CN104561047A - 毒害艾美耳球虫配子体抗原Engam59基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程疫苗领域，具体涉及一种鸡毒害艾美耳球虫配子体抗原基因、表达及其表达产物的应用。该基因的开放阅读框大小为1473bp，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示。选取编码酪氨酸-丝氨酸和脯氨酸与甲硫氨酸特殊结构域并富含抗原表位的基因片段，构建原核表达载体pET28a(+)-En<i>gam59</i>，转化BL21宿主菌后诱导表达。表达产物能被鸡康复血清识别，显示重组蛋白有免疫原性。用该基因片段构建的重组真核表达质粒pcDNA3.1-En<i>gam59</i>免疫小鼠制备的血清，能与pET28a(+)-En<i>gam59</i>的表达产物特异性结合，显示该基因能用于鸡球虫基因工程疫苗的研制。

Description

毒害艾美耳球虫配子体抗原Engam59基因及其应用

技术领域

本发明涉及毒害艾美耳球虫（Eimeria necatrix）的配子体抗原基因，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体以及所述基因的获取方法和多肽的体外表达方法以及功能鉴定。具体地，本发明的基因来自于鸡毒害艾美耳球虫有性生殖阶段的配子体。

背景技术

鸡球虫病是由艾美耳属的一种或数种球虫寄生在鸡小肠或盲肠黏膜内引起的严重危害养鸡业的原虫病，估计每年全球因球虫病的损失为30亿美元。我国每年仅抗球虫药的年消费就约6～18亿元人民币，由鸡球虫病造成的直接和间接经济损失则难以估计。长期以来，鸡球虫病的防治主要依赖药物。但由于球虫对药物普遍产生了耐药性，引起药效下降。而且在鸡饲养周期中长期添加药物还导致药物残留肉蛋，直接危害人类健康，并污染环境。为此，鸡球虫病的防治方法由化学预防转向了免疫预防。

目前，临床上用于免疫预防鸡球虫病的疫苗有活虫苗和由天然蛋白组成的亚单位疫苗两大类。虽然鸡球虫病活疫苗有着较强的免疫效果，但存在着如扩散病原的风险、球虫虫株的抗原变异、致弱虫株毒力易返强、疫苗接种剂量难以控制、疫苗影响饲料报酬、生产成本高、免疫程序繁琐、操作和免疫后的监测和管理技术要求高等一些突出的问题。

商品化的鸡球虫病亚单位疫苗是由来源于巨型艾美耳球虫配子体的三种纯化抗原（分子质量分别为230、82、56 kDa）配制而成，用于干扰卵囊壁的形成，即阻断艾美耳球虫的有性生殖阶段，从而降低卵囊的产生与传播。由于该类疫苗的抗原需从配子体蛋白中经亲和柱分离纯化，配子体又需从感染鸡体的肠道上皮细胞中分离纯化，因此生产工艺复杂，成本高，难易满足生产需求。而利用基因工程技术大量生产该类抗原，可能是解决这一问题的最佳策略。但巨型艾美耳球虫配子体抗原Emgam82和Emgam56基因已受到专利保护，而且在不同鸡球虫种类间缺乏完全的交叉保护力。

毒害艾美耳球虫是鸡球虫病的重要病原之一，主要发生在60日龄以上的鸡。由于在鸡球虫不同种间缺乏交叉保护性，毒害与柔嫩和巨型艾美耳球虫在寄生部位的竞争性，以及毒害艾美耳球虫繁殖力低等原因，因此在育雏阶段用疫苗免疫预防，往往不能控制鸡饲养后期由毒害艾美耳球虫引发的球虫病。从毒害艾美耳球虫配子体克隆配子体抗原基因，构建原核表达载体表达重组抗原。用毒害艾美耳球重组配子体抗原或用毒害艾美耳球虫配子体抗原基因构建的核酸疫苗免疫饲养后期的鸡，针对性地防治毒害艾美耳球虫引发的球虫病。

迄今为止，文献报道的毒害艾美耳球虫配子体抗原基因仅见Engam22基因，并已受专利保护。除了Engam22基因外，在国内外还没有其他毒害艾美耳球虫配子体抗原基因序列及其重组表达的报道。

发明内容

本发明利用基因工程技术，克隆毒害艾美耳球虫配子体抗原基因Engam59，选取编码酪氨酸-丝氨酸和脯氨酸和甲硫氨酸特殊性结构域并富含抗原表位的基因片段（第631-1296位核苷酸），转入工程菌进行表达，获得大量的重组抗原，并对重组抗原的特异性、免疫原性等进行深入研究，旨为研制鸡球虫重组配子体抗原疫苗奠定基础。

本发明涉及毒害艾美耳球虫的一种配子体抗原基因，其中，所述的基因全长为1473 bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。：

其中包含的开放阅读框大小为1473 bp，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

选取第211-432位氨基酸片段进行原核表达。

本发明涉及到一种表达载体pET28a(+)，其含有所述配子体抗原基因。将分离得到的配子体抗原基因插入酶切位点，连接到原核表达载体pET28a(+)中，常规转化肠杆菌BL21（DE3），构建基因工程菌，并诱导表达，对表达产物进行分离、纯化和复性。

此外，本发明涉及一种真核表达载体pcDNA3.1(+)，其含有所述配子体抗原基因。将分离得到的Engam59基因片段插入酶切位点，连接到pcDNA3.1(+)中，构建成pcDNA3.1(+)- Engam59真核重组质粒，免疫小鼠获得多克隆抗体；以此鼠多抗为一抗，以原核表达的Engam59重组蛋白为抗原进行Western-blot检测，鉴定真核质粒的免疫原性。

作为优选的方案，具体操作是：

1）从毒害艾美耳球虫配子体基因中分离Engam59基因：

常规方法分离纯化毒害艾美耳球虫配子体，用RNA提取试剂盒提取总RNA。设计特异性引物：

上游引物：5’- ATGACTCGTCTCGCCGCCTGCGCTG -3’ （ SEQ ID NO.3）；

下游引物：5’- TTACTCAAATCCAAAAGAAGGAATGCC -3’ （ SEQ ID NO.4）；。

以配子体总RNA反转录得到的cDNA为模板，经过PCR条件的反复优化后，成功扩增出与预期结果相符且大小为1473 bp左右的特异性片段（图1），命名为Engam59。将含有目的片段PCR产物经试剂盒纯化回收后，克隆到pGEM-T-easy载体中，得到pGEM-T-easy-Engam59。

2）原核表达载体的构建

根据毒害艾美耳球虫Engam59基因的ORF序列和质粒pET28a(+)酶切位点，选取编码第211-432位氨基酸的基因片段，设计1对特异性引物：

上游引物F：5’- CCGGAATTCGCTGAGGAGGATATTGTGAAG -3’， （ SEQ ID NO.5）；含EcoRⅠ酶切位点（划线部分）和3个保护性碱基；

下游引物R：5’- CCGAAGCTT TTATGCTGGGTAGGCGGGGTA -3’， （ SEQ ID NO.6）；含HindⅢ酶切位点（划线部分）、终止密码子（黑体部分）和3个保护性碱基。

以构建的pGEM-T-easy-Engam59载体为模板，成功扩增出与预期结果相符且大小为687bp左右的特异性片段（图2），并将此片段连接到原核表达载体pET28a(+)中，得到pET28a(+)-Engam59。

3）毒害艾美耳球虫Engam59基因的高效表达，纯化，复性

将构建好的原核表达载体pET28a(+)-Engam59转化BL21宿主菌，IPTG诱导表达后，经过可溶性分析，发现此体外重组表达的蛋白以包涵体形式存在（图3）。重组蛋白的大量表达时，超生裂解释放包涵体后，尿素变性。变性蛋白通过含有HIS标签的Ni-NTA亲和层析纯化后，分别在含有6M、4M、2M、1M尿素的透析液和不含尿素的PBS中各复性8h，最终通过PEG8000浓缩，收集蛋白，12% SDS-PAGE分析（图4），4°C保存。

4）体外重组表达蛋白的特异性和免疫原性检测

分别以抗HIS的单克隆抗体（图5）、鼠抗Engam59的多克隆抗体（图6）和毒害艾美耳球虫卵囊三次免疫后鸡的康复血清（图7）为一抗，采用Western-blot方法检测重组蛋白的特异性和免疫原性。

本发明还公开了所述Engam59基因在构建防治鸡毒害艾美耳球虫核酸疫苗中的应用。

所述核酸疫苗的构建如下：

根据Engam59基因序列和pcDNA3.1(+)的特性，设计1对特异性引物：

上游引物F1：5’- CCGAAGCTTGCTGAGGAGGATATTGTGAAG -3’ （ SEQ ID NO.7），，含HindⅢ酶切位点（划线部分）和3个保护性碱基；

下游引物R1：5’- CCGGAATTC TTATGCTGGGTAGGCGGGGTA -3’ （ SEQ ID NO.8），，含EcoR Ⅰ酶切位点（划线部分）、终止密码子（黑体部分）和3个保护性碱基。

以构建的pGEM-T-easy-Engam59载体为模板，成功扩增得到与预期结果相符大小为687bp左右的特异性片段（图8），并将该目的片段连接到质粒pcDNA3.1(+)中，得到pcDNA3.1(+)-Engam59。

将构建的重组质粒pcDNA3.1-Engam59进行EcoR I和Hind Ⅲ双酶切鉴定（图9），选择阳性克隆株测序，确定阅读框正确后大量克隆用于后续试验。

核酸疫苗的免疫原性分析：

鼠抗重组质粒pcDNA3.1(+)-Engam59多克隆抗体的制备：取6~8周龄BALB/c雌鼠6只，肌肉注射0.75%利多卡因50μl/只辅助扩散，24h后在相同部位注射重组质粒pcDNA3.1(+)-Engam59 100μg/只。此后第2周第3周各加强免疫一次，操作与剂量不变。3次免疫后第10天摘眼球取血，37°C静置30min，4°C静置4h，2500rpm离心15min，收集分离血清。以此血清为一抗，采用Western-blot方法检测原核表达的Engam59重组蛋白，从而鉴定核酸疫苗的免疫原性（图10）。

附图说明

图1是毒害艾美耳球虫Engam59基因整个ORF扩增结果。泳道1为标准分子量；泳道2为扩增得到的目的片段，大小为1473bp。

图2是毒害艾美耳球虫Engam59基因第211-432位氨基酸编码区基因，加入酶切位点、保护性碱基和终止密码子后的扩增结果。泳道1为标准分子量；泳道2为扩增得到的目的片段，大小为687bp。

图3是毒害艾美耳球虫Engam59基因体外重组表达蛋白可溶性分析结果，其中1：标准蛋白质分子量标记；2：菌体裂解后的上清；3：菌体裂解后的包涵体。

图4是毒害艾美耳球虫Engam59基因的纯化和复性结果分析，其中1：标准蛋白质分子量标记；2：重组菌超生后上清；3：包涵体尿素裂解后沉淀；4：包涵体尿素裂解后上清；5：结合缓冲液作用下裂解液与Ni-NTA结合后的流出液；6：洗涤缓冲液的第一次洗脱液；7：洗涤缓冲液的第三次洗脱液；8：Ni-NTA亲和纯化后的目的蛋白。

图5是Western-blot鉴定体外重组表达蛋白特异性的结果，其中1：预染蛋白质分子量标记；2：pET28a(+)/BL21 IPTG诱导；3：BL21 IPTG诱导；4：pET28a(+)-Engam59/BL21 IPTG诱导。

图6是鼠抗毒害艾美耳球虫体外重组表达蛋白Engam59多克隆抗体Western-blot检测结果，其中1：预染蛋白质分子量标记；2：pET28a(+)-Engam59/BL21 IPTG诱导；3：pET-28a(+)/BL21 IPTG诱导；4：BL21 IPTG诱导。

图7是毒害艾美耳球虫三次免疫鸡的康复血清Western-blot检测结果，其中1：预染蛋白质分子量标记；2：pET28a(+)-Engam59/BL21 IPTG诱导；3：pET-28a(+)/BL21 IPTG诱导；4：BL21 IPTG诱导。

图8是构建核酸疫苗用Engam59基因片段扩增结果：其中1：标准分子量；2、3是扩增得到的目的片段，大小为687bp。

图9是重组质粒pcDNA3.1-Engam59双酶切鉴定结果：其中1：标准分子量；2、3、4是双酶切结果，其中质粒片段大小为5391 bp，目的片段大小为687 bp。

图10是毒害艾美耳球虫Engam59基因体外重组表达蛋白对重组真核质粒免疫小鼠多克隆抗体Western-blot检测结果，其中1：预染蛋白质分子量标记；2：BL21 IPTG诱导；3：pET-28a(+)/BL21 IPTG诱导；4：pET-28a(+)-Engam56/BL21 IPTG诱导。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

实施例1：从毒害艾美耳球虫配子体基因中分离Engam59基因

常规方法分离纯化毒害艾美耳球虫配子体，用RNA提取试剂盒提取总RNA。

 RT-PCR钓取Engam59基因：

参照TaKaRa公司的（TaKaRa RNA LA PCR^TM Kit (AMV) Ver.1.1）提供的方法：两步法RT-PCR试剂盒扩增gam59基因。

Engam59基因的钓取采用上游引物(5’- ATGACTCGTCTCGCCGCCTGCGCTG -3’) 和下游引物(5’- TTACTCAAATCCAAAAGAAGGAATGCC -3’)。

第一步：反转录反应，总体系为10μl：0.5μl总RNA（≤500ng total RNA），2μl 25mM的MgCl₂，1μl 10×RNA PCR Buffer，4.25μl RNase Free dH₂O，1μl浓度为10 mM的dNTP，0.25μl RNase Inhibitor，0.5μl 5u/μl AMV逆转录酶和0.5μl Oligo dT接头引物。反应步骤：42°C逆转录反应30min；99°C变性5min；5°C冷却5min。

第二步：PCR反应，总体积为50μl： 3μl 25mM的MgCl₂，4μl 10×LA PCR BufferⅡ（Mg²⁺ Free），31.75μl灭菌蒸馏水，0.25μl TaKaRa LA Taq，0.5μl上游引物（10μM），0.5μl下游引物（10μM），然后把第一步反转录反应中的产物10μl加入到此体系中。PCR反应步骤：94°C预变性3min；94°C变性30s；60°C退火30s；72°C延伸1.5min，共28个循环。反应结束后，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1。将得到的Engam59基因克隆到pGEM-T-Easy载体中，送往华大基因公司测序。（重组载体命名为：pGEM-T-Easy-Engam59）。

实施例2：表达片段Engam59的扩增

根据毒害艾美耳球虫Engam59基因的ORF序列和质粒pET28a(+)（Invitrogen，USA）的酶切位点，选取第211-432位氨基酸编码区基因片段，设计特异性引物，扩增表达用的基因片段。

根据质粒pET28a(+)上具备的酶切位点，对Engam59基因进行序列分析后，选择第211-432位氨基酸编码区基因进行截短表达，选取EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点，设计得到的特异性引物为：上游引物（5’- CCGGAATTCGCTGAGGAGGATATTGTGAAG -3’）含EcoRⅠ酶切位点（划线部分）和3个保护性碱基，下游引物（5’- CCGAAGCTT TTATGCTGGGTAGGCGGGGTA -3’）含HindⅢ酶切位点（划线部分）、含终止密码子（黑体部分）和3个保护性碱基。

50μl PCR反应体系如下：5μl 10×反应缓冲液；浓度为10μM的上、下游引物各1μl，4μl dNTP（10mM）；37.5μl H₂O；0.5μl TaKaRa LA Taq酶，1μl模板pGEM-T-Easy-Engam59。95°C变性5min；95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸1min，共30个循环；72°C，延伸10min。反应结束后，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2。扩大反应体系后，将得到的PCR产物纯化回收，-20°C保存备用。

实施例3：原核表达载体的构建

双酶切pET28a(+)：

EcoRⅠ和HindⅢ为Fermentas产品。50μl酶切体系为：5μl 10×FastDigest Green Buffer，20μl载体pET28a(+)，FastDigest EcoRⅠ和FastDigest HindⅢ各2.5μl，20μl ddH₂O。37°C反应2h，1.2%琼脂糖凝胶电泳，胶回收产物。

双酶切实施例2中纯化的PCR产物：

EcoRⅠ和HindⅢ为Fermentas产品。100μl酶切体系：10μl 10×FastDigest Green Buffer；20μl纯化PCR（Engam59）产物；FastDigest EcoRⅠ和FastDigest HindⅢ各5μl；60μl ddH₂O。37°C反应2h，1.2%琼脂糖凝胶电泳，胶回收酶切产物。

连接反应：

SolutionⅠ为TaKaRa产品。8μl双酶切载体pET28a(+)，2μl双酶切PCR产物，10μl solutionⅠ，16°C连接过夜。

取10μl连接产物转化感受态细胞DH5α。涂布到含有卡那霉素抗性的LB平板，第二天挑取单克隆，过夜培养后，提取质粒，采用双酶切鉴定法挑选阳性克隆（重组载体命名为：pET28a(+)-Engam59），并送交华大基因公司测序。

实施例4：Engam59基因在大肠杆菌中的诱导表达

挑取测序正确的克隆转化感受态BL21(DE3)。挑取单个菌落接种到3ml LB培养液(含100μg/ml卡那霉素)中，37°C，200rpm振荡培养过夜，按1∶100转接种到10ml含相同浓度抗生素LB中，37°C 200rpm振荡培养4h，加入终浓度为1mM的IPTG，37°C 200rpm诱导4h，12% SDS-PAGE检测表达情况。结果如图3，清楚表明表达的蛋白分子量在28 kDa左右，而且主要存在于包涵体内。

实施例5：表达产物的纯化和复性

4°C 12 000rpm离心5min收集菌体，以0.1M PBS重悬沉淀，然后冰浴超声（超声2s，间隙3s，25min）。4°C 12000rpm离心10min，收集包涵体沉淀。沉淀中加入10ml Lysis Equilibrium Buffer (100 mM NaH₂PO₄，10 mM Tris-Cl，8M urea，pH 8.0)，超声（超声2s，间隙3s，15min）辅助包涵体的裂解，4°C 12000rpm离心10min，收集上清加入到预先用LE Buffer平衡处理的Ni-NTA柱中，4°C作用30min，期间要不断的摇晃。按照GenScript公司提供的操作手册纯化蛋白。

收集Elution Buffer（100 mM NaH₂PO₄，10 mM Tris-Cl，500 mM Imidazole，8 M urea，pH 8.0）洗脱的蛋白，装入透析袋，在复性缓冲液 (50mmol/L Tris-HCl，0.15mol/L NaCl，pH 8.0)分别加入6M、4M、2M、1M 尿素进行梯度透析复性，每个浓度的尿素，4°C透析复性8h，最后在含有0M尿素的PBS（pH8.0）中透析复性8h。PEG8000浓缩蛋白，12% SDS-PAGE检测，蛋白-20°C保存。重组蛋白的纯化和复性结果如图4。

实施例6：表达产物的特异性检测

将诱导的阳性重组菌、空质粒转化菌和未转化菌蛋白20μl，12% SDS-PAGE电泳，并转移到硝酸纤维素膜上，转印结束后将NC膜置在含3% BSA的TBS缓冲液中室温封闭1.5h，随后用一抗为鼠抗HIS标签单克隆抗体（BBI，USA）（用封闭液稀释至1 μg/ml，共15ml），37°C下作用1.5h，TBST洗涤5min，重复3次；接着用HRP标记的兔抗鼠IgG为二抗，用封闭液1∶2000稀释，室温下作用1.5h，TBST洗涤5min，重复3次；最后用TMB缓冲液显色1min，去离子水漂洗终止反应后室温干燥，结果如图5。

实施例7：表达产物的免疫原性检测

将诱导的阳性重组菌、空质粒转化菌和未转化菌蛋白20μl，12% SDS-PAGE电泳，并转移到硝酸纤维素膜上，转印结束后将NC膜置在含3% BSA的TBS缓冲液中室温封闭1.5h，随后用一抗为本实验室制备的鼠抗rEnGAM59多克隆抗体，用封闭液1∶200稀释，37°C下作用1.5h；TBST洗涤5min，重复3次，接着用HRP标记的兔抗鼠IgG为二抗，用封闭液1∶1000稀释，室温下作用1.5h；TBST洗涤5min，重复3次；最后用TMB缓冲液显色1min，去离子水漂洗终止反应后室温干燥，结果如图6。

将诱导的阳性重组菌、空质粒转化菌和未转化菌蛋白20μl，12% SDS-PAGE电泳，并转移到硝酸纤维素膜上，转印结束后将NC膜置在含3% BSA的TBS缓冲液中室温封闭1.5h，随后一抗为本实验室制备免疫毒害艾美耳球虫后鸡的康复血清，用封闭液1∶100稀释，37°C下作用1.5h；TBST洗涤5min，重复3次，接着用HRP标记的兔抗鸡IgY（IgG）为二抗，用封闭液1∶1000稀释，室温下作用1.5h；TBST洗涤5min，重复5次；最后用TMB缓冲液显色1min，去离子水漂洗终止反应后室温干燥，结果如图7。

实施例8：构建核酸疫苗

PCR扩增Engam59基因：

根据质粒pcDNA3.1(+)（购自Invitrogen公司）的特征和Engam59基因序列，设计特异性引物，扩增目的片段（第631-1296位核苷酸，片段大小为687 bp）。

根据质粒pcDNA3.1(+)的特性，选取EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点，设计特异性引物：

上游引物F1：5’- CCGAAGCTTGCTGAGGAGGATATTGTGAAG -3’，含HindⅢ酶切位点（划线部分）和3个保护性碱基；

下游引物R1：5’- CCGGAATTC TTATGCTGGGTAGGCGGGGTA -3’，含EcoR Ⅰ酶切位点（划线部分）、终止密码子（黑体部分）和3个保护性碱基。

50μl PCR反应体系： 5μl 的10×反应缓冲液；浓度为10μM的上、下游引物各1μl，4μl dNTP（10mM）；37.5μl H₂O；0.5μl TaKaRa LA Taq酶，1μl模板pGEM-T-Easy-Engam59。95°C变性5min； 95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸1min，共30个循环；72°C，延伸10min。反应结束后，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2。扩大反应体系后，将得到的PCR产物纯化回收，-20°C保存备用。

双酶切纯化回收的PCR产物：

HindⅢ和EcoRⅠ为Fermentas产品。100μl酶切体系：10μl 10×FastDigest Green Buffer；20μl纯化的PCR（Engam59）产物；FastDigest HindⅢ和FastDigest    EcoRⅠ各5μl；60μl高压灭菌ddH₂O。37°C水浴反应2h，1.2%琼脂糖凝胶电泳,胶回收试剂盒回收酶切产物。

双酶切质粒pcDNA3.1(+):

HindⅢ和EcoRⅠ为Fermentas产品。60μl酶切体系为：6μl 10×FastDigest Green Buffer，30μl载体pcDNA3.1(+)，FastDigest HindⅢ和FastDigest EcoRⅠ各3μl，18μl高压灭菌ddH₂O。37°C水浴反应2h，1.2%琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收酶切产物。

连接反应:

SolutionⅠ购自TaKaRa公司。1μl双酶切载体pcDNA3.1，3μl双酶切PCR产物，10μl solutionⅠ，6μl高压灭菌ddH₂O。16℃连接过夜。

取10μl连接产物转化200μl感受态细胞DH5α。接种到含氨苄抗性的LB平板，37°C培养过夜。第二天挑取单菌落，过夜培养，提取质粒，双酶切鉴定法挑选阳性克隆株（重组质粒命名为：pcDNA3.1(+)-Engam59）送至华大基因公司测序。

实施例9：核酸疫苗的免疫原性分析

多克隆抗体的制备：

获取血清：常规方法大剂量获取重组质粒，并测定质粒浓度。取6周龄BABL/c雌鼠肌肉注射质粒溶液（质粒浓度100μg）。在此后第8天、第15天各加强免疫一次，注射部位与免疫剂量同上。每次免疫前24h在免疫部位注射0.75%的利多卡因50ml，用于辅助肌细胞对质粒的吸收扩散。3免后第10天摘眼球取血，分离血清，用于Western-blot检测真核重组质粒的免疫原性。

Western-blot检测：将诱导的阳性重组菌、空菌和空质粒转化菌蛋白20μl，12% SDS-PAGE电泳，并转移到硝酸纤维素膜上，转印结束后将NC膜置在含3% BSA的TBS缓冲液中4°C封闭过夜，随后用上述试验制备的鼠抗pcDNA3.1(+)-Engam59多克隆抗体作为一抗，用封闭液1∶200稀释，37°C下作用1.5h；TBST洗涤5min，重复3次，再用TBS洗涤5min；接着用HRP标记的兔抗鼠IgG为二抗，用封闭液1∶1000稀释，室温下作用1.5h；TBST洗涤5min，重复5次，再用TBS洗涤5min；最后用DAB缓冲液显色1min，去离子水漂洗终止反应后室温干燥，结果如图10，即重组质粒pcDNA3.1-Engam59免疫小鼠后产生的抗体能与原核表达的Engam59重组蛋白特异性反应，显示核酸疫苗具有免疫原性。

Claims (4)

1.一种鸡毒害艾美耳球虫配子体抗原基因Engam59，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种鸡毒害艾美耳球虫配子体抗原，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.重组毒害艾美耳球虫配子体抗原的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1）从毒害艾美耳球虫配子体基因中分离Engam59基因：

引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，以配子体总RNA反转录得到的cDNA为模板，扩增出大小为1473 bp的特异性片段，命名为Engam59；将含有目的片段PCR产物经试剂盒纯化回收后，克隆到pGEM-T-easy载体中，得到pGEM-T-easy-Engam59；

2）原核表达载体的构建

特异性引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以构建的pGEM-T-easy-Engam59载体为模板，扩增大小为687bp的特异性片段，并将此片段连接到原核表达载体pET28a(+)中，得到pET28a(+)-Engam59；

3）毒害艾美耳球虫Engam59基因的高效表达，纯化，复性

将构建好的原核表达载体pET28a(+)-Engam59转化BL21宿主菌，IPTG诱导表达后，超声裂解释放包涵体后，尿素变性；变性蛋白通过含有HIS标签的Ni-NTA亲和层析纯化后，分别在含有6、4、2、1 mol/L尿素的复性缓冲液中透析复性8h，随后在PBS液中透析8h，最终通过PEG8000浓缩，收集蛋白，12% SDS-PAGE分析，4°C保存。

4.权利要求1所述的Engam59基因在构建防治鸡毒害艾美耳球虫核酸疫苗中的应用。