CN102643853A - 硫化物醌氧化还原酶肠道定向表达载体及其细胞系 - Google Patents

Abstract

本发明涉及硫化物醌氧化还原酶肠道定向表达载体及其细胞系，属于生物技术领域。将SQR基因插入真核表达载体pcDNA3.1(-)，构建慢病毒重组载体Lanti4-blockit-IFABP-SQR-GFP，将其感染原代培养的猪小肠上皮细胞，构建特异表达SQR-GFP蛋白的真核细胞系。为进一步开展体细胞核移植克隆转SQR基因胚胎制备，培育减少污染物排放的转基因猪新品种提供必要的转基因生物材料和关键技术体系支撑。

Description

硫化物醌氧化还原酶肠道定向表达载体及其细胞系

一、技术领域

本发明涉及硫化物醌氧化还原酶肠道定向表达载体及其细胞系，属于生物技术领域。

二、背景技术

环境友好型养殖业是畜牧业可持续健康发展的新方向。改革开放以来，随着我国国民经济的全面、快速发展，人民生活需求水平的不断提高，我国畜牧产业规模化取得了空前的发展。然而，随着畜牧场规模化、集约化和机械化程度的提高，畜禽粪便已成为一个不可忽视的污染源。畜禽粪便不仅会带来水体和土壤污染，也会带来严重的空气污染。据检测，一个年出栏10万头的养猪场，每小时可向大气排出近148 kg氨气（NH3）、13.5 kg硫化氢（H2S）、24 kg粉尘和14亿个菌体，这些物质的污染半径可达5 km，而尘埃和病原微生物可随风传播30 km以上。如何降低这些废气排放一直是困扰大型养猪场的难题之一。目前，猪场对这些废气只能做到一定程度上的控制，不能做到真正无害化。主要采取的控制方法有吸附法、焚烧法、化学与生物除臭剂法、洗涤法及生物过滤等，这些方法对H2S、NH3等有害气体有一定的控制作用，但因成本较高或是二次污染问题而不能大规模运用。所以寻求一种经济可行的废气无害化处理方案很有必要。

硫化物-醌氧化还原酶，即Sulfide-Quinone Reductase或Sulfide:Quinone Oxidoreductase (SQR)，广泛存在于光营养和化学营养细菌（绿菌属、荚膜杆菌属、着色菌属等）中，它是一条57kDa的多肽，能够分解H₂S等硫化物。1997年，Shütz等从荚膜红杆菌中分离纯化出SQR，并将SQR基因成功克隆于大肠杆菌中，结果显示，大肠杆菌表达的SQR具有生物酶活性。另外很重要的一点是，SQR降解H₂S的反应是在细胞外进行的，无需进入细胞内。基于以上研究进展，利用SQR分解硫化物废气的生物学特性，综合现在的分子和细胞生物学手段，采用转基因手段在目的动物细胞中导入具有特殊生物学功能的外源SQR基因，通过转基因体细胞克隆技术途径获得能在肠道中稳定表达和稳定遗传的转SQR基因动物新品种，将可从源头上解决动物粪便中H₂S废气减排环境污染问题。

肠道脂肪酸结合蛋白（IFABP）是一类是重要的脂肪酸转运蛋白，其特异地表达于小肠上皮吸收细胞，与食物中长链脂肪酸(LCFA)的吸收、靶向运输及代谢密切相关。肠道脂肪酸结合蛋白启动子是IFABP特异表达于肠道的关键，相关研究显示IFABP启动子具有种间保守性，大鼠IFABP启动子能够启动人生长激素在小鼠肠道中特异表达。 所以本发明利用大鼠IFABP启动子构建SQR基因的肠道定向表达载体，并进一步转染体细胞，建立成纤维细胞系，解决了转基因动物肠道目的基因定向表达及其有效发挥其生物学功能的关键技术。

三、发明内容

技术问题 本发明的目的是提供SQR肠道定向表达载体pcDNA3.1-IFABP- SQR-GFP和pLenti4-IFABP- SQR-GFP慢病毒载体的构建方法及构建相关转基因细胞系的技术体系，是专用于生命科学和畜牧科研与生产的环保型的生物制品，可作为开展环境友好型转基因猪研究提供必要的生物材料及其相关关键技术方法参考。

技术方案 稳定表达SQR的真核细胞系，是通过以下方法生产的，包括：

（一）SQR肠道定向表达载体pcDNA3.1-IFABP- SQR-GFP的构建

1. SQR真核表达载体pcDNA3.1(-)-SQR-Myc构建

根据SQR基因序列，设计PCR引物P1，P2，为了加入Myc标签，P2引物3’端末端引入Myc-Tag序列。以原核载体pRSETA-SQR为模板进行PCR扩增，扩增产物（SQR-Myc基因片段）与pMD-18T使用T4 DNA连接酶连接，获得克隆载体pMD18T-SQR- Myc。

将pMD18T-SQR-Myc用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，纯化回收目的片段SQR-Myc，同时用相同内切酶酶切质粒pcDNA3.1(-)，将酶切回收后的pcDNA3.1(-)质粒片段和SQR-Myc目的片段由T4 DNA连接酶连接，获得真核表达载体pcDNA3.1(-)-SQR-Myc（图1）。

2. 中间载体pMD18T-SQR-GFP的构建

为了便于后期转基因细胞（系）的检测，在基因载体结构序列中导入GFP标记基因，并采用重叠PCR扩增法获得SQR-GFP融合基因片段。以pcDNA3.1(-)-SQR-Myc为模板设计PCR反应引物 P3、P4，以pEGFP-C3为模板设计PCR反应引物P5、P6，引物 P4、P5 均在5’端含有GFP和SQR-Myc部分序列。

以pcDNA3.1(-)-SQR-Myc质粒为模板，使用引物P3、P4，扩增SQR-Myc片段（1334bp），以质粒pEGFP-C3为模板，使用引物P5、P6，扩增GFP片段（744bp）。以上述扩增产物SQR-Myc片段及GFP片段为模板，使用引物P3和P6，采用重叠PCR方法将两种组件融合，得到SQR-GFP片段（2048bp），将该片段与pMD-18T载体通过T4 DNA连接酶连接处理，获得中间载体pMD18T-SQR-GFP。

3. 融合蛋白SQR-GFP表达载体pcDNA3.1(-)-SQR-GFP的构建

将中间载体pMD18T-SQR-GFP用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，纯化回收目的片段（2kb），同时用相同内切酶酶切pcDNA3.1(-)，纯化回收大片段（5.3kb），T4 DNA连接酶连接上述两个酶切片段获得SQR-GFP表达载体pc DNA3.1(-)-SQR-GFP（图2）。

4. SQR肠道特异表达载体pcDNA3.1(-)-IFABP-SQR-GFP的构建

为了在载体pcDNA3.1(-)中插入IFABP启动子，根据Genebank中IFABP（基因序列号NM_013068.1）启动子序列设计引物P7、P8，PCR扩增获得IFABP片段（1352bp），将该片段纯化后进行TA克隆获得重组载体pMD18T-IFABP。用Nhe I和Xba I对pMD18-IFABP进行双酶切，回收得到的IFABP片段克隆到质粒pcDNA3.1-SQR-GFP相应的酶切位点，得到重组载体pcDNA3.1-IFABP- SQR-GFP（图3）。

5. 携带IFABP-SQR-GFP基因片段的慢病毒载体制备

pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP质粒采用NheⅠ、KpnⅠ双酶切，并经琼脂糖凝胶分离纯化后获取目的片段IFABP-SQR-GFP。相同酶切方法处理pLenti4质粒获取含慢病毒转运载体序列的 DNA 片段，琼脂糖凝胶分离纯化后用快速连接试剂盒与 IFABP-SQR-GFP连接，获得新的重组质粒pLenti4-IFABP- SQR-GFP，再与病毒辅助质粒pC-GP、pR-Rev、pC-VSVG通过脂质体转染法共转染HEK293细胞，随后采用高速离心法浓缩，制备慢病毒病毒载体。

（二）转SQR基因猪体细胞系的制备

1. 转SQR基因猪胎儿肠上皮细胞系的建立：

采用组织块培养方法。采集刚出生仔猪小肠，将小肠组织PBS充分洗净后，剪成小于1 mm³ 的碎片，用含5% FBS、添加表皮生长因子、胰岛素和肝素钠的DMEM/F12悬浮组织块并接种于培养瓶中，间隔24h后换液，继续培养直至获得细胞单层。利用上皮细胞与成纤维细胞对胰蛋白酶的敏感度不同，采用胰蛋白酶消化法去除其中的成纤维细胞，经过胰蛋白酶的多次消化获得纯度高的猪肠上皮细胞系。

携带IFABP-SQR-GFP的慢病毒转染猪肠上皮细胞，24~48小时后进行瞬时转染，取部分细胞置荧光倒置显微镜下观察，鉴定转基因阳性细胞，并经传代培养，筛选出稳定表达SQR的细胞细胞株（系）。

2. 转SQR基因猪胎儿成纤维细胞系制备

采用酶消化法进行体外培养。将猪胎儿皮肤用剪刀剪碎，放入0.25% 的胰蛋白酶消化成单个细胞，取少量细胞悬液进行细胞计数后，适量稀释细胞悬液于含10% FCS的DMEM/F12中进行培养，待细胞长到100%汇合时进行反复传代，获得纯化猪成纤维细胞。

pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP基因载体采用脂质体法转染猪成纤维细胞，24~48小时后进行瞬时转染效率检测，同时加入适量浓度的G418（300 μg/ml）进行反复筛选，经四周以上传代培养，筛选鉴定出稳定表达SQR的细胞克隆，挑取单克隆继续扩大培养获得SQR稳定表达细胞株（系）。

有益效果

本发明成功构建了SQR的肠道定向表达载体pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP和pLenti4-IFABP- SQR-GFP慢病毒载体，并通过该两种携带目的基因SQR、标记基因GFP以及其肠道特异表达启动子IFABP的真核基因载体转染体细胞，经反复传代培养、筛选及其相关分子和细胞生物学鉴定技术途径获得能够稳定遗传SQR的猪胎儿成纤维细胞株（系）。

本发明首次将原核表达的SQR基因导入真核表达载体中，使SQR能够在真核细胞中表达，同时将肠道特异启动子连入载体中，使得SQR在动物肠道中定向表达，由此获得了转SQR基因的猪胎儿成纤维细胞株，为进一步开展体细胞核移植克隆转SQR基因胚胎制备，培育减少污染物排放的转基因猪新品种提供必要的转基因生物材料和关键技术体系支撑。

四、附图说明

图1：pcDNA3.1(-)-SQR-Myc构建流程图

图2：pcDNA3.1(-)-SQR-GFP构建流程图

图3：pcDNA3.1(-)-IFABP-SQR-GFP构建流程图

图4：携带SQR目的基因和GFP标记基因的慢病毒构建流程图

图5：SQR-Myc 扩增片段电泳图

M: DL2000 Marker; 1-6: SQR-Myc扩增条带

图6：pMD-18T-SQR-Myc酶切鉴定结果

M1: DL2000 Marker; M2: DL5000 Marker; 1，2，3，4: 重组质粒pMD-18T-SQR-Myc经XhoⅠ、KpnⅠ双酶切 ; 5，6: 重组质粒EcoRⅠ、Hind Ⅲ 双酶切

图7：pcDNA3.1(-)-SQR-Myc双酶切鉴定

M: DL5000 Marker; 1-8: 重组质粒pcDNA3.1(-)SQR-Myc 经XhoⅠ、KpnⅠ双酶切结果

图8：PCR扩增SQR、GFP片段电泳图

M: DL2000 Marker; A：1-4为SQR-Myc扩增条带 B：1-4为GFP扩增条带

图9：SQR-GFP扩增片段电泳图

M: DL2000 Marker; 1-6: SQR-GFP扩增条带

图10：pcDNA3.1-SQR-GFP酶切鉴定

M: Marker; 1: 重组质粒pcDNA3.1-SQR-GFP经XhoⅠ、KpnⅠ双酶切 (5300+2038 bp)

图11：IFABP扩增片段电泳图

M: DL5000 Marker; 1,2: IFABP扩增条带

图12 pcDNA3.1-IFABP-SQR-Myc-GFP酶切鉴定

M: Marker 1: 重组质粒pcDNA3.1-IFABP-SQR-Myc-GFP由 Nhe I and Xba I 双酶切

图13 真核细胞表达的SQR蛋白检测

1：pcDNA3.1(-)-SQR-Myc转染HEK293胞浆蛋白；2：pcDNA3.1(-)-SQR-Myc转染HEK293培养基上清蛋白；泳道3：空载质粒转染HEK293胞浆蛋白

图14：IFABP启动SQR基因表达的转基因阳性上皮细胞

A：白光下猪肠上皮细胞；B：470nm光波激发的猪肠上皮细胞（呈绿色荧光细胞为GFP表达细胞）；C：猪成纤维细胞白光下；D：猪成纤维细胞470nm光波激发

图15：转基因猪胎儿成纤维细胞克隆的阳性PCR鉴定结果

1：阳性对照 2-17：细胞克隆提取的DNA样品 M：Marker

五、具体实施方式

实施例 1 SQR 真核表达载体pcDNA3.1(-)-SQR-Myc 的构建

1．实验材料

质粒：pcDNA3.1(-)质粒购于上海Invitrogen生命技术有限公司；pMD18T质粒购于大连宝生物有限公司；pRSETA-SQR质粒由华南农业大学动物科学学院李加琪教授课题组构建并惠赠（于峰祥等，江苏农业学报，2011，27(5)：1043-1046）。

菌种：大肠杆菌DH5α菌种购于大连宝生物有限公司。

主要酶及试剂药盒：限制性内切酶XhoⅠ、KpnⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ，Prime STAR 高保真DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶购自大连Takara公司；中量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自Promega公司；其余普通化学试剂均为国产、进口分装或进口。

2. 溶液配制

培养基、试剂的配制若无特别要求，均以重蒸水为溶剂，高压灭菌条件为102.9kPa蒸气灭菌30分钟。

LB液体培养基:蛋白陈l0g，酵母粉5g, NaCl l0g，溶于800m1水中，调节pH值至7. 5，定容至1000m1，高压灭菌。

LB固体培养基:蛋白陈10g，酵母粉5g，NaCl l0g，溶于800m1水中，加琼脂粉15g, 调节pH值至7. 5，定容至1000m1，高压灭菌。

KCM转化法相关试剂配制：

(1) 、TSM液配制（10ml）

母液	体积	终浓度
			LB	7.3m1
50% PEG MW4000	2 ml	10%
			DMSO	0.5ml	5%
1M MgC12	100μl	l 0mM
			1M MgS04	100μl	l 0mM

(2) 、5×KCM: 0.5M KCl, 0.15M CaC1₂, 0.25M MgC1₂过滤除菌后, 分装至1.5m1 EP管中，冻存于一20℃冰箱备用。

质粒提取溶液I: 50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris·Cl (pH8.0) , l0mmol/L EDTA（pH8. 0) ，高压灭菌15分钟。

质粒提取溶液II: 0. 2mmol/L NaOH, 1% SDS，现用现配。

质粒提取溶液III：5mol/L乙酸钾60m1，冰乙酸11. 5m1，水28. 5m1，4℃保存。

50×TAE: 242g Tris碱，57.1ml冰乙酸，100m1 0. 5mo1/L EDTA (pH 8.0)，溶解后定容至1000m1。

3. 实验步骤

（1）中间载体pMD18T-SQR-Myc的构建及鉴定

引物设计：以原核载体pRSETA-SQR为模板，根据SQR基因序列，设计PCR引物P1，P2，其中5’端引物P1带有Xho I酶切位点（CTCGAG）及其保护碱基，3’端引物P2末端引入Myc-Tag序列，带有Kpn I酶切位点（GGTACC）及其保护碱基，由南京金斯瑞生物公司合成：

P1: 5’-CCGCTCGAGATGGCTCATATCGTGGTTCTGGG-3’ Xho I

P2:5’-GGGGTACCTTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCCCCTTCTTCACGGCCTTCA-3’ Kpn I

PCR扩增目的基因SQR-Myc：以质粒pRSET-A-SQR为模板，用引物P1、P2终浓度约1μmol/mL，50μL体系使用Prime STAR高保真DNA聚合酶扩增，反应条件为98℃10s，55℃10s，72℃90s，30循环，72℃延伸5min获得目的基因SQR-Myc。

PCR反应体系（50µl）：F primer 0.5µl；R primer 0.5µl；DNA 1µl；Prime STAR 0.5µl；5×buffer 10µl；d NTP 1µl；dd H₂O 37µl。

连接反应：取目的基因SQR-Myc 5µg加入Taq DNA聚合酶构成25μL PCR体系，72℃30min延伸，为Prime STAR DNA聚合酶产物添加A-碱基尾。将上述PCR终产物与pMD-18T使用T4 DNA连接酶4℃连接过夜（按照产品说明书操作），KCM法（C. T. Chung and R. H. Miller. Nucleic Acids Res. 1988;16:3580）转化大肠杆菌DH5α，经氨苄青霉素筛选pMD18T-SQR-Myc的阳性转化子，并采用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ 酶切鉴定。

（2）pcDNA3.1(-)-SQR-Myc的构建及鉴定

将pMD18T-SQR-Myc重组质粒用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，纯化回收约1.3kb的目的片段（SQR-Myc），同时用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切pcDNA3.1(-)，将酶切回收后的pcDNA3.1(-)载体质粒和SQR-Myc目的片段由T4 DNA连接酶连接过夜。

连接反应体系(10 μL)：

20ng 载体DNA

20ng 外源DNA

1 μL T4DNA连接酶10 X buffer

1~2U T4 DNA连接酶

补加水至10 μ1，16 ℃温育8~12h。

取5 μ1连接产物使用KCM法转化55 µL大肠杆菌DH5α感受态细胞，经过含有氨苄青霉素的LB平板固体培养基中选择培养，挑取阳性转化子经过LB液体培养基扩大培养后采用碱裂解法少量提取质粒（参见《分子克隆实验指南》，J·萨姆布鲁克等编，第二版，全冬雁等译的相关章节），酶切鉴定（图3）。

4. 实验结果

PCR扩增获得目的基因片段SQR-Myc，大小为1326bp（图5）。图6 双酶切鉴定显示，SQR-Myc成功连接到p18T载体中。重组载体pcDNA3.1(-)-SQR-Myc经双酶切，获得的两条带与实际相符，表明连接成功（图7）。

实施例 2 肠道特异表达载体 pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP 构建及其慢病毒制备

1. 主要试剂

限制性内切酶Nhe I、XbaⅠ、XhoⅠ、KpnⅠ，Prime STAR 高保真DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶均购自大连Takara公司；去内毒素中量质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、快速连接试剂盒（Liga Fast^TM Rapid DNA Ligation System）购自Promega公司，转染试剂Lipofectamine^TM LTX、质粒pLenti4、pC-GP、pR-Rev、pC-VSVG购自invitrogen公司；胰酶、青、链霉素购自SIGMA公司；DMEM（高糖）、胎牛血清（FBS）购自GIBCO公司。

2. 溶液

HEK293细胞完全培养基（1L）：DMEM（高糖）13.4g，FBS（胎牛血清）100ml，青霉素0.06g，链霉素0.1g，超纯水定容到1L，调pH值至7.2，抽滤除菌4℃保存备用。

Ca²⁺/Mg²⁺ free PBS (1L)：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄ 1.44g，KH₂PO₄ 0.24g，HCl调pH值至7.2，高压灭菌，室温保存。如果配含Ca²⁺/Mg²⁺的PBS，需再加入CaCl₂.H₂O 0.133g，MgCl₂.6H₂O 0.10g。

3. 操作步骤

（1）中间载体pcDNA3.1(-)-SQR-GFP的构建

扩增SQR-Myc片段：根据质粒pcDNA3.1(-)-SQR-Myc设计PCR引物 P3、P4，P3引物5’端带有酶切位点Xho I，P4引物5’端序列与GFP序列5’末端互补。PCR条件为：98℃， 5min；98℃，10s；52℃，10s；72℃，80s；30个循环；72℃，10min，扩增的SQR-Myc片段大小为1334bp。

P3：5’-CCGCTCGAGAATGGCTCATAT-3’ Xho I

P4：5’-CCTTTGCTAGCCATCAGATCCTCTTCTC-3’ 重叠序列

扩增GFP基因片段：以pEGFP-C3（由南京大学模式动物研究中心高翔教授惠赠，Ormo et al., Science, 1996, 273(5280) : 1392～1395）序列为模板，设计PCR反应引物 P5、P6，P5的5’端序列与SQR-Myc序列3’末端一致，引物P6的5’端带有酶切位点KpnI。扩增程序为：98℃， 5min；98℃，10s；62℃，30s；72℃，30s；30个循环；72℃，10min，扩增的片段大小为744bp。

P5: 5’-GAAGAGGATCTGATGGCTAGCAAAGG-3’ 重叠序列

P6：5’-GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’ Kpn I

重叠PCR获得SQR-GFP融合片段：以上述扩增产物SQR-Myc片段及GFP片段为模板，用引物为P3和P6，采用重叠PCR方法（Ho et al., Gene 1989; 77:51-59）将两种组件融合，获得SQR-GFP融合片段（2048bp），扩增的程序：98℃， 4min；98℃，10s；52℃，10s；72℃，130s；30个循环；72℃，10min。

T-A克隆：取20μL上述重叠PCR产物，加入Taq DNA聚合酶构成25μL PCR体系，72℃ 30min延伸，添加A-碱基尾。将加尾后的SQR-GFP融合片段纯化后与pMD-18T使用T4 DNA连接酶4℃连接，得到中间载体pMD18T-SQR-GFP。

酶切连接：用Xho I和Kpn I对pMD18-SQR-GFP进行双酶切，回收得到的SQR- GFP片段克隆到pcDNA3.1(-)相应的酶切位点，获得重组载体pcDNA3.1(-)-SQR- GFP，并进行双酶切鉴定。

（2） 真核特异表达载体pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP的构建

大鼠全基因组DNA提取：取大鼠尾组织样，剪碎后采用酚/氯仿提取法提取全基因组DNA，详细操作参照《分子克隆手册》第三版 上册6.23。

扩增IFABP片段：根据Genebank中IFABP启动子序列设计PCR引物P7、P8，以大鼠全基因组DNA为模板，扩增的程序为98℃， 4min；98℃，10s；55℃，10s；72℃，80s；30个循环；72℃，5min，获得1352bp的IFABP片段。

P7: 5’-CGGCTAGCACGAACATTGACTGGAGT Nhe I

P8: 5’-GCTCTAGATACTTTCCAAGTGCCATC Xba I

连接反应：将IFABP片段通过T-A克隆获得中间载体pMD18T-IFABP，用Nhe I和Xba I对pMD18-IFABP进行双酶切，回收得到的IFABP片段克隆到pcDNA3.1- SQR-GFP相应的酶切位点，获得重组载体pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP，并酶切鉴定。

(3) SQR慢病毒制备

① pLenti4-IFABP-SQR-GFP的构建

目的片段IFABP-SQR-GFP来自pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP质粒，由质粒经 NheⅠ、KpnⅠ双酶切后经琼脂糖凝胶分离纯化后获取。相同的酶处理pLenti4质粒获取含慢病毒转运载体序列的 DNA 片段，琼脂糖凝胶分离纯化后以快速连接试剂盒与 IFABP-SQR-GFP连接，获得新的重组质粒pLenti4-IFABP- SQR-GFP，再与病毒辅助质粒pC-GP、pR-Rev、pC-VSVG共转染HEK293细胞以生产病毒。

② 慢病毒的制备

细胞准备：转染前一天，胰酶消化HEK293细胞，取约 6×10⁶个细胞种植于 75 cm²培养瓶中，加入约 10ml完全培养基进行培养。 转染当天，待细胞达到 80-85% 融合度时，移除培养液，加入 6ml无双抗培养基。

DNA－脂质体转染复合物制备：将 pC-GP、pR-Rev、pC-VSVG 质粒按 6.5:2.5:3.5 的质量比进行混合制作包装混合物。取包装混合物11. 5μg与pLenti4-IFABP-SQR-GFP 5 μg，加入到1.9ml无血清无双抗培养基中，混匀称为A液。取另一离心管，于1.9 ml无血清无双抗培养基中加入70μl的脂质体Lipofectamine^TM LTX，轻轻混匀，室温孵育5 min，称为B液，迅速将B液轻轻加入到A液中，混匀，室温孵育 30 min，以形成 DNA－脂质体复合物。

脂质体转染后收集病毒并浓缩：将DNA－脂质体复合物逐滴加入细胞培养瓶中，并轻轻混匀，37℃孵育过夜，转染12 h后移去含有DNA－脂质体复合物的培养基，换上新鲜完全培养基，继续培养48-72 h收集含病毒培养液，4℃ 5000g离心15 min去除细胞沉淀，取上清并采用0.45μm低蛋白结合 PVDF滤膜进行抽滤。 病毒原液经 4℃ 50000g 离心2 h，弃上清，以1: 200 DMEM重悬，取部分病毒稀释测量滴度，其余－80℃保存备用。

4. 结果

（1）pcDNA3.1(-)-SQR-GFP重组质粒鉴定

以pMD18T-SQR-Myc质粒为模板，PCR扩增获得SQR片段（1334bp，图8-A）；以质粒pEGFP-C3为模板，PCR扩增获得GFP片段（744bp，图8-B）。

以扩增产物SQR-Myc片段及GFP片段为模板，采用重叠PCR方法将两种组件融合，获得SQR-GFP片段（2048bp，见图9）。

将 pcDNA3.1-SQR-GFP重组质粒用限制性内切酶XhoⅠ、KpnⅠ双酶切鉴定, 酶切产物电泳分别可见大小为2038 bp和5420 bp的两条条带，与基因图谱一致（图10）。

（2）pcDNA3.1(-)-IFABP -SQR-GFP重组质粒酶切鉴定

以大鼠基因组DNA为模板，PCR扩增获得IFABP片段（1342bp，图11）。

将重组质粒pcDNA3.1(-)-IFABP-SQR-GFP用限制性内切酶Nhe I 、 Xba I双酶切鉴定, 酶切产物电泳分别可见大小为1342 bp和7435 bp的两条带（图12），证明IFABP已经成功连接到pcDNA3.1(-)-SQR-GFP中的相应位点。

（3）慢病毒液病毒滴度测定

通过滴度测定结果表明由此生产的慢病毒的物理滴度为4.76E+08，具体计算方法见表1。

表1 Lenti4-blockit-IFABP -SQR-GFP滴度测定

则Lenti4-blockit-i-FABP-信号肽-SQR-GFP的物理滴度为： {（1.48E+08）+（8.04E+08）}/2=4.76E+08

实施例3 表达SQR 的猪成纤维细胞系的构建与鉴定

1. 试剂

脂质体LipofectamineTM LTX（GEⅡ）、DMEM（高糖）、DMEM-F12、胎牛血清（FBS）购自Invitrogen公司；胰酶、EGF、胰岛素、青、链霉素、购自SIGMA公司。抗Myc的小鼠一抗、辣根过氧化物酶偶联的羊抗小鼠二抗、Pro-light HRP化学发光检测试剂均购于天根生化公司。SDS-PAGE及Western Blot相关试剂购自上海生工，显影液、定影液购自南京正然科技公司。

2. 溶液配制

HEK293细胞培养基（1L）：同实施例2

成纤维细胞完全培养基（1L）：DMEM（高糖）13.4g；FBS（胎牛血清）100ml；青霉素0.06g；链霉素0.1g；超纯水定容到1L，抽滤除菌。

IEC（肠上皮细胞）完全培养基（1L）：DMEM-F12（液体）900ml；FBS（胎牛血清）100ml；EGF（表皮生长因子）10µg；胰岛素 1.0g；青霉素 0.06g；链霉素0.1g。超纯水定容到1L，抽滤除菌。

Ca²⁺/Mg²⁺ free PBS (1L)：同实施例2

改良 RIPA buffer：Tris-HCl 50 mM pH 7.4；NP-40 1%；Na-deoxycholate 0.25%；NaCl 150mM；EDTA 1 mM；PMSF 1 mM；Aprotinin, leupeptin, pepstatin 各1mg /ml；Na₃VO4 1 mM；NaF: 1 mM。

1×SDS 样品缓冲液：62.5 mM Tris-HCl（pH 6.8 于25°C）；2% w/v SDS；10%甘油；50 mM DTT；0.01% w/v溴酚蓝。

TBST：1×TBS，0.1% Tween-20。

封闭缓冲液：1×TBS，0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA。

100% (w/v) Trichloroacetic acid (TCA)：500g TCA 加入 350 ml H2O中，室温保存。

0.01% w/v溴酚蓝：0.01g溴酚蓝溶于100ml无水乙醇，密闭保存。

10X Tris缓冲盐(TBS)：准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1M HCl调pH为7.6。

转移缓冲液：25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)。

一抗稀释液：1X TBS, 0.1% Tween-20 加5%脱脂奶粉。

3. 步骤

（1）SQR-Myc在HEK293细胞中的表达检测

脂质体转染：将HEK293细胞按1×10⁶个细胞/孔的量在6孔板中接种，于37℃、 5% CO₂培养箱中过夜培养，直到细胞汇集成片并生长到约80%。在EP管中按照转染试剂说明书配制质粒pcDNA3.1(-)-SQR-Myc及转染脂质体GEⅡ，DNA（μg）: GEⅡ（µL）=1：2，转染后于37℃、5%CO2、100% 湿度培养箱中孵育6 h，孵育结束后，换以含10%FBS的DMEM培养液继续培养，48h后于荧光显微镜下观察。

Western Blot检测SQR-Myc的表达：将转染后48小时的HEK293细胞系，应用RIPA裂解液裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，上清收集后-20℃保存。细胞培养液采用TCA法收集蛋白，加入上样缓冲液溶解后-20℃保存。取适量细胞胞浆蛋白及培养液上清蛋白进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，100V转膜1h，4℃封闭过夜，室温下一抗（1:500）孵育1h，洗膜3次后室温二抗（1:10000）孵育1h，ECL显色5min，曝光1min，显影，定影。

（2）猪小肠上皮细胞的分离及培养（Schierack et al., Histochem Cell Biol. 2006;125(3):293-305）

采用组织块培养法进行猪肠上皮细胞的培养，操作步骤如下：

①无菌条件下剔除肠系膜，将小肠移至培养皿中，用含有双抗的PBS 液将小肠内腔冲洗干净。用眼科剪刀纵向剖开肠管，先用PBS 液反复清洗，再用无血清的DMEM/F12 清洗数次。

② 将肠管剪成碎片，用无血清的DMEM/F12 清洗，静置1-2 min，弃去上清液，继续剪碎，将肠组织剪成小于1 mm³ 的碎片，再转移至50mL的离心管中加入无血清DMEM/F12，用移液管反复吹打，1500g离心7min。如此反复清洗组织块, 直至上清液澄清。

③ 用含5% FBS的DMEM/F12悬浮组织块并接种于培养瓶中，间隔24h后换液，继续培养获得细胞单层。

④ 利用上皮细胞与成纤维细胞对胰蛋白酶的敏感度不同，采用胰蛋白酶消化法去除其中的成纤维细胞，以提高上皮细胞的纯度。

（3）猪胎儿成纤维细胞的培养（Lai et al., Methods Mol Biol, 2004, 254:149-164.）

将获得的猪胎儿皮肤用剪刀剪碎，放入0.25% 的胰蛋白酶中，37℃消化10-20 min。加入含10%（v/v）胎牛血清的DMEM/F12终止消化，机械吹打使细胞分散。取少量细胞悬液进行细胞计数后，向悬液中加入含10% 犊牛血清的DMEM/F12使终浓度为5-8×105个/ml。6孔培养板每孔中加入2 ml悬液，于37.5℃，5%CO2，100%湿度培养箱内培养。待细胞长成单层时换液，以后每隔1天移换一半培养液。待细胞长到100%汇合时进行传代，继续培养。

（4）慢病毒感染猪肠上皮细胞

当猪肠上皮细胞汇集成片约80%时，解冻病毒贮液，用新鲜的完全培养基稀释到病毒滴度为4.76×10⁶，移除细胞原有培养基，将含有病毒的培养基逐滴加至细胞上，6 h后除去含有病毒的培养基，换上新鲜完全培养液，48 h后荧光显微镜下观察。

（5）稳定表达SQR的猪成纤维细胞株的建立

转染前12 h将猪成纤维细胞接种于培养孔中，生长汇合至80%左右。采用脂质体法将pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP转到猪成纤维细胞，6 h后更换培养基并加入300 mg/ml G418筛选，一周后G418浓度减半维持筛选三周左右，获得阳性克隆，提取全基因组DNA采用GFP特异引物进行PCR阳性鉴定（GFP引物序列：5'TGGTGAGCAAGGGCGAGG AG3'，5'CAGGGCGGACTGGGTGCTCA3'）。

4. 结果

（1）Western blot结果显示，转SQR基因的HEK293细胞的胞浆中含有目的蛋白，大小为约57kDa，转入pcDNA3.1空载质粒的HEK293细胞中只有内参蛋白条带，而未检测到目的蛋白（图13）。表明真核细胞能够表达外源蛋白SQR。

（2）慢病毒转染法将IFABP-SQR-GFP成功导入猪肠上皮细胞中，约有70%的细胞为转基因阳性（图14），表明来源于大鼠的IFABP启动子能够在猪肠上皮细胞中启动SQR-GFP融合蛋白的表达。

（3）采用脂质体法转染pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP到猪成纤维细胞中，经过G418筛选获得了多个细胞克隆，并且PCR能够成功扩增出674 bp的GFP条带（图15），表明获得的细胞克隆为转基因阳性细胞。

实施例4. SQR 在真核细胞中的表达鉴定

采用脂质体转染方法，将重组载体pcDNA3.1-SQR-Myc瞬时转染HEK293细胞，24 ~ 48小时后分别提取细胞胞浆蛋白及培养液上清蛋白，通过Myc标签检测SQR在细胞内外的表达情况。Western Blot结果显示，SQR能够在真核细胞内表达，未分泌到胞外（图13）。

实施例5. 转SQR 基因细胞株（系）特异性表达鉴定

采用慢病毒转染方法检验目的基因SQR特异性表达效果。将携带有IFABP-SQR-GFP基因片段的慢病毒分别转染猪肠上皮细胞和成纤维细胞，24~48小时后进行瞬时表达荧光检测，表明IFABP肠道启动子能够启动SQR在肠上皮细胞中表达，而不能启动SQR在成纤维细胞中表达，说明IFABP启动子具有肠道特异性（图14）。

pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP经脂质体转染猪胎儿成纤维细胞，经过G418筛选四周以上，获得宿主基因组整合有SQR基因的细胞克隆，挑取单克隆扩大培养获得SQR转基因成纤维细胞株，并提取基因组DNA采用PCR方法检测，表明其为转SQR基因阳性细胞系（图15）。

SEQUENCE LISTING

<110> 江苏省农业科学院

<120> 硫化物醌氧化还原酶肠道定向表达载体及其细胞系

<130> 0

<160> 8

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P1

<222> (1)..(47)

<223>

<400> 1

ccgctcgaga tggctcatat cgtggttctg gggtgccatt gttatct 47

<210> 2

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P2

<222> (1)..(61)

<223>

<400> 2

ggggtacctt acagatcctc ttctgagatg agtttttgtt cccccttctt cacggccttc 60

a 61

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P3

<222> (1)..(21)

<223>

<400> 3

ccgctcgaga atggctcata t 21

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P4

<222> (1)..(28)

<223>

<400> 4

ccttgctcac catcagatcc tcttctga 28

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P5

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 5

gaagaggatc tgatggtgag caaggg 26

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P6

<222> (1)..(28)

<223>

<400> 6

ggggtacctt acttgtacag ctcgtcca 28

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工

<220>

<221> P7

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 7

cggctagcac gaacattgac tggagt 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 1

<220>

<221> P8

<222> (1)..(26)

<223>

<400> 8

gctctagata ctttccaagt gccatc 26

Claims (5)

1.硫化物醌氧化还原酶肠道定向表达载体，是通过以下方法构建而成的：

(1)以原核载体pRSETA-SQR为模板，根据SQR基因序列，设计PCR引物P1和P2，P2 3’端引入Myc-Tag序列：

P1: 5’-CCGCTCGAGATGGCTCATATCGTGGTTCTGGG-3’ Xho I

P2:5’-GGGGTACCTTACAGATCCTCTTCTGAGATGAGTTTTTGTTCCCCCTTCTTCACGGCCTTCA-3’ Kpn I

PCR 扩增条件为：98℃，5min；98℃，10s；55℃，100s；72℃，80s；30个循环；72℃，5min，扩增片段大小为1331bp；

将上述PCR终产物与pMD-18T使用T4 DNA连接酶4℃连接，得到克隆载体pMD18T-SQR-Myc；

(2)将上述克隆载体pMD18T-SQR-Myc用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，同时用相同限制性内切酶双酶切pcDNA3.1(-)，将酶切回收的SQR-Myc目的片段和pcDNA3.1(-)载体片段由T4 DNA连接酶16℃连接过夜，得到SQR真核表达载体pcDNA3.1(-)-SQR-Myc；

(3)根据SQR基因及GFP基因序列，设计PCR反应引物 P3 / P4 和 P5 / P6，引物 P3/P4 扩增 SQR-Myc，引物 P5/P6 扩增 GFP，P4有部分序列与 GFP基因互补，同时P5有部分序列与SQR-Myc基因片段互补；

P3: 5’-CCGCTCGAGAATGGCTCATAT-3’ Xho I

P4: 5’-CCTTGCTCACCATCAGATCCTCTTCTGA-3’

P5: 5’-GAAGAGGATCTGATGGTGAGCAAGGG-3’

P6: 5’-GGGGTACCTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3’ Kpn I

以pMD18T-SQR-Myc载体为模板，使用引物P3/P4，扩增SQR-Myc片段，大小为1334bp；以质粒pEGFP-C3为模板，使用引物P5/P6，扩增GFP片段，大小为744bp；

以上述扩增产物SQR-Myc片段及GFP片段为模板，用引物P3和P6，采用重叠PCR方法将两种组件融合，得到SQR-GFP片段，该融合片段的大小为2048bp，扩增程序为98℃，4min；98℃，10s；52℃，10s；72℃，130s；30个循环；72℃，10min；

利用T4 DNA连接酶将上述PCR终产物SQR-GFP片段与pMD-18T 在4℃条件下连接，获得重组载体pMD18T-SQR-GFP；

(4)将中间载体pMD18T-SQR-GFP用限制性内切酶XhoⅠ和KpnⅠ双酶切，同时用同样的限制性内切酶双酶切pcDNA3.1(-)，将酶切回收的SQR-GFP目的片段和pcDNA3.1(-)载体片段采用T4 DNA连接酶连接16℃过夜，获得真核表达载体pcDNA3.1(-)-SQR-GFP；

(5)根据Genebank中IFABP启动子序列设计PCR引物P7、P8，扩增IFABP启动子片段，扩增的程序为：98℃，4min；98℃，10s；55℃，10s；72℃，80s；30个循环；72℃，5min，获得IFABP片段的大小为1352bp；

P7: 5’-CGGCTAGCACGAACATTGACTGGAGT Nhe I

P8: 5’-GCTCTAGATACTTTCCAAGTGCCATC Xba I

将上述获得的IFABP片段TA克隆到载体pMD-18T上，获得重组载体pMD18T-IFABP，并采用Nhe I和Xba I进行双酶切，将回收得到的IFABP片段克隆到pcDNA3.1-SQR-GFP相应的酶切位点，获得重组载体pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP。

2.用权利要求1所述硫化物醌氧化还原酶肠道定向表达载体制备的慢病毒载体。

3.用权利要求1所述硫化物醌氧化还原酶肠道定向表达载体制备慢病毒载体的方法，其特征在于：

权利要求1所述重组载体pcDNA3.1-IFABP-SQR-GFP采用NheⅠ、KpnⅠ双酶切后经琼脂糖凝胶分离纯化后获取IFABP-SQR-GFP，利用相同酶切方法处理pLenti4质粒获取含慢病毒转运载体序列的 DNA 片段，将此片段与 IFABP-SQR-GFP连接，获得新的重组质粒pLenti4-IFABP- SQR-GFP，与病毒辅助质粒pC-GP、pR-Rev、pC-VSVG共转染HEK293细胞制备获得慢病毒载体。

4.用权利要求2或3所述慢病毒载体转染猪成纤维细胞后获得的转基因细胞系。

5.用权利要求2或3所述慢病毒载体转染猪成纤维细胞后获得的转基因细胞系的方法，其特征在于：

将权利要求2或3所述含有IFABP-SQR-GFP的慢病毒载体转染猪成纤维细胞，24~48小时后进行瞬时转染效率检测，同时加入300 μg/ml G418进行筛选，筛选四周后获得稳定表达SQR的细胞克隆，挑取单克隆继续扩大培养获得SQR稳定表达细胞系。

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