. La mancha observada en las lineas 3 y 4 para la TFP250 recombinante (Figura 3) fue probablemente debido a la agregación del péptido con el material de célula hospedera.

A partir de los resultados, todos los constructos parecieron estar bien expresados separados del constructo de ancla de membrana TFP250, el cual no mostró una banda clara. Esto puede ser debido al anclaje de membrana de la proteina expresada y al cambio conformacional potencial después de la extracción de la membrana.

Existen muchas posibilidades diferentes disponibles para alguien experto en la técnica. Para hacer los constructos necesarios, se presentan tres ejemplos a continuación. En la Figura 5, se representa un esquema para la síntesis química del sitio de enzima de restricción, la secuencia de señal dentro del marco con ORF de interés (por ejemplo un r56 truncado, proteína 82kDa o TFP 250) y un segundo sitio de enzima de restricción para dirigir la inserción del constructo dentro de un cásete de expresión de extremo derecho FAV.

Alternativamente, (Figura 6) la persona experta puede amplificar por PCR la secuencia deseada de ORF de interés usando cebadores que tienen los sitios RE apropiados asi como también una secuencia de señal dentro del marco.

En otros ejemplos, la persona experta puede construir el cásete de expresión FAV RHE¦ para contener el promotor con una secuencia de señal luego un CS para la inserción del ORF de interés dentro del marco con la secuencia de señal (Figura 7).

Ejemplo 2 : Inducción de la Respuesta inmunitaria Protectora El presente ejemplo somete a prueba la capacidad de los vectores FAV8-r56 y FAV8-TFP250 para inducir una respuesta inmunitaria protectora que bloquea el desarrollo del E. máxima y previene lesiones por parásitos.

Tabla 2: A fin de evaluar el número de ooquistes necesarios producir lesiones, se condujo un pre-ensayo en el cual 30 pollos SPF se crian bajo condiciones sin coccidiosis (limpieza, agua y alimentación) en jaulas limpias, portátiles. Los pollos se tratan semanalmente para prevenir la infección de coccidiosis antes de la estimulación al administrar amprolio a través de su agua para beber. En el día 28 los pollos se estimularon con el número apropiado de ooquistes de Eimeria máxima por os (véase la Tabla 2) . En el día 34 se realiza el registro de lesión (por lo menos cinco pollos por nivel de dosificación) . El grupo que tiene los registros de lesión más consistentes con un promedio de 3-4, se selecciona para la alta- dosificación de estimulación usada en el ensayo. El mismo lote de ooquistes usado para el pre-ensayo se almacena en dicromato de potasio al 2% a 4°C y se usa en el ensayo.

El pre-ensayo luego se conduce en 400 pollos SPF obtenidos del criadero cerca de Armidale (permite hasta 10% de mortalidad en las primeras 3) asi como también 180 huevos fértiles a 18 días de incubación para la inmunización in ovo.

Se usarán las siguientes vacunas y controles: Controles: No vacunados (control negativo); vector FAV8 solo (control negativo) ; vacunación de proteina r56; y vacunación de proteina TFP250. Las vacunas que se someten a prueba son las vacunas basadas en el constructo FAV8 como sigue: proteina nativa FAV8 - r56; ancla de membrana N- terminal FAV8 - r56; forma secretada FAV8 - r56; proteína nativa FAV8 - TFP250 ancla de membrana N-terminal FAV8 -TFP250 y forma secretadas FAV8 - TFP250.

La concentración de los constructos FAV8 será 1 x 10 por dosis. La vacuna se va a administrar por vía oral, in ovo, o vacunación subcutánea como se describe a continuación.

Para la administración oral de la vacuna se usa una jeringa de 1 mi con una aguja despuntada de calibre 21. El ave se mantiene derecha y su boca se abre suavemente y la aguja despuntada se inserta en la porción anterior de la hendidura coanal. La vacuna se administra lentamente permitiendo que la vacuna bañe la hendidura coanal y la orofaringe antes de ser tragada. De esta manera, la mayor parte de la nasofaringe y casi la cavidad oral completa entran en contacto con la vacuna conforme está siendo administrada .

Para la vacunación in ovo a 18 días de incubación, 180 huevos reciben en el fluido alantoico una inyección de virus (grupos 5, 6, 17, 18, 23 y 24 de huevos cada uno, véase la Tabla 3 a continuación) en el mismo nivel de dosis como aquel usado para los pollitos de un día de nacidos.

Para la vacunación subcutánea e intramuscular usando las bacterias de antígenos recombinantes se concentrarán 10 veces de la concentración de fermentación, lisadas por sonicación en solución amortiguadora de urea; Tris 25mM pH 8.0, urea 6M, NaCl 100 mM y se filtran a través de un filtro de 0.8 µ?. Las emulsiones (fase de agua al 25%) de 100 mi se prepararán de cada 25 mi de muestra CE y de solución amortiguadora de urea y PBS . El adyuvante completo de Freund se usa para el ensayo y la emulsión se prepara justo antes de la inyección.

Cada pollo será vacunado primero subcutáneamente con 0.5 mi por dosis en el día 1 y luego se reforzará intramuscularmente con 0.5 mi por dosis en el día 14.

La siguiente Tabla resume el diseño experimental para vacunación.

No . de Tipo de prueba No . de Vacuna grupo polli os** 1 Conteo de ooquistes 20 No vacunado (control negativo) 2 Registro de lesión 20 No vacunado (control negativo ) 3 Conteo de ooquistes 20 PBS en adyuvante de Freund (grupo de control negativo) 4 Registro de lesión 20 PBS en adyuvante de Freund (grupo de control negativo) 5* Conteo de ooquistes 20 Vector FAV8 solo (control negativo) vacunación in ovo 6* Registro de lesión 20 Vector FAV8 solo (control negativo) vacunación in ovo 7 Conteo de ooquistes 20 vacunación de r56 en adyuvante de Freund 8 Registro de lesión 20 vacunación de r56 en adyuvante de Freund 9 Conteo de ooquistes 20 vacunación de TFP250 en adyuvante de Freund 10 Registro de lesión .20 vacunación de TFP250 en adyuvante de Freund 11 Conteo de ooquistes 20 proteína nativa FAV8-r56 12 Registro de lesión 20 proteína nativa FAV8-r56 13 Conteo de ooquistes 20 ancla de membrana N- terminal FAV8-r56 14 Registro de lesión 20 ancla de membrana N- terminal FAV8-r56 15 Conteo de ooquistes 20 Forma secretada FAV8-r56 16 Registro de lesión 20 Forma secretada FAV8-r56 17* Conteo de ooquistes 20 Forma secretada FAV8- r56. Vacunación in ovo IB* Registro de lesión 20 Forma secretada FAV8- r56. Vacunación in ovo 19 Conteo de ooquistes 20 Proteina nativa FAV8- EmTFP250 20 Registro de lesión . 20 Proteina nativa FAV8- EmTFP250 21 Conteo de ooquistes 20 Forma de membrana FAV8- EmTFP250 22 Registro de lesión 20 Forma de membrana FAV8- EmTFP250 23* Conteo de ooquistes 20 Forma secretada FAV8- EmTFP250. Vacunación in ovo 24* Registro de lesión 20 Forma secretada FAV8- EmTFP250. Vacunación in ovo A fin de evitar contaminaciones de coccidiosis los pollos se tratarán semanalmente con amprolio en su agua para beber en los días 7, 14 y 21. Por otra parte, la infección de coccidiosis se evitará al limpiar completamente los aisladores, instalación, etcétera y todos los trabajadores se cambiarán la ropa en la entrada. En el dia 26, se tomarán muestras fecales para someter a prueba la presencia de ooquistes de Eimeria. En el dia 28, los pollos usados para medir la excreción de ooquistes se estimularán con 100 ooquistes espurulados de E. máxima por os y aquellos para registro de lesión recibirán . el número de ooquistes espurulados que causan patología significativa como es determinado en un pre-ensayo (20-50,000).

El ensayo anterior seguirá el siguiente programa.

En el día 18 de la incubación del huevo, Ira vacunación in ovo del grupo 3, 9 y 12.

En el día 21 de incubación del huevo, los pollitos de los grupos vacunados in ovo se sacan el cascarón en 3 incubadoras de huevos separadas.

En el día 1, se lleva a cabo la Ira vacunación de todos los otros grupos.

En el día 14, se lleva a cabo la 2da vacunación de todos los pollitos (incluyendo los grupos 3, 9 y 12) .

En el día 28, se les extrae sangre a los pollos para pruebas serológicás y luego se estimulan con E. máxima, con el número correcto de ooquistes requeridos por pollo para el registro de lesión (con base en los resultados del pre-ensayo) o 100 ooquistes por pollo para el conteo de ooquistes .

En el día 34 el registro de lesión se realiza en los grupos que recibieron la dosificación grane de ooquistes.

En los días 34-37 se recolectan las heces en una sola pileta de cada grupo de pollos infectados con 100 ooquistes, y en el día 37 se realizan los conteos de ooquistes en todas las muestras.

En el día 42 (14 días después de la infección) a las aves se les extrae sangre para pruebas serológicás y se sacrifican .

Se realiza la prueba in vitro para evaluación de la respuesta inmunitaria en la cual se conduce una prueba de serologia pos-inmunización de cuatro semanas (días 28) en la placa recubierta con FAV8 (TropBio Ltd.) para asegurar la infección de los constructos FAV8 (para toda la parvada) . También se realizarán ensayos ELISA a los sueros posinmunización de cuatro semanas asi como también a los sueros pos-estimulación de 14 días, sobre placas recubiertas con APGA, r56 y TFP250 (para todos los grupos) . Además, se realizaré el análisis de proteina usando técnicas de Western blots con gametocito preparativo y tinciones que contienen TFP 250 recombinantes usando anti-r56/APGA/anti-TFP250/como sueros de control positivo asi como también suero de pollo normal como un control negativo.

En un ensayo inicial conducido como se expone anteriormente, se descubrió que los grupos vacunados con la protección más alta fueron el grupo que secretó r56 y el grupo nativo r56 con registros de lesión promedio de 1.31 y 1.36 respectivamente, donde un registro de 1 se considera aceptable para obtener buenos resultados de desempeño en los pollos para la producción de carne. La diferencia entre un registro de lesión promedio de- 2.37 en el grupo de control a 1.31 en el grupo vacunado se puede asignar definitivamente el espacio entre un pollo enfermo a un pollo protegido.

Se concluyó que el vector FAV8 que contiene el constructo secretado r56 funcionó muy bien al inducir la protección en pollitos de un dia de nacidos con base en tanto el registro de lesión- como los conteos de ooquistes. Los grupos que se vacunaron con este constructo mediante inmunización in ovo no mostraron este alto nivel de protección. Se cree que la razón para esto es que los pollitos no tienen suficiente tiempo a ser expuestos al virus debido al nacimiento temprano. No obstante, la vacunación in ovo sigue siendo un procedimiento viable y económico para vacunaciones futuras. La vacunación oral de pollitos de un dia de nacidos ha probado ser efectiva y como tal se espera que las vacunas por rocío o de alimentación a tales aves sea un método útil para prevenir la inmunidad a largo plazo a los pollos para la producción de carne.

Además de proporcionar buenos resultados con los constructos r56, se' descubrió que tanto por el registro de lesión como los conteos de ooquistes'el constructo secretado TFP250 también indujo un nivel significativo de inmunidad protectora (aunque menor que 20-30%). 61 proteínas r56 completa mostrada en SEQ ID NO:2; b) un r56 truncado codifica el fragmento R56 truncado que consiste de los aminoácidos 24-345 de SEQ ID N0:2 o un fragmento de aminoácidos 24-345 de SEQ ID N0:2; c) un TFP250 truncado comprende la secuencia de nucleótidos 6448-7083 de la secuencia TFP250 de longitud completa mostrada en SEQ ID NO: 16 pero no codifica la secuencia de proteínas TFP250 completa mostrada en SEQ ID NO : 4 ; y d) un TFP250 ' truncado consiste de la secuencia de ácidos nucleicos de nucleótidos 6448-7083 de SEQ ID NO: 16 8. Una vacuna de coccidiosis para la protección de aves de corral contra la infección de Eimeria, la vacuna caracterizada porque comprende un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende un promotor ligado operablemente a una secuencia de señal hidrofóbica que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de anclaje de membrana, y un ácido nucleico que codifica un r56 truncado que consiste de los aminoácidos 24-345 de SEQ ID NO: 2 o un fragmento de aminoácidos 24-345 de SEQ ID NO: 2 insertados dentro del marco con la secuencia de señal hidrofóbica, una señal de poiiadeniiación; y un genoma de adenovirus aviar. 9. Una vacuna de coccidiosis para la protección de aves de corral contra la infección de Eimeria, la vacuna

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Una vacuna de coccidiosis para la protección de aves de corral contra la infección por Eimeria, la vacuna caracterizada porque comprende un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende un promotor ligado operablemente a una secuencia de señal hidrofóbica que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de anclaje de membrana, un sitio de clonación múltiple para la inserción de un marco abierto de lectura (ORF) para permitir la inserción de un ORF dentro del marco con la secuencia de señal hidrofóbica, una señal de poliadenilación; y un genoma de adenovirus aviar. 2. La vacuna de coccidiosis de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ORF de interés codifica un antigeno seleccionado del grupo que consiste de un antigeno r56 truncado de Eimeria máxima, un antigeno TFP250 truncado de Eimeria máxima y un antigeno de 82kDa truncado de Eimeria máxima. 3. La vacuna de coccidiosis de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el sitio de clonación múltiple contiene un ORF que codifica un antigeno r56 truncado de Eimeria máxima, en combinación con un antigeno TFP250 truncado de Eimeria máxima y/o un antigeno de 82kDa truncado de Eimeria máxima. 4. La vacuna de coccidiosis de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el genoma de adenovirus aviar se selecciona del grupo que consiste del genoma de FAV 1, FAV 2, FAV 3, FAV 4, FAV 5, FAV 6, FAV 7, FAV 8, FAV 9, FAV 10, FAV 11 y FAV 12. 5. La vacuna de coccidiosis de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada porque el genoma de adenovirus aviar es un genoma FAV 8. 6. La vacuna de coccidiosis de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el vector de adenovirus aviar recombinante comprende además una secuencia de escisión inmediatamente cadena arriba del sitio de clonación para la inserción del ORF de interés, en donde el producto de expresión del vector produce un producto soluble. 7. La vacuna de coccidiosis de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el ácido nucleico que codifica un antigeno seleccionado del grupo consiste de: a) un R56 truncado comprende la secuencia de nucleótidos 70-1035 de la secuencia r56 de longitud completa mostrada en SEQ ID NO: 13. pero no codifica la secuencia de caracterizada porque comprende un vector de adenovirus aviar recombinante comprende un promotor ligado operablemente a una secuencia de señal hidrofóbica que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de anclaje de membrana, y un ácido nucleico que codifica .un TFP250 truncado que consiste de la secuenciasde ácidos nucleicos de los nucleótidos 6448-7083 de SEQ ID NO: 16 insertados dentro del marco con la secuencia de señal hidrofóbica, una señal de poliadenilación ;· y un genoma de adenovirus aviar. 10. Una vacuna de coccidiosis para la protección de aves de corral contra la infección por Eimeria, la vacuna caracterizada porque comprende un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende un promotor ligado operablemente a una secuencia de señal hidrofóbica que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de anclaje de membrana, y un ácido nucleico que codifica un antigeno de 82kDa truncado de Eimeria máxima insertados dentro del marco con la secuencia de señal hidrofóbica, una señal de poliadenilación; y un genoma de adenovirus aviar. 11. Una preparación de la vacuna de coccidiosis multivalente, caracterizada porque comprende una vacuna de coccidiosis de conformidad con la reivindicación 7, y una vacuna de coccidiosis que comprende un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende un promotor ligado operablemente a una secuencia de señal hidrofóbica que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de anclaje de membrana, y un ácido nucleico que codifica un TFP250 truncado que consiste de la secuencia de ácidos nucleicos de los nucleótidos 6448-7083 de SEQ ID NO: 16 insertados dentro del marco con la secuencia de señal hidrofóbica, una señal de poliadenilación; y un genoma de adenovirus aviar; y/o una vacuna de coccidiosis que comprende un vector de adenovirus aviar recombinante que comprende un promotor ligado operablemente a una secuencia de señal hidrofóbica que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de anclaje de membrana, y un ácido nucleico que codifica un antigeno de 82kDa truncado de Eimeria máxima insertado dentro del marco con la secuencia de señal hidrofóbica, una señal de poliadenilación; y un genoma de adenovirus aviar. 12. La preparación de la vacuna de coccidiosis multivalente de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque además comprende un inmunógeno seleccionado del grupo que consiste de virus de Enfermedad de Marek (MDV) , virus de Enfermedad de Newcastle (NDV) , virus de Bronquitis Infecciosa (IBV), Virus de Anemia del Pollo (CAV) , virus de enfermedad de-bursitis infecciosa (IBDV) , influenza Aviar (AI), Reo virus, Retrovirus aviar, Adenovirus aviar, virus de Rinotraqueitis de pavo, especies Salmonella y E. coli . 13. Un método para inmunizar un sujeto contra la infección por Eimeria tenella, Eimeria máxima, Eimeria acervulina , Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti , caracterizado porque comprende la etapa de administrar al sujeto una vacuna de conformidad con la reivindicación 1. 14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la administración induce un nivel aumentado de inmunidad en comparación con la inmunidad observada cuando el sujeto se inmuniza con un vector FAV que comprende un r56 de longitud completa o un antigeno TFP250 de longitud completa o un antigeno de 82kDa de longitud completa . 15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el sujeto es de una especie aviar seleccionada del grupo que consiste de pollos, pavos, gansos, patos, gallinillas enanas, codornices y pichones. 16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la especie aviar son pollos. 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque los pollos son pollos adultos para la producción de carne. 18. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la administración comprende rociar al sujeto con la vacuna, alimentar al sujeto con la vacuna en el alimento, y proporcionar la vacuna en el suministro de bebida del sujeto. 19. Una terapia de vacunación de combinación para proporcionar inmunidad protectora contra Eimeria tenella, Eimeria máxima, Eimeria acervulina , Eimeria necatrix, Eimeria praecox, Eimeria mitis o Eimeria brunetti , a una población de pollos, caracterizada porque comprende la etapa de administrar al sujeto una vacuna de conformidad con la reivindicación 1 y administrar el CoxAbicMR a la población de' pollos. 20. La terapia de vacunación' de combinación de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el CoxAbicMR se administra a gallinas reproductoras para conferir inmunidad a los pollitos en el nacimiento y la vacuna de la reivindicación 1 se administra a los pollitos en el día 1 después de la salida del huevo y posteriormente a gallinas para producción de carne adultas de la población. 21. Un vector de adenovirus aviar recombinante, caracterizado porque comprende un genoma de adenovirus aviar que comprende un promotor heterólogo, una secuencia de señal hidrofóbica heteróloga, un sitio de clonación múltiple, y una secuencia de poliadenilación, en donde el promotor y la secuencia de señal hidrofóbica se localizan cadena arriba de un sitio de clonación múltiple, en donde la inserción de un ORF de interés dentro del sitio de clonación múltiple dará por resultado un vector de expresión capaz de expresar el ORF de interés bajo el control del promotor y dentro del marco con la secuencia de señal.' 22. El vector de adenovirus aviar recombinante de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la secuencia de señal hidrofóbica comprende un sitio de escisión para permitir la secreción del producto de expresión del ORF de interés de la célula hospedera en la cual se expresa. 23. El vector de adenovirus aviar recombinante de conformidad con la reivindicación -21, caracterizado porque la secuencia de señal no contiene un sitio de escisión dando por resultado en consecuencia la expresión de un producto de expresión fusionado del ORF de interés que se ancla a la superficie celular de la célula hospedera. 24. Un vector de adenovirus aviar recombinante, caracterizado porque comprende un promotor ligado operablemente a una .secuencia de señal hidrofóbica que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de anclaje de membrana, un sitio de clonación múltiple para la inserción de ORF de . interés para permitir la inserción de un ORF de interés dentro del marco con la secuencia de señal hidrofóbica, una señal de poliadenilación; y un genoma de adenovirus aviar. 25. El vector de adenovirus aviar recombinante de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque además comprende una secuencia de escisión inmediatamente cadena arriba del sitio de clonación para la inserción del ORF de interés, en donde el producto de expresión del vector produce un producto ORF soluble. 26. Un vector de adenovirus aviar recombinante, caracterizado porque comprende un promotor ligado operablemente a a) una secuencia de señal de secreción hidrofóbica y un sitio de escisión en una secuencia de señal que comprende un ácido nucleico - que codifica un dominio de anclaje de membrana, b) un ácido nucleico que codifica una proteina r56 truncada de Eimeria máxima, c) una señal de poliadenilación y d) un genoma de adenovirus aviar. 27. Un vector de adenovirus aviar recombinante, caracterizado porque .comprende un promotor ligado operablemente a a) una secuencia de señal de secreción hidrofóbica y un sitio de escisión, o una secuencia de señal que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de anclaje de membrana b) un ácido nucleico que codifica una proteina TFP250 truncada de Eimeria máxima, c) una señal de poliadenilación y d) un genoma de adenovirus aviar. 28. Un vector de adenovirus aviar recombinante, caracterizado porque comprende un promotor ligado operablemente a a) una secuencia de señal de secreción hidrofóbica y un sitio de escisión, o una secuencia de señal que comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de anclaje de membrana b) un ácido nucleico que codifica una proteina de 82kDa truncada de Eimeria máxima, c) una señal de poliadenilación y d) un genoma de adenovirus aviar. 29. Un vector de adenovirus aviar recombinante de conformidad con la . reivindicación 26, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica un r56 truncado comprende la secuencia de nucleótidos 70-1035 de la secuencia r56 de longitud completa mostrada en SEQ ID NO: 14 pero no codifica la secuencia de proteínas r56 completa mostrada en SEQ ID NO: 2. 30. El adenovirus aviar recombinante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica un r56 truncado codifica el fragmento R56 truncado que consiste de los aminoácidos 24-345 de SEQ ID NO: 2 o un fragmento de los aminoácidos 24-345 de SEQ ID NO: 2. 31. El vector de adenovirus aviar recombinante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica un TFP250 truncado comprende la secuencia de nucleótidos 6448-7083 de la secuencia de TFP250 de longitud completa mostrada en SEQ ID NO: 16 pero no codifica la secuencia de proteínas TFP250 completa mostrada en SEQ ID NO: 4. 32. El vector de adenovirus aviar recombinante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica r56 truncado codifica el fragmento r56 truncado que consiste de los aminoácidos 2150-2361 de SEQ ID NO: 4. 33. El vector de adenovirus aviar recombinante de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica un TFP250 truncado comprende la secuencia de nucleótidos 6444-7083 de la secuencia TFP250 de longitud completa mostrada en SEQ ID NO: 16 pero no codifica la secuencia de proteínas TFP250 completa mostrada en SEQ ID NO: 4. 34. El vector de adenovirus aviar recombinante de conformidad con la reivindicación. 27, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica un TFP250 truncado codifica el fragmento TFP250 truncado que consiste de los aminoácidos 2149-2361 de SEQ ID NO:4. 35. El vector de adenovirus aviar recombinante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la secuencia de señal de secreción se selecciona del grupo que consiste de la secuencia de señal de secreción de gamma interferón de pollo, gamma interferón de porcino e Influenza Humana H1N2. 36. El vector de adenovirus aviar recombinante de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque la secuencia de señal de anclaje de membrana se selecciona del grupo que consiste de la secuencia de señal de secreción de un antígeno HA de influenza aviar. 37. Una vacuna, caracterizada porque comprende un vector de adenovirus aviar recombinante de conformidad con la reivindicación 26. 38. Un método para inducir una respuesta inmunitaria en una población aviar, caracterizado porque comprende administrar a la población una vacuna de conformidad con la reivindicación 38. 39. Un método para vacunar una población aviar contra la coccidiosis, caracterizado porque comprende administrar una vacuna que comprende un¦ vector de adenovirus aviar recombinante de conformidad con la reivindicación 24, en donde la administración de la vacuna induce una respuesta inmunitaria incrementada en comparación con la administración de una vacuna que comprende r56 de longitud completa o TFP250 de longitud completa. 40. Una célula aislada, caracterizada porque comprende el vector de adenovirus aviar recombinante de conformidad con la reivindicación 24. 41. Una formulación farmacéutica, caracterizada porque comprende un vector de adenovirus aviar recombinante de conformidad con la reivindicación 24 y un excipiente adecuado .