EA036764B1 - Ослабленный штамм streptococcus suis, индуцирующий иммунный ответ у свиней, и его применение - Google Patents

Abstract

В соответствии с данным изобретением предлагаются ослабленные штаммы Streptococcus suis, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие мутантные белки rpsL-S12, ABC-ATPBMP и marR, которые вызывают у свиней иммунный ответ, направленный против S. suis, применение указанных штаммов для индукции у свиней иммунного ответа, направленного против S. suis, и для лечения заболеваний, вызываемых S. suis, а также композиции, содержащие указанные штаммы.

Description

Отсылки к родственным заявкам

Данная заявка испрашивает приоритет по предварительной заявке на патент США серийный номер

61/664935, поданной 27 июня 2012 г., содержание которой целиком включается в настоящий документ путем отсылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Данное изобретение относится в широком смысле к вакцинам на основе ослабленных бактерий, в частности к тем, которые обеспечивают безопасную и эффективную полиспецифичную защиту свиней от инфекций/заболеваний, вызываемых Streptococcus suis. Данное изобретение также относится к способам получения ослабленных бактерий и идентификации вариантов нуклеотидных последовательностей, связанных с пониженной вирулентностью ослабленных бактерий.

В соответствии с этим данное изобретение относится также к иммуногенным или вакцинным композициям, содержащим бактерии по данному изобретению, например живые ослабленные бактерии. В этих композициях бактерии также могут быть инактивированными, но предпочтительны живые ослабленные бактерии S. suis. Данное изобретение также относится к способам получения и/или составления таких композиций; например к способам культивирования, или выращивания, или размножения бактерий на или в подходящей среде, сбора бактерий, при необходимости инактивирования бактерий, при необходимости смешивания бактерий с подходящими фармацевтически или ветеринарно приемлемыми носителями, разбавителями, средствами доставки и/или иными эксципиентами и/или адъювантами и/или стабилизирующими агентами. Таким образом, данное изобретение относится также к применению указанных бактерий при составлении таких композиций.

Уровень техники

Streptococcus suis - это грамположительные шаровидные бактерии (кокки), поселяющиеся обычно в организме у свиней. Но если взрослые свиньи являются бессимптомными носителями, то у поросят этот микроорганизм может вызывать менингит со смертельным исходом, септический артрит и бронхопневмонию. У взрослых особей S. suis обычно живут как комменсалы на криптах небных миндалин и в верхних отделах дыхательных путей, хотя этих бактерий выделяли также из желудочно-кишечного тракта и половых путей. Почти все взрослые свиньи служат резервуаром S. suis, и этот патогенный агент приносит ущерб свиноводству во всем мире.

Не только свиньи могут быть заражены S. suis: эти бактерии обитают также у многих видов млекопитающих и птиц [Gottschalk et al., 2007]. Также S. suis является важным возбудителем зоонозов [Perch et al., 1968], но у людей в Северной Америке и в Европе инфекция S. suis встречается редко. Большинство случаев заражения человека S. suis связаны с профессиональной деятельностью, предполагающей контакт со свиньями, свининой и продуктами из нее. Однако в Юго-Восточной Азии и в Китае инфекция S. suis у людей распространена гораздо больше. Наиболее частым проявлением этой инфекции у человека является менингит, а также иногда бывают септицемия и эндокардит.

Из 33 известных на сегодняшний день серотипов S. suis с двумя чаще всего ассоциированы менингит и артрит у свиней североамериканского и европейского происхождения [Fittipaldi et al., 2009; Higgins and Gottschalk, 2006]. Вирулентность S. suis определяется различными факторами, в том числе: капсулой; белками, связывающими фибронектин/фибриноген; фактором, подобным ОРА-протеину (белку мутности сыворотки); модификациями липотейхоевых кислот и пептидогликана клеточной стенки [Baums et al., 2006; Chabot-Roy et al., 2006; de Greeff et al., 2002; Fittipaldi et al., 2008a, b; Smith et al., 1999]. Кроме того, общие для различных штаммов одного и того же серотипа факторы вирулентности значительно варьируют [Berthelot-Herault et al., 2005; Quessy et al., 1995; Vecht et al., 1992]. Фенотипические маркеры вирулентности S. suis включают фактор гемолиза, суилизин (кодируемый геном sly), высвобождающий мурамидазу белок, содержащий мотив LPXTG (MRP, 136 кДа, кодируется геном mrp), и секретируемый белковый внеклеточный фактор (EF, 110 кДа, кодируется геном epf). Среди евразийских штаммов S. suis имеется значительная положительная корреляция между присутствием этих белковых факторов вирулентности и фенотипами вирулентности [Gottschalk et al., 2007; Vecht et al., 1991]. В Европе и Азии штаммы серотипа 2 MRP'EF'SLY' выделяются в основном у больных свиней с выраженными клиническими симптомами, в то время как штаммы MRPEFSLY^- часто выделяют у здоровых особей [Allgaier et al., 2001; Vecht et al., 1992].

На роль компонентов вакцины изучались цельные клетки и многие белки S. suis. Иммунизация бактериями дикого типа полностью защищает от заражения гомологичным серотипом, а мутантные бактерии без капсулы не создают защиты [Wisselink et al., 2002]. В одном из исследований (Li et al.) рекомбинантный белок поверхности S. suis (SAO) в сочетании с адъювантом Quil А (частично очищенным сапонином) защищал свиней от заболевания, вызываемого S. suis серотипа 2. Иммунизация путем внутримышечного введения SAO вызывала значительный гуморальный иммунный ответ, но антитела были представлены преимущественно IgG2. Иммунизация рекомбинантным SAO также вызывала образование антител, опосредующих опсонофагоцитоз [Li et al., 2007]. Иммунизация поросят очищенным суилизином из штамма P1/7 S. suis (серотип 2) вызывала повышение титра нейтрализующих антител, откуда следует, что SLY может функционировать как защитный антиген [Jacobs et al., 1996]. Однако ни в одном из этих исследований для заражения свиней, вакцинированных указанными антигенами, не использовались гете- 1 036764 рологичные серотипы. В исследовании, проведенном Баумсом с коллегами [Baums et al.], бактерии S. suis серотипа 2 вызывали протективный иммунитет против заражения гомологичными микроорганизмами. Напротив, эффективность защиты, создаваемой субъединичной вакциной на основе белков, ассоциированных с муреином (MAP), была низкой, хотя иммунизация MAP приводила к высоким титрам IgG2, направленных против MRP и SAO, в сыворотке. Важно, что иммунизация именно бактериями, а не MAP вызывала возрастание титра опсонизирующих антител против штамма серотипа 2, и по величине титры этих антител коррелировали со степенью защиты. Однако сыворотка, взятая у поросят, иммунизированных бактериями, после истощения изогенными мутантами без капсулы не способствовала фагоцитарной функции нейтрофилов, свидетельствуя о том, что антитела, направленные против капсулы, возможно, не важны для опсонофагоцитоза. [Baums et al., 2009]. Также в группе особей, получавших бактерии, или в группе особей, получавших вакцину на основе MAP, индукция опсонизирующих антител против серотипа 9 не выявлялась и степень защиты от штаммов серотипа 9 была низкой.

Ни в одном из исследований, в которых изучалась вакцинация от заражения S. suis, не была получена вакцина, обеспечивающая полиспецифичную иммунную защиту от этой инфекции. Кроме того, сведения о точном механизме патогенеза при инфекции S. suis на молекулярном уровне отрывочны, отчасти из-за широкого спектра факторов вирулентности у штаммов этих бактерий в пределах серотипа и сложности молекулярных механизмов, участвующих во взаимодействии возбудителя инфекции с организмом-хозяином. Отсутствие эффективной вакцины против инфекции S. suis является существенной проблемой в современном свиноводстве. Таким образом, основная задача настоящего описания - предложить безопасную и эффективную вакцину против S. suis.

Раскрытие изобретения

Цель данного изобретения - предложить аттенуированные вакцины, а также способы лечения и профилактики инфекции S. suis.

Данное изобретение также относится к новым ослабленным штаммам S. suis, которые вызывают безопасную и эффективную полиспецифичную иммунную защиту. По сравнению с исходным штаммом S. suis ослабленные штаммы могут нести один или более полиморфных нуклеотидов, присутствие которых ассоциировано с пониженной вирулентностью.

Данным изобретением предлагаются мутантные бактерии, несущие мутацию (мутации) в одной или более нуклеотидных последовательностях по сравнению с исходными (дикого типа) бактериями, причем с этими мутациями связана ослабленность мутантных бактерий по сравнению с исходными бактериями, которые несут нуклеотидные последовательности, кодирующие белки дикого типа с аминокислотными последовательностями, представленными SEQ ID NO: 2, 6 и 10. В одном из конкретных воплощений данного изобретения мутантные бактерии несут нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO: 3, 7 и 11 и кодирующие пептиды, аминокислотные последовательности которых представлены SEQ ID NO: 4, 8 и 12, причем эти нуклеотидные последовательности обусловливают ослабленность/отсутствие вирулентности у мутантных бактерий по сравнению с вирулентными бактериями дикого типа/исходными. В другом воплощении данного изобретения у мутантных бактерий имеются другие мутации в пептидах, представленных SEQ ID NO: 2, 6 и 10 (т.е. отличные от тех, что имеются в пептидах, представленных SEQ ID NO: 4, 8 и 12), обусловливающие ослабленность мутантных бактерий по сравнению с исходным/дикого типа штаммом.

По одному из конкретных воплощений данного изобретения у предлагаемых штаммов могут быть альтернативные формы генов; в настоящем документе термин альтернативные формы определяется как аллели в сравнении с исходным штаммом S. suis. В одном из воплощений данного изобретения эти альтернативные аллели обусловливают пониженную вирулентность или ослабленность бактерий. В настоящем документе термин ген употребляется в широком смысле и охватывает как кодирующие, так и не кодирующие нуклеотидные последовательности, т.е. регуляторные последовательности, расположенные в сторону 3'- и 5'-концов от кодирующей последовательности, промоторы, 3'- и 5'-концевые нетранслируемые области (UTR), интроны и экзоны. В настоящем описании там, где имеется в виду только кодирующая последовательность гена, употребляется термин кодирующая нуклеотидная последовательность гена или как синоним кодирующая последовательность ДНК (сокращенно CDS).

В одном из конкретных воплощений данного изобретения у ослабленных штаммов имеются один или более полиморфизмов в rpsL-S12 (белок субъединицы 30S рибосомы), в АТФ-связывающем мембранном белке, ABC-транспортере (сокращенно АВС-АТРВМР) и в регуляторе транскрипции семейства marR - во всех трех этих белках или в каких-то из их комбинаций. В одном из воплощений данного изобретения между исходным и ослабленным штаммами имеются по меньшей мере 4 нуклеотидных различия: два однонуклеотидных полиморфизма (SNP) в гене rpsL-S12 и по одному SNP в генах АВСАТРВМР и marR.

В другом своем аспекте данное изобретение относится к генетически модифицированным штаммам S. suis, у которых экспрессия rpsL-S12, ABC-ATPBMP и marR или всех трех этих белков изменена по сравнению с исходным штаммом S. suis, в результате чего генетически модифицированные штаммы отличаются пониженной вирулентностью.

Штаммы по изобретению могут быть получены способом, включающим следующие этапы:

- 2 036764 (a) выращивание исходного штамма S. suis в присутствии мутагенного агента;

(b) посев жизнеспособных клеток на подходящую среду;

(c) определение вирулентности бактерий каждой колонии путем введения свиньям;

(d) классификация штамма как ослабленного, если у свиней не наблюдается клинических признаков, ассоциированных с инфекцией исходным штаммом.

В одном из воплощений данного изобретения аттенуированные вакцины содержат также адъювант. Адъювантом может быть любое вещество, усиливающее и/или продлевающее вызываемый вакциной иммунный ответ по сравнению с вакциной без адъюванта. Применительно к описанным в настоящем документе аттенуированным вакцинам, применяемым перорально, особенно подходят адъюванты для мукозальных вакцин, включая хитозаны и их производные.

Штаммы по изобретению могут быть использованы для индуцирования иммунологической (или иммуногенной) реакции или защитного иммунного ответа против S. suis, а также для профилактики или лечения инфекции S. suis, или патологического состояния (состояний), вызываемых S. suis, причем соответствующие способы включают введение ослабленных бактерий или композиций, содержащих ослабленные бактерии, нуждающимся в том животным.

Каждый штамм по изобретению может быть представлен в виде набора, включающего, по меньшей мере, ослабленный штамм S. suis и инструкции по его применению.

Упомянутые выше и другие воплощения данного изобретения описываются в приведенном ниже разделе Осуществление изобретения, или явствуют из него, или охватываются им.

Осуществление изобретения

Данным изобретением предлагаются нуклеотидные последовательности и гены, имеющие отношение к аттенуированию микроорганизмов, например бактерий, например грамположительных бактерий, например Streptococcus suis (S. suis); продукты (например, белки, антигены, иммуногены, эпитопы), кодируемые этими нуклеотидными последовательностями; способы получения таких нуклеотидных последовательностей, продуктов и микроорганизмов и их применения, например, для получения вакцин или иммуногенных композиций, или для возбуждения иммунологической реакции или иммунного ответа, или в качестве векторов, например экспрессивных векторов для использования in vitro или in vivo.

В результате вызванных мутаций в нуклеотидных последовательностях и генах микроорганизмов получаются новые неожиданные аттенуированные мутанты. Эти мутантные варианты можно использовать для создания высокоиммуногенных композиций или вакцин на основе живых ослабленных бактерий.

Мутантные бактерии можно также использовать в качестве векторов для экспрессии нужных продуктов in vitro, а также для воспроизведения или размножения нуклеотидных последовательностей (например, для репликации ДНК) и для экспрессии нужных продуктов in vivo.

Идентификация таких мутаций дает возможность установить новые неожиданные нуклеотидные последовательности и гены, а также новые неожиданные генные продукты, кодируемые этими нуклеотидными последовательностями и генами.

Такие генные продукты позволяют получить антигены, иммуногены и эпитопы; можно использовать также изолированные генные продукты.

Изолированные генные продукты, а также их эпитопы можно использовать для получения антител с целью их диагностического применения.

Генные продукты, которые позволяют получить или создать эпитопы, антигены или иммуногены, можно использовать в иммуногенных или иммунологических композициях, а также в вакцинах.

В одном из аспектов данного изобретения предлагаются бактерии, несущие аттенуирующие мутации в нуклеотидных последовательностях или генах, изменяющие, ослабляющие или прекращающие экспрессию и/или биологическую активность полипептидов или белков, кодируемых этими генами, в результате чего снижается вирулентность бактерий.

Для того чтобы мутация повлияла на функцию гена аттенуирующим образом, она не обязательно должна затрагивать его кодирующую последовательность. Такая мутация может быть в нуклеотидных последовательностях, участвующих в регуляции экспрессии данного гена, например в областях, регулирующих инициацию и терминацию транскрипции и трансляции. В их числе промоторы и участки связывания с рибосомой (как правило, эти регуляторные элементы располагаются на расстоянии 60-250 нуклеотидов в сторону 5'-конца от стартового кодона кодирующей последовательности гена; Doree S.M. et al., J. Bacteriol. 2001, 183(6): 1983-9; Pandher K. et al., Infect. Imm. 1998, 66(12): 5613-9; Chung J.Y. et al., FEMS Microbiol letters 1998, 166: 289-296), терминаторы транскрипции (как правило, терминатор располагается на расстоянии до приблизительно 50 нуклеотидов в сторону 3'-конца от стоп-кодона кодирующей последовательности гена; Ward С К et al., Infect. Imm. 1998, 66(7): 3326-36). В случае оперона такие регуляторные участки могут располагаться на большем расстоянии в сторону 5'-конца от гена или кодирующей последовательности. К аттенуированию могут приводить и мутации в областях между генами.

Мутации в таких регуляторных последовательностях, ассоциированных с кодирующей последовательностью или геном таким образом, что из-за мутаций в этой нуклеотидной последовательности изменяется, подавляется или прекращается экспрессия и/или биологическая активность полипептида или бел- 3 036764 ка, кодируемого данным геном и это приводит к снижению вирулентности бактерий, эквивалентных мутациям в самом гене или в кодирующей последовательности, идентифицированным в настоящей работе.

Аттенуирование состоит в снижении или исчезновении патогенности бактерий и в уменьшении степени тяжести обусловленных этими бактериями клинических проявлений или повреждений, а также уменьшается интенсивность клеточного роста бактерий; в итоге ниже вероятность гибели животного (свиньи) из-за бактериальной инфекции.

В частности, данное изобретение включает ослабленные штаммы S. suis и содержащие их вакцины, вызывающие у животного иммуногенную реакцию; в частности ослабленные штаммы S. suis, вызывающие, индуцирующие или стимулирующие ответную реакцию у свиней.

У ослабленных штаммов S. suis, представляющих интерес в контексте данного изобретения, имеются мутации в генах, которые у исходного вирулентного штамма дикого типа имеют отношение к его вирулентности. При практическом осуществлении данного изобретения можно использовать не только штаммы с описанными в настоящем документе мутациями, но и ослабленные штаммы с любым числом мутаций в описанных в настоящем документе генах, имеющих отношение к вирулентности.

В одном из воплощений данного изобретения ослабленные штаммы содержат нуклеотидные последовательности, включающие нуклеотиды, представленные SEQ ID NO: 3, 7 и 11 или их комбинациями. На момент написания настоящего документа не было известно о существовании этих последовательностей в геномах, встречающихся в природе S. suis - эти последовательности получали только в результате мутагенеза способами, применявшимися авторами данного изобретения, из исходного вирулентного штамма, у которого гены дикого типа содержали нуклеотиды, представленные SEQ ID NO: 1, 5 и 9.

В другом воплощении данного изобретения ослабленные штаммы S. suis несут нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды, аминокислотные последовательности которых представлены SEQ ID NO: 4, 8 и 12 или их комбинациями. В еще одном воплощении данного изобретения штаммы S. suis содержат нуклеиновые кислоты, кодирующие пептиды, в аминокислотных последовательностях которых имеется по меньшей мере одна замена по сравнению с последовательностями, представленными SEQ ID NO: 2, 6, 10 или их комбинациями. В одном из воплощений данного изобретения используются аминокислотные замены, представленные в табл. 1 (для вакцинного штамма).

В еще одном воплощении данного изобретения штаммы S. suis несут мутации в тех генах, которые имеют отношение к вирулентности исходного штамма (этот штамм депонирован в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером (Patent Deposit Designation) РТА-13269. В результате этих мутаций получен ослабленный штамм с пониженной (по сравнению с исходным вирулентным штаммом) вирулентностью.

В одном из конкретных воплощений данного изобретения ослабленный штамм S. suis является штаммом, депонированным в Американской коллекции типовых культур (АТСС) под номером (Patent Deposit Designation) РТА-13269.

В другом аспекте данного изобретения новые ослабленные штаммы S. suis входят в состав безопасных эффективных вакцин, защищающих от S. suis и инфекций/заболеваний, вызываемых S. suis.

В одном из воплощений данного изобретения вакцины, защищающие от S. suis, содержат также адъювант. В одном из конкретных воплощений данного изобретения адъювант является мукозальным, например, это хитозан, метилированный хитозан, триметилхитозан или их производные или их комбинации.

В одном из воплощений данного изобретения адъювант содержит цельные бактериальные клетки и/или вирусные частицы, включая Н. parasuis, клостридий, вирус гриппа свиней (SIV), цирковирус свиней (PCV), вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), Mannheimia, Pasteurella, Histophilus, Salmonella, Escherichia coli или их сочетания и/или варианты. В нескольких воплощениях данного изобретения адъювант усиливает образование IgM, IgG, IgA и/или их сочетаний у животного.

Термины антиген или иммуноген в настоящем документе означают вещество, вызывающее у животного-хозяина специфичный иммунный ответ. Антиген может представлять собой целый организм живой, убитый или ослабленный; составную часть или фрагмент организма; рекомбинантный вектор, содержащий участок, обусловливающий иммуногенные свойства; участок или фрагмент ДНК, способный вызвать иммунный ответ у животного-хозяина; полипептид, эпитоп, гаптен или любое их сочетание. Или же иммуноген или антиген могут представлять собой токсин или антитоксин.

Термины белок, пептид, полипептид и фрагмент полипептида в настоящем документе употребляются как синонимы и относятся к полимерам любой длины, состоящим из остатков аминокислот. Этот полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты или аналоги аминокислот, цепочка которых может прерываться другими мономерами, химически отличными от аминокислот. Указанные термины охватывают также полимеры из аминокислот, модифицированные естественным или искусственным образом, например путем образования дисульфидных связей, гликозилирования, липидирования, ацетилирования, фосфорилирования или каким-либо иным образом или воздействием, например путем конъюгирования с меткой или биологически активным компонентом.

Термин иммуногенный или антигенный полипептид в настоящем документе включает полипеп- 4 036764 тиды, являющиеся иммунологически активными в том смысле, что, будучи введены в организм-хозяин, они способны вызывать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ, направленный против данного белка. Предпочтительно фрагмент белка берется такой, который обладает, по существу, той же иммунологической активностью, что и цельный белок. Таким образом, фрагмент белка по данному изобретению содержит по меньшей мере один эпитоп или одну антигенную детерминанту или состоит (или в основном состоит) по меньшей мере из одного эпитопа или антигенной детерминанты. Термин иммуногенный применительно к белку или полипептиду в настоящем документе включает полную аминокислотную последовательность белка, ее аналоги или иммуногенные фрагменты. Под иммуногенным фрагментом подразумевается фрагмент белка, включающий один или более эпитопов и вызывающий иммунологическую реакцию, описанную выше. Такие фрагменты можно идентифицировать, используя любые методы картирования эпитопов, хорошо известные в данной области техники [см., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996)]. Например, линейные эпитопы можно определить, синтезировав на твердой подложке параллельно большое число пептидов, соответствующих различным участкам белковой молекулы и воздействуя на эти эпитопы (на подложке) антителами. Такие методы известны в данной области техники и описаны, например, в патенте США № 4708871, а также в работах Geysen et al., 1984 и Geysen et al., 1986. Конформационные эпитопы нетрудно идентифицировать, определяя пространственную конформацию аминокислот путем, например, рентгеновской кристаллографии и двумерной спектроскопии ядерного магнитного резонанса (см., например, упомянутую выше работу Epitope Mapping Protocols). Методы, применимые к белкам Т. parva, описаны в заявке PCT/US 2004/02260, которая полностью включается в настоящий документ путем отсылки.

Как говорилось выше, данное изобретение охватывает активные фрагменты и варианты антигенных полипептидов. Таким образом, термин иммуногенный полипептид или антигенный полипептид также включает делеции, вставки и замены в аминокислотной последовательности, если при них полипептид сохраняет способность вызывать иммунологическую реакцию согласно приведенному в настоящем документе определению. Термин консервативная замена в настоящем документе означает, что аминокислотный остаток заменен другим, но биологически близким аминокислотным остатком или что замена нуклеотида в нуклеиновой кислоте такова, что в кодируемой ею аминокислотной последовательности соответствующий аминокислотный остаток не изменяется или заменяется на биологически близкий. В этой связи особенно предпочтительные замены являются в основном консервативными, т.е. аминокислотные замены не выходят за пределы данной группы аминокислот. Обычно аминокислоты подразделяют на четыре группы: (1) кислые (аспарагиновая кислота/аспартат и глутаминовая кислота/глутамат); (2) основные (лизин, аргинин, гистидин); (3) неполярные (аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, трипотофан) и (4) полярные не заряженные (глицин, аспарагин, глутамин, цистин, серии, треонин, тирозин). Фенилаланин, триптофан и тирозин иногда выделяют как ароматические аминокислоты. Примеры консервативных замен включают замены одного гидрофобного аминокислотного остатка, например изолейцина, валина, лейцина или метионина, на другой гидрофобный остаток, или замену одного полярного аминокислотного остатка на другой полярный, например замену аргинина на лизин, глутаминовой кислоты на аспарагиновую или глутамина на аспарагин и т.п.; или замены аминокислот на структурно родственные аминокислоты, что не влияет существенно на биологическую активность. Таким образом, в определение исходного (референсного) полипептида входят белки, по существу, с такой же аминокислотной последовательностью, как у исходной (референсной) белковой молекулы, но несущие незначительные замены аминокислот, практически не влияющие на иммуногенность данного белка. В настоящий документ включаются все полипептиды, получаемые в результате таких модификаций. Термин консервативная замена также включает использование замещенных аминокислот вместо не замещенных исходных при условии, что антитела, образовавшиеся против полипептида с заменами, иммунологически взаимодействуют также с полипептидом без замен.

Термин эпитоп в настоящем документе относится к участку антигена или гаптена, на который реагируют специфичные В- и/или Т-клетки. Этот термин употребляется синонимично термину антигенная детерминанта или сайт антигенной детерминанты. Антитела, узнающие один и тот же эпитоп, можно идентифицировать путем несложного иммунологического анализа, демонстрирующего способность антител блокировать связывание другого антитела с антигеном-мишенью.

Под иммунологической реакцией на композицию или вакцину понимается развитие клеточного и/или опосредованного антителами иммунного ответа на данную композицию или вакцину. Обычно иммунологическая реакция включает (но не ограничивается перечисленным здесь) один или более из следующих эффектов: образование антител, В-клеток, хелперных Т-клеток и/или цитотоксических Т-клеток, специфично направленных против антигена/антигенов, входящих в состав данной композиции или вакцины. Предпочтительно в организме-хозяине возникает лечебная или защитная иммунологическая реакция, например возрастает устойчивость к новому заражению и/или снижается тяжесть клинических проявлений заболевания. Такая защита демонстрируется ослаблением или отсутствием обычно развивающихся в зараженном организме симптомов и/или клинических признаков заболевания, более быстрым выздоровлением и/или снижением титра вируса.

- 5 036764

Термин животное подразумевает млекопитающих, птиц и проч.; в настоящем документе под животным или хозяином понимается млекопитающее или человек. Животное выбирается из группы, состоящей из представителей семейств лошадиных (например, лошади), собачьих (например, волка, лисицы, койота, шакала), кошачьих (например, льва, тигра и др. больших кошек, домашней кошки, диких кошек и др., в том числе гепарда и рыси), полорогих (например, овцы и коровы), нежвачных парнокопытных (например, свиньи), а также класса птиц (например, курицы, утки, гуся, индейки, перепела, фазана, попугаев, представителей семейств воробьиных и соколообразных, вороны, страусов, в том числе эму и казуара), отряда приматов (например, полуобезьян, обезьян Старого и Нового света, долгопятовых, гиббонов, человекообразных обезьян), хорьков, тюленей и рыб. Термин животное включает индивида на всех стадиях развития, в том числе новорожденного, эмбриона и плода.

В настоящем документе все технические и научные термины, если не дается иного объяснения, употребляются в том значении, которое общепринято и известно рядовым специалистам в данной области техники. Слова, используемые в единственном числе, также включают и множественное число, если только из контекста не явствует иное. Союз или подразумевает также значение и, если только из контекста не явствует иное.

Отметим, что в настоящем описании и, в частности, в формуле изобретения и/или в основном тексте глагол содержать и его производные (содержащий и проч.) имеет значение, соответствующее патентному законодательству США; например, он может означать включать. Выражение состоять в основном из и его производные (состоящий в основном из и проч.) имеет значение, соответствующее патентному законодательству США; например, оно может подразумевать содержание элементов, не названных буквально и явно, но исключать элементы, уже известные в данной области техники или влияющие на принципиальные или новые признаки данного изобретения.

Композиции.

Данное изобретение относится к вакцинам или композициям для защиты от S. suis, которые могут содержать ослабленный штамм S. suis и фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, средство доставки или иной эксципиент и которые вызывают, индуцируют или стимулируют ответную реакцию у животного.

Термины нуклеиновая кислота и полинуклеотид в настоящем документе относятся к молекулам рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) - не разветвленным или разветвленным, одноцепочечным или двухцепочечным или их гибридам. Этот термин также охватывает гибриды РНК/ДНК. Приведем примеры полинуклеотидов, не имеющих ограничительного характера: гены или фрагменты генов, экзоны, интроны, матричные РНК (мРНК), транспортные РНК (тРНК), рибосомные РНК (рРНК), рибозимы, комплементарные ДНК (кДНК), рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, изолированные ДНК с любой нуклеотидной последовательностью, изолированные РНК с любой нуклеотидной последовательностью, ДНК- или РНК-зонды и праймеры. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, например метилированные нуклеотиды, и аналоги нуклеотидов, урацил, другие сахара (не рибозу и не дезоксирибозу) и связующие группы, например фторрибозу и тиолаты, разветвления нуклеотидной цепи.

Последовательность нуклеотидов также может быть модифицирована после полимеризации, например, путем конъюгации с компонентом-меткой. Это определение включает и другие модификации: кэпирование, замену одного или более встречающихся в природе нуклеотидов на аналоги, введение в нуклеотидную цепь средств для присоединения полинуклеотида к белкам, ионам металлов, компонентам-меткам, другим полинуклеотидам или твердой подложке. Полинуклеотиды могут быть получены из микроорганизмов или путем химического синтеза.

Термин ген в настоящем документе употребляется в широком смысле применительно к любому отрезку полинуклеотида, ассоциированому с какой-либо биологической функцией. Таким образом, термин ген включает интроны и экзоны (как в случае геномной нуклеотидной последовательности) или только кодирующие последовательности (как в случае кДНК) и/или регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии. Например, термин ген относится также к фрагментам нуклеиновых кислот, по которым образуется мРНК или функциональная РНК или которые кодируют определенный белок и включают регуляторные последовательности.

Определение изолированный применительно к биологическому компоненту (например, к нуклеиновой кислоте, или к белку, или к органелле) означает, что данный компонент в основном отделен или очищен от других биологических компонентов клеток организма, у которого данный компонент имеется в природе, например от остальной хромосомной ДНК и внехромосомных ДНК и РНК, белков и органелл. Изолированные нуклеиновые кислоты и белки включают нуклеиновые кислоты и белки, очищенные путем стандартных методов очистки. Изолированными считаются также нуклеиновые кислоты и белки, полученные рекомбинантным путем или путем химического синтеза.

Термин консервативная замена в настоящем документе означает, что аминокислотный остаток заменен другим, но биологически близким аминокислотным остатком или что замена нуклеотида в нуклеиновой кислоте такова, что в кодируемой ею аминокислотной последовательности соответствующий аминокислотный остаток не изменяется или заменяется на биологически близкий. В этой связи особенно

- 6 036764 предпочтительные замены являются в основном консервативными, как говорилось выше.

Термин рекомбинантный применительно к полинуклеотиду означает, что он имеет полусинтетическое или синтетическое происхождение и не встречается в природе как таковой либо связан с другим полинуклеотидом в структуру, не встречающуюся в природе.

Термин гетерологичный означает, что данный объект происходит из структуры более высокого уровня (например, организма), генетически отличной от той, с которой проводится сравнение. Например, методами генетической инженерии полинуклеотид можно встроить в плазимиду или вектор, происходящий из иного источника - тогда этот полинуклеотид является гетерологичным. Или, скажем, промотор, взятый отдельно от той кодирующей последовательности, которую он регулирует в природе, и функционально связанный с другой, не естественной для него кодирующей последовательностью, является гетерологичным.

Полинуклеотиды по данному изобретению могут содержать дополнительные нуклеотидные последовательности, например дополнительные кодирующие последовательности, в пределах одной и той же транскрипционной единицы; регуляторные элементы, например промоторы, сайты связывания с рибосомой, 5'- и 3'-нетранслируемые области; терминаторы транскрипции; сайты полиаденилирования; дополнительные транскрипционные единицы, управляемые тем же или другим промотором; последовательности, обеспечивающие клонирование, экспрессию, гомологичную рекомбинацию и трансформацию клетки-хозяина; и любые конструкции, нужные для воплощений данного изобретения.

Способы применения и изделие.

Штаммы по изобретению применяют путем вакцинации животного (свиньи) путем введения композиции, в состав которой входит ослабленный штамм S. suis и фармацевтически или ветеринарно приемлемые носитель, средство доставки или иной эксципиент.

В одном из воплощений данного изобретения может применяться режим вакцинации прайм-буст; при этом делают по меньшей мере одно первичное введение (прайм) и по меньшей мере одну повторную иммунизацию (буст) с использованием по меньшей мере одного общего полипептида, антигена, эпитопа или иммуногенного агента. Обычно иммунологическая композиция или вакцина, используемая для первичного введения, отличается от тех, что используются для повторной иммунизации. Однако следует отметить, что и для первичного введения, и для повторной иммунизации можно использовать одну и ту же композицию. Такой режим введения вакцины называется прайм-буст.

Режим прайм-буст включает по меньшей мере одно первичное введение и по меньшей мере одну повторную иммунизацию с использованием по меньшей мере одного общего полипептида и/или его фрагментов или вариантов. Вакцина, используемая для первичного введения, может отличаться от тех, что используются позже для повторной иммунизации. Первичное введение может осуществляться однократно или в несколько приемов. Также и повторная иммунизация может осуществляться однократно или в несколько приемов.

Объем дозы композиций на основе бактериальных антигенов для млекопитающих, например в случае свиней (молодых или взрослых особей), обычно составляет от около 0,1 до около 2,0 мл, от около 0,1 до около 1,0 мл или от около 0,5 до около 1,0 мл.

Эффективность вакцин проверяют через около 2-4 недель после последней иммунизации, заражая животных (например, свиней) вирулентным штаммом S. suis. Для заражения с целью проверки эффективности вакцины используют как гомологичные, так и гетерологичные штаммы S. suis. Заражение животного осуществляется путем внутримышечной или подкожной инъекции, с помощью спрея, интраназально, внутрь глаза, интратрахеально и/или перорально. До и после заражения у животного берут образцы ткани из суставов, легких, головного мозга и/или полости рта; в этих образцах определяют присутствие антител, специфичных в отношении S. suis.

Композиции, содержащие ослабленные штаммы бактерий по данному изобретению и используемые для вакцинации в режиме прайм-буст, содержатся в фармацевтически или ветеринарно приемлемом средстве доставки, разбавителе или ином эксципиенте. Вакцинация в соответствии с протоколами по данному изобретению защищает животных от S. suis и/или предотвращает развитие заболевания у зараженных особей.

Процедуры иммунизации совершаются предпочтительно с интервалом от 1 до 6 недель. Предпочтительная продолжительность промежутка времени между двумя иммунизациями 3-5 недель, оптимальная по одному из воплощений данного изобретения - 4 недели; возможна также ежегодная иммунизация. На момент первой процедуры возраст иммунизируемого животного, например свиньи, может быть по меньшей мере 3-4 недели.

Специалистам в данной области техники должно быть ясно, что настоящее описание предлагается в качестве примера и данное изобретение им не ограничивается. Основываясь на представленных в настоящем документе и известных в данной области техники сведениях опытный специалист может для каждого протокола определить нужные число процедур иммунизации, путь введения иммунизирующего препарата и дозировку без излишнего экспериментирования.

Штаммы по изобретению могут быть использованы в виде набора для вызова или индукции у животного (свиньи) иммунологической или защитной реакции, направленной против S. suis, который вклю- 7 036764 чает иммунологическую композицию или вакцину на основе ослабленных S. suis и инструкции для осуществления способа доставки ее эффективного количества для возбуждения иммунного ответа у животного.

В другом воплощении данного изобретения набор для индуции у животного (свиньи) иммунологической или защитной реакции, направленной против S. suis, включает иммунологическую композицию или вакцину, содержащую ослабленный штамм S. suis по данному изобретению, и инструкции для осуществления способа доставки ее эффективного количества для возбуждения иммунного ответа у животного.

В еще одном своем аспекте набор предназначен для вакцинации в режиме прайм-буст по данному изобретению, как описано выше. Этот набор может содержать по меньшей мере две емкости: первая содержит вакцину или композицию для первичной иммунизации по данному изобретению, а вторая - вакцину или композицию для повторной иммунизации по данному изобретению. Этот набор предпочтительно содержит дополнительные емкости (как первая или как вторая) для дополнительной первичной иммунизации или для дополнительной повторной иммунизации.

Фармацевтически или ветеринарно приемлемые носители или средства доставки или иные эксципиенты хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель или средство доставки или иной эксципиент может представлять собой 0,9%-ный раствор NaCl (например, физиологический раствор) или фосфатный буферный раствор. Другие фармацевтически или ветеринарно приемлемые носители или средства доставки или иные эксципиенты, которые можно использовать в способах по данному изобретению, включают (но не ограничиваются перечисленным здесь) поли-(L-глутамат) или поливинилпирролидон. Фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель или средство доставки или иной эксципиент может представлять собой любое вещество или комбинацию веществ, способствующие введению вектора (или белка, экспрессию которого обеспечивает вектор по данному изобретению in vitro), предпочтительно, чтобы носитель, средство доставки или иной эксципиент способствовал трансфекции и/или улучшал сохранность вектора (или соответствующего белка). Дозы и объемы, в которых они вводятся, в настоящем документе обсуждаются в общем описании, а также специалист в данной области техники может их определить на основании этого описания в совокупности с известными сведениями без излишнего экспериментирования.

Иммунологические композиции и вакцины по данному изобретению могут содержать один или более адъювантов или состоять в основном из одного или более адъювантов. Для практического использования по данному изобретению подходят следующие адъюванты: (1) полимеры акриловой или метакриловой кислоты, малеинового ангидрида и алкенильных производных, (2) иммуностимулирующие последовательности (ISS), например олигодезоксирибонуклеотидные последовательности, в которых имеются один или более не метилированных элементов CpG (Klinman et al., 1996; WO 98/16247), (3) эмульсии типа масло в воде, например эмульсия SPT, описанная на стр. 147 работы Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, опубликованной М. Powell, M. Newman (Plenum Press 1995), и эмульсия MF59, описанная в той же работе на стр.183, (4) катионные липиды, содержащие соли четвертичного аммония, например диметилдиоктадециламмоний (DDA), (5) цитокины, (6) гидроксид алюминия или фосфат алюминия, (7) сапонин или (8) другие адъюванты, обсуждаемые в документах, цитируемых в настоящей заявке и включенных в нее путем отсылки, или (9) любые комбинации или смеси перечисленных веществ.

В одном из воплощений данного изобретения в число адъювантов входят такие, которые способствуют улучшению абсорбции в слизистые оболочки. Примеры этих адъювантов включают монофосфориллипид A (MPL), термолабильный токсин Escherichia coli LTK63, токсины, микрочастицы полилактидгликолида (PLG) и ряд других (Vajdy, M. Immunology and Cell Biology (2004) 82, 617-627). В одном из воплощений данного изобретения адъювантом может быть хитозан (Van der Lubben et al. 2001; Patel et al., 2005; Majithiya et al., 2008; US Patent Serial No. 5,980.912).

В одном из воплощений данного изобретения адъювантом могут быть инактивированные бактерии, инактивированные вирусы, фракции инактивированных бактерий, бактериальные липополисахариды, бактериальные токсины или их производные или их комбинации.

В одном из воплощений данного изобретения адъювант содержит целые бактерии и/или вирусы, включая Н. parasuis, клостридий, вирус иммунодефицита свиней (SIV), цирковирус свиней (PCV), вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), Mannheimia, Pasteurella, Histophilus, Salmonella, Escherichia coli или их комбинации и/или варианты. В некоторых воплощениях данного изобретения адъювант повышает уровень образования IgM, IgG, IgA и/или их комбинаций.

Литература

1. Allgaier, A., et al. 2001. Relatedness of Streptococcus suis isolates of various serotypes and clinical backgrounds as evaluated by macrorestriction analysis and expression of potential virulence traits. J. Clin. Microbiol. 39, 445-453.

- 8 036764

2. Baums, C. G. , et al., 2006. Identification of a novel virulence determinant with serum opacification activity in Streptococcus suis. Infect. Immun. 74, 6154-6162.

3. Baums, C.G., et al., 2009. Streptococcus suis bacterin and subunit vaccine immunogenicities and protective efficacies against serotypes 2 and 9.Clin Vaccine Immunol. 2, 200-208.

4. Berthelot-Herault, F., et al., 2005. Dilemma of virulence of Streptococcus suis: Canadian isolate 89- 1591 characterized as a virulent strain using a standardized experimental model in pigs. Can. J. Vet. Res. 69, 236-240.

5. Chabot-Roy, G. et al., 2006. Phagocytosis and killing of Streptococcus suis by porcine neutrophils. Microb. Pathog. 41, 21-32.

6. Davidson A.L., et al., 2008. Structure, function, and evolution of bacterial ATPbinding cassette systems. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 72, 317-364.

7. Davidson A.L., Chen J., 2004. ATP-binding cassette transporters in bacteria. Annu. Rev. Biochem 73, 241-268.

8. de Greeff, A., et al., 2002. Contribution of fibronectin-binding protein to pathogenesis of Streptococcus suis serotype 2. Infect. Immun. 70, 1319-1325.

9. Fittipaldi, N. et al., 2008a. Significant contribution of the pgdA gene to the virulence of Streptococcus suis. Mol. Microbiol. 78, 1120-1135.

10. Fittipaldi, N. et al., 2008b. D-Alanylation of lipoteichoic acid contributes to the virulence οι Streptococcus suis. Infect. Immun. 76, 3587-3594.

11. Fittipaldi, N. et al., 2011. Lineage and virulence of Streptococcus suis serotype 2 isolates from North America. Emerg Infect Dis. 12, 2239-2244.

12. Gottschalk, M. et al., 2007. Streptococcus suis infections in humans: the Chinese experience and the situation in North America. Anim. Health Res. Rev. 8, 29-45.

13. Henderson D.P., Payne, S.M., 1994. Vibrio cholerae iron transport system: roles of heme and siderophore iron transport in virulence and identification of a gene associated with multiple iron transport systems. Infect. Immun 62, 5120-5125.

14. Higgins, R., Gottschalk, M., 2006. Streptococcocal diseases. In: Straw, B.E., D’ Allaire, S., Mengeling, W.L., Taylor, D.J. (Eds.), Diseases of Swine. Blackwell Publishing, pp. 769-783.

15. Jacobs, A., et al., 1996. Protection of experimentally infected pigs by suilysin, the thiol-activated hemolysin of Streptococcus suis. Vet. Rec. 139, 225-228.

16. Li, Y., et al., 2007. Immunization with recombinant Sao protein confers protection against streptococcus suis infection. Clin. Vaccine Immunol. 14, 937-943.

17. McEvoy, G.K., editor. 1989. AHFS Drug information 89. Bethesda, MD: American

- 9 036764

Society of Hospital Pharmacists, 1925-1927.

18. Perch, B., et al., 1968. Group R streptococci pathogenic for man. Two cases of meningitis and one fatal case of sepsis. Acta Pathol Microbiol Scand 74, 69-76.

19. Poole, R.K., et al., 1994. The cydD gene product, component of a heterodimeric ABC transporter, is required for assembly of periplasmic cytochrome-c and of cytochrome-bd in Escherichia coli. FEMS Microbiol. Lett. 117, 217-224.

20. Poolman, B., et al., 2004. Bacterial osmosensing: roles of membrane structure and electrostatics in lipid-protein and protein-protein interactions. Biochim. Biophys. Acta 1666, 88-104.

21. Quessy, S., et al., 1995. Discrimination of virulent and avirulent Streptococcus suis capsular type 2 isolates from different geographical origins. Infect. Immun. 63, 1975-1979.

22. Smith, H.E., et al., 1999. Identification and characterization of the cps locus of Streptococcus suis serotype 2: the capsule protects against phagocytosis and is an important virulence factor. Infect. Immun. 67, 1750-1756.

23. Sinha, R.P.,1977. Acriflavine-Resistant Mutant of Streptococcus cremoris. Antimicro and Chemo 12, 383-389.

24. Vecht, U. et al., 1991. Identification of two proteins associated with virulence of Streptococcus suis type 2. Infect. Immun. 59, 3156-3162.

25. Vecht, U. et al., 1992. Virulence of Streptococcus suis type 2 strains in newborn germfree pigs depends on phenotype. Infect. Immun. 60, 550-556.

26. Wisselink, H. J., et al., 2002. Assessment of protective efficacy of live and killed vaccines based on a non-encapsulated mutant of Streptococcus suis serotype 2. Vet. Microbiol. 84, 155-168.

27. Zhou, Z.M., et al., 1998. Function of Escherichia coli MsbA, an essential ABC family transporter, in lipid A and phospholipid biosynthesis. J. Biol. Chem. 273,12466-12475.

28. George, A. M., and S. B. Levy. 1983. Gene in the major cotransduction gap of the

Escherichia coli K-12 linkage map required for the expression of chromosomal resistance to tetracycline and other antibiotics. J. Bacteriol. 155:541-548.

Далее данное изобретение описывается с помощью примеров, не имеющих ограничительного характера.

Примеры

Пример 1. Получение и анализ генома ослабленных S. suis.

С целью разработки, обеспечивающей полиспецифичную защиту от инфекции S.suis, был выделен полевой штамм (исходный штамм, США, Newport Laboratories № 8-1433-1, SEQ ID NO: 9) из мазка свиной ткани мозга. На основании результатов биохимического анализа и реакции агглютинации этот изолят был идентифицирован как S. suis серотипа 2.

Для аттенуирования этого исходного штамма использовали химический мутаген (акрифлавина гидрохлорид), как описано в работе Sinha et al. Коротко говоря, делали следующее. Клетки исходного штамма S. suis культивировали в течение 18 ч в триптическом соевом бульоне, содержащем 5% овечьей крови и 10 мкМ/мл акрифлавина гидрохлорида. Выжившие клетки отделяли и высевали на агар с овечьей кровью. Были отобраны 20 отдельных колоний и их выращивали по отдельности в той же жидкой среде. Брали одну из этих двадцати культур и вводили свиньям путем инъекции (1,76х10⁹ клеток/мл), чтобы определить вирулентность. Десяти особям ввели бактерии перорально и наблюдали животных в течение 26 суток. За это время не было замечено клинических признаков, соответствующих инфекции S. suis. Помимо того, что мутантный штамм был очень ослабленным, он имел устойчивость к неомицину. Было проведено полное секвенирование всего генома мутантного штамма - кандидата для вакцины (SEQ ID NO: 10) и исходного штамма (SEQ ID NO: 9), также у этих штаммов определили однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), с которыми мог быть связан невирулентный фенотип.

- 10 036764

Определение нуклеотидной последовательности.

Для секвенирования геномов исходного и мутантного штаммов получали клеточный осадок культур S. suis в экспоненциальной фазе роста и проводили очистку ДНК с помощью набора Qiagen DNA mini kit (Qiagen, Валенсия, шт. Калифорния, США). Затем получали библиотеку геномной ДНК с помощью набора Illumina Genomic DNA Prep Kit (Illumina, Сан-Диего, шт. Калифорния, США), и проводили кластерную амплификацию, применяя высокопроизводительное секвенирование в режиме одноконцевых чтений с проточной ячейкой (версия 4) [Single End Flow Cell v4] и платформу Illumina (Cluster Generation Station) с плотностью кластеров ~600,000/мм². Секвенирование осуществляли с помощью геномного анализатора GAII (56 циклов), используя набор реагентов для секвенирования производства Illumina. Полученные последовательности сравнивали с имеющимися в базе данных GenBank последовательностями генома S. suis, P1/7 (http://www.ncbi.nlm.nih.goV/nuccore/AM946016.1) (SEQ ID NO: 11) и определяли степень гомологии с известными генами. Сравнивали последовательности исходного и мутантного штаммов на предмет наличия однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) в кодирующих областях генов (хотя известно и авторы данного изобретения рассчитывали, что не кодирующие области также могут иметь значение для невирулентного/аттенуированного фенотипа). В результате было выявлено несколько SNP, и те из них, которые приводили к заменам аминокислот (не синонимичным), проверяли далее. Однонуклеотидные полиморфизмы, приводившие к аминокислотным заменам, проверяли путем секвенирования методом Сэнгера по стандартным протоколам.

Прочтения фильтровали по качеству, используя пользовательские скрипты на языке Python. При низком качестве нуклеотиды удаляли с концов прочтения, после чего сохранялись такие, где были по меньшей мере 40 пар нуклеотидов с качеством >20 и внутри не было неоднозначно определяемых нуклеотидов. После этапов концевого удаления и фильтрации прочтения картировали на референсный геном, используя алгоритм Барроуза-Уилера (BWA, версия 0.6.1-r104 (http://bio-bwa.sourceforge.net/). Получаемое в результате выравнивание и карта (SAM) далее анализировали с помощью программы SAMtools (http://samtools.sourceforge.net/) для детекции вариантов. Детектированные варианты далее анализировали, используя пользовательские скрипты, написанные на языке R, причем варианты аннотировались на основании их положения в геноме. Варианты фильтровали также на основании глубины охвата, качества по SAMtools и для вариантов, которые разделялись по происхождению образцов - исходный это штамм или мутантный. Программу SAMtools использовали также для составления консенсусных последовательностей на основании результатов картирования. Эту последовательность аннотируют по референсной последовательности и форматируют в виде файла базы данных Genbank для совместимости с программой Artemis, используя пользовательские скрипты и пакет BioPython (http://biopython.org/wiki/Biopython). Сравнение исходного и мутантного (кандидата для вакцины) геномов выявило три однонуклеотидных полиморфизма на протяжении двух генов: 1) два SNP в гене rpsL S12 (кодирующем белок рибосомной субъединицы 30S) и 2) один SNP в гене АТФ-связывающего мембранного белка, ABC-транспортера (сокращенно АВС-АТРВМР). Эти три однонуклеотидных полиморфизма были подтверждены путем стандартного секвенирования методом Сэнгера.

Функциональное значение rpsL-S12 белка рибосомной субъединицы 30S.

Белки малой (30S) и большой (50S) субъединиц рибосомы, обозначаемые буквами S и L соответственно, являются критически важными элементами клеточного аппарата синтеза белков. Эти белки действуют как сайты связывания многих антибиотиков, и мутации в каком-то одном или более из них радикально влияют на устойчивость или чувствительность к антибиотикам. Мутации, возникшие вследствие однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), в белках малой субъединицы придают устойчивость к таким антибиотикам, как тетрациклин, спектиномицин, гигромицин В и стрептомицин, а мутации в белках большой субъединицы придают устойчивость к хлорамфениколу, эритромицину и степграмину В. Вакцинный штамм S. suis устойчив к неомицину (16 мкг/мл) вследствие двух SNP в гене белка S12 малой рибосомной субъединицы, и у этого штамма невирулентный фенотип. У бактерий дикого типа неомицин активно переносится через клеточную мембрану, связывается со специфичным рецепторным белком на 30S-субъединице рибосом и мешает образованию инициаторного комплекса из матричной РНК (мРНК) и рибосомной субъединицы 30S, в результате синтез белков подавляется. ДНК может считываться неправильно, и тогда образуются нефункциональные белки, полирибосомы распадаются и не могут осуществлять синтез белков [McEvoy, 1989].

Функциональное значение АТФ-связывающего кассетного транспортного белка. У бактерий АТФсвязывающий кассетный транспортный мембранный белок, называемый ABC-транспортером (сокращенно АВС-АТРВМР) имеет значение для выживания бактериальных клеток и для транспорта факторов вирулентности или связанных с вирулентностью [Davidson et al., 2008; Henderson et al., 1994]. АВСтранспортеры жизненно необходимы бактериям: они действуют как осмопротекторы (защищают от осмолярного стресса), опосредуя поглощение растворенных веществ и предотвращая опасное для жизни клетки возрастание осмотического давления [Poolman et al., 2004]. Бактериальные ABC-белки также участвуют в регуляции ряда физиологических процессов. Так, АВС-транспортеры функционируют в выделительной системе бактериальной клетки, доставляя к клеточной поверхности некоторые компоненты (например, полисахариды, входящие в состав капсулы, липополисахариды и тейхоевые кислоты), белки,

- 11 036764 участвующие в патогенном действии бактерий (например, в гемолизе, связывании гема, расщеплении белков щелочной протеазой), гем, гидролитические ферменты, белки S-слоя, факторы компетентности, токсины, антибиотики (в том числе пептидные), бактериоцины, лекарственные вещества и сидерофоры [Davidson et al., 2008; Davidson and Chen, 2004]. АВС-транспортеры также играют важную роль в путях биосинтеза, в том числе в биосинтезе внеклеточных полисахаридов и биогенезе цитохромов [Zhou et al., 1998; Poole et al., 1994].

Функциональное значение регулятора транскрипции семейства marR. Анализ по базе данных консервативных доменов Национального центра биотехнологической информации США (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Struccture/cdd/wrpsb.cgi?RID=WWP257HN01N&mode=all) показывает, что ген marR кодирует белок-регулятор транскрипции, содержащий мотив спираль-поворот-спираль, ассоциированный с множественной устойчивостью к антибиотикам (HTHMARR), в составе оперона marRAB. У Escherichia coli, marA кодирует положительный регулятор устойчивости к антибиотикам, a marR кодирует репрессор транскрипции marRAB и определяет образование белка MarA в ответ на сигналы из окружающей среды (George and Levy, 1983). У описанного в настоящем документе вакцинного штамма SNP располагается в пределах домена HTHMARR (аминокислотные остатки с 30-го по 125-й). Домен спираль-поворот-спираль связывается с ДНК и является отличительным признаком белков, регулирующих транскрипцию. Белок MarR дикого типа представляет собой димер, каждая субъединица которого содержит ДНК-связывающий мотив типа крылатая спираль, участвующий в регуляции транскрипции.

Вместе взятые, мутации в этих трех генах (SNP, представленные в табл. 1) делают вакцинный штамм NPL S. suis невирулентным и устойчивым к неомицину, а возможно, и к другим антибиотикам.

Таблица 1

Расположение SNP и идентификация мутантных генов у ослабленного штамма S. suis

Ген	SNP #	Положение нуклеотида	Исходный штамм	Вакцинный штамм	Аминокислотная замена
rpsL-S12	1	167	А (в SEQ ID NO: 1)	с (в SEQ ID NO: 3)	Лизин-^ треонин (К-Т)
rpsL-S12	2	301	А (в SEQ ID NO: 1)	C (в SEQ ID NO: 3)	Лизин^глутамин (K-Q)
ABCтранспортер АТР bmp	3	323	G (в SEQ ID NO: 5)	A (в SEQ ID NO: 7)	АргининЭгистид ин (R-H)
Регулятор транскрипции marR	4	265	C (в SEQ ID NO: 9)	T (в SEQ ID NO: 11)	АргининЭцистеи н (R-C)

Пример 2. Эффективность аттенуированных вакцин против S. suis у свиней. Общий протокол исследования эффективности.

До и после вакцинации путем титрования определяли число колониеобразующих единиц (КОЕ) на миллилитр каждого разведения вакцины.

Все свиньи, участвовавшие в этом исследовании, были предоставлены компанией Midwest Research Swine (Гиббон, шт. Миннесота, США); на момент поступления все особи были здоровыми и без аномалий. Стадо считалось источником здоровых животных, если в нем никогда не было инфекции Streptococcus suis и не выявлялось присутствия вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV). В проведенных ранее исследованиях поросята из стада-источника бывали восприимчивы к заражению S. suis. Свиньи поступали в возрасте 17-24 суток. Перед вакцинацией животных обследовали и считали клинически нормальными при отсутствии признаков заболевания, включая кашель, брюшное дыхание и/или хромоту. В этих исследованиях каждая особь являлась экспериментальной единицей и перед поступлением имела метку на ухе. Поступивших животных случайным образом распределяли по помещениям для содержания и по экспериментальным группам, используя генератор случайных чисел в Microsoft Excel.

Схема эксперимента.

Всех особей вакцинировали в день 0. В группах животных, получавших вакцину, каждой особи вводили перорально 1 мл соответствующего вакцинного препарата. Контрольным особям давали 1 мл стерильного физиологического раствора, служившего плацебо. Приблизительно через 30-35 суток после вакцинации всех животных заражали и наблюдали на протяжении 11 суток после заражения.

Заражение.

Для заражения использовали изолят, полученный из мазка ткани головного мозга (изолят 8-1433-1). Он был идентифицирован по виду колоний на кровяном агаре (мелкие, белого цвета, гладкие, округлые), по окрашиванию по Граму, по биохимическим свойствам (α-гемолитический, каталаза-отрицательный, не растет в бульоне с 6,5% хлорида натрия, результат теста на гидролиз эскулина положительный) как Streptococcus suis типа 2. Этот изолят выращивали в жидкой культуральной среде до 9 логарифмов числа клеток в 1 мл, замораживали аликвоты по 1 мл в стерильных ампулах, помеченных 8-1433-1 и хранили

- 12 036764 при температуре -80°С. В проведенных ранее исследованиях была продемонстрирована вирулентность этого изолята у свиней.

Приблизительно за 4 ч до заражения ампулу с полевым изолятом вирулентных Streptococcus suis типа 2 (изолят 8-1433-1) оттаивали. Содержимое ампулы переносили в свежую среду и инкубировали на орбитальном шейкере при температуре 37°С до достижения оптической плотности при 600 нм приблизительно 1,0 (определяли с помощью спектрофотометра). Полученную культуру окрашивали по Граму; присутствовали чистые типичные колонии отдельных и объединенных в цепочки мелких шаровидных клеток. Непосредственно перед заражением и сразу после него определяли число жизнеспособных бактерий в инокуляте. Каждой свинье вводили внутримышечно 2 мл инокулята.

Наблюдения.

Животных обследовали ежедневно сотрудники, не осведомленные о том, какие особи получали вакцину, а какие плацебо. Отмечали появление у свиней хромоты, нежелания вставать, нарушений со стороны центральной нервной системы и случаи смерти.

В приведенных ниже таблицах S. suis DMO - это ослабленный штамм с SNP, представленными в табл. 1, который был депонирован в АТСС под номером РТА-13269 в соответствии с Будапештским договором о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.

Таблица 2

Пероральная вакцинация/заражение, исследование 1

Группа особей	Заболели, %	Умерли, %	Защита, %
Вакцинированные (6 Ig, DMO)	50%	30%	70%
Вакцинированные (7 Ig, DMO)	30%	10%	90%
Вакцинированные (8 Ig, DMO)	44%	11%	89%
Контрольные	90%	40%	60%

Таблица 3

Пероральная вакцинация/заражение, исследование 1

Группа особей	Заболели,%	Умерли, %	Защита, %
В акцинированные S', suis DMO	40%	30%	70%
Контрольные	80%	40%	60%

Таблица 4

Пероральная вакцинация/заражение, исследование 2

Группа особей	Заболели, %	Умерли, %	Защита, %
Вакцинированные (6 Ig, DMO)	15%	10%	90%
Вакцинированные (7 Ig, DMO)	10,5%	5,2%	94,8%
Вакцинированные (8 Ig, DMO)	10,5%	10,5%	89,5%
Контрольные	60%	33,3%	66,7%

Таблица 5

Исследование эффективности 1

Группа особей	Умерли	Умерли %	Заболели	Заболели %
Вакцинированные (6 Ig, DMO)	6/20	30%	9/20	45%
Вакцинированные (7 Ig, DMO)	0/20	0%	4/20	20%
Вакцинированные (8 Ig, DMO)	3/20	15%	6/20	30%
Контрольные	6/20	30%	11/20	55%

- 13 036764

Таблица 6

Исследование эффективности 2

Группа особей	Умерли	Умерли, %	Заболели	Заболели,%
Вакцинированные (6 1g, DM0)	8/20	40%	12/20	60,0%
Вакцинированные (7 1g, DM0)	4/19	21,1%	11/19	58,0%
Вакцинированные (8 1g, DM0)	5/20	25,0%	5/20	25,0%
Контрольные	10/19	52,6%	16/19	84,0%

Описав подробно предпочтительные воплощения данного изобретения, отметим, что оно, представленное в приведенном выше тексте, не ограничивается конкретными изложенными в настоящем документе деталями, поскольку возможно множество их вариантов, не отклоняющихся от сущности и объема данного изобретения.

Перечень последовательностей <110> Meria! Limited Bey, Russel! Lawrence, Paul raj Simonson, Randy sirigireddy, Kamesh McKeown, Danielle <120> ОСЛАБЛЕННЫЙ ШТАММ STREPTOCOCCUS SUIS, ИНДУЦИРУЮЩИЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ У СВИНЕЙ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ <130> MER 12-197 <150> USSN 61/664,935 <151> 2012-06-27 <160> 12 <170> Patentin version 3.5 <210> 1 <211> 411 <212> ДНК <213> streptococcus suis <400> 1 atgcctacaa ttaaccagtt ggtacgtaaa ccacgtaagt ctaaagtaga aaaatctaaa60 tcaccagctt tgaacgttgg ttacaacagc cgtaaaaaag ttcaaacaaa cgtttcatca120 ccacaaaaac gcggtgttgc aactcgtgtc ggaacaatga cacctaaaaa acctaactca180 gcccttcgta aatttgctcg tgtacgtttg agcaacctta tcgaagttac tgcttacatc240 ccaggtatcg gtcacaactt gcaagaacac agtgtggttc ttcttcgtgg tggacgtgta300 aaagaccttc caggggtacg ttaccatatc gttcgtggtg cacttgatac tgctggtgta360 aacgatcgta agcaaggccg ttctaaatac ggtactaaac gtccaaaagg c411 <210> 2 <211> 137 <212> белок <213> streptococcus suis <400> 2

Met 1

Pro Thr

He

Asn 5

Gin

Leu Vai

Arg

Lys 10

Pro

Arg

Lys

ser

Lys 15

Vai

Glu

Lys ser

Lys 20

ser

Pro

Ala Leu

Asn 25

Vai

Gly

Tyr

Asn

ser 30

Arg

Lys

Lys

Vai Gin 35

Thr

Asn

Vai

ser ser 40

Pro

Gin

Lys

Arg

Gly 45

Vai

Ala

Thr

Arg

Vai Gly 50

Thr

Met

Thr

Pro Lys 55

Lys

Pro

Asn

ser 60

Al a

Leu

Arg

Lys

Phe 65

Ala Arg

Vai

Arg

Leu 70

ser Asn

Leu

He

Glu 75

Vai

Thr

Ala

Tyr

He 80

Pro Gly lie Gly His Asn Leu Gin 85

Glu His ser Vai Vai Leu Leu Arg

95

Gly Gly Arg Vai Lys Asp Leu Pro 100

Gly Vai Arg Tyr His Ile Vai Arg 105 110

Gly Ala Leu Asp Thr Ala Gly Vai

115 120

Asn Asp Arg Lys Gin Gly Arg ser 12 5

Lys Tyr Gly Thr Lys Arg Pro Lys

130 135

Gly <210> 3 <211> 411 <212> ДНК <213> streptococcus suis <400> 3 atgcctacaa ttaaccagtt ggtacgtaaa ccacgtaagt ctaaagtaga aaaatctaaa60 tcaccagctt tgaacgttgg ttacaacagc cgtaaaaaag ttcaaacaaa cgtttcatca120 ccacaaaaac gcggtgttgc aactcgtgtc ggaacaatga cacctacaaa acctaactca180 gcccttcgta aatttgctcg tgtacgtttg agcaacctta tcgaagttac tgcttacatc240 ccaggtatcg gtcacaactt gcaagaacac agtgtggttc ttcttcgtgg tggacgtgta300 caagaccttc caggggtacg ttaccatatc gttcgtggtg cacttgatac tgctggtgta360 aacgatcgta agcaaggccg ttctaaatac ggtactaaac gtccaaaagg c411 <210> 4 <211> 137 <212> белок <213> streptococcus suis <400> 4

Met Pro Thr Ile Asn Gin Leu Vai Arg Lys Pro Arg Lys ser Lys Vai 15 1015

Glu Lys ser Lys ser Pro Ala Leu Asn Vai Gly Tyr Asn ser Arg Lys 20 2530

Lys Vai Gin Thr Asn Vai ser ser Pro Gin Lys Arg Gly Vai Ala Thr 35 4045

Arg Vai Gly Thr Met Thr Pro Thr Lys Pro Asn ser Ala Leu Arg Lys 50 5560

Phe Ala Arg 65	Vai Arg Leu ser Asn I 70	_eu Ile Glu 75	Vai Thr Ala Tyr Ile 80
Pro Gly Ile Gly Gly Arc	Gly His Asn Leu Gin Glu His ser 85 90 ) Vai Gin Asp Leu Pro Gly Vai Arg 100 105	Vai Vai Leu Leu Arg 95 Tyr His Ile Vai Arg 110
Gly Ala Let 115	i Asp Thr Ala Gly Vai l ; 120	\sn Asp Arg	Lys Gin Gly Arg ser 12 5
Lys Tyr Gl> 130	< Thr Lys Arg Pro Lys ( 135	31 у
<210> 5 <211> 1782 <212> ДНК <213> streptococcus suis
<400> 5 atgaagacgt	tacgtttttt	ctggttttat	tttaaacgct	ataaactgtc	ctttgctgtg	60
atttttctag	ccattgtggc	agcgacctac	ctgcaggtta	agacacctgt	tttccttgga	120
aatgccattg	cggagatggg	gaaaatcggg	caggcttact	ttatggccaa	tcaagctggt	180
caggctgact	ttcagccaga	catggctgat	tttaacgggg	ttatgctcaa	tcttttcttt	240
gcctatgcgg	cgacggttgt	ggcttccttg	atttacactc	tcctcttcac	gcgtatcgtg	300
gctcattcga	ccaaccgtat	gcgtaagggc	ttgtttggca	aactggaacg	cttgacagtt	360
gccttctttg	atagccacaa	ggacggggat	atactttctc	gctttaccag	tgatttggac	420
aatatccaaa	acgctttcaa	ccagtccttg	acccaagtgg	tgaccaacat	cgctctttat	480
gttggtatgg	tcatcatgat	gttccgtcag	gatactcgct	tggccttggt	gaccattgct	540
tctacgccag	ttgccttgat	tgccttggtc	gttatcatcc	gcctatcacg	gaaatatacg	600
gataagcaac	aggctgcggt	gtctaaactc	aatgcctaca	tggacgagaa	aatttctgga	660
caaaaagcga	ttattgtaca	aggtgtgcag	gaagagacaa	ttgatggttt	cttggagctc	720
aatgaagaag	ttcgtcgcac	aactttcaag	ggacgcttgt	ttggtgggat	tctcttccca	780
tttatgaatg	gtatgagttt	ggtcaatacg	gccattgtta	tctttgcagg	ttccagcatt	840
gttctcaatg	acagctcact	ggaaacagct	gccgcacttg	gtctggtggt	gacttttgtt	900
caatactcgc	aacagtatta	ccagccaatc	atgcaggttg	ctgccagctg	ggcagaattg	960
cagctagctt	tcacaggagc	tcatcgtatt	caggaaatgt	ttgatgagcc	tgaggaagtt	1020
cgtcctcaaa	acgctccgct	atttaccgaa	ttaaaagaag	gtgttgaaat	taaggacatc	1080
gactttggct	acttgccagg	tcagaaggtc	ttggacaagg	tgtctatctc	tgctcctaag	1140
ggtaagatgg	tggcggtcgt	tggtccgacg	ggatctggta	agactaccat	tatgaacttg	1200
attaaccgct	tctacgatgt	caatggtggt	agtgtggcct	ttgatggtcg	cgatattcgg	1260
gaatatgatt	tggatagctt	gcggaataag	gtcggtatcg	tcttgcagga	gtcggtgtta	1320
ttctcgggta	ctattgcgga	caatattcgc	tttggtgatg	agagcatttc	gcaggaaatg	1380
gtggaaaccg	cagctcgtgc	cacccatatc	cacgacttca	tcatgagctt	gccagagggc	1440
tatgaaacct	ttgtgaccga	tgatgagaat	gtcttctcaa	caggtcagaa	acagttgatt	1500
tccattgccc	gtacgctttt	gacagaccca	caagtcttga	ttttggacga	agcaacctca	1560

- 15 036764

aacgttgata ccgtaacgga	ggccaaaatt	caaaaggcta tggaggccat tatcgcagga	1620
cggactagct tcgtcattgc	ccaccgcctc	aaaaccattc tcaatgcgga tgaaatcatc	1680
gtcctcaagg atggaaaggt	tatcgagcaa	ggcaaccaca gccaacttct caaactaaat	1740
ggcttctacg ccgaacttta	ccacaaccag	tttgtgtttg aa	1782

<210> б <211> 594 <212> белок <213> streptococcus suis <400> 6

Met 1

Lys Thr Leu Arc 5 '

j Phe

Phe

T rp

Phe Tyr Phe Lyi 10

s Arg

Tyr

Lys 15

Leu

ser

Phe Ala Vai He Phe 20

Leu

Al a

He Vai Ala Ala Thr 25

Tyr 30

Leu

Gln

Vai

Lys Thr Pro Vai 35

Phe

Leu

Gly 40

Asn Ala lie Ala Glu 45

Met

Gly

Lys

lie

Gly Gln Ala Tyr 50

’ Phe

Met 55

Ala

Asn Gln Al

a Gly Gln 60

Ala

Asp

Phe

Gln 65

Pro Asp Met Ala Asp 70

Phe

Asn

Gly Vai Met Leu Asn 75

Leu

Phe

Phe 80

Al a

Tyr Ala Al

a Thr 85

’ Vai

Vai

Ala

ser Leu lie Ту 90

r Thr

Leu

Leu 95

Phe

Thr

Arg lie Vai Ala His 100

ser

Thr

Asn Arg Met An 105

9 Lys

Gly 110

Leu

Phe

Gly

Lys Leu Glu Arc 115 '

j Leu

Thr

Vai 120

Ala Phe Phe As|

p ser 12 5

His

Lys

Asp

Gly

Asp lie Leu ser Arg 130

Phe 135

Thr

ser Asp Leu As| 14(

p Asn Э

He

Gln

Asn

Al a 145

Phe Asn Gln ser Leu 150

Thr

Gln

Vai Vai Thr Asn lie 155

Ala

Leu

Tyr 160

Vai

Gly Met Vai He Met 165

Met

Phe

Arg Gln Asp Th 170

r Arg

Leu

Ala 175

Leu

Vai

Thr lie Ala ser Thr 180

Pro

Vai

Ala Leu lie Ala Leu 185

Vai 190

Vai

He

He Lys

Arg Leu ser Arc 195 ' Leu Asn Ala 210

) Lys Tyr

Tyr Met

Thr 200 Asp 215

Asp Lys Gln Gln Ala 205 Glu Lys He Ser

Ala Gly 220

Vai Gln

ser Lys

Al a

Il e

He 225

Vai

Gln

Gly

Vai

Gln 2 30

Glu

Glu

Thr

He

Asp 235

Gly

Phe

Leu

Glu

Leu 240

Asn

Glu

G1 U

Vai

Arg 245

Arg

Thr

Thr

Phe

Lys 250

Gly

Arg

Leu

Phe

Gly 255

Gly

He

Leu

Phe

Pro 260

Phe

Met

Asn

Gly

Met 265

ser

Leu

Vai

Asn

Thr 270

Al a

Il e

Vai

He

Phe 275

Al a

Gly

ser

ser

He 280

Vai

Leu

Asn

Asp

ser 285

Ser

Leu

Glu

Thr

Al a 290

Al a

Al a

Leu

Gly

Leu 295

Vai

Vai

Thr

Phe

Vai 300

Gln

Tyr

ser

Gln

Gln 305

Tyr

Tyr

Gln

Pro

He 310

Met

Gln

Vai

Al a

Al a 315

ser

Trp

Al a

Glu

Leu 320

Gln

Leu

Al a

Phe

Thr 325

Gly

Ala

His

Arg

He 330

Gln

G1 u

Met

Phe

Asp 335

Glu

Pro

G1 u

G1 u

Vai 340

Arg

Pro

Gln

Asn

Al a 345

Pro

Leu

Phe

Thr

G1 u 350

Leu

Lys

Glu

Gly

Vai 355

Glu

He

Lys

Asp

He 360

Asp

Phe

Gly

Tyr

Leu 365

Pro

Gly

Gln

Lys

Vai 370

Leu

Asp

Lys

Vai

ser 375

He

ser

Al a

Pro

Lys 380

Gly

LYS

Met

Vai

Al a 385

Vai

Vai

Gly

Pro

Thr 390

Gly

ser

Gly

Lys

Thr 395

Thr

He

Met

Asn

Leu 400

He

Asn

Arg

Phe

Tyr 405

Asp

Vai

Asn

Gly

Gly 410

ser

Vai

Al a

Phe

Asp 415

Gly

Arg

Asp

He

Arg 420

G1 u

Tyr

Asp

Leu

Asp 42 5

ser

Leu

Arg

Asn

Lys 430

Vai

Gly

He

Vai

Leu 435

Gln

G1 u

ser

Vai

Leu 440

Phe

ser

Gly

Thr

He 445

Al a

Asp

Asn

He

Arg 450

Phe

Gly

Asp

Glu

ser 455

He

ser

Gln

Glu

Met 460

Vai

G1 u

Thr

Al a

Ala 465

Arg

Al a

Thr

His

He 470

His

Asp

Phe

He

Met 475

ser

Leu

Pro

G1 u

Gly 480

Tyr

G1 u

Thr

Phe

Vai

Thr

Asp

Asp

G1 u

Asn

Vai

Phe

ser

Thr

Gly

Gln

- 16 036764

485 490 495

Lys

Gin

Leu

Ile 500

ser

Ile

Ala

Arg

Thr 505

Leu

Leu

Thr

Asp

Pro 510

Gin

Vai

Leu

lie

Leu 515

Asp

G1 u

Al a

Thr

ser 520

Asn

Vai

Asp

Thr

Vai 525

Thr

Glu

Ala

Lys

Ile

Gin

Lys

Al a

Met

Glu

Ala

Ile

Ile

Al a

Gly

Arg

Thr

ser

Phe

530 535 540

Vai Ile Ala His Arg Leu Lys Thr Ile Leu Asn Ala Asp Glu IleIle

545 550 555560

Vai Leu Lys Asp Gly Lys Vai Ile Glu Gin Gly Asn His ser GinLeu

565 570575

Leu Lys Leu Asn Gly Phe Tyr Ala Glu Leu Tyr His Asn Gin Phe Vai 580 585590

Phe Glu <210> 7 <211> 1782 <212> ДНК <213> streptococcus suis <400> 7

atgaagacgt	tacgtttttt	ctggttttat	tttaaacgct	ataaactgtc	ctttgctgtg	60
atttttctag	ccattgtggc	agcgacctac	ctgcaggtta	agacacctgt	tttccttgga	120
aatgccattg	cggagatggg	gaaaatcggg	caggcttact	ttatggccaa	tcaagctggt	180
caggctgact	ttcagccaga	catggctgat	tttaacgggg	ttatgctcaa	tcttttcttt	240
gcctatgcgg	cgacggttgt	ggcttccttg	atttacactc	tcctcttcac	gcgtatcgtg	300
gctcattcga	ccaaccgtat	gcataagggc	ttgtttggca	aactggaacg	cttgacagtt	360
gccttctttg	atagccacaa	ggacggggat	atactttctc	gctttaccag	tgatttggac	420
aatatccaaa	acgctttcaa	ccagtccttg	acccaagtgg	tgaccaacat	cgctctttat	480
gttggtatgg	tcatcatgat	gttccgtcag	gatactcgct	tggccttggt	gaccattgct	540
tctacgccag	ttgccttgat	tgccttggtc	gttatcatcc	gcctatcacg	gaaatatacg	600
gataagcaac	aggctgcggt	gtctaaactc	aatgcctaca	tggacgagaa	aatttctgga	660
caaaaagcga	ttattgtaca	aggtgtgcag	gaagagacaa	ttgatggttt	cttggagctc	720
aatgaagaag	ttcgtcgcac	aactttcaag	ggacgcttgt	ttggtgggat	tctcttccca	780
tttatgaatg	gtatgagttt	ggtcaatacg	gccattgtta	tctttgcagg	ttccagcatt	840
gttctcaatg	acagctcact	ggaaacagct	gccgcacttg	gtctggtggt	gacttttgtt	900
caatactcgc cagctagctt	aacagtatta tcacaggagc	ccagccaatc tcatcgtatt	atgcaggttg caggaaatgt	ctgccagctg ttgatgagcc	ggcagaattg tgaggaagtt	960 1020
cgtcctcaaa	acgctccgct	atttaccgaa	ttaaaagaag	gtgttgaaat	taaggacatc	1080
gactttggct	acttgccagg	tcagaaggtc	ttggacaagg	tgtctatctc	tgctcctaag	1140
ggtaagatgg	tggcggtcgt	tggtccgacg	ggatctggta	agactaccat	tatgaacttg	1200
attaaccgct	tctacgatgt	caatggtggt	agtgtggcct	ttgatggtcg	cgatattcgg	1260
gaatatgatt	tggatagctt	gcggaataag	gtcggtatcg	tcttgcagga	gtcggtgtta	1320
ttctcgggta	ctattgcgga	caatattcgc	tttggtgatg	agagcatttc	gcaggaaatg	1380
gtggaaaccg	cagctcgtgc	cacccatatc	cacgacttca	tcatgagctt	gccagagggc	1440
tatgaaacct	ttgtgaccga	tgatgagaat	gtcttctcaa	caggtcagaa	acagttgatt	1500
tccattgccc	gtacgctttt	gacagaccca	caagtcttga	ttttggacga	agcaacctca	1560
aacgttgata	ccgtaacgga	ggccaaaatt	caaaaggcta	tggaggccat	tatcgcagga	1620
cggactagct	tcgtcattgc	ccaccgcctc	aaaaccattc	tcaatgcgga	tgaaatcatc	1680
gtcctcaagg	atggaaaggt	tatcgagcaa	ggcaaccaca	gccaacttct	caaactaaat	1740
ggcttctacg	ccgaacttta	ccacaaccag	tttgtgtttg	aa		1782

<210> 8 <211> 594 <212> белок <213> streptococcus suis <400> 8

Met Lys Thr Leu Arg Phe Phe Trp Phe Tyr Phe Lys Arg Tyr Lys Leu 15 1015 ser Phe Ala Vai Ile Phe Leu Ala Ile Vai Ala Ala Thr Tyr Leu Gin 20 2530

Vai Lys Thr Pro Vai Phe Leu Gly Asn Ala Ile Ala Glu Met Gly Lys 35 4045

Ile Gly Gin Ala Tyr Phe Met Ala Asn Gin Ala Gly Gin Ala Asp Phe 50 5560

Gin Pro Asp Met Ala Asp Phe Asn Gly Vai Met Leu Asn Leu PhePhe

70 7580

Ala Tyr Ala Ala Thr Vai Vai Ala ser Leu Ile Tyr Thr Leu LeuPhe

9095

Thr Arg Ile Vai Ala His ser Thr Asn Arg Met His Lys Gly Leu Phe 100 105110

Gly Lys Leu Glu Arg Leu Thr Vai Ala Phe Phe Asp ser His Lys Asp 115 120125

Gly Asp Ile Leu ser Arg Phe Thr ser Asp Leu Asp Asn Ile Gin Asn

	130	135	' 140
Ala 145	Phe Asn Gin ser Leu 150	Thr Gin	val val Thr Asn Ile Ala Leu Tyr 155 160
Vai	Gly Met Vai Ile Met 165	Met Phe	Arg Gin Asp Thr Arg Leu Ala Leu 170 175
Vai	Thr Ile Ala ser Thr 180	Pro Vai	Ala Leu Ile Ala Leu val val Ile 185 190
Ile	Arg Leu ser Arg Lys 195	Tyr Thr 200	Asp Lys Gin Gin Ala Ala Val ser 205
Lys	Leu Asn Ala Tyr Met 210	Asp Glu 215	Lys Ile ser Gly Gin Lys Ala Ile 220
Ile 225	Vai Gin Gly Vai Gin 2 30	Glu Glu	Thr Ile Asp Gly Phe Leu Glu Leu 235 240
Asn	Glu Glu Vai Arg Arg 245	Thr Thr	Phe Lys Gly Arg Leu Phe Gly Gly 250 255
Ile	Leu Phe Pro Phe Met 260	Asn Gly	Met ser Leu Val Asn Thr Ala Ile 265 270
Vai	Ile Phe Ala Gly ser 275	ser Ile 280	Val Leu Asn Asp ser ser Leu Glu 285
Thr	Ala Ala Ala Leu Gly 290	Leu Vai 295	Val Thr Phe Val Gin Tyr ser Gin 300
Gin 305	Tyr Tyr Gin Pro Ile 310	Met Gin	Val Ala Ala ser Trp Ala Glu Leu 315 320
Gin	Leu Ala Phe Thr Gly 325	Ala His	Arg Ile Gin Glu Met Phe Asp Glu 330 335
Pro	Glu Glu Vai Arg Pro 340	Gin Asn	Ala Pro Leu Phe Thr Glu Leu Lys 345 350
Glu	G1 у Vai G1 u II e Lys 355	Asp Ile 360	Asp Phe Gly Tyr Leu Pro Gly Gin 365
Lys	Vai Leu Asp Lys Vai 370	ser Ile 375	ser Ala Pro Lys Gly Lys Met Val 380
Al a 385	Vai Vai Gly Pro Thr 390	Gly ser	Gly Lys Thr Thr Ile Met Asn Leu 395 400
Ile Arg lie Ile Ala 465 Tyr Lys Leu Lys Vai 545 Vai Leu	Asn Arg Phe Tyr Asp 405 Asp Ile Arg Glu Tyr Asp 420 Vai Leu Gin Glu ser Vai 435 Arg Phe Gly Asp Glu ser 450 455 Arg Ala Thr His Ile His 470 Glu Thr Phe Vai Thr Asp 485 Gin Leu Ile ser Ile Ala 500 Ile Leu Asp Glu Ala Thr 515 Ile Gin Lys Ala Met Glu 530 535 Ile Ala His Arg Leu Lys 550 Leu Lys Asp Gly Lys Vai 565 Lys Leu Asn Gly Phe Tyr 580	val Asn Gly Gly ser Vai Ala Phe Asp Gly 410 415 Leu Asp ser Leu Arg Asn Lys Val Gly 425 430 Leu Phe ser Gly Thr Ile Ala Asp Asn 440 445 Ile ser Gin Glu Met Val Glu Thr Ala 460 Asp Phe Ile Met ser Leu Pro Glu Gly 475 480 Asp Glu Asn Val Phe ser Thr Gly Gin 490 495 Arg Thr Leu Leu Thr Asp Pro Gin Val 505 510 ser Asn Val Asp Thr Val Thr Glu Ala 520 525 Ala Ile Ile Ala Gly Arg Thr ser Phe 540 Thr Ile Leu Asn Ala Asp Glu Ile Ile 555 560 Ile Glu Gin Gly Asn His ser Gin Leu 570 575 Ala Glu Leu Tyr His Asn Gin Phe Val 585 590

Phe Glu <210> 9 <211> 447 <212> ДНК <213> streptococcus suis <400> 9

atgggacata	ctattgcaga ttttcggaac ttgctcaatc agattgaaca aattagtgaa	60
accattgcaa	aagaatacga tgtggagcac ttggctggtc cacagggctg ggccttgcgc	120
ttcattgcgg	aacggtcgga agccgaaacc tttgtaaaag atatagaagc ggaattaaag	180
atttccaaat	cggttgccag caatctggtc aagagaatgg agaaaaatgg ctttatccaa	240
gtccttccct	ctaaggttga caaacgcttc aaacagctgg ttttgacaga gaagggacaa	300
gggaagatat	gtcacctgaa agcttttcat gaagaaatgc accattcact tttttggggc	360
attcaaaaag	aggactttga cttggttaaa caggtgggca atcaattaaa agtaaatatt	420

- 18 036764 caacgctata aggagaagaa tcatgtt 447 <210> 10 <211> 149 <212> белок <213> streptococcus suis <400> 10

Met Gly 1	His	Thr	lie Ala Asp 5	Phe Arg Asn Leu Leu 10	Asn	Gin	Ile 15	Gl U
Gln lie	ser	Glu 20	Thr lie Ala	Lys Glu Tyr Asp Val 25	Glu	His 30	Leu	Ala
Gly Pro	Gln 35	Gly	Trp Ala Leu	Arg Phe lie Ala Glu 40	Arg 45	ser	Glu	Al a
Glu Thr 50	Phe	Val	Lys Asp lie 55	Glu Ala Glu Leu Lys 60	Ile	ser	Lys	ser
Val Al a 65	ser	Asn	Leu Val Lys 70	Arg Met Glu Lys Asn 75	Gly	Phe	lie	Gin 80
Val Leu	Pro	ser	Lys Val Asp 85	Lys Arg Phe Lys Gln 90	Leu	Val	Leu 95	Thr
Glu Lys	Gly	Gln 100	Gly Lys lie	cys His Leu Lys Ala 105	Phe	His 110	Glu	Gl u
Met His	His 115	ser	Leu Phe Trp	Gly lie Gin Lys Glu 120	Asp 125	Phe	Asp	Leu
Val Lys 130	Gln	Val	Gly Asn Gln 135	Leu Lys Val Asn Ile 140	Gl n	Arg	Tyr	Lys

Glu Lys Asn His Val 145 <210> 11 <211> 447 <212> ДНК <213> streptococcus suis

<400> 11 atgggacata ctattgcaga	ttttcggaac ttgctcaatc agattgaaca aattagtgaa	60
accattgcaa aagaatacga	tgtggagcac ttggctggtc cacagggctg ggccttgcgc	120
ttcattgcgg aacggtcgga	agccgaaacc tttgtaaaag atatagaagc ggaattaaag	180
atttccaaat cggttgccag	caatctggtc aagagaatgg agaaaaatgg ctttatccaa	240
gtccttccct ctaaggttga	caaatgcttc aaacagctgg ttttgacaga gaagggacaa	300
gggaagatat gtcacctgaa	agcttttcat gaagaaatgc accattcact tttttggggc	360
attcaaaaag aggactttga	cttggttaaa caggtgggca atcaattaaa agtaaatatt	420
caacgctata aggagaagaa	tcatgtt	447

<210> 12 <211> 149 <212> белок <213> streptococcus suis <400> 12

Met Gly His Thr lie Ala Asp Phe Arg Asn Leu Leu Asn Gln lie Glu

1015

Gln lie ser Glu Thr lie Ala Lys Glu Tyr Asp Val Glu His Leu Ala 20 2530

Gly Pro Gln Gly Trp Ala Leu Arg Phe lie Ala Glu Arg ser Glu Ala 35 4045

Glu Thr Phe Val Lys Asp lie Glu Ala Glu Leu Lys lie ser Lys ser 50 5560

Val Ala ser Asn Leu Val Lys Arg Met Glu Lys Asn Gly Phe lie Gln 65 70 7580

Val Leu Pro ser Lys Val Asp Lys cys Phe Lys Gln Leu Val Leu Thr 85 9095

Glu Lys Gly Gln Gly Lys lie cys His Leu Lys Ala Phe His Glu Glu

100 105110

Met His His ser Leu Phe Trp Gly lie Gln Lys Glu Asp Phe Asp Leu

115 120125

Val Lys Gln Val Gly Asn Gln Leu Lys Val Asn lie Gln Arg Tyr Lys

130 135140

Glu Lys Asn His Val 145

Claims (11)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Ослабленный штамм Streptococcus suis, способный вызывать у свиней безопасный и эффективный иммунный ответ, направленный против S. suis, причем указанный ослабленный штамм содержит нуклеиновые кислоты, кодирующие мутантные белки rpsL-S12 (белок 30S-субъединицы рибосомы), АВС-АТРВМР (АТФ-связывающий мембранный белок ABC-транспортера), marR (регулятор транскрипции) с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 4, 8 и 12 соответственно, по сравнению с исходным вирулентным штаммом S. suis, который содержит нуклеиновые кислоты, кодирующие белки дикого типа rpsL-S12, АВС-АТРВМР и marR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 2, 6 и 10 соответственно.

   - 19 036764
2. 2. Ослабленный штамм по п.1, содержащий нуклеиновые кислоты с последовательностями SEQ ID

   NO: 3, 7 и 11, кодирующими мутантные белки rpsL-S12, АВС-АТРВМР и marR соответственно.
3. 3. Ослабленный штамм по п.2, отличающийся тем, что уровень(и) экспрессии пептида(ов) rpsL-S12,

   АВС-АТРВМР и marR уменьшен(ы) относительно исходного штамма S. suis.
4. 4. Ослабленный штамм по п.1, депонированный в АТСС под номером РТА-13269.
5. 5. Иммунологическая композиция, содержащая ослабленный штамм по любому из пп.1-4, которая вызывает у свиней иммунный ответ против вирулентного штамма S. suis.
6. 6. Иммунологическая композиция по п.5, содержащая фармацевтически или ветеринарно приемлемый носитель, разбавитель или иной эксципиент и адъювант, выбранный из хитозана, инактивированных бактерий, инактивированных вирусов, фракций инактивированных бактерий, бактериальных липополисахаридов, бактериальных токсинов или их производных либо их комбинаций.
7. 7. Иммунологическая композиция по любому из пп.5 или 6, дополнительно содержащая по меньшей мере один антиген, ассоциированный с патогеном, отличным от S. suis, где дополнительный антиген способен вызывать у свиней иммунный ответ, направленный против М. hyo, PCV2, PRRSV, SIV или других патогенов, которые могут заражать свинью и вызывать у нее заболевание или подверженность заболеванию.
8. 8. Применение ослабленного штамма по любому из пп.1-4 для получения композиции по любому из пп.5, 6 или 7.
9. 9. Применение ослабленного штамма по любому из пп.1-4 в лечении заболеваний, вызываемых S. suis.
10. 10. Применение ослабленного штамма по любому из пп.1-4 для индукции у свиньи иммунного ответа, направленного против S. suis.
11. 11. Применение по п.10, отличающееся тем, что свинья является свиноматкой за 3-6 недель до опороса, а вызываемый иммунный ответ приводит к снижению заболеваемости или смертности среди родившихся от нее поросят по сравнению с поросятами, родившимися от невакцинированных свиней.