CN105316252B - 一种猪链球菌2型五基因缺失株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种猪链球菌2型五基因缺失株，该菌株是猪链球菌2型ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS五基因缺失菌株，猪链球菌（Streptococcus suis）ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS，保藏编号为：CCTCC NO:M 2015033。该菌株毒力低，安全性高。该疫苗免疫原性高，能够保护免疫猪抵抗猪链球菌2型强毒菌株的攻击。该疫苗制备过程和方法简单，材料易得，适合工业化生产。同时，由于该突变株的免疫原性与野生强毒株相似，因此可以作为标准品（或阳性对照）和全菌（荚膜）抗原应用到快速试剂盒的开发中。

Description

一种猪链球菌2型五基因缺失株及应用

技术领域

本发明属于家畜传染病基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种猪链球菌2型五基因缺失株及应用。

背景技术

猪链球菌属革兰氏阳性菌，兼性厌氧，呈链状或成对存在，是一种重要的病原微生物，按照荚膜抗原的不同，共分为35个血清型(1-34和1/2)，其中，猪链球菌2型被认为是毒力最强、临床分离率最高的一种血清型(Wertheim HF et al.,Streptococcus suis:anemerging human pathogen.Clin Infect Dis 2009；48:617-25.)。能导致急性败血症及一系列炎症，比如脑膜炎、关节炎、支气管炎、心内膜炎等。自从1954年首次被报道，目前为止，猪链球菌致病的案例在30多个国家和地区均有发生，中国曾经有过多次猪链球菌病大爆发，给养猪产业造成极大损失。猪链球菌在猪的呼吸道和扁桃体中具有很高的分离率，致病的季节性不强，全年都有可能发生，且病死率极高，即使是妊娠母猪也可带菌，多见于阴道和子宫，这将导致猪幼崽面临极大的感染风险。此外，自从1968年首次有报道人感染猪链球菌导致脑膜炎，目前有不少于1600个人感染病例(Feng Y et al.,Streptococcus suisinfection An emerging/reemerging challenge of bacterial infectious diseases？Virulence,2014,5(4):477-497.)，主要症状有化脓性脑膜炎、耳聋、运动功能紊乱等，更有甚者出现中毒休克样综合征，导致多脏器衰竭及死亡。人感染猪链球菌主要存在于北欧及东南亚的国家，中国国土庞大人口众多，且喜食猪肉，对猪的需求量巨大，因此，猪链球菌带来的危害也更大。

与抗菌药物相比，通过接种疫苗防治猪链球菌病是当前公认的有效的、可持续发展的方法。目前在临床上应用较多的是全菌灭活疫苗，但它存在一些瓶颈问题。第一，灭活疫苗缺乏部分有效组分，免疫效果受限。已有文献报道病原菌的部分重要毒力因子在体外培养时并不表达，只有在进入宿主体内才受到诱导表达，而这部分蛋白可能在感染过程中发挥重要作用并且是重要的免疫原性蛋白。第二，灭活疫苗一般需要通过多次免疫才能获得较好的免疫效果。第三，灭活疫苗中某些组分以及佐剂成分共同作用会导致动物产生全身的或局部的不良反应。随着猪链球菌病流行的日益严重，针对猪链球菌尤其是影响与危害最大的猪链球菌2型，制备一种新型、安全、有效的基因工程减毒活疫苗尤为重要。

荚膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)是猪链球菌公认的毒力因子，在抵抗免疫细胞的吞噬杀伤中发挥重要作用。学者们期望通过以猪链球菌荚膜缺失菌株研发减毒活疫苗，然而Wisselink HJ等发现无荚膜的猪链球菌制备活疫苗诱导的抗体水平较低，并且最后证明无荚膜菌株不能给猪提供保护力(Wisselink HJ et al.,Assessment ofprotective efficacy of live and killed vaccines based on a non-encapsulatedmutant of Streptococcus suis serot ype 2.Vet Microbiol.2002；84(1-2):155-68.)。此外，由于荚膜良好的免疫原性和反应原性，已有多位学者建立了以猪链球菌荚膜多糖为包被抗原的酶联免疫吸附方法(CPS-ELISA)(del Campo Sepúlveda EM et al.,Detectionof antibodies against Streptococcus suis capsular type 2using a purifiedcapsular polysaccharide antigen-based indirect ELISA.Vet Microb iol.1996；52(1-2):113-25.)，并且有公司生产了相应的酶联免疫吸附试剂盒。以上研究表明在猪链球菌疫苗和检测试剂盒的研发中应该充分考虑猪链球菌荚膜多糖的重要性，破坏猪链球菌的荚膜多糖将影响到疫苗的效果和在检测试剂盒中的应用。

然而，早期发现与猪链球菌致病性密切相关的部分毒力因子，却显著影响荚膜多糖的形成。例如：Li M和付忠琳等人发现SalK/R双组份系统的基因缺失株抵抗中性粒细胞杀伤的能力和毒力显著降低，同时发现该菌株不能形成荚膜，证明双组分调控系统SalK/R通过调控荚膜的形成来抵抗免疫细胞的吞噬杀伤(Li M et al.,SalK/SalR,a Two-Component Si gnal Transduction System,Is Essential for Full Virulence ofHighly Invasive Streptococcus suis Serotype 2.PloS ONE，2008；3(5):e2080.)(付忠琳等，2型猪链球菌双组分调控系统SalK/SalR抗吞噬机制的初步研究，细胞与分子免疫学杂志，2013第(29)卷第(6)期570-573页)。有学者发现新型毒力因子HP0197通过减少荚膜多糖的形成，降低猪链球菌的抗吞噬杀伤能力和致病力(Zhang A et al.,HP0197contributes to CPS synthesis and the virulence of Streptococcus suisvia CcpA.PLoS One,2012,7(11):e50987)。综上所述，尽管以上毒力因子对应的基因缺失株毒力显著降低，却导致猪链球菌的重要抗原——荚膜多糖消失或含量降低，一定程度上限制了这些基因缺失株在基因工程减毒疫苗上的进一步应用。此外，也限制了该类基因工程缺失株在检测试剂盒中的应用。

因此，获得一种能荚膜多糖正常表达的减毒菌株在猪链球菌基因工程减毒活疫苗的研发中显得尤其重要。为实现以上目标，可通过设计并构建一种降低猪链球菌免疫逃逸能力并且不影响猪链球菌荚膜多糖合成的减毒菌株实现，这也是本申请的重要创新点之一。

在宿主抵抗病原菌的感染中，中性粒细胞(Polymorphonuclear neutrophil)是免疫系统抵抗感染的第一道防线。当病原入侵造成感染时，中性粒细胞可以迅速向感染部位募集，对入侵的病原菌发挥吞噬杀伤和清除作用(Chabot-Roy G et al.,Phagocytosisand killing of St reptococcus suis by porcine neutrophils.Microb Pathog,2006；41(1):21-32.)。但是，猪链球菌具有免疫逃逸机制，能够逃避中性粒细胞的吞噬杀伤和清除作用。因此，如果能通过基因工程的方法缺失猪链球菌免疫逃逸相关基因，减弱甚至消除猪链球菌的免疫逃逸功能，不仅有助于宿主免疫系统在第一时间吞噬和清除猪链球菌，而且有助于免疫细胞快速递呈相关抗原，激活宿主的获得性免疫系统，使宿主得到免疫保护作用。经过研究和筛选，本研究通过缺失Sly、ScpA、SsnA、Fhb和SsadS 5个不影响猪链球菌荚膜多糖形成的基因来减弱猪链球菌的免疫逃逸作用。5个基因的基本功能如下：

猪链球菌溶血素(Sly)是很多毒力菌株生长过程中释放的一种分泌型蛋白，溶血素基因以单拷贝形式存在。溶血素是胆固醇结合类细胞毒素，其活性能被还原剂活化，被氧化剂和胆固醇抑制，被氧化剂抑制的活性遇到还原剂时可重新恢复。溶血素对红细胞的裂解能力具有物种特异性，人的O型红细胞对其最易感，其次是马、绵羊、牛、和猪的红细胞。溶血素对不同的宿主细胞都具有细胞毒性，如不同的上皮细胞系、微血管内皮细胞、巨噬细胞。溶血素在猪链球菌裂解和侵入寄主细胞的过程中起到了重要的作用(He Z et al.,Increased production of suilysin contributes to invasive infection of theStreptococcus suis strain 05Z YH33.Molecular Medicine Reports,2014,(10):2819-2826)。

猪链球菌中的C5a肽酶类似物(ScpA)被认为与脑膜炎有关，用重组的ScpA蛋白刺激巨噬细胞，结果表明可以刺激巨噬细胞分泌细胞因子IL-1β，IL-6，TNF-α，CXCL8andCCL5。而该蛋白灭活后仍然具有此功能，表明ScpA刺激巨噬细胞是通过非蛋白酶水解途径。特定激酶抑制剂实验表明，ScpA可能是通过促分裂原活化蛋白激酶信号转到途径起作用。有证据表明ScpA能够降解细胞因子CCL5。此外，ScpA能降解明胶，还可通过水解纤维蛋白原的的Aα链来阻止凝血酶的纤维蛋白的形成，还表现出对脑微血管内皮细胞毒性。缺少该基因后，猪链球菌在全血杀菌实验中表现出较高的敏感性，小鼠攻毒实验表明该基因缺失对毒力有较大影响。(Kaqawa TF et al.,Model for substrate interactions in C5apepti dase from Streptococcus pyogenes:A 1.9 A crystal structure of theactive form of ScpA..Journal of Molecular Biology,2008,386(3):754-772.)

分泌型核酸酶(SsnA)不仅在猪链球菌2型中有表达，而且在致病性猪链球菌血清型1-9都有表达。氨基酸序列分析发现，该核酸酶含有3个较为保守的序列，分别是一段编码35个氨基酸的信号肽序列、一段编码22个氨基酸的DNA结合区域以及一段革兰氏阳性菌细胞壁的特有基序。研究表明，SsnA在整个猪链球菌的生长过程中都表达。用SsnA制备的抗血清能中和SsnA的活性。利用核酸电泳和Western印迹分析菌株SX332和它的缺失株的亚细胞成分，表明SsnA存在于细胞壁上。分析了258株分离于猪表面(鼻拭子或上颚棉拭子)和猪的内部(关节、脑、其他内部器官)的猪链球菌，发现核酸酶的表达水平和分离的位置有密切的关系(P<0.001)，提示这可能是一种新型的毒力因子。(Michael C et al.,Inv estigationof a Novel DNase of Streptococcus suis Serotype 2.Infection and Immunity,2004,72(2):774-781.)

猪链球菌2型表面蛋白Fhb(H因子结合蛋白)，也是一种毒力因子，其在猪链球菌血清型1，2，4，7和9中显示出分子的多态性。Fhb具有2个富含脯氨酸重复序列和XPZ域，以及一个显示出很高的同源性的重复序列。Fhb能够聚集人血清中的补体负调节子hFH，抑制补体替代途径的活化，从而增强猪链球菌在血中存活及抗吞噬的能力。Fhb除了结合hF H外，还能与补体蛋白C3b、C3d相互作用。故Fhb是一个重要的表面蛋白有助于猪链球菌毒力，在逃避宿主固有免疫系统的杀伤中具有重要的作用。(Pian Y et al.,Fhb,a Novel Factor H-Binding Surface Protein,Contributes to the Antiphagocytic Ability andVirulence of Streptococcus suis.Infection and Immunity,2012,80(7):2402-2413.)

SsadS是猪链球菌2型的腺苷合成酶。它能通过合成腺苷来抑制中性粒细胞的活力，进而帮助猪链球菌2型逃脱吞噬清除。SsadS可能在人体血液中通过A2a受体减少氧化活性及中性粒细胞脱粒，进而影响中性粒细胞对猪链球菌2型的防御。此外，这种酶缺陷型突变体被发现在仔猪感染模型中其毒力减弱。故SsadS在猪链球菌2型逃逸人类先天免疫中起着重要作用。(Liu P et al.,Streptococcus suis Adenosine Synthase Functions asan Effector in Evasion of PMN-mediated.The Journal of Infectious Diseases,2014,210(1):35-45.)

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的是在于提供了一种猪链球菌2型五基因缺失株，在猪链球菌2型强毒力分离株SC19的基础上，利用同源重组和反向筛选技术，获得猪链球菌ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS五基因缺失株(CCTCC NO:M 2015033)，该菌株毒力低，安全性高、免疫原性好，保护力高。

本发明第二个目的是在于提供了一种猪链球菌2型五基因缺失株在制备治疗或预防猪链球菌2型感染药物中的应用。

本发明第三个目的在于为快速检测猪链球菌的试剂盒提供一种全菌标准品。目前已有的猪链球菌酶联免疫吸附试剂盒主要以灭活菌体或者荚膜多糖作为包被抗原检测疑似感染动物的血清中是否存在猪链球菌的抗体，来判断动物是否曾经感染猪链球菌。本发明的五基因缺失突变株不影响猪链球菌荚膜多糖的合成，保持很高的免疫原性，可以作为一种标准品或一种包被抗原应用到快速检测试剂盒的生产中。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种猪链球菌2型五基因缺失株的制备方法如下：

1)设计引物分别扩增Sly基因、ScpA基因、SsnA基因、Fhb基因和SsadS基因的上下同源臂，分别将其连接到自杀性质粒pSET4s上构建重组穿梭质粒。

2)先将连接有Sly基因上下同源臂的重组质粒电转化到猪链球菌2型强毒力分离株中，利用温度与反向筛选标记进行筛选，获得猪链球菌2型ΔSly单基因缺失株。

3)再向已获得的猪链球菌2型ΔSly单基因缺失株电转入连接有ScpA基因上下同源臂的重组质粒，同样利用温度与反向筛选标记筛选，获得猪链球菌2型ΔSlyΔScpA双基因缺失株。

4)如步骤(2)、(3)所述，再依次缺失SsnA基因、Fhb基因和SsadS基因，获得猪链球菌2型ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS五基因缺失株。

该猪链球菌2型五基因缺失株在形态学特性、培养特性及生理特性上与猪链球菌2型一致。该菌株于2015年1月12日送交至湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，分类命名：猪链球菌(Streptococcus suis)ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS，保藏编号为：CCTCC NO:M 2015033，地址：中国武汉武汉大学。

一种猪链球菌2型五基因缺失株在制备治疗或预防猪链球菌2型感染药物中的应用，应用过程如下：

本发明的猪链球菌2型五基因缺失株，缺失了五个已知的与猪链球菌毒力具有明显相关性的基因，且五个基因敲除之后，猪链球菌仍然保有完整的荚膜多糖，具有较高的免疫原性。由于本发明的毒力已经显著降低，可以作为活疫苗直接应用。当然，加之其具有较好的免疫原性，也可以作为传统的灭活疫苗配以传统佐剂加以使用，相较于用强毒株灭活制成的疫苗，用本发明的五基因缺失突变株制备的灭活疫苗可以有效避免传统灭活疫苗由于灭活不彻底而存在的风险，安全性更高。

与现有技术相比，本发明的效果和优点如下：

本发明是在猪链球菌2型强毒力株的基础上构建的猪链球菌2型ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS五基因缺失菌株，Sly基因、ScpA基因、SsnA基因、Fhb基因和SsadS基因缺失后其毒力大幅度下降，安全性高，不含有抗性筛选标记且遗传稳定，不存在毒力返强的风险。五基因缺失菌株形成荚膜多糖的能力正常，将该五基因缺失菌株制成减毒活疫苗后，免疫原性高，能够保护免疫猪抵抗猪链球菌2型强毒菌株的攻击，为有效控制我国猪链球菌病的发生与流行提供了有效的防治工具。

附图说明

图1为构建重组穿梭质粒的pSET4s载体图谱，该质粒具有两个复制起点，一个是在革兰氏阴性菌中起作用的ColE1ori，用于质粒的构建和克隆。另一个是在革兰氏阳性菌中起作用的orfC，用于基因的敲除。载体具有壮观霉素抗性，可作为筛选标记。

图2为pSET4s-Sly重组质粒酶切鉴定图，泳道1-4为四个不同的克隆。

图3为pSET4s-ScpA重组质粒酶切鉴定图，泳道1-3分别为上游、下游、上下游整体片段的酶切。

图4为pSET4s-SsnA重组质粒酶切鉴定图，泳道1-3分别为上游、下游、上下游整体片段的酶切。

图5为pSET4s-Fhb重组质粒酶切鉴定图，泳道1-3分别为上游、下游、上下游整体片段的酶切。

图6为pSET4s-SsadS重组质粒酶切鉴定图，泳道1-2为四个不同的克隆。

图7为本发明实施例1中的的猪链球菌2型五基因缺失株的PCR鉴定结果示意图。其中M1：DNA marker(DL15000)；M2：DNAmarker(DL2000)；泳道1、3，用Sly基因的外部引物对进行扩增；泳道2、4，用Sly基因的内部引物对进行扩增；泳道5、7，用ScpA基因的外部引物对进行扩增；泳道6、8，用ScpA基因的内部引物对进行扩增；泳道9、11，用Ssn A基因的外部引物对进行扩增；泳道10、12，用SsnA基因的内部引物对进行扩增；泳道13、15，用Fhb基因的外部引物对进行扩增；泳道14、16，用Fhb基因的内部引物对进行扩增；泳道17、19，用SsadS基因的外部引物对进行扩增；泳道18、20，用SsadS基因的内部引物对进行扩增；泳道1、2、5、6、9、10、13、14、17、18：模板为猪链球菌2型强毒力分离株SC19；泳道3、4、7、8、11、12、15、16、19、20：模板为五基因缺失猪链球菌2型菌株。

图8为本发明实施例1中的的猪链球菌2型五基因缺失株连续传15代后的PCR鉴定结果示意图。泳道1、2，用Sly基因的内部引物对进行扩增；泳道3、4，用ScpA基因的内部引物对进行扩增；泳道5、6，用SsnA基因的内部引物对进行扩增；泳道7、8，用Fhb基因的内部引物对进行扩增；泳道9、10，用SsadS基因的内部引物对进行扩增；泳道1、3、5、7、9模板为猪链球菌2型强毒力分离株SC19；泳道2、4、6、8、10模板为五基因缺失猪链球菌2型菌株。

图9为本发明的猪链球菌2型五基因缺失株与猪链球菌2型强毒力分离株SC19的生长曲线示意图，生长无明显差异。

图10为透射电镜下观察本发明的猪链球菌2型五基因缺失株(10A)与猪链球菌2型强毒力分离株SC19(10B)。

结果显示本发明的提供的基因缺失株细胞形态和荚膜多糖正常。

图11为将猪链球菌2型五基因缺失株与猪链球菌2型强毒力分离株SC19作为全菌包被抗原应用猪链球菌2型阳性感染血清进行ELISA抗原性检测图。

结果显示，本发明提供的基因缺失株的反应原性与亲本菌株相似。

图12为五基因缺失突变株与SC19菌株的人全血杀菌实验。

结果显示本发明提供的基因缺失株在血液中的存活能力显著下降。

图13为本发明的猪链球菌2型五基因缺失株毒力检验的仔猪实验示意图。

结果显示，本发明提供的基因缺失株毒力显著降低。

图14为经本发明的猪链球菌2型五基因缺失株免疫小鼠后血清抗体产生情况鉴定图。

结果显示，免疫本发明提供的基因缺失株后能有效诱导抗体。

图15为经本发明的猪链球菌2型五基因缺失株免疫猪仔后血清抗体产生情况鉴定图。

结果显示，免疫本发明提供的基因缺失株能有效诱导抗体。

图16为经本发明的猪链球菌2型五基因缺失株免疫后强毒株攻击猪仔的存活情况示意图。

结果显示，本发明提供的基因缺失株作为减毒疫苗免疫动物后能有效抵抗感染。

图17为本发明的猪链球菌2型五基因缺失株免疫后强毒株攻击猪仔体温变化统计。

结果显示，本发明提供的基因缺失株作为减毒疫苗免疫动物后能有效抵抗感染。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：

猪链球菌(Streptococcus suis)ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS的获得：

1)引物设计：

根据GenBank上公布的猪链球菌2型05ZYH33株全基因组GB|CP000407.1|设计引物)，从猪链球菌2型野生菌SC19(该菌株2005年5月分离自四川省猪链球菌病中的一头病猪，是具有代表性的强毒力菌株，具有MRP+EF+SLY+表型；参见文献Li W，Liu L，Qiu D，ChenH and Zhou R.Identification of Streptococcus suis serotype 2genespreferential exp ressed in the natural host.Int JMed Microb，2010，300：482-488)基因组中分别扩增Sly基因(SEQ ID NO.1所示)、ScpA基因(SEQ ID NO.2所示)、SsnA基因(SEQ ID NO.3所示)、Fhb基因(SEQ ID NO.4所示)和SsadS基因(SEQ ID NO.5所示)的上游同源臂和下游同源臂。同时设计位于基因两侧的引物对和位于基因内部的引物对，用于筛选鉴定基因缺失突变株。引物序列与目的片段长度、相关酶切位点见表1-表4。上述引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1.各基因上游同源臂扩增引物及片段长度、酶切位点列表

表2.各基因下游同源臂扩增引物及片段长度、酶切位点列表

表3.各基因内部引物及目的片段长度

表4.各基因外部引物及目的片段长度

2)各基因重组转移质粒的构建：

分别用上下游同源臂引物对从猪链球菌2型强毒力分离株基因组中分别扩增Sly基因、ScpA基因、SsnA基因、Fhb基因和SsadS基因的上下游同源臂。用0.8％琼脂糖凝胶(即琼脂糖：TAE缓冲液＝8:1000)电泳检测扩增结果。扩增结果正确，则纯化回收目的片段。以构建连接有Fhb基因上下游同源臂的重组质粒pSET4s-Fhb为例讲述其构建过程。纯化的Fhb基因上游同源臂扩增产物，经HindⅢ和Sal Ⅰ双酶切后直接连接到经相同双酶切的质粒pSET4s HindⅢ和Sal Ⅰ位点上，获得的带有Fhb基因上游同源臂的重组质粒(pSET4s-Fhb)，经酶切证实构建正确。随后将纯化的Fhb基因下游同源臂扩增产物用Sal Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切后连接到所构建的质粒pSET4s-Fhb的Sal Ⅰ和BamH Ⅰ位点。连接有Fhb基因上下游同源臂的重组质粒经HindIII和BamH Ⅰ双酶切证实构建正确，测序证实无碱基误配，将获得的质粒命名为pSET4s-Fhb(图5)。质粒的重组、制备、酶切分析均按常规方法进行。以上述同样的方法，构建重组质粒pSET4s-Sly，pSET4s-ScpA，pSET4s-SsnA和pSET4s-SsadS。(图2、3、4、6)

3)猪链球菌2型五基因缺失菌株的构建、筛选与鉴定：

申请人构建和筛选缺失株是利用反向筛选标记通过重组质粒与菌株基因组间的两步单交换同源重组的方法实现的。这种方法可以重复使用来构建多基因突变株，且不会留下任何筛选标记。

参照DaisukeTakamatsu博士报道的方法(DaisukeTetal,ConstructionandcharacterizationofSt reptococcussuis-Escherichiacolishuttlecloningvectors.Plasmid,2001,45:101-113)，在强毒力分离株SC19的基础上，依次缺失Sly基因、ScpA基因、SsnA基因、Fhb基因和SsadS基因获得ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS五基因缺失猪链球菌2型菌株。

利用各基因的内部引物对(表3)和外部引物对(表4)对筛选得到的猪链球菌2型ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS五基因缺失株进行PCR扩增。若是缺失株，则内部引物对扩增Sly基因、ScpA基因、SsnA基因、Fhb基因和SsadS基因结果应为阴性，外部引物对扩增Sly基因、ScpA基因、SsnA基因、Fhb基因和SsadS基因将分别得到786bp、554bp、627bp、1178bp和721bp的条带；若是野生株，则内部引物对扩增Sly基因、ScpA基因、SsnA基因、Fhb基因和SsadS基因将分别得到608bp、513bp、526bp、717bp和721bp的条带，外部引物对扩增Sly基因、ScpA基因、SsnA基因、Fhb基因和SsadS基因将分别得到2280bp、2053bp、1453bp、3233bp和2887bp的条带。电泳检测PCR扩增结果证实猪链球菌2型ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS五基因缺失株构建成功(图7)。

将猪链球菌2型ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS五基因缺失株于含有10％新生牛血清的TSA(TrypticSoy Agar购至美国BD公司)平皿上连续传代，一共传15代，第15代挑取单菌落于2ml含10％的新生牛血清的TSB液体培养基中37℃振荡培养，用5个基因的内部引物(表3)对其进行PCR扩增，结果均没有扩出条带，而对应的阳性对照均扩出了预期大小的条带(图8)，说明猪链球菌2型ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS五基因缺失株在体外培养基中连传15代是稳定的。

该菌株于2015年1月12日送交至湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，分类命名：猪链球菌(Streptococcus suis)ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS，保藏编号为：CCTCC NO:M 2015033，地址：中国武汉武汉大学。

实施例2：

猪链球菌(Streptococcus suis)ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS的特性:

将猪链球菌2型分离菌株SC19和猪链球菌(Streptococcus suis)ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS分别接种于5mL含有10％新生牛血清的TSB培养基中培养，37℃培养，并于培养后每间隔一小时分别取100μL菌液测定OD₆₀₀值，绘制生长曲线，如图9所示。由图9可知，猪链球菌ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS和猪链球菌2型分离菌株SC19的生长曲线无显著差异，表明缺失的五个基因的缺失并不影响猪链球菌ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS的生长。

在电镜下观察猪链球菌ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS(图10A)和猪链球菌2型分离菌株SC19(图10B)，两者形态并无显著差异，且均形成了正常的细菌形态，细胞壁和荚膜，表明本发明的五基因缺失株并不影响猪链球菌的荚膜形成，而荚膜及荚膜上的蛋白是已知的重要保护性抗原，这是本基因缺失株具有较高免疫原性的结构基础。

为进一步证实本发明的五基因缺失突变株具备成为减毒活疫苗或标准品的基本特性，特对其反应原性进行检测。应用间接ELISA的方法，将猪链球菌ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS和猪链球菌2型分离菌株SC19分别作为全菌包被抗原，用猪链球菌2型感染阳性血清进行检测，并与荚膜多糖包被抗原进行比较，以反映本发明的五基因缺失突变株的抗原性。包被的全菌抗原浓度为1×10⁸CFU/mL，每孔包被100μL。结果如图11所示。由图11可知，阳性血清可以有效识别本发明的五基因缺失株，其反应原性较于分离株SC19并无差异，且全菌包被抗原的检测效果优于荚膜多糖包被抗原，表明本发明可以作为标准品或包被抗原应用到快速检测试剂盒的研制中。

取10⁸对数生长期的SC19菌株和ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS菌株，6000rpm离心5min收集菌体，用无菌PBS洗涤两次后重悬，稀释至5×10⁴CFU/mL，取50μL菌液与450μL人新鲜血液混合，并放置于静音混合器中缓慢转动，置于37℃条件下培养。分别于0min、60min、120min、180min取100μL适当稀释后涂TSA+10％小牛血清平板，37℃培养24h计数。存活比例＝各个时间段菌落数/原始菌落数×100％。统计结果见图12，由图12可知，五缺失突变株在人全血中的存活效率显著降低，表明其抵抗吞噬和杀伤等机体固有免疫防御的能力明显下降。

实施例3：

猪链球菌(Streptococcus suis)ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS安全性：

取单菌落培养至10⁸对数生长期的实施例1制备的的ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS五基因缺失猪链球菌2型菌株(本发明或简称5Δ)菌液和猪链球菌2型地方分离菌株SC19菌液，6000rpm离心5min收集菌体，用无菌PBS洗涤两次后重悬备用。经腹腔注射进行六周龄雌性BALB/c小鼠动物实验，SC19菌株分为两个剂量组，分别为2×10⁸cfu/只，5×10⁸cfu/只；五基因缺失株分为三个剂量组，分别为2×10⁸cfu/只，5×10⁸cfu/只，1×10⁹cfu/只。每个剂量组10只小鼠，每只小鼠接种200μL。每天观察小鼠的临床表现，统计存活情况。共观察14天，数据记录见表5，由表5可知，用SC19菌液攻毒小鼠时，低剂量组和高剂量组小鼠死亡率均达到了100％。而用五基因缺失株注射小鼠，低中高三个剂量组小鼠均全部存活。由此表明，本发明的ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS五基因缺失猪链球菌2型菌株较猪链球菌2型地方分离菌株SC19毒力有显著的下降，对小鼠是安全的。

表5 猪链球菌2型五基因缺失株毒力检验的小鼠实验数据。

注：表中X/Y表示存活率，Y表示该组共有实验动物数，X表示统计时的存活数。

通过小鼠实验初步确定五基因缺失突变株的安全性之后，进行猪实验验证。用单菌落培养的实施例1制备的猪链球菌(Streptococcus suis)ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS菌液和猪链球菌2型分离菌株SC19菌液，PBS洗涤后重悬，静脉注射35日龄猪链球菌阴性健康猪仔，剂量为1×10⁸cfu/只。每个剂量组6头猪仔，每头猪仔注射1mL。于攻毒后观察猪仔的临床表现，并统计存活情况，共观察14天。在整个观察期内，接种SC19菌株的猪仔表现出典型的猪链球菌感染临床症状：体温升高、食欲不振、嗜睡、乏力、皮肤红肿、关节跛行等。而接种五基因缺失突变株的猪仔，未出现任何不良反应，统计见图13。由图13可知，SC19分离株攻毒的猪仔，死亡率达到了100％。而用五基因缺失株攻毒的猪仔全部存活。由此表明，本发明的猪链球菌(Streptococcus suis)ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS较分离菌株SC19毒力有显著的下降，对猪是安全的。

实施例4：

猪链球菌(Streptococcus suis)ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS的保护性：

实验采用六周龄雌性BALB/c小鼠，共分为5组，分别为免疫组1、免疫组2、免疫组3、非免疫组、空白对照组。其中空白对照组5只小鼠，其余各组10只小鼠。免疫组1、2、3经腹腔注射无菌PBS重悬的猪链球菌ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS免疫小鼠，剂量分别为5×10⁵CFU/只、5×10⁶CFU/只、5×10⁷CFU/只(200μL)；非免疫攻毒组同等体积的PBS溶液，空白对照组不作任何处理。14天后，再次免疫小鼠，操作同第一次免疫。

第二次免疫后14天，经尾静脉采血分离血清，分离血清后用武汉科前动物生物制品有限责任公司生产的猪链球菌ELISA抗体检测试剂盒测定血清抗体水平，如果样品OD630nm值≥0.35，判为阳性；如果样品OD630nm值＜0.35，则判为阴性，经鉴定，三个免疫组小鼠均显示为抗体阳性，表明经免疫后小鼠产生了较高的抗体水平，可进行强毒力分离株SC19攻毒实验。

实验小鼠经腹腔注射无菌PBS重悬的猪链球菌2型分离菌株SC19，剂量为2×10⁸CFU/只(200μL)，观察14天。实验结果见表6。由表6可知，非免疫攻毒组和空白对照组小鼠全部死亡，中高免疫剂量的免疫组2和3免疫保护率达到了100％，低免疫剂量的免疫组1小鼠免疫保护率也达到了80％。表明本发明的基因缺失株作为减毒疫苗免疫动物后能有效抵抗感染。

表6 猪链球菌2型五基因缺失株梯度免疫后强毒株攻击小鼠的存活数据统计

注：表中存活情况统计数据表示统计当天小组存活的动物数。

根据小鼠免疫剂量梯度实验，下一步将免疫剂量调整为1×10⁷CFU/只，攻毒剂量进行梯度设定，以确定该减毒活疫苗的免疫保护效率。实验采用六周龄雌性BALB/c小鼠，共分为4组，分别为免疫组1、免疫组2、免疫组3、非免疫组。各组8只小鼠。免疫组1、2、3经腹腔注射无菌PBS重悬的猪链球菌ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS免疫小鼠，剂量为1×10⁷CFU/只(200μL)；非免疫攻毒组同等体积的PBS溶液。14天后，再次免疫小鼠，操作同第一次免疫。

第二次免疫后14天，经尾静脉采血分离血清，分离血清后用武汉科前动物生物制品有限责任公司生产的猪链球菌ELISA抗体检测试剂盒测定血清抗体水平，经鉴定，免疫后小鼠产生了较高的抗体水平(图14)，可进行强毒力分离株SC19攻毒实验。

实验小鼠经腹腔注射无菌PBS重悬的猪链球菌2型分离菌株SC19，三个免疫组剂量分别为5×10⁸CFU/只、1×10⁹CFU/只、5×10⁹CFU/只，非免疫组为5×10⁸CFU/只(200μL)，观察14天。实验结果见表7。由表7可知，非免疫攻毒组小鼠全部死亡，免疫组小鼠在5×10⁸CFU/只、1×10⁹CFU/只攻毒剂量下保护力达到了100％，5×10⁹CFU/只剂量下保护力达到了75％。表明本发明的五基因缺失突变株在毒力减弱的前提下仍然具有很高的免疫原性，能够给小鼠提供强有力的保护以抵抗强毒菌株的攻击。

表7 猪链球菌2型五基因缺失株免疫后梯度强毒株攻击小鼠的存活数据统计。

注：表中存活情况统计数据表示统计当天小组存活的动物数。

在小鼠实验初步确定本发明的五基因缺失突变株具有很高的免疫原性后，进行猪实验验证。

将18只猪链球菌为阴性的35日龄仔猪分为2组，免疫组和非免疫组各8只，空白2只。免疫组经颈部肌肉注射无菌PBS重悬的五基因缺失突变株，剂量为5×10⁶CFU/只，注射体积为1mL；非免疫攻毒组同等体积的PBS溶液，空白对照组不作任何处理。14天后，再次免疫，操作同第一次免疫。第二次免疫后14天通过前腔静脉采血分离血清，分离血清后用武汉科前动物生物制品有限责任公司生产的猪链球菌CPS ELISA抗体检测试剂盒检测血清抗体水平，如果样品OD630nm值≥0.35，判为阳性；如果样品OD630nm值＜0.35，则判为阴性，结果见图15。由图15可知，经免疫后猪仔产生了较高的抗体水平，可进行强毒力分离株SC19攻毒实验。

第二次免疫后14天，免疫组和非免疫组猪仔均通过静脉注射无菌PBS重悬的SC19强毒力菌株，剂量为5×10⁵CFU/只，体积为1mL，攻毒后观察14天，统计存活情况，实验结果见图16。由图16可知，非免疫组猪仔在观察期内全部死亡，而免疫组猪仔在观察期内全部存活，虽然有短暂的体温上升现象(图17)，随后即恢复正常，无其他不良反应。

非免疫攻毒组除出现体温升高、食欲不振、嗜睡、乏力、皮肤红肿、关节跛行等外在病症之外，剖杀后该组猪仔的各个器官也出现了不同程度的病变，如肝区坏死，脾脏肿大，呼吸道及肺部充血肿胀，脑膜及心包积液，关节出现脓性渗出等，而免疫攻毒组和空白对照组均未出现组织病变。

猪仔免疫保护力实验表明本发明的五基因缺失突变株在毒力减弱的前提下仍然具有很高的免疫原性，能够给猪仔提供强有力的保护以抵抗强毒菌株的攻击。

SEQUENCE LISTING

<110> 华中农业大学

<120> 一种猪链球菌2型五基因缺失株及应用

<130> 一种猪链球菌2型五基因缺失株及应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1494

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型（Streptococcus suis Serotype 2，S. suis 2）

<400> 1

ttactctatc acctcatccg catactgtgg gtataacgtt gttccccaga tggttatttt 60

acgttgacca acaagtggta aatctttgtc ataaactgtt ctccaccact cccatgctaa 120

tcctgtacat tcttgaatat tgacatgaag attgcgagca tttcctggaa tttgaatggt 180

ttcactccag tgtgaggtca gatttacacc attcttatcc caagcttttg gttcccaaac 240

ttcttctcca gcttcattgt aagatacttc ttcccaagta atgttgtatt tcgcaacata 300

agcacctgaa tgatccaatg tcaatgcact gctattatgg actgttgaag ttgtttctat 360

gtactctgaa ttgctcaaaa tctgagcagg tctattgtct ttgacaaagt tggttgaata 420

cgaaatcgga acacctggat tgagttttcc gtatcttgca ccttcttcaa taatcttctt 480

cagtgtttca atatttccgc tcacaacagt agccgcgcta cctgcatccc caccaaaaat 540

ataagcagag aatgaagtat ttttcagaat gtcttgatac tcagcattgc cactaatatc 600

aacgcctttg atggctgctt taaatgcggc ttgaacttgg gtactcctac tgctagtttc 660

taacttgatg aacatagagc gtccataaga aacgctggaa acataaacag gaggtacctc 720

atctgttatc ccatttcgtt tcaaatcttc tacagttgtc ccttctgcaa aaagcttgct 780

tggagattct ggttcatcaa cactaactgt ataataaatt tgtttaaagt taacaatctg 840

aacctgtttt tcacccgaat tcacggcatc aaaattgata tctaatggta cagcaatttt 900

ttcaaaagag gttccgaact tcgttttcaa ttgtgacata ctgtatgcca ttgtttcatc 960

atattgaagc tctgcttggg tattgccata ctctccagca tacgtattat tccatttaga 1020

cagaaggtta ttcacccctg ttcgaacagt acttcttgtt ggagaattta caacagtgtg 1080

gctatcccca ttggccaaac caggtaaatt caaactaagc gtcagatctc cccgcgcaat 1140

actgataagc gttggattat tatccagaag attttggtca gcacgcaata aagcacctgg 1200

ataaatattt gcagccttag catcaataac agcaatatct gcactattgt tcgtaatatt 1260

cttcttttct ctgcgaagta ctacaaaacg tccgttttct aacataccag ttgttgctgg 1320

cggattatca atgtattctc cctcatttgt aagaatctct tgtggctcgt aagtcaagct 1380

ttgaaaatac tgattaatat cttgtttgga atctgcaaga acactcaatg gtgtgacccc 1440

tacgagtgcc aaactgacta ttgagcttaa aatcaagtgc gaactttttc tcat 1494

<210> 2

<211> 1450

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型（Streptococcus suis Serotype 2，S. suis 2）

<400> 2

caacactttc ccagctgaaa tagcaaagct tctttgttgg tttcccagat tttccaaggt 60

tacctcaaat tctgtctcac gccctatttc ttttaattcc acccctcctt ttagacggtg 120

gtgaagaatc acatctgttt caaaggctct atcaatctgc aacagaccag caccttgttg 180

tctcggagaa ttttccaaag catgcccaga tgaatctaga acatcaacca aaggggtagc 240

agtattcatc aaaatgattc tcagcaaatc catcctagtc atgccttctg gtggtgtcat 300

ttggcgaatc cgtggcaata aaagtgcgct ggcacccgcc acaattggcg aagccatcga 360

agtccctgac atggagccat aacgattgtc attcaaggtt gcataaacat cctctcccgg 420

cgccacaatc tctggcttca attctaagtt gaccgtaggt ccccaactag aaaagcctga 480

tacagtcggc acttcaatca acttcttcat tccaattgta ggtttaagaa ccaaaccagt 540

gttgccttgc gattggttgg caacttctaa taatcgcctt ccatcttccc cgctaagact 600

aattccccag atagaggagt aggaaagcaa agtcttatca tctaccaaca actgatgggt 660

cctataataa tccttgttcc atccctgatc agtatttatc acaataattc cagcaacatc 720

cttgaatttc aaattacgaa cagcatcttt caagtcaaac ttatcttttt tgataaccgc 780

tactttacca gccaaatcaa gcccttgcac ttcttcccaa tgaccatttc cagcatctac 840

aaattcatat tttccctctg taagcgttgt atagccaata ggatagtaac caaaagactg 900

tccattcagc ataaattctc gttgaacaag atgggtattt ctcgccgaac caaccgcgat 960

aactgcggga gtcgctgcta caccaactgt tgttgccgta tccacagctc ctaaggcatt 1020

atttgtatgc aggtcaaagg aggtgtctga agaggaggca ccagcattac caatagccgc 1080

tgtaatgata attccctttt ctgctgccct cttagcaatc gtgtagtaag cattccctgg 1140

tagcccgcta tcataataac caacactcaa gctgatgaca tctgccccgt gtttgatagc 1200

atcttcaata gcagcataag cagcatcctc cgtctcagct ttataatttt tagggtcatt 1260

tgaaaaaatc ttgtagacta gcagttgtgc gttgggagca atcccatcaa ctcccttttt 1320

agacgcaact tcttcgtctg ttgcatttcc agccagagtt cctgctatgt gcataccatg 1380

tggttcgtgg gtatcataat gtgtatgtcc ctgtcgtaga tggagtaatg tccttaattt 1440

taggaatgac 1450

<210> 3

<211> 3119

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型（Streptococcus suis Serotype 2，S. suis 2）

<400> 3

atgaagatta gaaaccgttc tctcttctat accgtaggtt ctgtagcggt aacagccgga 60

ctcttgctta gtcttgctac ttcgcccata ccatctgtgc acgctactga agtggcgata 120

gagaattatc cgtcacttgc aataaccaag tcggaagtca cgatacaagg ctatcttatt 180

gcaccactta atagtagcgg aactgctttt gacgccacta acaaaacaaa tctagccctt 240

ggtgcaagca tggatactgc ggcagccgac actatcccta ttcaactaaa agaacctctt 300

cgtagccaat tcaacctcgt taatcatccc gaactagtcg gaaaattggt tcgcatcaca 360

ggaactagcg atacatacat gaagcgagct gggatcaaac cagctacagc gattgaaatc 420

gtagattcat cttctactaa tgttcagcca ccaacaagtg aaaatacagc taccaaacca 480

agtgaccttg tttctacacc gattgctact gttcgttccg gagcacaagg aacagagtac 540

acagtttctg gtaaaattat tagcctagta aacggttggg gaggaaatgg tttttacctc 600

cagggttctg acggtgctgg tatctatatc tacccagggg ctgccttggg ctatcagctt 660

ggtgatacag tccaattaac aggaacattg ggtgagtata aaggcgaact ccaactaacc 720

acagttagca accacaaggc tatctctgag aatttcaaca ctcctattac agaaacaaac 780

atcgctcagt tagcaacgca agcacaggca acactagttt ctctaaaaaa cttgactgtc 840

ggagatattc aaagcgatag ctatcaaaat tctaccttta ccgtaactga ctccgaagga 900

caaactgttg atgtacgctt agatagccga acaggcatca aaacggcgga tcttttgaac 960

cggatcaaca agggagataa gattaatcta accgctattt tatccaccta taacggaaaa 1020

atacaattaa aaccatttga cctctctcat tttgaagtca ttgaaaaggc aacgacggaa 1080

gcaggactag gaaagaccga agctgtaaca gtcggtcgca ttcaaggtgc aagtcaccag 1140

tcacctctgg tgaatcaatc tgttatgctt aaaaatgtcg tagtaaccta cgttacctct 1200

gccaataact tctacgtgca agatgtcaca ccagatggag acaccaaaac atctgacggc 1260

attaacatct ttactgacaa attaaaaaca aatgtcaagg taggagatct tgtcactatc 1320

gcaggacgag tagaagaata ccagggcaga gggtatgctg aacgtgacaa aacagactta 1380

accatcacac aaattcgagc tactgaagta actgtggatg ggactgcacc tgtaccatct 1440

cctatagtcc tcggtcttga tcggactatc ccagcagata ttattgacaa cgacggtttg 1500

gctcaatttg atccagaaca agatgcgctc gatttctggg aatccgttga aggcatggtg 1560

gttgccgtgg atgatgcaaa aatccttggc ccactaaaaa acaaggaaat ctatgtcact 1620

cctgccacta gtcaacttcc tttaaataat gttggaggcg tcaaccttcg ccctgaaggg 1680

aataatacca atatcattcc acttcttttg aaaaatggaa aacaaatcgt caaatcagga 1740

gactatttca tcggtcgtat cgctggacca gtcacctact cttacaccaa ttataaagtc 1800

tatgtagatg atagcaccct tccaacattg cacgaaggag ctacaaaacc agaaacaaca 1860

accattatcc caaatgatga caagctgact atcgcttctt ataacattga aaacttctct 1920

gctaatagta agtcaacatc agacgctaaa gtccaacgca ttgccaaatc ctttgtttca 1980

gacctacatt ctccagagtt atcggattga ttgaagtgca ggacaacaac ggtgctacaa 2040

acgacggcac aactgatgct agtaagagtg ctgaacgcct gattgcagcc attcaagcag 2100

ccggcggacc aacctatacc tatgtagaca ttgctcctga aaacaacaaa gacggcggac 2160

aagagggagg caatattcgc gtcggcttcc tctacaactc aaaacgtgtc agcctatctg 2220

acaaaccaat cggtaccgca acacaggcag ttgcatggga aaacggcgaa ctcaatctca 2280

gcctaggccg aatcgaccca accaaccctg cttgggcagc tgtccgcaaa acacttgcag 2340

ctgaattcgt cttcaaaggc gagaaagtcg ttgtccttgc caaccatctc aactcaaaac 2400

gcggtgacaa tggtctctac ggaaaaatcc aacctgtcag cttcaagtcc gaagaaaaac 2460

gccacatact agcacaaact atcgctgact ttacaaaagc aggcttagct caaaatccaa 2520

atgctaatat cgttatgcta ggcgacttca atgactatga atttactaaa accatagaaa 2580

ttttagaagc aggaggaatg gctaacctcg ttagtcgtca cgatgcatcc gatcgcttct 2640

cttacttcta taacggaaat aatcagtctc ttgacaatat gctagtatca actaacttgt 2700

tggagcgcta tgcctttgat atggtccatg tcaattcagc ctttatggaa gaacatggca 2760

gagcttctga ccacgatcca ctattggtac aactggatgt gacaaaggca caagaaccaa 2820

ctcaaccaga accaagcgac aagcagacag atgactcagg aacagtcaat aatagtgatg 2880

acaatggtac gaccaacaat aacaagccaa caaatctttc aacttctaat caaacagctg 2940

taaatgctga tgaccgttct ggcgctacag acaagagaca aacaaccgtg acccctactg 3000

ccaacaacag tcaaaagaaa atccttccaa agacaggagg agaaacaagc tttgtactta 3060

tcacaatcgg tctcgtattc ttgagcgcct gtcttgtcaa aaaacaaaaa gaatcctaa 3119

<210> 4

<211> 2055

<212> DNA

<213> 猪链球菌2型（Streptococcus suis Serotype 2，S. suis 2）

<400> 4

atgagcaagc agaaagttgt gtccagttta ttattaagca cagtcgtatt agggggatta 60

gccttttatt caacgacaac ggttaaagca gaatcgctag aaccagatgt tacatcagtt 120

aatgcaagcg atgctactaa taaaccggta gtaccaaatg aagagggagg cgacttttta 180

gctgaagagg agcttgaaga tgatgacact ttggaagaag aattaaatga gaaagccgaa 240

gaggttactg agccatcttc acctgaagca cttctccaac ctcgtgcgat gatgagtgat 300

tctgaaacta gtggtatgga agaaattccg atgaatgatg aaccttcaga taatacggaa 360

gaaaaggtag agaagcaaca gtcgccatta attcaaacct caaatgcaga ttataaaagt 420

ggtaaagatc aagagaaact taggacatca gtatctataa atctgttgaa ggcggaagaa 480

ggtcagattc agtggaaagt aacttttgat acaagcgaat ggtcttttaa tgttaaacat 540

gggggtgttt attttattct tccaaatggt ttggacttaa caaagattgt tgataataat 600

caacatgata taacagcctc cttccctacg gatattaatg attacagaaa ttctggtcaa 660

gaaaaatatc gtttctttag tagtaaacaa ggtcttgaca acgaaaatgg ttttaattct 720

caatggaact ggtctgctgg tcaagctaat cctagtgaaa cagtaaacag ttggaaatca 780

ggcaatcgtt tgtctaagat ttatttcata aatcaaataa cagatactac cgaattgacc 840

tatactttaa ctgctaaggt aactgaacca aatcagcaat cattccctct tctggcagtg 900

atgaagagct ttacgtatac aaactctaag agtacagagg ttacttcgct aggtgcacgt 960

gagattaccc ttgagaaaga aaaaactcta ccacctaagg agaatccaaa accagagcca 1020

gaagctccaa aaccagacgc tccacaagcg ccatcagcac cggaatctcc aacggaagaa 1080

cctaagaagg aagacgctcc agcgccatcg actccggaaa aacaaccaga agtaccggaa 1140

tcaccaaacc cagagacacc agacgcgcca tcgactccaa aagatgagcc gcaagttcca 1200

tcaatcccag aggagcaacc aaaagagact ccagcgccag aagaacctaa gaaggaagat 1260

actccgcaaa caccacaagc gccatcaact cctaaagagg aagcaccgaa ggaagaagtt 1320

ccaacaccac cggctccatc agtaccagaa gagcaaccaa aagaaactcc aacaccagaa 1380

gttccaaaac aagaagatgt tcaaccggaa gcgccaaaat ctgataaagt agaatctgac 1440

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aaggaacaaa agccgaaagc cgacgagcca aaggcagagc aaccacaaat ggacaaacca 1560

caaatggaag ctcctaagaa agattcggaa gcgccaaaat ctgataaagt agaaactgac 1620

aagcaattgc cagaaactaa gcaaccagat atgaagcaac cgaaggcaga cgacatgcct 1680

aaggaacaaa aaccgaaagc cgacgagcca aaggcagagc aaccacaaat ggacaaacca 1740

caaatggaag ctcctaagaa agattcggaa gcaccaaaat ctgataaagt agaaactgac 1800

aaaccaatgc cagaaactaa acaaccagat atgaagcaac cgaaggcaga taaaccagaa 1860

gcagagaaag ctcaaatgcc acggacagag ggtatgaagc ctgaatctaa ggcttcaatg 1920

atgccaaaag cagaggcacc aaaagcaact ttgccaaata caggcgaagc aagtagcgca 1980

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 猪链球菌2型（Streptococcus suis Serotype 2，S. suis 2）

<400> 5

ttaattttct tttctacgac ctactgccac ggccagtcct gcaagaccta aaccaaacag 60

gctgagcgtc agattcatct gatcaccagt atttggcaag actcctgctt ttgtagtttt 120

tgctggactt gctacttctg tttttttatc tcctactttc ggagaatcaa ctggggcctt 180

cttgtccgtt gctgaagtat tttgtacttg attagatggt gaatccgtat tttcggctgg 240

aacagtttct ggatttgagg ctggattttc tggatcagta tccaataaaa tttcgataaa 300

gtctgggtag ccatcttcat ccgtatcaat gcttgaattt acaggaatga tacgtgaata 360

tgggttgaca acctcataag ctgataagtc agctgtcttt aggtattcag caaagacgct 420

gtccattgaa ggaccttctt cacgtgctcc gccaagcatt gtgtagccat caccaccagc 480

agcaaggaag tcatttgttg ctaaatagta cgttttttca agatccaagg cgtcatattc 540

gccagtctct ggattaagaa taccgataag aagaacacgt tcttctacag gaagagttgg 600

atcgtagaat acatttgctc ctgaaatgtg taggaatcca ccactagctt caaagagcgg 660

catgccattt tcatctaaaa gcatctcgcc agtttctgga ttcacttgca atgtagatga 720

taaagacttg gtaaacatat cataaatttg ctgaccagtc acagtgattt gagaaacaat 780

gttaccaaat ggcaagactg caataatatc accttttgta acaggctgat ctttagcaat 840

tgttgcacgt agaccaccac cgttagtcac agcaaggcta gttttgtttg aaaatcctgt 900

ttgaccataa gcatagatcg catccgtcac tgcattcccc aagttggttt cgcgaacacg 960

cacgtttgag cggtctccgt ttaattccac tgggttattt tcaataacta cttgagcatt 1020

ttcagcttca tattttgctt taatttcatc aaccaaggct gcgattttag catttggcgt 1080

cacattttta gtatccgcag cagaaatcaa gctagcttca cccaataatt tatcggattt 1140

caaggttact ttaccgatat tgttcaagta agagcctgtt tgattataag taacgttatc 1200

tccataggta gtcgcttcta ccgtgtggga atgaccgtcg ataacaataa cacgtttacc 1260

agctaattta ctatttttag aaagtgcttc agcaagagtt gaacctctcc attcaacagg 1320

cgttgtagaa tcgacaccta ggtgagctag aatgatatag ttcttgtaaa cacgattatc 1380

tgctagagcg cgcgcttcca cttcgtcaat cactttattg acttctgtga ctgggtcggt 1440

aaatgttact ccctcaacat ttttcggatg ggtttttgta gcagtttcag gtgttgttac 1500

accgataact acaaattcat cgcctacaac agttggagtt ttatcgacaa tagttgaagc 1560

ttcaaaaaca cgagcaccat taacgtaagt gttagcactc aatagcggga agttcaaggt 1620

ttccttgtac ttgattgctt gatccatccc aaagtcaaat tcatggttac caacagccat 1680

tgcatcatag ccgacttggt tcatgatatt ggcgcggtct tcaccttttg tagagttgga 1740

aattggaagt ccttggaagg catcaccagc atctactaca attgtatttt ctactttggc 1800

acgttcttct tcaatgactg ccgcagcctt agcgtcaccg atgacattct tttcttcaag 1860

aatgcgaccg tgaacgtcgt ttgtgtggat aatgactgcc tctactgttt cttccgcagc 1920

agggacaaca gtttcctccg ttgctacgtt ttcaactgac gttgctggta ccgtagcagt 1980

tgcatcagtc gttgctggta ccgtagcagt tgcatcagtc gttgctggct gattggttgt 2040

ggtagctgca gtcgttgtct cagcagcttg tacttgttga gctaaaacaa atggcgccaa 2100

caagagtgtg gacattacag gcaacaagat ttttttcttt ttcataaata gacctttctt 2160

cggcat 2166

Claims (3)

1.一种猪链球菌2型五基因缺失株，其特征在于：猪链球菌（Streptococcus suis）ΔSlyΔScpAΔSsnAΔFhbΔSsadS，保藏编号为：CCTCC NO: M 2015033。

2.权利要求1所述的猪链球菌2型五基因缺失株在制备治疗或预防猪链球菌2型感染药物中的应用。

3.权利要求1所述的猪链球菌2型五基因缺失株在制备猪链球菌检测的全菌标准品中的应用。