CN110476953B - 一种细胞活性保存液以及疾病检测试剂盒 - Google Patents

一种细胞活性保存液以及疾病检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医学领域，提供一种细胞活性保存液以及疾病检测试剂盒，用于高效的保持样品中细胞的活性。本发明提供的一种细胞活性保存液，每毫升保存液包括：0.04~0.06ng表皮生长因子、0.015~0.19ng的葡萄糖、0.00095~0.0025μmol磷酸根、1.2×10‑4~2.15×10‑4μmol氯化钙、1.02×10‑4~1.15×10‑4μmol氯化镁，0.05~0.08ng的磷酸钙纳米粒子；占保存液总量10~15%的白蛋白和45~55%的二甲基亚飒，溶剂为双蒸水。保存液可以使细胞的活性可以长期稳定的保存，为后续检测提供了足量的可用的底物，提高了癌症早期检测的准确性。

Description

一种细胞活性保存液以及疾病检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种细胞活性保存液以及疾病检测试剂盒。
背景技术
尿样品中含有生理性代谢废弃物质包括含有机、无机类成分以及含微量元素的电解质成分，一些尿液中会含有蛋白类及糖类物质，属于患者性代谢产物；由于尿液排出前会经过一系列组织如膀胱，因此尿液中还会含有少量的组织脱落细胞，鉴于尿液与人体代谢的密切关系，因此用于很多分析实验或临床检测。然而也正是由于尿样中丰富的成分，使细菌能够快速地繁殖于其中，当尿样不能及时进入检测程序时，细菌与其中的一些成分会使尿液中反映患者状况的成分失活或者变态，导致后续检测结果不能准确反映患者的生理状况。
现有技术中，采集了细胞后，通常需要将样品和保存液混合再在-75℃下保存，这对于大部分的用户而言是难以实现的；同时虽然在现有保存技术下，细胞的活性可以长时间的保存，但是不及时检测，采集样品就没有意义，一年后检测时，患者的癌症可能已经由早期步入了中期甚至晚期，因此如何短时间便捷高效保存细胞，是亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明解决的技术问题为高效的保持样品中细胞的活性，提供一种细胞活性保存液以及疾病检测试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：
一种细胞活性保存液，每毫升保存液包括：0.04~0.06ng表皮生长因子、0.015~0.19ng的葡萄糖、0.00095~0.0025μmol磷酸根、1.2×10-4~2.15×10-4μmol氯化钙、1.02×10-4~1.15×10-4μmol氯化镁，0.05~0.08ng的磷酸钙纳米粒子；占保存液总量10~15%的白蛋白和45~55%的二甲基亚飒，溶剂为双蒸水。
在现有技术的基础上引入了磷酸钙纳米粒子，使得表皮生长因子的活性长期存在，可以长效的保存细胞的活性。
保存液可以使细胞的活性可以长期稳定的保存，为后续检测提供了足量的可用的底物，提高了癌症早期检测的准确性。
优选地，每毫升保存液包括：0.05ng表皮生长因子、0.018ng的葡萄糖、0.0015μmol磷酸根、1.8×10-4μmol氯化钙、1.1×10-4μmol氯化镁，0.06ng的磷酸钙纳米粒子；占保存液总量12%的白蛋白和50%的二甲基亚飒，溶剂为双蒸水。
优选地，所述白蛋白为人血清白蛋白。人血清白蛋白可以维持细胞的生理活性，可以作为营养物质运输的载体。
优选地，所述磷酸钙纳米粒子为表面复合纳米二氧化硅的磷酸钙纳米粒子。对纳米粒子进行改性，可以进一步保持表皮生长因子的活性，进而更长时间的维持细胞的活性。
优选地，所述磷酸钙纳米粒子的制备方法为：
S11.将0.01~1mol的氯化钙溶液，0.01~1mol的磷酸溶液按1:1~2混合后，在室温下搅拌24~48h，在环境温度4℃，10000rpm离心20min，去除上清液，加入去离子水，超声处理60min，得到第一浆液；
S12.将0.01~0.1mol的纳米二氧化硅加入第一浆液中，在40~80℃下加搅拌5~8h，搅拌速度为100~120r/min，搅拌结束后过滤，干燥，粉碎、研磨得到表面复合纳米二氧化硅的磷酸钙纳米粒子。按照一定的方式对纳米二氧化硅进行改性，可以更进一步的提高细胞的保存时间。
优选地，所述二氧化硅为改性纳米二氧化硅。改性纳米二氧化硅可以更进一步的提高细胞的保存效果，尤其可以提高细胞在-20~-18℃下的保存时间。
优选地，所述改性纳米二氧化硅的制备方法为：
S21.将纳米二氧化硅浸于0.1~0.5mol/L的磷酸氢铵溶液中，在室温下搅拌12~18h，过滤，得到的固体干燥后焙烧2~5h得到第一粉末；
S22.将钛酸正丁酯溶于正辛烷中，得到0.05~0.1mol/L的钛酸正丁酯溶液；将第一粉末在搅拌条件下加入钛酸正丁酯溶液中，惰性气体保护下加热回流，加热的温度为60~70℃，回流时间10~15h，回流结束后，过滤，得到的固体用无水乙醇洗涤，再经干燥、焙烧后，得到第二粉末；
S23.将硝酸铈、硝酸锌溶液去离子水中，得到混合溶液；将第二粉末溶于混合溶液中，干燥后焙烧，得到改性纳米二氧化硅。通过大量的实验确定了钛、铈、锌同硅复配后同磷酸钙复合，可以充分的维持细胞在常用冷冻环境下的活性。
优选地，所述二氧化硅：钛酸正丁酯：硝酸铈：硝酸锌：磷酸氢铵=80:5:1:1：15。
优选地，所述S21步骤中，所述焙烧温度为300~500℃；所述S22步骤中，所述焙烧温度为500~700℃，所述S23步骤中，所述焙烧温度为500~600℃。
一种疾病检测试剂盒，包括上述的保存液。还包括引物，核苷三磷酸，Taq聚合酶，与Taq聚合酶配套使用的缓冲液，双蒸水，阳性对照标准品。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：保存液可以使细胞的活性可以长期稳定的保存，为后续检测提供了足量的可用的底物，提高了癌症早期检测的准确性。
本发明的保存液可以-20℃下将未预处理的样品保存一周左右，细胞的活性同现有技术保存的并无显著的差异，可以有效的促进用户自采样品后送交检测机构检测。
附图说明
图1为细胞活性保存液在-20℃下未经预处理的应用效果。
图2为细胞活性保存液在-20℃下经过预处理的应用效果。
图3为细胞活性保存液在-75℃下经过预处理的应用效果。
具体实施方式
以下实施列是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
一种细胞活性保存液，每毫升保存液包括：0.05ng表皮生长因子、0.018ng的葡萄糖、0.0015μmol磷酸根、1.8×10-4μmol氯化钙、1.1×10-4μmol氯化镁，0.06ng的磷酸钙纳米粒子；占保存液总量12%的白蛋白和50%的二甲基亚飒，溶剂为双蒸水。所述白蛋白为人血清白蛋白。所述磷酸钙纳米粒子为表面复合纳米二氧化硅的磷酸钙纳米粒子。所述磷酸钙纳米粒子的制备方法为：
S11.将0.1mol的氯化钙溶液，0.1mol的磷酸溶液按1:1混合后，在室温下搅拌36h，在环境温度4℃，10000rpm离心20min，去除上清液，加入去离子水，超声处理60min，得到第一浆液；
S12.将0.05mol的纳米二氧化硅加入第一浆液中，在40~80℃下加搅拌5~8h，搅拌速度为100~120r/min，搅拌结束后过滤，干燥，粉碎、研磨得到表面复合纳米二氧化硅的磷酸钙纳米粒子。所述二氧化硅为改性纳米二氧化硅。所述改性纳米二氧化硅的制备方法为：
S21.将纳米二氧化硅浸于0.2mol/L的磷酸氢铵溶液中，在室温下搅拌15h，过滤，得到的固体干燥后焙烧4h得到第一粉末；
S22.将钛酸正丁酯溶于正辛烷中，得到0.08mol/L的钛酸正丁酯溶液；将第一粉末在搅拌条件下加入钛酸正丁酯溶液中，惰性气体保护下加热回流，加热的温度为60~70℃，回流时间12h，回流结束后，过滤，得到的固体用无水乙醇洗涤，再经干燥、焙烧后，得到第二粉末；
S23.将硝酸铈、硝酸锌溶液去离子水中，得到混合溶液；将第二粉末溶于混合溶液中，干燥后焙烧，得到改性纳米二氧化硅。所述二氧化硅：钛酸正丁酯：硝酸铈：硝酸锌：磷酸氢铵=80:5:1:1：15。所述S21步骤中，所述焙烧温度为400℃；所述S22步骤中，所述焙烧温度为600℃，所述S23步骤中，所述焙烧温度为550℃。
在现有技术的基础上引入了磷酸钙纳米粒子，使得表皮生长因子的活性长期存在，可以长效的保存细胞的活性。保存液可以使细胞的活性可以长期稳定的保存，为后续检测提供了足量的可用的底物，提高了癌症早期检测的准确性。人血清白蛋白可以维持细胞的生理活性，可以作为营养物质运输的载体。对纳米粒子进行改性，可以进一步保持表皮生长因子的活性，进而更长时间的维持细胞的活性。按照一定的方式对纳米二氧化硅进行改性，可以更进一步的提高细胞的保存时间。改性纳米二氧化硅可以更进一步的提高细胞的保存效果，尤其可以提高细胞在-20~-18℃下的保存时间。通过大量的实验确定了钛、铈、锌同硅复配后同磷酸钙复合，可以充分的维持细胞在常用冷冻环境下的活性。
实施例2
一种细胞活性保存液， 每毫升保存液包括：0.04ng表皮生长因子、0.015ng的葡萄糖、0.00095μmol磷酸根、1.2×10-4μmol氯化钙、1.02×10-4μmol氯化镁，0.05ng的磷酸钙纳米粒子；占保存液总量10%的白蛋白和45%的二甲基亚飒，溶剂为双蒸水。所述白蛋白为人血清白蛋白。所述磷酸钙纳米粒子为表面复合纳米二氧化硅的磷酸钙纳米粒子。所述磷酸钙纳米粒子的制备方法为：
S11.将0.01mol的氯化钙的溶液，0.02mol的磷酸的溶液按1:1混合后，在室温下搅拌36h，在环境温度4℃，10000rpm离心20min，去除上清液，加入去离子水，超声处理60min，得到第一浆液；
S12.将0.01mol的纳米二氧化硅加入第一浆液中，在40~80℃下加搅拌5h，搅拌速度为100~120r/min，搅拌结束后过滤，干燥，粉碎、研磨得到表面复合纳米二氧化硅的磷酸钙纳米粒子。所述二氧化硅为改性纳米二氧化硅。所述改性纳米二氧化硅的制备方法为：
S21.将纳米二氧化硅浸于0.1mol/L的磷酸氢铵溶液中，在室温下搅拌12h，过滤，得到的固体干燥后焙烧2h得到第一粉末；
S22.将钛酸正丁酯溶于正辛烷中，得到0.05mol/L的钛酸正丁酯溶液；将第一粉末在搅拌条件下加入钛酸正丁酯溶液中，惰性气体保护下加热回流，加热的温度为60℃，回流时间10h，回流结束后，过滤，得到的固体用无水乙醇洗涤，再经干燥、焙烧后，得到第二粉末；
S23.将硝酸铈、硝酸锌溶液去离子水中，得到混合溶液；将第二粉末溶于混合溶液中，干燥后焙烧，得到改性纳米二氧化硅。所述二氧化硅：钛酸正丁酯：硝酸铈：硝酸锌：磷酸氢铵=80:5:1:1：15。所述S21步骤中，所述焙烧温度为300℃；所述S22步骤中，所述焙烧温度为500℃，所述S23步骤中，所述焙烧温度为500℃。
实施例3
一种细胞活性保存液， 每毫升保存液包括：0.06ng表皮生长因子、0.19ng的葡萄糖、0.0025μmol磷酸根、2.15×10-4μmol氯化钙、1.15×10-4μmol氯化镁，0.08ng的磷酸钙纳米粒子；占保存液总量15%的白蛋白和55%的二甲基亚飒，溶剂为双蒸水。所述白蛋白为人血清白蛋白。所述磷酸钙纳米粒子为表面复合纳米二氧化硅的磷酸钙纳米粒子。所述磷酸钙纳米粒子的制备方法为：
S11.将1mol的氯化钙的溶液，1mol的磷酸的溶液按1:2混合后，在室温下搅拌48h，在环境温度4℃，10000rpm离心20min，去除上清液，加入去离子水，超声处理60min，得到第一浆液；
S12.将0.1mol的纳米二氧化硅加入第一浆液中，在80℃下加搅拌8h，搅拌速度为120r/min，搅拌结束后过滤，干燥，粉碎、研磨得到表面复合纳米二氧化硅的磷酸钙纳米粒子。所述二氧化硅为改性纳米二氧化硅。所述改性纳米二氧化硅的制备方法为：
S21.将纳米二氧化硅浸于0.5mol/L的磷酸氢铵溶液中，在室温下搅拌18h，过滤，得到的固体干燥后焙烧5h得到第一粉末；
S22.将钛酸正丁酯溶于正辛烷中，得到0.1mol/L的钛酸正丁酯溶液；将第一粉末在搅拌条件下加入钛酸正丁酯溶液中，惰性气体保护下加热回流，加热的温度为70℃，回流时间15h，回流结束后，过滤，得到的固体用无水乙醇洗涤，再经干燥、焙烧后，得到第二粉末；
S23.将硝酸铈、硝酸锌溶液去离子水中，得到混合溶液；将第二粉末溶于混合溶液中，干燥后焙烧，得到改性纳米二氧化硅。所述二氧化硅：钛酸正丁酯：硝酸铈：硝酸锌：磷酸氢铵=80:5:1:1：15。所述S21步骤中，所述焙烧温度为500℃；所述S22步骤中，所述焙烧温度为700℃，所述S23步骤中，所述焙烧温度为600℃。
实施例4
一种细胞活性保存液，每毫升保存液包括：0.05ng表皮生长因子、0.018ng的葡萄糖、0.0015μmol磷酸根、1.8×10-4μmol氯化钙、1.1×10-4μmol氯化镁，0.06ng的磷酸钙纳米粒子；占保存液总量12%的白蛋白和50%的二甲基亚飒，溶剂为双蒸水。所述白蛋白为人血清白蛋白。所述磷酸钙纳米粒子的制备方法为：
S11.将0.1mol的氯化钙溶液，0.1mol的磷酸溶液按1:1混合后，在室温下搅拌36h，在环境温度4℃，10000rpm离心20min，去除上清液，加入去离子水，超声处理60min，得到第一浆液；将第一浆液干燥既得连酸钙纳米粒子。
实施例5
一种细胞活性保存液，每毫升保存液包括：0.05ng表皮生长因子、0.018ng的葡萄糖、0.0015μmol磷酸根、1.8×10-4μmol氯化钙、1.1×10-4μmol氯化镁，0.06ng的磷酸钙纳米粒子；占保存液总量12%的白蛋白和50%的二甲基亚飒，溶剂为双蒸水。所述白蛋白为人血清白蛋白。所述磷酸钙纳米粒子为表面复合纳米二氧化硅的磷酸钙纳米粒子。所述磷酸钙纳米粒子的制备方法为：
S11.将0.1mol的氯化钙溶液，0.1mol的磷酸溶液按1:1混合后，在室温下搅拌36h，在环境温度4℃，10000rpm离心20min，去除上清液，加入去离子水，超声处理60min，得到第一浆液；
S12.将0.05mol的纳米二氧化硅加入第一浆液中，在40~80℃下加搅拌5~8h，搅拌速度为100~120r/min，搅拌结束后过滤，干燥，粉碎、研磨得到表面复合纳米二氧化硅的磷酸钙纳米粒子。
实施例6
一种细胞活性保存液，每毫升保存液包括：0.05ng表皮生长因子、0.018ng的葡萄糖、0.0015μmol磷酸根、1.8×10-4μmol氯化钙、1.1×10-4μmol氯化镁，0.06ng的磷酸钙纳米粒子；占保存液总量12%的白蛋白和50%的二甲基亚飒，溶剂为双蒸水。所述白蛋白为人血清白蛋白。所述磷酸钙纳米粒子为表面复合纳米二氧化硅的磷酸钙纳米粒子。所述磷酸钙纳米粒子的制备方法为：
S11.将0.1mol的氯化钙溶液，0.1mol的磷酸溶液按1:1混合后，在室温下搅拌36h，在环境温度4℃，10000rpm离心20min，去除上清液，加入去离子水，超声处理60min，得到第一浆液；
S12.将0.05mol的纳米二氧化硅加入第一浆液中，在40~80℃下加搅拌5~8h，搅拌速度为100~120r/min，搅拌结束后过滤，干燥，粉碎、研磨得到表面复合纳米二氧化硅的磷酸钙纳米粒子。所述二氧化硅为改性纳米二氧化硅。所述改性纳米二氧化硅的制备方法为：
S21.将纳米二氧化硅浸于0.2mol/L的磷酸氢铵溶液中，在室温下搅拌15h，过滤，得到的固体干燥后焙烧4h得到第一粉末；所述第一粉末即改性纳米二氧化硅。所述S21步骤中，所述焙烧温度为400℃。
实施例7
一种疾病检测试剂盒，包括上述的保存液，引物，核苷三磷酸，Taq聚合酶，与Taq聚合酶配套使用的缓冲液，双蒸水，阳性对照标准品。
对比例1
一种细胞活性保存液，每毫升保存液包括：0.05ng表皮生长因子、0.018ng的葡萄糖、0.0015μmol磷酸根、1.8×10-4μmol氯化钙、1.1×10-4μmol氯化镁；占保存液总量12%的白蛋白和50%的二甲基亚飒，溶剂为双蒸水。
实验例
采用实施例1~6和对比例1中保存液保存尿样。比较不同保存时间的端粒酶的活性。
具体为：
试验一：征集7个膀胱癌早期患者，每个患者取晨首次尿200mL于尿杯，一周内取7次，每个患者在取样过程中病情稳定，每个患者的样品为一组，每组7个样品，分别加入用实施例1~6和对比例1的保存液5mL；每组保存到-20℃的环境中。立即检测每组样品中的一个的活性，其余的样品分别在1周、2周、3周、4周、5周、6周后用实施例7的试剂盒检测细胞活性。
具体活性数据如图1所示。
试验二：征集7个膀胱癌早期患者，每个患者取晨首次尿200mL于尿杯，一周内取7次，每个患者在取样过程中病情稳定，每个患者的样品为一组，每组7个样品，分别加入用实施例1~6和对比例1的保存液5mL；室温下2000g，离心30min 沉淀尿样细胞；弃清液，然后加入10ml保存液重悬尿样细胞，重悬液进入下一步骤的检测或者保存到-20℃的环境中。立即检测每组样品中的一个的活性，其余的样品分别在1周、2周、3周、4周、5周、6周后用实施例7的试剂盒检测细胞活性。
具体活性数据如图2所示
试验三：征集7个膀胱癌早期患者，每个患者取晨首次尿200mL于尿杯，一周内取7次，每个患者在取样过程中病情稳定，每个患者的样品为一组，分别加入用实施例1~6和对比例1的保存液5mL；室温下2000g，离心30min 沉淀尿样细胞；弃清液，然后加入10ml保存液重悬尿样细胞，重悬液进入下一步骤的检测或者保存到-75℃的环境中。立即检测每组样品中的一个的活性，其余的样品分别在1周、2周、3周、4周、5周、6周后用实施例7的试剂盒检测细胞活性。
具体活性数据如图3所示。
各实施方式的检测方法均为：样品在室温下2000g，离心30min沉淀尿样细胞；弃清液，然后加入尿液细胞活性保存液重悬尿样细胞，加入量为第一次加入量的10倍，在4℃下8000g离心5min，尽量去除上清液；在RNA酶抑制剂为100~200units/mL的常规细胞裂解液中裂解细胞；在一个PCR管中，加入细胞裂解液2μL，进行PCR扩增；PCR产物进行光度测量，荧光激发光/压制光波长设定：fluorescein ：495nm/516nm，sulforhodamine ：600nm/620nm。
从图1~图3可知，在1周内，采用实施例1~3中的保存液，可以很好的保存尿样细胞的活性，且在-20℃下保存的活性同在-75℃下保存的活性并无显著地差异。因此，用户可以在采集了尿样后，在一周内，例如周六周日送到医院进行检测，无需立即检测。同时实施例1~3中保存液保存的细胞对温度要求不高，尤其是在1周内，保存温度对细胞活性的影响很小，-20℃时家庭冰箱冷冻室的预设温度，因此，实施例1~3中的保存液可以尽可能的降低用户保存尿样的成本，提高用户采集尿样提早检测癌症的积极性。
同时，在一周内，实施例1~3中的保存液对是否对尿样进行预处理并无要求，是否离心处理对细胞的活性影响不大。而对比例中，未对细胞进行离心处理，1周后（见图1），细胞的活性显著下降。因此，采用实施例1~3中的保存液，可以在家用的冰箱中保存样品，同时也无需对样品进行处理，即可有效的保存样品。
从图1可知，采用实施例1~3中保存液，在6周内，细胞的活性下降并不明显，实施例1的活性下降最低，表明加入改性的磷酸钙纳米粒子可以有效的保持细胞的活性。实施例2和3的保存液的效果略差于实施例1，但并无显著的区别。实施例4中的磷酸钙纳米粒子未改性，在2周后，由其保存的细胞的活性明显的低于实施例1~3，表明改性的磷酸钙纳米粒子对提高细胞的活性有较为重要的意义。实施例5中的二氧化硅未改性，其保存效果在3周后明显下降，因此，可以看出，对二氧化硅进行改性可以提高保存效果。实施例6中的噶性方式同实施例1~3不同，6周后，其保存效果甚至低于未改性二氧化硅的实施例5，表明只有采用实施例1~3中的改性方法改性二氧化硅才有可能将细胞在-20℃下长期的保存。
从图1和图3可知，实施例1的保存液在-20℃和-75℃下保存细胞的效果实际上有较为明显的差异。但是，本申请解决的问题是给用户提供较为宽松的时间将样品送到医院，因此-20℃且未离心的情况下保存一周是必须具备的保存方式。
上列详细说明是针对本发明可行实施例的具体说明，以上实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本案的专利范围中。

Claims (8)

1.一种细胞活性保存液，其特征在于，每毫升保存液包括：0.04~0.06ng表皮生长因子、0.015~0.19ng的葡萄糖、0.00095~0.0025μmol磷酸根、1.2×10-4~2.15×10-4μmol氯化钙、1.02×10-4~1.15×10-4μmol氯化镁，0.05~0.08ng的磷酸钙纳米粒子；占保存液总量10~15%的白蛋白和45~55%的二甲基亚飒，溶剂为双蒸水；
所述磷酸钙纳米粒子为表面复合纳米二氧化硅的磷酸钙纳米粒子；
所述磷酸钙纳米粒子的制备方法为：
S11.将0.01~1mol的氯化钙溶液，0.01~1mol的磷酸溶液按1:1~2混合后，在室温下搅拌24~48h，在环境温度4℃，10000rpm离心20min，去除上清液，加入去离子水，超声处理60min，得到第一浆液；
S12.将0.01~0.1mol的纳米二氧化硅加入第一浆液中，在40~80℃下加搅拌5~8h，搅拌速度为100~120r/min，搅拌结束后过滤，干燥，粉碎、研磨得到表面复合纳米二氧化硅的磷酸钙纳米粒子。
2.根据权利要求1所述的一种细胞活性保存液，其特征在于，每毫升保存液包括：0.05ng表皮生长因子、0.018ng的葡萄糖、0.0015μmol磷酸根、1.8×10-4μmol氯化钙、1.1×10-4μmol氯化镁，0.06ng的磷酸钙纳米粒子；占保存液总量12%的白蛋白和50%的二甲基亚飒，溶剂为双蒸水。
3.根据权利要求2所述的一种细胞活性保存液，其特征在于，所述白蛋白为人血清白蛋白。
4.根据权利要求1所述的一种细胞活性保存液，其特征在于，所述二氧化硅为改性纳米二氧化硅。
5.根据权利要求4所述的一种细胞活性保存液，其特征在于，所述改性纳米二氧化硅的制备方法为：
S21.将纳米二氧化硅浸于0.1~0.5mol/L的磷酸氢铵溶液中，在室温下搅拌12~18h，过滤，得到的固体干燥后焙烧2~5h得到第一粉末；
S22.将钛酸正丁酯溶于正辛烷中，得到0.05~0.1mol/L的钛酸正丁酯溶液；将第一粉末在搅拌条件下加入钛酸正丁酯溶液中，惰性气体保护下加热回流，加热的温度为60~70℃，回流时间10~15h，回流结束后，过滤，得到的固体用无水乙醇洗涤，再经干燥、焙烧后，得到第二粉末；
S23.将硝酸铈、硝酸锌溶液去离子水中，得到混合溶液；将第二粉末溶于混合溶液中，干燥后焙烧，得到改性纳米二氧化硅。
6.根据权利要求5所述的一种细胞活性保存液，其特征在于，所述二氧化硅：钛酸正丁酯：硝酸铈：硝酸锌：磷酸氢铵=80:5:1:1：15。
7.根据权利要求5所述的一种细胞活性保存液，其特征在于，所述S21步骤中，所述焙烧温度为300~500℃；所述S22步骤中，所述焙烧温度为500~700℃，所述S23步骤中，所述焙烧温度为500~600℃。
8.一种疾病检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1~7任一项所述的保存液。
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