WO2022039261A1 - 立体的細胞構造体の製造方法、及び立体的細胞構造体 - Google Patents

立体的細胞構造体の製造方法、及び立体的細胞構造体 Download PDF

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瑞穂 鈴木
史朗 北野
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins
    • C12N2533/54—Collagen; Gelatin

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a three-dimensional cell structure and a three-dimensional cell structure.
  • the present application claims priority with respect to Japanese Patent Application No. 2020-139260 filed in Japan on August 20, 2020, the contents of which are incorporated herein by reference.
  • ECM extracellular matrix
  • Patent Document 1 cells isolated by enzyme treatment or the like are brought into contact with collagen or the like, which is a typical ECM and a water-soluble polymer having a cytoprotective action, and then as a three-dimensional aggregate.
  • collagen or the like which is a typical ECM and a water-soluble polymer having a cytoprotective action
  • the method of culturing is disclosed. According to this method, a gel of a water-soluble polymer is formed around the cells during culturing.
  • Patent Document 2 a cell sheet is prepared using a culture dish in which poly (N-isotropylacrylamide) (PIPAAm), which is a temperature-responsive resin, is immobilized on the surface, and the prepared cell sheets are laminated.
  • PIPAAm poly (N-isotropylacrylamide)
  • Patent Document 3 the step of forming the cell layer and the step of alternately contacting the formed cell layer with the first substance-containing liquid and the second substance-containing liquid are repeated to obtain a nanometer-sized thickness.
  • a method for constructing a three-dimensional cell structure by continuously laminating cell layers via ECM is disclosed. It is said that this method does not require peeling of a single-layer cell sheet or stacking of peeled cell sheets, so that a three-dimensional cell structure can be produced with excellent reproducibility and efficiency.
  • Patent Document 4 discloses a method for constructing a three-dimensional cell structure by preparing coated cells in which the entire surface of each cell is covered with an adhesive membrane and adhering the cells via the adhesive membrane. Has been done.
  • a number of methods have been proposed as a technique for manufacturing a three-dimensional cell structure.
  • a three-dimensional cell structure can be temporarily formed by either method, if the vasculature cannot be reproduced inside the three-dimensional cell structure, it is possible to imitate a structure that is truly close to a living body. I can't say.
  • the vessel network is well formed in order to supply necessary nutrients to the cells inside the three-dimensional cell structure.
  • vascular endothelial cells are added to a cell population that constitutes a three-dimensional cell structure.
  • the vascular network also referred to as vascular network
  • the three-dimensional cell structure simply contains vascular endothelial cells, and the vascular network is formed by the surrounding environment in which the vascular endothelial cells are present. is important.
  • VEGF various growth factors
  • VEGF various growth factors
  • the mechanical properties of ECM are the vascular network. It has been reported that it affects the formation of (see Non-Patent Document 1).
  • step A The inventors of the present application have previously collected the cells from step A to obtain a mixture in which the cells are suspended in a solution containing at least a cationic buffer, ECM, and a polymer electrolyte, and the resulting mixture.
  • a step B for forming a cell aggregate on a substrate and a step C for culturing the cells to obtain a three-dimensional cell structure have been developed (Patent Document 5). , 6).
  • Patent Documents 5 and 6 are not largely limited to cell types and can be applied, have excellent ability to form a vasculature network when cells contain endothelial cells, and can also form a layer structure. This is an effective method.
  • vasculature may not be formed in the three-dimensional cell structure by the methods of Patent Documents 5 and 6.
  • an object of the present invention is to provide a technique for producing a three-dimensional cell structure having a stable vasculature.
  • a three-dimensional cell structure having a vascular network comprising a step of collecting a cell aggregate containing a cationic substance, the polymer electrolyte, and the extracellular matrix component, and a step of culturing the cell aggregate in a medium.
  • a method for producing a body, wherein the concentration of extracellular matrix components in the mixture is 1.0 ⁇ 10-8 mg / mL or more and less than 2.5 ⁇ 10 ⁇ 2 mg / mL.
  • the extracellular matrix component is selected from the group consisting of collagen, laminin, fibronectin, vitronectin, elastin, tenascin, entactin, fibrillin, proteoglycan, and combinations thereof, according to [1] or [2]. Production method.
  • the polyelectrolyte is composed of glycosaminoglycan, dextran sulfate, ramnan sulfate, fucoidan, caraginan, polystyrene sulfonic acid, polyacrylamide-2-methylpropane sulfonic acid, polyacrylic acid, and a combination thereof.
  • the production method according to any one of [1] to [3], which is selected.
  • [5] Any of [1] to [4], wherein the concentration of the polyelectrolyte in the mixture is 1.0 ⁇ 10-8 mg / mL or more and less than 2.5 ⁇ 10 ⁇ 2 mg / mL.
  • the liquid portion is removed from the mixture obtained in the step of obtaining the mixture, the obtained cell aggregate is suspended in a solution, and the cell aggregate is obtained from the obtained suspension.
  • the step of collecting the cell aggregates the cell aggregates are collected in a container having a bottom surface and a wall, and the number of the cells present per unit area of the bottom surface is 1.5 ⁇ 10 4 .
  • the number of the cells present per unit area of the bottom surface of the three-dimensional cell structure is 1.5 ⁇ 10 4 cells / mm 2 or more and 1.5 ⁇ 10 5 cells / mm 2 or less.
  • the three-dimensional cell structure according to. [10] The three-dimensional cell structure according to [8] or [9], which has a thickness of 5 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less.
  • the present invention comprises a step of mixing a cell population containing at least endothelial cells, a cationic substance, an extracellular matrix component, and a polymer electrolyte to obtain a mixture, and the resulting mixture.
  • the method for producing a steric cell structure having the above, wherein the concentration of the extracellular matrix component in the mixture is 1.0 ⁇ 10-8 mg / mL or more and less than 2.5 ⁇ 10 ⁇ 2 mg / mL. Provides a manufacturing method.
  • the total length of the vessels constituting the vessel network is 5,000 ⁇ m / mm 2 or more, for example, 5,200 ⁇ m. It may be / mm 2 or more, for example, 5,400 ⁇ m / mm 2 or more.
  • the total length of the vessels constituting the vessel network is measured by the following method.
  • a fluorescence microscope image of a three-dimensional cell structure is taken with a fluorescence microscope (for example, PerkinElmer's high-content cofocal imaging system Operatta CLS), and if the culture vessel is a 96-well well plate, at least 4.26 mm ⁇ 4.
  • an image having a range of at least 6.5 mm ⁇ 6.5 mm or more is analyzed using the cell structure image software Harmony (registered trademark, manufactured by PerkinElmer). More specifically, the culture vessel is designated as the ROI, or the three-dimensional cell structure is stained with DAPI (4', 6-diamidino 2-phenylindole) and the ROI is designated.
  • a threshold for the fluorescence intensity of the vessel is set for each image. Regions above the threshold and small in size (for example, 5 ⁇ m 2 or less) are excluded as noise. Then, the total length in the region above the threshold value of the fluorescence intensity is measured and used as the total length of the vasculature.
  • the morphology of the three-dimensional cell structure is not particularly limited, and for example, even a three-dimensional cell structure formed by culturing cells in a scaffold composed of a natural biopolymer such as collagen or a synthetic polymer. It may be a cell aggregate (also referred to as a spheroid), or it may be a sheet-like cell structure.
  • three-dimensional cell structure means an aggregate of three-dimensional cells containing at least one type of cell.
  • the morphology of the three-dimensional cell structure includes biological tissue models such as skin, hair, bone, cartilage, teeth, cornea, blood vessels, lymph vessels, heart, liver, pancreas, nerves, and esophagus, and gastric cancer, esophageal cancer, and colon. Examples include, but are not limited to, solid cancer models such as cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, renal cell cancer, and liver cancer.
  • the production method of the present embodiment is a step (A) of mixing at least a cell population containing endothelial cells, a cationic substance, an extracellular matrix component, and a polymer electrolyte to obtain a mixture, and the obtained above.
  • the cell population contains at least endothelial cells.
  • the endothelial cells vascular endothelial cells are preferable.
  • the origin of the cells is not particularly limited, and examples thereof include humans, monkeys, dogs, cats, rabbits, pigs, cows, mice, and rats.
  • the cells other than the endothelial cells are not particularly limited, and may be, for example, somatic cells derived from bone, muscle, viscera, nerve, brain, bone, skin, blood, etc., or germ cells. Further, the cells may be induced pluripotent stem cell cells (iPS cells) or embryonic stem cells (ES cells). Alternatively, the cells may be cultured cells such as primary cultured cells, subcultured cells and cell line cells. The cell population may contain one type of cell or may contain a plurality of types of cells.
  • cells include cancer cells such as nerve cells, dendritic cells, immune cells, vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, fibroblasts, and hepatoma cells, epithelial cells, myocardial cells, hepatocytes, pancreatic islet cells, and tissue stem cells. , And smooth muscle cells, but are not limited thereto.
  • cancer cells such as nerve cells, dendritic cells, immune cells, vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, fibroblasts, and hepatoma cells, epithelial cells, myocardial cells, hepatocytes, pancreatic islet cells, and tissue stem cells.
  • smooth muscle cells but are not limited thereto.
  • step (A) a cell population containing at least endothelial cells, a cationic substance, a polyelectrolyte, and an extracellular matrix component are mixed to obtain a mixture.
  • the extracellular matrix component By including the extracellular matrix component in the mixture, it tends to be easy to obtain a thick cell structure, but by lowering the concentration of the extracellular matrix component in the mixture, the cell structure having a vasculature becomes stable. Easy to obtain.
  • Cationic substances include tris-hydrochloride buffer, tris-maleic acid buffer, bis-tris-buffer, cationic buffer such as HEPES, ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, polyvinylamine, polyallylamine, polylysine. , Polyhistidine, polyarginine and the like, but are not limited thereto. Of these, a cationic buffer solution is preferable, and a Tris-hydrochloric acid buffer solution is more preferable.
  • the concentration of the cationic substance in the step (A) is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • the concentration of the cationic substance used in this embodiment is preferably 10 to 100 mM, for example, 20 to 90 mM, 30 to 80 mM, or 40 to 70 mM. For example, it may be 45 to 60 mM.
  • the pH of the cationic buffer is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • the pH of the cationic buffer used in this embodiment is preferably 6.0 to 8.0.
  • the pH of the cationic buffer used in this embodiment is 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7. It may be 8, 7.9, or 8.0.
  • the pH of the cationic buffer used in this embodiment is more preferably 7.2 to 7.6, and even more preferably 7.4.
  • any component constituting the extracellular matrix can be used as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • the extracellular matrix component includes, but is not limited to, collagen, laminin, fibronectin, vitronectin, elastin, tenascin, entactin, fibrillin, proteoglycan and the like. These extracellular matrix components may be used alone or in combination.
  • Proteoglycans include, but are not limited to, chondroitin sulfate proteoglycan, heparan sulfate proteoglycan, keratan sulfate proteoglycan, and dermatan sulfate proteoglycan.
  • the extracellular matrix component used in this embodiment is collagen, laminin, fibronectin, and more preferably collagen. Modifications and variants of the extracellular matrix components described above may be used as long as they do not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • the concentration of the extracellular matrix component used in this embodiment is 1.0 ⁇ 10-8 mg / mL or more and less than 2.5 ⁇ 10 ⁇ 2 mg / mL.
  • the concentration of the extracellular matrix component used in this embodiment is preferably 2.6 ⁇ 10 -8 mg / mL or more and 1 ⁇ 10 ⁇ 2 mg / mL or less, for example, 1.25 ⁇ 10 ⁇ 2 mg.
  • / ML 1 x 10 -2 mg / mL, 2.0 x 10 -3 mg / mL, 4.0 x 10 -4 mg / mL, 8.0 x 10-5 mg / mL, 1.6 x 10 -5 mg / mL, 3.2 x 10-6 mg / mL, 6.4 x 10-7 mg / mL, 1.3 x 10-7 mg / mL, and 2.6 x 10-8 mg / mL Is.
  • concentration of the extracellular matrix component used in this embodiment is 1.0 ⁇ 10-8 mg / mL or more and less than 2.5 ⁇ 10 ⁇ 2 mg / mL, a solid having a stable vasculature network.
  • the extracellular matrix component may be dissolved in an appropriate solvent and used.
  • solvents include, but are not limited to, water, buffers, acetic acid and media.
  • the extracellular matrix component is preferably dissolved in a medium or a buffer solution.
  • the medium is not particularly limited, but basal media such as DMEM, E-MEM, MEM ⁇ , RPMI-1640, Mccoy'5a, Ham's F-12, and CS (fetal bovine serum), FBS as these basal media.
  • basal media such as DMEM, E-MEM, MEM ⁇ , RPMI-1640, Mccoy'5a, Ham's F-12, and CS (fetal bovine serum), FBS as these basal media.
  • serums such as (fetal bovine serum) and HBS (horse fetal serum) is added so as to be about 1 to 20% by volume.
  • the buffer include Tris-hydrochloric acid buffer, Tris-maleic acid buffer, Bis-Tris-buffer,
  • polymer electrolyte means a polymer having a dissociable functional group in the polymer chain.
  • any polyelectrolyte can be used as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • High molecular weight electrolytes include heparin, chondroitin sulfate (eg, chondroitin 4-sulfate, chondroitin 6-sulfate), heparan sulfate, dermatane sulfate, keratane sulfate, and glycosaminoglycans such as hyaluronic acid; dextran sulfate and ramnan sulfate.
  • Fucoidan caraginan, polystyrene sulfonic acid, polyacrylamide-2-methylpropane sulfonic acid, polyacrylic acid and the like, but are not limited thereto. These polymer electrolytes may be used alone or in combination.
  • the polyelectrolyte used in this embodiment is preferably glycosaminoglycan. Further, the polyelectrolyte used in the present embodiment is more preferably heparin, dextran sulfate, chondroitin sulfate, or dermatan sulfate. The polyelectrolyte used in this embodiment is more preferably heparin. Derivatives of the above-mentioned polyelectrolytes may be used as long as they do not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • the concentration of the polyelectrolyte is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • the concentration of the polyelectrolyte used in this embodiment is preferably more than 0 mg / mL and less than 1.0 mg / mL.
  • the concentration of the polyelectrolyte used in this embodiment is preferably 1.0 ⁇ 10-8 mg / mL or more and less than 2.5 ⁇ 10 ⁇ 2 mg / mL.
  • the concentration of the extracellular matrix component used in this embodiment is more preferably 2.6 ⁇ 10 -8 mg / mL or more and 1 ⁇ 10 ⁇ 2 mg / mL or less, for example, 1 ⁇ 10 ⁇ 2 mg / mL.
  • the concentration of the extracellular matrix component used in the present embodiment is 1.0 ⁇ 10-8 mg / mL or more and less than 2.5 ⁇ 10 ⁇ 2 mg / mL, it has a more stable vasculature.
  • a three-dimensional cell structure can be produced.
  • the polymer electrolyte may be dissolved in an appropriate solvent and used.
  • solvents include, but are not limited to, water, buffers and media.
  • a cationic buffer solution is used as the above-mentioned cationic substance
  • the polyelectrolyte may be dissolved in the cationic buffer solution or the medium and used.
  • Cationic buffers and media include buffers and media that can be used to lyse extracellular matrix components.
  • One aspect of the present invention is the use of a polyelectrolyte in a method for producing a three-dimensional cell structure having a vasculature.
  • the method for producing the three-dimensional cell structure is as described above.
  • this polyelectrolyte include the above-mentioned polyelectrolytes, but heparin is preferable.
  • the compounding ratio of the polymer electrolyte and the extracellular matrix component is preferably 1: 2 to 2: 1.
  • the compounding ratio of the polyelectrolyte used in the present embodiment to the extracellular matrix component is more preferably 1: 1.5 to 1.5: 1.
  • the compounding ratio of the polyelectrolyte used in the present embodiment and the extracellular matrix component is more preferably 1: 1.
  • step (A) mixing of a cell population containing at least endothelial cells, a cationic substance, a polyelectrolyte, and an extracellular matrix component is carried out in a suitable container such as a dish, tube, flask, bottle, and plate. Can be done with.
  • step (B) a cell aggregate containing a cell population, a cationic substance, a polyelectrolyte, and an extracellular matrix component is collected from the mixture obtained in step (A).
  • the term "cell aggregate” means a population of cells.
  • the cell aggregate also includes a cell precipitate obtained by centrifugation, filtration, or the like.
  • the cell aggregate is a slurry-like viscous body.
  • “Slurry-like viscous material” means Akihiro Nishiguchi et al., Cell-cell crosslinking by bio-molecular recognition of heparin-based layer-by-layer nanofilms, Macromol Biosci., 15 (3), 312-317, Refers to a gel-like cell aggregate as described in 2015.
  • step (B) As a means for collecting cells in the step (B), a method known to those skilled in the art can be used. Cells may be collected, for example, by centrifugation, magnetic separation, or filtration. The conditions for centrifugation are not particularly limited as long as they do not adversely affect the growth of cells. For example, the mixture obtained in step (A) is seeded in a cell culture insert and subjected to centrifugation at 10 ° C. and 400 ⁇ g for 1 minute to collect cells. Alternatively, cells may be collected by spontaneous sedimentation.
  • step (B) the liquid portion is removed from the mixture obtained in step (A), the obtained cell aggregate is suspended in a solution, and the cell aggregate is collected from the obtained suspension (step (B). It may be B').
  • a method known to those skilled in the art can be used as a means for removing the liquid portion from the mixture obtained in the step (A) to obtain a cell aggregate.
  • the liquid portion may be removed by centrifugation or filtration. The conditions for centrifugation are not particularly limited as long as they do not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • the liquid moiety is removed by subjecting the microtube containing the mixture to centrifugation at 400-1,000 xg for 1 minute at room temperature to separate the liquid moiety and the cell aggregate.
  • the liquid portion may be removed after the cells have been collected by natural sedimentation.
  • a method known to those skilled in the art can be used as a means for collecting the cell aggregate from the suspension obtained by suspending the cell aggregate in the solution.
  • cell aggregates can be obtained in the container.
  • cell aggregates may be obtained in the container by natural sedimentation.
  • the cell aggregate in step (B) or step (B') may be layered.
  • the number of collected cells is, for example, when a cell aggregate is obtained in a container having a bottom surface and a wall, the number of cells existing per unit area of the bottom surface is 1.5 ⁇ 10. 4 pieces / mm 2 or more 1.5 x 10 5 pieces / mm 2 or less, for example 3.0 x 10 4 pieces / mm 2 or more 1.0 x 10 5 pieces / mm 2 or less 4.0 x 10 4 pieces / mm 2 or more 1.5 x 10 5 pieces / mm 2 or less, 5.0 x 10 4 pieces / mm 2 or more 1.3 x 10 5 pieces / mm 2 or less, 6.1 x 10 4 pieces / mm 2 or more 1 .3 ⁇ 10 5 pieces / mm 2 or less, 7.5 ⁇ 10 4 pieces / mm 2 or more 1.0 ⁇ 10 5 pieces / mm 2 or less, or 7.5 ⁇ 10 4 pieces / mm 2 or more 9.6 ⁇ It is preferably 10 4 pieces / mm 2 or more 1.5 x
  • step (C) the above cell aggregate is cultured in a medium to obtain a three-dimensional cell structure.
  • Cell aggregates may be suspended in solution prior to culturing.
  • the solution is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of three-dimensional cell structures.
  • a cell culture medium, a buffer solution, or the like suitable for the cells constituting the cell aggregate can be used, and the cell culture medium is preferable.
  • the cell culture medium and buffer include a medium and a buffer that can be used to dissolve extracellular matrix components. Suspension of cell aggregates can be done in suitable containers such as dishes, tubes, flasks, bottles, and plates.
  • the cell When the cell aggregate is suspended in a solution, the cell may be precipitated before culturing to form a cell precipitate on the substrate.
  • the base material include a culture vessel for use in culturing cells.
  • the culture container may be a container having a material and a shape usually used for culturing cells and microorganisms. Examples of the material of the culture container include, but are not limited to, glass, stainless steel, plastic and the like. Examples of the culture vessel include, but are not limited to, dishes, tubes, flasks, bottles and plates.
  • the substrate is, for example, a material that does not allow cells in the liquid to pass through but allows the liquid to pass through.
  • the base material is preferably a permeable membrane. Containers having such a permeable membrane include, but are limited to, cell culture inserts such as Transwell® inserts, Netwell inserts, Falcon® cell culture inserts, and Millicell® cell culture inserts. Not done.
  • cells may be collected by centrifugation, magnetic separation, filtration, or the like.
  • the conditions for centrifugation are not particularly limited as long as they do not adversely affect the growth of cells.
  • cells may be collected by seeding the mixture or suspension into a cell culture insert and subjecting it to centrifugation at 400 xg for 1 minute at 10 ° C.
  • cells may be collected by spontaneous sedimentation.
  • the collected cells may form a layered structure.
  • the number of cell aggregates, or cells suspended when the cell aggregates are suspended is 1,000 cells / mm 2 or more, for example 10,000 cells / mm 2 or more, for example 20,000 cells / mm 2 . As described above, for example, it is preferable to seed at a cell density of 25,000 cells / mm 2 or more. Further, the cells have a cell density of, for example, 1,000,000 cells / mm 2 or less, for example 500,000 cells / mm 2 or less, for example 200,000 cells / mm 2 or less, for example 100,000 cells / mm 2 or less. Can be sown. By carrying out the step of suspending the cell aggregate in the solution and the step of precipitating the cells, a more homogeneous three-dimensional cell structure can be obtained.
  • the cells can be cultured under culture conditions suitable for the cells to be cultured.
  • the cell culture medium is not particularly limited, but basal media such as DMEM, E-MEM, MEM ⁇ , RPMI-1640, Mccoy'5a, Ham's F-12, and CS (fetal bovine serum) as these basal media.
  • basal media such as DMEM, E-MEM, MEM ⁇ , RPMI-1640, Mccoy'5a, Ham's F-12, and CS (fetal bovine serum) as these basal media.
  • basal media such as DMEM, E-MEM, MEM ⁇ , RPMI-1640, Mccoy'5a, Ham's F-12, and CS (fetal bovine serum) as these basal media.
  • basal media such as DMEM, E-MEM, MEM ⁇ , RPMI-1640, Mccoy'5a, Ham's F-12, and CS (fetal bovine serum) as these basal media.
  • FBS feta
  • a substance for suppressing deformation of the constructed three-dimensional cell structure for example, contraction of tissue or detachment of tissue ends
  • examples of such substances include, but are not limited to, Y-27632, which is a selective ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase / Rho-binding kinase) inhibitor.
  • the step (C) is performed after the step (A) and the step (B) or the step (B') are performed at least once.
  • the step (C) it is possible to stack the cell aggregate or the cell precipitate. This makes it possible to construct a three-dimensional cell structure having a plurality of layers.
  • a plurality of types of cells may be used to construct a three-dimensional cell structure constructed by different types of cells.
  • vascular network refers to a network-like tubular structure having a large number of bifurcation points, such as a vascular network or a lymphatic network in a living tissue.
  • a three-dimensional cell structure having a stable vasculature can be produced, and a three-dimensional cell structure having a sufficient thickness can be produced.
  • the thickness of the three-dimensional cell structure produced by the production method in the present embodiment may be 5 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less, for example, 10 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less, 20 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, 20 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less, or 25 ⁇ m or more. It is 45 ⁇ m or less.
  • the thickness is kept at 5 to 100 ⁇ m even though the extracellular matrix component is small.
  • a section image of a cross section of the three-dimensional cell structure in the thickness direction is observed at a magnification of 100 to 200 times.
  • the three-dimensional cell structure according to one embodiment of the present invention is a three-dimensional cell structure containing at least a cell population containing endothelial cells, a cationic substance, a polymer electrolyte, and an extracellular matrix component, and having a vasculature. Therefore, the content of the extracellular matrix component is 0.01% by mass or more and 30% by mass or less.
  • the three-dimensional cell structure of the present embodiment is produced by the production method of the present embodiment.
  • the content of the extracellular matrix component contained in the three-dimensional cell structure of the present embodiment is 0.01% by mass or more and 30% by mass or less, preferably 0.1% by mass or more and 30% by mass or less, for example, 1% by mass. % Or more and 30% by mass or less, 5% by mass or more and 30% by mass or less, 10% by mass or more and 30% by mass or less, 20% by mass or more and 30% by mass or less, or 20% by mass or more and 25% by mass or less.
  • a vascular network is stably formed in the three-dimensional cell structure. It can be made into a three-dimensional cell structure having a sufficient thickness.
  • the number of the cells present per unit area of the bottom surface of the three-dimensional cell structure of the present embodiment is 1.5 ⁇ 10 4 cells / mm 2 or more and 1.5 ⁇ 10 5 cells / mm 2 or less, for example, 3. 0 x 10 4 pieces / mm 2 or more 1.0 x 10 5 pieces / mm 2 or less 4.0 x 10 4 pieces / mm 2 or more 1.5 x 10 5 pieces / mm 2 or less, 5.0 x 10 4 Pieces / mm 2 or more 1.3 x 10 5 pieces / mm 2 or less, 6.1 x 10 4 pieces / mm 2 or more 1.3 x 10 5 pieces / mm 2 or less, 7.5 x 10 4 pieces / mm 2 It is preferably 1.0 ⁇ 10 5 pieces / mm 2 or less, or 7.5 ⁇ 10 4 pieces / mm 2 or more and 9.6 ⁇ 10 4 pieces / mm 2 or less.
  • the thickness of the three-dimensional cell structure of the present embodiment may be 5 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less, and may be, for example, 10 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less, 20 ⁇ m or more and 100 ⁇ m or less, 20 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less, or 25 ⁇ m or more and 45 ⁇ m or less. ..
  • the three-dimensional cell structure of the present embodiment has a stable vasculature and a sufficient thickness, and is therefore useful as a model that imitates a structure close to a living body.
  • the invention includes the following aspects: [1] A step of mixing a cell population containing at least endothelial cells, a cationic substance, a polymer electrolyte, and an extracellular matrix component to obtain a mixture, and from the obtained mixture, the cell population, said.
  • a three-dimensional cell structure having a vasculature including a step of collecting a cell aggregate containing a cationic substance, the polymer electrolyte, and the extracellular matrix component, and a step of culturing the cell aggregate in a medium.
  • the extracellular matrix component is selected from the group consisting of collagen, laminin and fibronectin and combinations thereof, and the high molecular weight electrolyte is glycosaminoglycan, and the extracellular matrix in the mixture.
  • a production method in which the concentration of the component is 1.0 ⁇ 10-8 mg / mL or more and less than 2.5 ⁇ 10-2 mg / mL.
  • the cell aggregates are collected in a container having a bottom surface and a wall, and the number of the cells present per unit area of the bottom surface is 1.5 ⁇ 10 4 .
  • the manufacturing method according to any one of [1] to [6], wherein / mm 2 or more and 1.5 ⁇ 10 5 pieces / mm 2 or less.
  • a three-dimensional cell structure containing at least a cell population containing endothelial cells, a cationic substance, a polymer electrolyte, and an extracellular matrix component and having a vasculature, wherein the extracellular matrix component is collagen.
  • the polymer electrolyte is glycosaminoglycan, and the content of the extracellular matrix component is 0.01% by mass or more and 30% by mass or less.
  • Three-dimensional cell structure [9] The number of the cells present per unit area of the bottom surface of the three-dimensional cell structure is 1.5 ⁇ 10 4 cells / mm 2 or more and 1.5 ⁇ 10 5 cells / mm 2 or less. 8] The three-dimensional cell structure according to. [10] The three-dimensional cell structure according to [8] or [9], which has a thickness of 5 ⁇ m or more and 200 ⁇ m or less.
  • Example 1 (Formation of three-dimensional cell structure 1) 1.38 ⁇ 10 7 cells of normal human skin fibroblasts (NHDF) and 2.1 ⁇ 10 5 cells of GFP-introduced human umbilical vein endothelial cells (GFP-HUVEC) at 0.8 mg / mL, 0.4 mg / mL or 0.2 mg / mL heparin / 50 mM Tris-hydrochloride buffer (pH 7.4) 0.5 mL and collagen / 50 mM Tris-hydrochloride buffer (pH 7.4) 0.5 mL of the same concentration, 10% It was suspended in a mixture of 1 mL of Dalveco-modified Eagle's medium (DMEM medium) containing bovine fetal serum (FBS).
  • DMEM medium Dalveco-modified Eagle's medium
  • FBS bovine fetal serum
  • the final concentration of collagen and the final concentration of heparin were 0.2 mg / mL, 0.1 mg / mL, and 0.05 mg / mL, respectively.
  • a mixed solution having a final concentration of collagen and a final concentration of heparin of 0.05 mg / mL was further diluted 2-fold in DMEM medium, and the final concentration of collagen and the final concentration of heparin were 0.
  • a mixed solution having a final concentration of collagen and a final concentration of heparin of 0.05 mg / mL, respectively, was further diluted 5-fold stepwise with DMEM medium, and the final concentration of collagen and the final concentration of heparin were 1.
  • the entire amount of the resulting mixture was seeded in 96-well cell culture inserts (bottom area per well was 0.143 cm 2 ) and centrifuged at room temperature, 400 xg for 1 minute. This formed a cell layer on the cell culture insert.
  • the number of cells seeded in the cell culture insert was 9.0 ⁇ 10 5 for NHDF and 1.35 ⁇ 10 4 for GFP-HUVEC.
  • the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% O 2 ) for 24 hours (the time when this culture was started is defined as the start of culture). After culturing for 24 hours from the start of culturing, the medium was replaced with DMEM containing 10% FBS. After that, the medium was exchanged 48 hours and 120 hours after the start of the culture, and the culture was carried out for 8 days.
  • ⁇ Observation of three-dimensional cell structure >> Eight days after the start of the culture, the three-dimensional cell structure was fixed with a 10% formalin solution, and then a CD31 antibody (DAKO, JC70A M082329) and a secondary antibody (Invitrogen, A-11001) were used. , The vascular endothelial cells were fluorescently labeled, and the presence or absence of vascular network structure formation was observed using a fluorescence microscope (Operatta CLS, manufactured by PerkinElmer). FIG.
  • the final concentration of collagen and the final concentration of heparin are 0.2 mg / mL, 0.1 mg / mL, 0.05 mg / mL, 0.025 mg / mL, or 0.0125 mg / mL, respectively. It is a photograph which shows the result of the microscope observation.
  • the final concentration of collagen and the final concentration of heparin are 0.05 mg / mL, 1.0 ⁇ 10 ⁇ 2 mg / mL, 2.0 ⁇ 10 -3 mg / mL, 4.0 ⁇ 10- , respectively.
  • heparin / collagen final concentration indicates the final concentration of heparin and collagen. From the results of microscopic observations in FIGS. 1 and 2, the presence or absence of vascular network structure formation was evaluated. The evaluation was performed according to the following criteria. The results are shown in Table 1.
  • the vascular network structure is formed by the whole three-dimensional cell structure: A Vascular network structure is not formed in part of the three-dimensional cell structure: B Vascular network structure is not formed throughout the three-dimensional cell structure: C
  • the thickness of the three-dimensional cell structure It was clarified that can be more than 20 ⁇ m.
  • the total amount of the obtained mixtures 2-1 and 2-1 were seeded in 96-well cell culture inserts (bottom area per well was 0.143 cm 2 ), respectively, at room temperature, 400 ⁇ . Centrifuge at g for 1 minute. This formed a cell layer on the cell culture insert. The number of cells seeded in the cell culture insert was 9.0 ⁇ 10 5 for NHDF and 1.35 ⁇ 10 4 for GFP-HUVEC.
  • the cells were cultured in a CO 2 incubator (37 ° C., 5% O 2 ) for 24 hours (the time when this culture was started is defined as the start of culture). After culturing for 24 hours from the start of culturing, the medium was replaced with DMEM containing 10% FBS. After that, the medium was exchanged 48 hours and 120 hours after the start of the culture, and the culture was carried out for 8 days.
  • a threshold for the fluorescence intensity of the vessels was set for each image. Regions above the threshold and small in size (5 ⁇ m 2 or less) were excluded as noise. Then, the total area in the region above the threshold value of the fluorescence intensity was measured and used as the stained area of the vessel network.
  • Table 3 shows the results of evaluation of the stained area of the vascular network and the formation of the vascular network structure 5 days and 8 days after the start of culturing the mixtures 2-1 and 2-2.
  • the stained area of the vascular network is described as a relative ratio when the stained area of the vascular network after 8 days from the start of culturing the mixture 2-1 is 100%.
  • FIG. 3 shows the results of fluorescence microscopic observation of the three-dimensional cell structure after 5 days and 8 days from the start of culturing the mixtures 2-1 and 2-2.
  • the vascular network structure is a three-dimensional cell structure. It was confirmed that it may not be formed in some parts.

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Abstract

少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、カチオン性物質と、高分子電解質と、細胞外マトリックス成分と、を混合して混合物を得る工程と、得られた前記混合物から、前記細胞、前記カチオン性物質、前記高分子電解質、及び前記細胞外マトリックス成分を含む細胞集合体を集める工程と、前記細胞集合体を培地中で培養する工程と、を含む、脈管網を有する立体的細胞構造体の製造方法であって、前記混合物中における細胞外マトリックス成分の濃度が、１．０×１０－８ｍｇ／ｍＬ以上２．５×１０－２ｍｇ／ｍＬ未満である、製造方法。

Description

立体的細胞構造体の製造方法、及び立体的細胞構造体
　本発明は、立体的細胞構造体の製造方法、及び立体的細胞構造体に関する。
　本願は、２０２０年８月２０日に日本に出願された特願２０２０－１３９２６０号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、再生医療はもとより、生体に近い環境が求められる薬剤のアッセイ系において、平板上で成育させた細胞よりも立体的に組織化させた立体的細胞構造体を使用することの優位性が示されており、生体外で立体的細胞構造体を構築するための様々な技術が開発されている。例えば、細胞が付着できない表面基板上で細胞塊を形成させる方法、液滴中で細胞塊を形成させる方法及び透過性膜上に細胞を集積させる方法等が開発されている。
　このような細胞の組織化を維持するためには、細胞間の結合や足場形成のために、生体自身が産生するコラーゲン等の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）が必要である。そのため、人為的に細胞組織を構築する際にＥＣＭを外部から添加することが検討されてきた。
　例えば、特許文献１には、酵素処理等により単離した細胞を、代表的なＥＣＭであり、細胞保護作用を有する水溶性高分子である、コラーゲン等と接触させた後、三次元集合体として培養する方法が開示されている。この方法によれば、培養中に細胞周辺で水溶性高分子のゲルが形成される。
　また、特許文献２には、温度応答性の樹脂であるｐｏｌｙ（Ｎ－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）（ＰＩＰＡＡｍ）を表面に固定化した培養皿を用いて細胞シートを作製し、作製した細胞シートを積層することで立体的細胞構造体を構築する方法が開示されている。
　また、特許文献３には、細胞層の形成する工程と、形成した細胞層を第１物質含有液と第２物質含有液とに交互に接触させる工程とを繰り返し行い、ナノメートルサイズの厚みのＥＣＭを介して連続的に細胞層を積層することで、立体的細胞構造体を構築する方法が開示されている。この方法では、単層の細胞シートの剥離や剥離した細胞シートの重ね合わせ等が不要であるため、優れた再現性・効率で立体的細胞構造体を製造できるとされている。
　また、特許文献４には、個々の細胞の表面全体が接着膜で被覆された被覆細胞を作製し、接着膜を介して細胞を接着させることにより、立体的細胞構造体を構築する方法が開示されている。
　以上の通り、立体的細胞構造体の製造技術としていくつもの手法が提案されている。しかしながら、いずれかの手法によって立体的細胞構造体を一時的に形成できたとしても、立体的細胞構造体の内部に脈管網を再現できなければ、真に生体に近い構造を模倣できたとはいえない。特に立体的細胞構造体の場合、立体的細胞構造体の内部の細胞にまで必要な栄養を供給するためにも脈管網がよく形成されていることが求められる。
　一般的に、脈管網を形成させるためには、立体的細胞構造体を構成する細胞集団に血管内皮細胞を加える。しかしながら、立体的細胞構造体が単に血管内皮細胞を含有しているだけでは必ずしも脈管網（血管網ともいう）は形成されず、血管網の形成には、血管内皮細胞の存在する周辺の環境が重要である。
　立体的細胞構造体の内部の血管網の形成に影響を与える因子としては、ＶＥＧＦ等の各種成長因子等様々な因子が知られているが、その一つとして、ＥＣＭの機械的性質が血管網の形成に影響を及ぼすことが報告されている（非特許文献１を参照）。
　本願発明者らは、以前に、細胞が、カチオン性緩衝液、ＥＣＭ、及び高分子電解質を少なくとも含む溶液に懸濁されている混合物を得るＡ工程と、得られた前記混合物から前記細胞を集め、基材上に細胞集合体を形成するＢ工程と、前記細胞を培養し、立体的細胞構造体を得るＣ工程と、を含む、立体的細胞構造体の製造技術を開発した（特許文献５、６を参照）。
特許第２８２４０８１号公報 国際公開第２００２／００８３８７号 特許第４９１９４６４号公報 特許第５８５０４１９号公報 特許第６４２７８３６号公報 特許第６６３９６３４号公報
Rouwkema J. and Khademhosseini A., Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks, Trends Biotechnol, 34 (9), 733-745, 2016.
　特許文献５及び６に記載の方法は、細胞種に大きく限定されず適用可能であり、細胞が内皮細胞を含む場合の脈管網の形成能に優れ、且つ層構成を形成することも可能な有効な手法である。
　しかしながら、本発明者らは、特許文献５及び６の方法では、立体的細胞構造体において脈管網が形成されない場合があることを見出した。
　そこで、本発明は、安定的に脈管網を有する立体的細胞構造体を製造する技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］　少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、カチオン性物質と、高分子電解質と、細胞外マトリックス成分と、を混合して混合物を得る工程と、得られた前記混合物から、前記細胞集団、前記カチオン性物質、前記高分子電解質、及び前記細胞外マトリックス成分を含む細胞集合体を集める工程と、前記細胞集合体を培地中で培養する工程と、を含む、脈管網を有する立体的細胞構造体の製造方法であって、前記混合物中における細胞外マトリックス成分の濃度が、１．０×１０－８ｍｇ／ｍＬ以上２．５×１０－２ｍｇ／ｍＬ未満である、製造方法。
　［２］　前記培養する工程を、前記混合物を得る工程と、前記細胞集合体を集める工程とを、少なくとも１回行った後に行う、［１］に記載の製造方法。
　［３］　前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、プロテオグリカン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、［１］又は［２］に記載の製造方法。
　［４］　前記高分子電解質が、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、［１］～［３］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［５］　前記混合物中における前記高分子電解質の濃度が、１．０×１０－８ｍｇ／ｍＬ以上２．５×１０－２ｍｇ／ｍＬ未満である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［６］　前記細胞集合体を集める工程が、前記混合物を得る工程で得られた混合物から液体部分を除去し、得られた細胞集合体を溶液に懸濁し、得られた懸濁液から細胞集合体を集める工程である、［１］～［５］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［７］　前記細胞集合体を集める工程において、底面と壁とを有する容器内に前記細胞集合体を集め、前記底面の単位面積当たりに存在する前記細胞の数が、１．５×１０４個／ｍｍ２以上１．５×１０５個／ｍｍ２以下である、［１］～［６］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［８］　少なくとも内皮細胞を含む細胞集団、カチオン性物質、高分子電解質、及び細胞外マトリックス成分を含み、脈管網を有する立体的細胞構造体であって、前記細胞外マトリックス成分の含有量が、０．０１質量％以上３０質量％以下である、立体的細胞構造体。
　［９］　前記立体的細胞構造体の底面の単位面積当たりに存在する前記細胞の数が、１．５×１０４個／ｍｍ２以上１．５×１０５個／ｍｍ２以下である、［８］に記載の立体的細胞構造体。
　［１０］　厚みが５μｍ以上２００μｍ以下である、［８］又は［９］に記載の立体的細胞構造体。
　本発明によれば、安定的に脈管網を有する立体的細胞構造体を製造する技術を提供することができる。
実験例１において撮影した、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度が、それぞれ０．２ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０２５ｍｇ／ｍＬ、０．０１２５ｍｇ／ｍＬの場合の立体的細胞構造体の蛍光顕微鏡写真である。 実験例１において撮影した、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度が、それぞれ０．０５ｍｇ／ｍＬ、１．０×１０－２ｍｇ／ｍＬ、２．０×１０－３ｍｇ／ｍＬ、４．０×１０－４ｍｇ／ｍＬ、８．０×１０－５ｍｇ／ｍＬ、１．６×１０－５ｍｇ／ｍＬ、３．２×１０－６ｍｇ／ｍＬ、６．４×１０－７ｍｇ／ｍＬ、１．３×１０－７ｍｇ／ｍＬ、２．６×１０－８ｍｇ／ｍＬの場合の立体的細胞構造体の蛍光顕微鏡写真である。 実験例２において撮影した混合物２－１及び２－２の培養開始時から５日間経過後及び８日間経過後の立体的細胞構造体の蛍光顕微鏡写真である。
　一実施形態において、本発明は、少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、カチオン性物質と、細胞外マトリックス成分と、高分子電解質と、を混合して混合物を得る工程と、得られた前記混合物から、前記細胞集団、前記カチオン性物質、前記高分子電解質、及び前記細胞外マトリックス成分を含む細胞集合体を集める工程と、前記細胞集合体を培地中で培養する工程と、を含む、脈管網を有する立体的細胞構造体の製造方法であって、前記混合物中における細胞外マトリックス成分の濃度が、１．０×１０－８ｍｇ／ｍＬ以上２．５×１０－２ｍｇ／ｍＬ未満である、製造方法を提供する。
　本実施形態の製造方法によれば、安定的に脈管網を有する立体的細胞構造体を製造する技術を提供することができる。
　また、本実施形態の製造方法により製造される立体的細胞構造体の脈管網は、脈管網を構成する脈管の合計の長さが、５，０００μｍ／ｍｍ２以上、例えば５，２００μｍ／ｍｍ２以上、例えば５，４００μｍ／ｍｍ２以上であってよい。本明細書において、脈管網を構成する脈管の合計の長さは、以下の方法により測定される。蛍光顕微鏡（例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、ハイコンテント共焦点イメージングシステム　Ｏｐｅｒｅｔｔａ　ＣＬＳ）により、立体的細胞構造体の蛍光顕微鏡写真を撮像し、培養容器が９６穴ウェルプレートであれば少なくとも４．２６ｍｍ×４．２６ｍｍ以上の範囲、２４穴ウェルプレートであれば、少なくとも６．５ｍｍ×６．５ｍｍ以上の範囲の画像を細胞構造画像ソフトＨａｒｍｏｎｙ（登録商標、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて解析する。より具体的には、培養容器をＲＯＩに指定する、又はＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノー２－フェニルインドール）を用いて立体的細胞構造体を染色し、ＲＯＩを指定する。画像の平坦化によりノイズを除去した後、脈管の蛍光強度の閾値を各画像で設定する。閾値以上の領域で且つサイズが小さい領域（例えば５μｍ２以下）をノイズとして排除する。その後、蛍光強度の閾値以上の領域における合計の長さを測定し、脈管網の合計の長さとする。
　立体的細胞構造体の形態に特に制限は無く、例えば、コラーゲン等の天然生体高分子や合成高分子によって構成されたスキャフォールド内で細胞を培養して形成した立体的細胞構造体であってもよいし、細胞凝集体（スフェロイドともいう）であってもよいし、シート状の細胞構造体であってもよい。
　本明細書において、「立体的細胞構造体」とは、少なくとも１種類の細胞を含む立体的な細胞の集合体を意味する。立体的細胞構造体の形態としては、皮膚、毛髪、骨、軟骨、歯、角膜、血管、リンパ管、心臓、肝臓、膵臓、神経、食道等の生体組織モデル、及び、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎細胞癌、及び肝癌等の固形癌モデルが挙げられるが、これらに限定されない。
　本実施形態の製造方法は、少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、カチオン性物質と、細胞外マトリックス成分と、高分子電解質と、を混合して混合物を得る工程（Ａ）と、得られた前記混合物から、前記細胞集団、前記カチオン性物質、前記高分子電解質、及び前記細胞外マトリックス成分を含む細胞集合体を集める工程（Ｂ）と、前記細胞集合体を培地中で培養する工程（Ｃ）と、を含む。
　工程（Ａ）において、細胞集団は少なくとも内皮細胞を含む。内皮細胞としては血管内皮細胞が好ましい。細胞の由来は特に限定されず、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス、及びラット等が挙げられる。
　内皮細胞以外の細胞は特に限定されず、例えば、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚、又は血液等に由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよい。また、細胞は、誘導多能性幹細胞細胞（ｉＰＳ細胞）又は胚性幹細胞（ＥＳ細胞）であってもよい。あるいは、初代培養細胞、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。細胞集団は、１種類の細胞を含んでいてもよいし、複数種類の細胞を含んでいてもよい。
　細胞としては、例えば、神経細胞、樹状細胞、免疫細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、線維芽細胞、肝癌細胞等の癌細胞、上皮細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、組織幹細胞、及び平滑筋細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
　工程（Ａ）において、少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、カチオン性物質と、高分子電解質と、細胞外マトリックス成分と、を混合して混合物を得る。混合物における細胞外マトリックス成分を含むことにより、厚い細胞構造体が得られやすい傾向にあるが、混合物における細胞外マトリックス成分の濃度を低くすることにより、脈管網を有する細胞構造体が安定的に得られやすい。
　本実地形態で用いられるカチオン性物質としては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の正電荷を有する物質を用いることができる。カチオン性物質には、トリス－塩酸緩衝液、トリス－マレイン酸緩衝液、ビス－トリス－緩衝液、ＨＥＰＥＳ等のカチオン性緩衝液、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリリシン、ポリヒスチジン、及びポリアルギニン等が挙げられるが、これらに限定されない。なかでもカチオン性緩衝液が好ましく、トリス－塩酸緩衝液がより好ましい。
　工程（Ａ）におけるカチオン性物質の濃度は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。本実施形態で用いられるカチオン性物質の濃度は１０～１００ｍＭであることが好ましく、例えば２０～９０ｍＭであってもよく、例えば３０～８０ｍＭであってもよく、例えば４０～７０ｍＭであってもよく、例えば４５～６０ｍＭであってもよい。
　カチオン性物質としてカチオン性緩衝液を用いる場合、カチオン性緩衝液のｐＨは、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは６．０～８．０であることが好ましい。例えば、本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、又は８．０であってよい。本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは７．２～７．６であることがより好ましく、７．４であることが更に好ましい。
　本実施形態で用いられる細胞外マトリックス成分としては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を構成する任意の成分を用いることができる。細胞外マトリックス成分には、コラーゲンや、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、及びプロテオグリカン等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞外マトリックス成分は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。プロテオグリカンには、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、及びデルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態で用いられる細胞外マトリックス成分はコラーゲン、ラミニン、フィブロネクチンであり、中でもコラーゲンであることが好ましい。細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックス成分の改変体及びバリアントを用いてもよい。
　本実施形態で用いられる細胞外マトリックス成分の濃度は、１．０×１０－８ｍｇ／ｍＬ以上２．５×１０－２ｍｇ／ｍＬ未満である。本実施形態で用いられる細胞外マトリックス成分の濃度は、２．６×１０－８ｍｇ／ｍＬ以上１×１０－２ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、例えば、１．２５×１０－２ｍｇ／ｍＬ、１×１０－２ｍｇ／ｍＬ、２．０×１０－３ｍｇ／ｍＬ、４．０×１０－４ｍｇ／ｍＬ、８．０×１０－５ｍｇ／ｍＬ、１．６×１０－５ｍｇ／ｍＬ、３．２×１０－６ｍｇ／ｍＬ、６．４×１０－７ｍｇ／ｍＬ、１．３×１０－７ｍｇ／ｍＬ、及び２．６×１０－８ｍｇ／ｍＬである。本実施形態で用いられる細胞外マトリックス成分の濃度が、１．０×１０－８ｍｇ／ｍＬ以上２．５×１０－２ｍｇ／ｍＬ未満であることによって、安定的に脈管網を有する立体的細胞構造体を製造することができる。本実施形態において、細胞外マトリックス成分を適切な溶媒に溶解して用いてもよい。溶媒の例としては、水、緩衝液、酢酸及び培地などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態では、細胞外マトリックス成分は、培地又は緩衝液に溶解されることが好ましい。培地としては、特に限定されないが、ＤＭＥＭ、Ｅ－ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ－１６４０、及びＭｃｃｏｙ’５ａ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２等の基本培地や、これらの基本培地にＣＳ（ウシ血清）、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）及びＨＢＳ（ウマ胎児血清）等の血清のうち少なくとも一種を１～２０容量％程度になるように添加した培地が挙げられる。緩衝液としては、トリス－塩酸緩衝液、トリス－マレイン酸緩衝液、ビス－トリス－緩衝液、及びＨＥＰＥＳが挙げられる。
　本明細書において、「高分子電解質」とは、高分子鎖中に解離可能な官能基を有する高分子を意味する。本実施形態で用いられる高分子電解質としては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の高分子電解質を用いることができる。高分子電解質には、ヘパリンや、コンドロイチン硫酸（例えば、コンドロイチン４－硫酸、コンドロイチン６－硫酸）、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、及びヒアルロン酸等のグリコサミノグリカン；デキストラン硫酸や、ラムナン硫酸、フコイダンや、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、及びポリアクリル酸等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの高分子電解質は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。本実施形態で用いられる高分子電解質はグリコサミノグリカンであることが好ましい。また、本実施形態で用いられる高分子電解質は、ヘパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、又はデルマタン硫酸であることがより好ましい。本実施形態で用いられる高分子電解質は、ヘパリンであることがさらに好ましい。細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の高分子電解質の誘導体を用いてもよい。
　高分子電解質の濃度は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。本実施形態で用いられる高分子電解質の濃度は、０ｍｇ／ｍＬ超１．０ｍｇ／ｍＬ未満であることが好ましい。本実施形態で用いられる高分子電解質の濃度は、１．０×１０－８ｍｇ／ｍＬ以上２．５×１０－２ｍｇ／ｍＬ未満が好ましい。本実施形態で用いられる細胞外マトリックス成分の濃度は、２．６×１０－８ｍｇ／ｍＬ以上１×１０－２ｍｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、例えば、１×１０－２ｍｇ／ｍＬ、２．０×１０－３ｍｇ／ｍＬ、４．０×１０－４ｍｇ／ｍＬ、１．６×１０－５ｍｇ／ｍＬ、３．２×１０－６ｍｇ／ｍＬ、１．３×１０－７ｍｇ／ｍＬ、及び２．６×１０－８ｍｇ／ｍＬである。本実施形態で用いられる細胞外マトリックス成分の濃度が、１．０×１０－８ｍｇ／ｍＬ以上２．５×１０－２ｍｇ／ｍＬ未満であることによって、より安定的に脈管網を有する立体的細胞構造体を製造することができる。本実施形態において、高分子電解質を適切な溶媒に溶解して用いてもよい。溶媒の例としては、水、緩衝液及び培地が挙げられるが、これらに限定されない。上述のカチオン性物質としてカチオン性緩衝液が用いられる場合、高分子電解質をカチオン性緩衝液又は培地に溶解して用いてもよい。カチオン性緩衝液及び培地としては、細胞外マトリックス成分を溶解するのに溶解するのに用いることのできる緩衝液及び培地が挙げられる。
　本発明の一つの側面として、脈管網を有する立体的細胞構造体の製造方法における、高分子電解質の使用が挙げられる。前記立体的細胞構造体の製造方法は、前述の通りである。この高分子電解質としては、上述の高分子電解質が挙げられるが、ヘパリンであることが好ましい。立体的細胞構造体の製造方法において高分子電解質を使用することで、上述のように細胞外マトリックス成分が低濃度であっても脈管網の形成阻害を抑制することができる。
　本実施形態では、高分子電解質と細胞外マトリックス成分との配合比は、１：２～２：１であることが好ましい。本実施形態で用いられる高分子電解質と細胞外マトリックス成分との配合比は、１：１．５～１．５：１であることがより好ましい。本実施形態で用いられる高分子電解質と細胞外マトリックス成分との配合比は、１：１であることがさらに好ましい。
　工程（Ａ）において、少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、カチオン性物質と、高分子電解質と、細胞外マトリックス成分との混合は、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、及びプレートなどの適当な容器中で行うことができる。
　続いて、工程（Ｂ）において、工程（Ａ）で得られた混合物から、細胞集団、カチオン性物質、高分子電解質、及び細胞外マトリックス成分を含む細胞集合体を集める。本明細書において、「細胞集合体」とは、細胞の集団を意味する。細胞集合体には、遠心分離やろ過等によって得られる細胞の沈殿体も含まれる。ある実施形態では、細胞集合体はスラリー状の粘稠体である。「スラリー状の粘稠体」とは、Akihiro Nishiguchi et al., Cell-cell crosslinking by bio-molecular recognition of heparin-based layer-by-layer nanofilms, Macromol Biosci., 15 (3), 312-317, 2015. に記載されるようなゲル様の細胞集合体を指す。
　工程（Ｂ）における細胞を集める手段として、当業者に公知の手法を用いることができる。例えば、遠心分離、磁性分離、又はろ過によって、細胞を集めてもよい。遠心分離の条件は、細胞の生育に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、工程（Ａ）で得られた混合物をセルカルチャーインサートに播種し、１０℃、４００×ｇで１分間の遠心分離に供することで、細胞を集める。あるいは、自然沈降によって細胞を集めてもよい。
　また、工程（Ｂ）は、工程（Ａ）で得られた混合物から液体部分を除去し、得られた細胞集合体を溶液に懸濁し、得られた懸濁液から細胞集合体を集める工程（Ｂ’）であってもよい。工程（Ｂ’）において、工程（Ａ）で得られた混合物から液体部分を除去し、細胞集合体を得る手段としては、当業者に公知の手法を用いることができる。例えば、遠心分離やろ過によって、液体部分を除去してもよい。遠心分離の条件は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、混合物の入ったマイクロチューブを室温、４００～１，０００×ｇで１分間の遠心分離に供して液体部分と細胞集合体とを分離することによって、液体部分を除去する。あるいは、自然沈降によって細胞を集めた後、液体部分を除去してもよい。工程（Ｂ’）において、前記細胞集合体を溶液に懸濁して得られた懸濁液から前記細胞集合体を集める手段として、当業者に公知の手法を用いることができる。例えば遠心分離やろ過によって懸濁液から液体部分を除去することで、容器中に細胞集合体を得ることができる。あるいは、自然沈降によって容器中に細胞集合体を得てもよい。工程（Ｂ）又は工程（Ｂ’）における細胞集合体は層状であってもよい。
　工程（Ｂ）において、集められた細胞の数は、例えば、底面と壁を有する容器内に細胞集合体を得た場合、底面の単位面積当りに存在する細胞の数が、１．５×１０４個／ｍｍ２以上１．５×１０５個／ｍｍ２以下、例えば３．０×１０４個／ｍｍ２以上１．０×１０５個／ｍｍ２以下、４．０×１０４個／ｍｍ２以上１．５×１０５個／ｍｍ２以下、５．０×１０４個／ｍｍ２以上１．３×１０５個／ｍｍ２以下、６．１×１０４個／ｍｍ２以上１．３×１０５個／ｍｍ２以下、７．５×１０４個／ｍｍ２以上１．０×１０５個／ｍｍ２以下、又は７．５×１０４個／ｍｍ２以上９．６×１０４個／ｍｍ２以下であることが好ましい。
　続いて、工程（Ｃ）において、上記の細胞集合体を培地中で培養し、立体的細胞構造体を得る。培養の前に細胞集合体を溶液に懸濁してもよい。溶液は、細胞の生育及び立体的細胞構造体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、細胞集合体を構成する細胞に適した細胞培養培地、緩衝液等を用いることができ、細胞培養培地であることが好ましい。細胞培養培地及び緩衝液としては、細胞外マトリックス成分を溶解するのに用いることのできる培地及び緩衝液が挙げられる。
　細胞集合体の懸濁は、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、及びプレート等の適当な容器中で行うことができる。
　細胞集合体を溶液に懸濁した場合、培養の前に細胞を沈殿させて基材上に細胞の沈殿体を形成してもよい。基材としては、細胞の培養に用いるための培養容器が挙げられる。培養容器は、細胞や微生物の培養に通常用いられている素材及び形状を有する容器であってよい。培養容器の素材としては、ガラス、ステンレス及びプラスチック等が挙げられるが、これらに限定されない。培養容器としては、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル及びプレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。基材は、例えば、液体中の細胞を通過させず、液体を通すことが可能な材料である。基材は透過膜であることが好ましい。かかる透過膜を有する容器としては、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート、Ｎｅｔｗｅｌｌインサート、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）セルカルチャーインサート、及びＭｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）セルカルチャーインサートなどのセルカルチャーインサートが挙げられるが、これらに限定されない。
　細胞の沈殿は、当業者に公知の手法を用いることができる。例えば、遠心分離、磁性分離又はろ過等によって、細胞を集めてもよい。遠心分離の条件は、細胞の生育に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、混合物又は懸濁液をセルカルチャーインサートに播種し、１０℃、４００×ｇで１分間の遠心分離に供することで、細胞を集めてもよい。あるいは、自然沈降によって細胞を集めてもよい。また、集めた細胞は層構造を形成していてもよい。
　細胞集合体、又は、細胞集合体を懸濁した場合には懸濁された細胞は、１，０００個／ｍｍ２以上、例えば１０，０００個／ｍｍ２以上、例えば２０，０００個／ｍｍ２以上、例えば２５，０００個／ｍｍ２以上の細胞密度で播種することが好ましい。また、細胞は、例えば１，０００，０００個／ｍｍ２以下、例えば５００，０００個／ｍｍ２以下、例えば２００，０００個／ｍｍ２以下、例えば１００，０００個／ｍｍ２以下の細胞密度で播種することができる。細胞集合体を溶液に懸濁する工程、及び、細胞を沈殿させる工程を実施することにより、より均質な立体的細胞構造体を得ることができる。
　工程（Ｃ）において、細胞の培養は、培養される細胞に適した培養条件下で行うことができる。当業者は、細胞の種類や所望の機能に応じて適切な培地を選択することができる。細胞培養培地としては特に限定されないが、ＤＭＥＭ、Ｅ－ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ－１６４０、及びＭｃｃｏｙ’５ａ、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２等の基本培地や、これらの基本培地にＣＳ（ウシ血清）、ＦＢＳ（ウシ胎児血清）、ＨＢＳ（ウマ胎児血清）等の血清を１～２０容量％程度になるように添加した培地が挙げられる。培養環境の温度や大気組成等の諸条件もまた、当業者であれば容易に決定することができる。
　細胞の培養時に、構築された立体的細胞構造体の変形（例えば、組織の収縮又は組織末端の剥離等）を抑制するための物質を培地に添加してもよい。このような物質としては、選択的ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤であるＹ－２７６３２が挙げられるが、これに限定されない。
　工程（Ｃ）は、工程（Ａ）と工程（Ｂ）又は工程（Ｂ’）とを、少なくとも１回以上行った後に行うことが好ましい。工程（Ｃ）の前に、工程（Ａ）と工程（Ｂ）又は工程（Ｂ’）とを繰り返し行うことで、細胞集合体又は細胞の沈殿体を積層することが可能である。これにより、複数の層を有する立体的細胞構造体を構築することができる。この場合、複数種類の細胞を用いて、異なる種類の細胞によって構築される立体的細胞構造体を構築してもよい。
　本実施形態の製造方法により製造される立体的細胞構造体は、脈管網を有しているため、生体に近い構造を模倣したモデルとして有用である。本明細書において、「脈管網」とは、生体組織における血管網やリンパ管網のような、多数の分岐点を有するネットワーク状の管構造を指す。
　本実施形態の製造方法によれば、安定的に脈管網を有する立体的細胞構造体を製造することができ、且つ、十分な厚さを有する立体的細胞構造体を製造することができる。
　本実施形態での製造方法で製造される立体的細胞構造体の厚さは、５μｍ以上２００μｍ以下であってよく、例えば、１０μｍ以上１５０μｍ以下、２０μｍ以上１００μｍ以下、２０μｍ以上５０μｍ以下、又は２５μｍ以上４５μｍ以下である。本発明の上記方法の工程（Ａ）～（Ｂ）又は工程（Ａ）～（Ｂ’）を繰り返すことにより、細胞外マトリックス成分が少ないにもかかわらず、例えば、厚さを５～１００μｍに保ちながら、安定的に脈管網を有する立体的細胞構造体を製造できる。なお、本実施形態においては、１００～２００倍の倍率で立体的細胞構造体の厚み方向の断面の切片画像を観察する。
　本発明の一実施形態に係る立体的細胞構造体は、少なくとも内皮細胞を含む細胞集団、カチオン性物質、高分子電解質、及び細胞外マトリックス成分を含み、脈管網を有する立体的細胞構造体であって、細胞外マトリックス成分の含有量が、０．０１質量％以上３０質量％以下である。本実施形態の立体的細胞構造体は、本実施形態の製造方法により製造される。
　本実施形態の立体的細胞構造体に含まれる細胞外マトリックス成分の含有量は、０．０１質量％以上３０質量％以下、好ましくは、０．１質量％以上３０質量％以下、例えば、１質量％以上３０質量％以下、５質量％以上３０質量％以下、１０質量％以上３０質量％以下、２０質量％以上３０質量％以下、又は２０質量％以上２５質量％以下である。本実施形態の立体的細胞構造体に含まれる細胞外マトリックス成分の含有量を、０．０１質量％以上３０質量％以下とすることにより、立体的細胞構造体内に安定的に脈管網を形成させることができ、且つ十分な厚さを有する立体的細胞構造体とすることができる。
　本実施形態の立体的細胞構造体の底面の単位面積当たりに存在する前記細胞の数は、１．５×１０４個／ｍｍ２以上１．５×１０５個／ｍｍ２以下、例えば３．０×１０４個／ｍｍ２以上１．０×１０５個／ｍｍ２以下、４．０×１０４個／ｍｍ２以上１．５×１０５個／ｍｍ２以下、５．０×１０４個／ｍｍ２以上１．３×１０５個／ｍｍ２以下、６．１×１０４個／ｍｍ２以上１．３×１０５個／ｍｍ２以下、７．５×１０４個／ｍｍ２以上１．０×１０５個／ｍｍ２以下、又は７．５×１０４個／ｍｍ２以上９．６×１０４個／ｍｍ２以下であることが好ましい。
　本実施形態の立体的細胞構造体の厚さは、５μｍ以上２００μｍ以下であってよく、例えば、１０μｍ以上１５０μｍ以下、２０μｍ以上１００μｍ以下、２０μｍ以上５０μｍ以下、又は２５μｍ以上４５μｍ以下であってもよい。
　本実施形態の立体的細胞構造体は、安定的に脈管網を有しており、且つ、十分な厚さを有するため、生体に近い構造を模倣したモデルとして有用である。
　別の側面として、本発明は、以下の態様を包含する。
［１］　少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、カチオン性物質と、高分子電解質と、細胞外マトリックス成分と、を混合して混合物を得る工程と、得られた前記混合物から、前記細胞集団、前記カチオン性物質、前記高分子電解質、及び前記細胞外マトリックス成分を含む細胞集合体を集める工程と、前記細胞集合体を培地中で培養する工程と、を含む脈管網を有する立体的細胞構造体の製造方法であって、前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチン及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記高分子電解質が、グリコサミノグリカンであり、前記混合物中における細胞外マトリックス成分の濃度が、１．０×１０－８ｍｇ／ｍＬ以上２．５×１０－２ｍｇ／ｍＬ未満である、製造方法。
　［２］　前記培養する工程を、前記混合物を得る工程と、前記細胞集合体を集める工程とを、少なくとも１回行った後に行う、［１］に記載の製造方法。
　［３］　前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲンである、［１］又は［２］に記載の製造方法。
　［４］　前記高分子電解質が、ヘパリンである、［１］～［３］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［５］　前記混合物中における前記高分子電解質の濃度が、１．０×１０－８ｍｇ／ｍＬ以上２．５×１０－２ｍｇ／ｍＬ未満である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［６］　前記細胞集合体を集める工程が、前記混合物を得る工程で得られた混合物から液体部分を除去し、得られた細胞集合体を溶液に懸濁し、得られた懸濁液から細胞集合体を集める工程である、［１］～［５］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［７］　前記細胞集合体を集める工程において、底面と壁とを有する容器内に前記細胞集合体を集め、前記底面の単位面積当たりに存在する前記細胞の数が、１．５×１０４個／ｍｍ２以上１．５×１０５個／ｍｍ２以下である、［１］～［６］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［８］　少なくとも内皮細胞を含む細胞集団、カチオン性物質、高分子電解質、及び細胞外マトリックス成分を含み、脈管網を有する立体的細胞構造体であって、前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチン及びそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記高分子電解質が、グリコサミノグリカンであり、前記細胞外マトリックス成分の含有量が、０．０１質量％以上３０質量％以下である、立体的細胞構造体。
　［９］　前記立体的細胞構造体の底面の単位面積当たりに存在する前記細胞の数が、１．５×１０４個／ｍｍ２以上１．５×１０５個／ｍｍ２以下である、［８］に記載の立体的細胞構造体。
　［１０］　厚みが５μｍ以上２００μｍ以下である、［８］又は［９］に記載の立体的細胞構造体。
　［１１］　前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲンである、［８］～［１０］のいずれか一項に記載の立体的細胞構造体。
　［１２］　前記高分子電解質が、ヘパリンである、［８］～［１１］のいずれか一項に記載の製造方法。
　［１３］　［８］～［１０］のいずれか一項に記載の立体的細胞構造体の製造方法における、高分子電解質の使用。
　以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
　以下の各実験例において、特に説明がない限り、コラーゲンとしてコラーゲンＩを用いた。
［実験例１］
（立体的細胞構造体の形成１）
　１．３８×１０７細胞の正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）及び２．１×１０５細胞のＧＦＰ導入ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ）を、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、又は０．２ｍｇ／ｍＬのヘパリン／５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬと、同濃度のコラーゲン／５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬと、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）１ｍＬと、の混合液に懸濁した。この結果、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度は、それぞれ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬとなった。さらに、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度がそれぞれ０．０５ｍｇ／ｍＬの混合液を、さらにＤＭＥＭ培地で段階的に２倍希釈し、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度が、それぞれ、０．０２５ｍｇ／ｍＬ又は１．２５×１０－２ｍｇ／ｍＬとなる混合液を調製し、同様に上記正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）及びＧＦＰ導入ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ）を懸濁した。さらに、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度がそれぞれ０．０５ｍｇ／ｍＬの混合液を、さらにＤＭＥＭ培地で段階的に５倍希釈し、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度が、それぞれ、１．０×１０－２ｍｇ／ｍＬ、２．０×１０－３ｍｇ／ｍＬ、４．０×１０－４ｍｇ／ｍＬ、８．０×１０－５ｍｇ／ｍＬ、１．６×１０－５ｍｇ／ｍＬ、３．２×１０－６ｍｇ／ｍＬ、６．４×１０－７ｍｇ／ｍＬ、１．３×１０－７ｍｇ／ｍＬ、又は２．６×１０－８ｍｇ／ｍＬとなる混合液を調製し、同様に上記正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）及びＧＦＰ導入ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ）を懸濁した。
　続いて、得られた混合物の全量を９６ウェルセルカルチャーインサート（１ウェルあたりの底面積は、０．１４３ｃｍ２であった。）内に播種し、室温、４００×ｇで１分間遠心した。これにより、セルカルチャーインサート上に細胞層が形成された。セルカルチャーインサートに播種された細胞数は、ＮＨＤＦが９．０×１０５個、ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣが１．３５×１０４個であった。
　続いて、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％Ｏ２）中で２４時間培養した（この培養を開始した時点を培養開始時とする）。培養開始時から２４時間培養後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに培地交換した。以降、培養開始時から、４８時間後、１２０時間後にも培地交換し、８日間培養を行った。
《立体的細胞構造体の観察》
　培養開始時から８日間経過後に、立体的細胞構造体を１０％ホルマリン溶液で固定後、ＣＤ３１抗体（ＤＡＫＯ社製、ＪＣ７０Ａ　Ｍ０８２３２９）と二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ａ－１１００１）とを用いて、血管内皮細胞を蛍光標識し、蛍光顕微鏡（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、Ｏｐｅｒｅｔｔａ　ＣＬＳ）を用いて血管網構造形成の有無を観察した。図１は、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度が、それぞれ０．２ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍｇ／ｍＬ、０．０５ｍｇ／ｍＬ、０．０２５ｍｇ／ｍＬ、又は０．０１２５ｍｇ／ｍＬの場合の蛍光顕微鏡観察の結果を示す写真である。図２は、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度が、それぞれ０．０５ｍｇ／ｍＬ、１．０×１０－２ｍｇ／ｍＬ、２．０×１０－３ｍｇ／ｍＬ、４．０×１０－４ｍｇ／ｍＬ、８．０×１０－５ｍｇ／ｍＬ、１．６×１０－５ｍｇ／ｍＬ、３．２×１０－６ｍｇ／ｍＬ、６．４×１０－７ｍｇ／ｍＬ、１．３×１０－７ｍｇ／ｍＬ、又は２．６×１０－８ｍｇ／ｍＬの場合の蛍光顕微鏡観察の結果を示す写真である。図１及び図２中、「ヘパリン／コラーゲン終濃度」はヘパリン及びコラーゲンの終濃度を示す。図１及び図２の顕微鏡観察の結果から、血管網構造形成の有無を評価した。評価は以下の基準で行った。その結果を表１に示す。
　血管網構造が立体的細胞構造体の全体で形成されている：Ａ
　血管網構造が立体的細胞構造体の一部で形成されていない：Ｂ
　血管網構造が立体的細胞構造体の全体で形成されていない：Ｃ
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示したように、ヘパリンの終濃度及びコラーゲンの終濃度が２．６×１０－８ｍｇ／ｍＬ～１．２５×１０－２ｍｇ／ｍＬの場合、立体的細胞構造体の全体で血管網構造が形成されていることが確認された。ヘパリンの終濃度及びコラーゲンの終濃度が０．０２５～０．２ｍｇ／ｍＬの場合、血管網構造が立体的細胞構造体の一部で形成されていない場合があることが確認された。また、ヘパリン濃度及びコラーゲン濃度が、より低い方が、血管網構造が形成されやすい傾向があることが明らかとなった。
《立体的細胞構造体の厚さの測定》
　続いて、各立体的細胞構造体の厚さを測定した。厚さの測定は、切片画像の中央部の一箇所と両端部の二箇所の計三箇所をＩｍａｇｅ　Ｊを用いて算出し、その算術平均値を立体的細胞構造体の厚さとした。表２に、立体的細胞構造体の厚さの測定結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　その結果、コラーゲンの終濃度が２．６×１０－８ｍｇ／ｍＬ以上であり、ヘパリンの終濃度が２．６×１０－８ｍｇ／ｍＬ以上であれば、立体的細胞構造体の厚さを２０μｍ超とすることができることが明らかとなった。
［実験例２］
（立体的細胞構造体の形成２）
　０．２ｍｇ／ｍＬのヘパリン／５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬと、０．２ｍｇ／ｍＬのコラーゲン／５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬと、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ培地）１ｍＬと、の混合液を調製した。この混合液を、さらにＤＭＥＭ培地で４倍希釈し、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度が、それぞれ１．２５×１０－２ｍｇ／ｍＬとなる混合液を調製し、１．３８×１０７細胞のＮＨＤＦ及び２．１×１０５細胞のＧＦＰ－ＨＵＶＥＣを懸濁し、混合物２－１を得た。
　上記の０．２ｍｇ／ｍＬのヘパリン／５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬに代えて、５０ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）０．５ｍＬを加え、コラーゲンの終濃度及びヘパリンの終濃度が、それぞれ１．２５×１０－２ｍｇ／ｍＬ及び０ｍｇ／ｍＬとなる混合液を調製し、その他は同じ操作を行って混合物２－２を得た。
　続いて、得られた混合物２－１及び２－１の全量をそれぞれ９６ウェルセルカルチャーインサート（１ウェルあたりの底面積は、０．１４３ｃｍ２であった。）内に播種し、室温、４００×ｇで１分間遠心した。これにより、セルカルチャーインサート上に細胞層が形成された。セルカルチャーインサートに播種された細胞数は、ＮＨＤＦが９．０×１０５個、ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣが１．３５×１０４個であった。
　続いて、ＣＯ２インキュベーター（３７℃、５％Ｏ２）中で２４時間培養した（この培養を開始した時点を培養開始時とする）。培養開始時から２４時間培養後、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭに培地交換した。以降、培養開始時から、４８時間後、１２０時間後にも培地交換し、８日間培養を行った。
　培養開始時から８日間経過後に、《立体的細胞構造体の観察》と同じ方法で血管網構造形成の有無を観察し以下の方法により血管網の染色面積を算出した。蛍光顕微鏡（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製、ハイコンテント共焦点イメージングシステム　Ｏｐｅｒｅｔｔａ　ＣＬＳ）により、立体的細胞構造体の蛍光顕微鏡写真を撮像し、４．２６ｍｍ×４．２６ｍｍの範囲の画像を細胞構造画像ソフトＨａｒｍｏｎｙ（登録商標、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）を用いて解析した。より具体的には、セルカルチャーインサートをＲＯＩに指定した。画像の平坦化によりノイズを除去した後、脈管の蛍光強度の閾値を各画像で設定した。閾値以上の領域で且つサイズが小さい領域（５μｍ２以下）をノイズとして排除した。その後、蛍光強度の閾値以上の領域における合計の面積を測定し、脈管網の染色面積とした。
　混合物２－１及び２－２の培養開始時から５日間経過後及び８日間経過後の血管網の染色面積及び血管網構造形成の評価の結果を表３に示す。なお、血管網の染色面積は、混合物２－１の培養開始時から８日間経過後の血管網の染色面積を１００％とした場合の相対比率として記載している。また、混合物２－１及び２－２の培養開始時から５日間経過後及び８日間経過後の立体的細胞構造体の蛍光顕微鏡観察の結果を図３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３及び図３に示すように、コラーゲンの終濃度が１．２５×１０－２ｍｇ／ｍＬの場合であっても、ヘパリンが含まれていない場合は血管網構造が立体的細胞構造体の一部で形成されていない場合があることが確認された。
　本発明によれば、安定的に脈管網を有する、立体的細胞構造体の製造技術を提供することができる。

Claims (10)

  1. 　少なくとも内皮細胞を含む細胞集団と、カチオン性物質と、高分子電解質と、細胞外マトリックス成分と、を混合して混合物を得る工程と、
    　得られた前記混合物から、前記細胞集団、前記カチオン性物質、前記高分子電解質、及び前記細胞外マトリックス成分を含む細胞集合体を集める工程と、
    　前記細胞集合体を培地中で培養する工程と、を含む、脈管網を有する立体的細胞構造体の製造方法であって、
    　前記混合物中における細胞外マトリックス成分の濃度が、１．０×１０－８ｍｇ／ｍＬ以上２．５×１０－２ｍｇ／ｍＬ未満である、製造方法。
  2. 　前記培養する工程を、前記混合物を得る工程と、前記細胞集合体を集める工程とを、少なくとも１回行った後に行う、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、プロテオグリカン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記高分子電解質が、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
  5. 　前記混合物中における前記高分子電解質の濃度が、１．０×１０－８ｍｇ／ｍＬ以上２．５×１０－２ｍｇ／ｍＬ未満である、請求項１～４のいずれか一項に記載の製造方法。
  6. 　前記細胞集合体を集める工程が、前記混合物を得る工程で得られた混合物から液体部分を除去し、得られた細胞集合体を溶液に懸濁し、得られた懸濁液から細胞集合体を集める工程である、請求項１～５のいずれか一項に記載の製造方法。
  7. 　前記細胞集合体を集める工程において、底面と壁とを有する容器内に前記細胞集合体を集め、前記底面の単位面積当たりに存在する前記細胞の数が、１．５×１０４個／ｍｍ２以上１．５×１０５個／ｍｍ２以下である、請求項１～６のいずれか一項に記載の製造方法。
  8. 　少なくとも内皮細胞を含む細胞集団、カチオン性物質、高分子電解質、及び細胞外マトリックス成分を含み、脈管網を有する立体的細胞構造体であって、
    　前記細胞外マトリックス成分の含有量が、０．０１質量％以上３０質量％以下である、立体的細胞構造体。
  9. 　前記立体的細胞構造体の底面の単位面積当たりに存在する前記細胞の数が、１．５×１０４個／ｍｍ２以上１．５×１０５個／ｍｍ２以下である、請求項８に記載の立体的細胞構造体。
  10. 　厚さが５μｍ以上２００μｍ以下である、請求項８又は９に記載の立体的細胞構造体。
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