CN116096859A - 立体性细胞结构体的制造方法及立体性细胞结构体 - Google Patents

立体性细胞结构体的制造方法及立体性细胞结构体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有脉管网的立体性细胞结构体的制造方法，其包含：将至少包含内皮细胞的细胞集团、阳离子性物质、高分子电解质、和细胞外基质成分混合而得到混合物的工序；从得到的所述混合物中收集包含所述细胞集团、所述阳离子性物质、所述高分子电解质、和所述细胞外基质成分的细胞集合体的工序；以及在培养基中培养所述细胞集合体的工序；其中，所述混合物中的细胞外基质成分的浓度为1.0×10‑8mg/mL以上且小于2.5×10‑2mg/mL。

Description

立体性细胞结构体的制造方法及立体性细胞结构体
技术领域
本发明涉及立体性细胞结构体的制造方法及立体性细胞结构体。
本申请主张2020年8月20日在日本申请的日本特愿2020-139260号的优先权，其内容援引于此。
背景技术
近年来，再生医疗自不必说，在要求接近生物体的环境的药剂的试验体系中，显示了使用比在平板上生长的细胞更能立体地形成组织的立体性细胞结构体的优越性，并开发了用于在生物体外构建立体性细胞结构体的各种技术。例如，开发了在细胞不能粘附的表面基板上形成细胞块的方法、以及在液滴中形成细胞块的方法、以及在透过性膜上堆积细胞的方法等。
为了维持这样的细胞的组织化，为了细胞间的结合或支架形成，需要生物体自身所产生的胶原等细胞外基质(ECM)。因此，对在人为构建细胞组织时从外部添加ECM的情况进行了研究。
例如，专利文献1中公开了在使通过酶处理等分离的细胞与胶原等接触后、以三维集合体的形式进行培养的方法，其中，胶原是代表性的ECM，是具有细胞保护作用的水溶性高分子。根据该方法，在培养中在细胞周边形成水溶性高分子的凝胶。
另外，专利文献2中公开了如下方法：使用表面固定有属于温度响应性的树脂的聚异丙基丙烯酰胺(poly(N-isopropylacrylamide)，PIPAAm)的培养皿制作细胞片，将所制作的细胞片层叠，由此构建立体性细胞结构体。
另外，专利文献3中公开了如下方法：反复进行形成细胞层的工序和使所形成的细胞层与含有第一物质的溶液和含有第二物质的溶液交替接触的工序，介由纳米尺寸的厚度的ECM连续地将细胞层层叠，由此构建立体性细胞结构体。在该方法中，由于不需要单层的细胞片的剥离、所剥离的细胞片的重叠等，因此能够以优异的再现性、效率制造立体性细胞结构体。
另外，专利文献4中公开了如下方法：制作各个细胞的整个表面被粘接膜被覆的被覆细胞，通过粘接膜使细胞粘接，由此构建立体性细胞结构体。
如上所述，作为立体性细胞结构体的制造技术，已提出了几种方法。但是，即使通过任一方法暂时形成了立体性细胞结构体，如果无法在立体性细胞结构体的内部再现脉管网，则也不能说模仿了真正接近生物体的结构。特别是在立体性细胞结构体的情况下，为了向立体性细胞结构体的内部的细胞供给所需的营养，也要求良好地形成脉管网。
通常，为了形成脉管网，在构成立体性细胞结构体的细胞集团中加入血管内皮细胞。然而，立体性细胞结构体仅仅含有血管内皮细胞时，不一定会形成脉管网(也称为血管网)，对于血管网的形成而言，血管内皮细胞所存在的周边的环境是重要的。
作为影响立体性细胞结构体内部的血管网的形成的因素，已知有VEGF等各种生长因子等各种因子，作为其中之一，报告了ECM的机械性质会对血管网的形成产生影响(参照非专利文献1)。
本申请的发明者们以前开发了一种立体性细胞结构体的制造技术，其包含：A工序，得到细胞悬浮于至少含有阳离子性缓冲液、ECM和高分子电解质的溶液中的混合物；B工序，从得到的所述混合物中收集所述细胞，在基材上形成细胞集合体；以及C工序，培养所述细胞，得到立体性细胞结构体(参照专利文献5、6)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第2824081号公报
专利文献2：国际公开第2002/008387号
专利文献3：日本专利第4919464号公报
专利文献4：日本专利第5850419号公报
专利文献5：日本专利第6427836号公报
专利文献6：日本专利第6639634号公报
非专利文献
非专利文献1：Rouwkema J.and Khademhosseini A.,Vascularization andAngiogenesis in Tissue Engineering：Beyond Creating Static Networks,TrendsBiotechnol,34(9),733-745,2016.
发明内容
发明所要解决的课题
专利文献5及6中记载的方法可以在不受到细胞种类较大限定的情况下进行应用，是在细胞包含内皮细胞的情况下的脉管网的形成能力优异、且也能够形成层构成的有效的方法。
但是，本发明者们发现，在专利文献5和6的方法中，有时在立体性细胞结构体中并没有形成脉管网。
因此，本发明的目的在于提供一种制造稳定地具有脉管网的立体性细胞结构体的技术。
用于解决课题的手段
本发明包括以下的方式。
[1]一种具有脉管网的立体性细胞结构体的制造方法，其包含：将至少包含内皮细胞的细胞集团、阳离子性物质、高分子电解质、和细胞外基质成分混合而得到混合物的工序；从得到的所述混合物中收集包含所述细胞集团、所述阳离子性物质、所述高分子电解质、和所述细胞外基质成分的细胞集合体的工序；以及在培养基中培养所述细胞集合体的工序；其中，所述混合物中的细胞外基质成分的浓度为1.0×10-8mg/mL以上且小于2.5×10-2mg/mL。
[2]根据[1]所述的制造方法，其中，在进行至少1次的得到所述混合物的工序和收集所述细胞集合体的工序之后进行所述培养的工序。
[3]根据[1]或[2]所述的制造方法，其中，所述细胞外基质成分选自由胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、波连蛋白、弹性蛋白、细胞粘合素、巢蛋白、原纤蛋白、蛋白聚糖以及它们的组合组成的组。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的制造方法，其中，所述高分子电解质选自由糖胺聚糖、硫酸葡聚糖、硫酸鼠李聚糖、褐藻糖胶、角叉菜胶、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、聚丙烯酸以及它们的组合组成的组。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的制造方法，其中，所述混合物中的所述高分子电解质的浓度为1.0×10-8mg/mL以上且小于2.5×10-2mg/mL。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的制造方法，其中，收集所述细胞集合体的工序为从通过得到所述混合物的工序得到的混合物中除去液体部分，将得到的细胞集合体悬浮于溶液中，从得到的悬浮液中收集细胞集合体的工序。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的制造方法，其中，在收集所述细胞集合体的工序中，在具有底面和壁的容器内收集所述细胞集合体，所述底面的每单位面积存在的所述细胞的数量为1.5×104个/mm2以上且1.5×105个/mm2以下。
[8]一种具有脉管网的立体性细胞结构体，其包含至少包含内皮细胞的细胞集团、阳离子性物质、高分子电解质、和细胞外基质成分，其中，所述细胞外基质成分的含量为0.01质量％以上且30质量％以下。
[9]根据[8]所述的立体性细胞结构体，其中，所述立体性细胞结构体的底面的每单位面积存在的所述细胞的数量为1.5×104个/mm2以上且1.5×105个/mm2以下。
[10]根据[8]或[9]所述的立体性细胞结构体，其厚度为5μm以上且200μm以下。
发明效果
根据本发明，能够提供一种制造稳定地具有脉管网的立体性细胞结构体的技术。
附图说明
图1是实验例1中拍摄的胶原的终浓度和肝素的终浓度分别为0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL、0.0125mg/mL的情况下的立体性细胞结构体的荧光显微镜照片。
图2是实验例1中拍摄的胶原的终浓度和肝素的终浓度分别为0.05mg/mL、1.0×10-2mg/mL、2.0×10-3mg/mL、4.0×10-4mg/mL、8.0×10-5mg/mL、1.6×10-5mg/mL、3.2×10- 6mg/mL、6.4×10-7mg/mL、1.3×10-7mg/mL、2.6×10-8mg/mL的情况下的立体性细胞结构体的荧光显微镜照片。
图3是实验例2中拍摄的混合物2-1和2-2的培养开始时经过5天后和经过8天后的立体性细胞结构体的荧光显微镜照片。
具体实施方式
在一个实施方式中，本发明提供一种具有脉管网的立体性细胞结构体的制造方法，其包含：将至少包含内皮细胞的细胞集团、阳离子性物质、细胞外基质成分、和高分子电解质混合而得到混合物的工序；从得到的所述混合物中收集包含所述细胞集团、所述阳离子性物质、所述高分子电解质、和所述细胞外基质成分的细胞集合体的工序；以及在培养基中培养所述细胞集合体的工序；其中，所述混合物中的细胞外基质成分的浓度为1.0×10- 8mg/mL以上且小于2.5×10-2mg/mL。
根据本实施方式的制造方法，能够提供制造稳定地具有脉管网的立体性细胞结构体的技术。
另外，通过本实施方式的制造方法制造的立体性细胞结构体的脉管网中，构成脉管网的脉管的总长度可以为5,000μm/mm2以上、例如5,200μm/mm2以上、例如5,400μm/mm2以上。在本说明书中，构成脉管网的脉管的总长度通过以下的方法来测定。利用荧光显微镜(例如PerkinElmer公司制、高内涵共焦成像系统Operetta CLS)，拍摄立体性细胞结构体的荧光显微镜照片，使用细胞结构图像软件Harmony(注册商标，PerkinElmer公司制)进行分析，如果培养容器是96孔板，则分析至少4.26mm×4.26mm以上的范围的图像，如果是24孔板，则分析至少6.5mm×6.5mm以上的范围的图像。更具体而言，将培养容器指定为ROI，或者使用DAPI(4’,6-二脒基2-苯基吲哚)对立体性细胞结构体进行染色，指定ROI。在通过图像的平坦化去除了噪声之后，在各图像中设定脉管的荧光强度的阈值。将阈值以上的区域且尺寸小的区域(例如5μm2以下)作为噪声排除。然后，测定荧光强度的阈值以上的区域中的总长度，作为脉管网的总长度。
立体性细胞结构体的形态没有特别限制，例如可以是在由胶原等天然生物高分子、合成高分子构成的支架内培养细胞而形成的立体性细胞结构体，也可以是细胞凝聚体(也称为球状体)，也可以是片状的细胞结构体。
在本说明书中，“立体性细胞结构体”是指包含至少1种细胞的立体性的细胞的集合体。作为立体性细胞结构体的形态，可举出皮肤、毛发、骨、软骨、牙齿、角膜、血管、淋巴管、心脏、肝脏、胰腺、神经、食道等生物体组织模型、及胃癌、食管癌、大肠癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾细胞癌、及肝癌等固体癌模型，但并不限定于这些。
本实施方式的制造方法包含：工序(A)，将至少包含内皮细胞的细胞集团、阳离子性物质、细胞外基质成分、和高分子电解质混合而得到混合物；工序(B)，从得到的所述混合物中收集包含所述细胞集团、所述阳离子性物质、所述高分子电解质、和所述细胞外基质成分的细胞集合体；以及工序(C)，在培养基中培养所述细胞集合体。
在工序(A)中，细胞集团至少包含内皮细胞。作为内皮细胞，优选血管内皮细胞。细胞的来源没有特别限定，例如可举出人、猴、狗、猫、兔、猪、牛、小鼠和大鼠等。
除内皮细胞以外的细胞没有特别限定，例如可以是骨、肌肉、内脏、神经、脑、骨、皮肤或血液等来源的体细胞，也可以是生殖细胞。另外，细胞也可以是诱导多能性干细胞(iPS细胞)或胚胎干细胞(ES细胞)。或者，也可以是原代培养细胞、传代培养细胞和细胞株细胞等培养细胞。细胞集团可以包含1种细胞，也可以含有多种细胞。
作为细胞，例如可举出神经细胞、树突状细胞、免疫细胞、血管内皮细胞、淋巴管内皮细胞、成纤维细胞、肝癌细胞等癌细胞、上皮细胞、心肌细胞、肝细胞、胰岛细胞、组织干细胞和平滑肌细胞等，但并不限定于这些。
在工序(A)中，将至少包含内皮细胞的细胞集团、阳离子性物质、高分子电解质和细胞外基质成分混合而得到混合物。通过包含混合物中的细胞外基质成分，存在容易得到厚的细胞结构体的倾向，但通过降低混合物中的细胞外基质成分的浓度，容易稳定地得到具有脉管网的细胞结构体。
作为本实施方式中使用的阳离子性物质，只要不对细胞的生长和细胞集合体的形成产生不良影响，就可以使用任意的具有正电荷的物质。作为阳离子性物质，可举出Tris-盐酸缓冲液、Tris-马来酸缓冲液、Bis-Tris-缓冲液、HEPES等阳离子性缓冲液、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、聚乙烯基胺、聚烯丙基胺、聚赖氨酸、聚组氨酸、以及聚精氨酸等，但并不限定于这些。其中，优选阳离子性缓冲液，更优选Tris-盐酸缓冲液。
工序(A)中的阳离子性物质的浓度只要不对细胞的生长和细胞集合体的形成产生不良影响，就没有特别限定。本实施方式中使用的阳离子性物质的浓度优选为10～100mM，例如可以为20～90mM，例如可以为30～80mM，例如可以为40～70mM，例如可以为45～60mM。
在使用阳离子性缓冲液作为阳离子性物质的情况下，阳离子性缓冲液的pH只要不对细胞的生长和细胞集合体的形成产生不良影响，则没有特别限定。本实施方式中使用的阳离子性缓冲液的pH优选为6.0～8.0。例如，本实施方式中使用的阳离子性缓冲液的pH可以为7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、或8.0。本实施方式中使用的阳离子性缓冲液的pH更优选为7.2～7.6，进一步优选为7.4。
作为本实施方式中使用的细胞外基质成分，只要不对细胞的生长和细胞集合体的形成产生不良影响，就可以使用构成细胞外基质(ECM)的任意成分。作为细胞外基质成分，可举出胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、波连蛋白、弹性蛋白、细胞粘合素、巢蛋白、原纤蛋白、及蛋白聚糖等，但并不限定于这些。这些细胞外基质成分可以单独使用，也可以组合使用。作为蛋白聚糖，可举出硫酸软骨素蛋白聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖、硫酸角质素蛋白聚糖和硫酸皮肤素蛋白聚糖，但并不限定于这些。本实施方式中使用的细胞外基质成分为胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白，其中优选为胶原。只要不对细胞的生长和细胞集合体的形成产生不良影响，也可以使用上述的细胞外基质成分的修饰体及突变体。
本实施方式中使用的细胞外基质成分的浓度为1.0×10-8mg/mL以上且小于2.5×10-2mg/mL。本实施方式中使用的细胞外基质成分的浓度优选为2.6×10-8mg/mL以上且1×10-2mg/mL以下，例如为1.25×10-2mg/mL、1×10-2mg/mL、2.0×10-3mg/mL、4.0×10-4mg/mL、8.0×10-5mg/mL、1.6×10-5mg/mL、3.2×10-6mg/mL、6.4×10-7mg/mL、1.3×10-7mg/mL、及2.6×10-8mg/mL。通过本实施方式中使用的细胞外基质成分的浓度为1.0×10-8mg/mL以上且小于2.5×10-2mg/mL，能够制造稳定地具有脉管网的立体性细胞结构体。在本实施方式中，可以将细胞外基质成分溶解于适当的溶剂中使用。作为溶剂的例子，可举出水、缓冲液、醋酸及培养基等，但并不限定于这些。在本实施方式中，细胞外基质成分优选溶解于培养基或缓冲液中。作为培养基，没有特别限定，可举出DMEM、E-MEM、MEMα、RPMI-1640、及Mccoy’5a、Ham’s F-12等基础培养基；在这些基础培养基中按照达到1～20容量％左右方式添加CS(牛血清)、FBS(胎牛血清)及HBS(胎马血清)等血清中的至少一种而成的培养基。作为缓冲液，可举出Tris-盐酸缓冲液、Tris-马来酸缓冲液、Bis-Tris-缓冲液和HEPES。
在本说明书中，“高分子电解质”是指在高分子链中具有可解离的官能团的高分子。作为本实施方式中使用的高分子电解质，只要不对细胞的生长和细胞集合体的形成产生不良影响，则可以使用任意的高分子电解质。对于高分子电解质，可举出肝素、硫酸软骨素(例如4-硫酸软骨素、6-硫酸软骨素)、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、及透明质酸等糖胺聚糖；硫酸葡聚糖、硫酸鼠李聚糖、褐藻糖胶、角叉菜胶、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、及聚丙烯酸等，但并不限定于这些。这些高分子电解质可以单独使用，也可以组合使用。本实施方式中使用的高分子电解质优选为糖胺聚糖。另外，本实施方式中使用的高分子电解质更优选为肝素、硫酸葡聚糖、硫酸软骨素、或硫酸皮肤素。本实施方式中使用的高分子电解质进一步优选为肝素。只要不对细胞的生长和细胞集合体的形成产生不良影响，也可以使用上述高分子电解质的衍生物。
高分子电解质的浓度只要不对细胞的生长和细胞集合体的形成产生不良影响，就没有特别限定。本实施方式中使用的高分子电解质的浓度优选超过0mg/mL且小于1.0mg/mL。本实施方式中使用的高分子电解质的浓度优选为1.0×10-8mg/mL以上且小于2.5×10- 2mg/mL。本实施方式中使用的细胞外基质成分的浓度更优选为2.6×10-8mg/mL以上且1×10-2mg/mL以下，例如为1×10-2mg/mL、2.0×10-3mg/mL、4.0×10-4mg/mL、1.6×10-5mg/mL、3.2×10-6mg/mL、1.3×10-7mg/mL、及2.6×10-8mg/mL。通过本实施方式中使用的细胞外基质成分的浓度为1.0×10-8mg/mL以上且小于2.5×10-2mg/mL，能够制造更稳定地具有脉管网的立体性细胞结构体。在本实施方式中，可以将高分子电解质溶解于适当的溶剂中使用。作为溶剂的例子，可举出水、缓冲液及培养基，但并不限定于这些。在使用阳离子性缓冲液作为上述阳离子性物质的情况下，可以将高分子电解质溶解于阳离子性缓冲液或培养基中来使用。作为阳离子性缓冲液及培养基，可举出能够用于溶解细胞外基质成分的缓冲液及培养基。
作为本发明的一个方面，可举出高分子电解质在具有脉管网的立体性细胞结构体的制造方法中的用途。所述立体性细胞结构体的制造方法如前所述。作为该高分子电解质，可举出上述的高分子电解质，优选为肝素。通过在立体性细胞结构体的制造方法中使用高分子电解质，如上所述，即使细胞外基质成分为低浓度，也能够抑制脉管网的形成抑制。
在本实施方式中，高分子电解质与细胞外基质成分的配合比优选为1：2～2：1。本实施方式中使用的高分子电解质与细胞外基质成分的配合比更优选为1：1.5～1.5：1。本实施方式中使用的高分子电解质与细胞外基质成分的配合比进一步优选为1：1。
在工序(A)中，至少包含内皮细胞的细胞集团、阳离子性物质、高分子电解质和细胞外基质成分的混合可以在培养皿、试管、烧瓶、瓶子、及平板等适当的容器中进行。
接着，在工序(B)中，从工序(A)中得到的混合物中收集包含细胞集团、阳离子性物质、高分子电解质、以及细胞外基质成分的细胞集合体。在本说明书中，“细胞集合体”是指细胞的集团。细胞集合体还包括通过离心分离或过滤等得到的细胞的沉淀物。在某实施方式中，细胞集合体是浆状的粘稠物。“浆状的粘稠物”是指如Akihiro Nishiguchi et al.,Cell-cell crosslinking by bio-molecular recognition of heparin-based layer-by-layer nanofilms,Macromol Biosci.,15(3),312-317,2015.中记载的凝胶样的细胞集合体。
作为工序(B)中的收集细胞的方法，可以使用本领域技术人员公知的方法。例如，可以通过离心分离、磁性分离或过滤来收集细胞。离心分离的条件只要不对细胞的生长产生不良影响，就没有特别限定。例如，将工序(A)中得到的混合物接种到细胞培养插件中，在10℃、400×g下进行1分钟的离心分离，由此收集细胞。或者，也可以通过自然沉降来收集细胞。
另外，工序(B)也可以是从工序(A)中得到的混合物中除去液体部分，将得到的细胞集合体悬浮于溶液中，从得到的悬浮液中收集细胞集合体的工序(B’)。在工序(B’)中，作为从工序(A)中得到的混合物中除去液体部分、得到细胞集合体的方法，可以使用本领域技术人员公知的方法。例如，可以通过离心分离或过滤除去液体部分。离心分离的条件只要不对细胞的生长和细胞集合体的形成产生不良影响，就没有特别限定。例如，将装有混合物的微管在室温、400～1,000×g下进行1分钟的离心分离，将液体部分和细胞集合体分离，由此除去液体部分。或者，也可以在通过自然沉降收集了细胞之后，除去液体部分。在工序(B’)中，作为从将所述细胞集合体悬浮于溶液而得到的悬浮液中收集所述细胞集合体的方法，可以使用本领域技术人员公知的方法。例如，通过离心分离或过滤从悬浮液中除去液体部分，能够在容器中得到细胞集合体。或者，也可以通过自然沉降在容器中得到细胞集合体。工序(B)或工序(B’)中的细胞集合体可以为层状。
在工序(B)中，关于所收集的细胞的数量，例如在具有底面和壁的容器内得到细胞集合体的情况下，底面的每单位面积存在的细胞的数量优选为1.5×104个/mm2以上且1.5×105个/mm2以下、例如3.0×104个/mm2以上且1.0×105个/mm2以下、4.0×104个/mm2以上且1.5×105个/mm2以下、5.0×104个/mm2以上且1.3×105个/mm2以下、6.1×104个/mm2以上且1.3×105个/mm2以下、7.5×104个/mm2以上且1.0×105个/mm2以下、或7.5×104个/mm2以上且9.6×104个/mm2以下。
接着，在工序(C)中，将上述的细胞集合体在培养基中培养，得到立体性细胞结构体。也可以在培养前将细胞集合体悬浮于溶液中。溶液只要不对细胞的生长和立体性细胞结构体的形成产生不良影响，就没有特别限定。例如，可以使用适于构成细胞集合体的细胞的细胞培养用培养基、缓冲液等，优选为细胞培养用培养基。作为细胞培养用培养基及缓冲液，可举出能够用于溶解细胞外基质成分的细胞培养用培养基及缓冲液。
细胞集合体的悬浮可以在培养皿、试管、烧瓶、瓶子、及平板等适当的容器中进行。
在将细胞集合体悬浮于溶液中的情况下，可以在培养前使细胞沉淀而在基材上形成细胞的沉淀物。作为基材，可举出用于细胞培养的培养容器。培养容器可以是具有在细胞、微生物的培养中通常使用的原材料和形状的容器。作为培养容器的原材料，可举出玻璃、不锈钢及塑料等，但并不限定于这些。作为培养容器，可举出培养皿、试管、烧瓶、瓶子及平板等，但并不限定于这些。基材例如是不使液体中的细胞通过而能够使液体通过的材料。基材优选为透过膜。作为具有该透过膜的容器，可举出Transwell(注册商标)插件、Netwell插件、Falcon(注册商标)细胞培养插件、及Millinell(注册商标)细胞培养插件等细胞培养插件，但并不限定于这些。
细胞的沉淀可以使用本领域技术人员公知的方法。例如，可以通过离心分离、磁性分离或过滤等收集细胞。离心分离的条件只要不对细胞的生长产生不良影响，就没有特别限定。例如，可以通过将混合物或悬浮液接种于细胞培养插件中，在10℃、400×g下进行1分钟的离心分离，由此收集细胞。或者，也可以通过自然沉降收集细胞。另外，所收集的细胞也可以形成层结构。
细胞集合体、或在悬浮有细胞集合体的情况下为所悬浮的细胞优选以1,000个/mm2以上、例如10,000个/mm2以上、例如20,000个/mm2以上、例如25,000个/mm2以上的细胞密度进行接种。另外，细胞例如可以以1,000,000个/mm2以下、例如500,000个/mm2以下、例如200,000个/mm2以下、例如100,000个/mm2以下的细胞密度进行接种。通过实施将细胞集合体悬浮于溶液的工序、以及使细胞沉淀的工序，能够得到更均匀的立体性细胞结构体。
在工序(C)中，细胞的培养可以在适于所培养的细胞的培养条件下进行。本领域技术人员可以根据细胞的种类、所期望的功能选择适当的培养基。作为细胞培养用培养基，没有特别限定，可举出DMEM、E-MEM、MEMα、RPMI-1640、及McCoy’s 5A、Ham’s F-12等基础培养基、在这些基础培养基中按照达到1～20容量％左右的方式添加CS(牛血清)、FBS(胎牛血清)、HBS(胎马血清)等血清而得到的培养基。培养环境的温度、大气组成等各条件只要是本领域技术人员就可以容易地确定。
在细胞培养时，也可以在培养基中添加用于抑制所构建的立体性细胞结构体变形(例如组织的收缩或组织末端的剥离等)的物质。作为这样的物质，可举出属于选择性ROCK(Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶/Rho结合激酶)抑制剂的Y-27632，但并不限定于此。
工序(C)优选在进行至少1次以上的工序(A)和工序(B)或工序(B’)之后进行。在工序(C)之前，通过反复进行工序(A)和工序(B)或工序(B’)，能够将细胞集合体或细胞的沉淀物层叠。由此，能够构建具有多个层的立体性细胞结构体。在该情况下，可以使用多种细胞来构建由不同种类的细胞构建的立体性细胞结构体。
通过本实施方式的制造方法制造的立体性细胞结构体具有脉管网，因此作为模仿接近生物体的结构的模型是有用的。在本说明书中，“脉管网”是指生物体组织中的血管网或淋巴管网这样的具有多个分支点的网络状的管结构。
通过本实施方式的制造方法，能够制造稳定地具有脉管网的立体性细胞结构体，并且能够制造具有充分的厚度的立体性细胞结构体。
通过本实施方式中的制造方法制造的立体性细胞结构体的厚度可以为5μm以上且200μm以下，例如为10μm以上且150μm以下、20μm以上且100μm以下、20μm以上且50μm以下、或25μm以上且45μm以下。通过反复进行本发明的上述方法的工序(A)～(B)或工序(A)～(B’)，尽管细胞外基质成分少，也能够例如制造在将厚度保持为5～100μm的同时稳定地具有脉管网的立体性细胞结构体。需要说明的是，在本实施方式中，以100～200倍的倍率观察立体性细胞结构体的厚度方向的截面的切片图像。
本发明的一个实施方式的立体性细胞结构体包含至少包含内皮细胞的细胞集团、阳离子性物质、高分子电解质、和细胞外基质成分，是具有脉管网的立体性细胞结构体，细胞外基质成分的含量为0.01质量％以上且30质量％以下。本实施方式的立体性细胞结构体通过本实施方式的制造方法来制造。
本实施方式的立体性细胞结构体中所含的细胞外基质成分的含量为0.01质量％以上且30质量％以下，优选为0.1质量％以上且30质量％以下，例如为1质量％以上且30质量％以下，5质量％以上且30质量％以下，10质量％以上且30质量％以下，20质量％以上且30质量％以下，或20质量％以上且25质量％以下。通过使本实施方式的立体性细胞结构体中所含的细胞外基质成分的含量为0.01质量％以上且30质量％以下，能够在立体性细胞结构体内稳定地形成脉管网，且能够制成具有充分的厚度的立体性细胞结构体。
本实施方式的立体性细胞结构体的底面的每单位面积存在的所述细胞的数量优选为1.5×104个/mm2以上且1.5×105个/mm2以下、例如3.0×104个/mm2以上且1.0×105个/mm2以下、4.0×104个/mm2以上且1.5×105个/mm2以下、5.0×104个/mm2以上且1.3×105个/mm2以下、6.1×104个/mm2以上且1.3×105个/mm2以下、7.5×104个/mm2以上且1.0×105个/mm2以下、或7.5×104个/mm2以上且9.6×104个/mm2以下。
本实施方式的立体性细胞结构体的厚度可以为5μm以上且200μm以下，例如可以为10μm以上且150μm以下、20μm以上且100μm以下、20μm以上且50μm以下、或25μm以上且45μm以下。
本实施方式的立体性细胞结构体稳定地具有脉管网，且具有充分的厚度，因此作为模仿接近生物体的结构的模型是有用的。
作为另一方面，本发明包含以下的方式。
[1]一种具有脉管网的立体性细胞结构体的制造方法，其包含：将至少包含内皮细胞的细胞集团、阳离子性物质、高分子电解质和细胞外基质成分混合而得到混合物的工序；从得到的所述混合物中收集包含所述细胞集团、所述阳离子性物质、所述高分子电解质和所述细胞外基质成分的细胞集合体的工序；以及在培养基中培养所述细胞集合体的工序；其中，所述细胞外基质成分选自由胶原、层粘连蛋白及纤连蛋白以及它们的组合组成的组中，所述高分子电解质为糖胺聚糖，所述混合物中的细胞外基质成分的浓度为1.0×10-8mg/mL以上且小于2.5×10-2mg/mL。
[2]根据[1]所述的制造方法，其中，在进行至少1次的得到所述混合物的工序和收集所述细胞集合体的工序之后进行所述培养的工序。
[3]根据[1]或[2]所述的制造方法，其中，所述细胞外基质成分为胶原。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的制造方法，其中，所述高分子电解质为肝素。
[5]根据[1]～[4]中任一项所述的制造方法，其中，所述混合物中的所述高分子电解质的浓度为1.0×10-8mg/mL以上且小于2.5×10-2mg/mL。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的制造方法，其中，收集所述细胞集合体的工序为从通过得到所述混合物的工序得到的混合物中除去液体部分，将得到的细胞集合体悬浮于溶液中，从得到的悬浮液中收集细胞集合体的工序。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的制造方法，其中，在收集所述细胞集合体的工序中，在具有底面和壁的容器内收集所述细胞集合体，所述底面的每单位面积存在的所述细胞的数量为1.5×104个/mm2以上且1.5×105个/mm2以下。
[8]一种具有脉管网的立体性细胞结构体，其包含至少包含内皮细胞的细胞集团、阳离子性物质、高分子电解质和细胞外基质成分，其中，所述细胞外基质成分选自由胶原、层粘连蛋白及纤连蛋白以及它们的组合组成的组中，所述高分子电解质为糖胺聚糖，所述细胞外基质成分的含量为0.01质量％以上且30质量％以下。
[9]根据[8]所述的立体性细胞结构体，其中，所述立体性细胞结构体的底面的每单位面积存在的所述细胞的数量为1.5×104个/mm2以上且1.5×105个/mm2以下。
[10]根据[8]或[9]所述的立体性细胞结构体，其厚度为5μm以上且200μm以下。
[11]根据[8]～[10]中任一项所述的立体性细胞结构体，其中，所述细胞外基质成分为胶原。
[12]根据[8]～[11]中任一项所述的制造方法，其中，所述高分子电解质为肝素。
[13]高分子电解质在[8]～[10]中任一项所述的立体性细胞结构体的制造方法中的用途。
实施例
以下示出实施例对本发明更详细且具体地进行说明，但实施例并不是为了限定本发明的范围。
在以下的各实验例中，只要没有特别说明，则使用胶原I作为胶原。
[实验例1]
(立体性细胞结构体的形成1)
将1.38×107细胞的正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)及2.1×105细胞的GFP导入人脐带静脉内皮细胞(GFP-HUVEC)悬浮于0.8mg/mL、0.4mg/mL、或0.2mg/mL的肝素/50mM Tris-盐酸缓冲液(pH为7.4)0.5mL、同浓度的胶原/50mM Tris-盐酸缓冲液(pH为7.4)0.5mL、和含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecon修饰Eagle培养基(DMEM培养基)1mL的混合液中。其结果，胶原的终浓度和肝素的终浓度分别为0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL。进而，将胶原的终浓度和肝素的终浓度分别为0.05mg/mL的混合液进一步用DMEM培养基阶段性地稀释2倍，制备胶原的终浓度和肝素的终浓度分别为0.025mg/mL或1.25×10-2mg/mL的混合液，同样地将上述正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)和GFP导入人脐带静脉内皮细胞(GFP-HUVEC)悬浮。进而，将胶原的终浓度和肝素的终浓度分别为0.05mg/mL的混合液进一步用DMEM培养基阶段性地稀释5倍，制备胶原的终浓度和肝素的终浓度分别为1.0×10-2mg/mL、2.0×10-3mg/mL、4.0×10-4mg/mL、8.0×10-5mg/mL、1.6×10-5mg/mL、3.2×10-6mg/mL、6.4×10-7mg/mL、1.3×10- 7mg/mL、或2.6×10-8mg/mL的混合液，同样地将上述正常人皮肤成纤维细胞(NHDF)和GFP导入人脐带静脉内皮细胞(GFP-HUVEC)悬浮。
接着，将得到的混合物的总量接种于96孔细胞培养插件(每1孔的底面积为0.143cm2)内，在室温、400×g下离心1分钟。由此，在细胞培养插件上形成细胞层。关于接种于细胞培养插件的细胞数，NHDF为9.0×105个，GFP-HUVEC为1.35×104个。
接着，在CO2培养箱(37℃、5％O2)中培养24小时(将开始该培养的时刻记为培养开始时)。从培养开始时起培养24小时后，培养基更换为含有10％FBS的DMEM。之后，从培养开始时起，在48小时后、120小时后也进行培养基交换，培养8天。
《立体性细胞结构体的观察》
从培养开始时起经过8天后，用10％福尔马林溶液将立体性细胞结构体固定后，使用CD31抗体(DAKO公司制、JC70A M082329)和二次抗体(Invitrogen公司制、A-11001)，对血管内皮细胞进行荧光标记，使用荧光显微镜(PerkinElmer公司制、Operetta CLS)观察有无血管网结构形成。图1是表示胶原的终浓度和肝素的终浓度分别为0.2mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL、0.025mg/mL或0.0125mg/mL时的荧光显微镜观察的结果的照片。图2是表示胶原的终浓度和肝素的终浓度分别为0.05mg/mL、1.0×10-2mg/mL、2.0×10-3mg/mL、4.0×10- 4mg/mL、8.0×10-5mg/mL、1.6×10-5mg/mL、3.2×10-6mg/mL、6.4×10-7mg/mL、1.3×10-7mg/mL、或2.6×10-8mg/mL时的荧光显微镜观察的结果的照片。在图1和图2中，“肝素/胶原终浓度”表示肝素和胶原的终浓度。根据图1和图2的显微镜观察的结果，评价有无血管网结构形成。评价按照以下的基准进行。将其结果示于表1。
在立体性细胞结构体整体中形成有血管网结构：A
在立体性细胞结构体的一部分中形成有血管网结构：B
在立体性细胞结构体整体中未形成血管网结构体：C
表1
Figure BDA0004113260330000161
如表1所示，确认到肝素的终浓度和胶原的终浓度为2.6×10-8mg/mL～1.25×10- 2mg/mL时，在立体性细胞结构体整体中形成有血管网结构。在肝素的终浓度和胶原的终浓度为0.025～0.2mg/mL时，确认到有在立体性细胞结构体的一部分中未形成有血管网结构的情况。另外，可知肝素浓度和胶原浓度更低时具有容易形成血管网结构的倾向。
《立体性细胞结构体的厚度的测定》
接着，测定各立体性细胞结构体的厚度。厚度的测定使用Image J计算出切片图像的中央部的一个部位和两端部的两个部位共计三个部位的厚度，将其算术平均值作为立体性细胞结构体的厚度。表2中示出了立体性细胞结构体的厚度的测定结果。
表2
Figure BDA0004113260330000171
其结果可知，当胶原的终浓度为2.6×10-8mg/mL以上、肝素的终浓度为2.6×10- 8mg/mL以上时，可以使立体性细胞结构体的厚度超过20μm。
[实验例2]
(立体性细胞结构体的形成2)
制备0.2mg/mL的肝素/50mM Tris-盐酸缓冲液(pH为7.4)0.5mL、0.2mg/mL的胶原/50mM Tris-盐酸缓冲液(pH为7.4)0.5mL、以及含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecon修饰Eagle培养基(DMEM培养基)1mL的混合液。将该混合液进一步用DMEM培养基稀释4倍，制备胶原的终浓度和肝素的终浓度分别为1.25×10-2mg/mL的混合液，将1.38×107细胞的NHDF和2.1×105细胞的GFP-HUVEC悬浮，得到混合物2-1。
代替上述的0.2mg/mL肝素/50mM Tris-盐酸缓冲液(pH为7.4)0.5mL，加入50mMTris-盐酸缓冲液(pH为7.4)0.5mL，制备胶原的终浓度和肝素的终浓度分别为1.25×10- 2mg/mL和0mg/mL的混合液，其他进行相同操作，得到混合物2-2。
接着，将得到的混合物2-1和2-1的总量分别接种于96孔细胞培养插件(每1孔的底面积为0.143cm2)内，在室温、400×g下离心1分钟。由此，在细胞培养插件上形成细胞层。关于接种于细胞培养插件的细胞数，NHDF为9.0×105个，GFP-HUVEC为1.35×104个。
接着，在CO2培养箱(37℃、5％O2)中培养24小时(将开始该培养的时刻记为培养开始时)。从培养开始时起培养24小时后，培养基更换为含有10％FBS的DMEM。之后，从培养开始时起，在48小时后、120小时后也进行培养基交换，培养8天。
从培养开始时起经过8天后，用与《立体性细胞结构体的观察》相同的方法观察有无血管网结构形成，通过以下的方法计算出血管网的染色面积。利用荧光显微镜(PerkinElmer公司制，高内涵共焦成像系统Operetta CLS)，对立体性细胞结构体的荧光显微镜照片进行拍摄，使用细胞结构图像软件Harmony(注册商标，PerkinElmer公司制)对4.26mm×4.26mm的范围的图像进行分析。更具体而言，将细胞培养插件指定为ROI。在通过图像的平坦化去除了噪声之后，在各图像中设定脉管的荧光强度的阈值。将在阈值以上的区域且尺寸小的区域(5μm2以下)作为噪声排除。然后，测定荧光强度的阈值以上的区域中的总面积，作为脉管网的染色面积。
将从混合物2-1和2-2的培养开始时起经过5天后和经过8天后的血管网的染色面积和血管网结构形成的评价结果示于表3。需要说明的是，血管网的染色面积以将混合物2-1的培养开始时起经过8天后的血管网的染色面积作为100％时的相对比率进行记载。另外，将从混合物2-1和2-2的培养开始时起经过5天后和经过8天后的立体性细胞结构体的荧光显微镜观察的结果示于图3。
表3
Figure BDA0004113260330000181
如表3和图3所示，确认了即使在胶原的终浓度为1.25×10-2mg/mL的情况下，当不包含肝素时，有时也有在立体性细胞结构体的一部分中未形成血管网结构的情况。
产业上的可利用性
根据本发明，能够提供一种稳定地具有脉管网的立体性细胞结构体的制造技术。

Claims (10)

1.一种具有脉管网的立体性细胞结构体的制造方法，其包含：
将至少包含内皮细胞的细胞集团、阳离子性物质、高分子电解质、和细胞外基质成分混合而得到混合物的工序；
从得到的所述混合物中收集包含所述细胞集团、所述阳离子性物质、所述高分子电解质、和所述细胞外基质成分的细胞集合体的工序；以及
在培养基中培养所述细胞集合体的工序；
其中，所述混合物中的细胞外基质成分的浓度为1.0×10-8mg/mL以上且小于2.5×10- 2mg/mL。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，
在进行至少1次的得到所述混合物的工序和收集所述细胞集合体的工序之后进行所述培养的工序。
3.根据权利要求1或2所述的制造方法，其中，
所述细胞外基质成分选自由胶原、层粘连蛋白、纤连蛋白、波连蛋白、弹性蛋白、细胞粘合素、巢蛋白、原纤蛋白、蛋白聚糖以及它们的组合组成的组。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，
所述高分子电解质选自由糖胺聚糖、硫酸葡聚糖、硫酸鼠李聚糖、褐藻糖胶、角叉菜胶、聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酰胺-2-甲基丙磺酸、聚丙烯酸以及它们的组合组成的组。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的制造方法，其中，
所述混合物中的所述高分子电解质的浓度为1.0×10-8mg/mL以上且小于2.5×10-2mg/mL。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的制造方法，其中，
收集所述细胞集合体的工序为从通过得到所述混合物的工序得到的混合物中除去液体部分，将得到的细胞集合体悬浮于溶液中，从得到的悬浮液中收集细胞集合体的工序。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的制造方法，其中，
在收集所述细胞集合体的工序中，在具有底面和壁的容器内收集所述细胞集合体，所述底面的每单位面积存在的所述细胞的数量为1.5×104个/mm2以上且1.5×105个/mm2以下。
8.一种具有脉管网的立体性细胞结构体，其包含至少包含内皮细胞的细胞集团、阳离子性物质、高分子电解质、和细胞外基质成分，
其中，所述细胞外基质成分的含量为0.01质量％以上且30质量％以下。
9.根据权利要求8所述的立体性细胞结构体，其中，
所述立体性细胞结构体的底面的每单位面积存在的所述细胞的数量为1.5×104个/mm2以上且1.5×105个/mm2以下。
10.根据权利要求8或9所述的立体性细胞结构体，其厚度为5μm以上且200μm以下。
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