CN112694988B - 一种鸡源猪链球菌弱毒株及其应用 - Google Patents

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本发明公开了一种鸡源猪链球菌弱毒株及其应用，所述鸡源猪链球菌弱毒株分类命名：猪链球菌(Streptococcus suis)SSHuB12；其保藏编号为：CCTCC NO：M2019977，本发明所用的鸡源猪链球菌弱毒株，制备猪链球菌病弱毒活疫苗中的应用，可有效的诱导试验小鼠产生针对猪链球菌2型毒株的抗体，预防猪链球菌2型引起的疾病，免疫保护效果好。该弱毒活疫苗的组分较少，能有效的降低免疫负担，减少免疫的副反应提高安全性。同时该毒株缺少sly基因、epf基因、mrp基因3个毒力相关基因和89kb毒力岛的部分片段，在实际应用中，可区分疫苗免疫动物和野毒感染，从而有利于该病的根除和净化。

Description

一种鸡源猪链球菌弱毒株及其应用
技术领域
本发明涉及疫苗制备技术领域，具体涉及一种鸡源猪链球菌 弱毒株及其应用。
背景技术
猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一种革兰氏阳性菌，是重要 的人兽共患病原菌，根据荚膜多糖的差异可将猪链球菌分为29个血 清型，其中猪链球菌2型(SS2)是常见的毒力最强的人兽共患血清 型。SS感染可导致脑膜炎、关节炎、心内膜炎和败血性肺炎，常引 起断奶仔猪或者育肥猪死亡。猪链球菌给养猪业造成了重要的经济损 失，并极大的危害着公共卫生安全。更为严重的是，猪链球菌2型强 毒株感染，可以逃避补体系统在内的先天性免疫系统的监视，在血液 循环系统和全身组织器官中迅速繁殖，引起中毒性休克综合征。
目前我国针对猪链球菌2型的弱毒疫苗的研究多以基因工程构 建为主，以猪链球菌2型菌株为亲本菌株，构建单缺失/双缺失等 菌株，在一定程度上降低了猪链球菌菌的毒力，但是缺失菌株容易 存在回复突变的可能，易造成菌株的毒力返强。
猪链球菌猪主要能从猪体内分离，还偶尔从牛，绵羊，山羊， 马，猫，狗和鸟中分离出来。自然弱毒株是在自然界中存在的，非 人为改造的菌株，比目前以基因工程手段构建的缺失弱毒菌株更加 稳定，不易产生毒力返强。目前常用的SS2型毒株可能会突破血脑 屏障，引起脑膜炎。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种鸡源猪 链球菌弱毒株，该鸡源猪链球菌弱毒株是从健康鸡中分离的自然弱 毒株，毒力非常低，同时能刺激机体产生抗体，对抗猪链球菌2型， 既安全，又有效。
本发明的第二个目的是在于提供了一种鸡源猪链球菌弱毒株 在制备猪链球菌病弱毒活疫苗中的应用，利用该菌株制备的疫苗可 以预防猪链球菌2型引起的疾病，对于猪链球菌2型感染的免疫保 护效果好，不会对机体产生应激反应，可应用于猪链球菌疫苗候选 株，本发明所用的毒株，不能突破血脑屏障，不会引起脑膜炎，大 大提高了疫苗的安全性。
为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术措施：
本发明的第一目的提供了一种鸡源猪链球菌弱毒株，所述鸡 源猪链球菌弱毒株分类命名：猪链球菌(Streptococcus suis) SSHuB12；其保藏编号为：CCTCC NO：M2019977，于2019年11 月27日将该猪链球菌SSHuB12保藏于中国典型培养物保藏中心， 保藏地址为湖北省武汉市武汉大学。
本发明的第二目的是提供了一种上述鸡源猪链球菌弱毒株在 制备猪链球菌弱毒活疫苗中的应用。
本发明的有益效果：
1.本发明所用的鸡源猪链球菌弱毒株，制备猪链球菌病弱毒活 疫苗中的应用，可有效的诱导试验小鼠产生针对猪链球菌2型毒株 的抗体，预防猪链球菌2型引起的疾病，免疫保护效果好。该弱毒 活疫苗的组分较少，能有效的降低免疫负担，减少免疫的副反应提高安全性。
2.本发明所用的毒株缺少sly基因、epf基因、mrp基因3个毒 力相关基因和89kb毒力岛的部分片段，不能突破血脑屏障，不会 引起脑膜炎，大大提高了疫苗的安全性。同时由于上述基因的缺失， 该毒株在实际应用中，可区分疫苗免疫动物和野毒感染，从而有利 于该病的根除和净化。
附图说明
图1为SSHub12的革兰氏染色图；
图2为SSHub12的PCR鉴定图，其中M为marker，1泳道为 阴性对照，2泳道为SSHuB12；
图3为SSHuB12与SC19全基因组序列比对结果；
图4为SSHuB12、SC19在昆明鼠脑组织中的定植情况；
图5为免疫后14天昆明鼠体重与免疫前体重的比值；
图6为SSHuB12活疫苗免疫昆明鼠，首免后14天、二免后7 天产生的针对SSHuB12菌体抗体的水平；
图7为SSHuB12活疫苗免疫昆明鼠，首免后14天、二免后7 天产生的针对猪链球菌型SC19菌体抗体水平；
图8为SSHuB12活疫苗免疫昆明鼠后，用SC19菌株攻毒 (2×109CFU)后昆明鼠的生存曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领 域技术人员理解。
实施例1
猪链球菌(SSHub12株)的分离、筛选和鉴定：
1.病料采集
病料来自于2018年5月自湖北省大悟县某鸡场的健康鸡的咽 试纸。经各项鉴定证明为猪链球菌，所述菌株已于2019年11月27 日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：猪链球菌 (Streptococcus suis)SSHuB12，保藏编号：CCTCC NO：M2019977， 地址：中国武汉，武汉大学。
2.培养基的制备
TSB液体培养基：将TSB肉汤粉(Tryptic Soy broth，胰蛋白 胨大豆肉汤)30g，溶于1000mL超纯水中，115℃灭菌15min，加 胎牛血清50mL。
TSA固体培养基：将TSA琼脂粉(Tryptic Soy Agar，胰蛋白 胨大豆琼脂)40g，溶于1000mL超纯水中，115℃灭菌15min，加 胎牛血清50mL；于4℃保存备用。
3.菌株的分离培养
采集健康鸡的咽试纸接种于含有牛血清的TSA固体培养基上， 37℃恒温培养箱中培养24h，其中有部分菌落形态为针尖状大小、 灰白色半透明，圆形、光滑、边缘整齐。纯化接种后，进行革兰氏 染色(见图1)，该菌为革兰氏阳性菌，圆形或卵圆形，链状排列或 成双，链的长短不一。
4.菌株的鉴定
4.1引物设计
根据猪链球菌Glutamate dehydrogenase(gdh)基因的序列设 计一对通用引物，用于猪链球菌的鉴定，引物序列如下：
gdh-F 5’-CCATGGACAGATAAAGATGG-3’，
gdh-R 5’-GCAGCGTATTCTGTCAAACG-3’；
扩增片段大小应为689bp。
4.2PCR鉴定
按照DNA提取试剂盒的操作步骤提取出菌株的DNA，分光光 度计测定浓度为100μg/mL，进行PCR鉴定。
PCR扩增反应体系为25μL：10×缓冲液2.5μL，2.5mM (each)dNTPs Mix 0.5μL，10μM/L通用引物gdh-F，gdh-R各 1μL，5U/μL rTaq 1μL，100μg/mL DNA模板1μL，加入ddH2O 至25μL。
反应条件：95℃预变性5min，进入循环：95℃1min，57℃1min， 72℃30s，共35个循环，最后72℃延伸10min，PCR产物4℃保存。
扩增产物分别进行电泳，每孔加样10μL，1％琼脂糖凝胶电 泳，紫外光下观察结果，扩增出689bp片段(见图2)，证明菌株 SSHuB12为猪链球菌(Streptococcus suis)。
4.3全基因组测序
将SSHuB12菌株送去上海伯豪生物技术有限公司，进行全基 因组测序。测序结果与猪链球菌SC19菌株进行比对(SC19是2 型猪链球菌强毒株，分离自2005年四川省SS2疫区的感染猪只，GenBank登录号：NZ_MNPY00000000)，发现SSHuB12缺失了sly 基因、epf基因、mrp基因3个毒力相关基因和89kb毒力岛的部分 片段，比对结果如图3。
5致病性实验
5.1猪链球菌SSHuB12的毒力试验
将40只4-6周龄昆明系小鼠猪随机分成四组，分别为A、B、 C和生理盐水对照组，测定猪链球菌SSHuB12致病力，剂量及分 组如表1。每个剂量组用10只小鼠腹腔接种，每只接种0.2ml的菌 悬液或者生理盐水。观察7日，统计结果如表1所示。
表1猪链球菌SSHuB12的毒力测定
Figure BDA0002838329590000051
A、B组感染小鼠有少量在感染第一天有被毛粗乱的情况，但 随后快速恢复，C组小鼠精神正常。表1的结果表明，用1×109CFU 的SSHuB12菌株接种10只昆明鼠，对昆明鼠致病性低。
5.2SSHuB12在小鼠脑组织的定殖实验
将40只4-6周龄昆明系小鼠猪随机分成两组，每组20只，分 别为SC19组和SSHuB12组。将对数生长期的SC19和SSHuB12 集菌，用生理盐水洗涤重悬，稀释至2.5×109CFU/mL，取0.2mL 菌液(5×108CFU)分别腹腔接种20只小鼠。在接种后的6h、12 h、24h、48h的时间点取小鼠的脑组织，样品经过匀浆和稀释处理， 随后样品液涂含有牛血清的TSA固体培养基上。得到平板菌落数 后，计算脑组织载菌量。
体内定殖实验显示SC19能够突破血脑屏障在脑组织定殖， SSHuB12没有在脑组织中分离到(图4)。
实施例2
猪链球菌SSHuB12制备弱毒活疫苗的应用：
1.疫苗的制备
将猪链球菌SSHuB12接种到含有牛血清的TSA固体培养基 上，置于37℃摇床中培养，18h后收取培养物；然后挑取单菌落于 含有牛血清的TSB培养基中，在温度为37℃的条件下，以转速 180rpm振荡培养12h，此为原液。按原液与培养基的体积比1:100 接种于含有牛血清的TSB培养基中，在温度为37℃的条件下，以 转速180rpm振荡培养5h。集菌，并用生理盐水重悬菌体，重复操 作2次，将菌液用生理盐水调整到5×109CFU/ml，置2～8℃保存备用，当天制备的当天使用。
2.以SSHuB12制备的弱毒活疫苗对猪链球菌2型感染的免疫 保护效力
将20只4-6周龄昆明系小鼠猪随机分成两组，每组10只，分 别为活疫苗组和生理盐水对照组。
活疫苗组：通过腹腔注射接种0.2ml SSHuB12活疫苗(1×
109CFU)。
生理盐水组：腹腔注射接种0.2ml生理盐水。
免疫前和免疫后14天，每天测量小鼠的体重，计算小鼠每日 体重与免疫前体重的比值(图5)。
免疫后14天进行第二次人工接种。首免后14天、二免后7天 分别采血检测针对SSHuB12菌体抗体(图6)、针对猪链球菌型SC19 菌体抗体(图7)。实验结果显示该疫苗免疫小鼠后，可诱导产生针 对不同血清型菌株的抗体。
二免后7天使用猪链球菌2型菌株SC19(2×109CFU)进行人 工感染。对照小鼠全部发病，死亡率达到100％，而免疫小鼠10 只中有3只死亡，保护率达到了70％(图8)。
因此，SSHuB12免疫后可对猪链球菌2型强毒株感染提供免疫 保护。且由于该菌株具有很好的安全性，因此，该菌株可以作为弱 毒疫苗的候选菌株。
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发 明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全 部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他 实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (2)

1.一种鸡源猪链球菌弱毒株，其特征在于：所述鸡源猪链球菌弱毒株分类命名：猪链球菌(Streptococcus suis)SSHuB12；其保藏编号为CCTCC NO：M2019977。
2.一种权利要求1所述鸡源猪链球菌弱毒株在制备猪链球菌弱毒活疫苗中的应用。
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