JP7239068B2 - 立体的細胞組織の製造方法及び立体的細胞組織 - Google Patents

Description

本発明は、立体的細胞組織の製造方法及び立体的細胞組織に関する。
本願は、２０２０年１１月２６日に日本に出願された特願２０２０－１９６３１０号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。

近年、再生医療及び生体に近い環境が求められる薬剤のアッセイ系等の分野において、平板上で成育させた細胞よりも立体的に組織化させた立体的細胞組織を使用することの優位性が示されている。このため、生体外で立体的細胞組織を構築するための様々な技術が開発されている。

本願発明者らは、以前に、細胞が、カチオン性緩衝液、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を少なくとも含む溶液に懸濁されている混合物を得る工程と、得られた前記混合物から前記細胞を集め、基材上に細胞集合体を形成する工程と、前記細胞を培養し、立体的細胞組織を得る工程と、を含む、立体的細胞組織の製造技術を開発した（例えば、特許文献１を参照）。立体的細胞組織は、例えば、生体組織モデル及び固形癌モデル等に使用して、薬物スクリーニング等の様々なアッセイに利用することができる。

特許第６６３９６３４号公報

しかしながら、時間が経過しても製造時の立体的細胞組織の厚さを維持するためには、更なる改善の余地がある。

そこで、本発明は、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制する技術を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
［１］細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む混合物を得る工程と、前記混合物をゲル化させてゲル状組成物を得る工程と、前記ゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る工程と、を含む、立体的細胞組織の製造方法。
［２］前記ゲル状組成物が、前記細胞外マトリックス成分、アガロース、ペクチン及びフィブリン・モノマーからなる群より選択される少なくとも１種がゲル化したゲル状成分を含む、［１］に記載の製造方法。
［３］前記ゲル状成分が、フィブリン・モノマーがゲル化したフィブリンゲルであり、前記ゲル状組成物を得る工程が、前記混合物に、トロンビン及びフィブリノゲンを混合する工程を含む、［２］に記載の製造方法。
［４］前記ゲル状組成物を得る工程が、前記混合物に前記トロンビンを添加する工程と、前記トロンビンを添加した前記混合物に前記フィブリノゲンを添加し、その結果、前記フィブリンゲルが形成されて前記混合物がゲル化する工程と、を含む、［３］に記載の製造方法。
［５］前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリン、プロテオグリカン及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、［１］～［４］のいずれか１つに記載の製造方法。
［６］前記混合物における、前記細胞外マトリックス成分の含有量の合計が、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下である、［１］～［５］のいずれか１つに記載の製造方法。
［７］前記高分子電解質が、グリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、［１］～［６］のいずれか１つに記載の製造方法。
［８］前記混合物における、前記高分子電解質の含有量が、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上である、［１］～［７］のいずれか１つに記載の製造方法。
［９］前記ゲル状組成物を得る工程の前に、前記混合物に外力を加えて、前記細胞、前記カチオン性物質、前記細胞外マトリックス成分及び前記高分子電解質を含む細胞集合体を得る工程を更に含み、前記ゲル状組成物を得る工程において、前記混合物に代えて前記細胞集合体をゲル化させてゲル状組成物を得る、［１］～［８］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１０］細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分、高分子電解質及びゲル状成分を含む、立体的細胞組織。
［１１］細胞、カチオン性物質、高分子電解質及びゲル状成分を含む、立体的細胞組織。
［１２］前記ゲル状成分は、第１の細胞外マトリックス成分、アガロース、ペクチン及びフィブリン・モノマーからなる群より選択される少なくとも１種がゲル化したゲル状成分である［１１］に記載の立体的細胞組織。
［１３］さらに、第２の細胞外マトリックス成分を含み、前記ゲル状成分は、アガロース、ペクチン及びフィブリン・モノマーからなる群より選択される少なくとも１種がゲル化したゲル状成分である［１１］に記載の立体的細胞組織。
［１４］製造から８日目の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値が、製造直後の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値の８０％以上である、［１０］～［１３］のいずれか１つに記載の立体的細胞組織。

本発明によれば、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制する技術を提供することができる。

実験例１で測定した、立体的細胞組織の薄切切片の代表的な顕微鏡写真である。 実験例１で測定した、立体的細胞組織の薄切切片の代表的な顕微鏡写真である。 実験例１で測定した、立体的細胞組織の薄切切片の代表的な顕微鏡写真である。 実験例１で測定した、立体的細胞組織の薄切切片の代表的な顕微鏡写真である。

［立体的細胞組織の製造方法］
一実施形態において、本発明は、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む混合物を得る工程と、前記混合物をゲル化させてゲル状組成物を得る工程と、前記ゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る工程と、を含む、立体的細胞組織の製造方法を提供する。

本実施形態の製造方法によれば、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制することができる。具体的には、実施例において後述するように、製造から８日目の立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値が、製造直後の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値の８０％以上を維持することができる。ここで、製造から８日目の立体的細胞組織の前記最大値は、ゲル状組成物のインキュベートを開始してから８日間経過した立体的細胞組織を上面から見たときの重心を通る線に沿って、立体的細胞組織を切断して得られる切片において測定される立体的細胞組織の厚さの最大値ともいうことができる。また、製造直後の立体的細胞組織の前記最大値は、ゲル状組成物のインキュベート開始直後の立体的細胞組織を上面から見たときの重心を通る線に沿って、立体的細胞組織を切断して得られる切片において測定される立体的細胞組織の厚さの最大値ともいうことができる。本明細書において、立体的細胞組織の製造直後とは、ゲル状組成物のインキュベートを開始してから５分間～７２時間後であってもよく、１日後（好ましくは２４時間後）であってもよい。また、製造から８日目とは、ゲル状組成物のインキュベートを開始してから８日目（好ましくは１９２時間）であってもよい。

また、実施例において後述するように、本実施形態の製造方法によれば、従来製造することが困難であった厚さの立体的細胞組織を作製することができる。

立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さとは、立体的細胞組織のほぼ中央部における切片の厚さである。立体的細胞組織の形状は、立体的細胞組織の製造に使用した容器によって異なるが、例えば、円柱形状のセルカルチャーインサートを用いて立体的細胞組織を製造した場合には、円柱形状となる。この場合、立体的細胞組織を上面から見たときの形状は円であり、上面から見たときの重心は、円の中心となる。立体的細胞組織の形状は、円柱形状に限定されず、目的に応じて任意の形状であることができる。具体的には、例えば、三角柱形状及び四角柱形状等の多角柱形状等が例示できる。

立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さは、具体的には以下のように測定される。培養した細胞集合体をホルマリン緩衝液（例えば、型番「062-01661」、富士フイルム和光純薬）を用いて各立体的細胞組織を固定する。続いて、立体的細胞組織をパラフィンで包埋後、立体的細胞組織の上面（セルカルチャーインサートを用いて立体的細胞組織を製造する場合には、セルカルチャーインサートの上面）から見たときの重心を通る線に沿って薄切切片を作製する。続いて、薄切切片をヘマトキシリン・エオシン（ＨＥともいう）染色して顕微鏡で観察し、立体的細胞組織の厚さの最大値を測定する。

本明細書において、「立体的細胞組織」とは、立体的な細胞の集合体を意味する。立体的細胞組織の用途としては、生体組織モデル、固形癌モデルが挙げられるが、これらに限定されない。生体組織モデルとしては、皮膚、毛髪、骨、軟骨、歯、角膜、血管、リンパ管、心臓、肝臓、膵臓、神経、及び食道等のモデルが挙げられる。固形癌モデルとしては、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎細胞癌、及び肝癌等のモデルが挙げられる。

また、立体的細胞組織の形態に特に制限は無く、例えば、セルカルチャーインサート等の容器の内部で細胞を培養して形成した立体的細胞組織であってもよいし、コラーゲン等の天然生体高分子や合成高分子によって構成されたスキャフォールド内で細胞を培養して形成した立体的細胞組織であってもよいし、細胞凝集体（スフェロイドともいう）であってもよいし、シート状の細胞構造体であってもよい。

本実施形態の立体的細胞組織の製造方法は、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む混合物を得る工程（ａ）と、前記混合物をゲル化させてゲル状組成物を得る工程（ｂ）と、前記ゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る工程（ｃ）とを含む。以下、各工程について説明する。

まず、工程（ａ）において、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む混合物を得る。細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質の混合は、水性溶媒中で行ってもよい。水性溶媒の例としては、水、緩衝液及び培地が挙げられるが、これらに限定されない。

（細胞）
本実施形態の製造方法において、細胞としては特に限定されず、ヒト、サル、イヌ、ネコ、ウサギ、ブタ、ウシ、マウス及びラット等の哺乳動物に由来する細胞を使用することができる。細胞の由来部位も特に限定されず、骨、筋肉、内臓、神経、脳、皮膚又は血液等に由来する体細胞であってもよく、生殖細胞であってもよく、癌細胞であってもよい。

血液に由来する体細胞としては、リンパ球、好中球、マクロファージ及び樹状細胞等の免疫細胞が挙げられる。また、癌細胞としては、胃癌、食道癌、大腸癌、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎細胞癌及び肝癌等が挙げられる。

また、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）及び胚性幹細胞（ＥＳ細胞）等の多能性幹細胞であってもよく、組織幹細胞であってもよい。

細胞は、初代細胞であってもよいし、継代培養細胞及び細胞株細胞等の培養細胞であってもよい。また、細胞は１種を単独で用いてもよいし、複数種類を混合して用いてもよい。

（カチオン性物質）
カチオン性物質としては、細胞の生育及び後述する細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の正電荷を有する物質を用いることができる。カチオン性物質には、トリス－塩酸、トリス－マレイン酸、ビス－トリス、ＨＥＰＥＳ等のカチオン性緩衝剤、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ポリビニルアミン、ポリアリルアミン、ポリリシン及びポリヒスチジン、ポリアルギニン等が挙げられるが、これらに限定されない。なかでもカチオン性緩衝剤が好ましく、トリス－塩酸がより好ましい。

工程（ａ）における混合物中のカチオン性物質の濃度は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。本実施形態で用いられるカチオン性物質の濃度は、混合物の総体積に対し１０～１００ｍＭであることが好ましく、例えば２０～９０ｍＭであってもよく、例えば３０～８０ｍＭであってもよく、例えば４０～７０ｍＭであってもよく、例えば４５～６０ｍＭであってもよい。

カチオン性物質としてカチオン性緩衝剤を用いる場合、カチオン性緩衝液のｐＨは、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは６．０～８．０であることが好ましい。例えば、本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９又は８．０であってよい。本実施形態で用いられるカチオン性緩衝液のｐＨは７．２～７．６であることがより好ましく、約７．４であることが更に好ましい。

（細胞外マトリックス成分）
細胞外マトリックス成分としては、細胞の生育及び後述する細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、細胞外マトリックス（ＥＣＭともいう）を構成する任意の成分を用いることができる。細胞外マトリックス成分としては、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、フィブリン、プロテオグリカン及びこれらの組み合わせ等が挙げられるが、これらに限定されない。細胞外マトリックス成分は、上述したものの改変体又はバリアント等であってもよい。細胞外マトリックス成分は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

プロテオグリカンとしては、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン及びデルマタン硫酸プロテオグリカンが挙げられる。細胞外マトリックス成分としては、なかでも、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンが好ましく、コラーゲンが特に好ましい。

工程（ａ）における混合物中の細胞外マトリックス成分の含有量の合計は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。混合物の総体積に対する細胞外マトリックス成分の含有量の合計は、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上０．１ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。細胞外マトリックス成分は、適切な溶媒に溶解して用いることができる。溶媒としては、水、緩衝液及び酢酸等が挙げられるが、これらに限定されない。なかでも、緩衝液又は酢酸が好ましい。

（高分子電解質）
本明細書において、高分子電解質とは、高分子鎖中に解離可能な官能基を有する高分子を意味する。本実施形態で用いられる高分子電解質としては、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、任意の高分子電解質を用いることができる。高分子電解質としては、ヘパリン、コンドロイチン硫酸（例えば、コンドロイチン４－硫酸及びコンドロイチン６－硫酸）、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸及びヒアルロン酸等のグリコサミノグリカン、デキストラン硫酸、ラムナン硫酸、フコイダン、カラギナン、ポリスチレンスルホン酸、ポリアクリルアミド－２－メチルプロパンスルホン酸、ポリアクリル酸及びこれらの組み合わせ等が挙げられるが、これらに限定されない。高分子電解質は、上述したものの誘導体であってもよい。これらの高分子電解質は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。

高分子電解質は、グリコサミノグリカンであることが好ましい。なかでも、ヘパリン、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸が好ましく、ヘパリンが特に好ましい。

工程（ａ）における混合物中の高分子電解質の濃度は、細胞の生育及び細胞集合体の形成に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。細胞外マトリックス成分と異なり、高分子電解質は溶解の限界以下であれば、どのような濃度であっても効果があり、また、細胞外マトリックス成分による効果を阻害しない。高分子電解質の濃度は、混合物の総体積に対し０．００５ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０１ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．０２５ｍｇ／ｍＬ以上０．１ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。

高分子電解質は、適切な溶媒に溶解して用いることができる。溶媒の例としては、水及び緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。上述のカチオン性物質としてカチオン性緩衝液が用いられる場合、高分子電解質をカチオン性緩衝液に溶解して用いてもよい。

工程（ａ）における混合物中の高分子電解質と細胞外マトリックス成分との配合比（終濃度比）は１：２～２：１であることが好ましく、１：１．５～１．５：１であってもよく、１：１であってもよい。

工程（ａ）において、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質の混合は、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、ウェルプレート又はセルカルチャーインサート等の適当な容器中で行うことができる。これらの混合は、工程（ｂ）で使用する容器中で行ってもよい。

また、工程（ａ）における混合物は、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質以外の、その他の成分を含んでいてもよい。その他の成分としては、工程（ｂ）においてゲル状組成物を得るために必要なゲル化剤、細胞培養用培地等が挙げられる。

（ゲル化剤）
ゲル化剤としては、細胞外マトリックス成分；アガロース；ペクチン；フィブリノゲン及びトロンビンの組み合わせ等が挙げられる。ゲル化剤は、予め工程（ａ）における混合物中に含有させていてもよいし、以下に説明する工程（ｂ）において、工程（ａ）における混合物に添加してもよい。

工程（ａ）の後、工程（ｂ）において、工程（ａ）で得た混合物をゲル化させてゲル状組成物を得る。ゲル化の方法は、用いるゲル化剤によって異なり、例えば、工程（ａ）で得た混合物をゲル化条件下に置くことであってもよい。あるいは、工程（ａ）で得た混合物にゲル化剤を添加した後、ゲル化条件下に置くことであってもよい。

例えば、細胞外マトリックス成分をゲル化してゲル状組成物を得る場合、ゲル化条件としては、例えば、工程（ａ）で得た混合物を約３７℃で静置する条件が挙げられる。また、工程（ａ）で得た混合物にカルシウム塩等の添加剤を加えてもよい。この結果、工程（ａ）における混合物に含まれていた細胞外マトリックス成分がゲル化し、ゲル状組成物が得られる。あるいは、工程（ａ）で得た混合物に、細胞外マトリックス成分を更に添加したうえで、約３７℃静置してゲル化してもよい。

また、ゲル化剤としてアガロースを用いる場合、工程（ａ）で得た混合物にアガロースを添加して、使用するアガロースの融点以上の温度条件下でアガロースを溶解させた後、使用するアガロースの凝固点以下の温度条件下で静置してゲル化してもよい。一例として、アガロースを溶解させる温度は、５０℃～９０℃が挙げられる。また、溶解したアガロースをゲル化する温度は、３７℃～４０℃が挙げられる。混合物へのアガロースの添加割合は、混合物の総体積に対し０．５％～４％であってもよい。

また、ゲル化剤としてペクチンを用いる場合、工程（ａ）で得た混合物にペクチンを添加してもよい。その結果、混合物中に含まれるカルシウムイオン等の２価のイオンによりペクチンがゲル化し、ゲル状組成物が得られる。混合物へのペクチンの添加割合は、混合物の総体積に対し０．３～１．０％であってもよい。

また、ゲル化剤として、フィブリノゲン及びトロンビンを使用してもよい。セリンプロテアーゼの１種であるトロンビンが、フィブリノゲンを切断することにより、フィブリン・モノマーが形成される。フィブリン・モノマーは、カルシウムイオンの作用により互いに重合して難溶性のフィブリン・ポリマーを形成する。生体内では、第ＸＩＩＩ因子（フィブリン安定化因子）の作用でフィブリン・ポリマー間が架橋結合することにより安定化フィブリンと呼ばれるメッシュ状の繊維が形成され、血液凝固を引き起こす。本明細書では、フィブリン・ポリマーが形成されることでゲル化したゲル状組成物をフィブリンゲルということがある。本明細書においては、フィブリン・モノマーが重合しフィブリン・ポリマーを形成することを、フィブリン・モノマーがゲル化する、と記載する。

すなわち、ゲル状組成物を得る工程（ｂ）が、工程（ａ）で得た混合物に、トロンビン及びフィブリノゲンを混合する工程を含んでいてもよい。そして、工程（ｂ）におけるゲル状組成物は、ゲル状成分としてフィブリンゲルを含んでいてもよい。

この場合、ゲル状組成物を得る工程（ｂ）が、工程（ａ）で得た混合物にトロンビンを添加する工程（ｂ１）と、トロンビンを添加した混合物にフィブリノゲンを添加し、その結果、フィブリンゲルが形成されて混合物がゲル化する工程（ｂ２）とを含むことが好ましい。

ゲル化剤としてフィブリノゲン及びトロンビンを使用する場合には、工程（ｂ）において、混合物中のフィブリノゲン濃度は、０．５ｍｇ／ｍＬ以上７０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．５ｍｇ／ｍＬ以上４５ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ以上２５ｍｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。０．５ｍｇ／ｍＬ以上７０ｍｇ／ｍＬ以下であると、トロンビンと混合されることでフィブリン・モノマーがゲル化しやすくなる。また、２５ｍｇ／ｍＬ以下であることにより、混合物中に溶解しやすくなる。また、トロンビンは、工程（ｂ）において混合物中に溶解あるいは分散していることが好ましい。

工程（ｂ）において、混合物中のトロンビン濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬ以上であることが好ましく５．０ｍｇ／ｍＬ以上であることがより好ましい。混合物中のトロンビン濃度が１．０ｍｇ／ｍＬ以上であると、フィブリン・モノマーがゲル化しやすくなる。混合物中のトロンビン濃度の上限値は特に限定されないが、６０ｍｇ／ｍＬが挙げられる。混合物中のトロンビン濃度の上限値と下限値は、任意に組み合わせることができる。例えば、混合物中のトロンビン濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬ以上６０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、５．０ｍｇ／ｍＬ以上６０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよい。

工程（ｂ）における混合物中のトロンビン濃度及びフィブリノゲン濃度は、相互の濃度に応じて決定されることが好ましい。例えば、混合物中のフィブリノゲン濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ以上５．０ｍｇ／ｍＬ以下であるとき、トロンビン濃度は、１．０ｍｇ／ｍＬ以上６０ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。また、混合物中のフィブリノゲン濃度が１０ｍｇ／ｍＬ以上７０ｍｇ／ｍＬ以下であるとき、トロンビン濃度は、５ｍｇ／ｍＬ以上６０ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましい。

混合物が、抗凝固作用を有する物質（代表的には、高分子電解質としてヘパリンを選択した場合）を含む場合には、フィブリンがポリマー化しないことが考えられる。このため、通常は抗凝固作用を有する物質とフィブリンとを同時に使用することはない。これに対し、本実施形態では、材料の組み合わせによるものか、濃度が薄いことによるものか、理由は不明であるが、フィブリンのポリマー化が阻害されることがない。

また、発明者らは、工程（ａ）で得た混合物に先にフィブリノゲンを添加すると、条件によっては、それのみでゲル化してしまう場合があることを見出した。これは、工程（ａ）で得た混合物中に含まれる何らかのプロテアーゼによりフィブリノゲンが切断され、フィブリン・モノマーが形成されることによるものと推察している。このため、工程（ａ）で得た混合物にトロンビン及びフィブリノゲンを混合する場合には、先にトロンビンを混合し、その後にフィブリノゲンを混合することが好ましい。あるいは、工程（ｂ）において、ゲル化剤としてフィブリノゲンのみを添加しても、ゲル状組成物を得ることができる。

このように、工程（ｂ）で形成されるゲル状組成物は、細胞外マトリックス成分、アガロース、ペクチン、フィブリン・モノマーのうちの少なくとも１種がゲル化したゲル状成分を含んでいてもよい。

続いて、工程（ｃ）において、工程（ｂ）で得たゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る。立体的細胞組織を得るためにゲル状組成物を培養する時間は、５分～１９２時間であってもよく、１２時間～１４４時間であってもよく、２４時間から７２時間であってもよい。工程（ｃ）により、ゲル状組成物に含まれる細胞同士の接着が促進されて立体的細胞組織として安定的なものになるという効果が得られる。

工程（ｃ）における細胞の培養は、培養される細胞に適した培養条件下で行うことができる。当業者は、細胞の種類や所望の機能に応じて適切な培地を選択することができる。培地としては特に限定されないが、例えば、ＤＭＥＭ、ＥＭＥＭ、ＭＥＭα、ＲＰＭＩ－１６４０及びＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ、Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２等の培地、及びこれらに血清を１～２０容量％程度添加した培地が挙げられる。血清としては、ウシ血清（ＣＳ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びウマ胎児血清（ＨＢＳ）等が挙げられる。培養環境の温度や大気組成等の諸条件も、培養される細胞に適した条件に調整すればよい。

工程（ｃ）で用いる容器としては、工程（ｂ）で用いる容器と同様のものが挙げられる。工程（ｃ）において、工程（ｂ）で用いた容器をそのまま用いてもよいし、別の容器に移し替えてもよい。

細胞の培養時に、得られた立体的細胞組織の変形（例えば、組織の収縮、組織末端の剥離等）を抑制するための物質を培地に添加してもよい。このような物質としては、Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤であるＹ－２７６３２等が挙げられるが、これに限定されない。

工程（ａ）及び工程（ｂ）を２回以上行った後に工程（ｃ）を行ってもよい。工程（ａ）及び工程（ｂ）を繰り返すことにより、複数の層を有する立体的細胞組織を製造することができる。すなわち、厚さの大きい立体的細胞組織を製造することができる。

また、工程（ａ）及び工程（ｂ）を繰り返し、繰り返すたびに異なる細胞集団を使用して、異なる種類の細胞によって構成される立体的細胞組織を積層してもよい。例えば、１回目の工程（ａ）と工程（ｂ）を行った後に、１回目の工程（ａ）とは異なる細胞集団を用いて２回目の工程（ａ）を行う。その後、２回目の工程（ｂ）を行うことで、１回目の工程（ａ）で用いた細胞集団を含む層の上に、２回目の工程（ａ）で用いた細胞集団を含む層を形成することができる。このように工程（ａ）及び工程（ｂ）を複数回繰り返すことで、複数種の細胞集団によって構成される立体的細胞組織を積層することができる。

（細胞集合体）
本実施形態の製造方法は、ゲル状組成物を得る工程（ｂ）の前に、工程（ａ）で得た混合物に外力を加えて、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む細胞集合体を得る工程（ａ’）を更に含み、ゲル状組成物を得る工程（ｂ）において、工程（ａ）で得た混合物に代えて工程（ａ’）で得た細胞集合体をゲル化させてゲル状組成物を得るものであってもよい。

この場合、本実施形態の立体的細胞組織の製造方法は、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む混合物を得る工程（ａ）と、前記混合物に外力を加えて、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む細胞集合体を得る工程（ａ’）と、前記細胞集合体をゲル化させてゲル状組成物を得る工程（ｂ’）と、前記ゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る工程（ｃ）とを含むことになる。

本明細書において、「細胞集合体」とは、細胞が集合して一体となった構造体を意味する。細胞集合体には、遠心分離やろ過等によって得られる細胞の沈殿体も含まれる。ある実施形態では、細胞集合体はスラリー状の粘稠体である。「スラリー状の粘稠体」とは、Akihiro Nishiguchi et al., Cell-cell crosslinking by bio-molecular recognition of heparin-based layer-by-layer nanofilms, Macromol Biosci., 15 (3), 312-317, 2015. に記載されるようなゲル状の細胞集合体を指す。

細胞集合体は、工程（ａ）で得た混合物を適切な容器に入れて静置することによって形成することもできるし、工程（ａ）で得た混合物を適切な容器に入れて、例えば、遠心分離、磁性分離又はろ過等によって、細胞を集めて細胞集合体を形成してもよい。すなわち、工程（ａ’）における、外力を加えるとは、静置して重力を作用させること、遠心分離、磁性分離又はろ過等を行うこと等であってよい。静置、遠心分離、磁性分離又はろ過等によって細胞を集めた場合、液体部分は除去してもよいし、除去しなくてもよい。

工程（ａ’）で用いる容器としては、細胞の培養に用いるための培養容器が挙げられる。培養容器は、細胞や微生物の培養に通常用いられている素材及び形状を有する容器であってよい。培養容器の素材としては、ガラス、ステンレス及びプラスチック等が挙げられるが、これらに限定されない。培養容器としては、ディッシュ、チューブ、フラスコ、ボトル、ウェルプレート及びセルカルチャーインサート等が挙げられるが、これらに限定されない。容器は、少なくともその一部が、液体中の細胞を通過させず、液体を通すことが可能な材料で形成されていることが好ましい。このような容器としては、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサート、Ｎｅｔｗｅｌｌ（登録商標）インサート、Ｆａｌｃｏｎ（登録商標）セルカルチャーインサート及びＭｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）セルカルチャーインサート等のセルカルチャーインサートが挙げられるが、これらに限定されない。

遠心分離の条件は、細胞の生育に悪影響を及ぼさない限り、特に限定されない。例えば、混合物をセルカルチャーインサートに入れ、１０℃、４００×ｇで１分間の遠心分離に供することで、細胞を集め、細胞集合体を得ることができる。

細胞集合体をゲル化させてゲル状組成物を得る工程（ｂ’）は、上述した、工程（ａ）で得た混合物をゲル化させてゲル状組成物を得る工程（ｂ）と同様にして行うことができる。

例えば、ゲル化剤として細胞外マトリックス成分を用いる場合、工程（ａ’）で得た細胞集合体を約３７℃で静置してもよいし、工程（ａ’）で得た細胞集合体に、細胞外マトリックス成分を更に添加したうえで、約３７℃で静置してゲル化してもよい。また、工程（ａ’）で得た混合物にカルシウム塩等の添加剤を加えてもよい。

また、ゲル化剤としてアガロースを用いる場合、工程（ａ’）で得た細胞集合体にアガロースを添加して、使用するアガロースの融点以上の温度条件下でアガロースを溶解させた後、使用するアガロースの凝固点以下の温度条件下で静置してゲル化してもよい。一例として、アガロースを溶解させる温度は、５０℃～９０℃が挙げられる。また、溶解したアガロースをゲル化する温度は、３７℃～４０℃が挙げられる。

また、ゲル化剤としてペクチンを用いる場合、工程（ａ’）で得た細胞集合体にペクチンを添加してもよい。その結果、混合物中に含まれるカルシウムイオン等の２価のイオンによりペクチンがゲル化し、ゲル状組成物が得られる。

また、ゲル化剤として、フィブリノゲン及びトロンビンを使用してもよい。すなわち、ゲル状組成物を得る工程（ｂ’）が、工程（ａ’）で得た細胞集合体に、トロンビン及びフィブリノゲンを混合する工程を含んでいてもよい。そして、工程（ｂ’）におけるゲル状組成物は、ゲル状成分としてフィブリンゲルを含んでいてもよい。

この場合、ゲル状組成物を得る工程（ｂ’）が、工程（ａ’）で得た細胞集合体にトロンビンを添加する工程（ｂ１’）と、トロンビンを添加した細胞集合体にフィブリノゲンを添加し、その結果、フィブリンゲルが形成されて混合物がゲル化する工程（ｂ２’）とを含むことが好ましい。

続いて、工程（ｃ）において、工程（ｂ’）で得たゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る。工程（ｃ）については上述したものと同様である。

［立体的細胞組織］
一実施形態において、本発明は、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分、高分子電解質及びゲル状成分を含む、立体的細胞組織を提供する。もう一つの態様として、本発明は、細胞、カチオン性物質、高分子電解質及びゲル状成分を含む、立体的細胞組織を提供する。本実施形態の立体的細胞組織は、経時的な厚さの減少が抑制されている。

本実施形態の立体的細胞組織は、製造から８日目の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値が、製造直後の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値の８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることが好ましく、１００％以上であってもよい。ここで、「製造から８日目」及び「製造直後」については上述したものと同様である。

本実施形態の立体的細胞組織において、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分、高分子電解質及びゲル状成分、については上述したものと同様である。

なお、ゲル状成分とは、細胞外マトリックス成分、アガロース、ペクチン及びフィブリン・モノマーのうちの少なくとも１種がゲル化したゲル状成分である。

ゲル状成分がゲル化した細胞外マトリックスである場合、別の細胞外マトリックスを含んでいなくてもよく、具体的には、立体的細胞組織は、細胞、カチオン性物質、高分子電解質及びゲル状成分を含んでいてもよい。また、ゲル状成分がアガロース、ペクチン及びフィブリン・モノマーのうちの少なくとも１種がゲル化したゲル状成分である場合、立体的細胞組織は、細胞、細胞外マトリックス成分、カチオン性物質、高分子電解質及びゲル状成分を含んでいてもよい。

ゲル状成分が、アガロースがゲル化したゲル状成分である場合、立体的細胞組織に含まれるゲル状成分の含有量は、立体的細胞組織の総体積に対し０．５％～４％であってもよい。

ゲル状成分が、ペクチンがゲル化したゲル状成分である場合、立体的細胞組織に含まれるゲル状成分の含有量は、立体的細胞組織の総体積に対し０．３～１．０％であってもよい。

ゲル状成分が、フィブリン・モノマーがゲル化したゲル状成分である場合、立体的細胞組織に含まれるゲル状成分の含有量は、立体的細胞組織の総体積に対し、０．５ｍｇ／ｍＬ以上７０ｍｇ／ｍＬ以下であってもよく、０．５ｍｇ／ｍＬ以上４５ｍｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、０．５ｍｇ／ｍＬ以上２５ｍｇ／ｍＬ以下であることがより好ましい。

別の側面として、本発明は以下の態様を包含する。
［１］細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む混合物を得る工程と、前記混合物にトロンビン及びフィブリノゲンの少なくとも一方を混合しゲル状組成物を得る工程と、前記ゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る工程と、を含む、立体的細胞組織の製造方法。
［２］前記ゲル状組成物を得る工程が、前記混合物に前記フィブリノゲンを混合し、ゲル状組成物を得る工程である、［１］に記載の立体的細胞組織の製造方法。
［３］前記ゲル状組成物を得る工程が、前記混合物に前記トロンビンを添加する工程と、前記トロンビンを添加した前記混合物に前記フィブリノゲンを添加する工程と、を含む、［１］に記載の製造方法。
［４］前記混合物における、前記フィブリノゲンの含有量が、０．５ｍｇ／ｍＬ以上６０ｍｇ／ｍＬ以下である、［１］～［３］のいずれか１つに記載の製造方法。
［５］前記混合物における、前記トロンビンの含有量が、１．０ｍｇ／ｍＬ以上４０ｍｇ／ｍＬ以下である、［１］～［４］のいずれか１つに記載の製造方法。
［６］前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン及びフィブロネクチンからなる群より選択される少なくとも一つの細胞外マトリックスである、［１］～［５］のいずれか１つに記載の製造方法。
［７］前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲンである、［１］～［６］のいずれか１つに記載の製造方法。
［８］前記混合物における、前記細胞外マトリックス成分の含有量の合計が、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下である、［１］～［７］のいずれか１つに記載の製造方法。
［９］前記高分子電解質が、グリコサミノグリカンである、［１］～［８］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１０］前記高分子電解質が、ヘパリン、コンドロイチン硫酸及びデルマタン硫酸からなる群から選択される少なくとも一つのグリコサミノグリカンである、［９］に記載の製造方法。
［１１］前記混合物における、前記高分子電解質の含有量が、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上である、［１］～［１０］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１２］前記ゲル状組成物を得る工程の前に、前記混合物に外力を加えて、前記細胞、前記カチオン性物質、前記細胞外マトリックス成分及び前記高分子電解質を含む細胞集合体を得る工程を更に含み、前記ゲル状組成物を得る工程において、前記混合物に代えて前記細胞集合体をゲル化させてゲル状組成物を得る、［１］～［１１］のいずれか１つに記載の製造方法。
［１３］細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分、高分子電解質及びゲル化したフィブリン・モノマーを含む、立体的細胞組織。
［１４］前記立体細胞組織における、前記ゲル化したフィブリン・モノマーの含有量が、０．５ｍｇ／ｍＬ以上６０ｍｇ／ｍＬ以下である、［１３］に記載の立体的細胞組織。
［１５］製造から８日目の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値が、製造直後の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値の８０％以上である、［１３］又は［１４］に記載の立体的細胞組織。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実験例１］
（立体的細胞組織の製造）
フィブリンゲルを含まない立体的細胞組織、及び、フィブリンゲルを含む立体的細胞組織をそれぞれ製造した。細胞としてヒト新生児由来皮膚線維芽細胞ＮＨＤＦ（型番「ＣＣ－２５０９」、ロンザ社）を使用した。

《フィブリンゲルを含まない立体的細胞組織の製造》
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％抗生物質溶液（ペニシリン、ストレプトマイシン）を含むＤＭＥＭ培地（型番「０４３－３００８５」、富士フイルム和光純薬）を調製した（以下、「汎用培地」という場合がある。）。また、汎用培地と血管細胞用培地（製品名「ＥＧＭ－２ＭＶ」、型番「ＣＣ－３２０２」、ロンザ社）を１：１（体積比）となるように混合した培地を調製した（以下、「専用培地」という場合がある。）。

１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６及び８×１０^６個のＮＨＤＦ細胞を、それぞれ０．０５ｍｇ／ｍＬヘパリン（型番「Ｈ３１４９－１００ＫＵ」、シグマ社）及び０．０５ｍｇ／ｍＬコラーゲン（型番「ＡＳＣ－１－１００－１００」、シグマ社）を含む、５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）にそれぞれ懸濁した。

続いて、各細胞懸濁液を、室温、１，０００×ｇ（重力加速度）で１分間遠心し、上清を取り除き、適量の専用培地でそれぞれ再懸濁した。続いて、各細胞懸濁液を、２４ウェルセルカルチャーインサート（型番「３４７０」、コーニング社）内に播種した。

続いて、セルカルチャーインサートを、室温、４００×ｇで１分間遠心し、細胞集合体を得た。続いて、セルカルチャーインサートに、適量の専用培地を追加し、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）で８日間培養した。その間適宜培地交換を行った。

《フィブリンゲルを含む立体的細胞組織の製造》
上述した汎用培地に、終濃度１０Ｕｎｉｔ／ｍＬとなるようにトロンビン（型番「Ｔ４６４８－１０ＫＵ」、シグマ社）を溶解し、トロンビン溶液を調製した。

また、ＤＭＥＭ培地に終濃度１０ｍｇ／ｍＬとなるようにフィブリノゲン（型番「Ｆ８６３０－５Ｇ」、シグマ社）を溶解し、フィブリノゲン溶液を調製した。更に、フィブリノゲン溶液と汎用培地を１：１（体積比）となるように混合した培地を調製した（以下、「フィブリノゲン添加培地」という場合がある。）。

続いて、１×１０^６、２×１０^６、３×１０^６、４×１０^６、８×１０^６個のＮＨＤＦ細胞を、０．０５ｍｇ／ｍＬヘパリン（型番「Ｈ３１４９－１００ＫＵ」、シグマ社）、０．０５ｍｇ／ｍＬコラーゲン（型番「ＡＳＣ－１－１００－１００」、シグマ社）を含む、５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）にそれぞれ懸濁した。

続いて、各細胞懸濁液を、室温、１，０００×ｇで１分間遠心し、上清を取り除いた後、トロンビン溶液でそれぞれ再懸濁した。続いて、細胞を溶解したトロンビン溶液とフィブリノゲン添加培地を１：２（体積比）となるように混合し、この混合溶液１００μＬを、２４ウェルセルカルチャーインサート（型番「３４７０」、コーニング社）内に播種した。

続いて、セルカルチャーインサートを、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内でゲル化するまで静置した。続いて、セルカルチャーインサートに、適量の専用培地を追加し、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）で８日間培養した。その間適宜培地交換を行った。

《組織断面解析》
細胞集合体の培養開始から１日後及び８日後に、ホルマリン緩衝液（型番「062-01661」、富士フイルム和光純薬）を用いて各立体的細胞組織を固定した。続いて、各立体的細胞組織をセルカルチャーインサートから取り出し、パラフィンで包埋後、立体的細胞組織の上面（言い換えると、セルカルチャーインサートの上面）から見たときの重心を通る線に沿って薄切切片を作製した。続いて、薄切切片をヘマトキシリン・エオシン（ＨＥともいう）染色して顕微鏡で観察し、立体的細胞組織の厚さの最大値を測定した。

図１Ａ～図１Ｄは、各立体的細胞組織の薄切切片の代表的な顕微鏡写真である。図１Ａは、フィブリンゲルを含まない立体的細胞組織（細胞数２×１０^６個で製造）の培養開始から１日後の組織切片の顕微鏡写真である。図１Ｂは、フィブリンゲルを含まない立体的細胞組織（細胞数２×１０^６個で製造）の培養開始から８日後の組織切片の顕微鏡写真である。図１Ｃは、フィブリンゲルを含む立体的細胞組織（細胞数２×１０^６個で製造）の培養開始から１日後の組織切片の顕微鏡写真である。図１Ｄは、フィブリンゲルを含む立体的細胞組織（細胞数２×１０^６個で製造）の培養開始から８日後の組織切片の顕微鏡写真である。

下記表１に、フィブリンゲルを含まない各立体的細胞組織の厚さの最大値を測定した結果を示す。表２に、フィブリンゲルを含む各立体的細胞組織の厚さの最大値を測定した結果を示す。表１及び２中、「１日後厚さ」は培養開始から１日後の立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値（μｍ）を意味し、「８日後厚さ」は培養開始から８日後の立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値（μｍ）を意味する。また、「作製不可」は、細胞がセルカルチャーインサートから剥離し、立体的細胞組織を作製できなかったことを意味し、「測定不能」は、測定できなかったことを意味する。

また、表１及び２中、「厚さ維持率」は、下記式（１）に基づいて算出した値である。
厚さ維持率（％）＝培養開始から８日後の立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値／培養開始から１日後の立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値×１００ …（１）

また、表１及び２中、「維持可否」は以下の評価基準にしたがって評価した結果である。
（評価基準）
〇…上記式（１）に基づいて算出した厚さ維持率が８０％以上
×…上記式（１）に基づいて算出した厚さ維持率が８０％未満

その結果、フィブリンゲルを含む立体的細胞組織は、いずれの細胞数の条件においても、厚さ維持率が８０％以上を達成でき、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制できたことが確認された。

これに対し、フィブリンゲルを含まない立体的細胞組織では、８×１０^６個の細胞を用いた条件において、立体的細胞組織を作製することができなかった。また、その他の細胞数の条件においても、厚さ維持率が８０％未満となり、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少が確認された。

また、フィブリンゲルを含む立体的細胞組織では、フィブリンゲルを含まない立体的細胞組織と比較して、より厚い組織を形成することができることが明らかとなった。

［実験例２］
（立体的細胞組織の製造１）
フィブリンゲルを含む立体的細胞組織を製造した。細胞としてヒト新生児由来皮膚線維芽細胞ＮＨＤＦ（型番「ＣＣ－２５０９」、ロンザ社）とヒト臍帯静脈内皮細胞（ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ）（型番：ｃＡＰ－０００１ＧＦＰ、フナコシ社製）を使用した。

上述した汎用培地に、終濃度がそれぞれ０．５、１、５、１０、２０、及び４０Ｕｎｉｔ／ｍＬとなるようにトロンビン（型番「Ｔ４６４８－１０ＫＵ」、シグマ社）を溶解し、トロンビン溶液を調製した。

また、ＤＭＥＭ培地に終濃度がそれぞれ０．５、１、５．１０、３０、６０ｍｇ／ｍＬとなるようにフィブリノゲン（型番「Ｆ８６３０－５Ｇ」、シグマ社）を溶解し、フィブリノゲン溶液を調製した。更に、フィブリノゲン溶液と汎用培地を１：１（体積比）となるように混合した培地を調製した（以下、「フィブリノゲン添加培地」という場合がある。）。

続いて、２×１０^６個のＮＨＤＦ細胞及び４×１０^５個のＧＦＰ－ＨＵＶＥＣを０．００５ｍｇ／ｍＬヘパリン（型番「Ｈ３１４９－１００ＫＵ」、シグマ社）及び０．０５ｍｇ／ｍＬコラーゲン（型番「ＡＳＣ－１－１００－１００」、シグマ社）を含む、５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）にそれぞれ懸濁した。

続いて、各細胞懸濁液を、室温、１，０００×ｇで１分間遠心し、上清を取り除いた後、トロンビン溶液でそれぞれ再懸濁した。続いて、細胞を溶解したトロンビン溶液とフィブリノゲン添加培地を１：２（体積比）となるように混合し、この混合溶液１００μＬを、２４ウェルセルカルチャーインサート（型番「３４７０」、コーニング社）内に播種した。

続いて、セルカルチャーインサートを、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内でゲル化するまで静置した。続いて、セルカルチャーインサートに、適量の上述の専用培地を追加し、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）で８日間培養した。その間適宜培地交換を行った。

《組織断面解析》
細胞集合体の培養開始から１日後及び８日後に、ホルマリン緩衝液（型番「０６２-０１６６１」、富士フイルム和光純薬）を用いて各立体的細胞組織を固定した。続いて、各立体的細胞組織をセルカルチャーインサートから取り出し、パラフィンで包埋後、立体的細胞組織の上面（言い換えると、セルカルチャーインサートの上面）から見たときの重心を通る線に沿って薄切切片を作製した。続いて、薄切切片をヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色して顕微鏡で観察し、立体的細胞組織の厚さの最大値を測定した。

下記表３に、実験例１と同様の評価基準で評価した各立体細胞組織の「維持可否」評価結果を示す。

その結果、トロンビン終濃度が５ｍｇ／ｍＬ以上の場合、フィブリノゲン終濃度が０．５ｍｇ／ｍＬ以上であるいずれの条件で製造された立体的細胞組織においても、立体的細胞組織の厚さ維持率が８０％以上であることを達成でき、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制できたことが確認された。

トロンビン終濃度が１ｍｇ／ｍＬの場合は、フィブリノゲン終濃度が０．５～５ｍｇ／ｍＬの範囲において厚さ維持率が８０％以上であることを達成でき、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制できたことが確認された。

［実験例３］
（立体的細胞組織の製造２）
細胞外マトリックスをゲル化した立体的細胞組織を製造した。細胞としてヒト新生児由来皮膚線維芽細胞ＮＨＤＦ（型番「ＣＣ－２５０９」、ロンザ社）とヒト臍帯静脈内皮細胞（ＧＦＰ－ＨＵＶＥＣ）（型番：ｃＡＰ－０００１ＧＦＰ、フナコシ社製）を使用した。

《ゲル化した細胞外マトリックスを含まない立体的細胞組織の製造》
１×１０^６個のＮＨＤＦ細胞及び２×１０^５個のＧＦＰ－ＨＵＶＥＣを０．０５ｍｇ／ｍＬヘパリン（型番「Ｈ３１４９－１００ＫＵ」、シグマ社）を含む、５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）に懸濁した。同様に、２×１０^６個のＮＨＤＦ細胞及び４×１０^５個のＧＦＰ－ＨＵＶＥＣを上述の５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液に懸濁した。

続いて、各細胞懸濁液を、室温、１，０００×ｇ（重力加速度）で１分間遠心し、上清を取り除き、適量の上述の専用培地でそれぞれ再懸濁した。続いて、各細胞懸濁液を、２４ウェルセルカルチャーインサート（型番「３４７０」、コーニング社）内に播種した。

続いて、セルカルチャーインサートを、室温、４００×ｇで１分間遠心し、細胞集合体を得た。続いて、セルカルチャーインサートに、適量の上述の専用培地を追加し、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）で８日間培養した。その間適宜培地交換を行った。

《ゲル化した細胞外マトリックスを含む立体的細胞組織の製造》
１×１０^６個のＮＨＤＦ細胞及び２×１０^５個のＧＦＰ－ＨＵＶＥＣを０．０５ｍｇ／ｍＬヘパリン（型番「Ｈ３１４９－１００ＫＵ」、シグマ社）を含む５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）に懸濁した。同様に、２×１０^６個のＮＨＤＦ細胞４×１０^５個のＧＦＰ－ＨＵＶＥＣを０．０５ｍｇ／ｍＬヘパリン（型番「Ｈ３１４９－１００ＫＵ」、シグマ社）を含む５０ｍＭトリス－塩酸緩衝溶液に懸濁した。

続いて、各細胞懸濁液を、室温、１，０００×ｇで１分間遠心し、上清を取り除いた後、コラーゲン（ＣｅＩｌｍａｔｒｉｘ Ｔｙｐｅ Ｉ－Ａ、新田ゼラチン社）をメーカー所定の手順で調製後混合し、この混合溶液１００μＬを、２４ウェルセルカルチャーインサート（型番「３４７０」、コーニング社）内に播種した。

続いて、セルカルチャーインサートを、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で混合溶液がゲル化するまで静置した。続いて、セルカルチャーインサートに、適量の上述の専用培地を追加し、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）で８日間培養した。その間適宜培地交換を行った。

《組織断面解析》
細胞集合体の培養開始から１日後及び８日後に、ホルマリン緩衝液（型番「０６２-０１６６１」、富士フイルム和光純薬）を用いて各立体的細胞組織を固定した。続いて、各立体的細胞組織をセルカルチャーインサートから取り出し、パラフィンで包埋後、立体的細胞組織の上面（言い換えると、セルカルチャーインサートの上面）から見たときの重心を通る線に沿って薄切切片を作製した。続いて、薄切切片をヘマトキシリン・エオシン（ＨＥ）染色して顕微鏡で観察し、立体的細胞組織の厚さの最大値を測定した。

下記表４に、ゲル化した細胞外マトリックスを含む各立体的細胞組織及びゲル化した細胞外マトリックスを含む立体的細胞組織の厚さの最大値を測定した結果、厚さ維持率及び実施例１と同様の評価基準で評価した各立体細胞組織の「維持可否」評価結果を示す。

その結果、ゲル化した細胞外マトリックスを含む立体的細胞組織は、いずれの細胞数の条件においても、厚さ維持率が８０％以上を達成でき、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制できたことが確認された。

これに対し、ゲル化した細胞外マトリックスを含まない立体的細胞組織では、いずれの細胞数の条件においても、厚さ維持率が８０％未満となり、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少が確認された。

また、ゲル化した細胞外マトリックスを含む立体的細胞組織では、ゲル化した細胞外マトリックスを含まない立体的細胞組織と比較して、より厚い組織を形成することができることが明らかとなった。

本発明によれば、立体的細胞組織の経時的な厚さの減少を抑制する技術を提供することができる。

Claims (6)

1. 細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分及び高分子電解質を含む混合物を得る工程と、
   前記混合物をゲル化させてゲル状組成物を得る工程と、
   前記ゲル状組成物をインキュベートして立体的細胞組織を得る工程と、
   を含み、
   前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、プロテオグリカン又はこれらの組み合わせであり、
   前記高分子電解質が、ヘパリンを含み、
   前記ゲル状組成物が、フィブリン・モノマーがゲル化したフィブリンゲルを含み、
   前記ゲル状組成物を得る工程が、前記混合物にトロンビンを添加する工程と、前記トロンビンを添加した前記混合物にフィブリノゲンを添加して混合し、その結果、前記フィブリンゲルが形成されて前記混合物がゲル化する工程と、を含む、立体的細胞組織の製造方法。
2. 前記混合物における、前記細胞外マトリックス成分の含有量の合計が、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．５ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１に記載の製造方法。
3. 前記混合物における、前記高分子電解質の含有量が、０．００５ｍｇ／ｍＬ以上１．０ｍｇ／ｍＬ以下である、請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 前記ゲル状組成物を得る工程の前に、前記混合物に外力を加えて、前記細胞、前記カチオン性物質、前記細胞外マトリックス成分及び前記高分子電解質を含む細胞集合体を得る工程を更に含み、
   前記ゲル状組成物を得る工程において、前記混合物に代えて前記細胞集合体をゲル化させてゲル状組成物を得る、請求項１～３のいずれか一項に記載の製造方法。
5. 混合された、細胞、カチオン性物質、細胞外マトリックス成分、高分子電解質及びゲル状成分を含み、
   前記細胞外マトリックス成分が、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、エラスチン、テネイシン、エンタクチン、プロテオグリカン又はこれらの組み合わせであり、
   前記高分子電解質がヘパリンを含み、
   前記ゲル状成分が、フィブリン・モノマーがゲル化したフィブリンゲルである、立体的細胞組織。
6. 製造から８日目の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値が、製造直後の前記立体的細胞組織の上面から見たときの重心を通る線に沿って取得した切片の厚さの最大値の８０％以上である、請求項５に記載の立体的細胞組織。

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