CN102294027A - 一种呼吸道合胞病毒f2蛋白亚单位疫苗及其制备方法 - Google Patents

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杨靖佳
曾韦锟
黄芬
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Abstract

本发明公开了一种呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗及其制备方法，本方法构建了重组表达载体F2/pFN18K，并将重组表达载体转化到大肠杆菌中形成重组工程菌，重组工程菌经过发酵培养，通过鼠李糖诱导在大肠杆菌中获得高效表达Halo-F2蛋白，并通过烟草蚀斑病毒蛋白酶（TEV）酶切、层析纯化获得纯度较高的F2蛋白；本发明动物实验表明，F2蛋白免疫原性较强，能刺激机体产生较好的免疫应答，用于人体或动物预防接种，抵抗呼吸道合胞病毒的感染，在大肠杆菌中原核表达F2蛋白，可以提高蛋白疫苗的表达水平，对于规模化生产及其临床应用具有重要的现实意义。

Description

一种呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus, RSV）是引起婴幼儿患毛细支气管炎、肺炎、支气管炎的主要病原体之一，可导致婴幼儿的死亡。免疫缺陷病人及老年人也是RSV的易感人群。自病毒发现以来，虽对RSV研究取得一定进展，但目前只有两种单抗批准上市，以治疗患病严重的患者。而一种有效、完全安全的RSV疫苗并未问世。世界卫生组织(WHO)已将RSV 疫苗列为全球疫苗发展计划中优先发展的疫苗之一。
然而60年代使用的RSV灭活疫苗虽可诱导中和抗体的产生，但疫苗使用后增强了婴幼儿后继感染野毒株RSV的发病程度，甚至引发死亡。随后的RSV的减毒活疫苗会导致上呼吸道的轻微至中度充血，且免疫原形差、遗传性不稳定。目前研制的RSV亚单位疫苗被认为是相对安全的，并不存在毒力返祖与免疫原性低下等问题。RSV囊膜上的膜融合（F）和粘附(G)糖蛋白均可诱导机体产生中和抗体。但相比较而言，G蛋白倾向于体液免疫，而F蛋白既可诱发体液免疫也可以诱发一定的细胞免疫，且氨基酸序列相对保守。所以在SRV的保护性抗原中，F蛋白比G蛋白更重要。
但目前基于F蛋白相关的疫苗，难以在原核表达系统获得表达，完全依赖于细胞培养获得。其对环境要求较高，且成本昂贵，不利于疫苗的普及。F2肽段是决定RSV感染的宿主细胞特异性的唯一因素。目前已通过小鼠模型确定了2个位于F2区的CTL识别位点AA85-93和AA92-106，其次，AA51-65也是重要的T细胞识别表位。本发明选择通过原核表达系统融合表达F2蛋白，再通过酶切获得纯度较高的非融合的F2蛋白。
因此，本发明用F2蛋白免疫机体，开发一种有效的呼吸道合胞病毒亚单位疫苗。
发明内容
本发明提供了一种呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗，旨在能刺激机体产生较好的免疫应答，用于人体或动物预防接种，抵抗呼吸道合胞病毒的感染，F2蛋白是由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列所编码或具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
本发明另一目的在于提供一种呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：
（1）重组表达载体F2/pFN18K的构建
以F/pMD18T质粒为模板，PCR扩增获得F2基因，并引入NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点和6×His标签，F2基因经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后得到带有粘性末端的目的基因，并与同样双酶切过的大肠杆菌表达载体pFN18K相连接，形成重组表达载体F2/pFN18K；
（2）F2蛋白的诱导表达及其纯化
重组表达载体F2/pFN18K转化到大肠杆菌表达菌株中，形成重组工程菌，重组工程菌经过发酵培养，采用鼠李糖诱导表达Halo-F2融合蛋白；经诱导的重组工程菌采用超声破菌，4℃下2000rpm离心10分钟后，用梯度透析方法对Halo-F2融合蛋白复性，复性后的蛋白在4℃下，透析至烟草蚀斑病毒蛋白酶（TEV）反应液中，每1mg Halo-F2融合蛋白加入10U TEV酶，酶切反应8h-12h，酶切后的蛋白经过层析纯化，得到疫苗蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明所述的方法中大肠杆菌表达载体为质粒pFN18K及其衍生质粒、以及适用于大肠杆菌系统的含HaloTag®7或脱卤素酶的遗传修饰衍生物与TEV酶切位点系列的表达载体，如pFN6K、pFC14A等。
本发明所述的方法中大肠杆菌表达菌株为KRX菌株及其它E. coli K细胞株。
本发明所述的方法中转化大肠杆菌表达菌株的方法为热休克转化法，电转化法或原生质体转化法。
本发明所述的方法中采用金属离子亲和层析纯化法或离子交换层析法纯化蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
在大肠杆菌中原核表达F2蛋白，可以提高蛋白疫苗的表达水平，由于大肠杆菌结构简单、生长快速、易于培养和发酵、生产成本低、目的蛋白产量高，这对于规模化生产及其临床应用具有重要的现实意义。
附图说明
图1是PCR扩增获得F2基因电泳图。（1：DNA Marker 2K plus；2：F2目的基因片段）。
图2是重组表达载体F2/pFN18K双酶切鉴定电泳图。（1：DNA Marker 2K plus；2：1号F2/pFN18K质粒NcoⅠ和BamHⅠ双酶切结果；3：2号F2/pFN18K质粒NcoⅠ和BamHⅠ双酶切结果）。
图3是Halo-F2蛋白表达的SDS-PAGE检测图（1：蛋白分子量标准；2：未诱导的F2/pFN18K/KRX全菌蛋白；3：诱导后的F2/pFN18K/KRX全菌蛋白；4：诱导后的F2/pFN18K/KRX破菌2000rpm沉淀；5：诱导后的F2/pFN18K/KRX破菌12000rpm沉淀；6：诱导后的F2/pFN18K/KRX破菌上清）。
图4是Halo-F2蛋白酶切与F2纯化的SDS-PAGE检测图（1：蛋白分子量标准；2：酶切前的Halo-F2蛋白；3：酶切后的Halo-F2蛋白；4：流穿峰；5：0.4mol/L 咪唑洗脱峰；6：1mol/L咪唑洗脱峰）。
图5是动物免疫指标分析图。A是三次免疫后血清中总IgG的变化；B是免疫结束后检测IgG1/IgG2a比值。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。
实施例 1 F2 基因的获得
扩增F/18T/DH5α菌株（本实验室保存，含有RSV融合蛋白F的全基因），然后采用博大泰克公司质粒抽提试剂盒提取质粒（以下质粒抽提均按说明书方法操作），以此质粒为模板，用TIANGEN公司的Taq DNA聚合酶扩增F2基因，引入了NcoⅠ，BamHⅠ两个酶切位点以及6×His标签，采用的引物序列为：F2PFNP1: 5’-CCGCCATGGAGGCTTCCAGTCAAAACATCACTGAAGAATTT-3’，F2PFNP2: 5’-CGCGGATCCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCCTTCTGGCTCGATTGTTGGCTG-3’；PCR扩增条件为：94℃ 5min；94 ℃ 30s，50℃ 30s，72℃30s(30个循环)；72℃ 5min；回收扩增产物，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，扩增得到了大小为290bp的F2基因（见图1）。
实施例 2 重组表达载体 F2/pFN18K 和重组工程菌F2/pFN18K/KRX的构建
采用博大泰克公司的胶回收试剂盒纯化F2基因（以下胶回收纯化均按说明书方法操作）同时采用博大泰克公司的小量质粒抽提试剂盒抽提pFN18K质粒(购买于美国Promega公司)，用NcoⅠ和BamHⅠ（购于于TAKARA公司）于37℃双酶切F2基因与pFN18K质粒3小时。用胶回收试剂盒回收双酶切的F2片段与pFN18K片段。取180ng F2片段与90ng pFN18K片段，用0.5μl T4 DNA连接酶（来源于TAKARA公司，CK5021B）于16℃连接过夜，连接产物通过热休克法转化用CaCl2制备的E. coli KRX感受态细胞(购买于美国Promega公司)，涂布Kan+-LB平板，37℃培养16小时，挑取数个单菌落接种Kan+-LB培养液，37℃振荡培养12小时后抽提质粒。用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切重组载体F2/pFN18K（重组质粒：700ng；酶：各1μl；20μl总体系，置于37℃作用3h）后，可以得到大小为290bp的目的片段（见图2）。
实施例 3 Halo-F2 蛋白的诱导表达
挑取重组工程菌F2/pFN18K/KRX单菌落接种到Kan+-LB培养液中，37℃震荡培养过夜，第二天按1%分别接种到新鲜Kan+-LB培养液中，37℃震荡培养至OD600约为0.8时，取适当样品后分别加入终浓度为1μl/ml 鼠李糖（来源于Sanland-chem International Inc，102189），在28℃下诱导表达过夜，诱导结束后取适量样品进行SDS-PAGE鉴定其大小是否正确。Halo-F2蛋白的表观分子量是13.3KDa（见图3），与理论计算值基本一致，为包涵体与可溶蛋白两种形式表达。
实施例 4 F2 蛋白的纯化
诱导表达的重组菌液经过离心收集菌体，用菌体裂解液（0.3mol/L Tris basic、0.1mol/L NaCl、pH9.0）重悬，超声破菌，4℃下2000rpm沉淀弃上清，将2000rpm沉淀溶于变性缓冲液（0.1mol/L NaCl，0.3mol/L Tris basic, 8mol/L 尿素，pH9.0）后，通过梯度稀释复性，复性Halo-F2蛋白。将复性的Halo-F2蛋白透析至反应液(0.05mol/L NaH2PO4，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA，1mmmol/L DTT，pH8.0)，并稀释Halo-F2蛋白浓度为1mg/L，向其中加入10U TEV酶于20℃酶切8h-12h。酶切后的蛋白液透析至菌体裂解液中，并浓缩蛋白液至5mg/L。用Bio-Rad 5ml亲和层析预装柱进行亲和层析纯化，洗涤缓冲液（0.1mol/L NaCl，0.3mol/L Tris basic，8mol/L 尿素，0.4mol/L咪唑，pH9.0）洗涤杂蛋白，使用洗脱缓冲液（0.1mol/L NaCl，0.3mol/L Tris basic，8mol/L 尿素，1mol/L咪唑，pH9.0）洗脱目的蛋白，SDS-PAGE检测并用软件BandScan分析，纯度为90%（附图4）。洗脱的目的蛋白F2透析到PBS溶液中，－20℃保存备用。
实施例 5 动物的免疫及其免疫原性测定
取生长健康的6-8周龄的雌性昆明种小鼠若干，设置PBS（0.14mol/L NaCl，2.7mmol/L KCl，0.01mol/L Na2HPO4，1.8mmol/L KH2PO4，pH 7.4）组，F2蛋白组两组，每组5只。分别在0，2，4周免疫小鼠，每次抗原的使用剂量为50μg/只，PBS组以200μl的无菌PBS代替。每次免疫前一天尾部取血，用以监测血清中IgG的变化趋势。第3次免疫一周后摘眼球处死并取血制备血清。用F2蛋白包板，血清以1:1000稀释后作为一抗，HRP酶标兔抗鼠IgG（来源于KPL公司，100366）以1:4000稀释后作二抗，OPD显色，OD492读数。与PBS组相比，F2蛋白组的抗F2抗体效价上升更加明显，两者之间有显著性差异。说明F2蛋白能引起有效地免疫应答（见图5）。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 昆明理工大学
<120>一种呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗及其制备方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 288
<212> DNA
<213> respiratory syncytial virus
<400> 1
atggaggctt ccagtcaaaa catcactgaa gaattttatc aatcaacatg cagtgcagtt 60
agcaaaggct atcttagtgc tctaagaact ggttggtata ctagtgttat aactatagaa 120
ttaagtaata tcaaggaaaa taagtgtaat ggaacagatg ctaaggtaaa attgataaaa 180
caagaattag ataaatacaa aaatgctgta acagaattgc agttgctcat gcaaagcaca 240
ccagcagcca acaatcgagc cagaaggcac caccaccacc accactaa 288
<210> 2
<211> 95
<212> PRT
<213> respiratory syncytial virus, mycobacteria tuberculosis
<400> 2
MET Glu Ala Ser Ser Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr
1 5 10 15
Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp
20 25 30
Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys
35 40 45
Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp
50 55 60
Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu MET Gln Ser Thr
65 70 75 80
Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg His His His His His His
85 90 95
序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 昆明理工大学
<120>一种呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗及其制备方法
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 288
<212> DNA
<213> respiratory syncytial virus
<400> 1
atggaggctt ccagtcaaaa catcactgaa gaattttatc aatcaacatg cagtgcagtt 60
agcaaaggct atcttagtgc tctaagaact ggttggtata ctagtgttat aactatagaa 120
ttaagtaata tcaaggaaaa taagtgtaat ggaacagatg ctaaggtaaa attgataaaa 180
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<210> 2
<211> 95
<212> PRT
<213> respiratory syncytial virus, mycobacteria tuberculosis
<400> 2
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1 5 10 15
Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp
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50 55 60
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65 70 75 80
Pro Ala Ala Asn Asn Arg Ala Arg Arg His His His His His His
85 90 95

Claims (6)

1.一种呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗，其特征在于F2蛋白是由SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列所编码或具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
2.一种权利要求1所述的呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征是包括以下具体步骤：
（1）重组表达载体F2/pFN18K的构建
以F/pMD18T质粒为模板，PCR扩增获得F2基因，并引入NcoⅠ和BamHⅠ酶切位点和6×His标签，F2基因经NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后得到带有粘性末端的目的基因，并与同样双酶切过的大肠杆菌表达载体pFN18K相连接，形成重组表达载体F2/pFN18K；
（2）F2蛋白的诱导表达及其纯化
重组表达载体F2/pFN18K转化到大肠杆菌表达菌株中，形成重组工程菌，重组工程菌经过发酵培养，采用鼠李糖诱导表达Halo-F2融合蛋白；经诱导的重组工程菌采用超声破菌，4℃下2000rpm离心10分钟后，用梯度透析方法对Halo-F2融合蛋白复性，复性后的蛋白在4℃下，透析至烟草蚀斑病毒蛋白酶反应液中，每1mg Halo-F2融合蛋白加入10U TEV酶，酶切反应8h-12h，酶切后的蛋白经过层析纯化，得到疫苗蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗制备方法，其特征在于大肠杆菌表达载体为质粒pFN18K及其衍生质粒，以及适用于大肠杆菌系统的含HaloTag®7或脱卤素酶的遗传修饰衍生物与TEV酶切位点系列的表达载体。
4.根据权利要求2或3所述的呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗制备方法，其特征在于大肠杆菌表达菌株为KRX菌株及其它E. coli K细胞株。
5.根据权利要求4所述的呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗制备方法，其特征在于转化大肠杆菌表达菌株的方法为热休克转化法，电转化法或原生质体转化法。
6.根据权利要求5所述的呼吸道合胞病毒F2蛋白亚单位疫苗制备方法，其特征在于采用金属离子亲和层析纯化法或离子交换层析法纯化蛋白。
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