WO2023120573A1 - 立体的細胞組織の培養方法 - Google Patents

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WO2023120573A1
WO2023120573A1 PCT/JP2022/047103 JP2022047103W WO2023120573A1 WO 2023120573 A1 WO2023120573 A1 WO 2023120573A1 JP 2022047103 W JP2022047103 W JP 2022047103W WO 2023120573 A1 WO2023120573 A1 WO 2023120573A1
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cells
cell tissue
tissue
dimensional
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PCT/JP2022/047103
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English (en)
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靖之 平岡
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凸版印刷株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to a method for culturing three-dimensional cell tissue.
  • This application claims priority to Japanese Patent Application No. 2021-208086 filed in Japan on December 22, 2021 and Japanese Patent Application No. 2022-091422 filed in Japan on June 6, 2022, the contents of which are hereby incorporated by reference. to refer to.
  • Patent Document 1 discloses a method in which cells isolated by enzymatic treatment or the like are brought into contact with collagen or the like, which is a typical ECM and is a water-soluble polymer having a cell protective effect, and then cultured as a three-dimensional aggregate. is disclosed. According to this method, a water-soluble polymer gel is formed around the cells during culture.
  • a cell sheet is prepared using a culture dish on which poly(N-isopropylacrylamide) (PIPAAm), which is a temperature-responsive resin, is immobilized on the surface, and the prepared cell sheets are laminated to obtain a three-dimensional structure.
  • PIPAAm poly(N-isopropylacrylamide)
  • the problem to be solved by the present invention is a method for culturing a three-dimensional cell tissue, which can reduce the number of cells to be seeded for producing a three-dimensional cell tissue, and can be accumulated in one place.
  • the object is to provide a technique for producing a three-dimensional cell tissue to be formed.
  • the present inventors have found a method for producing a three-dimensional cellular tissue by mixing cells with a cationic substance, an extracellular matrix component and a polyelectrolyte, and culturing the cells.
  • the inventors have found that by culturing cells without suspending them in the entire medium, it is possible to produce a three-dimensional cell tissue with a small number of cells, and have completed the present invention. That is, the present invention includes the following aspects.
  • [1] a step of mixing cells with a cationic substance, an extracellular matrix component and a polyelectrolyte to obtain a mixture; collecting cells from the obtained mixture to obtain a cell aggregate; 1.
  • a method for culturing a three-dimensional cell tissue comprising the steps of: seeding in a medium contained in a culture vessel; and culturing the seeded cell aggregates without suspending them to obtain a three-dimensional cell tissue.
  • [2] The three-dimensional cell tissue according to [1], wherein in the step of seeding the cell aggregates in the medium contained in the culture vessel, 3 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 7 cells are seeded per 1 mL of the medium. culture method.
  • [3] The method for culturing a three-dimensional cell tissue according to [1] or [2], wherein the culture vessel is an adherent culture vessel.
  • the extracellular matrix component is selected from the group consisting of collagen, laminin, fibronectin, vitronectin, elastin, tenascin, entactin, fibrillin, proteoglycan, and combinations thereof, and the polyelectrolyte is glycosaminoglycan, Any one of [1] to [3] selected from the group consisting of dextran sulfate, rhamnan sulfate, fucoidan, carrageenan, polystyrenesulfonic acid, polyacrylamide-2-methylpropanesulfonic acid, polyacrylic acid, and combinations thereof
  • the concentration of the extracellular matrix component in the mixture is 0.01 mg/mL or more and less than 1.0 mg/mL, and the concentration of the polyelectrolyte in the mixture is 0.01 mg/mL or more and 10 mg. /mL, the method for culturing a three-dimensional cell tissue according to any one of [1] to [4].
  • the present invention includes the following aspects.
  • [6] a step of suspending a cell population containing a second cell in a solution containing a cationic substance, an extracellular matrix component and a polyelectrolyte to obtain a mixture; obtaining an aggregate; placing the cell aggregate in contact with a first cell tissue containing first cells placed in a medium; and combining the cell aggregate and the first cell tissue and culturing without suspending, as a result, the cell aggregate forms a second cell tissue and the three-dimensional cell tissue is formed, wherein the second cell tissue is the second cell tissue
  • the present invention it is possible to reduce the number of cells seeded in order to produce a three-dimensional cell tissue, and to provide a technique for producing a three-dimensional cell tissue that is formed in a state of being accumulated in one place.
  • FIG. 1(a) is a schematic diagram for explaining an experimental example according to the conventional technology
  • FIG. 1(b) is a fluorescence microscope image showing the results of the experimental example according to the conventional technology
  • FIG. 2(a) is a schematic diagram for explaining a comparative experiment example according to the prior art
  • FIG. 2(b) is a fluorescence microscope image showing the results of a comparative experiment example according to the prior art
  • (a) to (c) of FIG. 3 are graphs showing the results of experimental examples according to the prior art.
  • 1 is a photograph of microscopic observation of three-dimensional cell tissue in Experimental Example 1.
  • FIG. 10 is a microscopic photograph of three-dimensional cell tissue in Experimental Example 2.
  • FIG. 3 is a microscopic photograph of three-dimensional cell tissue in Experimental Example 3.
  • FIG. 10 is a microscopic photograph of three-dimensional cell tissue in Experimental Example 4.
  • FIG. 10 is a microscopic photograph of three-dimensional cell tissue immunohisto-stained in Experimental Example 5.
  • FIG. 9 is a fluorescence microscope image showing the results of Experimental Example 6.
  • FIG. 10 is a fluorescence microscope image showing the results of Experimental Example 7.
  • FIG. 10 is a fluorescence microscope image showing the results of Experimental Example 7.
  • the form of the three-dimensional cell tissue to which the present invention is applied is not particularly limited.
  • it may be a three-dimensional cell tissue formed by culturing cells inside a container such as a cell culture insert, or collagen. It can be applied to three-dimensional cell tissues, cell aggregates (spheroids), sheet-like cell structures, etc. formed by culturing cells in scaffolds composed of natural biopolymers and synthetic polymers such as .
  • the decrease in the cell structure causes the tissue to become thin, and the layer structure originally formed
  • the present invention it is possible to suppress the risk, so that it can be adopted more effectively.
  • three-dimensional cell tissue means a three-dimensional aggregate containing at least one type of cell. Cells within a three-dimensional tissue are attached to each other.
  • Three-dimensional cell tissues constructed by the present invention include living tissues such as skin, hair, bone, cartilage, teeth, cornea, blood vessels, lymph vessels, heart, liver, pancreas, nerves, and esophagus, as well as solid cancer models (for example, , gastric cancer, esophageal cancer, colon cancer, colon cancer, rectal cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, prostate cancer, renal cell cancer, liver cancer, etc.).
  • a three-dimensional cell tissue can be produced by the production method described below.
  • Examples of the sheet-like cell structure include those formed by culturing cells in a monolayer, peeling them from the culture container, and stacking them on other monolayer-cultured cells, and three-dimensional cell structures described below. can be applied to those formed by the manufacturing method of
  • a cell aggregate means a group of cells.
  • Cell aggregates include three-dimensional cell tissues, two-dimensional cell tissues, cell sediments obtained by centrifugation, filtration, and the like.
  • a planar cell tissue refers to a tissue formed by adhesion of approximately one layer of cells on a cell culture substrate.
  • a planar cell tissue can be formed, for example, by culturing adherent cells in a culture vessel by a conventional method.
  • the cell aggregate is a slurry-like viscous body.
  • a "slurry viscous body” refers to a gel-like cell aggregate as described in Non-Patent Document 1.
  • the first embodiment is (A) mixing the cells with a cationic substance, an extracellular matrix component and a polyelectrolyte to obtain a mixture; (B) collecting cells from the resulting mixture to obtain cell aggregates; (C) seeding the cell aggregates in a medium contained in a culture vessel; (D) culturing the seeded cell aggregates without suspending them to obtain a three-dimensional cell tissue.
  • seeding means first seeding cells as cell aggregates in a medium before forming a three-dimensional cell organization. It does not mean seeding in the entire process including the medium exchange process performed after the formation of.
  • cells are mixed with a cationic substance, an extracellular matrix component and a polyelectrolyte to obtain a mixture, cells are collected from the obtained mixture, cell aggregates are obtained, and the obtained cells are
  • a three-dimensional culture can be constructed, and the number of cells to be seeded in the medium to produce a three-dimensional cell tissue can be reduced.
  • step (A) of the method for producing a three-dimensional cell tissue cells are mixed with a cationic substance, an extracellular matrix component and a polyelectrolyte.
  • a three-dimensional cell tissue with few large internal voids can be obtained.
  • the obtained three-dimensional cell tissue is relatively stable, it can be cultured for at least several days, and the tissue does not easily collapse during medium exchange.
  • step (B) of the method for producing a three-dimensional cell tissue cells are collected from the obtained mixture to obtain cell aggregates.
  • step (B) may be (B′-0) a step of obtaining a cell aggregate by placing the mixture on a substrate, or (B′-1) liquid from the obtained mixture A step of removing a portion to obtain a cell aggregate may be performed, or a step of (B'-2) suspending the cell aggregate in a solution may be performed in addition to the step (B'-1).
  • steps (B'-1) and (B'-2) are performed, instead of step (C), (C') the step of seeding the obtained suspension in a culture medium contained in a culture vessel may be included. good.
  • the solution in (B'-2) is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth and formation of three-dimensional cell tissue.
  • a cell culture medium, buffer solution, etc. suitable for the cells forming the cell aggregate can be used.
  • the desired tissue can be obtained by performing the above-described steps (A) to (D), but as step (B), steps (B'-1) and (B'-2) are performed, By performing step (C′) instead of step (C), a more homogeneous tissue can be obtained.
  • step (A) Mixing the cells with cationic substances, polyelectrolytes, and extracellular matrix components in the method for producing a three-dimensional cell tissue, that is, step (A), is carried out in a suitable container such as a dish, tube, flask, bottle and plate. may be performed in The suspension in step (B'-2) may also be carried out in suitable containers such as dishes, tubes, flasks, bottles and plates.
  • Cationic substance Any positively charged substance can be used as the cationic substance in the method for producing a three-dimensional cell tissue as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • Cationic substances include cationic buffers such as Tris-HCl buffer, Tris-Maleate buffer, Bis-Tris-buffer, and HEPES, as well as ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, polyvinylamine, polyallylamine. , polylysine, polyhistidine, and polyarginine.
  • the cationic substance used in the present invention is a cationic buffer.
  • the cationic substance used in the present invention is Tris-HCl buffer.
  • the concentration of the cationic substance in the method for producing a three-dimensional cell tissue is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth and formation of cell aggregates.
  • the cationic substance used in this embodiment preferably has a concentration of 10 to 200 mM.
  • the concentration of the cationic substance used in this embodiment is preferably 20-180 mM, 40-160 mM, 60-140 mM or 80-120 mM. More preferably, the concentration of the cationic substance used in this embodiment is 100 mM.
  • the pH of the cationic buffer is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth and cell aggregate formation.
  • the pH of the cationic buffer used in this embodiment is preferably 6.0 to 8.0.
  • the pH of the cationic buffer used in this embodiment is 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7. 8, 7.9, or 8.0.
  • the pH of the cationic buffer used in this embodiment is more preferably 7.2 to 7.6. More preferably, the pH of the cationic buffer used in this embodiment is 7.4.
  • polyelectrolyte means a polymer having a dissociable functional group in the polymer chain. Any polymer electrolyte can be used as the polymer electrolyte used in the present embodiment as long as it does not adversely affect cell growth and formation of cell aggregates.
  • Polyelectrolytes include glycosaminoglycans such as heparin, chondroitin sulfates (eg, chondroitin 4-sulfate, chondroitin 6-sulfate), heparan sulfate, dermatan sulfate, keratan sulfate and hyaluronic acid; Examples include, but are not limited to, carrageenan, polystyrenesulfonic acid, polyacrylamido-2-methylpropanesulfonic acid, polyacrylic acid, and the like. These polymer electrolytes may be used alone or in combination.
  • the polyelectrolyte used in this embodiment is preferably a glycosaminoglycan.
  • the polymer electrolyte used in this embodiment is more preferably heparin, dextran sulfate, chondroitin sulfate, or dermatan sulfate. More preferably, the polymer electrolyte used in this embodiment is heparin. Derivatives of the polyelectrolytes described above may be used as long as they do not adversely affect cell growth and formation of cell aggregates.
  • the concentration of the polyelectrolyte in the method for producing a three-dimensional cell tissue is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth and formation of cell aggregates.
  • the concentration of the polymer electrolyte used in this embodiment is preferably more than 0 mg/mL and less than 10.0 mg/mL.
  • the concentration of the polymer electrolyte used in this embodiment is more preferably 0.01 mg/mL or more and 5.0 mg/mL or less, and further preferably 0.05 mg/mL or more and 3.0 mg/mL or less.
  • the concentrations of polyelectrolytes used in this embodiment are 0.01, 0.025, 0.05, 0.075, or 0.1, 0.3, 0.5, 1.0 mg/mL. be.
  • the concentration of the polymer electrolyte used in this embodiment is 0.1 mg/mL or more and 1.0 mg/mL or less. More preferably, the concentration of the polyelectrolyte used in this embodiment is 0.05 mg/mL.
  • the polymer electrolyte may be dissolved in an appropriate solvent and used.
  • solvents include, but are not limited to, water and buffers.
  • a cationic buffer is used as the above cationic substance
  • the polyelectrolyte may be dissolved in the cationic buffer and used.
  • Extracellular matrix component Any component that constitutes an extracellular matrix can be used as the extracellular matrix component in the method for producing a three-dimensional cell tissue as long as it does not adversely affect the growth of cells and the formation of cell aggregates.
  • Extracellular matrix components include, but are not limited to, collagen, laminin, fibronectin, vitronectin, elastin, tenascin, entactin, fibrillin, proteoglycans, and the like. These extracellular matrix components may be used alone or in combination.
  • Proteoglycans include, but are not limited to, chondroitin sulfate proteoglycans, heparan sulfate proteoglycans, keratan sulfate proteoglycans, and dermatan sulfate proteoglycans.
  • the extracellular matrix component used in this embodiment is preferably at least one of collagen, laminin and fibronectin, and more preferably collagen. Modifications and variants of the above extracellular matrix components may be used as long as they do not adversely affect cell growth and cell aggregate formation.
  • the concentration of extracellular matrix components is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth and cell aggregate formation.
  • the concentration of the extracellular matrix component used in this embodiment is preferably greater than 0 mg/mL and less than 1.0 mg/mL.
  • the concentration of the extracellular matrix component used in this embodiment is more preferably 0.01 mg/mL or more and 1.0 mg/mL or less, and more preferably 0.025 mg/mL or more and 0.5 mg/mL or less.
  • the concentration of the extracellular matrix component is 0.01, 0.025, 0.05, 0.075, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, or 0.5 mg/mL .
  • the concentration of the extracellular matrix component used in this embodiment is 0.05 mg/mL or more and 0.3 mg/mL or less. More preferably, the concentration of the extracellular matrix component used in this embodiment is 0.05 mg/mL.
  • the extracellular matrix component may be dissolved in an appropriate solvent and used. Examples of solvents include, but are not limited to, water, buffers, acetic acid, and the like. In this embodiment, the extracellular matrix components are preferably dissolved in buffer or acetic acid.
  • the mixing ratio of the polyelectrolyte and the extracellular matrix component in the method for producing a three-dimensional cell tissue is preferably 1:2 to 2:1.
  • the blending ratio of the polymer electrolyte and the extracellular matrix component used in this embodiment is more preferably 1:1.5 to 1.5:1. More preferably, the mixing ratio of the polymer electrolyte and the extracellular matrix component used in this embodiment is 1:1.
  • Cells used in the method for producing a three-dimensional cell tissue are not particularly limited, but are, for example, cells derived from animals such as humans, monkeys, dogs, cats, rabbits, pigs, cows, mice and rats.
  • the site of cell origin is not particularly limited, and may be somatic cells derived from bones, muscles, internal organs, nerves, brains, bones, skin, blood, or the like, or germ cells.
  • the cells used in the method according to this embodiment may be induced pluripotent stem cells (also referred to as iPS cells) or embryonic stem cells (also referred to as ES cells).
  • cultured cells such as primary cultured cells, subcultured cells, and cell line cells may be used.
  • Cells used in the method according to this embodiment include, for example, nerve cells, dendritic cells, immune cells, vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, fibroblasts, cancer cells such as liver cancer cells, epithelial cells, and cardiomyocytes. , hepatocytes, pancreatic islet cells, tissue stem cells, smooth muscle cells, and the like, but are not limited to these. Since the three-dimensional cell tissue of the present embodiment is a tissue that mimics the functions of tissues in vivo, the cells used in the method for producing the three-dimensional cell tissue may be cells other than immortalized cells. preferable.
  • the three-dimensional cell tissue obtained by the method for producing a three-dimensional cell tissue may contain one type of cell, or may contain multiple types of cells.
  • the cells contained in the three-dimensional cell tissue include nerve cells, dendritic cells, immune cells, vascular endothelial cells, lymphatic endothelial cells, fibroblasts, cancer cells, epithelial cells, cardiomyocytes, hepatocytes, Selected from the group consisting of pancreatic islet cells, tissue stem cells, and smooth muscle cells.
  • the three-dimensional cell tissue obtained by the method according to this embodiment may have a vasculature. "Vasculature" refers to network-like structures such as vascular networks and lymphatic networks in living tissue.
  • Cells may be collected, for example, by centrifugation, magnetic separation, or filtration.
  • a liquid portion may be removed.
  • Conditions for centrifugation are not particularly limited as long as they do not adversely affect cell growth and formation of cell aggregates.
  • the cells are collected by centrifuging the microtube or cell culture insert containing the mixture at room temperature (eg, 25° C.) at 400-1000 ⁇ g for 2 minutes to separate the liquid portion from the cell aggregates. .
  • the liquid portion may be removed after the cells have been collected by natural sedimentation.
  • the cell sediment in the cell aggregate in step (B-0) or (B'-1) may be layered.
  • the solution used in step (B'-2) in the method for producing a three-dimensional cell tissue is not particularly limited as long as it does not adversely affect cell growth and formation of cell aggregates.
  • cell culture media or buffers suitable for the cells used are used.
  • the culture vessel used in the step (C) of the method for producing a three-dimensional cell tissue may be a vessel having a material and shape commonly used for culturing cells and microorganisms.
  • materials for culture vessels include glass, stainless steel, and plastics such as polystyrene, which have no or low cytotoxicity, but are not limited to these.
  • Culture vessels include, but are not limited to, dishes, tubes, flasks, bottles and plates.
  • the culture vessel is preferably a vessel having a permeable membrane, for example, a material through which a liquid can pass without allowing cells in the liquid to pass through.
  • Containers with permeable membranes include, but are not limited to, cell culture inserts such as Transwell® inserts, Netwell inserts, Falcon® cell culture inserts, Millicell® cell culture inserts.
  • the culture vessel may be an adherent culture vessel or a non-adherent culture vessel, but an adherent culture vessel is preferred.
  • an adherent culture vessel By using an adherent culture vessel, it is possible to produce a three-dimensional cell tissue with the cells adhered to the vessel. It tends to accumulate locally in the medium without
  • the use of the adherent culture vessel makes it possible to perform post-process operations such as medium exchange, evaluation, and observation very easily.
  • Examples of the adherent culture vessel include, but are not limited to, general polystyrene culture vessels and culture vessels coated with a polymer or the like that promotes cell adhesion.
  • a substance is used to suppress deformation of the constructed three-dimensional cell tissue (for example, contraction of the tissue or exfoliation of the ends of the tissue, etc.).
  • Such substances include, but are not limited to, Y-27632, a selective ROCK (Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho-associated kinase) inhibitor.
  • step (D) is performed in the presence of the substance. Contraction of a three-dimensional cell tissue constructed by culturing cell aggregates in the presence of the substance is suppressed. As a result, detachment of the constructed tissue from the culture vessel is suppressed.
  • such substances may be further mixed.
  • such a substance may be further added to the solution used in step (B'-2).
  • such substances may be added to the medium when culturing the cells in step (D).
  • cells can be cultured under culture conditions suitable for the cells to be cultured.
  • a person skilled in the art can select an appropriate medium according to the cell type and desired function.
  • the cell culture medium is not particularly limited, but D-MEM, E-MEM, MEM ⁇ , RPMI-1640, McCoy'5a, and Ham's F-12, as well as CS (also called bovine serum), FBS ( (also referred to as fetal bovine serum) and HBS (also referred to as fetal horse serum) to about 1 to 20% by volume of serum.
  • CS also called bovine serum
  • FBS also referred to as fetal bovine serum
  • HBS also referred to as fetal horse serum
  • the number of cells in the three-dimensional tissue may be determined by the number of cells seeded when producing the three-dimensional tissue. Also, the number of cells in the three-dimensional cell organization may be the number of living cells. The number of viable cells in the three-dimensional tissue may be 1.5 ⁇ 10 6 or more.
  • the number of cells to be seeded is not particularly limited as long as a three-dimensional cell tissue can be produced, but is preferably 3 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 7 cells per 1 mL of medium, for example, 1 mL of medium.
  • the “number of cells to be seeded” is the number of cells per volume of medium when initially seeded in the medium before the formation of a three-dimensional cell tissue.
  • the seeding of the cell aggregates onto the medium may be performed by dropping the cell aggregates onto the surface of the medium, by injecting the cell aggregates into the medium, or by pouring the medium into a liquid. It may be formed as a droplet and injecting the cell aggregate into the droplet.
  • the cell aggregates are seeded in a locally accumulated state so as not to spread in the medium. More preferably, the cell aggregates are seeded in a state of being adhered to the side or bottom of the culture vessel and locally accumulated so as not to spread into the medium.
  • the amount of medium initially contained in the culture vessel before the formation of a three-dimensional cell tissue there is no particular limitation on the amount of medium initially contained in the culture vessel before the formation of a three-dimensional cell tissue, but by reducing the amount of medium, the number of cells initially seeded in the medium in the culture vessel can also be reduced.
  • the amount of medium is appropriately determined depending on the size of the culture vessel used.
  • the amount of medium used for medium exchange after the formation of a three-dimensional cell tissue and the amount can be determined as appropriate.
  • step (D) the cell aggregates seeded in step (C) are cultured without suspension.
  • “Culturing without suspending the cell aggregates” means culturing in a locally dense state without dispersing the cell aggregates substantially uniformly in the medium, preferably in a culture vessel. It means culturing in a locally congested state by adhering to the sides or bottom. Even when the seeded cell aggregates are cultured without being suspended, normal cells will naturally diffuse into the medium, making it difficult to construct a three-dimensional cell tissue. densely packed. Therefore, the process of culturing without suspension is generally not suitable for cell culture because it locally induces a high confluency state that is avoided in two-dimensional planar culture. be.
  • the cells do not diffuse into the medium. Since the cells are locally accumulated at , the cell density is high, so even if the number of cells to be seeded is small, a three-dimensional cell tissue can be produced.
  • the density of the cells in the cell suspension is not particularly limited, 2 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 8 /mL is preferable, for example, 2 ⁇ 10 6 to 9 ⁇ 10 7 /mL, 2 ⁇ 10 6 to 8 ⁇ 10 7 /mL, 2 ⁇ 10 6 to 7 ⁇ 10 7 /mL, 2 ⁇ 10 6 to 6 ⁇ 10 7 /mL, 2 ⁇ 10 6 to 5 ⁇ 10 7 /mL, 2 ⁇ 10 6 to 4 ⁇ 10 7 /mL, 2 ⁇ 10 6 to 3 ⁇ 10 7 /mL, 2 ⁇ 10 6 to 2 ⁇ 10 7 /mL, 2 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 7 /mL, preferably 2.5 ⁇ 10 6 to 1 ⁇ 10 8 /mL , for example, 2.5 ⁇ 10 6 to 9 ⁇ 10 7 cells/mL, 2.5 ⁇ 10 6 to 8 ⁇ 10 7 cells/mL, 2.5 ⁇ 10 6 to 7 ⁇ 10 7 cells/mL; 5 ⁇ 10 6
  • Cell aggregates, or suspended cells when cell aggregates are suspended are 1,000/mm 2 or more, such as 10,000/mm 2 or more, such as 20,000/mm 2 As described above, it is preferable to locally accumulate and sow the cells so that the cell density is 25,000 cells/mm 2 or more. Also, the cells are used at a cell density of, for example, 1,000,000 cells/mm 2 or less, such as 500,000 cells/mm 2 or less, such as 200,000 cells/mm 2 or less, such as 100,000 cells/mm 2 or less. Can be sown. By performing the step of suspending the cell aggregates in the solution and the step of precipitating the cells, a more homogeneous three-dimensional cell tissue can be obtained.
  • the method for producing a three-dimensional cell tissue By repeating steps (A) to (C) or (A) to (C') of the method for producing a three-dimensional cell tissue, it is possible to stack cell aggregates. Thereby, a three-dimensional cell tissue having multiple layers can be constructed. In this case, a plurality of types of cells may be used to construct a three-dimensional cell tissue composed of different types of cells. According to the method for producing a three-dimensional cell tissue, the thickness of the constructed three-dimensional cell tissue is about 5 to about 300, about 400, or about 500 ⁇ m. It is preferably 60 ⁇ m or more, more preferably 200 ⁇ m or more, and even more preferably 250 ⁇ m or more.
  • the thickness is as thick as 150 to 500 ⁇ m, there are few voids inside A three-dimensional tissue is obtained.
  • the number of cell layers in the constructed three-dimensional cell tissue is preferably 1 to about 100 layers, more preferably about 10 to about 100 layers.
  • the cell layer is defined as a section image of a three-dimensional cell tissue in the thickness direction, when observed at a magnification that allows the cell nuclei to be recognized, that is, at a magnification that allows the entire thickness of the stained section to be seen in the field of view.
  • a separate layer is defined when the cell nuclei do not overlap in the vertical direction.
  • At least 200 ⁇ m or more is secured for the self-weight and the vertical (horizontal) direction field of view.
  • a section image of a cross section in the thickness direction of the three-dimensional cell tissue is observed at a magnification of 100 to 200 times.
  • the three-dimensional cell tissue obtained by repeating the steps (A) to (C) or (A) to (C′) of the method for producing a three-dimensional cell tissue is a three-dimensional cell tissue obtained by a conventional cell lamination method.
  • the number of cell layers per unit thickness is smaller than that of the normal cell tissue.
  • the three-dimensional cell tissue to be constructed is obtained in vitro.
  • the three-dimensional cell tissue according to the method for producing a three-dimensional cell tissue contains cells and extracellular matrix components, and the number of cell layers per 10 ⁇ m of thickness is 2.8 or less, preferably It is 2.5 layers or less, more preferably 2.2 layers or less.
  • the number of cells per area of 100 ⁇ m in the thickness direction and 50 ⁇ m in the width direction in the region including the position (maximum point) where the thickness is maximum in the obtained three-dimensional cell tissue is 5 or more.
  • the number is preferably 70 or less, more preferably 10 or more and 60 or less, and even more preferably 15 or more and 50 or less.
  • the number of cells can be measured as follows using a section of tissue in the thickness direction.
  • the position (maximum point) where the thickness of the three-dimensional cell tissue is maximum is determined among the regions without voids of a predetermined size or larger.
  • a 50- ⁇ m-wide strip-shaped area (including the top surface to the bottom surface of the tissue) including the vicinity of the maximum thickness is used as the measurement area, and the number of cell nuclei contained in the measurement area is counted.
  • the measurement area is determined so as not to include voids.
  • the predetermined size of the void means a maximum diameter of 50 ⁇ m or more.
  • the maximum diameter of a void refers to the long side of a rectangular void, the diameter of a spherical void, the major axis of an elliptical void, and the major axis of an approximation of an ellipse to an irregular shape. Note that voids are not stained on HE-stained sections. However, when the top surface of the area including the maximum thickness value is convex, the tissue may be separated from the base material. In such a case, an area near the maximum value and with a relatively flat top surface is used as the measurement area. In this case, a region of 100 ⁇ m to 650 ⁇ m in the width direction including the vicinity of the maximum thickness is taken as the measurement region.
  • Cell nuclei at least partially included in the counted measurement area are counted as cell nuclei included in the measurement area. From the counted number of cells, the number of cells per area of 100 ⁇ m in the thickness direction and 50 ⁇ m in the width direction is calculated.
  • a method for producing a three-dimensional cell tissue of the second embodiment includes a first cell tissue containing first cells and a second cell tissue containing second cells, wherein the second cell tissue is , a method for producing a three-dimensional cell tissue arranged in contact with the first cell tissue, wherein the cell population containing the second cell is treated with a cationic substance, an extracellular matrix component and a polyelectrolyte obtaining a mixture by suspending it in a solution containing; collecting cells from the obtained mixture to obtain a cell aggregate; and culturing the cell aggregate and the first cell tissue without suspension, so that the cell aggregate forms the second cell tissue and the three-dimensional cell tissue is formed.
  • Patent Document 4 shows the applicability of a three-dimensional cell tissue having a vascular structure, prepared by applying the method of Patent Document 3, to screening for compounds that induce vascular structure-specific toxicity.
  • Non-Patent Document 2 In some cells such as hepatocytes, specific properties inherent to the cells are expressed and maintained for a long period of time, so it is important to form a three-dimensional cellular tissue only with those cell types. have been reported (see, for example, Non-Patent Document 2).
  • the present inventors previously prepared a three-dimensional cell tissue containing three types of cells: hepatocytes, hepatic sinusoidal-derived vascular endothelial cells, and hepatic stellate cells, based on the method described in Patent Document 4. , conducted experiments exposing them to compounds (eg, monocrotaline) that have been suggested to have a risk of damaging vascular endothelial cells. As a result, we clarified that reactive metabolites activated by hepatocyte metabolism damage vascular endothelial cells.
  • compounds eg, monocrotaline
  • FIG. 1(a) of FIG. 1 is a schematic diagram explaining this experiment.
  • a three-dimensional cell tissue containing three types of cells, hepatocytes, vascular endothelial cells, and hepatic stellate cells was prepared.
  • the tissue was fixed and stained for CD31 by fluorescent immunostaining.
  • CD31 is a marker for endothelial cells.
  • FIG. 1(b) The upper part of FIG. 1(b) is a fluorescence microscope image showing the results of immunostaining.
  • the lower part of FIG. 1B is a skeletonized image obtained by processing the upper part of the image of FIG. 1B. As a result, monocrotaline concentration-dependent damage to vascular endothelial cells was shown.
  • FIG. 2(a) of FIG. 2 is a schematic diagram explaining a comparative experiment.
  • a liver tissue consisting only of hepatocytes and a three-dimensional cell tissue containing two types of cells, vascular endothelial cells and hepatic stellate cells, were respectively prepared and placed in the same well. Subsequently, after exposure to various concentrations of monocrotaline, the tissues were fixed and stained for CD31 by fluorescent immunostaining.
  • FIG. 2 is a fluorescence microscope image showing the results of immunostaining. As a result, no damage to vascular endothelial cells was observed even after exposure to monocrotaline.
  • FIG. 3 shows three-dimensional cell tissues prepared by randomly mixing three types of cells similar to those shown in (a) of FIG. 1 is a graph showing the results of measuring the expression levels of liver function-related genes by RNA-seq analysis 1 day, 4 days and 8 days after each cell tissue was prepared and cultured.
  • CYP3A4, ALB and CYP2C9 were examined as liver function-related genes.
  • FIG. 3(a) is a graph showing the measurement results of CYP3A4.
  • (b) of FIG. 3 is a graph showing the measurement results of ALB.
  • (c) of FIG. 3 is a graph showing the measurement results of CYP2C9.
  • mixed tissue indicates a three-dimensional cell tissue prepared by randomly mixing three types of cells similar to those shown in (a) of FIG.
  • Hepatocytes only indicates a three-dimensional cell organization consisting only of hepatocytes.
  • the vertical axis of the graph corresponds to the relative expression level of each gene.
  • liver function-related genes were maintained in the three-dimensional cell tissue consisting only of hepatocytes, whereas in the three-dimensional cell tissue prepared by randomly mixing three types of cells, hepatocyte It was found that the function was changed and the expression of liver function-related genes was decreased.
  • This embodiment describes a method for producing a three-dimensional cell tissue in which a second cell tissue is arranged in contact with a first cell tissue.
  • a three-dimensional cell tissue can be produced in which the second cell tissue is arranged in contact with the first cell tissue.
  • the second cell tissue is accumulated in one place. Therefore, as described above with reference to FIGS. 1(a) to 3(c), the cell type X forms a three-dimensional cell organization that is accumulated in one place in order to maintain its function. Even if necessary, the interaction between cell type X and tissue Y can be accurately evaluated. In this case, cell type X corresponds to the second cell.
  • the first cell tissue may be a three-dimensional cell tissue or a two-dimensional cell tissue.
  • the first cell tissue contains the first cells.
  • a first cell is the cell whose interaction with the second cell is to be evaluated.
  • the first cell may be one type of cell, or may contain two or more types of cells.
  • the first cells comprise stromal cells.
  • Stromal cells refer to cells that constitute supporting tissue for epithelial cells. The origin of stromal cells is not particularly limited, and cells derived from mammals such as humans, monkeys, dogs, cats, rabbits, pigs, cows, mice and rats can be used. More specific stromal cells include fibroblasts, immune cells, vascular endothelial cells, smooth muscle cells, sinusoidal endothelial cells, and the like. Immune cells include lymphocytes, neutrophils and macrophages.
  • the first cell aggregate may be prepared in the same manner as the cell aggregate described in the first embodiment, but is not limited to this.
  • the first cell tissue is arranged in a medium.
  • the medium the one used in the first implementation can be used.
  • hepatocyte medium HCM, Lonza
  • kidney cell medium REGM, Lonza
  • nerve cell medium AGM, Lonza
  • the first cell tissue is preferably arranged in a culture vessel. Culture vessels include dishes, tubes, flasks, bottles, well plates, cell culture inserts and the like.
  • the second cell is the target cell whose interaction with the first cell is evaluated.
  • the second cell is preferably a cell that needs to form a three-dimensional cell tissue that is concentrated in one place in order to maintain its function.
  • the second cell may be one type of cell, or may contain two or more types of cells.
  • the first cells may contain vascular endothelial cells
  • the second cells may contain hepatocytes.
  • interactions between hepatocytes and vascular endothelial cells can be accurately evaluated.
  • the step of suspending the cell population containing the second cells in a solution containing a cationic substance, an extracellular matrix component and a polyelectrolyte to obtain a mixture is the same as described in the first embodiment.
  • This step is the same as the step (A) of the three-dimensional cell organization.
  • the cationic substance, extracellular matrix component and polyelectrolyte are the same as described above.
  • the step of collecting cells from the mixture to obtain a cell aggregate is the same step as the step (B) of the three-dimensional cell organization described in the first embodiment.
  • the total content of extracellular matrix components in the mixture in the step (A) described in the first embodiment is not particularly limited, and is 0.005 mg/mL or more and 1.5 mg/mL or less.
  • An extracellular matrix component can be dissolved in an appropriate solvent and used.
  • the concentration of the polymer electrolyte in the mixture in step (A) described in the first embodiment is not particularly limited. Unlike extracellular matrix components, polyelectrolytes are effective at any concentration below the solubility limit and do not interfere with the effects of extracellular matrix components.
  • the concentration of the polymer electrolyte is preferably 0.005 mg/mL or more, may be 0.005 mg/mL or more and 1.0 mg/mL or less, and is 0.01 mg/mL or more and 1.0 mg/mL or less. 0.025 mg/mL or more and 1.0 mg/mL or less, or 0.025 mg/mL or more and 0.5 mg/mL or less.
  • the step of arranging the cell aggregate containing the second cell so as to be in contact with the first cell tissue arranged in the medium is the above-described three-dimensional cell organization step ( This is the same step as in C).
  • the second cell aggregate is seeded so as to be in contact with the first cell organization. That is, in the step (C) of the three-dimensional cell organization of the first embodiment, the cell aggregates are seeded in the medium contained in the culture vessel, whereas in the present embodiment, the first A second cell aggregate is placed in contact with the tissue.
  • the first cell tissue and the second cell aggregate are cultured, and as a result, the mixture forms the second cell tissue, and a single three-dimensional cell tissue is formed as a whole.
  • the second cell aggregates after arranging the second cell aggregates, they are cultured without being suspended to form a second cell tissue. This facilitates formation of the second cell tissue in a state of being accumulated in one place on the first cell tissue.
  • a three-dimensional cell tissue in contact with the first cell tissue can be obtained in a state where the second cells are accumulated in one place without scattering. can be done.
  • This embodiment includes a first cell tissue containing a first cell and a second cell tissue containing a second cell, wherein the second cell tissue is in contact with the first cell tissue. It provides a three-dimensional cellular organization arranged in a vertical direction.
  • the three-dimensional cell tissue of this embodiment can be produced by the production method of this embodiment described above.
  • the second cell tissue is accumulated in one place. That is, the second cell organization is a three-dimensional cell organization. Therefore, as described above with reference to FIGS. 1A to 3C, even if the cell type X needs to form a three-dimensional cell organization that is accumulated in one place in order to maintain its function, , the interaction between the cell type X and the tissue Y can be accurately evaluated by using the three-dimensional cell tissue of this embodiment.
  • cell type X corresponds to the second cell.
  • the three-dimensional cell tissue of this embodiment is housed in a culture vessel.
  • Culture vessels include dishes, tubes, flasks, bottles, well plates and cell culture inserts.
  • the first cells and the second cells are the same as those described above. More specifically, for example, the first cells may contain vascular endothelial cells, and the second cells may contain hepatocytes. In this case, interactions between hepatocytes and vascular endothelial cells can be accurately evaluated.
  • ECGS hereinafter abbreviated as ECGS
  • HCM medium model number “CC-3198”, manufactured by Lonza
  • CC-3198 manufactured by Lonza
  • a cell suspension was also obtained in the same manner as described above, except that the cells were not suspended in the heparin/collagen solution.
  • HCM medium model number "CC- 3198", Lonza
  • a cloudy, mixed cell suspension was obtained.
  • a mixed cell suspension was also obtained in the same manner as described above, except that the mixed cells were not suspended in the heparin/collagen solution.
  • Example 3 Production of three-dimensional cell tissue 3 ⁇ Preparation of dispersion liquid of three-dimensional cell tissue> A cell suspension was obtained in the same manner as in Experimental Example 1 except that the cell density was resuspended to 9.75 ⁇ 10 3 cells/2 ⁇ L or 4.87 ⁇ 10 3 cells/2 ⁇ L. . A cell suspension not suspended in the heparin/collagen solution was also obtained in the same manner as in Experimental Example 1.
  • Example 4 Production of three-dimensional cell tissue 4 ⁇ Preparation of dispersion liquid of three-dimensional cell tissue> A mixed cell suspension was obtained in the same manner as in Experimental Example 2, except that the cell density was resuspended to 1.5 ⁇ 10 4 cells/2 ⁇ L or 7.5 ⁇ 10 3 cells/2 ⁇ L. rice field. A cell suspension not suspended in the heparin/collagen solution was also obtained in the same manner as in Experimental Example 2.
  • the three-dimensional cell tissue sample obtained above was treated with anti-CD31 antibody (monoclonal mouse anti-human CD31 antibody, Clone JC70A, Code M0823, manufactured by Dako) or anti-MRP2 antibody (monoclonal mouse anti-human MRP2 antibody, Clone M2 III- 6, Code ab3373, manufactured by abcam) as a primary antibody and goat anti-mouse IgG-AlexaFluor (registered trademark) 647 (manufactured by Thermo Fisher Scientific) as a secondary antibody, immunohistochemical staining of each sample was performed. The method of immunohistochemical staining followed a known method. The results are shown in FIG.
  • LX-2 hepatic stellate cells
  • HAVEC human umbilical vein endothelial cells
  • 1 v / v% vascular endothelial cell growth supplement (Endothelial Cell Growth Supplement, model number "1052", manufactured by Sciencecell, hereinafter abbreviated as "ECGS” was added to HCM medium (model number "CC-3198 ”, manufactured by Lonza).
  • ⁇ Preparation of second cell tissue >> 20 ⁇ L of 1.0 mg/mL heparin/200 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4) and 20 ⁇ L of 0.6 mg/mL collagen/5 mM acetic acid solution (pH 3.7) solution (heparin/collagen) 3.0 ⁇ 10 5 human hepatocytes (PXB Cells) were suspended in the solution) to obtain a mixture.
  • HCM medium containing 1 v/v% ECGS was added to the cell aggregates and resuspended to adjust the cell density to 1.95 ⁇ 10 4 cells/2 ⁇ L to obtain a cell suspension.
  • HCM medium containing 1 v / v% ECGS of 100 ⁇ L / well inside the insert and 300 ⁇ L / well outside the insert was added to the 96 transwell culture insert that formed the first cell tissue, and the inside of the insert 2 ⁇ L/well of the resulting cell suspension was seeded on the first cell tissue of , and cultured for 24 hours without suspension to form a second cell aggregate.
  • Example 1 A three-dimensional cell structure of Example 1 was obtained.
  • anti-CD31 antibody monoclonal mouse anti-human CD31 antibody, Clone JC70A, Code M0823, manufactured by Dako
  • anti-albumin antibody polyclonal rabbit anti-human albumin antibody, Code 16475-1-AP, manufactured by Proteintech
  • Goat anti-mouse IgG-AlexaFluor (registered trademark) 647 and goat anti-rabbit IgG-AlexaFluor (registered trademark) 594 were used as secondary antibodies.
  • CD31 is a marker for endothelial cells and albumin is a marker for hepatocytes.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of fluorescent immunostaining. As a result, in the three-dimensional cell tissue of Experimental Example 6, it was confirmed that the second cell tissue was formed in a state of being accumulated in one place on the first cell tissue.
  • Example 7 (Production of three-dimensional cell tissue 2) A three-dimensional cell structure of Experimental Example 7 was produced.
  • Experimental Example 7 is a comparative example.
  • a first cell tissue was formed in a 96-well Transwell culture insert coated with a 0.04 mg/mL fibronectin solution.
  • ⁇ Preparation of second cell tissue>> A cell suspension of human hepatocytes (PXB Cells) was obtained in the same manner as in Experimental Example 6, except that the cells were not suspended in the heparin/collagen solution.
  • HCM medium containing 1 v / v% ECGS of 100 ⁇ L / well inside the insert and 300 ⁇ L / well outside the insert was added to the 96 transwell culture insert that formed the first cell tissue, and the inside of the insert 2 ⁇ L/well of the resulting cell suspension was seeded on the first cell tissue of , and cultured for 24 hours without suspension to form a second cell tissue.
  • Example 7 A three-dimensional cell structure of Example 7 was obtained.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of fluorescent immunostaining. As a result, it was confirmed that in the three-dimensional cell tissue of Experimental Example 7, the second cell tissue could not be accumulated in one place on the first cell tissue and existed in a scattered state.

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Abstract

この立体的細胞組織の培養方法は、細胞をカチオン性物質、細胞外マトリックス成分および高分子電解質と混合して混合物を得る工程と、得られた前記混合物から細胞を集め、細胞集合体を得る工程と、前記細胞集合体を、培養容器に収納した培地に播種する工程と、前記播種した細胞集合体を懸濁せずに培養し、立体的細胞組織を得る工程と、を含む。

Description

立体的細胞組織の培養方法
　本発明は、立体的細胞組織の培養方法に関する。
　本願は、２０２１年１２月２２日に日本に出願された特願２０２１－２０８０８６および２０２２年６月６日に日本に出願された特願２０２２－０９１４２２号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年、再生医療はもとより、生体に近い環境が求められる薬剤のアッセイ系において、平板上で成育させた細胞よりも立体的に組織化させた三次元細胞組織を使用することの優位性が示されている。そして、生体外で細胞の三次元組織を構築するための様々な技術が開発されている。例えば、細胞が付着できない表面基板上で細胞塊を形成させる方法や液滴中で細胞塊を形成させる方法、透過性膜上に細胞を集積させる方法等が開発されている。このような細胞の組織化を維持するためには、生体自身が産生するコラーゲンなどの細胞外マトリックス（ＥＣＭともいう）が細胞間の結合や足場形成に必要である。そのため、人為的に細胞組織を構築する際、ＥＣＭを外部から添加することが検討されている。
　特許文献１には、酵素処理等により単離した細胞を、代表的なＥＣＭであって細胞保護作用を有する水溶性高分子であるコラーゲン等と接触させた後、三次元集合体として培養する方法が開示されている。この方法によれば、培養中に細胞周辺で水溶性高分子のゲルが形成される。特許文献２には、温度応答性の樹脂であるｐｏｌｙ（Ｎ－ｉｓｏｐｒｏｐｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）（ＰＩＰＡＡｍ）を表面に固定化した培養皿を用いて細胞シートを作製し、作製した細胞シートを積層することで三次元組織を構築する方法が開示されている。
　ところで、発明者らは、これまでに、細胞と、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分および高分子電解質と混合し、培養することにより、立体的細胞組織を作製する方法の研究を行ってきた（例えば、特許文献３を参照）。
特許第２８２４０８１号公報 国際公開第２００２／００８３８７号 特許第６４２７８３６号公報 国際公開第２０２１／１００７０９号
Nishiguchi A et al., "Cell‐Cell Crosslinking by Bio‐Molecular Recognition of Heparin‐Based Layer‐by‐Layer Nanofilms", Macromol Biosci., vol.15, 312-317, 2015. Kukla et al., Microscale Collagen and Fibroblast Interactions Enhance Primary Human Hepatocyte Functions in Three-Dimensional Models, Gene Expr., 20 (1), 1-18, 2020.
　特許文献３に記載の方法により、立体的細胞組織を作製する場合、培養容器の播種面全体に細胞を播種して三次元組織を形成する。そのため、容器の底面積が大きくなるにつれ播種する細胞の量を多くする必要がある。その結果、培地容量あたりの細胞量が多くなるため、全体の細胞量に対して培地内の栄養が枯渇する場合がある。
　そこで、本発明の解決すべき課題は、立体的細胞組織を培養する方法であって、立体的細胞組織を製造するために播種する細胞数を少なくすることができ、１ヶ所に集積した状態で形成される立体的細胞組織の製造技術を提供することにある。
　本発明者らは、細胞と、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分および高分子電解質と混合し、培養することにより、立体的細胞組織を作製する方法において、細胞を培地に播種した後に、播種した細胞を培地全体に懸濁せずに培養することにより、少ない細胞数で立体的細胞組織を製造できることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］細胞をカチオン性物質、細胞外マトリックス成分および高分子電解質と混合して混合物を得る工程と、得られた前記混合物から細胞を集め、細胞集合体を得る工程と、前記細胞集合体を、培養容器に収納した培地に播種する工程と、前記播種した細胞集合体を懸濁せずに培養し、立体的細胞組織を得る工程と、を含む、立体的細胞組織の培養方法。
［２］前記細胞集合体を、培養容器に収納した培地に播種する工程において、細胞を培地１ｍＬ当り３×１０４～１×１０７個播種する、［１］に記載の立体的細胞組織の培養方法。
［３］前記培養容器が接着培養容器である、［１］または［２］に記載の立体的細胞組織の培養方法。
［４］前記細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、プロテオグリカン、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記高分子電解質は、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、［１］～［３］のいずれか一項に記載の立体的細胞組織の培養方法。
［５］前記混合物中の前記細胞外マトリックス成分の濃度が、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ未満であり、前記混合物中の前記高分子電解質の濃度が、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ未満である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の立体的細胞組織の培養方法。
　もう一つの側面として、本発明は以下の態様を含む。
［６］、第２の細胞を含む細胞集団を、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分および高分子電解質を含む溶液に懸濁して混合物を得る工程と、得られた前記混合物から細胞を集め、細胞集合体を得る工程と、前記細胞集合体を、培地中に配置された第１の細胞を含む第１の細胞組織に接するように配置する工程と、前記細胞集合体および前記第１の細胞組織を懸濁せずに培養し、その結果、前記細胞集合体が第２の細胞組織を形成し、前記立体的細胞組織が形成される工程と、を含み、前記第２の細胞組織が前記第１の細胞組織に接して配置されている、立体的細胞組織の製造方法。
［７］前記第１の細胞が血管内皮細胞を含み、前記第２の細胞が肝細胞を含む、［６］に記載の製造方法。
［８］第１の細胞を含む第１の細胞組織と、第２の細胞を含む第２の細胞組織と、を含み、前記第２の細胞組織は、前記第１の細胞組織に接して配置されている、立体的細胞組織。
［９］前記第１の細胞が血管内皮細胞を含み、前記第２の細胞が肝細胞を含む、［８］に記載の立体的細胞組織。
　本発明によれば、立体的細胞組織を製造するために播種する細胞数を少なくすることができ、１ヶ所に集積した状態で形成される立体的細胞組織の製造技術を提供することができる。
図１の（ａ）は、従来技術に係る実験例を説明する模式図であり、図１の（ｂ）は、従来技術に係る実験例の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。 図２の（ａ）は、従来技術に係る比較実験例を説明する模式図である。図２の（ｂ）は、従来技術に係る比較実験例の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。 図３の（ａ）～（ｃ）は、従来技術に係る実験例の結果を示すグラフである。 実験例１における立体的細胞組織を顕微鏡観察し撮影した写真である。 実験例２における立体的細胞組織を顕微鏡観察し撮影した写真である。 実験例３における立体的細胞組織を顕微鏡観察し撮影した写真である。 実験例４における立体的細胞組織を顕微鏡観察し撮影した写真である。 実験例５における免疫組織染色した立体的細胞組織を、顕微鏡観察し撮影した写真である。 図９は、実験例６の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。 図１０は、実験例７の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。
　本発明の適用の対象となる立体的細胞組織の形態に特に制限は無く、例えば、セルカルチャーインサート等の容器の内部で細胞を培養して形成した立体的細胞組織であってもよいし、コラーゲンなどの天然生体高分子や合成高分子によって構成されたスキャフォール内で細胞を培養して形成した立体的細胞組織や、細胞凝集体（スフェロイド）、シート状の細胞構造体、などに適用し得る。特に、２以上の細胞層からなる積層構造等を有する立体的細胞組織（例えば、シート状の細胞構造体）の場合には、細胞組織の減少によって組織が痩せ細り、当初構成していた層構成が崩れるおそれがあるが、本発明を適用することによりそのリスクを抑えることが可能であることから、より効果的に採用し得るものである。
　また、本明細書において用いる場合、「立体的細胞組織」とは、少なくとも一種類の細胞を含む立体的な集合体を意味する。立体的細胞組織内の細胞は相互に接着している。本発明によって構築される立体的細胞組織には、皮膚、毛髪、骨、軟骨、歯、角膜、血管、リンパ管、心臓、肝臓、膵臓、神経、食道などの生体組織、ならびに固形癌モデル（例えば、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎細胞癌、肝癌など）が挙げられるが、これらに限定されない。立体的細胞組織は、後述する製造方法により製造することができる。
　シート状の細胞構造体としては、例えば、細胞を単層培養した後に培養容器から剥離し、他の単層培養細胞に積層していくことで形成したものや、下記に記載する立体的細胞組織の製造方法によって形成したものに適用することができる。
　本明細書において、細胞集合体とは、細胞の集団を意味する。細胞集合体には、立体的細胞組織、平面的細胞組織、遠心分離やろ過等によって得られる細胞の沈殿体等が含まれる。ここで、平面的細胞組織とは、細胞培養基板上に概ね１層の細胞が接着して形成された組織をいう。平面的細胞組織は、例えば、通常の方法により接着細胞を培養容器内で培養することにより形成することができる。ある実施形態では、細胞集合体はスラリー状の粘稠体である。「スラリー状の粘稠体」とは、非特許文献１に記載されるようなゲル様の細胞集合体を指す。
＜第１実施形態＞
［培養方法］
　第１実施形態は、
（Ａ）細胞をカチオン性物質、細胞外マトリックス成分および高分子電解質と混合して混合物を得る工程と、
（Ｂ）得られた前記混合物から細胞を集め、細胞集合体を得る工程と、
（Ｃ）前記細胞集合体を、培養容器に収納した培地に播種する工程と、
（Ｄ）前記播種した細胞集合体を懸濁せずに培養し、立体的細胞組織を得る工程と、を含む、立体的細胞組織の培養方法に関する。
　本明細書において用いる場合、「播種する」とは、特に断らない限り、立体的細胞組織が形成される前、最初に培地に細胞を細胞集合体として播種することを意味し、立体的細胞組織が形成された後に行う培地交換工程までを含めた工程全体における播種を意味するものではない。
　実施例において後述するように、細胞をカチオン性物質、細胞外マトリックス成分および高分子電解質と混合して混合物を得、得られた前記混合物から細胞を集め、細胞集合体を得、得られた細胞集合体を、培養容器に収納した培地に播種し、細胞を懸濁せずに培養すると、立体的培養組織を構築でき、かつ、立体的細胞組織を製造するために培地に播種する細胞数を少なくすることができる。
　前記立体的細胞組織の製造方法の工程（Ａ）において、細胞をカチオン性物質、細胞外マトリックス成分および高分子電解質と混合する。この細胞混合物から工程（Ｂ）において細胞集合体を形成することにより、内部に大きな空隙が少ない立体的細胞組織を得ることができる。また、得られた立体的細胞組織は、比較的安定であるため、少なくとも数日間の培養が可能であり、かつ培地交換時にも組織が崩壊し難い。
　前記立体的細胞組織の製造方法の工程（Ｂ）では、得られた前記混合物から細胞を集め、細胞集合体を得る。例えば、工程（Ｂ）は、（Ｂ’－０）前記混合物を基材上に配置することで細胞集合体を得る工程であってもよいし、（Ｂ’－１）得られた混合物から液体部分を除去し、細胞集合体を得る工程であってもよいし、（Ｂ’－１）工程に加え（Ｂ’－２）細胞集合体を溶液に懸濁する工程を行ってもよい。工程（Ｂ’－１）および（Ｂ’－２）を行う場合、工程（Ｃ）に代えて、（Ｃ’）得らえた懸濁液を培養容器に収納した培地に播種する工程を含んでもよい。（Ｂ’－２）における溶液は、細胞の生育及び立体的細胞組織の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、細胞集合体を構成する細胞に適した細胞培養培地、緩衝液等を用いることができる。上述の工程（Ａ）～（Ｄ）を実施することで所望の組織体を得ることができるが、工程（Ｂ）として、工程（Ｂ’－１）および（Ｂ’－２）を実施し、工程（Ｃ）に代えて工程（Ｃ’）を実施することで、より均質な組織体を得ることができる。
　前記立体的細胞組織の製造方法における細胞とカチオン性物質、高分子電解質、および細胞外マトリックス成分との混合、つまり工程（Ａ）は、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトルおよびプレートなどの適当な容器中で行われてもよい。工程（Ｂ’－２）における懸濁もまた、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトルおよびプレートなどの適当な容器中で行われてもよい。
（カチオン性物質）
　前記立体的細胞組織の製造方法におけるカチオン性物質としては、細胞の生育および細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の正電荷を有する物質を用いることができる。カチオン性物質には、トリス－塩酸緩衝液、トリス－マレイン酸緩衝液、ビス－トリス－緩衝液、およびＨＥＰＥＳなどのカチオン性緩衝液、ならびにエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリリシン、ポリヒスチジン、およびポリアルギニンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、本発明で用いられるカチオン性物質は、カチオン性緩衝液である。より好ましい実施形態では、本発明で用いられるカチオン性物質は、トリス－塩酸緩衝液である。
　前記立体的細胞組織の製造方法におけるカチオン性物質の濃度は、細胞の生育および細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。本実施形態で用いられるカチオン性物質の濃度は１０～２００ｍＭであることが好ましい。例えば、本実施形態で用いられるカチオン性物質の濃度は、２０～１８０ｍＭ、４０～１６０ｍＭ、６０～１４０ｍＭまたは８０～１２０ｍＭであることが好ましい。本実施形態で用いられるカチオン性物質の濃度は１００ｍＭであることがより好ましい。
　前記立体的細胞組織の製造方法におけるカチオン性物質としてカチオン性緩衝液が用いられる場合、カチオン性緩衝液のｐＨは、細胞の生育および細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは６．０～８．０であることが好ましい。例えば、本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、または８．０である。本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは７．２～７．６であることがより好ましい。本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは７．４であることがさらに好ましい。
（高分子電解質）
　本明細書において、「高分子電解質」とは、高分子鎖中に解離可能な官能基を有する高分子を意味する。本実施形態で用いられる高分子電解質としては、細胞の生育および細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の高分子電解質を用いることができる。高分子電解質には、ヘパリン、コンドロイチン硫酸（例えば、コンドロイチン４－硫酸、コンドロイチン６－硫酸）、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸およびヒアルロン酸等のグリコサミノグリカン；デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、およびポリアクリル酸等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの高分子電解質は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。本実施形態で用いられる高分子電解質は、グリコサミノグリカンであることが好ましい。また、本実施形態で用いられる高分子電解質は、ヘパリン、デキストラン硫酸、コンドロイチン硫酸、またはデルマタン硫酸であることがより好ましい。本実施形態で用いられる高分子電解質は、ヘパリンであることがさらに好ましい。細胞の生育および細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の高分子電解質の誘導体を用いてもよい。
　前記立体的細胞組織の製造方法における高分子電解質の濃度は、細胞の生育および細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。本実施形態で用いられる高分子電解質の濃度は０ｍｇ／ｍＬ超１０．０ｍｇ／ｍＬ未満であることが好ましい。本実施形態で用いられる高分子電解質の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上５．０ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上３．０ｍｇ／ｍＬ以下がさらに好ましい。例えば、本実施形態で用いられる高分子電解質の濃度は、０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、または０．１、０．３、０．５、１．０ｍｇ／ｍＬである。本実施形態で用いられる高分子電解質の濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。本実施形態で用いられる高分子電解質の濃度は、０．０５ｍｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。
　本実施形態において、高分子電解質を適切な溶媒に溶解して用いてもよい。溶媒の例としては、水および緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。上述のカチオン性物質としてカチオン性緩衝液が用いられる場合、高分子電解質をカチオン性緩衝液に溶解して用いてもよい。
（細胞外マトリックス成分）
　前記立体的細胞組織の製造方法における細胞外マトリックス成分としては、細胞の生育および細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、細胞外マトリックスを構成する任意の成分を用いることができる。細胞外マトリックス成分には、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、およびプロテオグリカン等が挙げられるが、これらに限定されない。これらの細胞外マトリックス成分は、単独で用いてもよく、組み合わせて用いてもよい。
　プロテオグリカンには、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン及びデルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態で用いられる細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンの少なくとも１つであることが好ましく、中でもコラーゲンであることがより好ましい。細胞の生育および細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、上述の細胞外マトリックス成分の改変体およびバリアントを用いてもよい。
　細胞外マトリックス成分の濃度は、細胞の生育および細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。本実施形態で用いられる細胞外マトリックス成分の濃度は、０ｍｇ／ｍＬ超１．０ｍｇ／ｍＬ未満であることが好ましい。本実施形態で用いられる細胞外マトリックス成分の濃度は、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下がより好ましく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上０．５ｍｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。例えば、細胞外マトリックス成分の濃度は、０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．２、０．３、０．４、または０．５ｍｇ／ｍＬである。本実施形態で用いられる細胞外マトリックス成分の濃度は、０．０５ｍｇ／ｍＬ以上０．３ｍｇ／ｍＬ以下であることがさらに好ましい。本実施形態で用いられる細胞外マトリックス成分の濃度は、０．０５ｍｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。本実施形態において、細胞外マトリックス成分を適切な溶媒に溶解して用いてもよい。溶媒の例としては、水、緩衝液および酢酸などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態では、細胞外マトリックス成分は緩衝液または酢酸に溶解されることが好ましい。
　前記立体的細胞組織の製造方法における高分子電解質と細胞外マトリックス成分との配合比は、１：２～２：１であることが好ましい。本実施形態で用いられる高分子電解質と細胞外マトリックス成分との配合比は、１：１．５～１．５：１であることがより好ましい。本実施形態で用いられる高分子電解質と細胞外マトリックス成分との配合比は、１：１であることがさらに好ましい。
　前記立体的細胞組織の製造方法に用いられる細胞は、特に限定されないが、例えば、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウスおよびラット等の動物に由来する細胞である。細胞の由来部位も特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、骨、皮膚および血液等などに由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよい。さらに、本実施形態に係る方法に用いられる細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞ともいう）、胚性幹細胞（ＥＳ細胞ともいう）であってもよい。あるいは、初代培養細胞、継代培養細胞、および細胞株細胞などの培養細胞であってもよい。一種類の細胞を用いてもよいし、複数種類の細胞を用いてもよい。本実施形態に係る方法に用いられる細胞には、例えば、神経細胞、樹状細胞、免疫細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、線維芽細胞、肝癌細胞等の癌細胞、上皮細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、組織幹細胞、および平滑筋細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本実施形態の立体的細胞組織は、生体内の組織の機能を模倣する組織であるため、前記立体的細胞組織の製造方法に用いられる細胞は、不死化された細胞以外の細胞であることが好ましい。
　前記立体的細胞組織の製造方法により得られる立体的細胞組織は、一種類の細胞を含んでいてもよく、複数種類の細胞を含んでいてもよい。本実施形態では、立体的細胞組織に含まれる細胞は、神経細胞、樹状細胞、免疫細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、線維芽細胞、癌細胞、上皮細胞、心筋細胞、肝細胞、膵島細胞、組織幹細胞、および平滑筋細胞からなる群から選択される。また、本実施形態に係る方法により得られる立体的細胞組織は、脈管構造を有していてもよい。「脈管構造」とは、生体組織における血管網やリンパ管網のような、ネットワーク状の構造を指す。
　前記立体的細胞組織の製造方法では、工程（Ｂ’－０）または工程（Ｂ’－１）における細胞を集める手段として、当業者に公知の手法を用いることができる。例えば、遠心分離、磁性分離、またはろ過によって、細胞を集めてもよい。液体部分を除去してもよい。遠心分離の条件は、細胞の生育および細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、混合物の入ったマイクロチューブまたはセルカルチャーインサートを室温（例えば２５℃）、４００～１０００×ｇで２分間の遠心分離に供して液体部分と細胞集合体とを分離することによって、細胞を集める。あるいは、自然沈降によって細胞を集めた後、液体部分を除去してもよい。工程（Ｂ－０）または（Ｂ’－１）における細胞集合体における細胞の沈殿体は層状であってもよい。
　前記立体的細胞組織の製造方法における工程（Ｂ’－２）において用いられる溶液は、細胞の生育および細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、使用される細胞に適した細胞培養培地または緩衝液が用いられる。
　前記立体的細胞組織の製造方法の工程（Ｃ）において用いられる培養容器は、細胞や微生物の培養に通常用いられている素材および形状を有する容器であってよい。培養容器の素材としては、ガラスや、ステンレス、およびポリスチレン等のプラスチックなどが細胞毒性が無いかもしくは低いものが挙げられるが、これらに限定されない。培養容器としては、ディッシュや、チューブ、フラスコ、ボトルおよびプレートなどが挙げられるが、これらに限定されない。培養容器としては透過膜、例えば、液体中の細胞を通過させず、液体を通すことが可能な材料を有する容器であることが好ましい。透過膜を有する容器としては、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート、Ｎｅｔｗｅｌｌインサート、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）セルカルチャーインサート、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）セルカルチャーインサート等のセルカルチャーインサートが挙げられるが、これらに限定されない。
　培養容器は、接着培養容器でも非接着培養容器でもよいが、接着培養容器が好ましい。接着培養容器を用いることにより、細胞を容器上に接着させた状態で立体的細胞組織を製造することが可能であり、この様な態様では細胞が容器に固定されているため、細胞が拡散せずに培地内で局所的に集積しやすい。また、接着培養容器を用いると、培地交換や評価および観察などの後工程の作業を非常に容易に行うことができる。接着培養容器としては、例えば一般的なポリスチレン製の培養容器や、容器上に細胞接着を促進する高分子等をコーティングした培養容器等が挙げられるが、これらに限定されない。
　前記立体的細胞組織の製造方法では、構築された立体的細胞組織の変形（例えば、組織の収縮または組織末端の剥離等）を抑制するための物質が用いられる。このような物質としては、選択的ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｆｏｒｍｉｎｇ　ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤であるＹ－２７６３２が挙げられるが、これに限定されない。本実施形態では、当該物質の存在下で工程（Ｄ）を行う。当該物質の存在下で細胞集合体を培養することにより構築された立体的細胞組織の収縮が抑制される。その結果、構築された組織が培養容器から剥離することが抑制される。例えば、工程（Ａ）において、このような物質をさらに混合してもよい。あるいは、工程（Ｂ’－２）において用いる溶液に、このような物質をさらに添加してもよい。あるいは、工程（Ｄ）で細胞を培養する際に、このような物質を培地に添加してもよい。
　前記立体的細胞組織の製造方法の工程（Ｄ）において、細胞の培養は、培養される細胞に適した培養条件下で行うことができる。当業者は、細胞の種類や所望の機能に応じて適切な培地を選択することができる。細胞培養培地としては特に限定されないが、Ｄ－ＭＥＭ、Ｅ－ＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ－１６４０、Ｍｃｃｏｙ‘５ａ、およびＨａｍ’ｓ　Ｆ－１２等や、これらにＣＳ（ウシ血清ともいう）、ＦＢＳ（ウシ胎児血清ともいう）およびＨＢＳ（ウマ胎児血清ともいう）等の血清を１～２０容量％程度になるように添加した培地が挙げられる。培養環境の温度や大気組成等の諸条件もまた、当業者が容易に定めうる。
　立体的細胞組織中の細胞の数は、立体的細胞組織を製造する際に播種された細胞数によって決められてもよい。また、立体的細胞組織中の細胞の数は、生細胞の数であってもよい。立体的細胞組織中の生細胞の数は、１．５×１０６個以上であってもよい。
　工程（Ｃ）において、播種する細胞の数は、立体的細胞組織を製造することができれば、特に制限はないが、培地１ｍＬ当り３×１０４～１×１０７個が好ましく、例えば、培地１ｍＬ当り３×１０４～９×１０6個、培地１ｍＬ当り３×１０４～８×１０６個、培地１ｍＬ当り３×１０４～７×１０６個、培地１ｍＬ当り３×１０４～６×１０６個、培地１ｍＬ当り３×１０４～５×１０６個、培地１ｍＬ当り３×１０４～４×１０６個、培地１ｍＬ当り３×１０４～３×１０６個、培地１ｍＬ当り３×１０４～２×１０６個、培地１ｍＬ当り３×１０４～１×１０６個であってもよい。なお、工程（Ｃ）において、「播種する細胞の数」とは、立体的細胞組織が形成される前、最初に培地に播種する際の培地量あたりの細胞の数である。
　工程（Ｃ）において、細胞集合体の培地への播種は、細胞集合体を培地表面に滴下することであっても、細胞集合体を培地内に注入することであっても、あるいは培地を液滴として形成し、液滴内部に細胞集合体を注入することであってもよい。細胞集合体は、培地中で拡散しないよう局所的に集積している状態で播種される。より好ましくは、細胞集合体は、培地中に拡散しないよう培養容器の側面または底面に接着し局所的に集積している状態で播種される。
　立体的細胞組織が形成される前、培養容器に最初に収納する培地の量は、特に制限はないが、培地の量を少なくすることにより、培養容器内の培地に最初に播種する細胞の数も少なくすることができる。培地の量は、用いる培養容器の大きさにより適宜決定される。なお、立体的細胞組織が形成された後に行う培地交換の際の培地量については特に制限はなく、適宜決定される。
　実施例において後述するように、工程（Ｄ）において、工程（Ｃ）で播種した細胞集合体を懸濁せずに培養する。「細胞集合体を懸濁せずに培養する」とは、培地中に細胞集合体を略均一に拡散させることなく、局所的に密集した状態で培養することを意味し、好ましくは培養容器の側面または底面に接着し局所的に密集させた状態で培養することを意味する。播種した細胞集合体を懸濁せずに培養した場合であっても、通常の細胞であれば培地中に自ずと拡散してしまい立体的細胞組織の構築は困難であり、加えて細胞が二次元的に密集してしまう。そのため、二次元平面培養時においては忌避されるコンフルエンシーの高い状態を局所的に誘引してしまうことから、懸濁せずに培養する工程は、一般的には細胞培養において適切ではない工程である。一方で、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分および高分子電解質を用いた一連の処理がされた細胞を用いる、本実施形態の立体的細胞組織の製造方法においては、細胞が拡散せずに培地内で局所的に集積し細胞の密度が高くなるため、播種する細胞数が少なくても、立体的細胞組織を製造することができる。
　細胞懸濁液を播種する場合、つまり工程（Ｂ）として工程（Ｂ’－１）および（Ｂ’－２）を行う場合、細胞懸濁液中の細胞の密度は、特に制限はされないが、２×１０６～１×１０８個／ｍＬが好ましく、例えば、２×１０６～９×１０７個／ｍＬ、２×１０６～８×１０７個／ｍＬ、２×１０６～７×１０７個／ｍＬ、２×１０６～６×１０７個／ｍＬ、２×１０6～５×１０７個／ｍＬ、２×１０6～４×１０７個／ｍＬ、２×１０6～３×１０７個／ｍＬ、２×１０6～２×１０７個／ｍＬ、２×１０６～１×１０７個／ｍＬ、２．５×１０６～１×１０８個／ｍＬが好ましく、例えば、２．５×１０６～９×１０７個／ｍＬ、２．５×１０６～８×１０７個／ｍＬ、２．５×１０６～７×１０７個／ｍＬ、２．５×１０６～６×１０７個／ｍＬ、２．５×１０6～５×１０７個／ｍＬ、２．５×１０6～４×１０７個／ｍＬ、２．５×１０6～３×１０７個／ｍＬ、２．５×１０6～２×１０７個／ｍＬ、２．５×１０６～１×１０７個／ｍＬであってもよい。
　細胞集合体、又は、細胞集合体を懸濁した場合には懸濁された細胞は、１，０００個／ｍｍ２以上、例えば１０，０００個／ｍｍ２以上、例えば２０，０００個／ｍｍ２以上、例えば２５，０００個／ｍｍ２以上の細胞密度となるように局所的に集積して播種することが好ましい。また、細胞は、例えば１，０００，０００個／ｍｍ２以下、例えば５００，０００個／ｍｍ２以下、例えば２００，０００個／ｍｍ２以下、例えば１００，０００個／ｍｍ２以下の細胞密度で播種することができる。細胞集合体を溶液に懸濁する工程、及び、細胞を沈殿させる工程を実施することにより、より均質な立体的細胞組織を得ることができる。
　前記立体的細胞組織の製造方法の工程（Ａ）～（Ｃ）または（Ａ）～（Ｃ’）を繰り返すことで、細胞集合体を積層することが可能である。これにより、複数の層を有する立体的細胞組織を構築することができる。この場合、複数種類の細胞を用いて、異なる種類の細胞によって構成される立体的細胞組織を構築してもよい。前記立体的細胞組織の製造方法によれば、構築される立体的細胞組織の厚さは約５～約３００、約４００、あるいは約５００μｍである。好ましくは、６０μｍ以上、より好ましくは２００μｍ以上、さらに好ましくは２５０μｍ以上である。本発明の上記方法の工程（Ａ）～（Ｃ）または（Ａ）～（Ｃ’）を繰り返すことにより、例えば、厚さが１５０～５００μｍと厚みがあるにもかかわらず、内部に空隙の少ない立体的細胞組織が得られる。本実施形態では、構築される立体的細胞組織における細胞層の数は１～約１００層であることが好ましく、約１０～約１００層であることがより好ましい。細胞層とは、立体的細胞組織の厚み方向の断面の切片画像において、細胞核を認識できる倍率、つまり、染色した切片の厚みの全体が視野に入る倍率で観察した際に、細胞の自重、高さ方向に対して細胞核が重ならない時に別の層と定義する。なお、その際、自重と垂直（横）方向の視野は、少なくとも２００μｍ以上は確保する。なお、本実施形態においては、１００～２００倍の倍率で立体的細胞組織の厚み方向の断面の切片画像を観察する。
　前記立体的細胞組織の製造方法の工程（Ａ）～（Ｃ）または（Ａ）～（Ｃ’）を繰り返すことで得られた立体的細胞組織は、従来の細胞の積層方法により得られた立体的細胞組織と比較して、単位厚み当たりの細胞層の数が少ない。前記立体的細胞組織の製造方法において、構築される立体的細胞組織は、生体外で得られる。また、前記立体的細胞組織の製造方法に係る立体的細胞組織は、細胞と、細胞外マトリックス成分とを含有し、厚み１０μｍ当たりの細胞層の数が、２．８層以下であり、好ましくは２．５層以下であり、より好ましくは２．２層以下である。前記立体的細胞組織の製造方法において、得られた立体的細胞組織において、厚みが最大となる位置（最大地点）を含む領域における厚み方向１００μｍ、幅方向５０μｍの面積あたりの細胞数が５個以上７０個以下であることが好ましく、１０個以上６０個以下であることがより好ましく、１５個以上５０個以下であることがさらに好ましい。
　本実施形態においては、組織の厚み方向の断面からなる切片を用いて、細胞数を以下のように測定することができる。当該切片において、所定の大きさ以上の空隙がない領域のうち、立体的細胞組織の厚みが最大になる位置（最大地点）を決定する。厚みの最大値付近を含む幅５０μｍの短冊状（組織の天面から底面までを含む）の領域を測定領域として、当該測定領域中に含まれる細胞核の数を計数する。当該測定領域は、空隙を含まないように決定する。なお、空隙の所定の大きさとは、最大径５０μｍ以上をいう。空隙の最大径とは空隙が矩形の場合は長辺、球形の場合は直径、楕円形の場合は長径、不定形の場合は略楕円に近似した場合の長径をいう。なお、ＨＥ染色した切片上で空隙は染色されない。但し、厚みの最大値を含む領域の天面が凸形状の場合、組織が基材から剥離している場合もある。このような場合は、その最大値近傍でかつ天面が比較的平坦な領域を測定領域とする。この場合、厚みの最大値付近を含む幅方向１００μｍ～６５０μｍの領域を測定領域とする。
　計数した当該測定領域に少なくとも一部分が含まれている細胞核は、測定領域に含まれる細胞核として計数する。計数した細胞数から、厚み方向１００μｍ、幅方向５０μｍの面積あたりの前記細胞数を算出する。
＜第２実施形態＞
　第２実施形態の立体的細胞組織の製造方法は、第１の細胞を含む第１の細胞組織と、第２の細胞を含む第２の細胞組織と、を含み、前記第２の細胞組織は、前記第１の細胞組織に接して配置されている、立体的細胞組織の製造方法であって、前記第２の細胞を含む細胞集団を、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分および高分子電解質を含む溶液に懸濁して混合物を得る工程と、得られた前記混合物から細胞を集め、細胞集合体を得る工程と、前記細胞集合体を、培地中に配置された前記第１の細胞組織に接するように配置する工程と、前記細胞集合体および前記第１の細胞組織を懸濁せずに培養し、その結果、前記細胞集合体が前記第２の細胞組織を形成し、前記立体的細胞組織が形成される工程と、を含む。
　特許文献４は、特許文献３の手法を応用して作成した、血管構造を有する立体的細胞組織について、血管構造特異的な毒性を惹起する化合物のスクリーニング用途への適用性を示している。
　特許文献４に記載するように、立体的細胞組織を構成するすべての細胞を混合した懸濁液を調製して播種することにより立体的細胞組織を形成する場合、各種細胞がランダムに相互接触した構造が形成されることになる。
　しかしながら、肝細胞等の一部の細胞においては、その細胞固有の特異的性質が発現し長期間維持されるために、その細胞種のみで立体的細胞組織を形成することが重要であることが報告されている（例えば、非特許文献２を参照）。
　また、このような性質を有する細胞種Ｘと、例えば血管を有する間質構造等の別組成からなる組織Ｙとの相互作用を評価したい場合に、細胞種Ｘで形成した立体的細胞組織と、組織Ｙを個別に分離して形成し、同じ容器内で非接触で共培養して評価すると、これらの細胞を混合して組織化した場合には発現する相互作用が発現しないケースも確認されている。
　本発明者らは、以前に、特許文献４に記載の手法に基づき、肝細胞と肝臓の類洞由来の血管内皮細胞と肝星細胞との３種の細胞を含む立体的細胞組織を作製し、血管内皮細胞を損傷するリスクが示唆されている化合物（例えばモノクロタリン）に暴露する実験を行った。その結果、肝細胞による代謝作用によって活性化した反応性代謝物が、血管内皮細胞を損傷することを明らかにした。
　図１の（ａ）は、この実験を説明する模式図である。図１の（ａ）に示すように、肝細胞と血管内皮細胞と肝星細胞との３種の細胞を含む立体的細胞組織を作製した。続いて、この立体的細胞組織に様々な濃度のモノクロタリンを暴露した後、組織を固定して蛍光免疫染色によりＣＤ３１を染色した。ＣＤ３１は、内皮細胞のマーカーである。
　図１の（ｂ）の上段は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。図１の（ｂ）の下段は、図１Ｂの上段の画像を処理し、スケルトン化した画像である。その結果、モノクロタリンの濃度依存的に血管内皮細胞血管が損傷することが示された。
　図２の（ａ）は、比較実験を説明する模式図である。図２の（ａ）に示すように、肝細胞のみからなる肝組織と、血管内皮細胞及び肝星細胞の２種の細胞を含む立体的細胞組織をそれぞれ作製し、同一ウェル内に配置した。続いて、様々な濃度のモノクロタリンを暴露した後、組織を固定して蛍光免疫染色によりＣＤ３１を染色した。
　図２の（ｂ）は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡画像である。その結果、モノクロタリンを暴露しても血管内皮細胞血管の損傷は観察されなかった。
　以上の結果は、モノクロタリンの作用を正確に評価するためには、肝細胞と血管組織とが近傍に存在している立体的細胞組織を使用する必要があることを示している。
　しかしながら、発明者らは、以前に、図１の（ａ）に示すような、３種の細胞をランダムに混合して作製した立体的細胞組織の培養を継続すると、肝機能関連遺伝子の発現が低下することを明らかにした。
　図３の（ａ）～（ｃ）は、図１の（ａ）に示すものと同様の３種の細胞をランダムに混合して作製した立体的細胞組織、及び、肝細胞のみからなる立体的細胞組織をそれぞれ作製して培養し、１日後、４日後および８日後にＲＮＡ－ｓｅｑ解析により、肝機能関連遺伝子の発現量を測定した結果を示すグラフである。肝機能関連遺伝子としては、ＣＹＰ３Ａ４、ＡＬＢおよびＣＹＰ２Ｃ９を検討した。図３の（ａ）は、ＣＹＰ３Ａ４の測定結果を示すグラフである。図３の（ｂ）は、ＡＬＢの測定結果を示すグラフである。図３の（ｃ）は、ＣＹＰ２Ｃ９の測定結果を示すグラフである。
　図３の（ａ）～（ｃ）中、「混合組織」は、図１の（ａ）に示すものと同様の３種の細胞をランダムに混合して作製した立体的細胞組織を示し、「肝細胞のみ」は肝細胞のみからなる立体的細胞組織を示す。また、グラフの縦軸は各遺伝子の相対的な発現量に相当する。
　その結果、肝細胞のみからなる立体的細胞組織では、肝機能関連遺伝子の発現が維持されていたのに対し、３種の細胞をランダムに混合して作製した立体的細胞組織では、肝細胞の機能が変化し、肝機能関連遺伝子の発現が低下することが明らかとなった。
　この結果は、複数種類の細胞を混合して作製した立体的細胞組織では、特定の細胞の機能を正確に評価できない場合があることを示す。
　このようなケースを鑑みると、細胞種Ｘと組織Ｙとの相互作用を正確に評価するためには、細胞種Ｘが１ヶ所に集積した立体的細胞組織が、組織Ｙに接して配置された立体的細胞組織を使用することが望まれる。
　本実施形態は、第１の細胞組織に接して、第２の細胞組織が配置されている、立体的細胞組織を製造する方法について説明する。
　実施例において後述するように、本実施形態の製造方法によれば、第１の細胞組織に接して第２の細胞組織が配置されている、立体的細胞組織を製造することができる。本実施形態の製造方法により得られる立体的細胞組織において、第２の細胞組織は、１ヶ所に集積している。したがって、図１の（ａ）～図３の（ｃ）を参照して上述したような、細胞種Ｘがその機能を維持するために、１ヶ所に集積した立体的細胞組織を形成している必要がある場合であっても、細胞種Ｘと組織Ｙとの相互作用を正確に評価することができる。この場合、細胞種Ｘは、第２の細胞に対応する。
　本実施形態の製造方法において、第１の細胞組織は、立体的細胞組織であってもよいし、平面的細胞組織であってもよい。
　第１の細胞組織は、第１の細胞を含む。第１の細胞は、第２の細胞との相互作用を評価する対象の細胞である。第１の細胞は、１種類の細胞であってもよいし、２種以上の細胞を含んでいてもよい。第１の細胞は、間質細胞を含むことが好ましい。間質細胞とは、上皮細胞の支持組織を構成する細胞を意味する。間質細胞の由来としては特に限定はされず、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウスおよびラット等の哺乳動物に由来する細胞を使用することができる。より具体的な間質細胞としては、線維芽細胞、免疫細胞、血管内皮細胞、平滑筋細胞および類洞内皮細胞等が挙げられる。免疫細胞としては、リンパ球、好中球およびマクロファージ等が挙げられる。
　第１の細胞組織が立体的細胞組織である場合、第１実施形態に記載した細胞集合体と同様にして第１の細胞集合体を調製してもよいが、これに限定されない。
　第１の細胞組織は、培地中に配置されている。培地については第１実施したものを使用することができる。これらに加え、培地として肝細胞用培地（ＨＣＭ、ロンザ社）、腎臓細胞用培地（ＲＥＧＭ、ロンザ社）、神経細胞用培地（ＡＧＭ、ロンザ社）等を適宜用いてもよい。培養環境の温度や大気組成等の諸条件もまた、当業者であれば容易に決定することができる。第１の細胞組織は、培養容器内に配置されていることが好ましい。培養容器としては、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、ウェルプレート、セルカルチャーインサート等が挙げられる。
　第２の細胞は、第１の細胞との相互作用を評価する対象の細胞である。第２の細胞は、その機能を維持するために、１ヶ所に集積した立体的細胞組織を形成している必要がある細胞であることが好ましい。第２の細胞は、１種類の細胞であってもよいし、２種以上の細胞を含んでいてもよい。
　例えば、前記第１の細胞が血管内皮細胞を含み、前記第２の細胞が肝細胞を含んでいてもよい。この場合、肝細胞と血管内皮細胞との相互作用を正確に評価することができる。
　本実施形態の製造方法において、第２の細胞を含む細胞集団を、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む溶液に懸濁して混合物を得る工程は、第１実施形態に記載の立体的細胞組織の工程（Ａ）と同様の工程である。カチオン性物質、細胞外マトリックス成分および高分子電解質については、上述したものと同様である。また、混合物から細胞を集め、細胞集合体を得る工程は、第１実施形態に記載の立体的細胞組織の工程（Ｂ）と同様の工程である。
　本実施形態において、第１実施形態に記載の工程（Ａ）における混合物中の細胞外マトリックス成分の含有量の合計は、特に限定されず、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上０．５ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上０．３ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。細胞外マトリックス成分は、適切な溶媒に溶解して用いることができる。
　本実施形態において、第１実施形態に記載の工程（Ａ）における混合物中の高分子電解質の濃度は、特に限定されない。細胞外マトリックス成分と異なり、高分子電解質は、溶解の限界以下であれば、どのような濃度であっても効果があり、また、細胞外マトリックス成分による効果を阻害しない。高分子電解質の濃度は、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上０．５ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。
　本実施形態の製造方法において、上記第２の細胞を含む細胞集合体を、培地中に配置された前記第１の細胞組織に接するように配置する工程は、上述した立体的細胞組織の工程（Ｃ）と同様の工程である。本実施形態では、上述した立体的細胞組織の工程（Ｃ）において、第１の細胞組織に接するように第２の細胞集合体を播種する。すなわち、第１実施形態の立体的細胞組織の工程（Ｃ）では、細胞集合体を、培養容器に収納した培地に播種するのに対し、本実施形態では、培地中に配置された第１の細胞組織に接するように第２の細胞集合体を配置する。
　続いて、上記第１の細胞組織および第２の細胞集合体を培養し、その結果、上記混合物が第２の細胞組織を形成し、全体として１つの立体的細胞組織が形成される。ここで、上記第２の細胞集合体を配置した後、懸濁せずに培養し、第２の細胞組織を形成させる。これにより、第１の細胞組織上の１ヶ所に集積した状態で第２の細胞組織が形成されやすくなる。
　実施例において後述するように、本実施形態の製造方法によれば、第２の細胞が分散することなく、１ヶ所に集積した状態で第１の細胞組織に接した立体的細胞組織を得ることができる。
［立体的細胞組織］
　本実施形態は、第１の細胞を含む第１の細胞組織と、第２の細胞を含む第２の細胞組織と、を含み、前記第２の細胞組織は、前記第１の細胞組織に接して配置されている、立体的細胞組織を提供する。
　本実施形態の立体的細胞組織は、上述した本実施形態の製造方法により製造することができる。本実施形態の立体的細胞組織において、第２の細胞組織は、１ヶ所に集積している。すなわち、第２の細胞組織は、立体的細胞組織である。したがって、図１Ａ～図３Ｃを参照して上述したような、細胞種Ｘがその機能を維持するために、１ヶ所に集積した立体的細胞組織を形成している必要がある場合であっても、本実施形態の立体的細胞組織を用いることにより、細胞種Ｘと組織Ｙとの相互作用を正確に評価することができる。この場合、細胞種Ｘは、第２の細胞に対応する。
　本実施形態の立体的細胞組織は、培養容器内に収容されている。培養容器としては、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、ウェルプレートおよびセルカルチャーインサート等が挙げられる。
　本実施形態の立体的細胞組織において、第１の細胞及び第２の細胞については上述したものと同様である。より具体的には、例えば、前記第１の細胞が血管内皮細胞を含み、前記第２の細胞が肝細胞を含んでいてもよい。この場合、肝細胞と血管内皮細胞との相互作用を正確に評価することができる。
　以下に実施例を示して本発明をより詳細かつ具体的に説明するが、実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。以下の実施例において、特に説明がない限り、コラーゲンとしてコラーゲンＩを用いた。
［実験例１］立体的細胞組織の製造１
＜立体的細胞組織の分散液の作成＞
　３．０×１０５細胞のヒト肝細胞（ＰＸＢ　Ｃｅｌｌｓ（登録商標））を、２０μＬの１．０ｍｇ／ｍＬ　ヘパリン／２００ｍＭ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）と、２０μＬの０．６ｍｇ／ｍＬ　コラーゲン／５ｍＭ　酢酸溶液（ｐＨ３．７）溶液との等量混合液（ヘパリン・コラーゲン溶液）に懸濁した。得られた混合物を室温、４００×ｇで２分間、遠心分離した後、上清を除去し、１ｖ／ｖ％の血管内皮細胞グロースサプリメント（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、型番「１０５２」、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ社製、以下、ＥＣＧＳと略記する）を含むＨＣＭ培地（型番「ＣＣ－３１９８」、Ｌｏｎｚａ社製）に、細胞密度が、１．９５×１０４個／２μＬ、９．７５×１０３個／２μＬ、または、４．８７×１０３個／２μＬになるように再懸濁し、細胞懸濁液を得た。また、上記において細胞をヘパリン・コラーゲン溶液に懸濁しない以外は同様にして細胞懸濁液を得た。
＜立体的細胞組織の構築および培養＞
　予め、各ウェルに５００μＬの１ｖ／ｖ％ＥＣＧＳを含むＨＣＭ培地を加えた４８ウェルマイクロプレートの中に、上記で得られた細胞懸濁液を２μＬ播種し、懸濁せずに２４時間培養した。その後、２日置きに１ウェルあたり５００μＬで培地交換を行い７日目まで培養を行った後、各サンプルの形態を位相差顕微鏡によって観察した。その結果を図１に示す。
　図４に示したように、ヘパリン・コラーゲン溶液に懸濁し、１．９５×１０４個の細胞を播種したサンプル（１－１）においては、細胞が培養容器上の一カ所に集積して接着しており、立体的細胞組織が構築されていることが観察された。しかしながら、９．７５×１０３個の細胞を播種したサンプル（１－２）、または、４．８７×１０３個の細胞を播種したサンプル（１－３）、およびヘパリン・コラーゲン溶液に懸濁しなかった細胞を播種したサンプル（１－４～１－６）では、立体的細胞組織が構築されなかった。
［実験例２］立体的細胞組織の製造２
＜立体的細胞組織の分散液の作成＞
　ヒト肝細胞（ＰＸＢ　Ｃｅｌｌｓ（登録商標））６５％、類洞内皮細胞（ＳＥＣ）２５％、肝星細胞（ＬＸ－２）１０％を含む混合細胞を、２０μＬの１．０ｍｇ／ｍＬ　ヘパリン／２００ｍＭ　トリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）と、２０μＬの０．６ｍｇ／ｍＬ　コラーゲン／５ｍＭ　酢酸溶液（ｐＨ３．７）溶液との等量混合液（ヘパリン・コラーゲン溶液）に懸濁した。得られた混合物を室温、４００×ｇで２分間、遠心分離した後、上清を除去し、１ｖ／ｖ％のＥＣＧＳ（型番「１０５２」、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ社製）を含むＨＣＭ培地（型番「ＣＣ－３１９８」、Ｌｏｎｚａ社製）に、総細胞密度が３．０×１０４個／２μＬ、１．５×１０４個／２μＬ、または、７．５×１０３個／２μＬになるように再懸濁し、混合細胞懸濁液を得た。また、上記において混合細胞をヘパリン・コラーゲン溶液に懸濁しない以外は同様にして混合細胞懸濁液を得た。
＜立体的細胞組織の構築および培養＞
　予め、各ウェルに５００μＬの１ｖ／ｖ％ＥＣＧＳを含むＨＣＭ培地を加えた４８ウェルマイクロプレートの中に、上記で得られた混合細胞懸濁液を２μＬ播種し、懸濁せずに２４時間培養した。その後、２日置きに１ウェルあたり５００μＬで培地交換を行い７日目まで培養を行った後、各サンプルの形態を位相差顕微鏡によって観察した。その結果を図２に示す。
　図５に示したように、ヘパリン・コラーゲン溶液に懸濁し、３．０×１０４個の細胞を播種したサンプル（２－１）、または、１．５×１０４個の細胞を播種したサンプル（２－２）においては、細胞が培養容器上の一カ所に集積して接着しており、立体的細胞組織が構築されていることが観察された。しかしながら、７．５×１０３個の細胞を播種したサンプル（２－３）、およびヘパリン・コラーゲン溶液に懸濁しなかった細胞を播種したサンプル（２－４～２－６）では、立体的細胞組織が構築されなかった。
［実験例３］立体的細胞組織の製造３
＜立体的細胞組織の分散液の作成＞
　細胞密度が、９．７５×１０３個／２μＬ、または、４．８７×１０３個／２μＬになるように再懸濁する以外は実験例１と同様にして、細胞懸濁液を得た。また、ヘパリン・コラーゲン溶液に懸濁しない細胞懸濁液も実験例１と同様にして得た。
＜立体的細胞組織の構築および培養＞
　４８ウェルマイクロプレートの各ウェルの表面に形成した３０μＬの１ｖ／ｖ％ＥＣＧＳを含むＨＣＭ培地からなる液滴の内部に、上記細胞懸濁液を２μＬ播種し、懸濁せずに２４時間培養した。その後、２日置きに１ウェルあたり５００μＬで培地交換を行い７日目まで培養を行った後、各サンプルの形態を位相差顕微鏡によって観察した。その結果を図６に示す。
　図６に示したように、ヘパリン・コラーゲン溶液に懸濁した細胞を播種したサンプル（３－１、３－２）において、立体的な組織が構築できていることが観察された。しかしながら、ヘパリン・コラーゲン溶液に懸濁しなかったサンプル（３－３、３－４）では、細胞が平面的に容器に接着しており、立体的な組織が構築されなかった。
［実験例４］立体的細胞組織の製造４
＜立体的細胞組織の分散液の作成＞
　細胞密度が、１．５×１０４個／２μＬ、または、７．５×１０３個／２μＬになるように再懸濁する以外は実験例２と同様にして、混合細胞懸濁液を得た。また、ヘパリン・コラーゲン溶液に懸濁しない細胞懸濁液も実験例２と同様にして得た。
＜立体的細胞組織の構築および培養＞
　４８ウェルマイクロプレートの各ウェルの表面に形成した３０μＬの１ｖ／ｖ％ＥＣＧＳを含むＨＣＭ培地からなる液滴の内部に、上記混合細胞懸濁液を２μＬ播種し、懸濁せずに２４時間培養した。その後、２日置きに１ウェルあたり５００μＬで培地交換を行い７日目まで培養を行った後、各サンプルの形態を位相差顕微鏡によって観察した。その結果を図７に示す。
　図７に示したように、ヘパリン・コラーゲン溶液に懸濁した細胞を播種したサンプル（４－１、４－２）において、立体的な組織が構築できていることが観察された。しかしながら、ヘパリン・コラーゲン溶液に懸濁しなかった細胞を播種したサンプル（４－３、４－４）では、細胞が平面的に容器に接着しており、立体的な組織が構築されなかった。
［実験例５］立体的細胞組織の製造５
＜立体的細胞組織の分散液の作成＞
　実験例２と同様にして、総細胞密度が３．０×１０４個／２μＬ、１．５×１０４個／２μＬ、または、７．５×１０３個／２μＬの混合細胞懸濁液を得た。
＜立体的細胞組織の構築および培養＞
　次に、４８ウェルマイクロプレートの各ウェルの表面に形成した３０μＬの１ｖ／ｖ％ＥＣＧＳを含むＨＣＭ培地からなる液滴の内部に、上記混合細胞懸濁液を２μＬ播種し、懸濁せずに２４時間培養した。その後、２日置きに１ウェルあたり５００μＬで培地交換を行い７日目まで培養を行った後、４％パラホルムアルデヒドによって組織を固定した。
＜免疫組織染色＞
　上記で得られた立体的細胞組織サンプルを、抗ＣＤ３１抗体（モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ３１抗体、Ｃｌｏｎｅ　ＪＣ７０Ａ、Ｃｏｄｅ　Ｍ０８２３、Ｄａｋｏ社製）、または抗ＭＲＰ２抗体（モノクローナルマウス抗ヒトＭＲＰ２抗体、Ｃｌｏｎｅ　Ｍ２　III－６、Ｃｏｄｅ　ａｂ３３７３、ａｂｃａｍ社製）を一次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を二次抗体として用いて、各サンプルの免疫組織染色を行った。免疫組織染色の方法は公知の方法に従った。その結果を図８に示す。
　図８に示したように、ＣＤ３１を用いた免疫組織染色の結果、全てのサンプルにおいて、組織中に血管網が形成されていることが確認された。また、ＭＲＰ２を用いた免疫組織染色の結果により、全てのサンプルにおいて、組織中の肝細胞間に毛細胆管が形成されていることが確認された。以上の結果から、構築されたサンプルが正常に組織化されていたことが確認された。
［実験例６］
（立体的細胞組織の製造１）
　実験例６の立体的細胞組織を製造した。実験例６は、実施例である。
《第１の細胞組織の作製》
　１．１２５×１０５個の肝星細胞（ＬＸ－２）及び３．７５×１０４個のヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を培地に懸濁し、細胞懸濁液を得た。培地としては、１ｖ／ｖ％の血管内皮細胞グロースサプリメント（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、型番「１０５２」、Ｓｃｉｅｎｃｅｌｌ社製、以下、「ＥＣＧＳ」と略記する。）を添加したＨＣＭ培地（型番「ＣＣ－３１９８」、ロンザ社製）を使用した。
　続いて、０．０４ｍｇ／ｍＬフィブロネクチン溶液でコーティングした９６ウェルトランズウェルのカルチャーインサート内に、上記の細胞懸濁液を１００μＬ／ウェル播種した。続いて、インサートの外側に１ｖ／ｖ％ＥＣＧＳを含むＨＣＭ培地を３００μＬ／ウェル加え、２４時間培養し、第１の細胞組織を形成した。
《第２の細胞組織の作製》
　２０μＬの１．０ｍｇ／ｍＬヘパリン／２００ｍＭトリス－塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）と、２０μＬの０．６ｍｇ／ｍＬコラーゲン／５ｍＭ酢酸溶液（ｐＨ３．７）溶液との等量混合液（ヘパリン・コラーゲン溶液）に、３．０×１０５個のヒト肝細胞（ＰＸＢ　Ｃｅｌｌｓ）を懸濁し、混合物を得た。
　続いて、得られた混合物を、室温、４００×ｇで２分間遠心分離した後上清を除去して細胞集合体を得た。細胞集合体に１ｖ／ｖ％ＥＣＧＳを含むＨＣＭ培地を加えて再懸濁し、細胞密度が１．９５×１０４個／２μＬとなるように調整し、細胞懸濁液を得た。
　続いて、第１の細胞組織を形成した９６トランズウェルカルチャーインサートに、インサート内に１００μＬ／ウェル、インサート外に３００μＬ／ウェルの１ｖ／ｖ％ＥＣＧＳを含むＨＣＭ培地を加えた状態で、インサートの内側の第１の細胞組織上に、得られた細胞懸濁液を２μＬ／ウェル播種し、懸濁せずに２４時間培養し、第２の細胞集合体を形成させた。
　続いて、２日おきに１００μＬ／ウェル（インサート内）及び３００μＬ／ウェル（インサート外）ずつ培地交換し、８日目まで培養を行い、第１の細胞組織及び第２の細胞組織を含む、実施例１の立体的細胞組織を得た。
《立体的細胞組織の免疫染色》
　続いて、立体的細胞組織を４％パラホルムアルデヒドで固定した。続いて、固定した立体的細胞組織サンプルを、蛍光免疫染色した。
　１次抗体として、抗ＣＤ３１抗体（モノクローナルマウス抗ヒトＣＤ３１抗体、Ｃｌｏｎｅ　ＪＣ７０Ａ、Ｃｏｄｅ　Ｍ０８２３、ダコ社製）及び抗アルブミン抗体（ポリクローナルウサギ抗ヒトアルブミン抗体、Ｃｏｄｅ　１６４７５－１－ＡＰ、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ社製）を使用した。また、２次抗体として、ヤギ抗マウスＩｇＧ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７及びヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）５９４（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）用いた。ＣＤ３１は内皮細胞のマーカーであり、アルブミンは肝細胞のマーカーである。
　図９は、蛍光免疫染色の結果を示す写真である。その結果、実験例６の立体的細胞組織では、第１の細胞組織上の１ヶ所に集積した状態で第２の細胞組織が形成されていることが確認された。
［実験例７］
（立体的細胞組織の製造２）
　実験例７の立体的細胞組織を製造した。実験例７は、比較例である。
《第１の細胞組織の作製》
　実験例６と同様にして、０．０４ｍｇ／ｍＬフィブロネクチン溶液でコーティングした９６ウェルトランズウェルのカルチャーインサート内に、第１の細胞組織を形成した。
《第２の細胞組織の作製》
　細胞をヘパリン・コラーゲン溶液に懸濁しなかった点以外は実験例６と同様にして、ヒト肝細胞（ＰＸＢ　Ｃｅｌｌｓ）の細胞懸濁液を得た。
　続いて、第１の細胞組織を形成した９６トランズウェルカルチャーインサートに、インサート内に１００μＬ／ウェル、インサート外に３００μＬ／ウェルの１ｖ／ｖ％ＥＣＧＳを含むＨＣＭ培地を加えた状態で、インサートの内側の第１の細胞組織上に、得られた細胞懸濁液を２μＬ／ウェル播種し、懸濁せずに２４時間培養し、第２の細胞組織を形成させた。
　続いて、２日おきに１００μＬ／ウェル（インサート内）及び３００μＬ／ウェル（インサート外）ずつ培地交換し、８日目まで培養を行い、第１の細胞組織及び第２の細胞組織を含む、実験例７の立体的細胞組織を得た。
《立体的細胞組織の免疫染色》
　続いて、実験例６と同様にして、実験例７の立体的細胞組織を４％パラホルムアルデヒドで固定し、蛍光免疫染色によりアルブミンを染色した。
　図１０は、蛍光免疫染色の結果を示す写真である。その結果、実験例７の立体的細胞組織では、第２の細胞組織が第１の細胞組織上の１ヶ所には集積できず、散らばった状態で存在していることが確認された。
　実験例６および７の結果は、第２の細胞組織を構成する細胞をヘパリン・コラーゲン溶液に懸濁することにより、第１の細胞組織上の１ヶ所に集積した状態で第２の細胞組織が形成された立体的細胞組織を製造することができることを示す。
　本発明の方法を用いることで、立体的細胞組織を製造するために播種する細胞数を少なくすることができ、１ヶ所に集積した状態で形成される立体的細胞組織の製造技術を提供することができる。

Claims (9)

  1. 　細胞をカチオン性物質、細胞外マトリックス成分および高分子電解質と混合して混合物を得る工程と、
    　得られた前記混合物から細胞を集め、細胞集合体を得る工程と、
    　前記細胞集合体を、培養容器に収納した培地に播種する工程と、
    　前記播種した細胞集合体を懸濁せずに培養し、立体的細胞組織を得る工程と、
    を含む、立体的細胞組織の培養方法。
  2. 　前記細胞集合体を、培養容器に収納した培地に播種する工程において、細胞を培地１ｍＬ当り３×１０４～１×１０7個播種する、請求項１に記載の立体的細胞組織の培養方法。
  3. 　前記培養容器が接着培養容器である、請求項１または２に記載の立体的細胞組織の培養方法。
  4. 　前記細胞外マトリックス成分は、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリリン、プロテオグリカン、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択され、
    　前記高分子電解質は、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１または２に記載の立体的細胞組織の培養方法。
  5. 　前記混合物中の前記細胞外マトリックス成分の濃度が、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ未満であり、
    　前記混合物中の前記高分子電解質の濃度が、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１０ｍｇ／ｍＬ未満である、請求項１または２に記載の立体的細胞組織の培養方法。
  6. 　第２の細胞を含む細胞集団を、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分および高分子電解質を含む溶液に懸濁して混合物を得る工程と、
    　得られた前記混合物から細胞を集め、細胞集合体を得る工程と、前記細胞集合体を、培地中に配置された第１の細胞を含む第１の細胞組織に接するように配置する工程と、
    　前記細胞集合体および前記第１の細胞組織を懸濁せずに培養し、その結果、前記細胞集合体が第２の細胞組織を形成し、立体的細胞組織が形成される工程と、を含み、前記第２の細胞組織が前記第１の細胞組織に接して配置されている、立体的細胞組織の製造方法。
  7. 　前記第１の細胞が血管内皮細胞を含み、前記第２の細胞が肝細胞を含む、請求項６に記載の立体的細胞組織の製造方法。
  8. 　第１の細胞を含む第１の細胞組織と、第２の細胞を含む第２の細胞組織と、を含み、前記第２の細胞組織は、前記第１の細胞組織に接して配置されている、立体的細胞組織。
  9. 　前記第１の細胞が血管内皮細胞を含み、前記第２の細胞が肝細胞を含む、請求項８に記載の立体的細胞組織。
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