CN105200085A - 重组人成纤维细胞生长因子-18的生产方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明一种重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法，包括以下步骤：步骤一、利用昆虫杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中表达成纤维细胞生长因子-18蛋白，具体包括：1)获得重组杆状病毒Bacmid-FGF18，FGF18基因为成纤维细胞生长因子-18基因，碱基序列如SEQ？ID？NO:1所示，2)用步骤1)得到的MOI为1～32的Bacmid-FGF18重组杆状病毒侵染昆虫细胞，之后于温度25～29℃下培养12h～96h后收获细胞液；以及，步骤二、从步骤一收获的细胞液中纯化得到人成纤维细胞生长因子-18蛋白。本发明还公开了重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白用于治疗骨骼性疾病和脱发症的用途。

Description

重组人成纤维细胞生长因子-18的生产方法及其用途

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及重组人成纤维细胞生长因子-18的生产方法及其用途。

背景技术

FGF18是FGF家族的一个新成员，是一种可分泌蛋白。1998年，日本科学家Ohbayashi首次从老鼠胚胎中分离得到了FGF18。人FGF18基因编码一个207氨基酸组成的蛋白序列，分子质量约为23kDa。序列分析结果表明，FGF18基因是由207个氨基酸组成的高度保守的序列，小鼠FGF18与人及大鼠的氨基酸序列具有99.5％和99％的同源性。在结构上，FGF18和FGF8、FGF17相似，为同一亚家族成员，具有70％～80％的氨基酸序列同源性。FGF18在骨骼生长发育过程中扮演着重要的角色，也参与皮质神经元活动，腺垂体的生存、分化和增殖及调节头发的生长和皮肤修复。体外和体内的多项研究表明，FGF18在形态发生、血管形成、肿瘤生长和其他细胞发育过程中也发挥着重要的作用。

由于FGF18的发现对于骨骼性疾病以及脱发症的治疗有着重要意义，对于FGF18的研究以及临床应用的前景日益受到人们的关注。因此，FGF18蛋白具有广阔的市场前景。然而，目前FGF18蛋白表达水平低，同时很难制备具有高活性的蛋白。这些已经构成了FGF18基础研究和临床应用的瓶颈问题。

发明内容

本发明在前期研究基础上，构建了以杆状病毒为载体的FGF18昆虫细胞表达系统，同时计划对于在系统中影响目的蛋白表达量的主要影响因素，如病毒的浓度滴度(MOI)，收获时间(TOI)以及细胞的状态等相关因素进行优化。

因此，本发明的目的之一是提供一种重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法，本发明通过利用昆虫细胞表达系统，对于影响蛋白表达量的主要影响因素，如病毒的浓度滴度(MOI)，收获时间(TOI)以及细胞的状态等相关因素进行优化，解决了FGF18不能稳定高效表达且不影响其蛋白生物活性的问题，同时通过CM-SepharoseFF阳离子交换和肝素亲和层析柱的两步法分离纯化技术，解决了FGF18蛋白纯度低的问题。。

本发明的还有一个目的是提供重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白用于治疗骨骼性疾病和脱发症的用途。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法，包括以下步骤：

步骤一、利用昆虫杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中表达成纤维细胞生长因子-18蛋白，具体包括：

1)获得重组杆状病毒Bacmid-FGF18，其中FGF18基因为成纤维细胞生长因子-18基因，其碱基序列如SEQIDNO:1所示，

2)用步骤1)得到的MOI为1～32的Bacmid-FGF18重组杆状病毒侵染昆虫细胞，侵染后于温度25～29℃下培养12h～96h后收获细胞液；以及，

步骤二、从步骤一收获的细胞液中纯化得到人成纤维细胞生长因子-18蛋白。

优选的是，所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法中，所述步骤2)中，所述Bacmid-FGF18重组杆状病毒的MOI为3.5。

优选的是，所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法中，所述步骤2)中，用Bacmid-FGF18重组杆状病毒侵染昆虫细胞后于温度27℃下培养96h后收获细胞。

优选的是，所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法中，所述步骤2)中所述重组杆状病毒Bacmid-FGF18为第四代重组杆状病毒。

优选的是，所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法中，所述步骤1)中，获得重组杆状病毒Bacmid-FGF18的具体方法包括：

步骤1.1)以人工合成含有FGF18基因的载体为模板，利用如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的基因片段，并将其构建到pFastBac质粒上以得到pFastBac-FGF18重组载体；

步骤1.2)利用步骤1.1)中得到的pFastBac-FGF18重组载体转座含有Bacmid质粒的E.ColiDH10Bac感受态细胞中，从而使其发生同源重组以得到Bacmid-FGF18重组载体；

步骤1.3)利用Bacmid-FGF18重组质粒转染昆虫细胞以得到第一代重组杆状病毒；以及，

步骤1.4)将步骤1.3)中得到的第一代重组杆状病毒转染昆虫细胞以表达得到第二代重组杆状病毒，之后再利用同样的方法侵染昆虫细胞直到得到第四代重组杆状病毒。

优选的是，所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法中，所述步骤二中，从步骤一中收获的细胞液中纯化得到人成纤维细胞生长因子-18蛋白的具体过程包括：

2.1)将步骤一中收获的细胞液于14000g离心15min，取上清经0.22μm滤膜过滤得滤液；

2.2)将步骤2.1)中得到的滤液使用阳离子交换柱进行层析并收集得到FGF18蛋白粗样品；以及，

2.3)将步骤2.2)中得到的FGF18样品再使用肝素亲和层析柱进行层析，并收集得到FGF18蛋白样品。

优选的是，所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法中，所述步骤2.2)中，将步骤2.1)中得到的滤液使用阳离子交换柱进行层析的具体过程包括：

首先将步骤2.1)中得到的滤液上样至CM-琼脂糖凝胶FF阳离子交换柱，然后使用10柱体积的溶液A清洗层析柱，再用20柱体积的溶液A和溶液B的混合溶液于时间90min内使溶液B的比例从0％升至100％进行梯度清洗，并收集FGF18蛋白粗样品。

优选的是，所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法中，所述步骤2.3)中将步骤2.2)中得到的FGF-18样品再使用肝素亲和层析柱进行层析的具体步骤包括：

首先将步骤2.2)中得到的FGF18蛋白粗样品上样至肝素亲和层析柱，然后使用10柱体积的溶液A清洗层析柱，再用20柱体积的溶液A和溶液C的混合溶液于时间90min内使溶液B的比例从0％升至100％进行梯度清洗，并收集FGF18蛋白样品。

优选的是，所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法中，所述昆虫细胞为Sf9细胞。

重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白用于治疗骨骼性疾病和脱发症的用途。

本发明的有益效果为：

本发明构建了以杆状病毒为载体的FGF18昆虫细胞表达系统，同时对于在系统中影响目的蛋白表达量的主要影响因素，如病毒的浓度滴度(MOI)，收获时间(TOI)以及细胞的状态等相关因素进行了优化，实现了在昆虫细胞中FGF18的表达，同时利用CM-SepharoseFF阳离子交换和肝素亲和层析柱分离纯化目的蛋白，经两步法最终获得蛋白纯度超过95％的FGF18重组蛋白，不但显著提高FGF18重组蛋白的表达量，而且简化了纯化工艺，提高了收率，为FGF18蛋白药物提供了一条高效、稳定的生产新途径。为今后开展产业化生产奠定了基础。

附图说明

图1a为本发明其中一个实施例中Bacmid-FGF18载体的PCR鉴定的部分凝胶电泳结果图。

图1b为本发明其中一个实施例中pFastBac-FGF18载体的PCR鉴定的部分凝胶电泳结果图。

图2a为本发明其中一个实施例中显微镜下观察到的正常的昆虫细胞的照片。

图2b为本发明其中一个实施例中显微镜下观察到的病毒侵染的昆虫细胞的照片。

图3为本发明其中一个实施例中FGF18蛋白表达情况的Westernblot鉴定示意图。

图4为本发明其中一个实施例中FGF18蛋白分子量的Westernblot鉴定示意图。

图5a为本发明其中一个实施例中显微镜下观察到的正常的昆虫细胞的照片。

图5b为本发明其中一个实施例中显微镜下观察到的病毒侵染的昆虫细胞的照片。

图6为本发明其中一个实施例中不同病毒转染时间对FGF18蛋白表达影响的曲线示意图。

图7为本发明其中一个实施例中经两步法纯化后的FGF18蛋白的Westernblot鉴定示意图。

具体实施方式

根据本发明，可采用本领域技能中的常规分子生物学、微生物学、细胞学和DNA重组技术。如果出现于本文下来术语的定义如下。

“DNA分子”指脱氧核糖核苷酸(胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤)的聚合形式，是染色体主要组成成分，同时也是组成基因的材料。这一术语只指分子的一级和二级结构，不限制其任何具体的三级形式。本术语包括特别是在线性DNA分子、病毒、染色体、质粒中国发现的双链DNA。这里讨论的结构，按照习惯上给出的只是DNA正义链的5'到3'方向的序列。

“载体”是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子，一种类型的载体是“质粒”，质粒是其他的DNA片段可与其连接的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其可将其他的DNA片段连接至病毒基因组。某些载体整合至宿主细胞基因组中，并得以与宿主基因组一起复制。并且，某些载体能指导与其可操作连接的基因的表达，一般使用的这样的表达载体为质粒形式。在本发明中，可交互使用“质粒”和“载体”。

“重组载体”是指已连接了基因的表达载体。在本发明中，可交互使用“重组质粒”和“重组载体”。

本文中的术语“宿主”不仅包括原核生物，也包括真核生物如酵母、植物和动物细胞。

本发明中的“反向互补”，指通过碱基配对原则关联的核苷酸序列。例如，序列“5’-A-T-G-3’”与序列“5’-C-A-T-3’”反向互补。

引物，又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3’-OH，必须是游离的。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。DNA上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，又称编码链。另一条链核苷酸序列与正义链互补，称为反义链。一般将与正义链互补的一个引物成为上游引物，与反义链互补的一个引物称为下游引物。

密码子优化：在基因表达研究中，研究者比较注意选择合适的表达载体和宿主系统，以及基因本身是否与载体和宿主系统为最佳匹配。基因的最佳化表达可以通过对基因的重新设计和合成来实现，如消除稀有密码子而利用最佳化密码子，二级结构最小化，调整GC含量等。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本发明提供一种重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法，包括以下步骤：

步骤一、利用昆虫杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中表达成纤维细胞生长因子-18蛋白，具体包括：

1)获得重组杆状病毒Bacmid-FGF18，其中FGF18基因为成纤维细胞生长因子-18基因，其碱基序列如SEQIDNO:1所示，

2)用步骤1)得到的MOI为1～32的Bacmid-FGF18重组杆状病毒侵染昆虫细胞，侵染后于温度25～29℃下培养12h～96h后收获细胞液；以及，

步骤二、从步骤一收获的细胞液中纯化得到人成纤维细胞生长因子-18蛋白。

在上述的方案中，作为优选，为了人成纤维细胞生长因子-18蛋白的表达量更大，所述步骤2)中，所述Bacmid-FGF18重组杆状病毒的MOI为3.5。

在上述的方案中，作为优选，为了人成纤维细胞生长因子-18蛋白的表达量更大，所述步骤2)中，用Bacmid-FGF18重组杆状病毒侵染昆虫细胞后于温度27℃下培养96h后收获细胞。

在上述的方案中，作为优选，为了人成纤维细胞生长因子-18蛋白的表达量更大，所述步骤2)中所述重组杆状病毒Bacmid-FGF18为第四代重组杆状病毒。

在本发明的其中一些实施例中，作为优选，所述步骤1)中，获得重组杆状病毒Bacmid-FGF18的具体方法包括：

步骤1.1)以人工合成含有FGF18基因的载体为模板，利用如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的基因片段，并将其构建到pFastBac质粒上以得到pFastBac-FGF18重组载体；

步骤1.2)利用步骤1.1)中得到的pFastBac-FGF18重组载体转座含有Bacmid质粒的E.ColiDH10Bac感受态细胞中，从而使其发生同源重组以得到Bacmid-FGF18重组载体；

步骤1.3)利用Bacmid-FGF18重组质粒转染昆虫细胞以得到第一代重组杆状病毒；以及，

步骤1.4)将步骤1.3)中得到的第一代重组杆状病毒转染昆虫细胞以表达得到第二代重组杆状病毒，之后再利用同样的方法侵染昆虫细胞直到得到第四代重组杆状病毒。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤二中，从步骤一中收获的细胞液中纯化得到人成纤维细胞生长因子-18蛋白的具体过程包括：

2.1)将步骤一中收获的细胞液于14000g离心15min，取上清经0.22μm滤膜过滤得滤液；

2.2)将步骤2.1)中得到的滤液使用阳离子交换柱进行层析并收集得到FGF18蛋白粗样品；以及，

2.3)将步骤2.2)中得到的FGF18样品再使用肝素亲和层析柱进行层析，并收集得到FGF18蛋白样品。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤2.2)中，将步骤2.1)中得到的滤液使用阳离子交换柱进行层析的具体过程包括：

首先将步骤2.1)中得到的滤液上样至CM-琼脂糖凝胶FF阳离子交换柱，然后使用10柱体积的溶液A清洗层析柱，再用20柱体积的溶液A和溶液B的混合溶液于时间90min内使溶液B的比例从0％升至100％进行梯度清洗，并收集FGF18蛋白粗样品。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述步骤2.3)中将步骤2.2)中得到的FGF-18样品再使用肝素亲和层析柱进行层析的具体步骤包括：

首先将步骤2.2)中得到的FGF18蛋白粗样品上样至肝素亲和层析柱，然后使用10柱体积的溶液A清洗层析柱，再用20柱体积的溶液A和溶液C的混合溶液于时间90min内使溶液B的比例从0％升至100％进行梯度清洗，并收集FGF18蛋白样品。

在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述昆虫细胞为Sf9细胞。

重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白用于治疗骨骼性疾病和脱发症的用途。

本发明中所采用的材料与方法等如下所示：

条件

项目依托温州医科大学药学院省生物制药工程重点实验室和生物反应器与药物开发实验室，实验所需的实验仪器以及器材均有配备。

材料和试剂

无菌摇瓶125ml、250ml、500ml、移液管、六孔板、Sf9细胞、Sf-900ⅡSFM培养基、蛋白质预染Marker、PVDF膜、RIPA裂解液、BCA法蛋白测定试剂、辣根过氧化酶标记驴抗鼠抗体、Tris-base、甘氨酸、SDS、甲醇、30％丙烯酰胺凝胶、ECL发光液、FBS。

Ex-Taq酶、高保真酶、HindIII和BamHI限制性内切酶、DNAMarker2000、DNA连接试剂盒、T载体、琼脂糖凝胶DNA试剂回收试剂盒、质粒提取试剂盒、琼脂糖、甘油、氨苄青霉素、庆大霉素、四环素、卡那霉素、IPTG、X-gal、酵母粉、蛋白胨等。

仪器

PCR仪、常温离心机、37℃恒温培养箱、核酸电泳仪、凝胶成像系统、电子天平、高压蒸汽灭菌锅、-80℃冰箱、超高速低温离心机、超净工作台、高速冷冻离心机、各种蛋白质分离纯化设备、水浴锅、恒温摇床、蛋白质电泳仪、凝胶成象系统、超声波提取器、倒置显微镜、脱色摇床、超纯水系统。

实施例1

1.实验方法

1.1Bacmid-FGF18载体的构建

根据GenBank中公布的人FGF-18天然序列(登录号：NM-003862.2)和氨基酸序列，其核苷酸序列如SEQIDNO:1所示，氨基酸序列如SEQIDNO:4所示，按照昆虫细胞密码子偏爱性并考虑消除发夹结构等不利于表达的二级结构，在不改变氨基酸序列的条件下，设计rhFGF-18的编码序列引物。通过PCR扩增的方法获得rhFGF-18的全长目的序列。人工合成重组人成纤维细胞生长因子-18(rhFGF-18)基因的全序列时，在该基因的5’端引入BamHI酶切位点及在3’端引入HindIII酶切位点。然后，使用如下引物对以人工合成序列为模板进行PCR扩增，用HindIII和BamHI双酶切，连接入同样用HindIII和BamHI双酶切的载体pFastBac，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞后抽提能在含氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基上生长的阳性克隆的载体，测序验证正确后，获得了载体pFastBac-FGF18。

上游引物：ATGGAGGAGAACGTCGACTTCC(SEQIDNO:2)；

下游引物：TTAAGCAGGGTGGGTAGGGC(SEQIDNO:3)。

然后，取上述制备的载体pFastBac-FGF18与含有杆状病毒穿梭载体(Bacmid)的E.coliDH10Bac感受态细胞混合，冰上放置30min，42℃热激45s，热激后立刻放到冰上，静置2分钟。然后，向热激产物加0.9ml室温的S.O.C.培养基，于37℃以225rpm震荡培养4h。然后，加入9倍体积S.O.C.培养基稀释培养物，取100μl稀释液涂到含有50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素、7μg/ml庆大霉素、80μg/mlX-gal和0.5mMIPTG的LB平板上，于37℃培养24h。然后，挑取白色单克隆，经PCR鉴定正确后，将克隆在LB液体培养基中于37℃培养过夜。

培养的菌液5ml以14000×g离心1min，弃上清，沉淀用0.3ml的SolutionI(配方为：15mMTris-HCl，pH8.0；10mMEDTA；100μg/mlRNaseA)重悬，然后加入0.3ml的SolutionII(配方为：0.2MNaOH，1％(w/w)SDS)混匀，室温放置5min。然后，缓慢加入0.3ml3M的乙酸-乙酸钠(pH5.5)缓冲液，边加入边轻轻混匀，冰上放置5～10min，14000×g离心10min。取上清转移到含有0.8ml异丙醇的离心管中，混匀后冰上放置5～10min，14000×g离心15min。取上清与0.5ml的70％(v/v)乙醇混合，14000×g离心5min，弃上清沉淀用无水乙醇洗涤一次后，室温空气干燥，沉淀用40μl的1×TE缓冲液(pH8.0)。沉淀就是病毒载体Bacmid-FGF18，克隆有FGF18基因。

1.2Bacmid-FGF18转染昆虫细胞

选择对数生长期的Sf9细胞，活细胞率>95％。6孔板中每板加入2ml的Sf-900IISFM培养基，将细胞接种到6孔板中，接种浓度为9×10⁵个Sf9细胞/孔，于28℃孵育6孔板1h。

分别取用Sf-900IISFM培养基稀释成1μg/ml的上述制备的Bacmid-FGF18的DNA的100ul，分别与新鲜配置的含5％(v/v)CELLFECTINIIReagent的Sf-900IISFM培养基100ul混合混匀，室温孵育25min。然后将混合液滴加到6孔板中的细胞培养物中，于27℃孵育4.5h。然后吸取上清，再添加2mlSf-900IISFM培养基，于27℃孵育72h，500×g离心5min，取上清，其中克隆有核苷酸序列FGF18基因的P1病毒，可用于感染昆虫细胞，用含2％(w/w)胎牛血清的无血清培养基4度避光保存病毒。按照Bac-to-Bac杆状病毒载体说明书，依次获得P2、P3病毒，噬斑法计算病毒滴度，计算MOI值为3.5进行蛋白表达分析。

1.3FGF18蛋白的表达

选择对数生长期的Sf9细胞(活细胞率>95％)，加入无血清培养基调节细胞浓度至2×10⁶细胞/ml，每个125ml的三角瓶接种30ml细胞，加入上述制备的P3病毒溶液(克隆有FGF18基因)，使病毒的MOI值为3.5，于27℃振荡培养96h，取上清或裂解细胞，用FGF18ELISA检测试剂盒检测，Sf9细胞或上清的表达量最高可达18mg/L。

2结果与讨论

2.1Bacmid-FGF18病毒载体的PCR鉴定

结果如图1a和图1b所示，图1a中，M：两个DNAMarker；1：经HindⅢ、BamHⅠ双酶切的FGF18质粒；图1a可以看出，FGF18双酶切后的质粒电泳位置与558bp预期结果一致，转移载体质粒双酶切电泳结果也与预期一致，说明Bacmid-FGF18病毒载体已成功构建。

图1b中，M为DNAMarker；1：转移载体pFastBac-FGF18质粒双酶切鉴定结果；2：胶回收后的FGF18片段；3：胶回收后的pFastBac片段；4：转移载体pFastBac-FGF18质粒；M：DNAMarkerDL15000。

2.2Bacmid-FGF18转染昆虫细胞

如图2a的正常的昆虫细胞和图2b所示的感染后的昆虫细胞，重组载体在转染试剂的介导下转染对数生长期的昆虫细胞，昆虫细胞感染病毒后，显微镜下观察形态，细胞停止分裂，细胞内有粒状物出现，细胞表面出芽，出泡，部分细胞裂解。

2.3FGF18在昆虫细胞中的表达

从图3中，病毒转染细胞后，在不同时间点收获相同体积细胞上清进行SDS电泳、WesternBlot鉴定。结果表明，FGF18在昆虫细胞系统中得到了表达。

与原核表达系统相比，昆虫表达体系可使较高分子量蛋白表达，在绝大多数情况下，所表达外源性真核蛋白翻译后的加工过程与哺乳类细胞所表达的蛋白基本一样，具有同样的生物学活性和免疫学活性。昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白；易于表达异源多聚体蛋白，可通过多种重组病毒同时感染昆虫细胞或用含有多个表达框的一种病毒感染昆虫细胞来实现；昆虫杆状病毒不感染脊椎动物，因此具体较好的安全性。

本发明在杆状病毒为载体的昆虫(细胞或成虫)的表达系统中，结合昆虫表达密码子优化体系，可实现FGF18在昆虫细胞表达系统中的表达，该方法为FGF18蛋白药物提供了一条高效、稳定的生产新途径。

实施例2

3实验方法

3.1Sf9昆虫细胞的培养

3.1.1Sf9昆虫细胞的复苏

从液氮罐中取出细胞冻存管，迅速放入37℃水浴中，不断摇晃使得细胞受热均匀融化，1min左右，于超净工作台中将细胞冻存液加入到25mlSf-900ⅡSFM培养基中。封口置于27℃恒温摇床中，110rpm，无CO₂培养。

3.1.2Sf9细胞的悬浮培养

细胞在摇瓶中悬浮培养，通过台盼蓝计数来记录细胞的成活率和死亡率。当密度达到2×10⁶个/ml，则表示细胞处于较好生长状态，为对数生长期，可以对细胞进行扩大培养，使细胞浓度保持在2-5×10⁵个/ml。

3.2Bacmid-FGF18转染昆虫细胞

①对数生长期的Sf9细胞，加入到六孔板中，每孔8×10⁵个；

②30min后，细胞贴壁；

③细胞转染用溶液：8μl加入到100μl的昆虫细胞培养基中混合，取1μlBacmid-FGF18质粒加入到100μl中混匀，将两种混合液混合，即转染混合物；

④将转染混合物滴加到细胞上，27℃3-5小时；

⑤弃去转染混合物，加入新的培养基2ml，27℃72h或者显微镜观察细胞状态。

3.3收获病毒

3.3.1收获P1代病毒

在显微镜下看到细胞出现体积变大，细胞膜不光滑，有颗粒状物质出现的时候，收集细胞上清，500g离心5min，加入胎牛血清(FBS)使得终体积比为2％，避光4℃保存。

3.3.2收获P2病毒

对数生长期的细胞加入到六孔板中，每孔2×10⁶个，贴壁后，每孔加入P1病毒约30μl。27℃培养2d后，收集细胞上清，500g离心5min，弃去沉淀后加入2％FBS，避光4℃保存。

3.3.3收获P3和P4代病毒

方法按照2.3.2，直到病毒达到的滴度为止。操作方法参照说明书。

3.4病毒滴度的测定

①对数生长期的Sf9细胞加入到六孔板中，每孔2×10⁶个，27℃过夜；

②按照10^-1到10^-8的稀释梯度用细胞培养基稀释，标记后室温1h；

③准备覆盖物：4％琼脂糖凝胶和培养基1：3比例混合，37℃水浴备用；

④病毒孵育后，弃去上清，加入琼脂覆盖物2ml；

⑤琼脂糖凝固后，27℃，湿润的条件下培养，每天观察噬斑的个数，直到连续2d个数不变。

3.5蛋白表达条件的初步优化

3.5.1蛋白质表达的最佳收获时间的确定

在细胞对数生长期是加入1.2mlP4代病毒，每隔12h，即12、24、36、48、60、72、84、96h分别取2ml细胞，台盼蓝计数后，500g离心5min，细胞的上清和细胞分别保存于4℃和-20℃中。

3.5.2蛋白质表达的最佳病毒浓度滴度的确定

处于对数生长期的昆虫细胞，使得MOI＝1、2、4、8、16、32，计算每瓶细胞中的病毒体积进行转染，在最佳收获时间收集样品，500g离心5min。

3.5.3蛋白样品的WesternBlot鉴定

①电泳：等量收集的样品加入蛋白上样缓冲液，煮沸10min。20μl样品上样，80V电压电泳15min左右直到蛋白样品被压成一条直线，加压到120V大约1h后上样缓冲液在底部为止；

②转膜：PVDF膜浸泡在甲醇中，卸下凝胶，按照预染Marker的指示位置切取目的条带大小的胶条置于滤纸上，按照顺序盖上滤纸和海绵，转膜架夹紧后，置于转膜液中，300mA转膜90min；

③封闭：取出PVDF膜，TBS稍洗后放入封闭液中封闭2h；

④孵育Ⅰ抗：按1:1000加入鼠源FGF18核心蛋白单克隆抗体混匀，4℃过夜；

⑤洗膜：TBST洗涤3次，每次7min；

⑥孵育Ⅱ抗：用TBST按1:2000稀释驴抗鼠二抗，室温孵育1h；

⑦洗膜：TBST洗涤3次，每次7min；

⑧曝光：现配曝光液，在凝胶成像系统中进行曝光。

3.6FGF18蛋白的纯化

取上述培养FGF18基因的P3病毒感染的Sf9细胞的培养物，14000×g离心15min，取上清经0.22μm滤膜过滤。然后将滤液采用如下两步进行纯化。

3.6.1.层析1(阳离子交换)：

层析介质：CM-SepharoseFF

缓冲液：溶液A：PB(20mM，pH6.5)+25mMNaCl

溶液B：PB(20mM，pH6.5)+1.2MNaCl

上样：将粗提蛋白溶液上CM阳离子交换柱。

清洗：上样后用10CV的溶液A清洗层析柱。

梯度：清洗后用20CV将溶液B从0％升至100％，时间梯度90min。

收集：收集FGF18样品峰。

3.6.2.层析2(肝素亲和层析柱)

层析介质：Heparin-sepharosecolumn

缓冲液：溶液A：PB(20mM，pH6.5)+25mMNaCl

溶液C：PB(20mM，pH6.5)+1.5MNaCl

上样：将盐析后的蛋白溶液上样。

清洗：上样后用10CV的溶液A清洗层析柱。

梯度：清洗后用20CV将溶液C从0％升至100％，时间梯度90min。

收集：收集FGF18样品峰。

即获得FGF18蛋白，样品经两步纯化纯度达到90％以上。

在以上纯化过程中，产物和中间产物均未发生去折叠和聚集沉淀的现象。

4结果与讨论

4.1FGF18的氨基酸序列

FGF18氨基酸序列表

FGF18蛋白是来源于人的FGF18基因编码一个207氨基酸组成的蛋白序列，其分子质量大约为23kDa，如图4所示，为WesternBlot鉴定结果图。

4.2Bacmid-FGF18转染昆虫细胞

图5a显示正常昆虫细胞，图5b显示转染后的昆虫细胞，从图5b中可以看出，昆虫细胞感染病毒后，显微镜下观察形态，细胞停止分裂，细胞内有粒状物出现，细胞表面出芽，出泡，部分细胞裂解。

4.3昆虫细胞的活细胞率随病毒侵染的时间变化

从图6可看出，病毒侵染细胞后，活细胞率随着时间一直呈下降趋势。虽然前36h活细胞数持续增加，36h时增至4.8×10⁶个/ml，但36小时之后细胞数目开始急剧下降，120h活细胞的数目不到0.9×10⁶个/ml。

病毒转染细胞后，在不同时间点和不同MOI收获相同体积细胞上清进行WesternBlot鉴定。结果表明，转染24小时细胞开始表达蛋白，96h时蛋白的表达量最高。

4.4昆虫细胞表达FGF18蛋白的纯化

经CM-SepharoseFF(CM-琼脂糖凝胶FF)阳离子交换和肝素亲和柱，两步法分离纯化目的蛋白，最终获得FGF18蛋白纯度超过95％

结论

通常，不同病毒浓度滴度(MOI)对蛋白表达影响较大，在MOI低水平的情况下可以扩增病毒，而过高浓度MOI不仅增加了病毒的使用量，对细胞的危害较大，会使得细胞短时间大量死亡，蛋白得不到足够时间表达，但较低的MOI则增长蛋白的产生时间，也加大了污染的可能。如果过早的收获病毒，则造成培养基的浪费；而过晚收获病毒，昆虫细胞的代谢产物和酶会使蛋白质发生部分降解，从而影响蛋白的收获。

目前国际上的FGF18表达系统生产工艺，为方便纯化都融合标签(His,GST,Trx等)来表达目的蛋白，但这些方法来表达的蛋白具有较高的免疫原性。同时去除融合标签既昂贵又会影响蛋白的生物活性。因此，迫切需要开发一种新型简易的生产工艺，利用目的蛋白结构特性，比如肝素结合能力和二硫键的形成，来表达目的蛋白是一种明智的选择，也会减少纯化对目的蛋白的破坏，同时也简化纯化步骤，提高成品的产量。本发明通过基因优化，表达载体筛选，获得FGF18的昆虫细胞表达体系，同时利用CM-SepharoseFF阳离子交换和肝素亲和柱分离纯化目的蛋白，最终获得蛋白纯度超过95％的FGF18重组蛋白，为今后开展产业化生产奠定了基础。

Claims (10)

1.一种重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、利用昆虫杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中表达成纤维细胞生长因子-18蛋白，具体包括：

1)获得重组杆状病毒Bacmid-FGF18，其中FGF18基因为人成纤维细胞生长因子-18基因，其碱基序列如SEQIDNO:1所示，

2)用步骤1)得到的MOI为1～32的Bacmid-FGF18重组杆状病毒侵染昆虫细胞，侵染后于温度25～29℃下培养12h～96h后收获细胞液；以及，

步骤二、从步骤一收获的细胞液中纯化得到人成纤维细胞生长因子-18蛋白。

2.如权利要求1所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述Bacmid-FGF18重组杆状病毒的MOI为3.5。

3.如权利要求1所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法，其特征在于，所述步骤2)中，用Bacmid-FGF18重组杆状病毒侵染昆虫细胞后于温度27℃下培养96h后收获细胞。

4.如权利要求1所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法，其特征在于，所述步骤2)中所述重组杆状病毒Bacmid-FGF18为第四代重组杆状病毒。

5.如权利要求1所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法，其特征在于，所述步骤1)中，获得重组杆状病毒Bacmid-FGF18的具体方法包括：

步骤1.1)以人工合成含有FGF18基因的载体为模板，利用如SEQIDNO:2和SEQIDNO:3所示的引物序列通过PCR扩增得到如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列的基因片段，并将其构建到pFastBac质粒上以得到pFastBac-FGF18重组载体；

步骤1.2)利用步骤1.1)中得到的pFastBac-FGF18重组载体转座含有Bacmid质粒的E.ColiDH10Bac感受态细胞中，从而使其发生同源重组以得到Bacmid-FGF18重组载体；

步骤1.3)利用Bacmid-FGF18重组质粒转染昆虫细胞以得到第一代重组杆状病毒；以及，

步骤1.4)将步骤1.3)中得到的第一代重组杆状病毒转染昆虫细胞以表达得到第二代重组杆状病毒，之后再利用同样的方法侵染昆虫细胞直到得到第四代重组杆状病毒。

6.如权利要求1至5任一所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法，其特征在于，所述步骤二中，从步骤一中收获的细胞液中纯化得到人成纤维细胞生长因子-18蛋白的具体过程包括：

2.1)将步骤一中收获的细胞液于14000g离心15min，取上清经0.22μm滤膜过滤得滤液；

2.2)将步骤2.1)中得到的滤液使用阳离子交换柱进行层析并收集得到FGF18蛋白粗样品；以及，

2.3)将步骤2.2)中得到的FGF18样品再使用肝素亲和层析柱进行层析，并收集得到FGF18蛋白样品。

7.如权利要求6所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法，其特征在于，所述步骤2.2)中，将步骤2.1)中得到的滤液使用阳离子交换柱进行层析的具体过程包括：

首先将步骤2.1)中得到的滤液上样至CM-琼脂糖凝胶FF阳离子交换柱，然后使用10柱体积的溶液A清洗层析柱，再用20柱体积的溶液A和溶液B的混合溶液于时间90min内使溶液B的比例从0％升至100％进行梯度清洗，并收集FGF18蛋白粗样品。

8.如权利要求6所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法，其特征在于，所述步骤2.3)中将步骤2.2)中得到的FGF-18样品再使用肝素亲和层析柱进行层析的具体步骤包括：

首先将步骤2.2)中得到的FGF18蛋白粗样品上样至肝素亲和层析柱，然后使用10柱体积的溶液A清洗层析柱，再用20柱体积的溶液A和溶液C的混合溶液于时间90min内使溶液B的比例从0％升至100％进行梯度清洗，并收集FGF18蛋白样品。

9.如权利要求1所述的重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白的生产方法，其特征在于，所述昆虫细胞为Sf9细胞。

10.重组人成纤维细胞生长因子-18蛋白用于治疗骨骼性疾病和脱发症的用途。