KR20100016648A - 나노입자를 포함하는 개선된 3차원 생체 적합성 골격 구조물 - Google Patents

나노입자를 포함하는 개선된 3차원 생체 적합성 골격 구조물 Download PDF

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KR20100016648A
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귄터 토바르
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프라운호퍼-게젤샤프트 추르 푀르데룽 데어 안제반텐 포르슝 에 파우
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Abstract

본 발명은 3차원 생체 적합성 골격 구조물 및 생체 적합성 나노입자를 포함하는 세포 배양 시스템, 세포 배양 방법, 그리고 이러한 세포 배양 시스템 그 자체에 의한 세포 또는 세포 산물 및 조직의 제조에 관련된다.
나노입자, 3차원, 생체 적합성, 골격 구조물

Description

나노입자를 포함하는 개선된 3차원 생체 적합성 골격 구조물{IMPROVED THREE-DIMENSIONAL BIOCOMPATIBLE SKELETON STRUCTURE CONTAINING NANOPARTICLES}
본 발명은 3차원 생체 적합성 골격 구조물 및 나노입자를 포함하는 세포 배양 시스템에 관련된다. 본 발명은 또한 상기 세포 배양 시스템의 제조 방법 및 상기 세포 배양 시스템에 의해 세포를 배양하는 방법에 관련된다.
세포는 생체 내에서 특히 세포외 간질(ECM), 성장 인자, 사이토카인 및 인접 세포로 구성되는 복잡하고 동적인 미세-환경에 의해 둘러싸여 있다. 세포외 간질은 4개의 기본 조직 유형, 즉 상피, 근육, 신경, 그리고 결합 및 지지 조직에 모두 존재한다. 주요 기능으로 오랫동안 여겨졌던 지지 골격으로서의 기능과 더불어, ECM은 세포의 막 관통 수용체에 의한 쌍방향 신호 교환의 역할을 주로 한다. 또한, 이러한 형태의 통신으로 인해 유전자 발현의 조절에 영향을 미친다. 이는 부착, 증식, 분화, 이동, 아포토시스 및 재구성 과정과 같은 본질적인 세포 특성에서 중요한 역할을 한다. ECM은 정적 시스템을 나타내지 않지만, 대신 ECM의 성분은 "흐름 평형" 상태에 있다. ECM의 성분은 세포에 의해 세포간 공간(세포들 사이의 공간)에서 분비 및 합성되지만, 또한 동시에 세포에 의해 다시 분해될 수 있다. 세포외 간질은 3개의 주요 성분: 콜라겐 섬유, 고정 단백질 및 공간-충진 탄수화물로 구성된 다. 기저막은 분화된 세포외 간질로 간주될 수 있는 단백질 층이다. 이는 안정화 층을 나타내며, 결합 조직으로부터 표면 상피를 분리한다. 이것은 이들 층의 세포가 미끄러져 분리되는 것을 방지한다.
세포외 간질의 한 성분은 섬유-형성 단백질로 구성된다. 이 목적에 대해 콜라겐이 ECM의 주된 단백질 군이다. 이들은 여러가지 형태의 섬유를 형성하며, 거의 모든 조직에 존재한다. ECM의 많은 부분이 원섬유 콜라겐 타입 I로 형성되는 반면에, 타입 IV의 콜라겐이 기저막에서 중요한 역할을 한다. 탄성 섬유는 단백질 피브릴린 및 엘라스틴으로 구성된다. 탄수화물은 ECM 내에서 부가적인 중요 성분이다. 이들은 또한 글리코사민 오글리칸(GAG)을 포함한다. 글리코사민 오글리칸은 특정 개체 모듈의 장-사슬 다당류와 결합된 단백질이다. 글리코사민 오글리칸이 큰 거대-분자로 응집되면, 프로테오글리칸이 생성된다. ECM의 실질적인 특성은 대다수로부터 명백하듯이 단백질, 글리코사민 오글리칸 및 프로테오글리칸의 상호 작용이다. ECM의 다른 탄수화물 성분은 히알루론산, 황산 헤파란, 황산 콘드로이틴 및 황산 케라탄이다.
세포외 간질의 다른 특징적인 성분은 부착 단백질을 포함한다. 부착 단백질, 어댑터 단백질 또는 다른 부착 단백질은 간질의 다른 부분과 상호 작용하고, 또한 특정 세포 수용체에 자신을 부착함으로써 다른 세포와 상호 작용한다. 부착 단백질의 예는 라미닌, 시트로넥틴 및 피브로넥틴의 단백질 군이다.
분화된 세포외 간질로서의 기저막은 다양한 필수 성분을 포함한다. 무엇보다 먼저 이들은 타입 I 내지 IV의 콜라겐을 포함하며, 이중에서 타입 IV는 특히 중요 한 의미를 갖는다. 라미닌은 기저막의 다른 부분이다. 이들은 칼-같은 모양을 갖는다. 이들의 단부는 인테그린과 주로 결합하는 세포 수용체로 채워진다. 라미닌 1은 가장 중요한 부착 성분이고, 라미닌 5는 기저막의 핵심 부분으로서 또 다른 특별한 의미를 갖는다. 엔탁틴(니도겐)은 콜라겐 층을 라미닌 층에 연결시키기 때문에, 기저막의 다른 성분으로서 특별한 의미를 갖는다. 끝으로, 기저막의 개별 성분은 페를레칸과 같은 프로테오글리칸에 의해 연결되는데, 페를레칸은 그 구조 내에 콜라겐, 라미닌, 니도겐 및 자신을 위한 결합 부위를 포함하기 때문이다.
마지막에 말하기는 하지만 아주 중요한, 세포 수용체는 세포외 간질의 다른 중요한 요소로 언급되어야 한다. 이와 관련하여 인테그린 군과 같은 세포막 단백질은 세포 부착을 위해 핵심 역할을 한다. 인테그린은 이종 이량체 단백질로서, 서로 다른 알파 및 베타 아단위로 구성될 수 있다. 인테그린의 알파 또는 베타 아단위의 조성에 따라, 인테그린은 라미닌, 비트로넥틴 또는 피브로넥틴과 같은 세포외 간질에 결합할 수 있다.
세포를 배양하는 하나의 목적은 가능한 정확한 방식으로 세포의 자연 환경처럼 세포외 간질을 재구성하는 것이다. 세포외 간질의 부분 이외에 성장 인자와 같은 다른 생물학적으로 중요한 물질을 상기 ECM 구조로 결합시킬 수 있는 것이 또한 바람직하다.
현재, 조직으로부터 분리한 1차 세포의 배양은 플라스틱으로 코팅된 세포 배양 용기에서 종종 수행된다. 그러나, 이 환경은 세포의 자연 생리학적 조건에 부합하지 못하고, 종종 기능의 상실, 세포의 탈분화, 최악의 경우, 세포의 사멸에 이르 게 한다. 세포 배양 용기의 현재 알려진 개량은 콜라겐 섬유 또는 피브로넥틴과 같은 세포외 간질의 개별, 천연 성분을 사용하여 표면을 코팅하는 것이다. 그러나, 이는 세포 유형에 특히 맞추어지는 것은 아니며, 정해지지 않은 방식으로 적용된다. 활성제를 포함하는 겔-같은 구조에서의 세포 배양이 또한 알려져 있다. 그 중에서, 한가지 단점은 배지의 선택적으로 필요한 변경과 함께 제어되지 않은 방식으로 활성제를 씻어버려야 한다는 것이다.
활성제가 용해된 형태로 이미 존재하는 세포 배양 배지에서 세포를 배양하는 것 또한 가능하다. 따라서 활성제는 세포에 직접 이용 가능하나, 한가지 단점은 활성제는 매우 빠르게 소모되고, 그 농도는 배양된 세포의 분화 및 성장 단계에서 제어된 방식으로 조절될 수 없다는 것이다.
나노입자 및 동정과 선별 방법을 위한 이의 용도는 DE 10144252 A1 및 DE 10031859 A1에 공지되어 있다. 이 문헌의 개시에 따르면, 나노입자는 특정의 생물학적 활성 물질을 검출 또는 운반할 수 있다.
나노입자의 제조를 위해, 유화 중합은 수용성 단량체를 유화제를 이용하여 물에 유화시키고, 과황산 칼륨과 같은 수용성 개시제를 이용하여 중합시키는 특별한 중합 방법이다. 라텍스 분산물과 같은 유화 중합 중에 생성되는 고분자 분산물은 다수의 용도로 이용될 수 있다. US 4,521,317 및 US 4,021,364는 유화 중합의 가능성 및 한계를 보여준다.
유화 중합의 범위 내에서 2종류의 에멀션이 일반적으로 이용될 수 있다: 즉, 반대되는 에멀션으로도 알려진 수중유적형 에멀션 및 유중수적형 에멀션이다. 두 경우 모두에서 반응 매체에 불용성인 단량체는 교반 중에 유화제를 첨가함으로써 분산시키고, 반응은 개시제를 첨가함으로써 개시된다.
본 발명은 세포의 자연 환경처럼 천연 세포외 간질에 가능한 근접하고, 세포 성장 및 세포 분화를 제어된 방식으로 조절하고, 또한 이를 상업적 요건에 맞추기 위해, 성장 인자 및 사이토카인의 제어된 첨가를 가능하게 하는 세포 배양 시스템을 제공하는 기술적 과제를 기초로 한다. 또한, 본 발명은 이식에 적합한 세포, 특히 조직 및 기관을 제공하는 기술적 과제를 기초로 한다. 또한, 소위 조직 공학의 범위 내에서 특수 조직 그리고 연구 목적을 위한 수요가 있다.
본 발명은 3차원 생체 적합성 골격 구조물 및 생체 적합성 나노입자를 포함하는 세포 배양 시스템, 세포 또는 세포 산물 및 조직을 제공함에 의해 세포를 배양하는 방법, 그리고 상기 세포 배양 시스템에 의한 그 자체의 세포 또는 세포 산물 및 조직을 제공함으로써 기술적 과제를 해결한다.
따라서, 본 발명은 생체 내 상태에 대응하는 조건 하에, 또는 원하는 합성적으로 조절된 환경에서 세포, 특히 진핵 세포, 특히 바람직한 태양에서는 동물 또는 인간 세포의 배양을 가능하게 하는 세포 배양 시스템을 제공한다.
특히, 본 발명은 3차원 생체 적합성 골격 구조물과 함께 생체 적합성 나노입자를 갖는 세포 배양 시스템을 제공하는 것을 기초로 한다. 이러한 시스템은 나노입자의 존재에 의해 특히 제공되는 영향과 조건에서 배양되는 세포와, 배양의 목표에 따라 생물학적 거동, 즉 성장 또는 분화 거동과 관련하여 세포의 영향을 가능하게 한다. 특히 바람직한 태양에서 나노입자는 예를 들어 표면 위에 둘러싸이거나 나노입자 자체 내에 삽입되는 방식으로 활성제를 포함할 수 있다. 물론, 활성제는 나노입자의 표면 및 내부 모두에 존재할 수 있다. 이 방식으로 나노입자에 결합되어 있는 활성제는 세포 배양 시스템을 이용하여 수행되는 세포 배양 방법의 과정 내에서 제어 및/또는 조절되고, 특히 연대순으로 지연된 방식으로 방출되며, 제어된 방식으로 장기간에 걸쳐서 그러한 양으로 세포에 첨가될 수 있다. 이 방식에서 상기 성장 인자의 제어된 운반은 예를 들어 성장 인자에 나노입자를 결합시킴으로써 정해진 기간에 걸쳐서 보장된다.
예를 들어, 고분자 재료로 만들어진 나노입자는 성장 인자의 담체로서 놀라운 이점을 갖는 것으로 밝혀졌다. 이와 같이, 담체로서 나노입자, 특히 고분자 나노입자는 예를 들어 사이토카인과 같은 활성제의 특정, 일반적으로 방출 지연 동력학을 이용하여 제어된 방출을 제어한다. 이 효과는 방출 제어로도 불린다. 본 발명의 바람직한 태양에서 활성제의 방출은 시간의 함수로서 미리 결정될 수 있는 방식으로 조절됨으로써, 원하는 특정의 활성제 방출 동력학을 제공한다. 본 발명에서 원하는 활성제 방출 동력학은 나노입자 재료의 선택에 의해 구현됨으로써, 활성제의 방출은 세포-특이적 방식으로 일어날 수 있다. 예를 들어, 활성제의 일정한 방출 속도는 전체 방출 기간에 근거하여 일어날 수 있다. 물론, 본 발명은 예를 들어 첫 단계에서는 초기에 낮은 활성제 방출 속도를, 그리고 특정 시점 이후부터는 증가된 방출 속도를 제공할 수 있다. 다른 바람직한 태양에서 초기 첫 단계에서는 활성제의 상대적으로 높은 방출 속도가 제공되고, 특정 시점 이후부터는 낮은 방출 속도로 줄어든다. 나노입자의 제조를 위해 적합한 고분자 재료를 이용함으로써, 세포 배양 방법의 범위 내에서 특정 시점에 파열 효과의 형태로 나노입자로부터 원하는 높은 농도의 활성제를 방출하는 것도 본 발명에 따라 가능하다. 바람직한 태양에서 나노입자는 활성제 농도가 방출 이후 1 ng/㎖ 내지 10 ㎍/㎖의 바람직한 범위 내에 있도록 활성제 충전량을 가질 수 있다.
이 목적을 위해 활성제 방출은 나노입자로부터 또는 이를 통한 활성제의 확산에 의해, 또는 나노입자 자체의 분해에 의해, 예를 들어 고분자의 가수분해에 의해 모두 수행될 수 있다.
특히 활성제로 채워지고, 골격 구조를 가지며, 특히 세포외 간질 성분으로 만들어진 나노입자의 조합은 다른 놀라운 이점을 나타냈다. 특히 특정 사이토카인이 채워진 나노입자를 갖는 골격 구조물에 세포를 배양함으로써 줄기 세포의 제어되고 조절된 분화를 얻는 것이 가능하다.
또한, 나노입자를 포함하고, 특정 성장 인자가 결합된 간질에서 배양함에 의해, 특히 1차 세포가 현저하게 높은 생존율을 가짐으로써, 이들 민감한 세포의 장기간 배양이 가능한 것으로 밝혀졌다.
놀랍게도, 제어되고 조절된 세포 이동이 본 발명에 따른 세포 배양 시스템에서의 배양에 의해 유도될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
시험에 따르면, 특히 본 발명에 따른 세포 배양 시스템에서 배양된 1차 세포는 놀랍게도 현저하게 증가된 증식율을 가졌다. 또한, 본 발명, 예를 들어 세포 배양 시스템에 따른 변형된 표면에 대한 현저하게 개선된 부착 물성은 통상적인 세포 배양 용기와 비교하여 측정될 수 있었다. 세포는 며칠에 걸친 배양 이후에도 전형적인 형태학적 물성을 유지하였다. 따라서, 본 발명에 따른 세포 배양 시스템은 1차 세포의 원하지 않은 탈분화를 크게 방지한다.
본 발명의 범위 내에서 "세포 배양 시스템"이란 말은 배양될 세포를 위해, 특히 그 안에 포함된 골격 구조물의 형태로, 예를 들어 간질 또는 하이드로겔처럼, 바람직하게는 3차원 방식으로 구성된 구조물로, 부착 장소를 제공하는 세포 배양 시스템을 의미한다. 일반적으로 이러한 세포 배양 시스템은 그 용도, 바람직하게는 생체외 용도로 사용될 때 인공 용기에 위치하며, 배양 배지와 함께 세포 배양 시스템 자체를 통해 배양될 세포를 수용할 수 있다.
따라서, 본 발명의 세포 배양 시스템은 특히 생체외로 세포를 배양하는 시스템이다. 본 발명에 따른 세포 배양 시스템은 페트리 접시 또는 세포 배양 병과 같은 통상적인 세포 배양 용기, 또는 다른 형태에서 세포를 배양하는데 이용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 태양에서 세포 배양 시스템은 1차 세포를 배양하는데 이용된다. 다른 태양에서 본 발명에 따른 세포 배양 시스템은 생체내, 즉 동물 실험에 이용된다.
본 발명에서 "골격 구조물"은 세포를 부착하는 구조물을 의미한다. 본 발명의 범위 내에서 골격 구조물의 바람직한 태양은 특히 표면 부착 또는 세포의 부착 뿐만 아니라, 또한 특히 골격 구조물 자체에서의 세포의 성장 또는 골격 구조물로의 세포의 통합을 허용하는 구조이다. 골격 구조물은 바람직하게는 기공 또는 중공을 갖는 간질이다. 본 발명의 바람직한 태양에서 간질은 기저막의 일부분, 부착 단백질, 섬유-형성 단백질, 탄수화물, 프로테오글리칸 또는 세포 수용체와 같은 세포외 간질의 하나 또는 그 이상의 성분을 갖는다.
본 발명에서 "1차 세포"는 기관 또는 배아로부터 얻어지는, 인간 또는 동물 유래의 진핵 세포를 의미한다. 특히 배아 줄기 세포가 1차 세포로서 바람직하게 제공되는데, 바람직하게는 제대혈로부터 얻어진다. 그러나, 본 발명에서 인간 배아 줄기 세포의 사용은 바람직하게는 제공되지 않는다. 본 발명에 따라 사용되는 줄기 세포는 만능, 분화 전능, 전능 또는 만능 세포일 수 있다. 또한, 1차 세포는 바람직하게는 동물 또는 인간 성체 줄기 세포와 같은 성체 줄기 세포이다.
본 발명에서 "1차 세포"는 또한 인간 또는 동물 유래의 진핵 세포를 의미한다. 1차 세포는 피부, 신장 또는 간장과 같은 기관, 또는 전체 배아로부터 얻어질 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 1차 세포의 한 예는 섬유아세포이다. 1차 세포는 바람직하게는 전능 또는 만능이다. 1차 세포는 또한 성체 줄기 세포일 수 있다. 세포는 트립신을 이용한 처리에 의해, 또는 다른 프로테아제에 의해 처리되어 조직으로부터 분리되며, 또한 밀착 연접과 같은 세포간 화합물의 분해에 의해 분리된다. 상피 세포의 1차 세포 배양물은 1차 세포의 또 다른 예이다. 일반적으로 상피는 조직과 기관의 외부와 내부 표면을 덮고 있다. 상피 세포는 꼭지면과 기저측면과 함께 세포의 분극으로 발현되는 매우 고도의 분화능을 갖는다. 다양한 표면은 여러가지 기능을 맡는다. 예를 들어, 창자 상피 세포의 꼭지면은 영양소를 흡수하는 역할을 하며, 기저측면은 영양소를 혈액으로 보내고, 인접 세포 및 기저막과의 연결고리를 형성한다. 그러나, 혈액, 뼈, 골수 또는 비장 유래의 1차 세포는 여전히 현탁액에서 배양될 수 있다. 트립신 처리 후, 분리된 1차 세포로부터 분리된 아류형을 더 선택하기 위해 부가적인 방법이 존재한다. 예를 들어, 자기 세포 분리 방법에 의해, 또는 형광 활성 세포 분류(FACS)에 의해, 예를 들어 골수 유래의 1차 세포로서 B-세포를 분리하는 것이 가능하다.
바람직하게는 1차 세포는 또한 비-인간 배아 줄기 세포, 바람직하게는 특히 바람직한 태양에서 제대혈로부터 얻어지는 배아 줄기 세포일 수 있다. 바람직한 태양에서 배아 줄기 세포는 8세포 까지의 단계에 있는 배아로부터 분리되는 세포이다. 8세포기로부터의 배아 줄기 세포는 분화 전능 세포이며, 주요 조직 형태, 예를 들어 장관의 벽 세포와 같은 내배엽, 근육, 뼈, 혈액 세포와 같은 중배엽, 피부 세포와 신경 조직과 같은 외배엽의 모든 세포 형태로 분화될 수 있다. 다른 바람직한 태양에서 배아 줄기 세포는 배반포의 단계에 있는 배아로부터 분리된 세포이다. 배반포 단계의 배아 줄기 세포는 만능 세포이고, 더 이상 형성될 수 없는 태반 조직의 형성을 제외하고, 주요 조직 형태, 예를 들어 내배엽과 외배엽의 모든 형태의 신체 세포로 분화될 수 있다. 줄기 세포의 특별한 특성은 이 세포가 세포 분할 중에 자기-복제하여 줄기 세포 집단을 얻을 수 있고, 동시에 분화된 세포를 만든다는 것이며, 이 경우에 낮은 분화능을 갖는다. 줄기 세포는 소위 마커에 의해 분화된 세포로부터 자신의 범위를 정한다. 마커는 줄기 세포에 의해 강화되거나 낮은 정도로 발현되는 특수 단백질일 수 있다. 쥣과 배아 줄기 세포 SSEA-1(단계-특이적 배아 항원-1)의 경우, AP 활성(알칼리 포스파타아제 활성) 및 전사 인자 Oct-3/4의 발현이 마커로 표시된다. 마커 단백질의 발현은 줄기 세포의 기원에 의존한다.
그러나, 본 발명은 또한 세포 배양 방법 및 이를 수행하기 위한 수단에 관련되며, 특히 비-배아 줄기 세포의 이용에 관련된다. 성체 줄기 세포는 배아기 이후에 생성되는 세포이다. 성체 줄기 세포는 골수, 피부, 지방 조직, 제대혈, 뇌, 간 또는 췌장과 같은 기관 및 조직으로부터 분리될 수 있고, 일반적으로 미리 결정되며, 예를 들어 이들은 낮은 분화능을 갖고 다분화능 또는 단분화능이다. 일반적으로 배아 또는 성체 포유류로부터 분리된 1차 세포는 매우 제한된 성장 능력을 갖는다. 인간 태아 세포에서 양호한 세포 성장은 그 분리 및 배양 이후 초기에 일어난다. 또한, 1차 세포는 종양으로부터 분리 및 배양될 수 있다. 아포토시스와 같은 조절 메커니즘은 유전적 변화, 발암성 형질전환에 의해 폐기되거나, 성장 수용체의 양성 성장 신호가 증폭된다. 따라서, 많은, 특히 1차 종양 세포는 종종 비-제한적 성장을 보인다. 종양 세포 하에 1차 세포의 특정 아집단은 소위 종양 줄기 세포이다. 이는 특정 종양 내에 매우 작은 세포 분율로 측정된다. 종양 줄기 세포는 유방암 종양으로부터 분리 및 배양된다. 유방암 줄기 세포에 대한 마커 단백질의 특징은 높은 CD44 발현, 없거나 낮은 양의 CD24 발현, 소위 라인 마커의 부재이다.
본 발명에서 "성체 줄기 세포"는 특히 배아기 이후 생성되고, 낮은 분화능을 가지며, 완전히 분화된 것과 대조적으로 아직 소모되지 않고, 미리 결정되며, 특히 심장, 골격근, 지방 조직, 피부 및 뇌 유래의 상피 세포, 내피 세포, 수지상 세포, 중간엽 세포, 지방 세포, 또는 특히 각 전구체 세포로부터 분리되는 세포를 의미한다.
본 발명에서 "3차원"은 모든 3개의 공간 좌표로의 공간 전개를 의미한다. 전개는 3개의 방향에서 본질적으로 균일할 수 있으며, 예를 들어 원통형, 원주형, 입방형 또는 정육면체 간질 구조가 존재한다. 그러나, 예를 들어, 전개는 2개의 방향에서는 크지만, 제3방향에서는 낮은 정도로만 일어나, 3차원 구조가 평면처럼 보여서, 예를 들어 막 또는 층으로 나타나는 것도 가능하다.
본 발명의 범위 내에서 "생체 적합"이란 말은 골격 구조물 및 나노입자가 그 재료 조성과 관련하여, 그리고 세포, 조직에서, 또는 특히 시험 동물의 유기체에서 그 위의 구조와 관련하여, 독성, 세포 사멸, 원하지 않는 면역학적 또는 다른 원하지 않는 반응을 야기하지 않고, 나노입자의 가능한 내부화, 또는 나노입자 및/또는 골격 구조물의 분해 이후에도, 세포 및 분자 작용을 방해하지 않거나 거의 방해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명의 특정 태양에서 바람직하게는 나노입자는 생분해성 또는 생재흡수성이고, 예를 들어 생물학적 영향, 특히 배양된 세포의 영향에 의해 연속적으로 분해되며, 바람직하게는 그 안에 함유된 활성제를 방출할 수 있다.
본 발명의 범위 내에서 나노입자는 1 내지 1000 nm의 직경을 갖는 입자이다. 이러한 나노입자는 무기 또는 유기 물질과 같은 여러가지 재료로 구성될 수 있다. 바람직한 태양에서 그 표면은 화학적 반응성 기능기를 포함할 수 있어서, 결합될 활성제의 상보적 기능기와의 인력 결합, 예를 들어 공유 및/또는 비-공유 결합을 형성하며, 따라서 그 표면으로 활성제를 신뢰성 높게 고정할 수 있다. 본 발명의 또 다른 바람직한 태양에서 나노입자는 또한 골격 구조물과의 결합을 형성할 수 있다. 이러한 결합은 바람직하게는 정전기적 상호작용이다.
바람직한 태양에서 본 발명은 나노입자가 50 내지 1000 nm, 바람직하게는 50 내지 900 nm, 바람직하게는 60 내지 600 nm의 직경을 갖는 세포 배양 시스템을 제공한다. 다른 바람직한 태양에서 본 발명은 나노입자가 80 내지 150 nm, 바람직하게는 50 내지 150 nm의 직경을 갖는 세포 배양 시스템을 제공한다.
다른 태양에서 본 발명에 따른 세포 배양 시스템은 금 또는 다른 귀금속과 같은 무기 물질, 또는 금속 또는 금속 산화물, 인산 칼슘 및 인산 수소 칼슘 또는 이들의 혼합 인산염, 실리케이트, 이산화 실리콘 등의 산화 실리콘과 같은 실리콘계 산화 물질로 구성되는 나노입자를 함유한다. 바람직한 태양에서 나노입자는 또한 DynaBead일 수 있다.
바람직한 태양에서 본 발명에 따른 세포 배양 시스템은 유기 물질, 특히 유기 고분자로 구성되는 나노입자를 함유한다. 바람직하게는, 나노입자는 유화 중합에 의해 제조될 수 있다.
바람직하게는 나노입자는 본 발명에 다른 세포 배양 시스템에 이용되며, 생분해성 고분자로 구성된다. 또한, 50 nm의 직경을 갖고 생분해성 간질을 포함하는 나노입자의 사용이 바람직하다.
바람직한 태양에서 본 발명에 따른 세포 배양 시스템은 폴리락티드(PLA), 폴리(락티드-코-글리콜리드)(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리글리콜리드, PCL/PGA 디-블록 시스템과 같은 디- 및 트리-블록 고분자, 폴리오르쏘에스터(POE), 폴리무수물, 폴리히드록시알카노에이트(PHA), 폴리피롤렌(PPy), 폴리프로필렌 카보네이트, 폴리에틸렌 카보네이트, 폴리알킬 시아노니트릴 또는 폴리에틸렌 글리콜로 구성되는 나노입자를 함유한다.
바람직하게는 본 발명에서 활성제의 원하는 방출 프로파일에 따라 나노입자는 여러가지 분자량 및 다양한 극성을 갖는 고분자를 포함한다. 나노입자의 제조에 사용되는 재료의 선택은 바람직하게는 활성제가 방출되는 형태 및 동력학에 따라 수행될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 태양에서, 나노입자는 방출되는 활성제의 방출 프로파일 제어 중에 특히 높은 변이성을 얻기 위해, 여러가지 재료, 특히 여러가지 고분자로 구성된다. 물론, 다른 태양에서 본 발명에 따른 세포 배양 시스템은 여러가지 재료로 구성되는 나노입자를 가지며, 다른 바람직한 태양에서는 여러가지 활성제를 가질 수 있다. 특히 활성제의 시간적으로 및/또는 공간적으로 정의된 방출은 이런 방식으로 일어날 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 태양에서 또한 나노입자는 적어도 하나의 활성제의 담체이다. 본 발명에서 활성제는 배양되는 세포에 영향을 미치는 물질이다. 이러한 활성제로서 바람직한 물질은 배양되는 세포의 성장 및 분화 과정의 조절에 관여하는 물질이다. 특히 활성제는 성장 및 분화 과정을 제어, 조절, 결정, 개시 또는 종결한다. 이러한 활성제는 또한 이동, 침입, 재분화 또는 분리 활성에 관여할 수 있다. 특히 바람직한 태양에서 활성제는 원하고 특이적인 특정의 적용 동력학으로 배양 세포에 첨가된다.
본 발명의 다른 바람직한 태양에서 세포 배양 시스템은 골격 구조물 내에 및/또는 그 표면 위에 둘러싸인 활성제를 갖는 나노입자를 함유한다.
본 발명의 다른 바람직한 태양에서 성장 인자와 같은 활성제를 결합시키기 위해, 유중수적형 기술이 활성제로 충전된 나노입자, 특히 PLA 및 PLGA 입자의 제조를 위한 바람직한 방법으로 이용된다.
이 목적을 위해 바람직하게는 본 발명은 나노입자에 둘러싸인 활성제가 성장 인자, 사이토카인, 인테그린과 같은 세포 부착 단백질, 형광아민과 같은 염료, 케모카인, 비타민, 미네랄, 지방, 단백질, 영양소, 섬유-형성 단백질, 탄수화물, 부착 단백질, 세포 수용체, 약물, DNA, RNA, 압타머, 혈관 신생 인자, 렉틴, 항체, 항체 단편 또는 억제제인 세포 배양 시스템을 또한 제공한다.
본 발명의 바람직한 태양에서 세포 배양 시스템은 안정화제를 갖는 나노입자를 함유한다. 이 목적을 위한 안정화제는 바람직하게는 트레할로스와 같은 탄수화물, 단백질, 폴리에틸렌 글리콜 또는 세정제이다.
본 발명의 다른 바람직한 태양에서 세포 배양 시스템은 기능기에 결합함으로써 기능기가 도입된 나노입자를 함유한다. 특히 바람직한 태양에서 나노입자 자신은 그 표면에 기능기를 포함한다.
특히 본 발명에서 제1기능기 1A는 나노입자의 표면에 부착되고, 고정화되는 활성제의 상보적 기 2A와 인력, 바람직하게는 공유 결합을 형성할 수 있다.
본 발명에서 제1기능기 1A는 아미노 기, 카르복시 기, 에폭시 기, 말레익 미도 기, 알킬 케톤 기, 알데히드 기, 히드라진 기, 히드라지드 기, 티올 기 및 티오에스터 기로 구성되는 군에서 선택된다.
본 발명에서 활성제의 기능기 2A는 아미노 기, 카르복시 기, 에폭시 기, 말레익 미도 기, 알킬 케톤 기, 알데히드 기, 히드라진 기, 히드라지드 기, 티올 기 및 티오에스터 기로 구성되는 군에서 선택된다. 본 발명에 따른 나노입자는 또한 고정화되는 활성제의 기능기 2A와 공유 결합하는 제1기능기 1A를 그 표면에 갖는데, 이때 표면 기능기 1A는 단백질 기능기 2A와는 다른 기이다. 결합을 형성하는 기 1A 및 2A는 모두, 예를 들어 공유 결합을 형성할 수 있도록 서로 상보적이어야 한다.
본 발명의 다른 바람직한 태양에서 본 발명에 따른 나노입자의 표면은 기능기 1B를 갖고, 고정화되는 활성제는 기능기 1B와 결합하는 상보적 기 2B를 갖는데, 이때 기능기 1B 및 2B는 본 발명에 따라 특히 비-공유 결합을 형성할 수 있다.
본 발명의 바람직한 태양에 따르면 나노입자 표면의 제2기능기 1B는 올리고히스티딘 기, 스트렙-태그 I, 스트렙-태그 II, 데스티오비오틴, 비오틴, 키틴, 키틴 유도체, 키틴 결합 도메인, 금속 이온 킬레이트 착물, 스트렙타비딘, 스트렙탁틴, 아비딘 및 뉴트라비딘으로 구성되는 군에서 선택된다.
본 발명에 따르면 고정화되는 활성제의 기능기 2B는 올리고히스티딘 기, 스트렙-태그 I, 스트렙-태그 II, 데스티오비오틴, 비오틴, 키틴, 키틴 유도체, 키틴 결합 도메인, 금속 이온 킬레이트 착물, 스트렙타비딘, 스트렙탁틴, 아비딘 및 뉴트라비딘으로 구성되는 군에서 선택된다. 본 발명에 따른 나노입자는 또한 분자의 기능기 2B와 비-공유 방식으로 결합하는 기능기 1B를 그 표면에 갖는데, 이때 나노입자의 표면 기능기 1B는 분자 기능기 2B와는 다른 기이다. 비-공유 결합을 형성하는 기는 모두, 예를 들어 서로와 비-공유 결합을 형성할 수 있도록 서로 상보적이어야 한다.
물론, 본 발명에서 본 발명에 따른 나노입자의 표면 및 고정화되는 활성제는 선택적으로 기능기 1A 및 1B, 그리고 2A 및 2B를 모두 가질 수도 있다.
본 발명의 특히 바람직한 태양에서 3차원 골격 구조물은 다음 성분, 즉 콜라겐, 탄성 섬유 형성 피브릴린 및/또는 엘라스틴과 같은 섬유-형성 단백질, 글루코사민 글리칸, 장쇄 다당류, 특히 히알루론산, 황산 헤파란, 황산 콘드로이틴 및 황산 케라탄과 같은 탄수화물, 어댑터 단백질과 같은 부착 단백질 또는 라미닌, 비트로넥틴 및 피브로넥틴과 같은 다른 부착성 단백질, 라미닌, 엔탁틴 및 프로테오글리칸과 같은 기적막 성분, 및 세포막 단백질과 같은 ECM 성분용 세포 수용체 중에서 하나 또는 그 이상을 함유한다.
본 발명의 바람직한 태양에서 3차원 골격 구조물은 라미닌, 글리코사민 글리칸(GAG), 프로테오글리칸, 엘라스틴, 콜라겐 타입 I, II, III 및 IV, 엔탁틴(니도겐), 비트로넥틴, 히알루론산, 황산 헤파란, 황산 데르마탄, 황산 콘드로이틴, 황산 케라탄, 페를레칸, 부착 단백질 및 피브로넥틴으로 구성되는 군에서 선택되는 세포외 간질 성분을 함유하거나 그 성분으로 구성된다. 본 발명의 바람직한 태양에서 골격 구조물은 콜라겐, 특히 콜라겐 섬유와 같은 골격 기초 구조물로 구성될 수 있으며, 이 골격 기초 구조물은 유리하고 선택적인 방식으로 골격 구조물을 형성하는 상술한 군의 부가적인 성분으로 구현된다. 이 방식에서 골격 구조물, 특히 콜라겐 골격 구조물은 부가적으로 예를 들어, 부착 및 증식과 같은 세포 특성을 촉진하는, 고정 단백질 및/또는 탄수화물과 같은 성분으로 구현될 수 있다.
본 발명에 따른 세포 배양 시스템의 바람직한 태양에서 특히 콜라겐으로 만들어진 골격 구조물은 섬유 형태 및/또는 그물 형태로 존재한다.
다른 바람직한 태양에서 특히 콜라겐으로 만들어진 골격 구조물은 그물 같은, 가지달린 형태로 3차원 방식으로 존재한다. 바람직한 태양에서 골격 구조물은 하이드로-겔 또는 스폰지 같은 형태로 존재할 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 세포 배양 시스템에서 3차원 생체 적합성 골격 구조물은 세포외 간질이다.
바람직한 태양에서 나노입자에서 활성제의 농도는 1 ng/㎖ 내지 10 ㎍/㎖의 범위에 있다.
본 발명의 다른 바람직한 태양에서 세포 배양 시스템은 완전히 분포된 방식으로 세포 배양 시스템에 존재하는 나노입자를 함유한다. 그러나, 바람직한 태양에서 나노입자의 불균일 분포 또한 존재할 수 있다. 다른 바람직한 태양에서 나노입자는 골격 구조물 위 및/또는 아래에 적어도 하나의 층의 형태로 존재한다. 다른 바람직한 태양에서 나노입자는 골격 구조물 위에 적어도 하나의 층의 형태로 존재한다.
바람직하게는 본 발명에 따른 세포 배양 시스템에서 나노입자는 골격 구조물 아래에 다층으로 배열된다.
바람직하게는 본 발명에 따른 세포 배양 시스템에서 나노입자는 골격 구조물 위에 다층으로 배열된다.
본 발명의 바람직한 태양에서 나노입자의 평균 직경은 골격 구조물의 평균 두께보다 항상 작거나 같다. 다른 바람직한 태양에서 모든 나노입자의 평균 직경은 골격 구조물의 평균 두께보다 항상 작다. 바람직한 태양에서 모든 나노입자는 바람직하게는 현저하게 또는 완전히 골격 구조물에 바람직하게는 끼워 넣어진다. 바람직하게는 골격 구조물의 두께에 대한 나노입자의 치수의 비율은 1:1 이하, 바람직하게는 1:10 이하, 더욱 바람직하게는 1:100 이하, 더욱 바람직하게는 1:1000 이하이다.
본 발명의 바람직한 태양에서 본 발명에 따른 세포 배양 시스템에서 나노입자는 골격 구조물 내에서 구배의 형태로 존재한다.
다른 태양에서 본 발명에 따른 세포 배양 시스템에서 바람직하게 제공되는 활성제는 골격 구조물 내에서 구배의 형태로 존재한다.
본 발명에서 "구배"란 말은 본 발명에 따른 세포 배양 시스템, 특히 골격 구조물 내에서 나노입자 및/또는 활성제의 다양한 농도의 형성, 특히 나노입자 및/또는 활성제의 공간적으로 점차 변화하는 농도 증가 또는 감소를 의미한다.
본 발명의 바람직한 태양에서 활성제 구배는 다양한 농도의 활성제를 갖는 나노입자의 사용에 의해 형성된다. 이 바람직한 태양에서 활성제는 나노입자에 다양한 농도로 둘러싸이거나 부착될 수 있다. 또한, 활성제는 기능기를 통한 결합에 의해 다양한 농도로 나노입자에 부착될 수도 있다. 골격 구조물 내에서 다양한 농도의 나노입자의 배열에 따라, 균일한 분포처럼, 세포 배양 시스템에서 활성제의 농도 구배의 농도 증가가 이 방식으로 얻어질 수 있다. 본 발명의 바람직한 태양에서 나노입자가 균일하게 분포된 방식으로 골격 구조물 내에 존재하고, 나노입자가 다양한 활성제 농도를 갖고, 활성제 구배가 형성되도록 배열됨으로써, 활성제 구배가 구현된다. 바람직한 태양에서 다양한 활성제 농도를 갖는 나노입자는 골격 구조물에서 공간적으로 불균일한 형태로 분포되고, 특히 이러한 나노입자는 나노입자 구배의 형태로 결합된다.
본 발명의 다른 바람직한 태양에서 나노입자 구배를 형성함으로써, 즉 이용되는 나노입자에서 특정 농도 및 동일한 농도의 활성제가 그 표면에 둘러싸이거나 부착되어 있는 나노입자가 공간적으로 불균일한, 예를 들어 다르게 분포되는 방식으로 골격 구조물에 존재함으로써, 활성제 구배가 세포 배양 시스템에서 구현된다. 이 방식에서 예를 들어 골격 구조물의 상부 영역에서는 나노입자의 양이 적고, 그 아래에 위치하는 골격 구조물의 영역에서는 나노입자의 양이 많을 경우, 골격 구조물 내의 구배에서 농도 증가를 초래한다. 반대로, 골격 구조물의 상부 영역에서는 나노입자의 양이 많고, 그 아래에 위치하는 골격 구조물의 영역에서는 나노입자의 양이 적을 경우, 골격 구조물 내의 구배에서 농도 감소를 초래한다.
본 발명의 또 다른 바람직한 태양에서 제어되고 지연되는 활성제 방출이 특히 생분해성 나노입자의 사용에 의해 일어난다. 본 발명에 따라 활성제의 바람직하게 제어되는 방출은 나노입자로부터 주위의 세포 배양 시스템으로, 특히 섬유 또는 그물형 골격 구조물로의 확산에 의해 부가적으로 또는 선택적으로 확보될 수 있다.
본 발명의 다른 바람직한 태양에서 나노입자는 골격 구조물에 결합된다. 바람직한 태양에서 배양 배지 변화가 골격 구조물로부터 나노입자를 분리시키지 않도록 결합이 수행된다. 바람직한 태양에서 결합은 헹굼 가능하며, 예를 들어 배양 배지의 변화 중에, 그리고 선택적으로는 완충제와 같은 통상적인 헹굼 매체를 이용하는 헹굼 단계를 수행하더라도, 나노입자는 골격 구조물로부터 분리되지 않을 것이다.
바람직하게는 본 발명에서 나노입자는 정전기적 상호작용, 특히 이온 결합을 통해 골격 구조물에 결합된다.
본 발명의 다른 바람직한 태양에서 나노입자는 UV 가교를 통해 골격 구조물에 결합된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 태양에서 세포 배양 시스템은 이동 시험, 특히 생체내 이동 시험을 수행하는데 이용된다.
또한, 본 발명은 골격 구조물이 예를 들어 다음 방법 중 어느 하나에 따라 나노입자와 접촉하게 되는, 3차원 생체 적합성 골격 구조물을 포함하는 세포 배양 시스템의 제조 방법에 관련된다.
본 발명의 바람직한 태양에서 세포 배양 시스템은 "비접촉 인쇄 방법"에 의해 제조된다.
본 발명에서 "비접촉 인쇄 방법"이라 말은 나노입자가 표면에 접촉하지 않고 기질에 전사되는 방법이다. 이를 달성하기 위한 여러가지 가능성이 있다. 제1의 바람직한 태양에서 소위 드롭 온 디맨드(drop on demand)가 잉크젯 방법에 의해 제공된다. 제2태양에서 푸쉬버튼 또는 개별 핀에 의한 방법이 제공된다. 두 태양에서 현탁액의 하나 또는 다수의 방울이 원하는 위치에 전사된다. 바람직하게는 상업적으로 이용가능한 Dimatrix(후지필름) 장치가 잉크젯 방법에 이용된다. 마이크로드롭 기술에 의해 만들어진 장치인 MicroFab TECHNOLOGIES(Scienion AG 및 GeSIM mbH) 또한 바람직한데, 이 장치는 개별 핀을 포함하고, 포인트-정밀 방식으로 컴퓨터를 통해 방울 방출을 조절할 수 있다. 본 발명에서 "포인트-정밀" 방법은 모든 방법에서 위치 정확도가 ± 25 ㎛ 이하로 나타나는 것을 의미한다. 위치 정확도의 관점에서 방울 부피 또한 고려되어야 한다. 이 부피는 Dimatix DMC-11601 장치에서 1 pL, Nano-Plotter NP1.2 장치(GeSIM)에서 100 pL로 조절될 수 있다. 본 발명의 범위 내에서, 바람직하게는 나노입자 현탁액의 방출은 공기압 방법, 진공 방법 또는 압전 방법을 통해 수행된다. 특히 본 발명에서 기질, 특히 세포 배양 시스템의 골격 구조물로의 나노입자의 침투 깊이는 본 발명에 따른 방법의 각 태양에서 방울 부피 또는 방울 속도에 의헤 제어된다. 비접촉 인쇄 방법은 바람직하게는 골격 구조물 내에서 나노입자의 층과 같은 부착을 유도한다.
본 발명의 다른 바람직한 태양에서 특히 나노입자를 함유하는 현탁액으로 포화시키는 것과 같이, 나노입자를 함유하는 현탁액이 골격 구조물에 스며드는, 함침에 의해 제조되는 세포 배양 시스템이 제공된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 태양에서 레이저 유도 포워드 전사(LIFT) 방법에 의해 제조되는 세포 배양 시스템이 제공된다. 이 목적을 위해 전사되는 재료, 특히 세포외 간질의 하나 또는 그 이상의 부분이 레이저 에너지에 의해 절단되고 목표 재료에 부착된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 태양에서 세포 배양 시스템은 전기방사(스핀코팅)에 의해 제조된다. 전기방사에 의해 고분자 구조물은 세포, 즉 세포외 간질의 자연 환경과 매우 유사한, 바람직하게는 2 내지 20 ㎛의 섬유 직경으로 바람직하게 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명은 특히 바람직한 태양에서 예를 들어 자발적 유화 용매 확산(SESD) 방법의 용매 증발, 염석, 스프레이 건조 또는 상 분리에 의해 생체 적합성 나노입자를 제조하는, 세포 배양 시스템의 제조 방법에 관련된다.
특히 바람직한 태양에서 용액 증발에 의해, 특히 유중수적형 기술에 의해 이용되는 나노입자를 제조한다. 이 방법에 따르면 바람직하게는 다양한 친수성 활성제를 나노입자에 결합시키는 것도 본 발명에 따라 가능하다. 이 목적을 위해 물에 있는 활성제가 고분자를 함유하는 오일 상에서 유화된다. 이 혼합물은 추가적인 수상에서 유화되고, 유기 용매는 예를 들어 감압에 의해 제거된다. 다른 태양에 따르면 특히 소수성 활성제를 결합시키기 위해, 유/수 에멀션(O/W)을 이용하는 것도 가능하다. 이 태양에서 오일 상은 고분자에 대한 용매 및 활성제로서 동시에 작용한다.
또 다른 태양은 특히 용매 증발에서 자발적 유화 용매 확산(SESD) 방법에 의한 본 발명에 따른 나노입자의 제조를 제공한다. 이 목적을 위해 본 발명에서는 고분자 및 활성제 모두를 유기 혼합물, 바람직하게는 디클로로메탄 및 아세톤에 용해시키고, 이 용액을 안정화제를 포함하는 수상에 옮기고, 이를 교반에 의해 유화시킨다. 특히 본 발명에서는 이 목적을 위해 친수성 용매, 바람직하게는 아세톤이 주위의 수상으로 확산되고, 본 발명에 따른 나노입자가 감압 하에서 교반에 의해 생성된다. 바람직한 태양에서 입자 크기는 물에 혼합될 수 있는 용매의 비율을 증가시킴으로써 감소한다.
다른 태양에서 특히 염석에 의해 본 발명에 따른 나노입자를 제조한다. 본 발명은 특히 이 제조에서 용매의 사용을 생략한다. 제조를 위해, 이 방식에서 수상으로서 점성 겔을 얻기 위해, 고분자, 바람직하게는 PVA가 포화 용액, 특히 염화 마그네슘 또는 아세트산 마그네슘에 첨가된다. 특히 본 발명에서 바람직하게는 유기 상으로서 아세톤에 활성제를 포함하는 생분해성 고분자를 용해시킨다. 수상 및 유기 상을 혼합함으로써, 생성되는 2상 시스템에서 교반에 의해 유기 상은 겔에 유화된다. 바람직하게는 본 발명에서 충분한 양의 물을 첨가함으로써, 바람직하게는 아세톤의 확산 이후, 본 발명에 따른 나노입자는 수상에 침전된다.
또 다른 태양에서 스프레이-건조에 의해 본 발명에 따른 나노입자를 제조한다. 본 발명에서 바람직하게는 본 발명에 따른 나노입자는 생분해성 고분자 및 활성제가 용해되어 있는 용액 및 에멀션의 스퍼터링 또는 아토마이징 각각에 의해, 특히 뜨거운 공기 기류에서 2차 노즐에 의해 제조된다.
다른 태양에서 본 발명에 따른 나노입자는 특히 상 분리-코아세르베이션에 의해 제조된다. 이 목적을 위해 본 발명에서 바람직하게는 디클로로메탄에 생분해성 고분자를 용해시키고, 그 속에 활성제를 분산 또는 유화시킨다. 또한, 본 발명에서 바람직하게는 유기 고분자 상과 혼합되지 않는 실리콘 오일을 교반 중에 단계적으로 첨가하고, 상 분리를 수행한다. 바람직하게는 헵탄을 첨가하면서 이 혼합물을 더욱 교반함으로써, 본 발명에 따른 나노입자가 얻어질 수 있다.
본 발명에 따른 세포 배양 시스템의 제조 방법은 바람직하게는 비접촉 인쇄 방법에 의해 제조되는 세포 배양 시스템에 관련된다.
다른 바람직한 태양에서 본 발명은 함침에 의해 제조되는 세포 배양 시스템의 제조 방법에 관련된다.
다른 바람직한 태양에서 본 발명은 LIFT 방법에 의해 제조되는 세포 배양 시스템의 제조 방법에 관련된다.
다른 바람직한 태양에서 본 발명은 전기방사(스핀코팅)에 의해 제조되는 세포 배양 시스템의 제조 방법에 관련된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 세포 배양 시스템 및 적절한 배양 배지를 함유하는 세포 배양 용기에 세포를 삽입하고, 거기서 배양을 촉진하는 적절한 조건 하에 배양하는 세포 배양 방법에 관련된다.
바람직하게는 배양되는 세포는 특히 인간 또는 동물 유래의 진핵 세포이다. 바람직하게는 배양되는 세포는 1차 세포이다.
본 발명의 다른 태양에서 배양되는 세포는 MCF-7, HeLa, HepG2, PC3, CT-26, A125, A549, MRC-5, CHO, MelJuso28, Nalm6 또는 Jurkat와 같은 종양 세포, 특히 종양 세포계이다.
본 발명의 다른 태양에서 배양되는 세포는 HUVEC 또는 HaCaT와 같은 부착 세포, 특히 확립된 세포계이다.
본 발명의 다른 태양은 배양되는 세포가 완전히 분화된 세포인, 본 발명에 따른 세포 배양 시스템에 의한 세포 배양 방법에 관련된다.
다른 바람직한 태양에서 본 발명은 미분화된 세포를 본 발명에 따른 세포 배양 방법으로 배양하고, 분화된 세포 또는 통합 세포 구조물을 이 방식으로 얻는, 분화된 세포 또는 미분화된 세포로 만들어진 통합 세포 구조물의 제조를 위한 방법, 특히 비-치료적 방법에 관련된다.
다른 바람직한 태양에서 본 발명은 미리 분화되거나 분화된 세포를 본 발명에 따른 세포 배양 방법으로 배양하는, 미리 분화되거나 분화된 세포의 분화 단계를 유지하기 위한 방법, 특히 비-치료적 방법에 관련된다. 다른 바람직한 태양에서 본 발명은 미분화된 세포를 본 발명에 따른 세포 배양 방법으로 배양하고, 미분화된 상태로 유지하는, 상술한 바람직하게는 비-치료적 방법에 관련된다.
바람직하게는 본 발명에서 통합 세포 구조물은 이식물 또는 시험 시스템이다.
본 발명에서 또한 바람직하게는 통합 세포 구조물은 기관, 기관 일부, 특히 호흡관 또는 그 일부일 수 있다.
또한, 본 발명은 분화 또는 미분화 세포, 또는 이식물, 시험 시스템, 기관, 기관 일부, 특히 호흡관 또는 그 일부와 같은 통합 세포 구조물의 본 발명에 따른 배양 이후 얻어지는, 분화된 세포 및 통합 세포 구조물에 관련된다.
본 발명, 특히 본 발명의 세포 배양 방법은 줄기 및 전구체 세포의 장기간 배양을 가능하게 함으로써, 이식 및 시험 시스템 뿐만 아니라, 기초 연구와 같은 다양한 응용 분야에 사용될 수 있다.
본 발명, 특히 본 발명의 세포 배양 방법은 기능성 세포, 특히 1차 세포의 증식을 가능하게 한다.
본 발명, 특히 본 발명의 세포 배양 방법은 이식물의 제조 또는 약물 개발에서의 시험 시스템와 같은 분야에서, 기능성 세포 및 조직으로의 방향성 분화를 가능하게 한다.
본 발명, 특히 본 발명의 세포 배양 방법은 나노입자에 의해 유도되는 세포 이동에 의해, 만성/당뇨병성 상처를 치료하기 위한 이식물의 제조를 가능하게 한다.
또한, 본 발명은 세포를 본 발명에 따른 세포 배양 방법에 따라 배양할 수 있고, 이 세포 배양으로부터 발현 산물을 얻을 수 있는, 세포의 발현 산물의 제조 방법에 관련된다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 방법에 따라 배양하고, 그 발현 산물을 얻을 수 있는, 세포의 발현 산물에 관련된다.
다른 태양들은 종속항으로부터 명백하다.
본 발명은 다음의 실시예 및 도면에 근거하여 더욱 상세하게 설명된다. 실시예는 비-제한적인 것으로 이해하여야 한다.
도 1은 생분해성 나노입자의 REM 이미지를 도시한 것이다.
도 2는 실시예 1에서 8% BSA로 충전된 PLGA 입자의 방출 결과를 도시한 것이다.
도 3은 1일째에 PAH + 카르복시 나노입자로 코팅된 대물 슬라이드 위의 세포를 도시한 것으로; A)는 시험 1, B)는 시험 2를 나타낸다.
도 4는 시험 2에서 대조군으로서 세포 배양 병에서 배양한 세포를 도시한 것으로; A)는 1일째, B)는 3일째를 나타낸다.
도 5는 아미노 기능기를 갖는 나노입자를 이용하여 표면에서 배양하고, 이어서 평면 및 구형의 표면을 갖는 카르복시 나노입자를 이용하여 코팅한 세포를 도시한 것으로; A)는 PAA, 1일, 시험 1, B)는 PAH + 카르복시 나노입자, 1일, 시험 1, C)는 PAA, 3일, 시험 2, D)는 PAH + 카르복시 나노입자, 3일, 시험 2를 나타낸다.
도 6은 아미노 기능기를 갖는 나노입자를 이용하여 표면에서 배양하고, 이어서 평면 및 구형의 표면을 갖는 카르복시 나노입자를 이용하여 코팅한 세포를 도시한 것으로; A)는 PAH, 1일, 접근 3, B)는 PAA + 아미노 나노입자, 1일, 접근 3, C)는 PAH, 3일, 접근 2, D)는 PAA + 아미노 나노입자, 3일, 접근 2를 나타낸다.
약어
PLGA = 폴리(락티드-코-글리콜리드)
PLA = 폴리락티드
PCL = 폴리카프로락톤
PGA = 폴리글리콜리드
PAA = 폴리아크릴산
PAH = 폴리알릴아민 염산염
EGF = 상피 성장 인자
BMP = 골 형성 단백질
SESD = 자발적 유화 용매 확산 방법
MES = 모르폴린 에탄 술폰산
실시예 1:
수중 유중수적형 기술(W/O/W)에 의해 BSA로 충전된 PLGA 유래 나노입자의 제조
먼저 120 mg의 폴리(락티드-코-글리콜리드)를 3.1 ㎖ 디클로로메탄에 용해시켰다(O-상). 이 상에 캡슐화되는 단백질(소 혈청 알부민, BSA)의 수용액을 초음파 처리에 의해 유화시켰고(W/O), 또한 10 mg의 BSA를 100 ㎕ PBS 완충제(pH 7.4)에 용해시켰다. 활성제를 보호하기 위해 당, 단백질, 폴리에틸렌 글리콜 및 다른 세정제와 같은 다양한 안정화제를 수용액에 첨가할 수 있다. 제조된 W/O 상을 다른 수상(100 ㎖ 물 + 500 mg 폴리비닐 알코올)에 초음파로 분산시킴으로써, W/O/W 에멀션을 생성시켰다. 고분자를 함유하는 O상의 유기 용액을 증발에 의해 제거하였고, 이와 같이 나노입자로서 고분자를 침전시켰다. 입자의 크기는 약 150 내지 350 nm이었다. 따라서 활성제의 첨가량은 약 5-8 중량%이었다. 다량의 활성제를 사용함으로써 더 많은 충전량을 얻을 수 있다.
실시예 2:
W/O/W 기술에 의해 BMP-2로 충전된 PLA 유래 생분해성 나노입자의 제조
10 mg 폴리락티드를 300 ㎕ 디클로로메탄에 용해시켰다. BMP-2(골 형성 단백질-2, c = 200 mg/㎖)의 수용액 10 ㎕를 0.05% Lutrol F 68과 함께 이 상에 첨가한 후, 초음파로 유화시켰다.
상기 W1/O 상을 제2수상(10 ㎖의 0.5% PVA 용액)에 초음파로 분산시켰다. W1/O/W2 에멀션으로부터 디클로로메탄/아세톤 혼합물의 제거는 진공 하의 증발에 의해 수행하였다. 100-250 nm 크기의 나노입자를 침전시켰다. 활성제 충전량은 약 10-15 중량%이었다(도 1).
실시예 3:
W/O/W 방법에 의해 BSA로 충전된 PLA 나노입자의 제조
먼저 120 mg의 폴리(락티드-코-글리콜리드)를 3.1 ㎖ 디클로로메탄/아세톤(8/2)에 용해시켰다(O-상). 이 상에 캡슐화되는 단백질(소 혈청 알부민, BSA)의 수용액을 초음파 처리에 의해 유화시켰고(W/O), 또한 10 mg의 BSA를 100 ㎕ 물에 용해시켰다. 제조된 W/O 상을 다른 수상(0.5% 폴리비닐 알코올을 포함하는 물 100 ㎖)에 초음파로 분산시킴으로써, W/O/W 에멀션을 생성시켰다. 고분자를 함유하는 O상의 유기 용액을 증발에 의해 제거하였고, 이와 같이 나노입자로서 고분자를 침전시켰다. 입자의 크기는 약 150 내지 300 nm이었다. 따라서 활성제의 첨가량은 약 7-8 중량%이었다.
방출 동력학의 측정
BSA로 충전된 폴리(락티드-코-글리콜리드) 입자(Resomer® 502 H) 50 mg을 5 ㎖ PBS 완충제(pH 7.4)에 현탁시키고, 37℃의 오일 중탕에서 교반하였다. 샘플 당 300 ㎕를 제거하고 원심분리하였다. 펠렛을 PBS 완충제에 재현탁시키고, 실험으로 돌아갔다.
입자로부터 방출되는 활성제의 정량 측정을 HPLC, 여러가지 단백질 분 석(Lowry 또는 BCA 분석), 전자 스핀 공명(ESR) 등과 같은 여러가지 방법으로 수행하였다(도 2).
실시예 4:
나노입자 표면에 염료 및 단백질의 결합
(실시예 1에서) 제조된 생분해성 PLGA 나노입자 10 mg을 0.4 ㎖의 0.1 M MES 완충제에 현탁시켰다. 여기에 형광아민(3 mg/㎖) 용액 300 ㎕를 첨가하였다. 그러나, 인테그린과 같은 단백질은 입자 표면에 결합될 수 있다. 160 ㎕의 EDC 용액(c = 110 mg/㎖)을 한방울씩 첨가하고, 실온에서 밤새 진동시켰다. 현탁액을 원심분리하고, 펠렛을 완충제에서 세척하였다. 입자 g당 형광아민 3 μmol의 결합을 달성할 수 있었다.
실시예 5:
이후 수행되는 세포를 이용한 실시예를 위한 표면 개질된 실리카 나노입자의 제조
실리카 입자의 합성:
12 mmol 테트라에톡시 실란 및 90 mmol NH3을 200 ㎖ 에탄올에 첨가하였다. 이를 실온에서 24시간 동안 교반하였다. 이후, 입자를 다중 원심분리에 의해 세척하였다. 그 결과, 125 nm의 평균 입자 크기를 갖는 실리카 입자 650 mg을 얻었다.
실리카 입자의 아미노 기능기 도입:
실리카 입자의 1 중량% 수성 현탁액을 25% 암모니아 10 부피%에 첨가하였다. 입자를 기준으로 20 중량%의 아미노 프로필 트리에톡시 실란을 첨가한 후, 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 입자를 다중 원심분리로 세척하고, 그 표면에 아미노 기능기를 도입하였다(0.1 M 아세테이트 완충제에서의 제타 전위: + 35 mV).
실리카 입자의 카르복시 기능기 도입:
아미노 기능기가 도입된 나노입자의 2 중량% 현탁액 10 ㎖를 테트라하이드로푸란에 첨가하였다. 260 mg의 숙신산 수화물을 첨가하였다. 초음파를 이용하여 5분간 처리한 후 이를 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 입자를 다중 원심분리로 세척하고, 그 표면에 카르복시 기능기를 도입하였다(0.1 M 아세테이트 완충제에서의 제타 전위: - 35 mV). 평균 입자 크기는 170 nm이었다.
실시예 6:
표면 개질된 나노입자에 의한 최적화된 세포 배양 조건
개질된 표면에서 1차 상피 세포의 부착, 증식, 이동 및 분화에 대한 비교 실험을 수행하였다. 나노입자와 더불어, 개질된 표면도 섬유형 골격 구조물을 포함한다. 접종된 나노입자는 이 섬유형 골격 구조물에 10 내지 1000 nm의 간격으로 존재하였다.
표면 개질을 위해, 먼저 대물 슬라이드(OT)를 2%(v/v) Hellmanex II 용액을 이용하여 40℃의 물 중탕에서 세척하였다. 이후 음 전하를 생성하기 위해 표면의 수산화를 70℃에서 3:1(v/v) NH3(30%) 및 H2O2(25%) 용액에서 수행하였다. 예를 들어, 0.1 내지 6 mg/㎖의 농도를 갖는 콜라겐 타입 I과 같은 콜라겐 용액을 이용한 코팅을 수산화 전 또는 후에 일반적으로 알려진 방법으로 수행하였다.
표면의 고분자 전해질 코팅은 소위 층상 조립 기술에 의해 생성하였다. 이 방법에서 새로 세척되고 음으로 하전된 OT를 먼저 양이온성 폴리(알릴아민 염산염) 용액(PAH 용액)(0.01 M; 단량체 기준) 또는 폴리(디알릴 디메틸 암모늄 염화물) 용액(PDADMAC 용액)(0.02 M; 단량체 기준)에 두고, 실온에서 적어도 20분 동안 배양하였다. 오직 하나의 양이온성 PE 층의 구성은 카르복시 나노입자를 이용하는 이후 코팅을 위해 충분하였다. 아미노 나노입자를 이용하는 코팅을 위해, 음이온성 폴리아크릴산 용액(PAA 용액)(0.01 M; 단량체 기준)에서 20분 동안 PAH 코팅 이후 OT를 배양하는 것이 필요하다. 실리카 나노입자의 결합은 정전기적 인력을 통해 수행하였다. 카르복시 나노입자는 양이온성 고분자 전해질 PAH에 의해 유인되고, 아미노 나노입자는 음이온성 고분자 전해질 PAA에 의해 유인되었다. 이후 70% 에탄올을 이용한 표면 살균을 수행하였다.
여러가지 표면 개질의 결과는 표 1에 상세하게 나타난다. 표 1은 카르복시 및 아미노 나노입자에서 인간 케라티노사이트의 형태에 대한 관찰 결과를 보여준다. 개질된 표면에서의 시험은 n = 3 샘플을 이용하여 3번 수행하였다. 콜로니 밀도, 세포의 부착량, 증식율, 형태 및 1차 세포의 분화 상태를 평가하였다. 배양 병(도 4)과 대조적으로, 케라티노사이트의 현저하게 빠른 부착과 증식이 섬유형 골격 구조물을 갖는 개질된 표면에서 일어났다(도 3). 특히 표면 개질된 나노입자는 빠른 증식을 유도함으로써, 단지 몇 시간 후에 볼 수 있었다.
개질된 기질에서 1차 상피 세포의 형태는 세포 배양 병의 것과 유사하였다. 또한, 1차 세포의 빠른 분화가 아미노 기능기가 도입된 표면에서 관찰되었으며(도 6), 반면에 카르복시 표면에서 케라티노사이트의 분화는 대조군의 것과 상응하였다(도 5).
1일 2일 3일
시험 No. 1 2 3 1 2 3 1 2 3
PAH를 포함하는 유리 대물 슬라이드 K=+ M=+ K=+(+) M=+ K=+(+) M=0 K=++ M=(+) K=++ M=+ K=++ M=0 K=++ M=- K=++(+) M=+ -
PAH 및 카르복시 나노입자를 포함하는 유리 대물 슬라이드 K=++ M=(+) K=+ M=+ K=+(+) M=0 한 OT*에서 K=++(+) M=+ 다른 OT*에서 M=(0) K=++ M=+ K=++(+) M=- K=++(+) M=- K=++(+) M=0 -
PAA를 포함하는 유리 대물 슬라이드 K=++ M=+ K=++ M=+(+) K=++ M=0 K=++ M=0 K=++(+) M=+(+) K=++ M=0 K=++ M=- K=++(+) -
PAA 및 아미노 나노입자를 포함하는 유리 대물 슬라이드 K=++(+) M=+(+) K=++ M=+ K=++ M=+ K=++ M=(+) K=+++ M=+ K=++(+) M=+ K=++(+) M=- OT*1에서 M=- OT*2에서 K=+++ M=+(+) OT*3에서 M=- -
유리 대물 슬라이드 K=+ M=+ K=(+) M=+(+) K=+ M=0 K=++ M=+ K=++ M=+(+) K=++ M=- K=++ M=- K=++ M=+ -
세포 배양 병(Greiner) K=0 K=+ M=++ K=0 K=+ M=++ K=+ M=++ K=+ M=++ K=++ M=++ K=++ M=++ -
K = 콜로니 밀도: 0: 콜로니가 없거나 콜로니 당 5개 세포 이하, +: 콜로니 ＜ 콜로니 당 20개 세포, ++: 콜로니 ＞ 콜로니 당 20개 세포, +++: 세포 층 M = 형태: -: 분화 단계가 매우 늦거나 죽은 세포, 비부착 세포, 0: 분화된 세포, 긴 형태, 세포질은 코어에 비해 큼, +: 분화 단계가 빠른 세포, 일부는 분화가 늦음, ++: 모든 세포의 분화 단계가 빠름, 입방체 형태, 세포질/코어의 비율이 균형 잡힘 *OT = 대물 슬라이드
본 발명은 세포의 자연 환경처럼 천연 세포외 간질에 가능한 근접하고, 세포 성장 및 세포 분화를 제어된 방식으로 조절하고, 또한 이를 상업적 요건에 맞추기 위해, 성장 인자 및 사이토카인의 제어된 첨가를 가능하게 하는 세포 배양 시스템을 제공하며, 또한 이식에 적합한 세포, 특히 조직 및 기관을 제공한다.

Claims (60)

  1. 3차원 생체 적합성 골격 구조물 및 생체 적합성 나노입자를 포함하는 세포 배양 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 나노입자가 적어도 하나의 활성 성분을 포함하는 세포 배양 시스템.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 나노입자가 50 내지 1000 nm, 바람직하게는 60 내지 600 nm의 직경을 갖는 세포 배양 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 80 내지 150 nm, 바람직하게는 50 내지 150 nm의 직경을 갖는 세포 배양 시스템.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 무기 고분자, 금, 귀금속, 금속, 금속 산화물, 인산 칼슘, 인산 수소 칼슘, 혼합 인산염, 또는 실리케이트, 실리콘 산화물, 실리콘 이산화물과 같은 실리콘계 산화물로 구성되는 세포 배양 시스템.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 유기 고분자로 구성 되는 세포 배양 시스템.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 생분해성 고분자로 구성되는 세포 배양 시스템.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 폴리락티드(PLA), 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA), 폴리카프로락톤(PCL), 폴리글리콜리드, 디- 및 트리블록 고분자, 예를 들어 PCL/PGA 디블록 시스템, 폴리오르쏘에스터(POE), 폴리무수물, 폴리히드록시알카노에이트(PHA) 또는 폴리피롤(PPy), 폴리프로필렌 카보네이트, 폴리에틸렌 카보네이트, 폴리알킬시아노니트릴 또는 폴리에틸렌 글리콜로 구성되는 세포 배양 시스템.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 활성 성분을 둘러싸거나 활성 성분이 그 표면에 부착되는 세포 배양 시스템.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 여러가지 분자량 및 여러가지 극성의 고분자로 구성됨으로써 나노입자에 둘러싸인 활성 성분의 특정 방출 프로파일을 보증하는 세포 배양 시스템.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 유화 중합 방법을 이용하여 제조되는 세포 배양 시스템.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자에서 활성 성분의 둘러싸임이 수중유적형 기술에 의해 일어나는 세포 배양 시스템.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 성분이 성장 인자, 사이토카인, 케모카인, 비타민, 미네랄 물질, 지방, 단백질, 영양소, 섬유-형성 단백질, 탄수화물, 부착 단백질, 인테그린, 세포 수용체, 약물, DNA, RNA, 압타머, 혈관 신생 인자, 렉틴, 항체, 항체 단편, 염료, 형광 아민 또는 억제제인 세포 배양 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 안정화제를 포함하는 세포 배양 시스템.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화제가 탄수화물, 단백질, 폴리에틸렌 글리콜 또는 세정제인 세포 배양 시스템.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 기능기와 결합함으로써 기능기가 도입되는 세포 배양 시스템.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 성분의 상보적 기 2A와 인력 결합, 바람직하게는 공유 결합을 할 수 있는 제1기능기 1A가 나노입자의 표면에 적용되는 세포 배양 시스템.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자 표면의 제1기능기 1A 및 활성 성분의 상보적 기 2A가 아미노 기, 카르복시 기, 에폭시 기, 말레이미드 기, 알킬케톤 기, 알데히드 기, 히드라진 기, 히드라지드 기, 티올 기 및 티오에스터 기로 구성되는 군에서 선택되는 세포 배양 시스템.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 성분의 상보적 기 2B와 인력 결합, 바람직하게는 비-공유 결합을 할 수 있는 제2기능기 1B가 나노입자의 표면에 적용되는 세포 배양 시스템.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자 표면의 제2기능기 1B 및 활성 성분의 상보적 기 2B가 올리고히스티딘 기, 스트렙 태그 I, 스트렙 태그 II, 데스티오비오틴, 비오틴, 키틴, 키틴 유도체, 키틴 결합 도메인, 금속 이온 킬레이트 착물, 스트렙타비딘, 스트렙탁틴, 아비딘 및 뉴트라비딘으로 구성되는 군에서 선택되는 세포 배양 시스템.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 3차원 골격 구조물이 라미닌, 글리코사미노글리칸(GAG), 프로테오글리칸, 엘라스틴, 콜라겐 타입 I 내지 IV, 엔탁틴(니도겐), 비트로넥틴, 히알루론산, 황산 헤파란, 황산 데르마탄, 황산 콘드로이틴, 황산 케라틴, 페를레칸, 부착 단백질 및 피브로넥틴으로 구성되는 군에서 선택되는 세포 배양 시스템.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 골격 구조물이 섬유 형태로 존재하는 세포 배양 시스템.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 골격 구조물이 3차원 하이드로젤라틴 형태 또는 스폰지 형태로 존재하는 세포 배양 시스템.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 3차원 생체 적합성 골격 구조물이 세포외 간질인 세포 배양 시스템.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 완전히 분포된 방식 또는 층을 이룬 형태로 세포 배양 시스템에 존재하는 세포 배양 시스템.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 층을 이룬 형태로 존재하는 나노입자가 골격 구조물 아래에 배치되는 세포 배양 시스템.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자, 특히 활성 성분을 채워 넣은 나노입자가 골격 구조물 내에서 양이 증가 또는 감소하는 구배의 형태로 분포하는 세포 배양 시스템.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 각각 동일한 농도의 둘러싸이거나 도입된 활성 성분을 갖는 나노입자가 골격 구조물 내에서 특정 영역에 여러가지 양으로 존재하도록, 활성 성분 구배가 골격 구조물 내에서 형성되는 세포 배양 시스템.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 여러가지 농도의 둘러싸이거나 도입된 활성 성분을 갖는 나노입자가 골격 구조물 내에서 균일하게 분포되는 방식으로 존재하도록, 활성 성분 구배가 골격 구조물 내에서 형성되는 세포 배양 시스템.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 여러가지 농도의 둘러싸이거나 도입된 활성 성분을 갖는 나노입자가 골격 구조물 내에서 특정 영역에 여러가지 양으로 존재하도록, 활성 성분 구배가 골격 구조물 내에서 형성되는 세포 배양 시스템.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 시스템이 활성 성분 의 제어, 지연 방출을 갖는 시스템인 세포 배양 시스템.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 골격 구조물에 연결되는 세포 배양 시스템.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 정전기적 상호작용에 의해 골격 구조물에 연결되는 세포 배양 시스템.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 이온 결합에 의해 골격 구조물에 연결되는 세포 배양 시스템.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 나노입자가 UV 가교 결합에 의해 골격 구조물에 연결되는 세포 배양 시스템.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 시스템이 이동 실험, 특히 생체내 이동 실험을 수행하는데 사용되는 세포 배양 시스템.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 시스템이 비접촉 인쇄 방법을 이용하여 제조되는 세포 배양 시스템.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 시스템이 함침에 의해 제조되는 세포 배양 시스템.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 시스템이 LIFT 방법을 이용하여 제조되는 세포 배양 시스템.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 시스템이 전기-방사(스핀 코팅)에 의해 제조되는 세포 배양 시스템.
  41. 생체 적합성 나노입자를 3차원 생체 적합성 골격 구조물에 접촉시키는, 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 시스템의 제조 방법.
  42. 제41항에 있어서, 비접촉 인쇄 방법을 이용하여 세포 배양 시스템을 제조하는 방법.
  43. 제41항 또는 제42항에 있어서, 3차원 골격 구조물을 나노입자로 함침함으로써 세포 배양 시스템을 제조하는 방법.
  44. 제41항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, LIFT 방법을 이용하여 세포 배양 시스템을 제조하는 방법.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 전기-방사(스핀 코팅)에 의해 세포 배양 시스템을 제조하는 방법.
  46. 세포를 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 따른 세포 배양 시스템을 함유하는 세포 배양 용기에 두고, 배양을 허용하는 적절한 조건 하에 세포 배양 배지에서 배양하는, 세포 배양 방법.
  47. 제46항에 있어서, 세포가 1차 세포인 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 1차 세포가 제대혈로부터 수득한 배아 줄기 세포, 특히 전능 또는 만능 줄기 세포인 방법.
  49. 제46항 또는 제47항에 있어서, 1차 세포가 성체 줄기 세포, 특히 상피 세포, 수지상 세포, 간질 세포, 지방 세포, 중간엽 세포 또는 골수 세포인 방법.
  50. 제46항 또는 제47항에 있어서, 세포가 종양 세포, 특히 MCF-7, HeLa, HepG2, PC3, CT-26, A125, A549, MRC-5, CHO, MelJuso28, Nalm6 또는 Jurkat와 같은 종양 세포 라인인 방법.
  51. 제46항 또는 제47항에 있어서, 세포가 부착 세포, 바람직하게는 HUVEC 또는 HaCaT와 같은 부착 세포 라인인 방법.
  52. 제46항 또는 제47항에 있어서, 세포가 분화된 세포인 방법.
  53. 세포를 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 배양하고 발현 산물을 얻는, 세포 발현 산물의 제조 방법.
  54. 미분화된 세포를 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 배양하고 분화된 세포 또는 세포 클러스터를 얻는, 분화된 세포 또는 세포 클러스터의 제조 방법.
  55. 제54항에 있어서, 세포 클러스터가 이식물 또는 시험 시스템인 방법.
  56. 제54항에 있어서, 세포 클러스터가 기관 또는 기관 일부, 특히 호흡관인 방법.
  57. 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 제조되는 세포 발현 산물.
  58. 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 제조되는 분화된 세포 또는 세포 클러스터.
  59. 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 제조되는 이식물 또는 시험 시스템.
  60. 제46항 내지 제56항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 제조되는 기관 또는 기관 일부, 특히 호흡관.
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