CN102876695A

CN102876695A - 一种含有Z-Tag蛋白融合标签的快速克隆及表达质粒载体

Info

Publication number: CN102876695A
Application number: CN2012103366881A
Authority: CN
Inventors: 邹培建; 韦泓丽; 崔云凤; 李健; 高娟
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2012-09-12
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2013-01-16

Abstract

本发明涉及一种克隆及蛋白表达质粒载体，包含有一段含有TEV酶识别位点的，用于编码Z-Tag蛋白的基因片段和两侧带有BsaI酶切位点的GFP基因片段。本发明构建的载体可以在不依赖于连接酶的情况下实现目的基因的快速高效克隆及蛋白表达。并且在载体中引入了Z-Tag融合蛋白标签和TEV酶切位点，Z-Tag融合蛋白标签帮助增加难溶解蛋白的溶解度，利于蛋白的分离纯化；TEV酶识别序列位于Z-Tag蛋白的基因序列的下游，通过TEV酶对纯化的蛋白质进行切割，可以将Z-Tag蛋白标签切除，得到天然的目的蛋白。TEV酶是目前最经济适用的酶，从而极大地节约了实验成本。

Description

一种含有Z-Tag蛋白融合标签的快速克隆及表达质粒载体

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种克隆及蛋白表达质粒载体，即一种含有Z-Tag蛋白融合标签的快速克隆及蛋白表达质粒载体。

背景技术

传统的克隆方法是通过将质粒载体同目的基因片段分别用相同的双酶切消化后产生2-4个碱基的粘性末端，利用连接酶将互补的粘性末端进行连接，随后转化大肠杆菌细胞，表达纯化蛋白。由于粘性末端长度比较短，后续必须通过T4 DNA连接酶将载体和目的基因片段进行连接，并且在此过程中可能会有部分载体发生自连接。这种方法克隆基因大约需要两到三天时间。为了实现不依赖于连接酶的克隆方法，就需要构建一种更加方便有效的克隆载体。而且，目前市场上的商品化载体能够利用的融合标签也非常有限，将载体上设计的将目的蛋白同标签分离的蛋白酶价格也都比较昂贵。基于上述几方面的考虑，有必要提供一种带有常用的融合蛋白标签的快速克隆及蛋白表达载体。

发明内容

本发明的目的在于提供一种克隆及蛋白表达质粒载体，即一种在N端含有Z-Tag融合蛋白标签并且能够将目的蛋白的基因进行快速克隆及蛋白表达的载体，从而弥补现有技术的不足。

本发明的所述的质粒载体，包含有：

一段含有TEV酶识别位点的，用于编码Z-Tag蛋白的基因片段；

两侧带有BsaI酶切位点的GFP基因片段。

上述的Z-Tag蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

上述的两侧带有BsaI酶切位点的GFP基因片段，其核苷酸序列为SEQ IDNO:2。

本发明的载体，还包括有转录启动子、转录终止子、卡那霉素编码序列和复制子片段。

本发明的载体，其遗传图谱如图1所示，核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明构建的质粒载体用于在原核菌中表达目的基因的重组蛋白。

本发明构建的载体可以在不依赖于连接酶的情况下实现目的基因的快速高效克隆及蛋白表达。并且在载体中引入了Z-Tag融合蛋白标签和TEV酶切位点，Z-Tag融合蛋白标签帮助增加难溶解蛋白的溶解度，利于蛋白的分离纯化；TEV酶识别序列位于Z-Tag蛋白的基因序列的下游，通过TEV酶对纯化的蛋白质进行切割，可以将Z-Tag蛋白标签切除，得到天然的目的蛋白。TEV酶是目前最经济适用的酶，从而极大地节约了实验成本。

附图说明

图1：本发明的质粒载体pJM-Z-Tag的遗传图谱；

图2：重组蛋白pJM-Z-Tag的表达纯化蛋白图谱；

其中：M、PageRuler^TMPrestained Protein Ladder；1、诱导前BL21/pJM-Z-Tag的总蛋白；2、诱导后经超声裂解并离心后的上清部分；3、诱导后经超声裂解并离心后的沉淀部分；4、亲和层析流穿液；5、20mM咪唑洗涤液；6、200mM咪唑洗脱液。

具体实施方式

本发明的载体以pET-24d为出发质粒，在构建过程中，分别加入了Z-Tag蛋白基因，TEV酶切位点以及GFP基因。在GFP基因两侧各引入了一个BsaI单酶切位点。一方面，通过BsaI单酶切，该载体被线性化并在线性化的片段两侧各产生5′端突出的4个碱基的粘性末端，通过T4 DNA Polymerase及dTTP处理后，粘性末端的碱基数各增加至10个和12个，利用该粘性末端，能够方便快速将的目的基因克隆到该载体上并进行蛋白的表达纯化。另一方面，为了更快，更方便的控制克隆质量，在克隆的酶切位点BsaI位点中间插入的GFP基因，在后续筛选阳性克隆的过程中，能够通过观察是否产生绿色荧光，来判断克隆基因是否插入到载体当中。

下面对本发明的载体构建过程及应用进行详细描述。

一、表达质粒载体（pJM-Z-Tag）的构建

第一步，在pET-24d（购买自Novogen公司，编号69772-3）的多克隆位点的N端加上his-Tag-Z-Tag标签及TEV酶切位点。首先全序列合成his-tag-Z-Tag-TEV，合成时在his-tag-Z-Tag-TEV核酸序列的两端分别加上XbaI和NcoI的酶切位点，再连接到克隆载体上（其中his-tag-Z-Tag-TEV序列为SEQID NO:1）。制备的克隆质粒用XbaI和NcoI双酶切后得到包含有his-Tag-Z-Tag标签的小片段，与pET-24d经过XbaI和NcoI双酶切处理得到的载体进行连接，通过筛选得到N端带有his-Tag-Z-Tag标签及TEV酶切位点的质粒，暂时命名为pET-24d-Z-Tag。

第二步，将两个BsaI酶切位点引入上述构建好的质粒pET-24d-Z-Tag当中，取代其中的多克隆位点。

设计引物，引物合成时要求5’端经过磷酸化修饰

上游引物：5’-GGTCTCACCGCGTCGGGTCACCACCACCACCAC-3’

下游引物：5’-CGGTCTCATGGCGCCCTGAAAATAAAGATTCTC-3’

以pET-24d-Z-Tag为模板进行扩增，PCR产物回收纯化后利用T4连接酶连接，筛选得到带有BsaI酶切位点的质粒pET-24d-Z-Tag-2BsaI。

第三步，根据GFP蛋白（SEQ ID NO:2）的基因序列，合成BsaI-GFP-BsaI的核酸序列到克隆载体上。制备的克隆载体用BsaI酶切处理后得到的包含GFP的片段，与pET-24d-Z-Tag-2BsaI经过BsaI酶切处理后的载体进行连接，得到最终的质粒pJM-Z-Tag。

制备的质粒pJM-Z-Tag的遗传图谱如图1所示，其核苷酸序列为SEQ IDNO:3。

二、本发明质粒的应用效果检测

本发明提供的质粒载体在其GFP基因外侧各包含一个BsaI的酶切位点(黑体表示)，该载体经BsaI单酶切去除GFP基因后，载体被线性化，并且在线性化的片段两侧各产生5’端突出的4个碱基的粘性末端。BsaI酶切后的载体经过T4 DNA polymerse和dTTP处理，利用T4 DNA polymerse的3′→5′外切酶活性，可以去除3′端碱基直到遇到T终止，由此质粒载体被线性化并且两端的粘性末端碱基数目增加至10个和12个。该粘性末端可以在不依赖于连接酶的情况下同互补链发生特异性的退火。

具体实验步骤：

1.BsaI消化质粒载体

配置混合体系：

5μg质粒载体

2.5μl BsaI(10units/μl)

5μl 10×NEB buffer 3

无菌水补齐到50μl

50℃酶切1h。

0.8%琼脂糖电泳检测酶切效果，胶回收质粒载体片段。

2.T4 DNA polymerse处理质粒载体

配置混合体系：

600ng BsaI消化后载体

0.5μl dTTP(100mM)

1μl DTT(100mM)

0.2μl 100×BSA

0.4μl T4 DNA polymerse(3units/μl)

2μl 10×NEB buffer 2

无菌水补齐到20μl

22℃孵育30min。75℃孵育20min，灭活T4 DNA polymerse。

制备目的基因片段

2.2.1设计目的基因的引物

上游引物：CAGGGCGCCATG-目的基因

下游引物：GACCCGACGCGGTTA-目的基因

上下游引物含有同质粒载体粘性末端互补的碱基序列，上游引物中含有ATG起始密码子，下游引物含有TAA终止密码子。

2.2.2利用T4 DNA polymerse处理PCR产物

利用设计好的引物，以目的基因为模板进行PCR扩增，扩增出来的产物回收后，利用T4 DNA polymerse和dATP处理，利用T4 DNA polymerse的3’→5’外切酶活性，可以去除3’端碱基直到遇到A终止。

2.3目的基因片段同载体进行快速连接

取1.5ml离心管，按照下面方法操作：

取1μl处理好的质粒载体（25-50ng），同2μl处理好的目的基因片段（0.02pmol）混匀后置于22℃孵育5min。加入1μl EDTA(25mM)，混合后置于22℃继续孵育5min。

利用本发明的质粒构建新的克隆，从PCR结束到连接的完成，仅仅需要1h即可完成。而传统的方法需要通过对目的基因片段进行双酶切后再利用T4 DNA连接酶连接，一般需要1d时间。

2.4转化：将连接产物转化E.coli DH5a感受态细胞。

2.5鉴定阳性克隆

通过菌落PCR方法鉴定阳性克隆，测序表明为目的阳性克隆。

本发明所述的质粒载体转化的宿主细胞为大肠杆菌细胞，最佳的大肠杆菌细胞为BL21、BL21(DE3)等。表达质粒pJM-Z-Tag转化入大肠杆菌BL21，用含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基在37℃培养至OD600约为0.6，加入终浓度为0.3mM IPTG诱导，表达产物跑SDS-PAGE电泳，如图2所示，第二泳道为目的蛋白的可溶性表达量，第六泳道为纯化后的电泳结果；上述结果表明目的蛋白的可溶性表达量和纯度都满足实验的需要。

已知酿酒酵母细胞基因组中含有28个SH3蛋白，普通的带有his-tag标签的表达质粒仅能表达出其中的16个蛋白，利用本发明的质粒能够成功的表达出其中的25个蛋白。以表达YHH6 SH3蛋白为例，首先设计目的基因引物:上游引物5’-CAG GGCGCCATGGCAACGGCTGTTGCTCT-3’下游引物5’-GACCCGACGCGGT TAGCAGCCGGAATCCGAGCT-3’，以含有YHH6 SH3基因的质粒为模板进行PCR，PCR产物回收后利用BsaI进行酶切处理，与pJM-Z-Tag载体连接，转化E.coli DH5a，筛选得到阳性克隆。将测序正确的质粒转化E.coli BL21，IPTG诱导蛋白表达，利用镍柱亲和层析对该蛋白进行纯化，通过TEV酶对纯化的蛋白质进行切割，将Z-Tag蛋白标签切除，得到天然的目的蛋白。TEV酶是目前最经济适用的酶，这也极大地节约了实验成本。

Claims

1.一种克隆及蛋白表达质粒载体，其特征在于所述的质粒载体包含有：

1）一段含有TEV酶识别位点的，用于编码Z-Tag蛋白的基因片段；

2）两侧带有BsaI酶切位点的GFP基因片段。

2.如权利要求1所述的载体，其特征更在于所述的编码Z-Tag蛋白的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

3.如权利要求1所述的载体，其特征更在于所述的两侧带有BsaI酶切位点的GFP基因片段，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.如权利要求1所述的载体，其特征更在于所述的质粒载体还包括有转录启动子、转录终止子、卡那霉素编码序列和复制子片段。

5.权利要求1所述的载体，其遗传图谱如图1所示。

6.权利要求1所述的载体，其核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

7.权利要求1所述的载体用于在原核菌中表达目的基因。