KR102126096B1

KR102126096B1 - 약독화 스트랩토코쿠스 수이스 백신 및 이의 제조 방법 및 용도

Info

Publication number: KR102126096B1
Application number: KR1020157002139A
Authority: KR
Inventors: 러셀 에프 베이; 파울라즈 키루바카란 로렌스; 랜디 알 시몬슨; 카메쉬 레디 시리기레디; 다니엘 에이 맥커운
Original assignee: 뵈링거 잉겔하임 애니멀 헬스 유에스에이 인코포레이티드
Priority date: 2012-06-27
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2020-06-23
Also published as: AR091582A1; EP2866828A1; DK2866828T3; PH12014502855B1; EA201500054A1; MX365879B; ES2662801T3; EA036764B1; KR20150033692A; AU2016222520B2; WO2014004361A1; EP2866828B1; AU2013280718B2; MX2015000045A; HK1203834A1; MY173796A; BR112014032636A2; CN104780935A; CN104780935B; PL2866828T3

Abstract

본 발명은 동물에서 S. 수이스에 대한 면역 반응을 이끌어내는 약독화 S. 수이스 균주, 상기 균주를 포함하는 조성물, S. 수이스에 대한 예방접종 방법, 및 이러한 방법 및 조성물로 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명은 신규한 약독화 S. 수이스 박테리아 균주의 생성에 유용한, S. 수이스 유전자에서 신규하고 돌연변이유발적으로 유도된 돌연변이를 추가로 제공한다.

Description

약독화 스트랩토코쿠스 수이스 백신 및 이의 제조 방법 및 용도 {ATTENUATED STREPTOCOCCUS SUIS VACCINES AND METHODS OF MAKING AND USE THEREOF}

참고문헌

본 출원은 2012 년 6 월 27 일에 출원하였으며 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 가출원 USSN 61/664,935 에 대해 우선권을 주장한다.

기술분야

본 발명은 일반적으로 약독화 박테리아 백신, 특히 스트랩토코쿠스 수이스 (Streptococcus suis) 에 의한 감염/질환에 대하여 돼지에 대해 광범위하고, 안전하며 효과적인 보호를 제공하는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 또한 약독화 박테리아 생성 방법, 및 상기 약독화 박테리아의 감소된 독성과 연관되는 핵산 변이의 확인에 관한 것이다.

따라서 본 발명은 본 발명의 박테리아; 예를 들어 생 약독화 박테리아를 포함하는 면역성 또는 백신 조성물에 관한 것이다. 상기 박테리아는 또한 조성물 중에서 불활성화될 수 있으나; 박테리아가 생 약독화 S. 수이스 박테리아인 것이 유리할 수 있다. 본 발명은 따라서 또한 이러한 조성물을 제조하고/하거나 제형화하는 (예를 들어, 적합한 배지 상 또는 적합한 배지 내에서 박테리아를 배양하거나 성장시키거나 증식시키고, 박테리아를 수확하고, 임의로는 박테리아를 불활성화시키고, 임의로는 박테리아를 적합한 수의학적 또는 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제 또는 비히클 및/또는 아쥬반트 및/또는 안정화제와 혼합하는) 방법에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 이러한 조성물을 제헝화하는데 있어서의 박테리아의 용도에 관한 것이다.

스트랩토코쿠스 수이스는 대부분 돼지에서 군집화하는 그람 양성 구균이다. 성인 돼지가 무증상 운반체로서 역할하지만, 이는 새끼 돼지에서 치명적인 뇌수막염, 패혈증 관절염 및 기관지 폐렴을 일으킬 수 있다. 성인 돼지는 통상 편도음와 및 상부 호흡기에서의 공생 세균으로서 S. 수이스를 수반하지만, 박테리아는 또한 위장관 및 생식기에서 단리된 바 있다. 거의 모든 성인 돼지가 S. 수이스에 대한 병원소로서 역할하며 상기 병원균은 전세계 돼지 산업에 영향을 준다.

추가적으로 S. 수이스는 또한 광범위한 포유동물 및 조류 종에서 군집화한다 [Gottschalk et al., 2007]. 또한, S. 수이스로 감염된 인간이 유럽 및 북아메리카에서 드물지만, S. 수이스는 중요한 동물매개 감염 작용제 [Perch et al., 1968] 이다. 북아메리카 및 유럽에서의 이러한 경우 중 대부분은 돼지 또는 돼지고기 제품에 대한 직업적 노출에 거의 독점적으로 관련된다. 그러나 S. 수이스로의 인간 감염 발생 정도는 동남아시아 및 중국에서 더 크다. 뇌수막염이 인간에서 가장 흔한 징후이지만, 때때로 패혈증 및 심내막염이 또한 관찰된다.

33 개의 공지된 S. 수이스 혈청형 중에서, 혈청형 2 가 북아메리카 및 유럽에서의 돼지에서 뇌수막염 및 관절염과 가장 빈번하게 연관된다 [Fittipaldi et al., 2009; Higgins and Gottschalk, 2006]. 다양한 S. 수이스 독성 인자는 캡슐, 피브로넥틴/피브리노겐 결합 단백질, 혈청 불투명형 인자 및 세포 벽 리포테이코산 및 펩티도글리칸의 변형을 포함한다 [Baums et al., 2006; Chabot-Roy et al., 2006; de Greeff et al., 2002; Fittipaldi et al., 2008a,b; Smith et al., 1999]. 또한, 동일 혈청형의 다양한 균주 사이에서 공유되는 독성 인자는 광범위한 변이를 나타낸다 [Berthelot-Herault et al., 2005; Quessy et al., 1995; Vecht et al., 1992]. S. 수이스 독성에 대한 표현형 마커는 용혈 인자, 수일리신 (suilysin) (sly 에 의해 인코딩됨), 뮤라미다아제-방출 단백질로 공지된 LPXTG-단백질 [MRP, 136 kDa, 유전자 mrp 에 의해 인코딩됨] 및 분비된 단백질 세포외 인자 [EF, 110 kDa, 유전자 epf 에 의해 인코딩됨] 을 포함한다. S. 수이스의 유라시아 균주에서의 이들 독성 단백질의 존재와 독성 표현형 사이에 강력한 양성 상관관계가 존재한다 [Gottschalk et al., 2007; Vecht et al., 1991]. 이들 성분에서, 혈청형 2 MRP⁺EF⁺SLY⁺ 균주는 중증의 임상적 질환 징후를 나타내는 유병 돼지로부터 주로 단리되는 한편, MRP^-EF^-SLY^-균주는 건강한 돼지에서 종종 단리된다 [Allgaier et al., 2001; Vecht et al., 1992].

전체 세포 및 수많은 S. 수이스 단백질이 잠재적 백신 후보물로서 조사되어왔다. 야생형 세균 백신으로의 면역화는 상동 혈청형으로의 챌린지에 대해 완전히 보호되지만, 비-캡슐화된 돌연변이체는 보호를 제공하는데 실패하였다 [Wisselink et al., 2002]. [Li et al] 에 의해 실행된 연구에서, Quil A 와 조합된 재조합 SAO (S. 수이스 표면 단백질) 는 돼지에서의 S. 수이스 혈청형 2 질환에 대해 보호되었다. SAO 로의 근육내 면역화는 상당한 체액성 항체 반응을 이끌어내지만, 대부분 IgG2 에 해당된다. 재조합 SAO 면역화는 또한 OPA (opsonophagocytic) 항체를 유도하였다 [Li et al., 2007]. S. 수이스 균주 P1/7 (혈청형 2) 로부터의 정제된 수일리신을 갖는 새끼 돼지의 면역화는 중화 항체 역가를 증가시켜, 이로써 SLY 가 보호 항원으로서 기능할 수 있다는 것이 제안된다 [Jacobs et al., 1996]. 그러나, 이들 실험 중 아무 것도 이들 항원으로 예방접종된 돼지에 챌린지하기 위한 이종 혈청형으로 사용되지 않았다. [Baums et al.] 에 의한 연구에서, S. 수이스, 혈청형 2 세균 백신은 상동의 챌린지에 대해 보호 면역성을 유도하였다. 반대로, MAP 서브유닛 백신의 보호 효능은 매우 낮았으나, MAP 면역화는 MRP 및 SAO 에 대해 높은 혈청 IgG2 역가를 초래하였다. 중요하게, 세균 백신을 사용하나 MAP 을 사용하지 않는 면역화는 혈청형 2 균주에 대해 옵소닌 항체 역가를 유도하였으며, 이들 항체 역가는 보호와 상호연관되는 것으로 발견되었다. 그러나, 비-캡슐화된 동질유전자 돌연변이체로 흡수된 후, 세균 백신-면역화된 새끼 돼지로부터의 혈청은 호중구 사멸을 촉진시키는데 실패하였으며, 이는 캡슐에 대해 유도된 항체가 옵소닌식작용에 필수적이 아닐 수 있다는 것을 나타낸다 [Baums et al., 2009]. 또한, 혈청형 9 에 대한 옵소닌 항체의 유도는 세균 백신을 투여받은 군 또는 MAP 백신을 투여받은 군에서 검출가능하지 않았으며, 따라서 혈청형 9 균주에 대한 낮은 보호를 초래한다.

예방접종-챌린지 연구 중 아무 것도 S. 수이스 감염에 대해 광범위한 보호 백신을 산출해내지 않았다. 또한, 분자 수준에서의 S. 수이스 발병과정의 정확한 이해에 대한 지식은 이의 숙주와의 상호작용에 포함된 복잡한 분자 메커니즘 및 혈청형 내 균주 사이의 독성 인자의 공급으로 인해 단편화된다. S. 수이스 감염에 대한 효과적 백신의 결여는 현대 돼지 생산에 있어서 주요 문제점이다. 따라서, 안전하고 효과적인 S. 수이스 백신을 제공하는 것이 본 개시물의 주요 목적이다.

본 발명의 목적은 약독화 백신 뿐 아니라 S. 수이스에 의한 감염의 치료 및 예방 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 안전하고, 효과적이고 광범위한 보호 면역성을 제공하는 새로운 S. 수이스의 약독화 균주에 관한 것이다. S. 수이스 모균주에 관해서, 약독화 균주는 그의 존재가 감소된 독성과 연관되는 하나 이상의 다형성 변이체 뉴클레오티드를 가질 수 있다.

본 발명은 야생형/모체 박테리아에 대하여 하나 이상의 핵산 서열에서의 돌연변이(들) 를 포함하는 돌연변이체 박테리아를 제공하는데, 이는 돌연변이체 박테리아를 모체 박테리아에 비해 약독화시킨다 (모체 박테리아는 SEQ ID NO: 2, 6 및 10 에서 나타낸 펩티드 서열을 갖는 야생형 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함함). 특정 구현예에서, 돌연변이체 박테리아는 SEQ ID NO: 4, 8 및 12 에서 나타낸 바와 같은 펩티드를 인코딩하며 독성 야생형/모체 박테리아에 비해 돌연변이체 박테리아가 약독화/비-독성이 되도록 하는 SEQ ID NO: 3, 7 및 11 에서 나타낸 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 돌연변이체 박테리아는 야생형/모체 균주에 비해 돌연변이체 박테리아가 약독화되게 하는, SEQ ID NO: 2, 6 및 10 에서 나타낸 바와 같은 야생형 펩티드 (즉, SEQ ID NO: 4, 8 및 12 에서 나타낸 바와 같은 펩티드를 산출하는 것들 외) 에서의 다른 돌연변이를 갖는다.

한 특정 구현예에 따라서, 균주는 모체 S. 수이스 균주에 대해 "대립형질" 로서 본원에서 정의하는 "유전자의 대체 형태" 를 가질 수 있다. 한 구현예에서, 대체 대립형질은 감소되거나 약독화된 독성에 관련된다. 본원에서 정의한 바와 같이, 용어 "유전자" 는 광범위한 의미로 사용되며, 코팅 및 비-코딩 서열 (즉, 업스트림 및 다운스트림 조절 서열, 프로모터, 5'/3' UTR, 인트론 및 엑손) 을 모두 포함한다. 유전자의 코딩 서열에 대한 언급만이 의도되는 경우, 용어 "유전자의 코딩 서열" 또는 "CDS" 가 본 개시물 전체에 걸쳐 상호교환가능하게 사용될 것이다.

특정 구현예에서, 약독화 균주는 rpsL-S12 (30S 리보솜 서브유닛 단백질), ABC 트랜스포터 ATP 결합 멤브레인 단백질 (ABC-ATPBMP) 및 박테리아 전사 조절자 (marR), 상기 세 가지 모두 또는 이의 조합에 있어서 하나 이상의 다형성(들) 을 갖는다. 한 구현예에서, 약독화 균주와 이의 모체 균주 사이에 4 개 이상의 뉴클레오티드 차이가 존재한다 (rpsL-S12 에서 2 SNP, ABC-ATPBMP 및 marR 에서 1 SNP).

또 다른 양태에 따라서, 본 발명은 rpsL-S12, ABC-ATPBMP 및 marR 또는 상기 세 가지 모두의 발현이 모체 S. 수이스 균주에 비해 변형되어, 유전적-변형 균주의 독성을 감소시키는 유전적-변형 S. 수이스 균주에 관한 것이다.

또 다른 양태에 따라서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 약독화 S. 수이스 박테리아 생성 방법에 관한 것이다:

(a) 돌연변이 유발제의 존재 하에 S. 수이스 모체 균주를 성장시키는 단계;

(b) 적절한 배지에 살아있는 세포를 시딩하는 단계;

(c) 독성을 측정하기 위해 돼지에게 주입하여 개별 콜로니를 시험하는 단계;

(d) 모체 균주에 의한 감염과 연관되는 임상적 징후가 돼지에게 나타나지 않는 경우 균주가 약독화된 것을 결정하는 단계.

한 구현예에서, 약독화 백신은 아쥬반트를 추가로 포함한다. 아쥬반트는 약독화된 백신 단독과 비교하여 유도된 면역 반응을 증가시키고/시키거나 증강시키는 임의의 물질일 수 있다. 점막 아쥬반트, 예컨대 키토산 및 이의 유도체가 개시된 경구 약독화 백신에 특히 유용하다.

본 발명은 약독화된 박테리아 또는 상기 약독화된 박테리아를 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 동물에게 투여하는 것을 포함하는, S. 수이스에 대항하여 면역 (또는 면역성) 또는 보호 반응을 유도하는 방법 및 S. 수이스, 또는 S. 수이스에 의한 질환 상태(들) 를 예방 또는 치료하는 방법을 추가로 제공한다.

적어도 약독화 S. 수이스 균주 및 사용 지시사항을 포함하는 키트가 또한 제공된다.

이러한 구현예 및 기타 구현예가 개시되거나 하기 상세한 설명에서 명백하며 상세한 설명에 의해 포함된다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 미생물, 예컨대 박테리아, 예를 들어 그람 양성 박테리아, 예를 들어 스트랩토코쿠스 수이스 (S. 수이스) 의 약독화에 수반되는 뉴클레오티드 서열 및 유전자, 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된 생성물 (예를 들어 단백질, 항원, 면역원, 에피토프), 이러한 뉴클레오티드 서열, 생성물, 미생물을 생성하는 방법, 및 이에 대한, 예컨대 백신 또는 면역성 조성물을 제조하기 위한, 또는 면역학적 또는 면역 반응을 이끌어내기 위한, 또는 발현 벡터 (예를 들어 시험관내 또는 생체내 발현 벡터) 와 같은 벡터로서의 용도를 제공한다.

미생물의 뉴클레오티드 서열 및 유전자에 도입된 돌연변이는 신규하고 불분명한 약독화 돌연변이체를 생성한다. 이들 돌연변이체는 높은 정도의 면역원성을 갖는 생 약독화 면역성 조성물 또는 생 약독화 백신의 생성에 유용하다.

이들 돌연변이체는 또한, 발현 생성물의 시험관내 발현 뿐 아니라 뉴클레오티드 서열의 재생산 또는 복제 (예를 들어 DNA 의 복제), 및 생체내 발현 생성물에 유용할 수 있는 벡터로서 유용하다.

돌연변이의 확인으로 인해, 신규하고 불분명한 뉴클레오티드 서열 및 유전자 뿐 아니라 상기 뉴클레오티드 서열 및 유전자에 의해 인코딩된 신규하고 불분명한 유전자 생성물이 제공된다.

이러한 유전자 생성물은 항원, 면역원 및 에피토프를 제공하며, 단리된 유전자 생성물로서 유용하다.

이러한 단리된 유전자 생성물 뿐 아니라 이의 에피토프는 또한, 진단 적용에 있어서 유용한 항체 생성에 유용하다.

에피토프, 항원 또는 면역원을 제공할 수 있는 이러한 유전자 생성물은 또한 면역성 또는 면역학적 조성물 뿐 아니라 백신에 유용하다.

한 양태에서, 본 발명은 뉴클레오티드 서열 또는 유전자에 있어서 약독화 돌연변이를 함유하는 박테리아를 제공하며, 이때 상기 돌연변이는 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드 또는 단백질의 발현 및/또는 생물학적 활성을 변형시키고, 감소시키거나 없애어, 박테리아의 독성을 약독화시킨다.

돌연변이는 코딩 서열 또는 유전자의 기능에 지장을 주어 약독화를 초래하기 위하여 반드시 코딩 서열 또는 유전자 내에 위치하지는 않는다. 돌연변이는 또한, 예를 들어 전사 개시, 번역 및 전사 완료를 조절하는 부위에서의, 유전자의 발현 조절에 포함된 뉴클레오티드 서열에서 만들어질 수 있다. 따라서 또한 프로모터 및 리보솜 결합 부위 (일반적으로 이러한 조절 요소는 코딩 서열 또는 유전자의 출발 코돈의 대략 60 내지 250 뉴클레오티드 업스트림에 위치함; Doree S M et al., J. Bacteriol. 2001, 183(6): 1983-9 ; Pandher K et al., Infect. Imm. 1998, 66(12): 5613-9 ; Chung J Y et al., FEMS Microbiol letters 1998, 166: 289-296), 전사 터미네이터 (일반적으로 터미네이터는 코딩 서열 또는 유전자의 중지 코돈의 대략 50 뉴클레오티드 다운스트림 내에 위치함; Ward C K et al., Infect. Imm. 1998, 66(7): 3326-36) 가 포함된다. 오페론의 경우, 이러한 조절 부위는 유전자 또는 코딩 서열의 더 먼 거리 업스트림에 위치할 수 있다. 유전자간 부위에서의 돌연변이가 또한 약독화를 초래할 수 있다.

이러한 조절 서열 내의 돌연변이는 코딩 서열 또는 유전자와 연관되어, 이러한 뉴클레오티드 서열의 돌연변이가 상기 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드 또는 단백질의 발현 및/또는 생물학적 활성을 변형시키고, 저해하거나 없앰으로써, 박테리아의 약독화된 독성이 본 발명에서 확인된 유전자 또는 코딩 서열 내의 돌연변이와 동등해질 수 있다.

약독화는 박테리아의 병원성 및 임상적 징후 또는 병변의 중대성을 감소시키거나 없애고, 박테리아의 성장 속도를 감소시키며, 박테리아로 인한 사망을 방지한다.

특히 본 발명은, 동물에서의 면역성 반응을 이끌어내는 약독화 S. 수이스 균주 및 이를 포함하는 백신, 특히 돼지에서의 반응을 이끌어내고, 유도하거나 자극하는 약독화 S. 수이스 균주를 포함한다.

특정한 관심 S. 수이스 약독화 균주는 야생형 독성 모체 균주에 대하여 유전자에 있어서 돌연변이를 가지며, 이는 독성과 연관된다. 개시된 돌연변이를 갖는 균주에 추가로, 개시된 독성 유전자에 있어서 임의 수의 돌연변이를 갖는 약독화 균주가 본 발명의 실행에 사용될 수 있다는 것이 인지된다.

한 구현예에서, 약독화 균주는 SEQ ID NO: 3, 7, 11 에서 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드, 또는 이의 조합을 포함한다. 이러한 개시의 시기에, 이들 서열은 임의의 자연 발생적 S. 수이스 게놈에 존재하는 것으로 공지되어 있지 않으며, 독성 모체 균주에서 수행된 발명자의 돌연변이유발 방법의 결과로서만 생성된다 (상기 야생형 유전자는 SEQ ID NO: 1, 5 및 9 에서 나타낸 바와 같은 뉴클레오티드를 포함함).

또 다른 구현예에서, 약독화 S. 수이스 균주는 SEQ ID NO: 4, 8, 12 에서 나타낸 바와 같은 서열, 또는 또는 이의 조합을 갖는 펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 균주는 SEQ ID NO: 2, 6, 10 에서 나타낸 바와 같은 서열 또는 이의 조합에 대하여 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 한 구현예에서, 치환은 표 1 에서 나타낸 바와 같다 (백신 균주에 대함).

또 다른 구현예에서, 약독화 S. 수이스 균주는 특허 수탁 번호 PTA-13269 하에 ATCC 에 수탁된 균주로서 이의 독성 모체 균주에 대해 동일한 유전자에서 돌연변이를 갖는다. 이들 돌연변이는 그의 독성 모체 균주에 비해 감소된 독성을 갖는 약독화 균주를 초래한다.

특정 구현예에서, 약독화 균주는 특허 수탁 번호 PTA-13269 하에 ATCC 에 수탁된 균주이다.

또 다른 양태에서, 신규한 약독화 S. 수이스 균주는 S. 수이스, 그리고 S. 수이스에 의한 감염 / 질환에 대해 안전하고 효과적인 백신으로 제형화된다.

한 구현예에서, S. 수이스 백신은 아쥬반트를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 아쥬반트는 점막 아쥬반트, 예컨대 키토산, 메틸화 키토산, 트리메틸화 키토산 또는 이의 유도체 또는 조합이다.

한 구현예에서, 아쥬반트는 전체 박테리아 및/또는 바이러스, 예컨대 H. 파라수이스 (H. parasuis), 클로스트리디움 (clostridium), 돼지 인플루엔자 바이러스 (SIV), 돼지 서코바이러스 (circovirus) (PCV)(예를 들어 PCV2), M. hyo, 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 (PRRSV), 만헤이미아 (Mannheimia), 파스츄렐라 (Pasteurella), 히스토필루스 (Histophilus), 살모넬라 (Salmonella), 대장균 (Escherichia coli) 또는 이의 조합 및/또는 변이를 포함한다. 여러 구현예에서, 아쥬반트는 동물의 IgM, IgG, IgA 및/또는 이의 조합의 생성을 증가시킨다.

"항원" 또는 "면역원" 은 숙주 동물에서 특이적 면역 반응을 유도하는 물질을 의미한다. 항원은 전체 유기체 (사멸, 약독화 또는 살아있는); 유기체의 서브유닛 또는 일부; 면역성을 갖는 삽입물을 포함하는 재조합 벡터; 숙주 동물에게 제시될 때 면역 반응을 유도할 수 있는 DNA 의 조각 또는 단편; 폴리펩티드, 에피토프, 합텐, 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로, 면역원 또는 항원은 독소 또는 항독소를 포함할 수 있다.

용어 "단백질", "펩티드", "폴리펩티드" 및 "폴리펩티드 단편" 은 본원에서 임의 길이의 아미노산 잔기의 중합체를 의미하는 것으로 상호교환가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있으며, 개질된 아미노산 또는 아미노산 유사체를 포함할 수 있고, 아미노산 외의 화학적 부분에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 간섭에 의해; 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 기타 조작 또는 개질, 예컨대 표지 또는 생물활성 성분과의 접합에 의해 개질된 아미노산 중합체를 포함한다.

본원에 사용한 바와 같은 용어 "면역성 또는 항원 폴리펩티드" 는 숙주에 일단 투여되고 나면 단백질에 대해 유도된 체액 및/또는 세포 유형의 면역 반응을 유발할 수 있다는 의미에 있어서 면역학적으로 활성인 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게는 단백질 단편은 총 단백질과 실질적으로 동일한 면역학적 활성을 갖는 것이다. 따라서 본 발명에 따른 단백질 단편은 하나 이상의 에피토프 또는 항원 결정자를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진다. 본원에서 사용한 바와 같은 "면역성" 단백질 또는 폴리펩티드는 단백질의 전체-길이 서열, 이의 유사체, 또는 이의 면역성 단편을 포함한다. "면역성 단편" 은 하나 이상의 에피토프를 포함하며 그에 따라 상기 기재한 면역학적 반응을 이끌어내는 단백질의 단편을 의미한다. 이러한 단편은 당업계에 널리 공지된 임의 수의 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, [Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996)] 을 참고한다. 예를 들어 선형 에피토프는, 고체 지지체 상의 다수의 펩티드, 단백질 분자 일부에 상응하는 펩티드를 동시에 합성하고, 펩티드를 여전히 지지체에 부착시키면서 상기 펩티드를 항체와 반응시킴으로써 측정될 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들어 미국 특허 번호 4,708,871; [Geysen et al., 1984; Geysen et al., 1986] 에 기재되어있다. 유사하게, 구조적 에피토프는 아미노산의 공간적 구조를 예를 들어 x-선 결정학 및 2-차원 핵 자기 공명에 의해 측정함으로써 용이하게 확인된다. 예를 들어, 상기 [Epitope Mapping Protocols] 을 참고한다. T. 파르바 (T. parva) 의 단백질에 특히 적용가능한 방법이, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT/US2004/022605 에 전부 기재되어있다.

본원에서 토의한 바와 같이, 본 발명은 항원성 폴리펩티드의 활성 단편 및 변이체를 포함한다. 따라서, 용어 "면역성 또는 항원성 폴리펩티드" 는 폴리펩티드 기능이 본원에서 정의한 바와 같은 면역학적 반응을 생성시키는 한, 서열에 대한 결실, 부가 및 치환을 추가로 고려한다. 용어 "보존적 변이" 는 또 다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의한 아미노산 잔기의 대체, 또는 인코딩된 아미노산 잔기가 변화하지 않으며 또 다른 생물학적으로 유사한 잔기이도록 하는 핵산 서열에서의 뉴클레오티드의 대체를 의미한다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 치환은 일반적으로 자연계에 있어서 보존적일 것이다 (즉, 아미노산 패밀리 내에서 발생하는 치환). 예를 들어, 아미노산은 일반적으로 다음의 4 개 패밀리로 분화된다: (1) 산성--아스파르테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성--리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비-극성--알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전된 극성--글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스틴, 세린, 트레오닌, 티로신. 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 보존적 변이의 예는 1 개의 소수성 잔기 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 또 다른 소수성 잔기로의 치환, 또는 1 개의 극성 잔기의 또 다른 극성 잔기로의 치환, 예컨대 아르기닌의 리신으로의 치환, 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환, 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환 등; 또는 생물학적 활성에 대해 주요한 영향을 갖지 않는 구조적으로 관련된 아미노산으로의 아미노산의 유사한 보존적 대체를 포함한다. 참조 분자와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만 단백질의 면역원성에 실질적으로 영향을 주지 않는 소수의 아미노산 치환을 갖는 단백질이 따라서 참조 폴리펩티드의 정의 내에 있다. 이러한 개질에 의해 생성된 모든 폴리펩티드가 본원에 포함된다. 용어 "보존적 변이" 는 또한 비치환된 모체 아미노산 대신 치환된 아미노산을 사용하는 것을 포함한다 (단, 치환된 폴리펩티드에 대해 유도된 항체가 또한 비치환된 폴리펩티드와 면역반응함).

용어 "에피토프" 는 특이적 B 세포 및/또는 T 세포가 이에 대응하는 항원 또는 합텐에서의 부위를 의미한다. 상기 용어는 또한 "항원 결정자" 또는 "항원 결정자 부위" 와 상호교환가능하게 사용된다. 동일한 에피토프를 인지하는 항체는 한 항체의, 표적 항원에 대한 또 다른 항체의 결합을 차단하는 능력을 나타내는 단순한 면역검정에서 확인될 수 있다.

조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 반응" 은 관심 조성물 또는 백신에 대한 세포 및/또는 항체-매개 면역 반응의, 숙주에서의 진전이다. 통상, "면역학적 반응" 은 비제한적으로, 하기 효과 중 하나 이상을 포함한다: 관심 조성물 또는 백신에 포함된 항원(들) 에 특이적으로 유도된 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포의 생성. 바람직하게는, 숙주는 치료 또는 보호 면역 반응을 나타내어, 새로운 감염에 대한 저항성이 증강되고/되거나 질환의 임상적 중증도가 감소된다. 이러한 보호는 감염된 숙주에 의해 보통 나타나는 증상 및/또는 임상적 질환의 감소 또는 결여, 빠른 회복 시간 및/또는 감염된 숙주에서의 감소된 바이러스 역가에 의해 입증된다.

"동물" 은 포유동물, 조류 등으로 의도된다. 본원에서 사용한 바와 같은 동물 또는 숙주는 포유동물 및 인간을 포함한다. 동물은 말과 (예를 들어 말), 개과 (예를 들어 개, 늑대, 여우, 코요테, 재칼), 고양이과 (예를 들어 사자, 호랑이, 애완용 고양이, 야생 고양이, 기타 대형 고양이, 및 기타 고양이과 예컨대 치타 및 스라소니), 양류 (예를 들어 양), 소류 (예를 들어 소), 돼지류 (예를 들어 돼지), 조류 (예를 들어 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩, 앵무새, 핀치 (finch), 매, 까마귀, 타조, 에뮤 및 화식조), 영장류 (예를 들어 원원류, 안경원숭이, 원숭이, 긴팔원숭이, 유인원), 페럿, 물개 및 어류로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다. 용어 "동물" 은 또한 신생아, 배아 및 태아 단계를 포함하는 모든 진전 단계에 있어서의 개별 동물을 포함한다.

다르게 설명하지 않는 한, 본원에서 사용한 바와 같은 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 개시물이 속하는 당업계의 통상의 지식 중 하나에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문맥상 다르게 명백히 나타내지 않는 한, 단수형 표현은 복수형 표현을 포함한다. 유사하게, 문맥상 다르게 명백히 나타내지 않는 한, 단어 "또는" 은 "및" 을 포함하는 것으로 의도된다.

본 개시물 및 특히 특허청구범위 및/또는 단락에서, "포함한다", "포함된", "포함하는" 등은 미국 특허법에서 반영된 의미를 가질 수 있다; 예를 들어, 이는 "함유하다", "함유된", "함유하는" 등을 의미할 수 있으며; "본질적으로 이루어지는" 및 "본질적으로 이루어진다" 와 같은 용어는 미국 특허법에서 간주된 의미를 가져, 예를 들어, 요소가 명백히 인용되지 않게 하나, 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적 또는 신규한 특징에 영향을 주는 요소는 배제한다.

조성물

본 발명은 약독화 S. 수이스 균주 및 약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 비히클 (동물에서의 반응을 이끌어내고, 유도하거나 자극함) 을 포함할 수 있는 S. 수이스 백신 또는 조성물에 관한 것이다.

용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드" 는 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중 가닥, 또는 이의 하이브리드인 RNA 또는 DNA 를 의미한다. 상기 용어는 또한 RNA/DNA 하이브리드를 포함한다. 하기는 폴리뉴클레오티드의 비제한적 예이다: 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지형 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머. 폴리뉴클레오티드는 개질된 뉴클레오티드, 예컨대 메틸화된 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체, 우라실, 기타 당류 및 연결기 예컨대 플루오로리보오스 및 티올레이트, 및 뉴클레오티드 분지를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 중합 후, 예컨대 접합에 의해 표지 성분으로 추가 개질될 수 있다. 이러한 정의에 포함되는 기타 유형의 개질은 캡 (cap), 하나 이상의 자연 발생적 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 및 폴리뉴클레오티드를 단백질, 금속 이온, 표지 성분, 기타 폴리뉴클레오티드 또는 고체 지지체에 부착시키기 위한 수단의 도입이다. 폴리뉴클레오티드는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있거나 미생물로부터 유래할 수 있다.

용어 "유전자" 는 생물학적 기능과 연관되는 폴리뉴클레오티드의 임의의 부분을 지칭하는데 광범위하게 사용된다. 따라서, 유전자는 게놈 서열에서와 같이 인트론 및 엑손을 포함하거나, cDNA 에서와 같이 단지 코딩 서열 및/또는 그의 발현에 필요한 조절 서열을 포함한다. 예를 들어, 유전자는 또한 mRNA 또는 기능적 RNA 를 발현하거나 특정 단백질을 인코딩하며, 조절 서열을 포함하는 핵산 단편을 의미한다.

"단리된" 생물학적 성분 (예컨대 핵산 또는 단백질 또는 세포소기관) 은, 예를 들어 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 단백질 및 세포소기관과 같은, 상기 성분이 자연적으로 발생하는 유기체의 세포 내 다른 생물학적 성분으로부터 실질적으로 단리되거나 정제된 성분을 의미한다. "단리된" 핵산 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 및 단백질을 포함한다. 상기 용어는 또한 재조합 기술 뿐 아니라 화학적 합성에 의해 제조된 핵산 및 단백질을 포괄한다.

용어 "보존적 변이" 는 또 다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의한 아미노산 잔기의 대체, 또는 인코딩된 아미노산 잔기가 변화하지 않거나 또 다른 생물학적으로 유사한 잔기이도록 하는 핵산 서열에서의 뉴클레오티드의 대체를 의미한다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 치환은 일반적으로 상기 기재한 바와 같이 자연계에 있어서 보존적인 것이다.

용어 "재조합" 은 자연계에서 발생하지 않거나 자연계에서 발견되지 않는 배열로 또 다른 폴리뉴클레오티드와 연결되는 반합성 또는 합성 기원을 갖는 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

"이종" 은 비교하는 개체의 나머지로부터 유전적으로 뚜렷하게 구분되는 개체에서 유래한 것을 의미한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 유전 공학 기술에 의해 상이한 근원에서 유래한 플라스미드 또는 벡터 내로 넣어질 수 있으며, 이종 폴리뉴클레오티드이다. 이의 선천적 (native) 코딩 서열로부터 제거되고 선천적 서열 외의 코딩 서열에 작동적으로 연결된 프로모터는 이종 프로모터이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 추가적인 서열, 예컨대 동일 전사 유닛 내의 추가적인 인코딩 서열, 제어 요소 예컨대 프로모터, 리보솜 결합 부위, 5'UTR, 3'UTR, 전사 터미네이터, 폴리아데닐화 부위, 동일 또는 상이한 프로모터의 제어 하 추가적인 전사 유닛, 숙주 세포의 클로닝, 발현, 상동 재조합 및 형질전환을 가능하게 하는 서열을 포함할 수 있으며, 임의의 이러한 구축물은 본 발명의 구현예를 제공하기에 필요할 수 있다.

사용 방법 및 제조 물품

본 발명은 하기 방법 구현예를 포함한다. 한 구현예에서, 약독화 S. 수이스 균주 및 약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 비히클을 포함하는 조성물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물의 예방접종 방법이 개시된다. 이러한 구현예의 한 양태에서, 동물은 돼지이고, 바람직하게는 분만 전 약 3 주 내지 약 6주인 암퇘지로서, 예방접종되지 않은 암퇘지로부터의 새끼 돼지와 비교하여 감소된 이환율 및/또는 사망률을 갖는 새끼돼지를 생성한다.

본 발명의 한 구현예에서, 프라임-부스트 체계 (prime-boost regimen) 가 이용될 수 있는데, 이는 하나 이상의 통상적 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 사용하는 하나 이상의 주요 투여 및 하나 이상의 부스터 투여로 이루어진다. 전형적으로, 주요 투여에 사용된 면역학적 조성물 또는 백신은 부스터로서 사용되는 것들과 성질에 있어서 상이하다. 그러나, 동일한 조성물이 주요 투여 및 부스터 투여로서 사용될 수 있다는 것에 주목한다. 이러한 투여 프로토콜을 "프라임-부스트" 라고 지칭한다.

프라임-부스트 체계는 하나 이상의 통상적 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체 또는 단편을 사용하는 하나 이상의 프라임-투여 및 하나 이상의 부스트 투여를 포함한다. 프라임-투여에 사용한 백신은 이후의 부스터 백신으로서 사용한 것들과 그 성질에 있어서 상이할 수 있다. 유사하게, 부스터 투여는 하나 이상의 투여를 포함할 수 있다.

포유동물인 표적 종류에 대한 조성물의 용량 부피, 예를 들어 박테리아 항원을 기준으로 한 돼지 (pig) 또는 돼지류 (swine) 조성물의 용량 부피는 일반적으로 약 0.1 내지 약 2.0 ml, 약 0.1 내지 약 1.0 ml, 약 0.5 ml 내지 약 1.0 ml 이다.

백신의 효능은 돼지와 같은 동물을 S. 수이스의 독성 균주로 챌린지하여, 마지막 면역화 약 2 내지 4 주 후 시험될 수 있다. 상동 균주 및 이종 균주 모두 백신 효능 시험을 위한 챌린지에 사용된다. 동물은 IM 또는 SC 주사, 스프레이, 비강내, 안구내, 기관내 및/또는 경구로 챌린지될 수 있다. 관절, 폐, 뇌 및/또는 입으로부터의 샘플을 챌린지 전 및 챌린지 후 수집할 수 있으며 S. 수이스-특이적 항체의 존재에 대해 분석할 수 있다.

프라임-부스트 프로토콜에서 사용한 본 발명의 약독화 박테리아 균주를 포함하는 조성물은 약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 비히클, 희석제 또는 부형제 내에 함유된다. 본 발명의 프로토콜은 동물을 S. 수이스로부터 보호하고/하거나 감염된 동물에서의 질환 진전을 방지한다.

다양한 투여는 바람직하게는 1 내지 6 주 간격으로 실행된다. 바람직한 시간 간격은 3 내지 5 주이며, 한 구현예에 따라서 최적으로는 4 주, 연간 부스터가 또한 예견된다. 동물, 예를 들어 돼지는 제 1 투여 시기에 적어도 3-4 주령일 수 있다.

본원의 개시물이 예로서 제공되며 본 발명이 이에 제한되지 않는다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 본원의 개시물 및 당업계의 지식으로부터, 숙련된 기술자는 투여 수, 투여 경로 및 각 주입 프로토콜에 사용할 용량을, 어떠한 과도한 실험 없이도 결정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예는 약독화 S. 수이스 면역학적 조성물 또는 백신, 및 동물에서 면역 반응을 이끌어내기 위한 유효량을 전달하는 방법을 수행하기 위한 지시사항을 포함하는, 동물에서 S. 수이스에 대항한 면역 또는 보호 반응을 이끌어내거나 유도하는 방법을 수행하기 위한 키트이다.

본 발명의 또 다른 구현예는 본 발명의 약독화 S. 수이스 균주를 포함하는 조성물 또는 백신, 및 동물에서 면역 반응을 이끌어내기 위한 유효량을 전달하는 방법을 수행하기 위한 지시사항을 포함하는, 동물에서 S. 수이스에 대항한 면역 또는 보호 반응을 유도하는 방법을 수행하기 위한 키트이다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 기재한 바와 같은 본 발명에 따른 프라임-부스트 예방접종을 위한 키트에 관한 것이다. 상기 키트는 2 개 이상의 바이알을 포함할 수 있다: 본 발명에 따른 프라임-예방접종을 위한 백신 또는 조성물을 함유하는 제 1 바이알, 및 본 발명에 따른 부스트-예방접종을 위한 백신 또는 조성물을 함유하는 제 2 바이알. 상기 키트는 유리하게는 추가적인 프라임-예방접종 또는 추가적인 부스트-예방접종을 위한 추가적인 제 1 또는 제 2 바이알을 함유할 수 있다.

약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제는 당업자에게 널리 공지되어있다. 예를 들어, 약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제는 0.9% NaCl (예를 들어 식염수) 용액 또는 인산염 완충액일 수 있다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 기타 약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제는 비제한적으로, 폴리-(L-글루타메이트) 또는 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 부형제는 벡터 (또는 시험관내 발명적 벡터로부터 발현된 단백질) 의 투여를 촉진시키는 임의의 화합물 또는 화합물의 조합일 수 있으며; 유리하게는 담체, 비히클 또는 부형제는 벡터 (또는 단백질) 의 트랜스펙션을 촉진시키고/시키거나 보존을 향상시킬 수 있다. 용량 및 용량 부피는 본원에서 일반 설명에서 토의되며, 또한 당업계의 지식으로 본 개시물을 읽는 숙련된 기술자에 의해, 어떠한 과다 실험 없이도 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 면역학적 조성물 및 백신은 하나 이상의 아쥬반트를 포함할 수 있거나 본질적으로 이로 이루어질 수 있다. 본 발명의 실행에서 사용하기에 적합한 아쥬반트는 (1) 아크릴산 또는 메타크릴산의 중합체, 말레산 무수물 및 알케닐 유도체 중합체, (2) 면역자극 서열 (ISS), 예컨대 하나 이상의 비-메틸화 CpG 유닛을 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 서열 (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) 수중유 에멀젼, 예컨대 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" (published by M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995) 의 147 페이지에 기재된 SPT 에멀젼, 및 동일 저작물의 183 페이지에 기재된 에멀젼 MF59, (4) 4 차 암모늄 염을 함유하는 양이온성 지질, 예를 들어 DDA (5) 사이토카인, (6) 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄, (7) 사포닌 또는 (8) 본 출원에 대한 참고문헌에 의해 인용되고 포함된 임의의 문헌에서 토의된 아쥬반트, 또는 (9) 이의 임의의 조합 또는 혼합물이다.

한 구현예에서, 아쥬반트는 점막내층을 통한 향상된 흡수를 촉진시키는 것들을 포함한다. 일부 예는 MPL, LTK63, 독소, PLG 미세입자 및 기타 여러가지 (Vajdy, M. Immunology and Cell Biology (2004) 82, 617-627) 를 포함한다. 한 구현예에서, 아쥬반트는 키토산일 수 있다 (Van der Lubben et al. 2001; Patel et al. 2005; Majithiya et al. 2008; US 특허 일련 번호 5,980.912).

한 구현예에서, 아쥬반트는 불활성화된 박테리아, 불활성화된 바이러스, 불활성화된 박테리아의 분획물, 박테리아 지질다당류, 박테리아 독소, 또는 이의 유도체 또는 조합일 수 있다.

한 구현예에서, 아쥬반트는 전체 박테리아 및/또는 바이러스, 예컨대 H. 파라수이스, 클로스트리디움, 돼지 인플루엔자 바이러스 (SIV), 돼지 서코바이러스 (PCV), 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 (PRRSV), 만헤이미아, 파스츄렐라, 히스토필루스, 살모넬라, 대장균, 또는 이의 조합 및/또는 변이를 포함한다. 여러 구현예에서, 아쥬반트는 동물의 IgM, IgG, IgA, 및/또는 이의 조합의 생성을 증가시킨다.

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27. Zhou, Z.M., et al.,1998. Function of Escherichia coli MsbA, an essential ABC family transporter, in lipid A and phospholipid biosynthesis". J. Biol. Chem. 273,12466-12475.

28. George, A. M., and S. B. Levy. 1983. Gene in the major cotransduction gap of the Escherichia coli K-12 linkage map required for the expression of chromosomal resistance to tetracycline and other antibiotics. J. Bacteriol. 155:541-548.

하기의 비제한적 실시예에 의해 본 발명을 이제 추가로 설명할 것이다.

실시예

실시예 1 - 약독화 S. 수이스의 생성 및 게놈 분석

S. 수이스 감염에 대해 광범위하게 보호성인 백신을 개발하기 위해서, US 필드 균주 (모체 균주, Newport Laboratories 번호 8-1433-1, SEQ ID NO: 9) 를 돼지 뇌 스왑으로부터 단리하였다. 단리물은 생화학적 반응 및 응집 시험을 기반으로 S. 수이스 혈청형 2 인 것으로 확인되었다. 상기 모체 균주의 약독화를 Sinha et al. 에 의해 기재된 바와 같이 아크리플라빈 히드로클로라이드를 사용하여 화학적 돌연변이유발에 의해 수행하였다. 간략하게, S. 수이스 모체 세포를 10 μM/ml 아크리플라빈 히드로클로라이드가 보충된 5% 양 혈액 함유 트립티카아제 소이 브로쓰 중에서 18 시간 동안 성장시켰다. 살아있는 세포를 양 혈액 한천 플레이트 상에서 재단리하였다. 20 개의 개별적 콜로니를 선택하고 동일 액체 배지에서 별도로 성장시켰다. 20 개 중 1 개의 배양물을 선택하고 돼지에게 주입하여 (1.76 x 10⁹세포/ml) 독성을 측정하였다. 10 마리의 돼지를 경구 접종시키고, 26 일 동안 관찰하였다. S. 수이스 감염과 일치하는 임상적 징후는 이 기간에 관찰되지 않았다. 매우 약독화되는 것에 추가로, 돌연변이체 균주는 네오마이신에 저항성이 있었다. 또한, 돌연변이체/후보 백신 균주 (SEQ ID NO: 10) 뿐 아니라 모체 균주 (SEQ ID NO: 9) 의 전체 게놈을 완전히 서열분석하고, 무독성 표현형을 부여할 수 있는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 에 대해 분석하였다.

서열분석. 모체 및 돌연변이체 균주의 게놈을 서열분석하기 위해, S. 수이스의 지수 증식기 배양물을 펠렛화하고 Qiagen DNA 미니 키트 (Qiagen, Valencia, CA) 를 사용하여 DNA 를 정제하였다. 게놈 DNA 라이브러리를 이후 생성시키고 (Illumina Genomic DNA Prep 키트, Illumina, San Diego, CA), Cluster Generation Station 기기 (Illumina) 로 Single End Flow Cell v4 상에서 클러스터 증폭시켜 ~600,000 mm² 의 미가공 클러스터 (raw cluster) 강도를 생성시켰다. 서열분석을 Sequencing 키트 시약 (Illumina) 을 사용하여 56 사이클 동안 Genome Analyzer GAII 상에서 수행하였다. 서열을 이후 S. 수이스의 보고된 GenBank 게놈 서열, P1/7 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AM946016.1) (SEQ ID NO: 11) 에 대해 비교하고, 공지된 규정 유전자로 상동성을 확인하였다. 모체 및 돌연변이체 균주 둘 모두의 서열을 비교하여, 유전자의 코딩 부위에서 발생하는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 을 탐색하였다 (발명자에 의해 숙지되어있고 예견되지만 비-코딩 부위는 또한 약독화/무독성 표현형에 대해 관련있을 수 있다). 이러한 분석은 여러 SNP, 및 아미노산 변화를 초래하는 것들 (비-동의어) 이 추가 확인되었다는 것을 나타내었다. 확립된 프로토콜에 따라 Sanger 서열분석 기술을 사용하여 아미노산 변화를 초래하는 SNP 를 확인하였다.

판독물을 커스텀 (custom) Python 스크립트를 사용하여 품질에 대해 필터링하였다. 저품질 염기를 판독물의 말단으로터 먼저 트리밍하고, 이후 20 초과의 품질을 갖는 40bp 이상이 있으며 모호하게 콜링 (call) 된 내부 염기가 없는 경우에만 유지시켰다. 트리밍 및 필터링 단계 후 판독물을 Burrows-Wheeler Aligner (BWA) 버전 0.6.1-r104 (http://bio-bwa.sourceforge.net/) 를 사용하여 참조 게놈 세트에 대해 맵핑하였다. BWA 의 Sequence Alignment/Map (SAM) 출력물을 SAMtools 패키지 (http://samtools.sourceforge.net/) 를 사용하여 추가 분석하여, 변이체를 콜링하였다. 생성된 변이체 콜을 변이체가 게놈 내 그의 위치를 기반으로 주석 달려진, R 로 작성된 커스텀 스크립트를 사용하여 추가 분석하였다. 변이체를 또한 커버리지의 깊이, SAMtools 에 의해 보고된 유전자형 품질, 및 모체 및 돌연변이체로부터의 샘플에 대해 분리된 변이체를 기반으로 필터링하였다. SAMtools 를 또한 맵핑 결과를 기반으로 컨센서스 서열을 생성시키는데 사용하였다. 참조 서열을 기반으로 이 서열에 주석을 달고, 커스텀 스크립트 및 BioPython (http://biopython.org/wiki/Biopython) 을 사용하여 Artemis 양립성에 대한 Genbank 파일로서 포맷하였다. 모체 대 돌연변이체 (백신) 게놈의 비교로, 2 개 유전자에 걸쳐 3 개의 SNP 스패닝이 생성되었다; 1) rpsL-S12 30S 리보솜 서브유닛 단백질에서의 2 개 SNP 및 2) ABC 트랜스포터 ATP 결합 멤브레인 단백질에서의 1 개 SNP. 이들 3 개 SNP 를 표준 Sanger 서열분석 방법에 의해 확인하였다.

rpsL-S12 30S 리보솜 서브유닛 단백질의 기능적 중요성 : 소규모, 30S 서브유닛 단백질 (S) 및 대규모 50S 서브유닛 단백질 (L) 은 단백질 합성 기관의 중요한 성분이다. 이들 서브유닛 단백질은 많은 항생제에 대한 결합 부위로서 기능하며 이들 서브유닛 단백질의 임의의 하나/그 이상에서의 돌연변이는 항생제 저항성 또는 감수성을 초래한다. 소규모 서브유닛에서의 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 에 의한 돌연변이는 테트라사이클린, 스펙티노마이신, 히그로마이신 B 및 스트렙토마이신과 같은 항생제에 대해 저항성을 부여하는 한편, 대규모 서브유닛에서의 돌연변이는 클로람페니콜, 에리트로마이신 및 스트렙그라민 B 에 대한 저항성을 부여한다. S. 수이스 백신 균주는 소규모 리보솜 서브유닛 단백질 (S12) 에서의 이들 2 개 SNP 의 결과로서 네오마이신 (16 ㎍/ml) 에 대해 저항성이 있으며 무독성 표현형을 갖는다. 야생형 박테리아에서, 네오마이신은 박테리아 세포 멤브레인을 통해 능동적으로 이동되고, 박테리아 리보솜의 30S 서브유닛 상의 특정 수용체 단백질에 결합하며, 단백질 합성을 저해하는 mRNA (메신저 RNA) 와 30S 서브유닛 사이의 개시 복합체로 간섭된다. DNA 는 오독될 수 있으며, 따라서 비-기능적 단백질을 생성시키고; 폴리리보솜이 분열되며 단백질을 합성할 수 없게 된다 [McEvoy, 1989].

ABC 트랜스포터 ATP 결합 멤브레인 단백질의 기능적 중요성 : 박테리아 ATP-결합 카세트 트랜스포터 (ABC-트랜스포터) 는 세포 생존을 위해, 그리고 독성이나 독성 연관 인자를 이동시키는데 필수적이다 [Davidson et al., 2008; Henderson et al., 1994]. ABC 트랜스포터는 세포 생존에 있어서 대단히 필수적이며, 용질 흡수의 중재에 의해 삼투억제제로서 기능하고 삼투 세기에 있어서 치사율 증가를 방지한다 [Poolman et al., 2004]. 추가로, 박테리아 ABC 단백질은 또한 여러 생리학적 과정의 조절에도 관여한다. ABC-트랜스포터는 또한 성분을 세포 표면 (예를 들어 캡슐형 다당류, 지질다당류 및 테이코산), 박테리아 발병 과정에서 관여하는 단백질 (예를 들어 용혈, 헴-결합 단백질 및 알칼리성 프로테아제), 헴, 가수분해 효소, S-층 단백질, 수용능 인자, 독소, 항생제, 박테리오신, 펩티드 항생체, 약물 및 사이드로포어에 밀어냄으로써 박테리아 유출 시스템에서 역할한다 [Davidson et al., 2008; Davidson and Chen, 2004]. 이들은 또한 생합성 경로, 예컨대 세포외 다당류 생합성 및 시토크롬 생물발생에 있어서 중요한 역할을 한다 [Zhou et al., 1998; Poole et al., 1994].

marR 전사 조절자의 기능적 중요성. NCBI 보존 도메인 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi?RID=WWP257HN01N&mode=all) 분석은, 상기 유전자가 marRAB 오페론의 일부인 다수의 항생제 저항성에 관여된 "헬릭스-턴-헬릭스 (helix-turn-helix)" 모티프 (HTH_MARR) 를 함유하는 전사 조절자를 인코딩한다는 것을 나타낸다. 대장균에서, marA 는 항생제 저항성 반응의 양성 조절자를 인코딩하는 한편, marR 은 marRAB 전사의 억제자를 인코딩하며 환경적 신호에 반응하여 MarA 의 생성을 제어한다 (George and Levy, 1983). 개시된 백신 균주에서의 SNP 는 HTH_MARR 도메인 (아미노산 위치 30 ~ 125) 내에 존재한다. 헬릭스-턴-헬릭스 도메인은 DNA 에 결합하며 전사 조절자의 특질이다. 야생형 MarR 단백질은 각각의 서브유닛이 전사 조절에 관여하는 날개형 나선 DNA 결합 모티프를 함유하는 이량체이다.

종합하여, 이들 3 개 유전자에서의 돌연변이 (SNP 는 표 1 에 요약되어있음) 는 NPL S. 수이스 백신 균주를 무독성이고 네오마이신, 가능하게는 기타 항생제에 저항성이 있게 만든다.

표 1. SNP 의 위치 및 약독화 S. 수이스 균주에서의 돌연변이 유전자의 확인

실시예 2 - 돼지에서의 약독화 S. 수이스 백신의 효능

효능 연구에 대한 일반적 프로토콜: 각 백신 희석물의 1 ml 당 콜로니 형성 단위 (CFU) 를 예방접종 전 및 후에 적정을 통해 측정하였다.

이 연구에 포함된 모든 돼지는 Midwest Research Swine, Gibbon, MN 에서 수득하였고, 전달시 건강하고 정상이었다. 상기 무리는 스트랩토코쿠스 수이스 감염 이력이 없으며 돼지 생식 및 호흡 증후군 바이러스 (PRRSV) 에 대해 음성인 고건강 무리로 간주된다. 새끼 돼지 무리는 이전 연구에서 S. 수이스 챌린지에 민감한 이력을 가졌다. 17-24 일령에 돼지를 받았다. 예방접종 전에 동물을 관찰하였고, 기침, 비정상적 호흡 및/또는 파행을 포함하는 질환의 징후가 없었으므로 임상적으로 정상인 것으로 간주되었다. 개별 돼지를 이 연구에서 실험 단위체로 사용하였고, 전달 전에 귀표를 달았다. 마이크로소프트 엑셀에서 무작위수 생성기를 사용하여, 돼지를 방 및 처리군에 무작위하게 배정하였다.

이벤트 일정. 모든 돼지를 제 0 일에 예방접종하였다. 백신군에서의 각각의 돼지에게 1 mL 의 적절한 백신을 경구 투여하였다. 대조군 동물에게 위약으로 역할하는 1 mL 멸균식염수를 경구 투여하였다. 예방접종하고 대략 30-35 일 후, 모든 돼지를 챌린지하고 다음 챌린지 후 7 일 동안 관찰하였다.

챌린지. 챌린지 단리물은 뇌 스왑 샘플로부터의 것이었다 (단리물 8-1433-1). 이는 혈액 한천 플레이트 상에서의 콜로니 외양 (작고, 백색이고, 매끈하며 둥근 콜로니), 그람 염색 반응, 생화학적 시험 (알파-용혈성, 카탈라아제 음성, 6.5% 염화나트륨을 갖는 브로쓰에서 성장이 없음, 에스쿨린 양성) 을 통해 스트랩토코쿠스 수이스 유형 2 단리물로서 확인되었다. 단리물을 액체 배양 배지에서 약 9 log/mL 로 성장시켜, "8-1433-1" 로 표지한 멸균 앰플 중 1 mL 분취액으로 동결시키고, -80℃ 에서 보관하였다. 이전 연구는 돼지에서 상기 단리물의 독성을 입증하였다.

챌린지 하기 약 4 시간 전에, 독성 유형 2 스트랩토코쿠스 수이스 필드 단리물 (단리물 8-1433-1) 의 앰플을 해동하였다. 상기 앰플을 새로운 배지에 접종하는데 사용하고 상기 배양물을 분광광도계에서 600 나노미터 (nm) 에서 광학 밀도가 약 1.0 이 될 때까지 37℃ 에서 궤도 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 배양물을 그람 염색하였고; 연쇄로 있는 작은 구균의 특징적 콜로니 및 단일 세포가 존재하였으며 순수했다. 챌린지 접종물의 생균 계수를 챌린지 직전에, 그리고 챌린지 직후에 측정하였다. 각각의 돼지에게 2 mL 의 챌린지 접종물을 근육내 투여하였다.

관찰. 처리 배분에 대해 맹검 상태인 개인에 의해 돼지를 매일 관찰하였다. 파행, 일어나기를 꺼림, 중추신경계 (CNS) 장애 또는 폐사를 나타내는 임의의 동물을 기록하였다. "S. 수이스 DMO" 는 ATCC 특허 수탁 번호 PTA-13269 하에 부다페스트 조약에 따라 수탁된, 표 1 에 인용한 SNP 를 포함하는 약독화 균주이다.

표 2. 경구 경로 Vx/챌린지 연구 1

표 3. 경구 경로 Vx/챌린지 연구 1

표 4. 경구 경로 Vx/챌린지 연구 2

표 5. 효능 연구 1

표 6. 효능 연구 2

* * * * * * * *

이에 따라 본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 기재하였으며, 본 발명의 취지 또는 범주를 벗어나지 않고 이의 많은 명백한 변형이 가능하므로, 상기 단락에 의해 정의된 본 발명이 상기 상세한 설명에서 나타낸 특정 세부사항에 제한되지 않는다는 것이 이해된다.

The American Type Culture Collection (ATCC)

PTA-13269

20121017

<110> Merial Limited Bey, Russell Lawrence, Paulraj Simonson, Randy Sirigireddy, Kamesh McKeown, Danielle <120> Attenuated Streptococcus suis Vaccines and Methods of Making and Use Thereof <130> MER 12-197 <150> USSN 61/664,935 <151> 2012-06-27 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 411 <212> DNA <213> Streptococcus suis <400> 1 atgcctacaa ttaaccagtt ggtacgtaaa ccacgtaagt ctaaagtaga aaaatctaaa 60 tcaccagctt tgaacgttgg ttacaacagc cgtaaaaaag ttcaaacaaa cgtttcatca 120 ccacaaaaac gcggtgttgc aactcgtgtc ggaacaatga cacctaaaaa acctaactca 180 gcccttcgta aatttgctcg tgtacgtttg agcaacctta tcgaagttac tgcttacatc 240 ccaggtatcg gtcacaactt gcaagaacac agtgtggttc ttcttcgtgg tggacgtgta 300 aaagaccttc caggggtacg ttaccatatc gttcgtggtg cacttgatac tgctggtgta 360 aacgatcgta agcaaggccg ttctaaatac ggtactaaac gtccaaaagg c 411 <210> 2 <211> 137 <212> PRT <213> Streptococcus suis <400> 2 Met Pro Thr Ile Asn Gln Leu Val Arg Lys Pro Arg Lys Ser Lys Val 1 5 10 15 Glu Lys Ser Lys Ser Pro Ala Leu Asn Val Gly 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Leu Asp Ser Leu Arg Asn Lys Val Gly 420 425 430 Ile Val Leu Gln Glu Ser Val Leu Phe Ser Gly Thr Ile Ala Asp Asn 435 440 445 Ile Arg Phe Gly Asp Glu Ser Ile Ser Gln Glu Met Val Glu Thr Ala 450 455 460 Ala Arg Ala Thr His Ile His Asp Phe Ile Met Ser Leu Pro Glu Gly 465 470 475 480 Tyr Glu Thr Phe Val Thr Asp Asp Glu Asn Val Phe Ser Thr Gly Gln 485 490 495 Lys Gln Leu Ile Ser Ile Ala Arg Thr Leu Leu Thr Asp Pro Gln Val 500 505 510 Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ser Asn Val Asp Thr Val Thr Glu Ala 515 520 525 Lys Ile Gln Lys Ala Met Glu Ala Ile Ile Ala Gly Arg Thr Ser Phe 530 535 540 Val Ile Ala His Arg Leu Lys Thr Ile Leu Asn Ala Asp Glu Ile Ile 545 550 555 560 Val Leu Lys Asp Gly Lys Val Ile Glu Gln Gly Asn His Ser Gln Leu 565 570 575 Leu Lys Leu Asn Gly Phe Tyr Ala Glu Leu Tyr His Asn Gln Phe Val 580 585 590 Phe Glu <210> 7 <211> 1782 <212> DNA <213> Streptococcus suis <400> 7 atgaagacgt tacgtttttt ctggttttat tttaaacgct ataaactgtc ctttgctgtg 60 atttttctag ccattgtggc agcgacctac ctgcaggtta 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ggcagaattg 960 cagctagctt tcacaggagc tcatcgtatt caggaaatgt ttgatgagcc tgaggaagtt 1020 cgtcctcaaa acgctccgct atttaccgaa ttaaaagaag gtgttgaaat taaggacatc 1080 gactttggct acttgccagg tcagaaggtc ttggacaagg tgtctatctc tgctcctaag 1140 ggtaagatgg tggcggtcgt tggtccgacg ggatctggta agactaccat tatgaacttg 1200 attaaccgct tctacgatgt caatggtggt agtgtggcct ttgatggtcg cgatattcgg 1260 gaatatgatt tggatagctt gcggaataag gtcggtatcg tcttgcagga gtcggtgtta 1320 ttctcgggta ctattgcgga caatattcgc tttggtgatg agagcatttc gcaggaaatg 1380 gtggaaaccg cagctcgtgc cacccatatc cacgacttca tcatgagctt gccagagggc 1440 tatgaaacct ttgtgaccga tgatgagaat gtcttctcaa caggtcagaa acagttgatt 1500 tccattgccc gtacgctttt gacagaccca caagtcttga ttttggacga agcaacctca 1560 aacgttgata ccgtaacgga ggccaaaatt caaaaggcta tggaggccat tatcgcagga 1620 cggactagct tcgtcattgc ccaccgcctc aaaaccattc tcaatgcgga tgaaatcatc 1680 gtcctcaagg atggaaaggt tatcgagcaa ggcaaccaca gccaacttct caaactaaat 1740 ggcttctacg ccgaacttta ccacaaccag tttgtgtttg aa 1782 <210> 8 <211> 594 <212> PRT <213> Streptococcus suis <400> 8 Met Lys Thr Leu Arg Phe Phe Trp Phe Tyr Phe Lys Arg Tyr Lys Leu 1 5 10 15 Ser Phe Ala Val Ile Phe Leu Ala Ile Val Ala Ala Thr Tyr Leu Gln 20 25 30 Val Lys Thr Pro Val Phe Leu Gly Asn Ala Ile Ala Glu Met Gly Lys 35 40 45 Ile Gly Gln Ala Tyr Phe Met Ala Asn Gln Ala Gly Gln Ala Asp Phe 50 55 60 Gln Pro Asp Met Ala Asp Phe Asn Gly Val Met Leu Asn Leu Phe Phe 65 70 75 80 Ala Tyr Ala Ala Thr Val Val Ala Ser Leu Ile Tyr Thr Leu Leu Phe 85 90 95 Thr Arg Ile Val Ala His Ser Thr Asn Arg Met His Lys Gly Leu Phe 100 105 110 Gly Lys Leu Glu Arg Leu Thr Val Ala Phe Phe Asp Ser His Lys Asp 115 120 125 Gly Asp Ile Leu Ser Arg Phe Thr Ser Asp Leu Asp Asn Ile Gln Asn 130 135 140 Ala Phe Asn Gln Ser Leu Thr Gln Val Val Thr Asn Ile Ala Leu Tyr 145 150 155 160 Val Gly Met Val Ile Met Met Phe Arg Gln Asp Thr Arg Leu Ala Leu 165 170 175 Val Thr Ile Ala Ser Thr Pro Val Ala Leu Ile Ala Leu Val Val Ile 180 185 190 Ile Arg Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Asp Lys Gln Gln Ala Ala Val Ser 195 200 205 Lys Leu Asn Ala Tyr Met Asp Glu Lys Ile Ser Gly Gln Lys Ala Ile 210 215 220 Ile Val Gln Gly Val Gln Glu Glu Thr Ile Asp Gly Phe Leu Glu Leu 225 230 235 240 Asn Glu Glu Val Arg Arg Thr Thr Phe Lys Gly Arg Leu Phe Gly Gly 245 250 255 Ile Leu Phe Pro Phe Met Asn Gly Met Ser Leu Val Asn Thr Ala Ile 260 265 270 Val Ile Phe Ala Gly Ser Ser Ile Val Leu Asn Asp Ser Ser Leu Glu 275 280 285 Thr Ala Ala Ala Leu Gly Leu Val Val Thr Phe Val Gln Tyr Ser Gln 290 295 300 Gln Tyr Tyr Gln Pro Ile Met Gln Val Ala Ala Ser Trp Ala Glu Leu 305 310 315 320 Gln Leu Ala Phe Thr Gly Ala His Arg Ile Gln Glu Met Phe Asp Glu 325 330 335 Pro Glu Glu Val Arg Pro Gln Asn Ala Pro Leu Phe Thr Glu Leu Lys 340 345 350 Glu Gly Val Glu Ile Lys Asp Ile Asp Phe Gly Tyr Leu Pro Gly Gln 355 360 365 Lys Val Leu Asp Lys Val Ser Ile Ser Ala Pro Lys Gly Lys Met Val 370 375 380 Ala Val Val Gly Pro Thr Gly Ser Gly Lys Thr Thr Ile Met Asn Leu 385 390 395 400 Ile Asn Arg Phe Tyr Asp Val Asn Gly Gly Ser Val Ala Phe Asp Gly 405 410 415 Arg Asp Ile Arg Glu Tyr Asp Leu Asp Ser Leu Arg Asn Lys Val Gly 420 425 430 Ile Val Leu Gln Glu Ser Val Leu Phe Ser Gly Thr Ile Ala Asp Asn 435 440 445 Ile Arg Phe Gly Asp Glu Ser Ile Ser Gln Glu Met Val Glu Thr Ala 450 455 460 Ala Arg Ala Thr His Ile His Asp Phe Ile Met Ser Leu Pro Glu Gly 465 470 475 480 Tyr Glu Thr Phe Val Thr Asp Asp Glu Asn Val Phe Ser Thr Gly Gln 485 490 495 Lys Gln Leu Ile Ser Ile Ala Arg Thr Leu Leu Thr Asp Pro Gln Val 500 505 510 Leu Ile Leu Asp Glu Ala Thr Ser Asn Val Asp Thr Val Thr Glu Ala 515 520 525 Lys Ile Gln Lys Ala Met Glu Ala Ile Ile Ala Gly Arg Thr Ser Phe 530 535 540 Val Ile Ala His Arg Leu Lys Thr Ile Leu Asn Ala Asp Glu Ile Ile 545 550 555 560 Val Leu Lys Asp Gly Lys Val Ile Glu Gln Gly Asn His Ser Gln Leu 565 570 575 Leu Lys Leu Asn Gly Phe Tyr Ala Glu Leu Tyr His Asn Gln Phe Val 580 585 590 Phe Glu <210> 9 <211> 447 <212> DNA <213> Streptococcus suis <400> 9 atgggacata ctattgcaga ttttcggaac ttgctcaatc agattgaaca 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Cys His Leu Lys Ala Phe His Glu Glu 100 105 110 Met His His Ser Leu Phe Trp Gly Ile Gln Lys Glu Asp Phe Asp Leu 115 120 125 Val Lys Gln Val Gly Asn Gln Leu Lys Val Asn Ile Gln Arg Tyr Lys 130 135 140 Glu Lys Asn His Val 145 <210> 11 <211> 447 <212> DNA <213> Streptococcus suis <400> 11 atgggacata ctattgcaga ttttcggaac ttgctcaatc agattgaaca aattagtgaa 60 accattgcaa aagaatacga tgtggagcac ttggctggtc cacagggctg ggccttgcgc 120 ttcattgcgg aacggtcgga agccgaaacc tttgtaaaag atatagaagc ggaattaaag 180 atttccaaat cggttgccag caatctggtc aagagaatgg agaaaaatgg ctttatccaa 240 gtccttccct ctaaggttga caaatgcttc aaacagctgg ttttgacaga gaagggacaa 300 gggaagatat gtcacctgaa agcttttcat gaagaaatgc accattcact tttttggggc 360 attcaaaaag aggactttga cttggttaaa caggtgggca atcaattaaa agtaaatatt 420 caacgctata aggagaagaa tcatgtt 447 <210> 12 <211> 149 <212> PRT <213> Streptococcus suis <400> 12 Met Gly His Thr Ile Ala Asp Phe Arg Asn Leu Leu Asn Gln Ile Glu 1 5 10 15 Gln Ile Ser Glu Thr Ile Ala Lys Glu Tyr Asp Val Glu His Leu Ala 20 25 30 Gly Pro Gln Gly Trp Ala Leu Arg Phe Ile Ala Glu Arg Ser Glu Ala 35 40 45 Glu Thr Phe Val Lys Asp Ile Glu Ala Glu Leu Lys Ile Ser Lys Ser 50 55 60 Val Ala Ser Asn Leu Val Lys Arg Met Glu Lys Asn Gly Phe Ile Gln 65 70 75 80 Val Leu Pro Ser Lys Val Asp Lys Cys Phe Lys Gln Leu Val Leu Thr 85 90 95 Glu Lys Gly Gln Gly Lys Ile Cys His Leu Lys Ala Phe His Glu Glu 100 105 110 Met His His Ser Leu Phe Trp Gly Ile Gln Lys Glu Asp Phe Asp Leu 115 120 125 Val Lys Gln Val Gly Asn Gln Leu Lys Val Asn Ile Gln Arg Tyr Lys 130 135 140 Glu Lys Asn His Val 145

Claims

스트랩토코쿠스 수이스 (Streptococcus suis) (S. 수이스) 또는 S. 수이스에 의한 질환에 대항하여 돼지에서 안전하고 효과적인 면역 반응을 제공할 수 있는 약독화 S. 수이스 균주로서,
SEQ ID NO: 4, 8 및 12 에서 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 갖는 약독화 S. 수이스 균주.
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제 1 항에 있어서, 특허 수탁 번호 PTA-13269 하에 ATCC 에서 수탁된 균주인 것을 특징으로 하는 약독화 S. 수이스 균주.
제 1 항 또는 제 6 항에 따른 약독화 균주를 포함하는 면역학적 조성물.
제 7 항에 있어서, 약학적 또는 수의학적으로 허용가능한 비히클, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는 면역학적 조성물.
제 8 항에 있어서, 아쥬반트를 추가로 포함하는 면역학적 조성물.
제 9 항에 있어서, 아쥬반트가 키토산인 면역학적 조성물.
제 9 항에 있어서, 아쥬반트가 불활성화된 박테리아, 불활성화된 바이러스, 불활성화된 박테리아의 분획물, 박테리아 지질다당류, 박테리아 독소, 또는 이의 유도체 또는 조합인 면역학적 조성물.
제 7 항에 있어서, 독성 S. 수이스 챌린지에 대항하여 돼지에서 보호 면역 반응을 제공하는 면역학적 조성물.
제 8 항에 있어서, S. 수이스 외의 병원균과 연관된 하나 이상의 추가적인 항원을 추가로 포함하는 면역학적 조성물.
제 13 항에 있어서, 적어도 하나 또는 그 이상의 추가적인 항원(들) 이 M. hyo(Mycoplasma hyopneumoniae, 마이코플라즈마 하이오뉴모니애), PCV2, PRRSV, SIV 또는 돼지를 감염시킬 수 있고 돼지에서 질병을 일으킬 수 있거나 질병에 걸리기 쉽게 할 수 있는 기타 병원균에 대항한 면역 반응을 돼지에서 이끌어낼 수 있는 면역학적 조성물.
제 8 항에 따른 조성물의 하나 이상의 투여를 포함하는, 인간을 제외한 동물의 예방접종 방법.
제 15 항에 있어서, 돼지가 분만 전 3 주 내지 6 주인 암퇘지인 동물의 예방접종 방법.
제 16 항에 있어서, 예방접종되지 않은 암퇘지로부터의 새끼 돼지와 비교하여, 생성된 새끼 돼지가 감소된 이환율 및/또는 사망률을 갖는 동물의 예방접종 방법.
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