MXPA99009162A - Vacunas de coccidiosis - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a polipéptidos de Eimeria hidrofílicos, fragmentos de ADN que codifican dichos péptidos, moléculas de ADN recombinantes que comprenden los fragmentos de ADN, vehículos recombinantes vivos que comprenden los fragmentos de ADN o moléculas de ADN recombinantes y células huésped que comprenden los fragmentos de ADN, moléculas de ADN recombinantes o vehículos recombinantes vivos. Además, la invención se refiere a anticuerpos contra los polipéptidos y a las vacunas de coccidiosis basadas en dichos polipéptidos. La invención también se refiere a métodos para la preparación de anticuerpos y vacunas y a métodos para la detección de parásitos de Eimeria y anticuerpos contra parásitos de Eimeria.
Description
VACUNAS DE COCC1DIOSIS
La presente invención se refiere a polipéptidos de Eimeria, fragmentos de ADN que codifican estos péptidos, moléculas de ADN recombinantes que comprenden dichos fragmentos, vehículos recombinantes vivos que comprenden dichos fragmentos o moléculas, células huésped que comprenden dichos fragmentos, moléculas o vehículos, anticuerpos contra el polipéptido y vacunas de coccidiosis. La invención también se refiere a métodos para la preparación de dichos anticuerpos y vacunas y a métodos para la detección de parásitos de Eimeria y anticuerpos contra parásitos de Eimeria. Los protozoarios parasíticos que pertenecen al género Eimeria son los agentes que causan la coccidiosis intestinal, una enteritis que afecta a las aves. Esto ocasiona pérdidas económicas significativas, especialmente a la industria de crianza de aves. (Para los fines de la presente solicitud, el término "crianza de aves" se toma como aves que sirven como fuentes de huevos o carne. Incluye, entre otras cosas, pollos, pavos, patos, gansos, gallinas de guinea, codornices, pichones y pavo reales). En la actualidad, la coccidiosis principalmente se controla mediante el uso de fármacos antibióticos en el alimento. La emergencia rápida de cepas resistentes a fármacos (Chapman H.D. Parasitology Today 9, 159-162 (1993)) y los costos prohibitivos para desarrollar y registrar un fármaco novedoso ha conducido a un creciente interés en el desarrollo de un método alternativo de control. Por o tanto, durante muchos años se ha deseado el desarrollo de vacunas efectivas. Sin embargo, solamente se ha tenido un éxito parcial. Las estrategias de vacuna actualmente disponibles consisten de infecciones controladas con parásitos atenuados virulentos o vivos (Shirley M.W. In: Proceedings of the Vlth. International Coccidiosis Conference (Eds.: J.R. Barta and M.A. Fernando) Moffitt Print Craft Ltd., Gueiph, págs. 61-72 (1993)). Por razones de seguridad y costo, el método más conveniente de inmunoprofiláxis contra coccidiosis parece ser el uso de una vacuna sub-unitaria. Aunque muchos intentos se han hecho para inmunizar pollos contra coccidiosis con fracciones de materia parásito (Murray P.K., Bhogal B.S., Crane M.S.J. & MacDonald T.T. In: Research in Avian Coccidiosis. Proceedings of the Georgia Coccidiosis Conference (Eds.: L.R. McDougald, Joyner, L.P. and P.L. Long) Athens, University of Georgia, págs. 564-573 (1986), McKenzie M.E. & Long P.L. Poultry Science 65, 892-897 (1986)) o polipéptidos de Eimeria recombinantes (Danforth H.D., Augustine P'C, Ruff M.D., McCandliss R., Strausberg R.L. & Likel M. Poultry Science 68, 1643-1642 (1989), Jenkins M.C., Augustine P.C., Danforth H.D. & Barta J.R. Infection and Immunity 59, 4042-4048 (1991)) únicamente se podía lograr una protección limitada contra la infección que confrontan. Generalmente se piensa que las etapas de los parásitos responsables de la inducción de inmunidad protectora son las etapas tempranas del desarrollo asexual (Jenkins y otros, 1991).
Inicialmente, la selección de antígenos candidatos se llevo a cabo usando anticuerpos de pollos inmunes, pero, en vista del papel fundamental de las respuestas mediadas por células en la inmunidad protectora (revisado en Lillehoj H.S. & Trout J.M. Avian Pathology 22, 3-31 (1993), Rose M.E. In: Poultry Immunology (Ed.: T.F. Davison, T.R. Morris and L.N. Payne), Carfax Publishing Company, Oxfordshire, U.K. págs. 265-299 (1996), ahora se enfocó la atención, después de los antígenos inductores de células B, en el tamizado de antígenos para su capacidad de estimular respuestas de células T específicas (Dunn P.P.J., Billington K., Bumstead J.M. & Tomley F.M. Molecular and Biochemical Parasitology 70, 211-215 (1995)). Es un objetivo de la presente invención proveer polipéptidos que son capaces de inducir protección contra efectos patogénicos de infección de Eimeria en aves de corral. Sorprendentemente, ahora se ha encontrado que 6 polipéptidos diferentes podrían identificarse y aislarse específicamente, esencialmente libres de otros polipéptidos de Eimeria, de una fracción hidrofílica de polipéptidos de Eimeria, cada uno de estos diferentes polipéptidos siendo capaces de inducir una respuesta inmune contra parásitos de Eimeria. Los inventores han encontrado que estos polipéptidos pueden usarse, ya sea solos o en combinación uno con el otro, para proveer una vacuna que da a las aves un grado significativo de protección (preferiblemente aves de corral). Por ejemplo, la protección contra la formación de lesiones cecales puede lograrse en aves inmunizadas con dicha vacuna, cuando se someten a la confrontación subsecuente con parásitos de Eimeria. Una primera modalidad de la invención se refiere a un polipéptido hidrofílico de Eimeria que en su forma de longitud completa tiene un peso molecular de 25 kD y comprende una secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos el 70% de la homología con la secuencia de aminoácidos MPFELPPLPYPMDALEPYISKETLEYHYGKHHAAYVNNLNRLVEGKPEA SKSLEEIIKTSSGSVLNNAQAWNHTFYWKSMRPASAGGPPGAPGGGPP GAPGAPLREELESAFGGVEKFREAFAAAAAAHFGSGWAWLCFCKKSRS LFLLQTHDGATPFRDNPNCAPLLTCDLWEHAYYIDRRNDRKSYLDAWWS VVNWDFANENLKKAMQGSD (denominada más adelante como SEQ ID NO:1:) y fragmentos inmunogénicos del polipéptido capaz de inducir una respuesta inmune contra dicho polipéptido. El polipéptido se refiere funcionalmente a un Superoxido Dismutasa (SOD) encontrado en parásitos que no son de Eimeria y por lo tanto se caracterizan como similar a SOD. También, esta modalidad se refiere a un polipéptido hidrofílico de Eimeria que es un polipéptido similar a peroxidoxina, en su forma de longitud completa tiene un peso molecular de 22 kD y comprende una secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos el 70% de homología con la secuencia de aminoácidos LGPLALPLLADVR (denominada más adelante como SEQ ID NO: 2:) y fragmentos inmunogénicos del polipéptido capaz de inducir una respuesta inmune contra ese polipéptido. Un polipéptido hidrofílico de Eimeria que un polipéptido similar a peroxidoxina, en su forma de longitud completa tiene un peso molecular de 25 kD y comprende una secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos el 70% de homología con la secuencia de aminoácidos MPLNLGDSFPDFQAEALGAEHFRLHEYLGDSWGVMFSHPNDFTPVCTT ELAEAVKLQDSFTKKNCKLVGFSCNDLQSHREWAKDIMAYAGRSGNLPF PLVCDPNRELAASLGIMDPAEKDKKGLPLTCRCVFFISPEKKLAASILYPA TTGRNFAEILRVLDSLQLTAKFPVATPVDWTAGAKCCVVPNLAAEEAQR LLPKGHEALQLPSGKPYLRLTPDPRG (denominada más adelante como SEQ ID NO: 3:), así como fragmentos inmunogénicos del polipéptido capaz de inducir una respuesta inmune contra ese polipéptido también son parte de esta modalidad. También parte de esta modalidad es un polipéptido hidrofílico de Eimeria que en su forma de longitud completa tiene un peso molecular de 22 kD y comprende una secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos el 70% de homología con la secuencia de aminoácidos MSPSPAGVAEYLASL (denominada más adelante como SEQ ID NO: 4:), o un fragmento inmunogénico de este polipéptido capaz de inducir una respuesta inmune contra dicho polipéptido. Esta modalidad también incluye un polipéptido hidrofílico similar a triosafosfato isomerasa de Eimeria que en su forma de longitud completa tiene un peso molecular de 28 kD y comprende una secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos el 70% de homología con la secuencia de aminoácidos NHAEFDPSQTEVVVFP (denominada más adelante como SEQ ID NO: 5:), o un fragmento inmunogénico de este polipéptido capaz de inducir una respuesta inmune contra dicho polipéptido. Finalmente, esta modalidad se refiere a un polipéptido hidrofílico de Eimeria que en su forma de longitud completa tiene un peso molecular de 28 kD y comprende una secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos el 70% de homología con la secuencia de aminoácidos VDSFTPSVGCVFAGMPADFR (denominada más adelante como SEQ ID NO: 6:), o un fragmento inmunogénico de este polipéptido capaz de inducir una respuesta inmune contra dicho polipéptido. Aunque varios grupos han descrito proteínas derivadas de Eimeria las cuales, oportunamente, podrían tener masas moleculares dentro de la escala de 26-30 kDa +. 5kDa descrita antes, estas proteínas son muy diferentes de los polipéptidos de la presente invención. Por ejemplo, en EP-A-0231537 (Newman y otros) se describe una proteína superficial de 25 kDa. Sin embargo, bajo condiciones de reducción esta se divide para formar dos bandas sobre SDS-PAGE de aproximadamente 17 y alrededor de 8 kDa, mientras que los polipéptidos de la presente invención tuvieron masas moleculares relativas de por lo menos 21 kDa cuando se separaron bajo las condiciones de reducción.
Bouvier y otros (J. Biol. Chem. (1985) 260(29); págs 15504-15509) enseña que usando proteínas anfifílícas de extracción de Tritón X114 (asociadas con membrana) únicamente se detectaron en la fase de detergente y no en la fase hidrofílica. En la US-A-4710377 (Schenkel y otros) los antígenos se describieron con masas moleculares de aproximadamente 28 y 26 kDa. Sin embargo, estos son componentes de membrana externa anfifílica y por lo tanto no podrían estar presentes en la fase hidrofílica de un extracto de Tritón X-114, el cual se podría usar para preparar polipéptidos de la presente invención. Las proteínas de Eimeria que son anfifílicas también se describen en WO92/04461 (Jacobson y otros), EP-A-0324648 (Liberator y otros), AU-A-28542/49 (Turner y otros), EP-A-0344808 (Alternburger y otros) y EP-A-0167443 (Murray y otros). Se entenderá que, para los polipéptidos hidrofílicos particulares abarcados en la presente, pueden existir variaciones naturales entre parásitos individuales de Eimeria o cepas. Estas variaciones pueden existir en las diferencias de aminoácidos en la secuencia global o mediante supresiones, substituciones, inserciones, inversiones o adiciones de aminoácidos en dicha secuencia. Las substituciones de aminoácidos que no alteran esencialmente las actividades biológicas e inmunológicas, se han descrito, v.gr., por Neurath y otros, en '"The Proteins" Academic Press New York (1979). Los reemplazos de aminoácidos entre los aminoácidos relacionados o reemplazados que se han presentado con frecuencia en evolución son, entre otros, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, lie/Val (ver Dayhof, M.D., Atlas of protein sequence and structure, Nat. Biomed. Res. Found., Washington D.C., 1978, vol. 5, suppl. 3). Otras substituciones de aminoácidos incluyen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/lie, Leu/Val y Ala/Glu. Basado en esta información, Lipman y Pearson desarrollaron un método para la comparación rápida y sensible de proteínas (Science, 227, 1435-1441, 1985) y para determinar la similitud funcional entre proteínas homologas. Dichas substituciones de aminoácidos de las modalidades ilustrativas de esta invención están dentro del alcance de la invención mientras que los polipéptidos resultantes retienen su inmunoreactividad. Por lo tanto, las variaciones naturales que no influencian esencialmente la inmunogenicidad del polipéptido comparado con el polipéptido de tipo silvestre, se consideran variantes inmunológicamente equivalentes de los polipéptidos de acuerdo con ia invención. Por lo tanto, un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos variantes, que tiene por lo menos 70% de homología a la secuencia de aminoácidos respectiva
MPFELPPLPYPMDALEPYISKETLEYHYGKHHAAYVNNLNRLVEGKPEA SKSLEEIIKTSSGSVLNNAGQAWNHTFYWKSMRPASAGGPPGAPGGGP PGAPGAPLREELESAFGGVEKFREAFAAAAAAHFGSGWAWLCFCKKSR SLFLLQTHDGATPFRDNPNCAPLLTCDLWEHAYYIDRRNDRKSYLDAWW SVVNWDFANENLKKAMQGSD, LGPLALPLLADVR, MPLNGDSFPDFQAEALGAEHFRLHEYLGDSWGVMFSHPNDFTPVCTTE LAEAVKLQDSFTKKNCKLVGFSCNDLQSHREWAKDIMAYAGRSGNLPFP LVCDPNRELAASLGIMDPAEKDKKGLPLTCRCVFFISPEKKLAASILYPAT TGRNFAEILRVLDSLQLTAKFPVATPVDWTAGAKCCVVPNLAAEEAQRLL PKGHEALQLPSGKPYLRLTPDPRG, MSPSPAGVAEYLASL,
NHAEFDPSQTEVVVFP y VDSFTPSVGCVFAGMPADFR como se describe en SEQ ID NO: 1-6, también se considera que caen dentro del alcance de la invención. El nivel de homología se define mediante la siguiente fórmula: H = m/n x 100%, en donde H es la homología porcentual, m es el número de aminoácidos idénticos en la secuencia y n es el número total de aminoácidos. La secuencia de aminoácidos ABCDEEGHIJK, cuando se compara con ABCDEFGHIJK, entonces podría tener una homología de 10/11 x 100% = 90.9%. La secuencia de aminoácidos ABCDEGHIJK también podría tener una homología de 10/11 x 100% = 90.9%: únicamente sería un espacio en el punto en donde una secuencia tiene la F y la otra secuencia no la tiene. Cuando se usa un polipéptido, por ejemplo, con fines de vacunación o para elevar los anticuerpos, no es necesario, sin embargo, utilizar todo el polipéptido. También es posible utilizar un fragmento de este polipéptido que es capaz de inducir una respuesta inmune contra el polipéptido, un fragmento inmunogénico así llamado. Un "fragmento inmunogénico" se entiende que es un fragmento de la proteína de longitud completa, que aún tiene retenida su capacidad para inducir una respuesta inmune en el huésped. En este momento, está disponible una variedad de técnicas para identificar fácilmente los fragmentos antigénicos (determinantes). El método descrito por Gaysen y otros (Solicitud de Patente WO 84/03564. solicitud de Patente WO 86/06487, "Patente de E.U.A. NR. 4.833.092. Proc. Nati. Acad. Sci. 81:3998-4002 (1984), J. Imm. Meth. 102, 259-274 (1987), el método de PEPSCAN, así llamado, es un método fácil de realizar, rápido y bien establecido para la detección de epítopes; las regiones inmunológicamente importantes de la proteína, se usan en todo el mundo y también son conocidas por ios expertos. Este método (empírico) es especialmente adecuado para la detección de los epítopes de células B. También, dada la secuencia del gen que codifica cualquier proteína, los algoritmos de computadora son capaces de designar los fragmentos específicos para polipéptidos como los epítopes inmunológicamente importantes basados en su homología secuencial y/o estructural con epítopes que se conocen ahora. La determinación de estas regiones se basa en una combinación del criterio de hidrofilicidad de acuerdo con Hopp y Woods (Proc. Nati. Acad. Sci. 78: 38248-3828 (1981)) y los aspectos de la estructura secundaria de acuerdo con Chou y Fasman (Avances in Enzymology 47: 45-148 (1987) y Patente de E.U.A. 4.554.101). La secuencia de los epítopes de las células T, así mismo, pueden predecirse por computadora con la ayuda del criterio de anfif'rlicidad de Berzofsky (Science 235, 1059-1062 (1987) y la solicitud de Patente NTIS US 07/005,885). Una revisión general condensada se encuentra en: Shan Lu on common principies: Tibtech 9: 238-242 (1991), Good y otros on Malaria epitopes; Science 235: 1059-1062 (1987), Lu for a review; Vaccine 10: 3-7 (1992), Berzofsky for HlV-epitopes; The FASEB Journal 5:2412-2418 (1991). Por lo tanto, esta modalidad de la invención no solamente se refiere a los polipéptidos de acuerdo con la invención, sino también a fragmentos de los polipéptidos que son no son capaces de inducir una respuesta inmune contra los polipéptidos (fragmentos inmunogénicos así llamados). En una forma preferida de esta modalidad, se provee un polipéptido hidrofílico el cual comprende secuencias de aminoácidos que por lo menos son 80% homologas a la secuencia dada en uno de SEQ ID NO: 1-6. En una forma más preferida de esta modalidad, la secuencia de aminoácidos por lo menos es 90% homologa a la secuencia dada en uno de SEQ ID NO: 1-6. En una forma aún más preferida de esta modalidad, la secuencia de aminoácidos de la secuencia dada en uno de SEQ ID NO: 1-6. De preferencia el polipéptido de acuerdo con la invención se aisla de Eimeria tenelia. Otra modalidad de la invención se refiere a fragmentos de ADN que codifican un polipéptido de la presente invención o fragmentos inmunogénicos del mismo. Debido a que para el primer tiempo la secuencia de aminoácidos parcial de los polipéptidos de acuerdo con la invención se proveen ahora, el experto (usando la tabla de códigos genéticos encontrada en los textos de bioquímica como, por ejemplo en Lubert Stryer's Biochemistry. Ed. Freeman and Company, New York) puede preparar fácilmente una sonda de ADN mezclada y seleccionada del gen que codifica el polipéptido de acuerdo con la invención a partir de Eimeria. Pueden haber variaciones menores en la secuencia global de nucleótidos del ADN que codifica los polipéptidos de acuerdo con la invención en las cepas de Eimeria respectivas. Estas variaciones pueden no tener efecto sobre la secuencia de aminoácidos del polipéptido, en el caso de que la modificación sea tal que el triplete variante codifique para el mismo aminoácido. Esta causa de variación se basa en el fenómeno de degeneración del código genético. Por lo tanto, sucede que debido a la mutación natural de G en el triplete CTG, la codificación para el aminoácido de leucina, se reemplaza por C, que también codifica para Leucina, o que A en GAA codifica para ácido glutámico se reemplace por una G, cuyo triplete aún codifica ácido glutámico. Dicha mutación es una mutación inactiva, es decir que no muestra el nivel de aminoácido. Dichas modificaciones inactivas se encuentran muy frecuentemente en la naturaleza, cuando se comparan, v.gr., dos aislados de campo diferentes de Eimeria. Este fenómeno se encuentra para todos los aminoácidos, excepto para Met y Trp. Por lo tanto, es obvio, que los polipéptidos de la presente invención se pueden codificar por una gran variedad de otras secuencias, todos codificando el polipéptido idéntico. Por lo tanto, dentro del alcance de la invención también se considera, sin tener que mencionarlo, que cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos los cuales comprenden una secuencia de aminoácidos, es decir, por lo menos 70% homólogos a la secuencia de aminoácidos como se describe en SEQ ID NO: 1-6 de la presente invención o un fragmento inmunogénico de los mismos. Meramente con el fin de dar un ejemplo, todas las sondas posibles para detectar el gen que codifica el polipéptido de Eimeria hidrofílico similar a SOD de 25 kD i. a. la secuencia de aminoácidos YLDAWWSVVNWDFANENLK (parte de SEQ ID NO:1:) se dan en SEQ ID NO: 7-38. En estas ID de SEQ, se listan todas las secuencias de ácidos nucleicos posibles, las cuales codifican para la secuencia de aminoácidos VNWDFA de SEQ ID NO: 1:. De las 32 sondas, una tiene por definición un ajuste perfecto con cada fragmento de ADN que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ I D N 0 : 1. Como se describió i. a. en Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. y otros Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6) la hibridización de sondas al ADN se realiza a 12°C debajo de la Tm, en donde Tm = 60.3'0.41 x(G + C)%-650/L (L = Iongitud de la sonda). Esto significa que bajo condiciones estrictas (una temperatura de hibridización de entre 38 y 48 grados Celsius), el gen que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:1 siempre puede seleccionarse de manera selectiva y estar libre de señales de hibridización falsas, usando las sondas de SEQ ID NO: 7-38. Dichas sondas mezcladas hacen muy fácil el uso de procedimientos normales en v.gr., uno de los muchos sintetizadores de ADN automáticos comercialmente disponibles. Por las razones dadas antes, especialmente una sonda de ADN que codifica toda la secuencia de aminoácidos de una de las secuencias de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 1-6 puede utilizarse para detectar los genes que codifican los polipéptidos de acuerdo con la invención en Eimeria. La identificación y clonación de los genes que codifican los polipéptidos de acuerdo con la invención en Eimeria, no solamente para tenella sino también para otras especies, se puede realizar fácilmente de la siguiente manera: el primer hilo de ADNc puede hibridizarse con una sonda mezclada para uno de los polipéptidos de acuerdo con la invención y con una sonda de oligo-dT. El fragmento de ADN entre ambas sondas puede multiplicarse en una reacción de RCP normal (las técnicas de RCP son v.gr., descritas en Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratory manual, ISBN 0-87969-309-6)). El fragmento de RCP entonces puede clonarse en un plásmido y v.gr., usarse para secuenciar o detectar el gen de longitud completa en el genoma de cualquier especie de Eimeria. Este método permite una selección fácil y directa y secuenciación de los genes que codifican los polipéptidos de acuerdo con la invención, no solamente de Eimeria tenella sino también de otras especies de Eimeria tales como necatrix, brunetti, mitis o acervulina. Por lo tanto, en otra modalidad, la invención se refiere a un fragmento que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico del mismo. El método de sonda mezclada descrito antes para la detección de los ADN que codifican varios polipéptidos de acuerdo con la invención se ha utilizado v.gr., para obtener el ADN que codifica el polipéptido similar a SOD de 25 kD de acuerdo con la invención en Eimeria tenella. Usando el método descrito en los Ejemplos, un fragmento de ADN que codifica prácticamente todo el polipéptido similar a SOD de 25 kD de Eimeria tenella podría aislarse, clonarse y secuenciarse. Se encontró que la secuencia del fragmento de ADN es ATGCCGTTCGAACTCCCCCCGCTGCCGTACCCCATGGACGCCCTC GAGCCGTACATCAGCAAAGAGACTCTCGAGTACCACTATGGGAAGCA CCACGCGGCTTACGTGAACAACTTGAACAGACTCGTCGAGGGGAAGC CGGAGGCTTCCAAGAGCCTGGAGGAAATAATAAAGACCTCCTCGGGG TCGGTGCTGAACAACGCGGGCCAGGCGTGGAACCACACGTTCTACTG GAAGTCGATGCGGCCGGCCTCGGCGGGGGGCCCCCCGGGGGCCCC CGGCGGGGGCCCCCCGGGGGCCCCGGGGGCCCCCCTGCGGGAGGA GCTGGAGAGCGCGTTCGGGGGCGTGGAGAAGTTCCGGGAGGCCTTT GCTGCTGCTGCTGCTGCGCACTTCGGCTCGGGCTG'GGCCTGGCTCT GCTTCTGCAAGAAGTCCCGCAGCCTCTTTTTGCTGCAGACCCACGAC GGGGCCACGCCTTTCAGAGACAACCCCAACTGCGCGCCGCTGCTCAC CTGCGACCTGTGGGAGCACGCCTACTACATCGACCGCAGAAACGACC GCAAGAGCTACCTCGACGCGTGGTGGTCTGTGGTGAATTGGGACTTC GCGAACGAGAACTTGAAGAAGGCAATGCAGGGAAGCGACTAGGCGC GTGGTGGTCTGTGGTGAATTGGGACTTTCGCGAACGAGAACTTGAAG AAGGCAATGCAGGGAAGCGACTAG y se denominará más adelante como SEQ ID NO:39: Por lo tanto una forma preferida de esta modalidad se refiere a un fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos como se describe en SEQ ID NO: 39. El método de sonda mezclada también su utilizó para obtener un ADN que codifica el polipéptido similar a peroxidoxina de 25 kD de acuerdo con la invención Eimeria tenella. Usando el método descrito en los Ejemplos, un fragmento de ADN de acuerdo con una parte de todo el polipéptido similar a peroxidoxina de 25 kD de Eimeria tenella podría aislarse, clonarse y secuenciarse. Además, la secuencia genómica, es decir la secuencia de la parte dei gen se encontró en el genoma de Eimeria tenella se encontró que es TTCCCGGATTTTCAGGCGGAGGCGCTGGGCGCCGAGCACTTCCGCTT GCACGAGTACTTGGGGGACAGCTGGGGAGTGATGTTCAGgtaagattgg cgtaaaaaagcccccatttaatcgcatttttaattctgtagactctgtgtcgactgctgagcacga ggggggggcctgctgcacgggagagccttgtctcgcgctcaactctgggtttctggcgttgcttg cagCCACCCGAACGACTTCACCCCCGTCTGACCACCGA. La secuencia se denomina más adelante como SEQ ID NO: 40: Las letras mayúsculas indican la secuencia encontrada en el ARNm, las letras pequeñas indican el intrón en el gen. Por lo tanto, otra forma preferida de esta modalidad se refiere a un fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos como se describe en SEQ ID NO: 40: El ADNc que codifica el ARNm para este polipéptido también se detectó usando el enfoque de sonda mezclada. El ADNc se secuenció y se encontró que tiene la siguiente secuencia: ATGCGTTGAACTTGGGAGATTCCTTTCCAGACTTCCAGGCGGAGGCG CTGGGCGCCGAGCACTTCCGCTTGCACGAGTACTTGGGGGACAGCT GGGGAGTGATGTTCAGCCACCCGAACGACTTCACTCCCGTTTGCACA ACGGAGCTCGCCGAAGCCGTGAAGCTCCAGGACTCCTTCACGAAGAA GAACTGCAAACTCGTTGGCTTCTCCTGCAACGACCTGCAGACTCCTTC ACGAAGAAGAACTGCAAACTCGTTGGCTTCTCCTGCAACGACCTGCA GAGCCACAGAGAATGGGCGAAGGATATAATGGCCTATGCAGGCCGAT CTGGGAACTTGCCGTTTCCCCTCGTTTGCGACCCCAATAGGGAACTG GCCGCGAGTTTGGGAATTATGGATCCTGCAGAAAAGGACAAAAAGGG GCTGCCTTTGACTTGCCGCTGCGTCTTTTTCATAAGTCCAGAGAAGAA GCTCGCGGCCTCTATTTTGTACCCGGCTACCACCGGGAGAAACTTCG CGGAAATCCTTAGGGTCCTGGACTCTCTGCAGCTCACTGCCAAGTTTC CAGTGGCCACTCCAGTGGACTGGACCGCTGGGGCCAAATGCTGCGT AGTGCCGAACTTGGCAGCAGAAGAGGCCCAAAGGCTTTTGCCCAAAG GCCACGAGGCGCTGCAGCTGCCTTCGGGGAAGCCTTACCTGCGGCT CACCCCAGACCCCAGGGGCTGA. Esta secuencia se denomina más adelante como SEQ ID NO: 41: Por lo tanto, aún otra forma preferida de esta modalidad se refiere a un fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos como se describe en SEQ ID NO:41: Los polipéptidos de la presente invención se pueden aislar de parásitos de Eimeria usando cualquier procedimiento de aislamiento normal conocido en la materia para aislar los polipéptidos de Eimeria. Los polipéptidos se pueden obtener v.gr., como se describe en los ejemplos. Se pueden usar subsecuentemente para v.gr., la preparación de una vacuna o para elevar los anticuerpos. Alternativamente un fragmento de ADN de acuerdo con la invención puede expresarse en un sistema de expresión in vitro y ei producto de expresión, el polipéptido de acuerdo con la invención puede usarse v.gr., para las preparaciones de vacunas o anticuerpos. Un requerimiento esencial para la expresión del fragmento de ADN es un promotor adecuado ligado operablemente al fragmento. Es obvio para los expertos en la materia que la elección de un promotor se extiende a cualquier promotor eucariótico, procariótico o viral capaz de dirigir la transcripción de genes en células usadas como células huésped para la expresión de proteínas. Por lo tanto, una forma preferida de esta modalidad se refiere a fragmentos de ADN recombinantes, es decir fragmentos de ADN de acuerdo con la invención, para los cuales las secuencias reguladoras que permiten la expresión de dichas secuencias de ácidos nucleicos se ha agregado por medios de v.gr., técnicas de biología molecular normales (Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-87969-309-6)). Cuando las células huésped son bacterias, secuencias de control de expresión útiles que pueden utilizarse incluyen el promotor y operador Trp (Goeddel, y otros, Nucí. Acids Res.. 8_, 4057, 1980); el promotor y operador lac (Chang, y otros., Nature. 275. 615, 1978); el promotor de proteína de membrana externa (Nakamura, K. and Inouge, M., EMBO J., 1, 771-775, 1982); los promotores de lambda bacteriófagos y operadores (Remaut, E. y otros., Nucí. Acids Res.. 11. 4677-4688, 1983); el promotor de -amilasa (B. subtilis) y el operador, secuencias de terminación y otras secuencias de mejora compatibles con la célula huésped seleccionada. Cuando la célula huésped es levadura, las secuencias de control de expresión útiles incluyen, v.gr., el factor de igualación de a. Para las células de insectos la polihedrina o promotores p10 de baculovirus pueden utilizarse (Smith, G.E. y otros, Mol. Cell. Biol. 3_, 2156-65, 1983). Cuando la célula huésped es de origen mamífero, las secuencias de expresión de control ilustrativas útiles incluyen el promotor SV-40 (Berman, P.W. y otros, Science. 222. 524-527, 1983) o el promotor de metalotionina (Bripster, R.L., Nature. 296. 39-42, 1982) o un promotor de choque de calor (Voellmy y otros., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 82. 4949-53, 1985). Alternativamente, las secuencias de expresión de control presentes en Eimeria también pueden aplicarse. Para aumentar al máximo la expresión del gen, ver también Roberts and Lauer (Methods in Enzvmology. 6_8, 473, 1979). Los sistemas de expresión de células en bacterias, levaduras, hongos, insectos y mamíferos son sistemas más frecuentemente usados. Dichos sistemas son bien conocidos en la materia y están fácilmente disponibles, v.gr., comercialmente a través de Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabián Way, Palo Alto, California 94303-4607, USA. Después de estos sistemas de expresión, los sistemas de expresión basados en parásitos son sistemas de expresión muy atractivos. Dichos sistemas por ejemplo, se describen en la Solicitud de Patente French con Número de Publicación 2 714 074, y en la publicación US-NTIS No. US 08/043109 (Hoffman, S and Rogers, W.: publicada el 1° de Diciembre de 1993). Por lo tanto, en una forma más preferida de esta modalidad de la invención se refiere a una molécula de ADN recombinante que codifica el fragmento de polipéptidos bajo el control de secuencias reguladoras que permiten la expresión de la proteína codificada por dicha secuencia de ácidos nucleicos. Otra modalidad de la invención se refiere a Vehículos Recombinantes Vivos (LRC por sus siglas en inglés) que comprenden un fragmento de ADN o una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la invención que un polipéptido de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico de los mismos. Dichos Vehículos Recombinantes Vivos son v.gr., bacterias, parásitos y virus. Estos microorganismos de LRC son microorganismos en los cuales se clonó la información genética adicional. Los animales infectados con dichos LRC producirán una respuesta inmunogénica no solamente contra los inmunogenos de los LRC, sino también contra las partes inmunogénicas de los polipéptidos para los cuales el código genético se clona adicionalmente en los LRC, v.gr., el polipéptido de acuerdo con la invención. Como un ejemplo de los LRC bacterianos, las cepas de Salmonella atenuadas conocidas en la materia pueden usarse atractivamente. También, los virus de LRC pueden usarse como una forma de transportar el fragmento de ADN en la célula blanco. Los parásitos de vehículos recombinantes vivos se han descrito i. a. por Vermeulen, A. N. (Int. Journ. Parasitol. 28: 1121-1130 (1998)). Los virus de vehículos recombinantes vivos también se llaman virus de vectores. El sitio de integración del ADN que codifica el polipéptido de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico del mismo puede ser un sitio en un gen viral que no es esencial para el virus, o un sitio en una región intergénica. Los virus con frecuencia usados como vectores son virus de Vaccinia (Panicali y otros; Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 79: 4927 (1982). Herpesvirus (E.P.A. 0473210A2) y Retrovirus ( (Valerio, D. y otros;
en Baum, S.J., Dicke, K.A., Lotzova, E. And Pluznik, D.H. (Eds.), Experimental Haematology today - 1988. Springer Verlag, New York; págs. 92-99 (1989)). Los virus de aves especialmente, un virus de vaccinia infecciosos para aves de corral y Herpesvirus de Pavos (HVT por sus siglas en inglés) son virus portadores recombinantes vivos muy atractivos para portar ADN que codifica un polipéptido de la invención o un fragmento inmunogénico del mismo. La invención también se refiere a una célula huésped que contiene un fragmento de ADN de acuerdo con la invención, a una célula huésped que contiene una molécula de ADN recombinante que contiene un fragmento de ADN de acuerdo con la invención bajo el control de secuencias reguladoras que permiten la expresión de la proteína codificada por la secuencia de ácidos nucleicos y a una célula huésped que contiene un microorganismo de Vehículos Recombinantes Vivos (LCR) que contiene un fragmento de ADN de acuerdo con la invención. Una célula huésped puede ser una célula de origen bacteriano, v.gr., Escherichia coli, Bacillus subtilus y especies de Lactobacilos, en combinación con los vectores basados bacterias como pBR322, o vectores de expresión bacterianos como pGEX, o con bacteriófagos. La célula huésped también puede ser de origen eucariótico, v.gr., células de levadura en combinación con moléculas de vector específicas de levadura o células eucarióticas superiores similares a células de insectos (Luckow y otros; Biotechnology 6: 47-55 (1988)) en combinación con vectores o baculovirus recombinantes, células de plantas en combinación con v.gr., vectores basados en plásmido Ti o vectores vírales de plantas (Barton, K.A., y otros; Cell 32: 1033 (1983), células de mamíferos como células Hela, células de Hámster Chino (CHO) o células de Riñon de Felinos Crandell, también con vectores apropiados o virus recombinantes. La técnica de recombinación homologa in vivo, bien conocida en la materia se puede usar para introducir una secuencia de ácido nucleico recombinante en el genoma de una bacteria, parásito o virus de elección, capaz de inducir la expresión del gen infectado en animal huésped. Otra modalidad de la invención se refiere a vacunas capaces de protegerá las aves de corral contra los efectos patogénicas de la infección de Eimeria. Las vacunas de acuerdo con la infección de la presente invención pueden hacerse v.gr., mezclando meramente un polipéptido de acuerdo con la invención o un fragmentó inmunogénico del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo farmacéuticamente aceptable se entiende que es un compuesto que no afecta adversamente la salud del animal que será vacunado, por lo menos no al grado que el efecto adverso sea pero que los efectos observados debido a la enfermedad cuando no se vacuna el animal. Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser v.gr., estéril en agua o una solución salina fisiológica estéril. En una forma más compleja, el vehículo puede ser v.gr., una solución reguladora de pH.
La vacuna de acuerdo con la presente invención en una presentación preferida puede contener un adyuvante. Los adyuvantes en general comprenden substancias que refuerzan la respuesta inmune del huésped en una forma no específica. En la técnica se conocen cierto número de adyuvantes diferentes. Los ejemplos de adyuvantes son el completo e incompleto de Freund, vitamina E, polímeros de bloque no iónicos y poliamidas tales como sulfato de dextrano, carbopol y pirano. También son adecuadas las substancias de superficie activa tal como Span. Tween, hexadecilamina, lisolecitina, metoxihexadecilglicerol y saponinas tales como Quill A®. Un adyuvante preferido de Quill A. Este se puede administran a un nivel de alrededor de 150µg/dosis (por ejemplo). Además, los péptidos tales como muramildipéptidos, dimetiig lici na , tuftsina, se usan con frecuencia. Después de estos adyuvantes, se pueden usar ventajosamente los Complejos de Estimulación inmunes (ISCOMS), aceites minerales v.gr., aceites vegetales de Bayol® o Markol®, o emulsiones de los mismos y Diluvac® Forte. La vacuna también puede comprender un "vehículo" así llamado. Un vehículo es un compuesto al cual se le adhiere el polipéptido, sin estar unido covalentemente al mismo. Con frecuencia se usan compuestos de vehículo, tal como, por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato, sulfato u oxido, silicio, caolín y Bentonita. Una forma especial de dicho vehículo, en el cual se embebe parcialmente el antígeno en el vehículo, es el ISCOM así llamado (EP 109.942, EP 180a564, EP 241.380). Un adyuvante preferido es Quill A. Este se puede administrar a un nivel de alrededor de 50 µg/dosis (por ejemplo). Con frecuencia, la vacuna se mezcla con estabilizantes, v.gr., para proteger los polipéptidos propensos a la degradación degradados, para mejorar la vida de almacenamiento de la vacuna, o para mejorar la eficiencia de secado por congelación. Los estabilizadores útiles son es decir, SPGA (Bovanik y otros; J. Bacteriology 59: 509 (1950)), leche descremada, gelatina, albúmina de suero de bovino, carbohidratos v.gr., sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína o productos de degradación de los mismos y soluciones reguladoras de pH, tal como fosfatos de metales alcalinos. El secado por congelación es un método eficiente para la conservación. El material secado por congelación puede almacenarse y mantenerse viable durante muchos años. Las temperaturas de almacenamiento del material sacado por congelación están por arriba de cero grados, sin ser perjudicial para el material. El secado por congelación puede realizarse de acuerdo con todos los procedimientos de secado por congelación normales bien conocidos. Por lo tanto, en una modalidad más preferida, la vacuna es una forma secada por congelación.
Además, la vacuna puede suspenderse en un diluyente fisiológicamente aceptable. Dicho diluyente, por ejemplo puede ser tan simple como agua estéril o una solución de sal fisiológica. No es necesario decir, que también se emulsifican en la presente invención otras formas para adyuvar, agregar compuestos o diluyentes de vehículos, emulsificar o estabilizar un polipéptido. La vacuna de acuerdo con la invención puede administrarse en un esquema de inmunización activo convencional: administración sola o repetida en una forma compatible con la formulación de dosis y en tal cantidad que será profilácticamente efectiva, es decir la cantidad de inmunizar el antígeno o un microorganismo recombinante capaz de expresar dicho antígeno que inducirá la inmunidad en pájaros (especialmente aves de corral) contra confrontación por parásitos de Eimeria virulentos. La inmunidad se define como la inducción de un nivel significativo de protección en una población de pájaros después de la vacuna comparado con un grupo no vacunado. Una vacuna que comprende el polipéptido de la invención puede reducir el número de oocitos dispersos por los animales infectados. Normalmente, los oocitos dispersos infectarán a otros animales en la bandada. Una disminución en el número de oocitos dispersos entonces también dará una disminución en el número de animales que se infecta subsecuentemente y también una disminución en el número de oocitos dispersos que dan origen a una menor carga infecciosa.
Además, aún sin el efecto sobre el propio parásito, una vacuna puede disminuir la incidencia de la enfermedad. Esto especialmente es así cuando se ocasionan los síntomas de enfermedad por los productos liberados por el parásito. Las vacunas dirigidas contra dichos productos alivian los síntomas sin atacar al parásito. En cualquier caso, se prefiere que una vacuna de la presente invención sea capaz de reducir el número de lesiones cecales en un ave cuando se confronta con una infección de Eimeria subsecuente.
Para vacunas de vectores virales vivos, el régimen de dosis por pollo variará de 103 a 108 (pero aún <1000 pfu pueden ser suficiente para v.gr., HVT). Una vacuna subunitaria típica de acuerdo con la invención comprende de 0.1 a 100µg del polipéptido (o variante o fragmento del mismo) de acuerdo con la invención. Preferiblemente por lo menos estarán presentes 5µg. Dichas vacunas se pueden administrar intradérmicamente, subcutáneamente, intramuscularmente, ¡ntraperitonealmente, intravenosamente, oralmente o intranasalmente. La vacuna de acuerdo con la invención también puede ser mezclada efectivamente con otros componentes antigénicos de las mismas especies de Eimeria y/u otras, y/o con inmunogenos adicionales derivados de un virus patogénico de aves o microorganismo y/o secuencias de ácidos nucleicos que codifican estos inmunógenos. Dicha vacuna de combinación puede disminuir la carga de parásitos en una bandada de aves y puede incrementar el nivel de protección contra coccidiosis y además proteger contra otros patógenos de aves. Los demás inmunógenos pueden v.gr., seleccionarse del grupo de virus patogénicos de aves o microorganismos que consisten del virus de Enfermedad de Marek (MDV, por sus siglas en inglés), virus de Enfermedad de Newcastle (NDV, por sus siglas en inglés), virus de Bronquitis infecciosa (IBV, por sus siglas en inglés), Agente de Anemia de Pollo (CAÁ, por sus siglas en inglés), Reo virus, Retrovirus de Aves, Adenovirus de Aves de corral, virus de Rinotraqueitis en Pavos, Salmonella spp. o E. coli. Por lo tanto, se puede proveer una vacuna multivalente. Aún otra modalidad de la invención se refiere a métodos para la preparación de una vacuna. Dichos métodos comprenden mezclar un polipéptido de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico del mismo y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una forma alternativa y eficiente de vacuna es vacunación directa con ADN que codifica el antígeno relevante. La vacuna directa con ADN que codifica polipéptidos ha sido exitosa para muchos polipéptidos diferentes. (Como se revisó en v.gr., Donnelly y otros, The Immunologist 2: 20-26 (1993)). En el campo de vacunas contra parásitos, la protección contra v.gr., Plasmodium yoelli se ha obtenido con la vacunación de ADN con el gen de circunesporozoito de Plasmodium yoelli (Vacuna 12: 1529-1533 (1994)). La protección contra Leishmania major se ha obtenido con la vacuna de ADN con el gen gp63 de glicoproteína de superficie de Leishmania major (Vacuna 12:1534-1536 (1994)). Los anticuerpos o derivados de los mismos (v.gr., fragmentos tales como Fab, F(ab')2 o fragmentos de Fv), que se dirigen contra un polipéptido de acuerdo con la invención tienen usos potenciales en inmunoterapia pasiva, inmunoanálisis de diagnóstico y en la generación de anticuerpos anti-idiotípicos. De preferencia, estos son específicos para los polipéptidos de Eimeria de la presente invención o variantes/fragmentos de los mismos. También se pueden proveer anticuerpos que comprenden suero o derivados de los mismos. Los polipéptidos de Eimeria (o variantes y fragmentos de los mismos) como se caracterizó antes, pueden usarse para producir anticuerpos, los cuales pueden ser policlonales, monoespecíficos o monoclonales (o derivados de los mismos). Si se desean anticuerpos policlonales, en la materia se conocen técnicas para producir y procesar sueros policlonales (v.gr., Mayer and Walter, eds. Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology, Academic Press, London, 1987). Los anticuerpos monoclonales, reactivos contra los polipéptidos de Eimeria (variantes o fragmentos de los mismos) de acuerdo con la presente invención, se pueden preparar inmunizando ratones en crianza mediante técnicas conocidas en la materia (Kohler and Milstein, Nature, 256, 495-497, 1975).
Los anticuerpos anti-idiotípicos son inmunoglobulinas que portan una "imagen interna" del antígeno del patógeno contra el cual se desea protección y se pueden utilizar como un inmunógeno en una vacuna (Dreesman y otros, J. Infecí. Disease, 151, 761, 1985). Las técnicas para elevar los anticuerpos anti-idiotípicos se conocen en la materia (MacNamara y otros, Science 226, 1325, 1984). Los anticuerpos contra cualquiera de los polipéptidos de la presente invención y hechos, v.gr., en una dé las formas descritas antes, se pueden usar i. a. para fines de vacunación, especialmente en animales inmunocomprometidos. Por lo tanto, aún otra modalidad de la presente invención se refiere a anticuerpos contra cualquiera de los polipéptidos de acuerdo con la invención. También la invención se refiere a métodos para la preparación de dichos anticuerpos. Estos métodos comprenden administración de un polipéptido de acuerdo con la invención a un animal adecuado, es decir, un animal capaz de formar anticuerpos contra polipéptidos. Puede ser conveniente detectar Eimeria como la causa de enfermedad en aves: especialmente detección temprana de infección por Eimeria en un conjunto de aves ofrece la oportunidad de tomar las medidas adecuadas para la prevención de difusión de la infección. La detección de infección por Eimeria puede realizarse detectando el parásito de Eimeria en el huésped o detectando los anticuerpos del huésped contra Eimeria.
La detección de parásitos de Eimeria puede realizarse, v.gr., de la siguiente manera: ADN preparado del contenido del tracto digestivo de un animal enfermo puede sondearse con fragmentos de ADN de acuerdo con la invención y someterse a la Reacción en Cadena de Polimerasa (RCP) normal. Si el ADN de Eimeria está presente, aún en cantidades extremadamente bajas, esto da como resultado un producto de RCP, visible sobre geles de agarosa normales después de varios ciclos de RCP. Las técnicas de RCP, por lo tanto, se describen en Maniatis/Sambrook (Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. ISBN 0-97969-309-6). Por lo tanto, la invención, en aún otra modalidad, se refiere a métodos para la detección de Eimeria, cuyos métodos comprenden incubar una preparación de ADN aislado de aves con un fragmento de ADN de acuerdo con la invención. Alternativamente, pueden detectarse los anticuerpos contra
Eimeria. La detección de anticuerpos puede realizarse, por ejemplo, usando un análisis de ELISA, en el cual un polipéptido de acuerdo con la invención se reviste sobre la pared de una placa de ELISA. El primer paso de dicha ELISA puede comprender, por lo tanto, la adición de suero del animal que será sondeado a la placa de ELISA. Los anticuerpos contra Eimeria, si están presentes en todos se unirán al polipéptido revestido sobre la pared. La ausencia o presencia de estos anticuerpos en el siguiente paso se puede detectar vía incubación con un anticuerpo anti-aves marcado. Si los anticuerpos contra Eimeria están presentes en el suero pueden sondearse, el anticuerpo anti-aves marcado se unirá a ellos y la etiqueta revela su presencia. Estas técnicas normales se describen extensamente en "Antibodies: a laboratory manual" por Harlow, E. y Lañe, D. ISBN 0-87969-314-2. Por lo tanto, la invención en aún otra modalidad se refiere a métodos para la detección de Eimeria, cuyos métodos comprenden la detección de anticuerpos a n ti -E mer/a huéspedes, contra cualquiera de los polipéptidos de acuerdo con la presente invención. EJEMPOS Ejemplo 1: aislamiento de proteínas y secuenciación de proteínas Pollos La crianza de pollos White Leghorn asexuales o en serie, criados bajo condiciones específicas libres de patógenos, se mantuvieron en aisladores con acceso libre a alimento y agua. Las heces se monitorearon semanalmente para asegurarse de que los animales estuvieran libres de infecciones coccidiales no deseadas. Para la infección se usaron pollos de 5-7 semanas de edad. Para la vacunación se usaron pollos de 3 semanas edad. Parásitos y purificación de esporozoitos Se utilizó la cepa Weybridge de E. tenella (Shirley M.W. In: Research in Avian Coccidiosis. Porceedings of the Georgia Coccidiosis Conference (Eds.: L.R. McDougald, Joyner L.P. y P.L. Long) Athens, University of Georgia, págs. 13-35 (1986)). Los parásitos se pasaron en intervalos regulares a través de pollos libres de coccidiosis. La manipulación de oocitos, liberación de esporocistos y esporozoitos de oocitos esporulados se llevó a cabo como se describió antes (Long P.L., Milla rd B.J., Joyner L.P. & Norton C.C. Folia Veterinaria Latina 6, 201-217 (1976)) usando 0.4% de taurocolato (Sigma, St. Louis, MO, USA) en lugar de sales biliares (Toyama T. & Kitano N. Japanese Journal of Veterinary Science 45, 139-141 (1983)). Los esporozoitos además se purificaron por el paso en tejido de nilón (Larsen R.A. Kyle J.E., Whitmire W.M. & Speer C.A. Journal of Parasitology 70, 597-601 (1984)) y se almacenaron como pellas a -70°C. Fraccionación de proteína de esporozoitos Extracción de Triton-X114 Se llevó a cabo una extracción de Tritón X-114 para aislar la fase hidrofílica de las proteína de esporozoitos totales (HPS) (Bordier C. Journal of Biological Chemistry 256, 1504-1607 (1981)). De aquí, 5 x 109 esporozoitos de E. tenella purificados se suspendieron (2 x 108/ml) en 10 mM Tris-HCl, 150 mM de NaCI pH 7.4 (TBS) suplementado con ADNsa (20 µg/ml) e inhibidores de proteasa; 1 mM de fluoruro de fenilmetil sulfonilo (PMSF, Serva, Heidelberg, Germany), 5 µg/ml de Aprotinina, 1 µg/ml de Leupeptina y 1 µg/ml de Pepstatina A y se trataron con sonido tres veces durante 20 segundos en la posición 7, sobre hielo (usando un aparto para tratar con sonido de Branson, Soest, Netherlands). El Tritón X-114 precondensado (Serva) en TBS se agregó a la suspensión de esporozoitos a una concentración final de 10% (v/v) y se mezcló bien para disolver las proteínas. Ei material no solubilizado se formó en pellas por centrifugación (20 min. 12000g a 4°C). El sobrenadante recuperado se formó en capas sobre un cojín de sacarosa de 6% y se incubó durante 15 minutos a 40°C (separación de fase) y se hizo girar 10 minutos, 400 g a temperatura ambiente (TM). La extracción de la fracción hidrofílica se repitió una vez en 10% (v/v) y subsecuentemente en 20% (v/v) de Tritón X-114 precondensado. La concentración de proteína total se determinó usando el análisis de ácido biquincónico (BCA) (Pierce Chemicals, Rockford, Illinois, USA). Esta fase hidrofílica se almacenó a -70°C hasta que se usó después. Fraccionación de células preparativas Todos los procedimientos se llevaron a cabo a 4°C. Antes de la fraccionación se concentró HPS por precipitación con acetona (HPS:acetona + 1:9). Después de la centrifugación durante 60 minutos a 15000g y 4°C y las pellas secadas en aire se disolvieron en una solución reguladora de muestra de reducción (Laemmli 1970) conteniendo 30 mg/ml de ditiotreitol (DTT) e hirviendo 3 minutos a 100°C. Las proteínas hidrofílicas se fraccionaron usando 12% (p/v) de gel de separación de poli acrilamida (PAA) (7 cm) y un gel de separación de PAA de 4% (p/v) en el tubo de 37 mm de diámetro del aparato de células preparadas de Bio-Rad (Bio-Rad Labs, Richmond, CA) de acuerdo con el protocolo de fabricante. Las células preparadas se operaron a 40 mA, 500 V max. Se recuperaron fracciones (+.3ml) durante la noche y se almacenaron a -85°C. Las muestras de las fracciones se diluyeron una vez en una solución reguladora de pH de reducción de muestras de consistencia doble y se analizaron con la electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE por sus siglas en inglés) usando un gel de PAA de 12% (p/v) (Laemmli 1970). Los geles se tiñeron con plata de acuerdo con Wray y otros (Wray W., Boulikas T., Wray V.P. & Hannock R. (1981) Silver staining of proteins in polyacrilamida). Cincuenta fracciones se analizaron basado en su masa molecular relativa y se dializaron con solución salina de pH de fosfato de 0.01M (PBS) pH 7.3. Estas fracciones que contienen proteínas con un P.M. entre 26 y 30 kD ( + /+ 5 kD) se seleccionaron para análisis adicional. La concentración de proteína total en las fracciones se determinó usando el análisis de BCA. Caracterización de antígenos seleccionados y secuenciación de Proteínas Las fracciones que contienen polipéptidos descritos bajo la fraccionación de células Preparatorias y que varían de 26-30 kD (+.5 kDa, para permitir limitaciones posibles en las técnicas de medición utilizadas) se colocaron sobre gel para análisis adicional. Además de fraccionaron en un gel de poliacrilamida al 12% (p/v) preparativo, se tiñeron con Azul Brillante de Coomassie y se extirparon subsecuentemente del gel. Las bandas de estos geles se usaron para fines de secuenciación como se describe más adelante.
Los polipéptidos en los sílices de gel se sometieron a digestión tríptica como se describe por- Rosenfeld y otros, Anal. Biochem. 203: 173-179 (1992). Por lo tanto, las digestiones trípticas se liberaron del gel y se pre-purificaron en CLAR preparativa usando el sistema de ácido Trifluroacético (TFA), seguido por CLAR preparativa usando el sistema de Acetato de Amonio. Los fragmentos de polipéptidos purificados se secuenciaron usando el método de Edman normal como se describió (Edman, P., Acta Chem. Scand. 10: 761-768 (1956) and Use, D. & Edman, P., Aust. J. Chem. 16: 411-416 (1963)). Ejemplo 2: aislamiento/clonación de ADN y secuenciación de ADN La clonación y secuenciación de un fragmento del gen que codifica el polipéptido de 25 kD similar a SOD. Se aisló ARNm de trofozoitos de la primera generación de E. tenella (obtenidos de células de MDBK infectadas con esporozoitos extirpados recientemente) a 40-48 horas después de la infección usando reactivo de aislamiento de ARN total de Ultraspec (Biotecx Lab. Inc., Houston, Texas). El primer hilo de ADNc se sintetizó usando un iniciador posterior específico para SOD, de acuerdo con el código de ambigüedad GCRAARTCCCARTTIACIAC, el cual se dedujo de una parte de (VVNWDFA) de oligopéptido YLDAWWSVVNWDFANENLK que se aisló y se secuenció como se describió antes y que es parte de la secuencia dada en SEQ ID NO:1. Al 0.5 µg el iniciador de ARNm se agregó y se incubó a 70°C durante 10 minutos. La síntesis de ADNc se llevo a cabo usando transcriptasa inversa Superscript (equipo de síntesis de ADNc, Gibco BRL). La reacción se incubó durante 50 minutos a 41°C. La síntesis de ADNc se detuvo mediante el enfriamiento rápido sobre hielo. Después el ADNc se purificó por la extracción de fenol/cloroformo seguido por la precipitación en etanol de acuerdo con los procedimientos normales (Sambrook T, y otros). Este ADNc iniciado específico se sometió a RCP usando el iniciador posterior y un iniciador delantero específico, de acuerdo con el código de ambigüedad (CCIGAYGCTYTIGARCCITAYAT), el cual se dedujo de una parte (PDALEPYI) de otro oligopéptido, FSLPPLPYKPDALEPYIS, el cual se aisló y se secuenció como se describió antes, y que también es parte de la secuencia dada en SEQ ID NO: 1. La reacción se operó en un sistema de RCP de GeneAmp (Perkin Elmer) que se programó de la siguiente manera: 10 minutos 94°C - 1 minuto 94°C; 30 segundos 55°C; 90 segundos 68°C (30 ciclos) - 10 minutos 68°C; 4°C. Los productos de RCP obtenidos se operaron en un bromuro de etidinio que contiene gel de agarosa TAE al 1%. Los fragmentos de RCP específicos se visualizaron usando luz UV y se extirparon del gel. Los fragmentos se eluyeron del gel incubando el gel en una cantidad igual de agua desionizada durante la noche. Los fragmentos de RCP se clonaron en un vector romo pCRII-topo (equipo de clonación de RCP Cero-Topo, Invitrogen, Leek, the Netherlands) de acuerdo con las especificaciones del fabricante.
Usando iniciadores específicos de pCRII-topo el fragmento de RCP insertado se secuenció usando un Analizador Genético ABI Prism 310 (Perkin Elmer). La clonación y secuenciación de un fragmento del gen que codifica el polipéptido de 25 kD similar a peroxidoxina. El procedimiento fue similar al procedimiento descrito antes, sin embargo el iniciador posterior (TCITGTRCAIACIGGIGTRAART) usado para la síntesis de ADNc específica se dedujo de una parte conservada (DFTPVCTTE) de moléculas de peroxidoxina. En la reacción de RCP este iniciador posterior se usa en combinación con el iniciador delantero (TTYCCIGAYTTYCARGCIGARGC) deducido de una parte del oligopéptido aislado (FPDFQAE). Ejemplo 3: experimentos de vacunación. La determinación de potencial de vacuna de polipéptidos seleccionados. Los grupos de pollo se inmunizaron con los polipéptidos seleccionados. Los animales recibieron una vacunación de iniciación en el día 0 y una vacunación de refuerzo en el día 21. Catorce días después de la vacuna de refuerzo todos los animales se confrontaron con oocitos esporulados de E. tenella. siete días después los animales se sacrificaron para determinar la clasificación de lesión en la ceca. El grupo de animales vacunados con los polipéptidos de acuerdo con la invención tuvo clasificaciones de lesiones cecales reducidos comparado con los controles no vacunados. Esta reducción fue estadísticamente importante (P<0.05).
Experimentos de vacunación Los volúmenes de polipéptidos seleccionados se combinaron y se ajustaron para obtener 5-10 µg de un polipéptido de acuerdo con la invención/dosis (0.5 mi) a menos que se indique de otra manera. Para cada dosis 150 µg/dosis Quill A (Superfos Biosector, Vedbaek, Denmark) se agregó como adyuvante. Las diferentes preparaciones de vacuna se inyectaron subcutáneamente en grupos de +.10 pollos. El grupo control se inyectó con adyuvante en PBS. Después de +_3 semanas los pollos se reforzaron con la misma preparación, la cual se preparó recientemente de la materia prima de antígenos congelados.
LISTA DE SECUENCIAS
(1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE (A) NOMBRE: Akzo Nobel N.V. (B) CALLE: Velperweg 76 (C) CIUDAD: Arnhem (E) ESTADO: The Netherlands (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): 6824 BM (G) TELEFONO: 0412 666379 (H) TELEFAX: 0412 650592 (¡i) TITULO DE LA INVENCIÓN: Vacunas de Coccidioss (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 41 (iv) FORMA LEÍBLE POR COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: disco flexible (B) COMPUTADORA: PC compatible con IBM (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Reléase #1.0, Versión #1.30 (EPO) (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 214 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE HILO: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno < (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
Met Pro Phe Glu Leu Pro Pro Leu Pro Tyr Pro Met Asp Ala Leu Glu 1 5 10 15
Pro Tyr lie Ser Lys Glu Thr Leu Glu Tyr His Tyr Gly Lys His Hie 20 25 30 Ala Ala Tyr Val Asn Asn Leu Asn Arg Leu Val Glu Gly Lys Pro Glu 35 40 45 Ala Ser Lys Ser Leu Glu Glu He He Lys Thr Ser Ser Gly Ser Val 50 55 60 Leu Asn Asn Ala Gly Gln Ala Trp Asn His Thr Phe Tyr Trp Lys Ser 65 70 75 80
Met Arg Pro Ala Ser Ala Gly Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Gly Gly
85 90 95
Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Leu Arg Glu Glu Leu Glu Ser Ala loo 105 110 Phe Gly Gly Val Glu Lys Phe Arg Glu Ala Phe Ala Ala Ala Ala Ala 115 120 125 Ala His Phe Gly Ser Gly Trp Ala Trp Leu Cys Phe Cys Lys Lys Ser 130 135 140 Arg Ser Leu Phe Leu Leu Gln Thr His Asp Gly Ala Thr Pro Phe Arg 145 150 155 160
Asp Asn Pro Asn Cys Ala Pro Leu Leu Thr Cys Asp Leu Trp Glu His 165 170 175
Ala Tyr Tyr He Asp Arg Arg Asn Asp Arg Lys Ser Tyr Leu Asp Ala 180 185 190 Trp Trp Ser Val Val Asn Trp Asp Phe Ala Asn Glu Asn Leu Lys Lvs 195 200 205 Ala Met Gln Gly Ser Asp 210
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 13 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE HILO: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
Leu Gly Pro Leu A la Leu Por Leu Leu Ala Asp Val Arg 1 5 10
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 223 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE HILO: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
Met Pro Leu Asn Leu Gly Asp Ser Phe Pro Asp Phe Gln Ala Glu Ala
1 5 10 15 s- Leu Gly Ala Glu His Phe Arg Leu His Glu Tyr Leu Gly Asp Ser Trp 20 25 30 Gly Val Met Phe Ser His Pro Asn Asp Phe Thr Pro Val Cye Thr Thr 35 40 45 Glu Leu Ala Glu Ala Val Lys Leu Gln Asp Ser Phe Thr Lys Lys Asn 50 55 60 Cys Lys Leu Val Gly Phe Ser Cys Asn Asp Leu Gln Ser His Arg Glu 65 70 75 80
Trp Ala Lys Asp He Met Ala Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Asr. Leu Pro 85 90 95
Phe Pro Leu Val Cys Asp Pro Asn Arg Glu Leu Ala Ala Ser Leu Gly 10C 105 110 He Met Asp Pro Ala Glu Lys Asp Lys Lys Gly Leu Pro Leu Thr Cys 115 120 125 Arg Cys Val Phe Phe lie Ser Pro Glu Lys Lys Leu Ala Ala Ser He 130 135 140 Leu Tyr Pro Ala Thr Thr Gly Arg Asn Phe Ala Glu He Leu Arg Val 145 150 155 160
Leu Asp Ser Leu Gln Leu Thr Ala Lys Phe Pro Val Ala Thr Pro Val 165 170 175
Asp Trp Thr Ala Gly Ala Lys Cys Cys Val Val Pro Asn Leu Ala Ala 180 185 190 Glu Glu Ala Gln Arg Leu Leu Pro Lys Gly His Glu Ala Leu Gln Leu 195 200 205 Pro Ser Gly Lys Pro Tyr Leu Arg Leu Thr Pro Asp Pro Arg Gly 210 215 220
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 15 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE HILO: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: Met Ser Por Ser Pro Ala Gly Val Ala Glu Tyr Leu Ala Ser Leu 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 16 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE HILO: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: Asn His Ala Glu Phe Asp Pro Ser Gln Thr Glu Val Val Val Phe Pro 1 5 10 15 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FORMA DE HILO: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (v) TIPO DE FRAGMENTO: interno (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: Val Asp Ser Phe Thr Pro Ser Val Gly Cys Val Phe Ala Gly Met Pro 1 5 10 15
Ala Asp Phe Arg 20
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: GTAAATTGGG ACTTCGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
GTAAACTGGG ACTTCGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: GTAAATGGG ACTTCGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: GTAAATTGGG ACTTCGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11 GTAAATTGGG ACTTCGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: GTTAACTGGG ACTTCGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
GTTAATTGGG ACTTCGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico _.(C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: GTTAATTGGG ACTTCGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: GTGAATTGGG ACTTTGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16: GTGAATTGGG ACTTTGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17: GTGAATTGGG ACTTTGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
GTGAACTGGG ACTTTGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE L SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: GTCAATTGGG ACTTTGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20: GTCAACTGGG ACTTTGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21 GTCAATTGGG ACTTTGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22: GTCAACTGGG ACTTTGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
GTAAATTGGG ATTTCGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24: GTAAACTGGG ATTTCGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25: GTAAATTGGG ATTTCGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26: GTAAACTGGG ATTTCGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27: GTTAATTGGG ATTTCGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
GTTAACTGGG ATTTCGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29: GTTAATTGGG ATTTCGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30: GTTAACTGGG ATTTCGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31 GTGAATTGGG ATTTTGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32: GTGAACTGGG ATTTTGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
GTGAATTGGG ATTTTGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34: GTGAACTGGG ATTTTGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35: GTCAATTGGG ATTTTGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36: GTCAACTGGG ATTTTGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37: GTCAATTGGG ATTTTGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:
GTCAACTGGG ATTTTGC 17
2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 719 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 10 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:
atg ccg ttc gaa etc ecc ceg ctg ceg tac ecc atg gac gee etc gag 48 Met Pro Phe Glu Leu Pro Pro Leu Pro Tyr Pro Met Asp Ala Leu Glu 1 5 10 15 •je ccg tac ate age aaa gag act etc gag tac cae tat ggg aag cae cae 96 Pro Tyr He Ser Lys Glu Thr Leu Glu Tyr His Tyr Gly Lys Hie His 20 25 30 gcg gct tac gtg aac aac ttg aac aga etc gtc gag ggg aag ccg gag 14- Ala Ala Tyr Val Asn Asn Leu Asn Arg Leu Val Glu Gly Lys Pro Glu 35 40 45 gct tcc aag age ctg gag gaa ata ata aag acc tcc tcg ggg tcg gtg 192 Ala Ser Lys Ser Leu Glu Glu lie He Lys Thr Ser Ser Gly Ser Val 50 55 60 20 ctg aac aac gcg ggc cag gcg tgg aac cae acg ttc tac tgg aag tcg 240 Leu Asn Asn Ala Gly Gln Ala Trp Asn His Thr Phe Tyr Trp Lys Ser 65 70 75 80 atg cgg ccg gee tcg gcg ggg ggc ecc ccg ggg gee ecc ggc ggg ggc 283 Met Arg Pro Ala Ser Ala Gly Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Gly Gly 85 90 95
ecc ccg ggg gcc ccg ggg gcc ecc ctg cgg gag gag ctg gag age gcg 336 Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Leu Arg Glu Glu Leu Glu Ser Ala 100 *" 105 110 ttc ggg ggc gtg gag aag ttc cgg gag gcc ttt gct gct gct gct gct 3S4 Phe Gly Gly Val Glu Lys Phe Arg Glu Ala Phe Ala Ala Ala Ala Ala 115 120 125 gcg cae ttc ggc tcg ggc tgg gcc tgg etc tgc ttc tgc aag aag tcc 432 Ala His Phe Gly Ser Gly Trp Ala Trp Leu Cys Phe Cys Lys Lys Ser 130 135 140 cgc age etc ttt ttg ctg cag acc cae gac ggg gcc acg ect ttc aga 480 Arg Ser Leu Phe Leu Leu Gln Thr His Asp Gly Ala Thr Pro Phe Arg 145 150 155 160 gac aac ecc aac tgc gcg ccg ctg etc acc tgc gac ctg tgg gag cae 528 Asp Asn Pro Asn Cys Ala Pro Leu Leu Thr Cys Asp Leu Trp Glu His 165 170 175 gcc tac tac ate gac cgc aga aac gac cgc aag age tac etc gac gcg 576 Ala Tyr Tyr He Asp Arg Arg Asn Asp Arg Lys Ser Tyr Leu Asp Ala 180 185 19C tg tgg tet gtg gtg aat tgg gac ttc gcg aac gag aac ttg aag aag 624 Trp Trp Ser Val Val Asn Trp Asp Phe Ala Asn Glu Asn Leu Lys Lys 195 ' 200 205 gca atg cag gga age gac tag gcgcgtggtg gtctgtggtg aattgggact 675 Ala Met Gln Gly Ser Asp 210 215 tegegaaega gaacttgaag aaggcaatgc agggaagcga ctag 719
) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 265 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:
TTCCCGGATT TTCAGGCGGA GGCGCTGGGC GCCGAGCACT TCCGCTTGCA CGAGTACTTG 60 GGGGACAGCT GGGGAGTGAT GTTCAGGTAA GATTGGCGTA AAAAAGCCCC ATTTAATCGC 120 ATTTTTAATT CTGTAGACTC TGTGTCGACT GCTGAGCACG AGGGGGGGGC CTGCTGCACG 180 GGAGAGCCTT GTCTCGCGCT CAACTCTGGG TTTCTGGCGT TGCTTGCAGC CACCCGAACG 240 ACTTCACCCC CGTCTGCACC ACCGA 265
) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 672 pares de base (B) TIPO: ácido nucleico (C) FORMA DE HILO: sencillo (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:
atg ccg ttg aac ttg gga gat tcc ttt cea gac ttc cag gcg gag gcg 48 Met Pro Leu Asn Leu Gly Asp Ser Phe Pro Asp Phe Gln Ala Glu Ala 1 5 10 15 ctg ggc gcc gag cae ttc cgc ttg cae gag tac ttg ggg gac age tgg 96 Leu Gly Ala Glu His Phe Arg Leu His Glu Tyr Leu Gly Asp Ser Trp 20 25 30 gga gtg atg ttc age cae ccg aac gac ttc act ecc gtt tgc acá acg 144 Gly Val Met Phe Ser His Pro Asn Asp Phe Thr Pro Val Cys Thr Thr 35 40 45 gag etc gcc gaa gcc gtg aag etc cag gac tcc ttc acg aag aag aac 192 Glu Leu Ala Glu Ala Val Lys Leu Gln Asp Ser Phe Thr Lys Lys Asn 50 55 60 tgc aaa etc gtt ggc ttc tcc tgc aac gac ctg cag age cae aga gaa 240 Cys Lys Leu Val Gly Phe Ser Cys Asn Asp Leu Gln Ser His Arg Glu 65 70 75 80 tgg gcg aag gat ata atg gcc tßt gca ggc cga tet ggg aac ttg ccg 288 Trp Ala Lys Asp He Met Ala Tyr Ala Gly Arg Ser Gly Asn Leu Pro 85 90 95 ttt ecc etc gtt tgc gac ecc aat agg gaa ctg gcc gcg agt ttg gga 336 Phe Pro Leu Val Cys Asp Pro Asn Arg Glu Leu Ala Ala Ser Leu Gly 100 105 110 att atg gat ect gca gaa aag gac aaa aag ggg ctg ect ttg act tgc 384 He Met Asp Pro Ala Glu Lys Asp Lys Lys Gly Leu Pro Leu Thr Cys 115 120 125 cgc tgc gtc ttt ttc ata agt cea gag aag aag etc gcg gcc tet att 432 Arg Cys Val Phe Phe He Ser Pro Glu Lys Lys Leu Ala Ala Ser He 130 135 140 ttg tac ccg gct acc acc ggg aga aac ttc gcg gaa ate ctt agg gtc 480 Leu Tyr Pro Ala Thr Thr Gly Arg Asn Phe Ala Glu -He Leu Arg Val 145 150 155 160
ctg gac tet ctg cag etc act gcc aag ttt cea gtg gcc act cea gtg 528 Leu Asp Ser Leu Gln Leu Thr Ala Lys Phe Pro Val Ala Thr Pro Val 165 170 175 gac tgg acc gct ggg gcc aaa tgc tgc gta gtg ccg aac ttg gca gca 576 Asp Trp Thr Ala Gly Ala Lys Cys Cys Val Val Pro Asn Leu Ala Ala 180 185 190 gaa gag gcc ca agg ctt ttg ecc aaa ggc cae gag gcg ctg cag ctg 624
Glu Glu Ala Gln Arg Leu Leu Pro Lys Gly His Glu Ala Leu Gln Leu 195 200 205 ect tcg ggg aag ect tac ctg cgg etc acc cea gac ecc agg ggc tga 672 Pro Ser Gly Lys Pro Tyr Leu Arg Leu Thr Pro Asp Pro Arg Gly 210 215 220
Claims (1)
1-7, caracterizado porque Eimeria es Eimeria tenella. 9. Fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica .un polipéptido hidrofílico o un fragmento inmunogénico del polipéptido, de acuerdo con las reivindicaciones 1-8. 10. Fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos como se describió en la SEQ ID NO:39: o un fragmento del mismo. 11. Fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos como se describió en la SEQ ID NO:40: o un fragmento del mismo. 12. Fragmento de ADN de acuerdo con la reivindicación 9, caracterizado porque comprende una secuencia de ácidos nucleicos como se describió en la SEQ ID NO:41: o un fragmento del mismo. 13. Molécula de ADN recombinante que comprende un fragmento de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 9-12. 14. Vehículo recombinante vivo que comprende un fragmento de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 9-12, o una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 13. 15. Célula huésped que comprende un fragmento de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 9-12, una molécula recombinante de acuerdo con la reivindicación 13 o un vehículo recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 14. 16. Vacuna capaz de proteger a las aves contra infección por Eimeria, caracterizado porque comprende un polipéptido hidrofílico de acuerdo con las reivindicaciones 1-8, un fragmento de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 9-12, un fragmento de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 13, un vehículo recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 14 o una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 17. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 16, caracterizada por que comprende adicionalmente un adyuvante. 18. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17, caracterizada por que comprende un inmunogeno adicional derivado de un virus patogénico de aves o microorganismo. 19. Vacuna de acuerdo con la reivindicación 18, caracterizada por que el inmunogeno se selecciona del grupo de virus patogénicos de aves o microorganismos que consisten de (MDV), virus de Enfermedad de Newcastle (NDV), virus de Bronquitis infecciosa (IBV), Agente de Anemia de Pollo (CAÁ), Reo virus, Retro virus de Aves, Adeno virus de Aves de corral, virus de Rinotraqueitis en Pavos, Salmonella spp. o E. coli. 20. Vacuna de acuerdo con las reivindicaciones 16-19, caracterizada por que está en una forma secada por congelación. 21. Un anticuerpo surgido contra un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1-8. 22. Método de preparación de anticuerpos contra un polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el método comprende administrar el polipéptido a un animal adecuado. 23. Método para la preparación de una vacuna para combatir infecciones por Eimeria, caracterizado porque el método comprende mezclar un polipéptido acuerdo con las reivindicaciones 1-8, un fragmento de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 9-12, un fragmento de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 13, un vehículo recombinante vivo de acuerdo con la reivindicación 14 o una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 15 y un vehículo farmacéuticamente aceptable 24. Método para la preparación de una vacuna para combatir infecciones por Eimeria, caracterizado porque el método comprende mezclar anticuerpos de acuerdo con la reivindicación 21, con un vehículo farmacéuticamente aceptable. 25. Método para la detección de parásitos de Eimeria en aves, caracterizado porque el método comprende incubar una preparación de ADN aislado de aves con un fragmento de ADN de acuerdo con las reivindicaciones 9-12. 26. Método para la detección de anticuerpos contra parásitos de Eimeria en suero de aves, caracterizado porque el método comprende incubar el suero con un polipéptido hidrofílíco de acuerdo con las reivindicaciones 1-8.
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