CN111051495A - 原代培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种原代培养方法，其是在体外对从生物体采集的组织中所含的细胞进行原代培养的原代培养方法，其中，将从生物体采集的组织中的细胞接种至含有构成间质的细胞、且单层的或2个以上的细胞层在厚度方向上层叠的细胞结构体的顶面上，进行培养。

Description

原代培养方法
技术领域
本发明涉及对从生物体采集的组织中的细胞进行原代培养的方法。本发明特别是涉及对癌症患者的肿瘤组织来源的癌细胞进行原代培养的方法。
本申请基于2017年8月21日在日本提出申请的日本特愿2017-158901号主张优先权，将其内容援引至此。
背景技术
一直以来，在癌症研究中，使用在最适于培养的条件下进行传代培养而建立的细胞株的实验是主流。但是，长年来在生物体外维持、被持续培养的癌细胞株与原本的患者肿瘤组织相比，性质发生了变化，有可能无法说是充分地反映了生物体内的行为。于是，为了开发精度更高的抗癌剂、选择最适于每个患者的治疗，癌细胞的原代培养被认为是有希望的。
例如，非专利文献1中介绍了使用原代培养细胞的CD-DST(Collagen gel dropletembedded drug sensitivity test，胶原凝胶微滴包埋药敏试验)法。该试验法是将从患者分离出的组织或细胞在胶原凝胶内进行包埋培养并进行验证的药物敏感性试验。但是，对于原代培养细胞，很难说已经确立了培养法，培养成功率低成为课题。
作为从患者肿瘤组织对癌细胞进行原代培养的方法，为了抑制伴随细胞分散的细胞死亡(凋亡)，提出了在培养基中添加作为ROCK抑制剂的Y-27632的方法(非专利文献2)、或者获得在维持着细胞间黏附的状态下的一定尺寸的细胞团块并进行悬浮培养的方法(专利文献1)。这些培养法中，使用在干细胞用的无血清培养基中添加了血清代替物或各种增殖因子的培养基。但是，一般来说，干细胞用无血清培养基除了价格昂贵之外，还有在人为地大量添加有增殖因子的生长环境中将不同于实际生物体内的信号通路亢进或抑制的可能性。在这种环境下，特别是在使用了分子靶向药物的敏感性试验等中，有可能获得与实际生物体内不同的结果。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第5652809号公报
非专利文献
非专利文献1：Takamura et al.,International Journal of Cancer,2002,Vol.98,p.450-455.
非专利文献2：Zhang L et al.,PLOS ONE,2011,vol.6,p.18271.
非专利文献3：Nishiguchi et al.,Macromol Bioscience,2015,vol.15(3)，p.312-317.
发明内容
发明要解决的技术问题
本发明的目的在于提供不特别地添加增殖因子或任何抑制剂、使用通常的细胞培养中使用的培养用培养基对从生物体采集的组织(生物体组织)中的细胞进行原代培养的方法。
用于解决技术问题的手段
本发明人们为了解决上述技术问题反复进行深入研究时发现，当在细胞外对从生物体采集的组织中的细胞进行培养时，在培养的初期，间质的存在是很重要的，从而完成了本发明。
[1]本发明第一方式的原代培养方法是在体外对从生物体采集的组织中所含的细胞进行原代培养的原代培养方法，其中，将从生物体采集的组织中的细胞接种至含有构成间质的细胞、且单层的或2个以上的细胞层在厚度方向上层叠的细胞结构体的顶面上，进行培养。
[2]可以将从所述生物体采集的所述组织的碎片化物、从所述生物体采集的所述组织的酶处理物、或者由从所述生物体采集的所述组织中回收的细胞接种在所述细胞结构体的所述顶面来进行培养。
[3]所述细胞结构体可以含有选自成纤维细胞、周细胞、内皮细胞及免疫细胞中的1种以上作为构成所述间质的细胞。
[4]所述内皮细胞可以是选自血管内皮细胞及淋巴管内皮细胞中的1种以上。
[5]所述细胞结构体可以具备脉管网结构。
[6]所述细胞结构体的厚度可以为5μm以上。
[7]所述细胞结构体的厚度可以为150μm以上。
[8]从所述生物体采集的所述组织可以含有肿瘤组织。
[9]可以在将从所述生物体采集的所述组织进行碎片化之后，从所得的碎片化物中分选出癌细胞，将分选出的所述癌细胞接种在所述细胞结构体的所述顶面上来进行培养。
[10]在从所述碎片化物分选所述癌细胞时，可以利用选自流式细胞仪、磁性分离、介电泳、尺寸分级及密度梯度分级中的1种以上的手法来分选所述癌细胞。
[11]可以通过以下工序构筑所述细胞结构体：在阳离子性缓冲液中，将至少含有构成间质的细胞的细胞与强电解质高分子及细胞外基质成分混合，获得混合物的工序(a)；将通过所述工序(a)获得的所述混合物接种在细胞培养容器中的工序(b)；以及在所述工序(b)后，在所述细胞培养容器中获得至少含有构成间质的细胞的细胞多层地层叠而成的细胞结构体的工序(c)。
[12]本发明第二方式的含原代培养细胞的细胞结构体在含有构成间质的细胞、且单层的或2个以上的细胞层在厚度方向上层叠的间质细胞层的顶面上具备由从生物体采集的组织中所含的细胞形成的细胞层。
发明效果
本发明上述方式的原代培养方法由于在模拟间质的细胞结构体的顶面培养生物体组织中的细胞，因此即便是不使用以往的原代培养那样的大量的增殖因子或特殊的抑制剂、而使用培养细胞株的培养中常用的通常的培养用培养基时，也能够以高的成功率进行原代培养。
附图说明
图1为实施例1中培养了2周后的经PKH标记的癌细胞株JC004的荧光图像。
图2为实施例2中距离培养开始的第5天、第7天、第10天及第13天的经PKH标记的患者肿瘤组织来源JC-115细胞的荧光图像。
图3为实施例3中在D-MEM培养基(10％FBS)中培养2.5周后的患者肿瘤组织来源JC-121细胞的荧光图像。
图4为实施例3中在含Y-27632的StemPro培养基中培养2.5周后的患者肿瘤组织来源JC-121细胞的荧光图像。
图5为表示实施例4中将患者肿瘤组织来源JC-052-3-liv细胞接种在未构筑有细胞结构体的24孔Transwell细胞培养池内并培养了5天的样品的5天后增殖率(接种数比)的测定结果的图。
图6为表示实施例4中将患者肿瘤组织来源JC-052-3-liv细胞接种在含有间质细胞的细胞结构体的顶面上并培养了5天的样品的5天后增殖率(接种数比)的测定结果的图。
图7为表示实施例4中将患者肿瘤组织来源JC-052-3-liv细胞接种在含有间质细胞的细胞结构体的顶面上并培养了5天的样品的EpCAM阳性细胞与总细胞数的比例(细胞数比、％)的测定结果的图。
图8为表示实施例4中对于将患者肿瘤组织来源JC-052-3-liv细胞在细胞层数为10层或20层的细胞结构体中进行了培养的样品、分选回收前后的EpCAM阳性细胞与总细胞数的比例(细胞数比、％)的测定结果的图。
图9为实施例4中利用抗EpCAM抗体对直接接种于细胞培养容器的JC-052-3-liv细胞进行了荧光免疫染色的荧光图像。
图10为实施例4中利用抗EpCAM抗体对由NHDF和HUVEC形成的20层细胞结构体进行了荧光免疫染色的荧光图像。
图11为表示实施例5中以下样品的14天后增殖率(接种数比)的测定结果的比较的图：(1)将患者肿瘤组织来源JC039-2-Liv细胞接种在含有间质细胞的细胞结构体的顶面并分别使用4种培养基培养了14天的样品；(2)将患者肿瘤组织来源JC039-2-Liv细胞接种在未构筑有细胞结构体的胶原包被6孔板内并分别使用4种培养基培养了14天的样品。
图12为表示实施例5中以下样品的14天后增殖率(接种数比)的测定结果的比较的图：(1)将患者肿瘤组织来源JC047-2-Liv细胞接种在含有间质细胞的细胞结构体的顶面并分别使用4种培养基培养了14天的样品；(2)将患者肿瘤组织来源JC047-2-Liv细胞接种在未构筑有细胞结构体的胶原包被6孔板内并分别使用4种培养基培养了14天的样品。
图13为表示实施例6中改变所构成的细胞结构体的3D组织的层数时，将患者肿瘤组织(结直肠癌原发灶)来源JC406-1-TT细胞接种在含有间质细胞的细胞结构体的顶面并分别使用3种培养基培养了14天的样品的14天后增殖率(接种数比)的测定结果的图。
图14为表示实施例6中改变2种细胞结构体(不具备由NHDF形成的血管网结构的细胞结构体、或具备由NHDF和HUVEC形成的血管网结构的细胞结构体)的3D组织的层数时，将患者肿瘤组织(结直肠癌原发灶)来源JC247-2-PUL细胞接种在含有间质细胞的细胞结构体的顶面并培养了14天的样品的14天后增殖率(接种数比)的测定结果的图。
图15为表示实施例7中改变所构成的细胞结构体的血管内皮细胞的含有率时，将患者肿瘤组织(结直肠癌原发灶)来源JC406-1-TT细胞接种在含有间质细胞的细胞结构体的顶面并培养了14天的样品的14天后增殖率(接种数比)的测定结果的图。
具体实施方式
本发明一个实施方式的原代培养方法是用于在体外对从生物体采集的组织中所含的细胞进行原代培养的培养方法，其中，将生物体组织中的细胞接种于含有构成间质的细胞(间质细胞)、且单层的或2个以上的细胞层在厚度方向上层叠的细胞结构体的顶面上，进行培养。本实施方式中使用的细胞结构体是含有间质细胞、模拟了间质组织的结构体。通过将生物体组织中的细胞不在通常的培养用培养基材表面、而是在模拟了间质的细胞结构体的顶面上进行培养，即便是使用培养细胞株的培养中常用的通常的培养用培养基时，也能够以高的成功率进行原代培养。
本实施方式的原代培养方法中，在模拟了间质组织的细胞结构体的顶面上，作为培养用培养基不使用过剩的增殖因子或人工的抑制剂即可进行原代培养。其结果是，可获得在含有构成间质的细胞、且单层的或2个以上细胞层在厚度方向上层叠的间质细胞层的顶面上具备由从生物体采集的组织中所含的细胞形成的细胞层的含原代培养细胞的细胞结构体。即，通过本实施方式获得的原代培养物(含原代培养细胞的细胞结构体)是在更接近于生物体内的环境下获得的培养物。因此，通过本实施方式获得的原代培养物作为用于进行更接近生物体内的细胞水平分析的试样是非常有用的。
＜细胞结构体＞
本实施方式中使用的细胞结构体(以下有时称作“本实施方式的细胞结构体”)至少含有间质细胞，且单层的或2个以上的细胞层在厚度方向上层叠。通过立体地构筑间质细胞，可以构筑模拟了间质组织的细胞结构体。此外，本实施方式及本说明书中，“细胞结构体”是指至少含有间质细胞的平面的或立体的细胞集合体，“细胞结构体的厚度”是指该结构体的自重方向上的长度。自重方向是指重力施加的方向，也称为厚度方向。“细胞层”是指由存在于垂直于厚度方向的方向上、以细胞核在厚度方向上不重叠的方式存在的一组细胞及间质所构成的层。
构成本实施方式的细胞结构体的间质细胞等细胞并无特别限定，可以是从动物采集的细胞、也可以是对从动物采集的细胞进行了培养而得到的细胞、还可以是对从动物采集的细胞实施了各种处理而得到的细胞、还可以是培养细胞株。另外，还可以使用市售的细胞、还可以使用患者来源的细胞。在为从动物采集的细胞时，采集部位并无特别限定，可以是骨、肌肉、内脏、神经、脑、骨、皮肤、血液等来源的体细胞，还可以是生殖细胞，也可以是胚胎干细胞(ES细胞)。另外，构成本实施方式的细胞结构体的细胞所来源的生物种类并无特别限定，例如可以使用人、猴、狗、猫、兔子、猪、牛、小鼠、大鼠等动物来源的细胞。作为对从动物采集的细胞进行了培养而得到的细胞，可以是原代培养细胞、也可以是传代培养细胞。另外，作为实施了各种处理而得到的细胞，可举出诱导多能干细胞细胞(iPS细胞)或分化诱导后的细胞。另外，本实施方式的细胞结构体可以仅由同种的生物种来源的细胞构成，还可以由多种生物种来源的细胞构成。
作为构筑本实施方式的细胞结构体的间质细胞，例如可举出内皮细胞、成纤维细胞、周细胞、免疫细胞、神经细胞、肥大细胞、上皮细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、组织干细胞、平滑肌细胞等。免疫细胞是指与免疫有关的细胞。具体地说，可举出淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。淋巴细胞有T细胞、B细胞、NK细胞、浆细胞等。本实施方式的细胞结构体中所含的间质细胞可以是1种、也可以是2种以上。作为本实施方式的细胞结构体中所含的间质细胞，优选含有选自成纤维细胞、周细胞、内皮细胞及免疫细胞中的1种以上。
本实施方式的细胞结构体中的间质细胞的数量并无特别限定，由于可形成更加模拟了间质组织的细胞结构体，因此构成本实施方式的细胞结构体中的间质细胞与全部细胞的存在比(细胞数比)优选为30％以上、更优选为50％以上、进一步优选为70％以上、更进一步优选为80％以上。
认为血管网结构或淋巴管网结构对于本实施方式的细胞结构体表现出类似于生物体内的间质组织的功能是重要的。因此，本实施方式的细胞结构体优选是具备脉管网结构的细胞结构体。即，作为本实施方式的细胞结构体，优选是在未形成脉管的细胞的层叠体的内部三维地构筑淋巴管及/或血管等的脉管网结构、从而构筑了更接近生物体内的组织的细胞结构体。脉管网结构可以仅形成在细胞结构体的内部，也可以按照至少脉管网结构的一部分露出至细胞结构体的表面或底面的方式来形成。另外，脉管网结构可以在细胞结构体整体中构筑，也可以仅形成在特定的细胞层中。此外，本实施方式及本申请说明书中，“脉管网结构”是指生物体组织中的血管网或淋巴管网那样的网状的结构。
脉管网结构可以通过含有构成脉管的内皮细胞作为间质细胞来形成。作为本实施方式的细胞结构体中所含的内皮细胞，可以是血管内皮细胞、也可以是淋巴管内皮细胞。另外，本实施方式的细胞结构体中所含的内皮细胞还可以含有血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞这两者。
本实施方式的细胞结构体具备脉管网结构时，作为该细胞结构体中的内皮细胞以外的细胞，由于内皮细胞易于形成保持原本功能及形状的脉管网，因此优选是在生物体内构成脉管周边组织的细胞，为了使其更接近于生物体内的间质组织及生物体内的间质组织附近的环境，作为内皮细胞以外的细胞，更优选是至少含有成纤维细胞的细胞，进一步优选是含有血管内皮细胞和成纤维细胞的细胞、含有淋巴管内皮细胞和成纤维细胞的细胞、或含有血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞和成纤维细胞的细胞。此外，作为细胞结构体中所含的内皮细胞以外的细胞，可以是与内皮细胞同种的生物种来源的细胞，也可以是不同种生物种来源的细胞。
本实施方式的细胞结构体中的内皮细胞的数量只要是足以形成脉管网结构的数量，则无特别限定，可以考虑细胞结构体的大小、内皮细胞或内皮细胞以外的细胞的细胞种类等适当决定。例如，通过使构成本实施方式的细胞结构体中的内皮细胞与全部细胞的存在比(细胞数比)为0.1％以上，可以制备形成有脉管网结构的细胞结构体。作为内皮细胞以外的细胞使用成纤维细胞时，本实施方式的细胞结构体中的内皮细胞数优选为成纤维细胞数的0.1％以上、更优选为0.1～5.0％。作为内皮细胞含有血管内皮细胞和淋巴管内皮细胞这两者时，血管内皮细胞及淋巴管内皮细胞的总细胞数优选是成纤维细胞数的0.1％以上、更优选是0.1～5.0％。
特别是，将通过本实施方式的原代培养方法获得的原代培养物用于药物敏感性试验等细胞水平分析时，所使用的细胞结构体优选是更接近于生物体内的间质的结构体。因此，作为该细胞结构体，优选形成有脉管网结构的细胞结构体，更优选形成脉管网结构且含有成纤维细胞的细胞结构体。
另外，为了应对想要获得更多癌细胞的需求，优选具有脉管网结构。
本实施方式的细胞结构体的大小或形状并无特别限定。由于能够形成更接近于生物体内的间质组织的状态的细胞结构体、能够期待更接近于生物体内的环境下的原代培养，因此该细胞结构体的厚度优选为5μm以上、更优选为30μm以上、进一步优选为100μm以上、更进一步优选为150μm以上。作为该细胞结构体的厚度，还优选为500μm以下、更优选为400μm以下、进一步优选为200μm以下。作为本实施方式的细胞结构体的细胞层的数量，优选为1～60层左右、更优选为2～60层左右、进一步优选为5～60层左右、更进一步优选为5～20层左右。
此外，细胞结构体是2层以上的细胞层层叠而成的立体结构时，构成细胞结构体的细胞层数通过构成三维结构的细胞的总数除以每1层的细胞数(用于构成1层所需的细胞数)来测定。每1层的细胞数可以通过预先将细胞按照变得汇合的方式在构成细胞结构体时要使用的细胞培养容器中平面地进行培养来研究。具体地说，形成于某个细胞培养容器中的细胞结构体的细胞层数可以通过计测构成该细胞结构体的全部细胞数、然后除以该细胞培养容器的每1层的细胞数来算出。
一般来说，在细胞培养容器中构筑本实施方式的细胞结构体。作为该细胞培养容器，只要是能够构筑细胞结构体、且能够培养所构筑的细胞结构体的容器，则无特别限定。作为该细胞培养容器，具体地可举出盘子、细胞培养池(例如Transwell(注册商标)小室、Netwell(注册商标)小室、Falcon(注册商标)细胞培养池、Millicell(注册商标)细胞培养池等)、管、烧瓶、瓶、板等。本实施方式的细胞结构体的构筑中，由于能够将所构筑的细胞结构体直接用于原代培养，因此优选盘子或各种细胞培养池。
本实施方式的细胞结构体只要是由含有间质细胞的单层或多层的细胞层形成的结构体即可，细胞结构体的构筑方法并无特别限定。例如，可以是一层层地进行构筑、然后依次将其层叠来进行构筑的方法，还可以是一次性地构筑2层以上的细胞层的方法，还可以是适当地将两构筑方法组合来构筑多层的细胞层的方法。
另外，本实施方式的细胞结构体可以是构成各细胞层的细胞种类各层不同的多层结构体，还可以是构成各细胞层的细胞种类在结构体的全部层中相同的细胞种类。例如，可以是每个细胞种类地形成层、然后依次层叠该细胞层、从而进行构筑的方法，还可以是预先制备混合有多种细胞的细胞混合液、由该细胞混合液一次性地构筑多层结构的细胞结构体的方法。
作为一层层地进行构筑、让依次将其层叠来进行构筑的方法，例如可举出日本专利第4919464号公报所记载的方法，即通过将形成细胞层的工序和使所形成的细胞层接触于含有ECM(细胞外基质)的成分的溶液的工序交替地反复进行，从而连续地层叠细胞层的方法。例如，进行该方法时，通过预先制备混合有构成细胞结构体的全部细胞的细胞混合物，由该细胞混合物形成各细胞层，从而可以构筑在结构体整体中形成有脉管网结构的细胞结构体。另外，通过按每个细胞种类地形成各细胞层，可以构筑仅在由内皮细胞形成的层中形成有脉管网结构的细胞结构体。
作为一次性地构筑2层以上的细胞层的方法，例如可举出日本专利第5850419号公报所记载的方法。该方法是如下的方法：预先利用含有整联蛋白所键合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列的高分子和与含有所述RGD序列的高分子发生相互作用的高分子将细胞的表面整体覆盖，将被该粘接膜覆盖的被覆细胞装在细胞培养容器中之后，通过离心处理等使被覆细胞彼此聚集，从而构筑由多层细胞层形成的细胞结构体。例如，进行该方法时，使用预先制备混合有构成细胞结构体的全部细胞的细胞混合物、通过在该细胞混合物中添加粘接性成分而制备的被覆细胞。由此，通过1次的离心处理，可以构筑细胞组成在结构体整体中为均质的细胞结构体。
本实施方式的细胞结构体还可以通过具有下述工序(a)～工序(c)的工序的方法进行构筑。
工序(a)：在阳离子性缓冲液中将细胞与细胞外基质成分混合，获得混合物的工序(a)；
工序(b)：将通过所述工序(a)获得的混合物接种到细胞培养容器中的工序(b)；
工序(c)：在所述工序(b)之后，在所述细胞培养容器中获得细胞多层地层叠而成的细胞结构体的工序(c)。
工序(a)中，将细胞与含有阳离子性物质的缓冲液(阳离子性缓冲液)及细胞外基质成分混合，由该细胞混合物形成细胞集合体，从而可以获得内部少有较大空隙的立体细胞组织。另外，所得的立体细胞组织由于比较稳定，因此至少能够培养数天，且在培养基更换时组织也难以崩解。另外，本实施方式中，工序(b)中可以包含使接种于细胞培养容器内的细胞混合物在该细胞培养容器内沉降的步骤。细胞混合物的沉降可以通过离心分离等积极地使细胞沉降，也可使其自然沉降。
工序(a)中，优选将细胞进一步与强电解质高分子混合。通过将细胞与阳离子性物质、强电解质高分子及细胞外基质成分混合，在工序(b)中并不需要离心分离等使细胞积极地集合的处理，即便是使其自然沉降时，也可获得空隙少、具有厚度的立体细胞组织。
作为所述阳离子性缓冲液，例如可举出Tris-盐酸缓冲液、Tris-马来酸缓冲液、Bis-Tris-缓冲液或HEPES等。该阳离子性缓冲液中的阳离子性物质(例如Tris-盐酸缓冲液中的Tris)的浓度及pH只要是不会对细胞的生长及细胞结构体的构筑造成不良影响，则无特别限定。例如，阳离子性缓冲液中的阳离子性物质的浓度可以为10～100mM、优选为40～70mM、更优选为50mM。另外，该阳离子性缓冲液的pH可以为6.0～8.0、优选为6.8～7.8、更优选为7.2～7.6。
作为所述强电解质高分子，例如可举出肝素、硫酸软骨素(例如软骨素4-硫酸、软骨素6-硫酸)、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、透明质酸等粘多糖；硫酸葡聚糖、硫酸鼠李聚糖、岩藻多糖、卡拉胶、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、以及聚丙烯酸、或它们的衍生物等，但并非限定于这些。工序(a)中制备的混合物中可以仅混合1种强电解质高分子、还可以组合混合2种以上。本实施方式的细胞结构体的构筑中，强电解质高分子优选为粘多糖。另外，更优选使用肝素、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素及硫酸皮肤素中的至少1个。本实施方式中使用的强电解质高分子进一步优选为肝素。混合在所述阳离子性缓冲液中的强电解质高分子的量只要不会对细胞的生长及细胞结构体的构筑造成不良影响，则无特别限定。
例如阳离子性缓冲液中的强电解质高分子的浓度可以是超过0mg/mL(高于0mg/mL)且小于1.0mg/mL、优选为0.025～0.1mg/mL、更优选为0.05～0.1mg/mL。另外，本实施方式中，也可以在不混合所述强电解质高分子的情况下制备所述混合物来进行细胞结构体的构筑。
作为所述细胞外基质成分，例如可举出胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、弹性蛋白、腱生蛋白、巢蛋白、原纤蛋白、蛋白聚糖、或者它们的改性体或变异体等。蛋白聚糖可举出硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、硫酸角质素蛋白聚糖、硫酸皮肤素蛋白聚糖等。工序(a)中制备的混合物中可以仅混合1种细胞外基质成分、还可以组合混合2种以上。本实施方式的细胞结构体的构筑中，优选使用胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白，更优选使用胶原。只要是不对细胞的生长及细胞结构体的形成造成不良影响，还可以使用上述的细胞外基质成分的改性体及变异体。混合在所述阳离子性缓冲液中的细胞外基质成分的量只要是不对细胞的生长及细胞结构体的构筑造成不良影响，则无特别限定。例如阳离子性缓冲液中的细胞外基质成分的浓度可以是超过0mg/mL(高于0mg/mL)且小于1.0mg/mL、优选为0.025～0.1mg/mL、更优选为0.05～0.1mg/mL。
混合在所述阳离子性缓冲液中的强电解质高分子与细胞外基质成分的配比为1：2～2：1。本实施方式的细胞结构体的构筑中，强电解质高分子与细胞外基质成分的配比优选为1：1.5～1.5：1、更优选为1：1。
反复进行工序(a)～工序(c)，具体地说，在工序(c)中获得的细胞结构体上，接种工序(a)中制备的混合物作为工序(b)之后，再进行工序(c)，通过这样反复进行，从而可以构筑充分厚度的细胞结构体。在工序(c)中获得的细胞结构体上新接种的混合物的细胞组成可以与构成已经构筑的细胞结构体的细胞组成相同、也可以不同。
反复进行工序(a)～工序(c)时，也可以在工序(c)之后且在进行工序(b)之前，对所得的细胞结构体进行培养。培养中使用的培养用培养基的组成、培养温度、培养时间、培养时的大气组成等培养条件在适于构成该细胞结构体的细胞的培养的条件下进行。作为培养用培养基，例如可举出D-MEM、E-MEM、MEMα、RPMI-1640、Ham’s F-12等。
在工序(a)之后，也可以进行(a’-1)将液体部分从所得的混合物中除去、获得细胞集合体的工序；及(a’-2)将细胞集合体悬浮在溶液中的工序，然后进入工序(b)。通过实施上述工序(a)～工序(c)，可以获得所期望的组织体，但通过在工序(a)后实施工序(a’-1)及工序(a’-2)再实施工序(b)，可获得更为均质的组织体。
另外，还可以在工序(a)之后代替所述工序(b)而进行下述工序(b’-1)及工序(b’-2)。通过进行工序(b’-1)及工序(b’-2)，也可获得更为均质的组织体。工序(b’-2)中，与工序(b)同样，也可包含使接种在细胞培养容器内的细胞混合物在该细胞培养容器内沉降的步骤。细胞混合物的沉降可以通过离心分离等积极地使细胞沉降、也可使其自然沉降。本实施方式及本申请说明书中，“细胞粘稠体”是指非专利文献3所记载那样的凝胶样的细胞集合体。
工序(b’-1)：将工序(a)中获得的混合物接种在细胞培养容器内之后，将液体成分从混合物中除去，获得细胞粘稠体的工序；
工序(b’-2)：在细胞培养容器内将细胞粘稠体悬浮在溶剂中的工序。
作为用于制备细胞悬浮液的溶剂，只要是对细胞没有毒性、不会损害增殖性或功能的溶剂，则无特别限定，可以使用水、缓冲液、细胞的培养用培养基等。作为该缓冲液，例如可举出磷酸生理盐水(PBS)、HEPES、Hanks缓冲液等。作为培养用培养基，可举出D-MEM、E-MEM、MEMα、RPMI-1640、Ham’s F-12等。当使用细胞的培养用培养基作为用于制备细胞悬浮液的溶剂，时，在后述的工序(c)中可以在不将液体成分除去的情况下直接对细胞进行培养。
也可代替所述工序(c)而进行下述工序(c’)。
工序(c’)：在基材上形成细胞的层的工序。
工序(c)及工序(c’)中，可以将液体成分从所接种的混合物中除去。工序(c)及工序(c’)中的液体成分的除去处理的方法只要是不对细胞的生长及细胞结构体的构筑造成不良影响，则无特别限定，作为将液体成分从液体成分和固体成分的悬浮物中除去的方法，可以利用本领域技术人员公知的手法适当地进行。作为该手法，例如可举出抽吸、离心分离处理、磁性分离处理或过滤处理等。例如作为细胞培养容器使用细胞培养池时，通过将接种有混合物的细胞培养池供至10℃、400×g、1分钟的离心分离处理，由于细胞混合物发生沉降，因此可以通过抽吸将液体成分除去。
＜生物体组织所含的细胞＞
本实施方式中培养的细胞是生物体组织中含有的细胞。本实施方式的原代培养方法中，可以对生物体组织中所含的多种细胞同时地进行原代培养，也可仅将生物体组织所含细胞中的特定种类的细胞分离出来进行原代培养。
本实施方式中培养的细胞所来源的生物体组织可以是从任一种生物种类的动物中采集的组织。例如可以使用从人、猴、狗、猫、兔子、猪、牛、小鼠、大鼠等动物中采集的生物体组织。
本实施方式中培养的细胞所来源的生物体组织可以是固形的组织、也可以是液体的组织。作为固形组织，例如可举出将上皮组织、结缔组织、肌肉组织、神经组织、间质组织、粘膜组织外科地切除采集的组织。作为液体组织，例如可举出血液、淋巴液、胸腔积液、腹水、髄液、泪液、唾液、尿等体液。
这些组织例如可以在手术或内窥镜检查等中利用手术刀或激光等摘出，或者利用注射器、棉签等采集。作为人的生物体组织，例如可以使用为了临床检查所采集的组织。
本实施方式中培养的细胞可以是正常组织来源的生物体组织，也可以是如病变组织那样发生了一些功能障碍的细胞。例如通过本实施方式的原代培养方法，可以效率良好地对从癌症患者采集的肿瘤组织中所含的癌细胞进行原代培养。此外，癌细胞是指由体细胞分化、获得了无限的增殖能力的细胞。本实施方式的原代培养方法中，可以将癌细胞与从癌症患者采集的肿瘤组织中所含的癌细胞以外的细胞一起进行原代培养，也可以仅将癌细胞分离出来进行原代培养。
通过本实施方式的原代培养方法，能够以高的成功率对如从癌症患者采集的癌细胞那样从各种疾病患病者采集的疾病相关细胞进行原代培养，所得的疾病相关细胞的原代培养物特别适于细胞水平分析。另外，本实施方式的原代培养方法对于从患者采集的疾病相关细胞的培养株的构筑也是有用的。例如通过利用本实施方式的原代培养方法对患者肿瘤组织中所含的细胞进行原代培养，能够有效地建立较通常的细胞株更能反映原本的患者肿瘤的特性、例如增殖能力等的患者来源癌细胞株。
作为成为本实施方式中进行原代培养的癌细胞的来源的癌，例如可举出乳腺癌(例如浸润性乳腺导管癌、乳腺导管内原位癌、炎症性乳腺癌等)、前立腺(例如激素依赖性前列腺癌、激素非依赖性前列腺癌等)、胰腺癌(例如胰腺管癌等)、胃癌(例如乳头状腺癌、粘液腺癌、腺鳞癌等)、肺癌(例如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤等)、结肠癌(例如胃肠道间质肿瘤等)、直肠癌(例如胃肠道间质肿瘤等)、结直肠癌(例如家族性结直肠癌、遗传性非息肉病性结直肠癌、胃肠道间质肿瘤等)、小肠癌(例如非霍奇金淋巴瘤、胃肠道间质肿瘤等)、食道癌、十二指肠癌、舌癌、咽癌(例如鼻咽癌、口咽癌、喉咽癌等)、头颈癌、唾液腺癌、脑肿瘤(例如松果体星形细胞瘤、毛细胞型星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤等)、神经鞘瘤、肝癌(例如原发性肝癌、肝外胆管癌等)、肾癌(例如肾细胞癌、肾盂及输尿管移行上皮癌等)、胆囊癌、胆管癌、胰脏癌、肝癌、子宮内膜癌、宫颈癌、卵巢癌(例如上皮性卵巢癌、性腺外生殖细胞瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、低恶性卵巢癌等)、膀胱癌、尿道癌、皮肤癌(例如眼内(眼)黑色素瘤、梅克尔细胞癌等)、血管瘤、恶性淋巴瘤(例如网状细胞肉瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病等)、黑色素瘤(恶性黑色素瘤)、甲状腺癌(例如甲状腺髓样癌等)、甲状旁腺癌、鼻腔癌、副鼻腔癌、骨肿瘤(例如骨肉瘤、尤文肉瘤、子宫肉瘤、软组织肉瘤等)、转移性成神经管细胞瘤、血管纤维瘤、隆突性皮纤维肉瘤、网膜肉瘤、阴茎癌、睾丸肿瘤、小儿实体肿瘤(例如肾母细胞肿瘤、小儿肾肿瘤等)、卡波西氏肉瘤、AIDS引起的卡波西氏肉瘤、上颌窦肿瘤、纤维性组织细胞瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、慢性骨髓增生性疾病、白血病(例如急性骨髄性白血病、急性淋巴细胞性白血病等)等，但并不限定于这些。
＜原代培养＞
本实施方式的原代培养方法中，在本实施方式的细胞结构体的顶面接种生物体组织中的细胞来进行培养。具体地说，在本实施方式的细胞结构体的培养溶液中添加生物体组织中的细胞。由此，生物体组织中的细胞黏附在细胞结构体的顶面，生物体组织中的细胞以黏附在细胞结构体的顶面上的状态被培养。
作为培养中使用的培养用培养基，可以是如StemPro培养基那样的在原代培养中通常使用的培养用培养基那样含有增殖因子或ROCK抑制剂等的培养用培养基，优选是培养细胞株的培养中常用的通常的培养用培养基。
作为培养细胞株的培养中常用的通常的培养用培养基，例如可举出D-MEM、E-MEM、MEMα、RPMI-1640、Ham’s F-12等、在它们中添加了1～10容量％左右的CS(牛血清)、FBS(胎牛血清)、HBS(胎马血清)等血清的培养基。
另外，其它的培养条件可以与通常的动物细胞的培养条件同样地适当设定。例如培养温度优选约为30～40℃、最优选为37℃。另外，CO2浓度优选约为1～10容量％、最优选约为5容量％。另外，还可以在将O2浓度控制在低于大气的浓度的环境下进行培养。
生物体组织为固形组织时，优选按照内部细胞效率良好地黏附在细胞结构体的顶面地能够开始培养的方式预先进行碎片化。生物体组织的碎片化中优选使用利用了剪刀、刀、手术刀、镊子等的机械手法，但并不限定于这些。为了能够效率更好地将内部的细胞取出，生物体组织优选碎片化至例如约5mm以下。
经碎片化的生物体组织可以直接用于原代培养，但也优选进行酶处理。通过酶处理，存在于碎片化物的内部的细胞易于自表面露出，因此当将该酶处理物添加至细胞结构体的培养用培养基中时、易于黏附在顶面上。酶处理可以在生物体组织为液体组织时进行。例如，当如粘性较高时那样仅将生物体组织添加至细胞结构体的培养用培养基中时，该生物体组织所含的细胞也有难以黏附在细胞结构体的顶面的情况。优选对这种生物体组织预先进行酶处理。
对生物体组织或其碎片化物进行的酶处理中使用的酶并无特别限定，优选使用将蛋白质、糖、脂质、核酸等分解的酶。生物体组织的碎片化物的酶处理中使用的酶可以是1种、也可以是2种以上。本实施方式中，优选使用选自胰蛋白酶、胶原蛋白酶、分散酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶及透明质酸酶中的1种以上的酶，更优选使用胶原蛋白酶或含有胶原蛋白酶的2种以上的酶，进一步优选将胶原蛋白酶及分散酶根据需要与其它酶一起使用。此外，所使用的酶只要是具有目标酶活性的酶，则无特别限定，可以是任何一种生物种类来源的酶，也可以是对天然存在的酶进行了改性而得到的人工酶。另外，可以是从各种细胞中抽提、精制而成的酶，也可以是化学合成的酶。
在生物体组织的碎片化处理或酶处理中，为了防止因从碎片化处理中或酶处理中溶解的细胞中释放的DNA的影响而细胞凝集成块状，也可并用DNase I。作为所使用的DNaseI，只要是具有DNase I活性的酶，则无特别限定。作为含有蛋白质等生物体成分的分解酶和DNase I的市售的酶混合物，可举出Liberase Blendzyme 1(注册商标)(Roche-diagnostics公司制)或Tumor Dissociation Kit(Miltenyi Biotec公司制)。
酶处理的处理温度只要是所使用的酶能够发挥酶活性的条件即可，由于可抑制对生物体组织的碎片物中的细胞的影响，优选为30～40℃、更优选为37℃。另外，酶处理的处理时间并无特别限定，例如可以为10～90分钟，优选为30～60分钟。
生物体组织的酶处理物在接种于本实施方式的细胞结构体的顶面之前，优选预先计测细胞数、特别优选预先计测活细胞的细胞数。细胞数的计测、活细胞数的计测可以利用常规方法进行。例如，活细胞数的计测可举出使用台盼蓝的染色法等。
生物体组织的碎片化物可以在酶处理之前使用缓冲液或培养用培养基进行洗涤。作为洗涤中使用的缓冲液，可以使用磷酸缓冲液、乙酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、硼酸缓冲液、酒石酸缓冲液、Tris缓冲液、PBS等。另外，也可以在洗涤中使用的缓冲液或培养用培养基中添加抗生素。特别优选利用含有青霉素G(200U/mL)、链霉素硫酸(200μg/mL)及两性霉素B(0.5μg/mL)的PBS进行组织的洗涤。洗涤的次数可以根据所采集的生物体组织的来源来适当地决定，优选3～8次。另外，使用了缓冲液或培养用培养基的洗涤可以仅在酶处理之后进行，也可以在酶处理的前后进行。
在细胞结构体的顶面仅培养生物体组织中的特定细胞时，在从生物体组织或生物体组织的酶处理物中仅将目标细胞种类的细胞分选后，将该分选出的细胞添加到细胞结构体的培养用培养基中。例如从肿瘤组织的酶处理物中将癌细胞分选后，仅将癌细胞添加到细胞结构体的培养用培养基中。从生物体组织或生物体组织的酶处理物中分选特定细胞的方法并无特别限定，可以从通常的在细胞的分选中使用的各种方法中适当选择使用。例如可以利用选自流式细胞仪、磁性分离、介电泳、尺寸分级及密度梯度分级中的1种以上的手法来分选特定的细胞。
从癌症患者来源的生物体组织或生物体组织的酶处理物中仅将癌细胞分选出后在细胞结构体的顶面上培养所分选出的癌细胞时，还可以在癌细胞的分选之前确认生物体组织或生物体组织的酶处理物中所含的癌细胞量。将癌细胞特异性蛋白质的表达或酶活性的提高作为癌标记物，可以对癌细胞进行分选。作为癌标记物并无特别限定，例如在将EpCAM或CEA、Cytokeratin、HER2等癌细胞中特异性表达的蛋白质作为癌标记物时，通过利用了针对它们的抗体的免疫组织化学(IHC)染色或免疫荧光(IF)染色，能够对癌细胞进行可视化。另外，当以癌细胞中提高的γ-谷氨酰转肽酶或β-半乳糖苷酶的酶活性作为癌标记物时，可以利用ProteoGREEN(注册商标、五稜化药)或GlycoGREEN(注册商标、五稜化药)等荧光探针测定它们的酶活性。
癌细胞的分选可以通过流式细胞仪、磁性分离、介电泳、尺寸分级、密度梯度分级等手法进行，该分选手法可以根据原本患者肿瘤的来源脏器或临床背景、提前实行的各种检查结果等适当决定。使用流式细胞仪时，通过使用IF或荧光探针进行染色后、对染色处理阳性的细胞进行分取，从而可进行癌细胞的分选。另外，流式细胞仪中，由于还可以由前散射光及侧散射光的值来判定活细胞和死细胞，因此能够更有效地将活着的癌细胞分选并回收。另外，使用磁性分离时，可以选择以下的任意方式：使用抗体对细胞进行磁标记，利用磁性将所标记的癌细胞回收的细胞正选方式；利用磁性将所标记的间质细胞除去的细胞负选方式。另外，使用介电泳及/或密度梯度分级时，优选预先把握在间质细胞的构筑中使用过的细胞种类的介电特性及/或密度梯度特性。
另外，在细胞结构体的顶面进行培养之前，生物体组织中的细胞还可以预先利用荧光物质等进行标记。可以将生物体组织中的全部细胞进行标记，也可以仅将要进行原代培养的目标特定细胞进行标记。细胞的标记方法并无特别限定，可以从该领域中公知的各种标记方法中适当选择进行使用。例如对生物体组织中的癌细胞进行原代培养时，生物体组织中的癌细胞的标记可优选地利用CellTracker(注册商标、Thermo Fisher Scientific公司)或PKH Cell Linker试剂盒(Sigma-Aldrich公司)进行的荧光标记等。癌细胞的标记可以对生物体组织自身进行，也可对生物体组织的细碎物或生物体组织的细碎物的酶处理物进行。另外，从生物体组织或其酶处理物中分选癌细胞时，还可对选拔处理后的癌细胞进行标记。
实施例
以下使用实施例具体地说明本发明的上述实施方式，但本发明不受这些实施例的任何限定，在不脱离本发明主旨的范围内，该领域中具有通常知识的人员可进行多种变形。
以下的实施例中，如果无特别说明，则作为胶原使用胶原I。
[实施例1]
在含有间质细胞的细胞结构体的顶面对由从癌症患者采集的肿瘤细胞所建立的细胞株进行培养，并对用通常培养用培养基和原代培养用培养基进行培养的情况进行比较。
＜癌细胞株＞
癌细胞株使用结直肠癌患者来源细胞株(由公益财团法人癌症研究会通过手术检体建立)JC-004。该患者来源癌细胞株如下构筑。
首先，对从癌症患者采集的肿瘤组织机械地进行碎片化之后，使用胶原蛋白酶/分散酶(Roche-diagnostics公司制)及Dnase I(Thermo Fisher Scientific公司制)对碎片化物进行处理。接着，在添加有作为ROCK抑制剂的Y-27632的干细胞用无血清培养用培养基StemPro培养基(注册商标、Thermo Fisher Scientific公司制)中对所得的酶处理物进行培养，从而建立得到。建立后的癌细胞株使用该培养用培养基进行培养直至用于本实验。
＜细胞结构体的构筑＞
使用人新生儿来源皮肤成纤维细胞(Normal Human Dermal Fibroblasts：NHDF)(Lonza公司制、产品编号：CC-2509)、人脐带静脉内皮细胞(Human Umbilical VeinEndothelial Cell：HUVEC)(Lonza公司制、产品编号：CC-2517A)这2种细胞来构筑含有血管网结构的细胞结构体。作为细胞培养容器，使用Transwell细胞培养池(Corning公司制、产品编号：#3470)，作为培养用培养基，使用含有10容量％FBS(Corning公司制、产品编号：#35-010-CV)及1容量％青霉素/链霉素(和光纯药公司制、产品编号：168-23191)的D-MEM(和光纯药公司制、产品编号：043-30085)。
首先，将NHDF和HUVEC悬浮在含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.05mg/mL肝素、0.05mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中，制备细胞悬浮液(工序(a))。将该细胞悬浮液在室温下以1200rpm离心处理3分钟，将上清除去后，利用适量的培养用培养基进行再悬浮(工序(a’-1)、工序(a’-2))。接着，按照细胞层数达到20层的方式，将该细胞悬浮液接种在Transwell细胞培养池内之后(工序(b))，将该Transwell细胞培养池在室温下以400×g离心分离1分钟。之后，在该Transwell细胞培养池中追加适量的培养用培养基后，在CO2孵育箱(37℃、5％CO2)中培养24小时(工序(c))。由此，构筑了由20层的细胞层形成且形成有脉管网结构的细胞结构体。
此外，本实施例中，按照NHDF达到2×106个/孔、HUVEC相对于NHDF总数达到1.5％的方式来制作细胞结构体。
＜癌细胞的接种＞
首先，使用PKH67 Cell Linker试剂盒对患者来源细胞株JC-004进行荧光标记。之后，用适量的D-MEM培养基(10％FBS)或含有Y-27632的StemPro培养基悬浮PKH26标记JC-004，接种于构筑在24孔Transwell细胞培养池内的细胞结构体的顶面上。之后，一边适宜地进行培养基更换，一边培养2周。作为对照，在未构筑有细胞结构体的24孔Transwell细胞培养池内接种用适量的D-MEM培养基(10％FBS)或含有Y-27632的StemPro培养基悬浮的PKH26标记JC-004并进行培养。
＜形态评价＞
使用荧光显微镜观察培养后的癌细胞，确认到生长。将各癌细胞的荧光图像示于图1。
图1中，“没有间质”是直接接种在培养池上进行培养的样品。
另外，图1中，“3D组织上”是接种在细胞结构体的顶面上进行培养的样品。
另外，“DMEM”是用D-MEM培养基(10％FBS)培养的样品、“ES培养基”是用含有Y-27632的StemPro培养基培养的样品。
结果为，直接接种在培养池上进行培养的样品中，虽然在含Y-27632的StemPro培养基中没有问题地生长了，但为D-MEM培养基(10％FBS)时，细胞基本没有残留在培养池上。另一方面，接种在含有间质细胞的细胞结构体的顶面进行培养的样品中，虽然根据培养基不同而可见形态上的差异，但确认到任何培养基中癌细胞均生长了。
[实施例2]
利用通常培养用培养基在含有间质细胞的细胞结构体的顶面对利用手术摘出的患者肿瘤组织中的癌细胞进行培养。培养用培养基使用含有10％FBS的D-MEM培养基。
＜患者肿瘤组织中的癌细胞＞
患者肿瘤组织中的癌细胞如下制备。首先，将公益财团法人癌症研究会从结直肠癌患者摘出的肿瘤组织(JC-115)机械地碎片化之后，与实施例1同样地使用胶原蛋白酶/分散酶及Dnase I进行酶处理后，为了防止污染，充分地进行洗涤。接着，使用PKH 67CellLinker试剂盒对所得酶处理物中的癌细胞(患者肿瘤组织来源JC-115细胞)进行荧光标记。
＜细胞结构体的构筑＞
分别在培养基材上(细胞培养容器内)构筑由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的细胞结构体；仅由NHDF形成且没有血管网结构的细胞结构体；以及仅由1层的HUVEC形成的细胞结构体(二维培养物)。细胞培养容器、NHDF、HUVEC及它们的培养用培养基使用与实施例1同种的物质。
由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的20层的细胞结构体与实施例1中构筑的细胞结构体同样地构筑。
仅由NHDF形成的20层的细胞结构体除了将NHDF悬浮在含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.05mg/mL肝素、0.05mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中来进行细胞悬浮液的制备之外，与实施例1中构筑的细胞结构体同样地构筑。
仅由1层HUVEC形成的细胞结构体通过按照细胞层数达到1层的方式将悬浮在含有肝素和胶原的Tris-盐酸缓冲液(0.05mg/mL肝素、0.05mg/mL胶原、50mM Tris、pH为7.4)中的HUVEC直接接种在24孔Transwell细胞培养池内进行培养，从而构筑。
＜癌细胞的接种＞
使用适量的D-MEM培养基(10％FBS)悬浮经荧光标记的患者肿瘤组织来源JC-115细胞，接种于构筑在24孔Transwell细胞培养池内的细胞结构体的顶面。之后，一边适宜地进行培养基更换、一边培养2周。作为对照，在未构筑有细胞结构体的24孔Transwell细胞培养池内接种用适量的D-MEM培养基(10％FBS)悬浮的荧光标记JC-115细胞并进行培养。
＜形态评价＞
使用荧光显微镜在距离开始培养的第5、7、10及13天对培养后的癌细胞进行观察，确认到生长。将经时地观察同一样品中的癌细胞的荧光图像示于图2。
图2中，“没有间质”是直接接种在培养池上进行培养的样品。
图2中，“仅H1层”是在仅由1层HUVEC形成的细胞结构体的顶面上培养的样品。
图2中，“仅N 20层(无血管)”是指在仅由NHDF形成的20层细胞结构体的顶面上培养的样品。
图2中，“N+H 20层(有血管)”是在由NHDF和HUVEC形成的20层细胞结构体的顶面上培养的样品。
经时地观察同一样品的结果表明，没有间质的样品中，虽然接种后的一定期间可确认荧光标记细胞，但逐渐减少。
另外，接种在二维培养HUVEC上的样品(图2中的“仅H1层”的样品)中，随着培养期间延长，荧光标记细胞减少至与没有间质的同等程度，但在培养5天的时间点，确认到比没有间质的情况更多的荧光标记细胞。即，二维培养HUVEC可以说虽然缺乏促进原代培养癌细胞的增殖的效果，但还是具有辅助培养初期的细胞黏附的效果。
接种于含有NHDF的20层细胞结构体的顶面的样品中，构筑有血管网结构的细胞结构体(图2中的“N+H 20层(有血管)”的样品)和未构筑有血管网结构的细胞结构体(图2中的“仅N 20层(无血管)”的样品)这两者在培养5天的时间点，均确认到了比没有间质的情况更多的荧光标记细胞。
进而，在构筑有血管网结构的细胞结构体与未构筑有血管网结构的细胞结构体之间，在自培养5天至2周的期间，未见荧光标记细胞的显著增减。
即教示了，通过在含有间质细胞的立体细胞结构体的顶面上进行培养，对原代培养癌细胞的生长产生了正面的影响，并且可获得辅助培养初期的细胞黏附的效果和促进原代培养癌细胞的增殖的效果这两者效果。
[实施例3]
在含有间质细胞的细胞结构体的顶面对利用手术摘出的患者肿瘤组织中的癌细胞进行培养。培养用培养基使用含有10％FBS的D-MEM培养基或含有Y-27632的StemPro培养基。
＜患者肿瘤组织中的癌细胞＞
患者肿瘤组织中的癌细胞如下制备。首先，对公益财团法人癌症研究会从结直肠癌患者摘出的肿瘤组织(JC-121)机械地进行碎片化之后，与实施例1同样地使用胶原蛋白酶/分散酶及Dnase I进行酶处理之后，为了防止污染，充分地进行洗涤。
＜细胞结构体的构筑＞
与实施例1中构筑的细胞结构体同样地构筑由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的20层的细胞结构体。
＜癌细胞的接种＞
使用适量的D-MEM培养基(10％FBS)或含有Y-27632的StemPro培养基悬浮患者肿瘤组织来源的JC-121细胞，接种于构筑在24孔Transwell细胞培养池内的细胞结构体的顶面。之后，使用D-MEM培养基(10％FBS)或含有Y-27632的StemPro培养基一边适宜地进行培养基更换，一边培养2.5周。
＜形态评价＞
从培养后的细胞结构体中除去培养基之后，使用PBS进行洗涤，使用10％中性缓冲福尔马林进行固定。之后，利用结直肠癌的标记物将样品中的癌细胞可视化来进行评价。具体地说，使用抗非磷酸化(活化)β-连环蛋白抗体、抗CD31抗体进行免疫荧光染色，进而利用DAPI进行核染色。非磷酸化β-连环蛋白是特异性地在癌细胞中蓄积的蛋白质，CD31是血管内皮细胞的特异性地表达的蛋白质。使用荧光显微镜观察染色后的细胞结构体。
图3表示在D-MEM培养基(10％FBS)中培养的细胞结构体的染色图像。
另外，图4表示在含有Y-27632的StemPro培养基中培养的细胞结构体的染色图像。
如图3及图4所示，任何一种培养用培养基中培养的细胞结构体中均可见在正常细胞中未见的非磷酸化β-连环蛋白的蓄积，由此确认到癌细胞的确存在。即确认到，患者肿瘤组织来源的细胞中，不仅成纤维细胞增殖、癌细胞也增殖了。
[实施例4]
将利用手术摘出的患者肿瘤组织中的癌细胞与其它细胞一起或者仅将癌细胞分选回收后，在细胞层数不同的多个细胞结构体的顶面分别进行培养。培养用培养基使用含有10％FBS的D-MEM培养基。
＜患者肿瘤组织中的癌细胞＞
患者肿瘤组织中的癌细胞如下制备。首先，对公益财团法人癌症研究会从肝癌(自结直肠癌的转移灶)患者中摘出的肿瘤组织(JC-052-3-liv)机械地进行碎片化之后，与实施例1同样地使用胶原蛋白酶/分散酶及Dnase I进行酶处理后，为了防止污染，充分地洗涤。
＜细胞结构体的构筑＞
与实施例1中构筑的细胞结构体同样地构筑由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的20层的细胞结构体。另外，除了使细胞层数为1、5或10层之外，同样地构筑由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的细胞结构体。
另外，与实施例2中构筑的细胞结构体同样地构筑由NHDF形成且没有血管网结构的20层的细胞结构体。另外，除了使细胞层数为1、5或10层之外，同样地构筑由NHDF形成且没有血管网结构的细胞结构体。
＜癌细胞的接种＞
使用适量的D-MEM培养基(10％FBS)将患者肿瘤组织来源的JC-052-3-liv细胞悬浮，接种于在24孔Transwell细胞培养池内构筑的细胞结构体的顶面。之后，使用D-MEM培养基(10％FBS)一边适宜地进行培养基更换，一边培养5天。
作为对照，在未构筑有细胞结构体的24孔Transwell细胞培养池内接种用适量的D-MEM培养基(10％FBS)或含有Y-27632的StemPro培养基悬浮的JC-052-3-liv细胞并进行培养。
＜酶处理及EpCAM阳性细胞的计测＞
从培养后的细胞结构体中将培养基除去后，使用PBS进行洗涤，使用TumorDissociation Kit(Miltenyi Biotec公司制)附带的酶进行处理，使构成该细胞结构体的细胞分散。之后，利用抗EpCAM抗体将酶处理物供至免疫荧光染色，使用荧光滤光器附带的自动细胞计数器计测EpCAM阳性细胞的比例。
对于各细胞结构体，将以培养开始前的(接种于细胞结构体的顶面的)JC-052-3-liv细胞数设为1时的培养后的相对细胞数作为JC-052-3-liv细胞的增殖率求出。
图5表示接种于未构筑有细胞结构体的24孔Transwell细胞培养池内的样品的计算结果。
图6表示接种于细胞结构体顶面的样品的计算结果。
图5中，“DMEM”是在D-MEM培养基(10％FBS)中培养的样品。
图5中，“ES”是在含有Y-27632的StemPro培养基中培养的样品。
另外，图6中，“有血管”表示具备血管网结构的细胞结构体的结果。
图6中，“没有血管”表示没有血管网结构的细胞结构体的结果。
进而，对于接种于细胞结构体的顶面的样品，将相对于总细胞数的EpCAM阳性细胞(用抗EpCAM抗体进行了染色的细胞)的比例(％)示于图7。
如图5所示，直接接种于细胞培养容器内时，JC-052-3-liv细胞虽然在含有Y-27632的StemPro培养基中有增殖，但在D-MEM培养基(10％FBS)中未能增殖。与此相对，如图6所示，在D-MEM培养基(10％FBS)中在细胞结构体的顶面进行培养时，在具备血管网结构的细胞结构体中，用5层以上的细胞结构体进行培养时，5天后的增殖率为1以上，可见接种的细胞的增殖。在没有血管网结构的细胞结构体中，用20层的细胞结构体进行培养时，5天后的增殖率为1以上，可见接种的细胞的增殖。
如图7所示，在细胞结构体的顶面进行培养的样品无论细胞层数如何，均可见EpCAM阳性细胞。由此结果确认了，通过在含有间质细胞的细胞结构体的顶面进行培养，在D-MEM培养基(10％FBS)中，原代培养癌细胞生长了。
＜磁性分离处理后的EpCAM阳性细胞的计测＞
进而，使用Tumor Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec公司制)，对该酶处理物中的NHDF及HUVEC进行磁标记后，利用细胞负选将经过磁标记的细胞除去，将NHDF和HUVEC以外的细胞分选回收。之后，使用上述自动细胞计数器，计测被分选回收的细胞中的EpCAM阳性细胞的比例。对于用细胞层数为10层及20层的细胞结构体进行培养的样品，将相对于分选回收后的全部细胞数的EpCAM阳性细胞数的比例(％)的计测结果示于图8。
为了比较，还同时示出分选回收前的结果。结果是，在分选回收的前后，EpCAM阳性细胞的比例上升。由此结果示出，能够实现将原代培养癌细胞富集地回收。
＜患者肿瘤组织来源JC-052-3-liv细胞的利用抗EpCAM抗体进行的染色＞
对于接种于未构筑有细胞结构体的24孔Transwell细胞培养池内、并在D-MEM培养基(10％FBS)中培养了5天的JC-052-3-liv细胞，与上述同样地利用抗EpCAM抗体进行荧光免疫染色。将染色结果示于图9。结果可知，由于确认到EpCAM阳性细胞，因此作为患者肿瘤组织来源癌细胞的JC-052-3-liv细胞是EpCAM阳性细胞。
＜NHDF及HUVEC的利用抗EpCAM抗体进行的染色＞
对于由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的20层的细胞结构体，与上述同样地利用抗EpCAM抗体进行荧光免疫染色。将染色结果示于图10中。结果确认了，NHDF和HUVEC未被抗EpCAM抗体染色。
[实施例5]
使用自结直肠癌的转移灶(肝癌)来源的患者肿瘤组织来源细胞(PDC)，探讨在使用DMEM以外的各种“通常的培养基”时是否也能够实现原代培养癌细胞的生长。
将自结直肠癌的转移灶(肝癌)来源的患者肿瘤组织来源细胞与其它细胞一起或者仅将癌细胞分选回收后，在细胞层数为20层的细胞结构体的顶面上进行培养。
＜患者肿瘤组织中的癌细胞＞
患者肿瘤组织来源细胞(PDC)如下制备。
首先，将公益财团法人癌症研究会从肝癌(自结直肠癌的转移灶)患者摘出的肿瘤组织(JC039-2-Liv)机械地碎片化后，与实施例1同样地使用胶原蛋白酶/分散酶及Dnase I进行酶处理后，为了防止污染，充分地洗涤。
同样地，将公益财团法人癌症研究会从肝癌(自结直肠癌的转移灶)患者摘出的肿瘤组织(JC047-2-Liv)机械地碎片化后，与实施例1同样地使用胶原蛋白酶/分散酶及DnaseI进行酶处理后，为了防止污染，充分地洗涤。
＜细胞结构体的构筑＞
与实施例1中构筑的细胞结构体同样地构筑由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的20层的细胞结构体(NHDF：2×106个/孔、HUVEC：相对于NHDF总数为1.5％)。
＜癌细胞的接种＞
使用适量的D-MEM培养基(10％FBS)将患者肿瘤组织来源JC039-2-Liv细胞悬浮，接种于在24孔Transwell细胞培养池内构筑的细胞结构体的顶面上。之后，使用D-MEM培养基(10％FBS)一边适宜地进行培养基更换，一边培养14天。
代替D-MEM培养基，分别使用以下的3个培养基，将患者肿瘤组织来源JC039-2-Liv细胞培养14天。
此外，代替D-MEM培养基，使用以下3个培养基中的任一个培养基，除此之外与使用上述D-MEM培养基时同样地将患者肿瘤组织来源JC039-2-Liv细胞进行培养。
·RPMI-1640培养基(是作为能够广泛用于哺乳类细胞的高营养培养基被使用的培养基。)
·McCoy’s5A培养基(是开发用于淋巴细胞的培养、癌细胞株也可良好使用的培养基。)
·ES培养基(本实施例中，使用含有Y-27632的StemPro培养基。是可良好用于癌症临床检体的原代培养、用于患者来源细胞株的建立和維持的培养基。)
此外，接种于细胞结构体的患者肿瘤组织来源的细胞数为1×104个/孔。
与上述患者肿瘤组织来源JC039-2-Liv细胞时同样地将患者肿瘤组织来源JC047-2-Liv细胞接种于细胞结构体的顶面，使用D-MEM培养基(10％FBS)、RPMI-1640培养基、McCoy’s5A培养基、ES培养基这4种培养基分别培养14天。
此外，接种于细胞结构体的患者肿瘤组织来源的细胞数为1×104个/孔。
作为对照，使用适量的上述4个培养基(D-MEM培养基、RPMI-1640培养基、McCoy’s5A培养基或ES培养基)分别将患者肿瘤组织来源细胞(JC039-2-Liv细胞或JC047-2-Liv细胞)接种在未构筑有细胞结构体的胶原包被的6孔板中，进行培养。
此外，接种于胶原包被的6孔板的患者肿瘤组织来源细胞的细胞数为1×105个/孔。
＜酶处理及EpCAM阳性细胞的计测＞
利用与实施例4相同的手法，从培养后的细胞结构体或者未构筑有细胞结构体的胶原包被的6孔板中将培养基除去后，使用PBS进行洗涤，使用Tumor Dissociation Kit(Miltenyi Biotec公司制)附带的酶进行处理，使构成该细胞结构体的细胞分散。之后，利用抗EpCAM抗体将酶处理物供至免疫荧光染色，使用荧光滤波器附带的自动细胞计数器，计测EpCAM阳性细胞的比例。
对于各细胞结构体，将以培养开始前的(接种于细胞结构体的顶面的)细胞数(JC039-2-Liv的细胞数或JC047-2-Liv的细胞数)设为1时的培养后的相对细胞数作为细胞(JC039-2-Liv细胞或JC047-2-Liv细胞)的增殖率求出。
图11表示在含有间质细胞的细胞结构体的顶面上接种患者肿瘤组织来源JC039-2-Liv细胞、并使用上述4种培养基分别培养了14天的样品(图11中示为3D、是使用具有三维结构的细胞结构体的例子)的增殖率的计算结果。
另外，作为对照，图11示出了在未构筑有细胞结构体的胶原包被的6孔板内接种患者肿瘤组织来源JC039-2-Liv细胞、并使用上述4种培养基分别培养了14天的样品(图11中示为2D、与没有间质相对应)的增殖率的计算结果。
换而言之，图11是表示实施例5中(1)将患者肿瘤组织来源JC039-2-Liv细胞接种于含有间质细胞的细胞结构体的顶面、并分别使用4种培养基培养了14天的样品与(2)将患者肿瘤组织来源JC039-2-Liv细胞接种于未构筑有细胞结构体的胶原包被的6孔板内、并分别使用4种培养基培养了14天的样品的14天后增殖率(接种数比)的测定结果的比较的图。
图12表示在含有间质细胞的细胞结构体的顶面接种患者肿瘤组织来源JC047-2-Liv细胞、并使用上述4种培养基分别培养了14天的样品(图12中示为3D、是使用了具有三维结构的细胞结构体的例子)的增殖率的计算结果。
另外，作为对照，图12示出了在未构筑有细胞结构体的胶原包被的6孔板内接种患者肿瘤组织来源JC047-2-Liv细胞、并使用上述4种培养基分别培养了14天的样品(图12中示为2D、与没有间质相对应)的增殖率的计算结果。
即，图12是表示实施例5中(1)将患者肿瘤组织来源JC047-2-Liv细胞接种于含有间质细胞的细胞结构体的顶面、并分别使用4种培养基培养了14天的样品与(2)将患者肿瘤组织来源JC047-2-Liv细胞接种于未构筑有细胞结构体的胶原包被的6孔板内、并分别使用4种培养基培养了14天的样品的14天后增殖率(接种数比)的测定结果的比较的图。
如图11及图12所示，在使用2种患者肿瘤组织来源细胞(JC039-2-Liv细胞、JC047-2-Liv细胞)中的任一种时，在使用具有三维结构的细胞结构体时(图11、图12中的3D)，无论是4种中的哪一种培养基，增殖率均超过了1.0。
即，使用具有三维结构的细胞结构体培养癌细胞时，即便是使用D-MEM培养基以外的通常的培养基时，也确认到了癌细胞的增殖。
另一方面，未构筑有细胞结构体的2D(“没有间质”时)时，在使用ES培养基以外的培养基时，回收细胞数比接种的细胞数少，确认到具有患者肿瘤组织来源的癌细胞在通常的培养基中不增殖的倾向。
由本实施例确认了，在使用上述实施方式的细胞结构体时，患者肿瘤组织来源的癌细胞在使用D-MEM培养基以外的“通常的培养基”时也会生长。
换而言之，由本实施例显示出了以下的可能性：在使用上述实施方式的细胞结构体时，无论哪种培养基，均可培养原代培养癌细胞。
[实施例6]
接着，使用原代培养的肿瘤细胞，探讨细胞结构体的3D组织的厚度或血管网的有无与增殖率的关系、癌种类所导致的影响。
＜患者肿瘤组织中的癌细胞＞
患者肿瘤组织中的癌细胞如下制备。
·结直肠癌原发灶来源的癌细胞的试样制备
首先，将公益财团法人癌症研究会从结直肠癌患者摘出的肿瘤组织(结直肠癌原发灶、JC406-1-TT)机械地碎片化之后，与实施例1同样地使用胶原蛋白酶/分散酶及DnaseI进行酶处理后，获得利用孔径为100μm的过滤器进行分级后得到的通过级分，为了防止污染，充分地进行洗涤。
·肺癌来源癌细胞的试样制备
另外，将公益财团法人癌症研究会从肺癌(自结直肠癌的转移灶)患者摘出的肿瘤组织(结直肠癌肺转移灶、JC247-2-PUL)机械地碎片化之后，与实施例1同样地使用胶原蛋白酶/分散酶及Dnase I进行酶处理后，获得利用孔径为100μm的过滤器进行分级后得到的通过级分，为了防止污染，充分地进行洗涤。
＜细胞结构体的构筑＞
·具备血管网结构的细胞结构体
与实施例1构筑的细胞结构体同样地构筑由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的20层的细胞结构体。另外，除了使细胞层数达到1、5、或10层以外，同样地构筑地由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的细胞结构体。
·没有血管网结构的细胞结构体
另外，与实施例2构筑的细胞结构体同样地构筑由NHDF形成且没有血管网结构的20层的细胞结构体。另外，除了使细胞层数达到1、5、或10层以外，同样地构筑地由NHDF形成且没有血管网结构的细胞结构体。
＜癌细胞的接种＞
·结直肠癌患者肿瘤组织来源JC406-1-TT细胞的接种
使用适量的D-MEM培养基(10％FBS)将通过上述分级获得的结直肠癌患者肿瘤组织来源JC406-1-TT细胞悬浮，接种于在24孔Transwell细胞培养池内构筑的20层的细胞结构体(由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的细胞结构体)的顶面上。之后，使用D-MEM培养基(10％FBS)一边适宜地进行培养基更换，一边培养14天。
另外，利用相同的方法，代替D-MEM培养基而使用RPMI-1640培养基对结直肠癌患者肿瘤组织来源JC406-1-TT细胞分别培养14天。
进而，利用相同的方法，代替D-MEM培养基而使用McCoy’s5A培养基对结直肠癌患者肿瘤组织来源JC406-1-TT细胞分别培养14天。
同样地，在层数为1层、5层、10层的细胞结构体的任一情况下，都分别使用3种培养基进行JC406-1-TT细胞的培养。
·肺癌患者肿瘤组织来源JC247-2-PUL细胞的接种
另外，使用适量的D-MEM培养基(10％FBS)将通过上述分级获得的肺癌患者肿瘤组织来源JC247-2-PUL细胞悬浮，接种于在24孔Transwell细胞培养池内构筑的20层的细胞结构体(由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的细胞结构体)的顶面上。之后，使用D-MEM培养基(10％FBS)一边适宜地进行培养基更换，一边培养14天。
同样地，在层数为1层、5层、10层的细胞结构体(由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的细胞结构体)的任一情况下，都使用D-MEM培养基(10％FBS)一边适宜地进行培养基更换，一边对肺癌患者肿瘤组织来源JC247-2-PUL细胞培养14天。
另外，对于由NHDF形成且没有血管网结构的细胞结构体(1层、5层、10层、20层)也同样地使用D-MEM培养基(10％FBS)一边适宜地进行培养基更换，一边对肺癌患者肿瘤组织来源JC247-2-PUL细胞培养14天。
＜酶处理及EpCAM阳性细胞的计测＞
利用与实施例4、实施例5同样的手法，从培养后的细胞结构体中将培养基除去后，使用PBS进行洗涤，使用Tumor Dissociation Kit(Miltenyi Biotec公司制)附带的酶进行处理，使构成该细胞结构体的细胞分散。之后，利用抗EpCAM抗体将酶处理物供至免疫荧光染色，使用荧光滤波器附带的自动细胞计数器计测EpCAM阳性细胞的比例。
对于各细胞结构体，将以培养开始前的(接种于细胞结构体的顶面)细胞数(JC406-1-TT的细胞数或JC247-2-PUL的细胞数)设为1时的培养后的相对细胞数作为细胞(JC406-1-TT细胞或JC247-2-PUL细胞)的增殖率求出。
图13表示分别使用3种培养基(D-MEM培养基、RPMI-1640培养基、McCoy’s5A培养基)时、相对于由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的细胞结构体的层数(3D组织的层数)的变化、JC406-1-TT细胞的2周后增殖率(％)的变化。
换而言之，图13是表示实施例6中在改变所构成的细胞结构体的3D组织的层数时、将患者肿瘤组织(结直肠癌原发灶)来源的JC406-1-TT细胞接种于含有间质细胞的细胞结构体的顶面、并分别使用3种培养基培养了14天的样品的14天后增殖率(接种数比)的测定结果的图。
另外，图14是表示实施例6中在改变2种细胞结构体(由NHDF形成且没有血管网结构的细胞结构体，或者由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的细胞结构体)的3D组织的层数时、将患者肿瘤组织(结直肠癌肺转移灶)来源的JC247-2-PUL细胞接种于含有间质细胞的细胞结构体的顶面并培养了14天的样品的14天后增殖率(接种数比)的测定结果的图。
如此，在使用原代培养的肿瘤细胞确认细胞结构体中的3D组织的厚度或血管网的有无与增殖率的关系时，如图13所示，具有无论是在哪种培养基中都随着3D组织的层数的增加、癌细胞的增殖率提高的倾向。
另外，如图14所示，通过本实施例确认了，在使用上述实施方式的细胞结构体时，除了实施例1～5所示的结直肠癌(结直肠癌原发灶)、肝癌(自结直肠癌的转移灶、肝脏转移病例)之外，即便是肺癌(自结肠的转移灶、肺转移病例)情况下也同样能够对癌细胞进行培养。另外，在肺癌细胞中，与结直肠癌细胞同样，具有随着细胞结构体的3D组织的层数的增加、癌细胞的增殖率提高的倾向。
进而，如图14所示，通过对由NHDF形成且没有血管网结构的细胞结构体与由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的细胞结构体进行比较可知，相比较于仅由成纤维细胞构成的细胞结构体，在含有血管内皮细胞的组织上显示细胞增殖率更高的倾向。
此外，如图14所示，由NHDF形成且没有血管网结构的细胞结构体及由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的细胞结构体这两者都是同样的随着细胞结构体的3D组织的层数增加、细胞增殖率提高的倾向。即，随着细胞结构体的3D组织的层数增加、细胞增殖率提高的倾向无论有没有血管网都是同样的。
[实施例7]
本实施例中，使用原代培养的肿瘤细胞确认了3D组织中的血管内皮细胞的比例与癌细胞的增殖率的关系。
＜患者肿瘤组织中的癌细胞＞
患者肿瘤组织中的癌细胞如下制备。
首先，将公益财团法人癌症研究会从结直肠癌(结直肠癌原发灶)患者摘出的肿瘤组织(JC406-1-TT)机械地碎片化之后，与实施例1同样地使用胶原蛋白酶/分散酶及DnaseI进行酶处理后，为了防止污染，充分地进行洗涤。
＜细胞结构体的构筑＞
与实施例1中构筑的细胞结构体同样地构筑由NHDF和HUVEC形成且具备血管网结构的20层细胞结构体(NHDF：2×106个/孔、HUVEC：相对于NHDF总数为1.5％)。
另外，按照改变3D组织中的血管内皮细胞的比例的方式来改变细胞结构体中的HUVEC相对于NHDF总数的含有率(以下有时称作HUVEC含有率)，构筑HUVEC含有率为0％、0.5％、5.0％、15％的细胞结构体(20层)。
换而言之，本实施例中构筑了HUVEC含有率为0％、0.5％、1.5％、5.0％、15％的5种细胞结构体(20层)。
＜癌细胞的接种＞
使用适量的D-MEM培养基(10％FBS)将患者肿瘤组织来源JC406-1-TT细胞悬浮，接种于在24孔Transwell细胞培养池内构筑的细胞结构体(HUVEC含有率为1.5％)的顶面上。之后，使用D-MEM培养基(10％FBS)一边适宜地进行培养基更换，一边培养14天。
另外，同样地将患者肿瘤组织来源JC406-1-TT细胞接种在使HUVEC含有率为0％、0.5％、5.0％、15％的细胞结构体的顶面上，使用D-MEM培养基(10％FBS)一边适宜地进行培养基更换，一边培养14天。
此外，接种于细胞结构体的患者肿瘤组织来源的细胞数为1×104个/孔。
＜酶处理及EpCAM阳性细胞的计测＞
利用与实施例4～6相同的手法，从培养后的细胞结构体中将培养基除去后，使用PBS进行洗涤，使用Tumor Dissociation Kit(Miltenyi Biotec公司制)附带的酶进行处理，使构成该细胞结构体的细胞分散。之后，利用抗EpCAM抗体将酶处理物供至免疫荧光染色，使用荧光滤波器附带的自动细胞计数器计测EpCAM阳性细胞的比例。
对于各细胞结构体，将以培养开始前的(接种于细胞结构体的顶面)细胞数(JC406-1-TT的细胞数)设为1时的培养后的相对细胞数作为细胞(JC406-1-TT细胞)的增殖率求出。
图15表示将患者肿瘤组织来源JC406-1-TT细胞接种在含有使HUVEC含有率在0～15％之间变化的间质细胞的细胞结构体的顶面上，使用D-MEM培养基培养了14天的样品的增殖率的计算结果。
换而言之，图15是表示实施例7中在改变所构成的细胞结构体的血管内皮细胞的含有率时、将患者肿瘤组织(结直肠癌原发灶)来源的JC406-1-TT细胞接种于含有间质细胞的细胞结构体的顶面上、并培养了14天的样品的14天后增殖率(接种数比)的测定结果的图。
如图15所示，根据本实施例可知，相比较于仅由如NHDF那样的成纤维细胞形成的细胞结构体(3D组织)，含有如HUVEC那样的血管内皮细胞的组织显示更高的癌细胞增殖率。
即，根据本实施例，当细胞结构体含有血管内皮细胞时，无论细胞结构体中的血管内皮细胞(HUVEC)的比例如何，都获得了从癌细胞的增殖的观点出发优选的结果。
另外，根据本实施例，当相对于成纤维细胞的血管内皮细胞的比例为0.5％～5.0％范围内时，具有癌细胞的增殖率特别地提高的倾向。
根据本实施例，就想要获得更多癌细胞的观点而言，细胞结构体中含有血管内皮细胞、形成脉管网结构者显示了优选的可能性。
以上说明了本发明的实施方式，但实施方式的各构成及它们的组合等为一例，在不脱离本发明主旨的范围内，可进行构成的附加、省略、置换及其它变更。另外，本发明不受实施方式所限定。

Claims (12)

1.一种原代培养方法，其是在体外对从生物体采集的组织中所含的细胞进行原代培养的原代培养方法，其中，
将从生物体采集的组织中的细胞接种至含有构成间质的细胞、且单层的或2个以上的细胞层在厚度方向上层叠的细胞结构体的顶面上，进行培养。
2.根据权利要求1所述的原代培养方法，其中，将从所述生物体采集的所述组织的碎片化物、从所述生物体采集的所述组织的酶处理物、或者由从所述生物体采集的所述组织中回收的细胞接种在所述细胞结构体的所述顶面来进行培养。
3.根据权利要求1或2所述的原代培养方法，其中，所述细胞结构体含有选自成纤维细胞、周细胞、内皮细胞及免疫细胞中的1种以上作为构成所述间质的细胞。
4.根据权利要求3所述的原代培养方法，其中，所述内皮细胞是选自血管内皮细胞及淋巴管内皮细胞中的1种以上。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的原代培养方法，其中，所述细胞结构体具备脉管网结构。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的原代培养方法，其中，所述细胞结构体的厚度为5μm以上。
7.根据权利要求1～5中任一项所述的原代培养方法，其中，所述细胞结构体的厚度为150μm以上。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的原代培养方法，其中，从所述生物体采集的所述组织含有肿瘤组织。
9.根据权利要求8所述的原代培养方法，其中，
在将从所述生物体采集的所述组织进行碎片化之后，从所得的碎片化物中分选出癌细胞，
将分选出的所述癌细胞接种在所述细胞结构体的所述顶面上来进行培养。
10.根据权利要求9所述的原代培养方法，其中，在从所述碎片化物中分选所述癌细胞时，利用选自流式细胞仪、磁性分离、介电泳、尺寸分级及密度梯度分级中的1种以上的手法来分选所述癌细胞。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的原代培养方法，其中，通过以下工序来构筑所述细胞结构体：
在阳离子性缓冲液中，将至少含有构成间质的细胞的细胞与强电解质高分子及细胞外基质成分混合，获得混合物的工序(a)；
将通过所述工序(a)获得的所述混合物接种在细胞培养容器中的工序(b)；以及
在所述工序(b)后，在所述细胞培养容器中获得至少含有构成间质的细胞的细胞多层地层叠而成的细胞结构体的工序(c)。
12.一种含原代培养细胞的细胞结构体，其在含有构成间质的细胞、且单层的或2个以上的细胞层在厚度方向上层叠的间质细胞层的顶面上具备由从生物体采集的组织中所含的细胞形成的细胞层。
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