CN113016782B - 一种细胞保存液及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种细胞保存液及其制备方法和应用，具体涉及一种间充质干细胞、NK细胞、CART细胞保存液及其制备方法和应用。一种细胞保存液，各组分含量如下：每100ml细胞保存液中，含有人血清白蛋白5‑15ml、复方电解质注射液80‑90ml、不含亚硫酸盐类抗氧化剂的复方氨基酸注射液1‑5ml、L‑谷氨酰胺0.01‑1g、无水葡萄糖0.1‑1g。本发明保存液维持细胞活率不低于80％长达144h及以上，结团率低于12％，极大的延长了细胞制剂的保存时间，可实现全国乃至全球范围内应用的可能性。本发明中应用的所有组分都为临床级药品，临床应用安全可靠。

Description

一种细胞保存液及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于细胞保存技术领域，涉及一种细胞保存液及其制备方法和应用，具体涉及一种间充质干细胞、NK细胞、CART细胞、DC细胞、CIK细胞、PBMC、造血干细胞保存液及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，随着干细胞治疗、免疫细胞治疗和基因编辑等基础理论、技术手段和临床医疗探索研究的不断发展，细胞疗法为一些严重及难治性疾病提供了新的治疗思路与方法。细胞疗法是一种将活细胞注射到患者体内以治疗某些疾病的方法。近些年，细胞库的建设和发展，以及由此带来的细胞生产、存储等能力的扩展，增强了全球细胞疗法市场的容量，细胞治疗产品由此受到广泛关注。
活细胞作为细胞治疗产品的主要有效成分，就如何维持细胞的高活率、总细胞浓度、活细胞浓度、低结团率以及如何保证产品的临床安全性是目前细胞临床转化的主要难点。因此，急需研究一种细胞保存液以解决上述问题。
活率、总细胞浓度、活细胞浓度是评价细胞治疗产品有效剂量的三个金标准。这三者的关系可表述为活率＝活细胞浓度/总细胞浓度×100％，当活细胞浓度和总细胞浓度低于质控标准时，活率数据可能依然达标，因此仅活率高这一个指标不足以说明细胞治疗产品剂量有效。而现有细胞治疗产品相关专利皆只展示活率数据，总细胞浓度和活细胞浓度数据未曾体现，因此无法有力说明产品剂量有效。
细胞结团率表示的是细胞的凝集程度，是评价细胞治疗产品安全性的一个重要指标。现有技术常通过加入人血白蛋白的生理盐水作为细胞保存液，在运输过程中，细胞极易结团，静脉输注存在极大的安全隐患。当细胞结团率高时，注入动物体内，常引起肺栓塞、血管栓塞等致命性反应，因此需要对结团率进行严格把控。现有技术常添加肝素以抗团聚，但该类产品不适用于凝血不全患者。
亚硫酸盐作为抗氧化剂常添加到易氧化的成分中，但该类抗氧化剂可引起敏感体质患者发生不良反应,可表现为皮炎、荨麻疹、潮红、低血压、腹痛、腹泻等,严重的可发生危及生命的过敏性休克和哮喘。现有技术相关专利中常添加含该类氧化剂的成分，存在临床应用安全风险。
低温运输既可减缓细胞的代谢速率，又可避免复苏再操作的安全风险，较常温运输和冷冻运输是更为理想的运输方式。但目前尚未见能长时间维持细胞活性的低温保存方法及其相关试剂，能够既无安全隐患又能长时间的维持较高的细胞活率和活细胞浓度，以满足细胞全国甚至全球运输的需要。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的主要目的在于提供一种在低温条件下维持间充质干细胞、NK细胞、CART细胞等细胞在长达5天及以上具有更高细胞活率和活细胞浓度且具备低结团率的在临床上安全可靠的细胞保存液。
本发明的另一目的在于提供上述细胞保存液的制备方法。
本发明的又一目的是提供该细胞保存液的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于制备细胞保存液的组合物,所述的组合物由复方氨基酸注射液、L-谷氨酰胺0.01-1g和无水葡萄糖按照(0.1-5)ml：(0.01-1)g：(0.1-1)g组成。
作为本发明的一种优选，所述的复方氨基酸注射液为不含亚硫酸盐类抗氧化剂的十四复方氨基酸注射液14AA-SF。
本发明所述的组合物在制备细胞保存液中的应用。
一种细胞保存液，包含本发明所述的组合物。
作为本发明的一种优选，所述的细胞保存液各组分含量如下：每100ml细胞保存液中，含有人血白蛋白5-15ml、复方电解质注射液80-90ml、不含亚硫酸盐类抗氧化剂的复方氨基酸注射液0.1-5ml、L-谷氨酰胺0.01-1g、无水葡萄糖0.1-1g。
作为本发明的进一步优选，所述不含亚硫酸盐类抗氧化剂的复方氨基酸注射液为不含亚硫酸盐类抗氧化剂的十四复方氨基酸注射液14AA-SF。
作为本发明的进一步优选，所述的保存液渗透压为275-345mOsmol/kg。
作为本发明的进一步优选，所述的保存液pH为6.0-8.0。
作为本发明的进一步优选，所述的人血白蛋白制剂的原始浓度为10g/50ml，是维持渗透压的重要物质。
作为本发明的一种优选，所述的复方电解质注射液规格为500ml/袋，是维持渗透压和各项生物学功能的重要辅料成分。
作为本发明的一种优选，所述的不含亚硫酸盐类抗氧化剂的复方氨基酸注射液为十四复方氨基酸注射液(14AA-SF)，复方氨基酸可为细胞提供必需氨基酸，参与各类物质合成和代谢。
所述的L-谷氨酰胺是细胞合成核酸和蛋白质的重要原料。
所述的无水葡萄糖可为细胞提供能量，减少生糖氨基酸的消耗。
本发明细胞保存液中,复方氨基酸注射液、L-谷氨酰胺和无水葡萄糖的组合对细胞保存效果具有重要影响。
本发明所述的细胞保存液的制备方法，是按配方将无水葡萄糖、L-谷氨酰胺于复方电解质注射液中溶解，加入复方氨基酸注射液充分混合，再加入人血白蛋白混合均匀，加入复方电解质注射液定容至100ml，调整pH值为6.0-8.0，渗透压为275-345mOsmol/kg。
本发明所述的细胞保存液在制备间充质干细胞制剂、NK细胞制剂、CART细胞制剂中的应用；优选在制备低温保存的间充质干细胞制剂、NK细胞制剂、CART细胞制剂中的应用；所述的低温为2-8℃。
本发明所述的细胞保存液在保存间充质干细胞、NK细胞、CART细胞中的应用；优选在低温条件下保存间充质干细胞、NK细胞、CART细胞中的应用，所述的低温为2-8℃。
一种低温保存的间充质干细胞制剂,由间充质干细胞和所述的间充质干细胞保存液组成；所述的低温为2-8℃。
作为本发明的一种优选，所述的间充质干细胞通过以下方法制备得到：
选择生长状态良好的P4代的间充质干细胞，待细胞融合度到80％以上时，用胰蛋白酶消化制备成单细胞悬液，离心，用3％HPL完全培养基换液培养；12h后，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞沉淀2-3次，用本发明所述的间充质干细胞保存液调整细胞浓度为所需浓度即得所述的间充质干细胞制剂；所述的3％HPL完全培养基为含3％HPL的DMEM/F12培养基。
一种低温保存的NK细胞制剂，由NK细胞和所述的细胞保存液组成；所述的低温为2-8℃。
作为本发明的一种优选，所述的NK细胞通过以下方法制备得到：
选择生长状态良好的NK细胞，轻轻反复吹打，制备成单细胞悬液，吸取培养基中NK细胞至离心管中，离心。用生理盐水洗涤细胞沉淀2-3次，用本发明所述的细胞保存液调整细胞浓度为所需浓度即得所述的NK细胞制剂。
一种低温保存的CART细胞制剂,由CART细胞和所述的细胞保存液组成；所述的低温为2-8℃。
作为本发明的一种优选，所述的CART细胞通过以下方法制备得到：
选择生长状态良好的CART细胞，轻轻反复吹打，制备成单细胞悬液，吸取培养基中CART细胞至离心管中，离心。用生理盐水洗涤细胞沉淀2-3次，用本发明所述的细胞保存液调整细胞浓度为所需浓度即得所述的CART细胞制剂。
本发明相较于现有技术具有以下优点及效果：
1、本发明保存液维持细胞活率不低于80％长达144h及以上，极大的延长了细胞制剂的保存时间，可实现全国乃至全球范围内应用的可能性。
2、本发明中应用的所有组分都为临床级药品，临床应用安全可靠。
3、本发明保存液中的复方氨基酸不含亚硫酸盐类抗氧化剂，可避免亚硫酸盐引起的敏感体质患者发生不良反应。
4、本发明保存液可实现低温保存后直接静脉输注，可避免冷冻保存的细胞在复苏过程中可能出现的安全风险，可减少再处理过程中的细胞损伤，提高了生物安全及细胞利用率。
5、间充质干细胞在本发明的保存液中保存144h后，间充质干细胞表型特征正常。
6、本发明中未添加肝素，抗团聚效果显著，细胞结团率288h内皆低于12％。
7、本发明中的细胞保存液稳定性长达180天，可制备成货架产品，极具商品化前景。
本发明细胞保存液作为一个有机整体，通过各成分的特定配比及细胞在保存液中的特定浓度，为细胞提供了适宜的保存环境，实现了既能在低温条件下长时间维持相应细胞活率，又能在不添加肝素的情况下保持较低的结团率。且本发明细胞保存液稳定而安全，具有非常喜人的商品化前景。
附图说明
图1间充质干细胞流式细胞术细胞阳性表型检测结果
图2间充质干细胞流式细胞术细胞阴性表型检测结果
图3间充质干细胞在本发明保存液中保存72h的阳性表型检测结果
图4间充质干细胞在本发明保存液中保存72h的阴性表型检测结果
图5间充质干细胞在本发明保存液中保存144h的阳性表型检测结果
图6间充质干细胞在本发明保存液中保存144h的阴性表型检测结果
图7细胞制剂放置2d上清的氨基酸稳定性结果
图8细胞制剂放置3d上清的氨基酸稳定性结果
图9细胞制剂放置7d上清的氨基酸稳定性结果
图10细胞制剂放置2、7d上清的人血白蛋白稳定性结果
图11细胞制剂放置2d裂解物的氨基酸稳定性结果
图12细胞制剂放置3d裂解物的氨基酸稳定性结果
图13细胞制剂放置7d裂解物的氨基酸稳定性结果
图14细胞制剂放置2、7d裂解物的人血白蛋白稳定性结果
图15交互作用2d氨基酸稳定性结果
图16交互作用3d氨基酸稳定性结果
图17交互作用7d氨基酸稳定性结果
图18交互作用2、3、7d人血白蛋白稳定性结果
图19保存液(含14AA-SF)放置14d氨基酸稳定性
图20保存液(含14AA-SF)放置28d氨基酸稳定性
图21保存液(含14AA-SF)放置60d氨基酸稳定性
图22保存液(含14AA-SF)放置90d氨基酸稳定性
图23保存液(含14AA-SF)放置180d氨基酸稳定性
图24保存液(含14AA-SF)放置14、28、60、90、180d人血白蛋白稳定性
具体实施方式
为便于本技术领域的技术人员更好的理解本发明，下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但必须表明的是，本发明的实施方式不限于此。
以下实施例中各试剂来源如下：
人血白蛋白规格为10g/50ml，购自瑞士杰特贝林生物制品有限公司；
复方电解质注射液规格为500ml/袋，购自上海百特医疗用品有限公司；
复方氨基酸注射液产品名称为复方氨基酸注射液(14AA-SF)，购自湖北一半天制药有限公司；
L-谷氨酰胺规格为25kg/桶，购自江苏神华药业有限公司；
无水葡萄糖购自盛泰药业。
实施例1
每100ml细胞保存液中，含有人血白蛋白5ml、复方电解质注射液90ml、复方氨基酸注射液(14AA-SF)5ml、L-谷氨酰胺0.01g、无水葡萄糖0.1g。
按配方将无水葡萄糖、L-谷氨酰胺于复方电解质注射液中溶解，加入复方氨基酸注射液充分混合，再加入人血白蛋白混合均匀，加入复方电解质注射液定容至100ml，调整pH值为6.97，渗透压检测为341mOsmol/kg。
实施例2
每100ml细胞保存液中，含有人血白蛋白15ml、复方电解质注射液84ml、复方氨基酸注射液(14AA-SF)1ml、L-谷氨酰胺1g、无水葡萄糖1g。
按配方将无水葡萄糖、L-谷氨酰胺于复方电解质注射液中溶解，加入复方氨基酸注射液充分混合，再加入人血白蛋白混合均匀，加入复方电解质注射液定容至100ml，调整pH值为7.00，渗透压检测为343mOsmol/kg。
实施例3
每100ml细胞保存液中，含有人血白蛋白10ml、复方电解质注射液88ml、复方氨基酸注射液(14AA-SF)2ml、L-谷氨酰胺0.05g、无水葡萄糖0.5g。
按配方将无水葡萄糖、L-谷氨酰胺于复方电解质注射液中溶解，加入复方氨基酸注射液充分混合，再加入人血白蛋白混合均匀，加入复方电解质注射液定容至100ml，调整pH值为6.97，渗透压检测为318mOsmol/kg。
对比例1
以人血白蛋白和复方电解质注射液作为对比例1，配制方法如下：每100ml细胞保存液中，含有10ml人血白蛋白和90ml复方电解质注射液，调整pH为7.04，渗透压检测为275mOsmol/kg。
实施例4
临床用间充质干细胞制剂的制备。
1.选择生长状态良好的P4代的间充质干细胞，待细胞融合度到80％以上时，用胰蛋白酶消化制备成单细胞悬液，离心，用3％HPL完全培养基换液培养。
2.12h后，用PBS洗涤细胞沉淀3次，分别用对比例1、实施例1-3制备得到的保存液调整细胞浓度为5.0×105个/ml，分装密封，20ml/袋，保存于2-8℃条件下，每隔24h用AO/PI染料染色及计数仪(上海睿钰生物科技有限公司，Count Star)计数，检测细胞活率，结果见表1。3.表1：间充质干细胞制剂的细胞活率
Figure BDA0002985312180000071
注：表格中的“/”表示活率低于80％，不再进行活率检测。
上述结果表明，在2-8℃的低温条件下，间充质干细胞保存在对比例1制备所得的保存液中48h后，细胞活率维持80％以上，更为重要的是，间充质干细胞保存在实施例1-3制备所得的保存液中144h后，仍可维持活率不低于80％，这说明本发明方法制备的保存液可以有效延长细胞的保存时间，保证高活率。可见，本发明所述的组合物在保证间充质干细胞长时间维持高活率中发挥着重要的作用。
实施例5
临床用间充质干细胞制剂的制备。
1.选择供者来源优异的生长状态良好的P4代间充质干细胞，待细胞融合度到80％以上时，用胰蛋白酶消化制备成单细胞悬液，离心，用3％HPL完全培养基换液培养。
2.12h后，用PBS洗涤细胞沉淀3次，分别用对比例1、实施例1制备得到的保存液调整细胞浓度为5.0×105个/ml，分装密封，20ml/袋，保存于2-8℃条件下，每隔24h用AO/PI染料染色及计数仪(上海睿钰生物科技有限公司，Count Star)计数，检测细胞活率，结果见表2。
3.表2：间充质干细胞制剂的细胞活率
Figure BDA0002985312180000081
注：表格中的“/”表示活率低于80％，不再进行活率检测。
上述结果表明，在2-8℃的低温条件下，间充质干细胞保存在对比例1制备所得的保存液中96h后，细胞活率降至80％以下，更为重要的是，间充质干细胞保存在实施例1制备所得的保存液中288h后，仍可维持活率不低于80％，这说明本发明方法制备的保存液可以有效延长细胞的保存时间，保证高活率，且维持时间与供者来源存在一定联系，供者来源优异可一定程度上延长细胞活率维持时间。
对比例2
以人血白蛋白和生理盐水作为对比例2，配制方法如下：每100ml细胞保存液中，含有25ml人血白蛋白和75ml生理盐水，调整pH为7.2，渗透压检测为292mOsmol/kg。
实施例6
临床用NK细胞制剂的制备。
1.选择生长状态良好的NK细胞，轻轻反复吹打，制备成单细胞悬液，吸取培养基中NK细胞至离心管中，离心。
2.生理盐水洗涤细胞沉淀3次后，用对比例2、实施例1制备得到的保存液调整细胞浓度为1.0×107个/ml，分装密封，100ml/袋，保存于2-8℃条件下，每隔24h用AO/PI染料染色及计数仪(上海睿钰生物科技有限公司，Count Star)计数，检测细胞活率，结果见表3。
3.表3：NK细胞制剂的细胞活率
Figure BDA0002985312180000091
注：表格中的“/”表示活率低于80％，不再进行活率检测。
上述结果表明，在2-8℃的低温条件下，NK细胞保存在对比例2制备所得的保存液中72h后，细胞活率降至80％以下，96h时已降至60％左右，说明生理盐水和人血白蛋白虽可以维持一定时间的高活率，但更为重要的是，NK细胞保存在实施例1制备所得的保存液中168h后，仍可维持活率不低于80％，这说明本发明组合物和本发明方法制备的保存液可以有效延长NK细胞的保存时间，保证高活率。
实施例7
临床用CART细胞制剂的制备。
1.选择生长状态良好的CART细胞，轻轻反复吹打，制备成单细胞悬液，吸取培养基中CART细胞至离心管中，离心。
2.生理盐水洗涤细胞沉淀3次后，用对比例2、实施例1制备得到的保存液调整细胞浓度为2.5×106个/ml，分装密封，100ml/袋，保存于2-8℃条件下，每隔24h用AO/PI染料染色及计数仪(上海睿钰生物科技有限公司，Count Star)计数，检测细胞活率，结果见表4。
3.表4：CART细胞制剂的细胞活率
Figure BDA0002985312180000101
注：表格中的“/”表示活率低于80％，不再进行活率检测。
上述结果表明，在2-8℃的低温条件下，CART细胞保存在对比例2制备所得的保存液中48h后，细胞活率降至80％左右，更为重要的是，CART细胞保存在实施例1制备所得的保存液中144h后，仍可维持活率不低于80％，这说明本发明组合物以及本发明方法制备的保存液可以有效延长CART细胞的保存时间，保证高活率。
实施例8
对未经过细胞保存液保存的间充质干细胞和在实施例1制备所得的保存液中保存72、144h后的间充质干细胞进行表型检测，结果见图1-图6.
图1、2表示未经过细胞保存液保存的间充质干细胞表型检测结果，阳性表型及其表达率分别为CD105-99.53％、CD73-99.77％、CD90-99.84％，阴性表型及其表达率分别为HLA-DR-0.26％、CD19-0.29％、CD11b-0.37％、CD34-0.02％、CD45-0.02％。
图3、4表示经过细胞保存液保存72h的间充质干细胞表型检测结果，阳性表型及其表达率分别为CD105-96.35％、CD73-96.49％、CD90-99.71％，阴性表型及其表达率分别为HLA-DR-1.43％、CD19-0.19％、CD11b-0.03％、CD34-0.33％、CD45-0.22％。
图5、6表示经过细胞保存液保存144h的间充质干细胞表型检测结果，阳性表型及其表达率分别为CD105-96.05％、CD73-97.61％、CD90-99.68％，阴性表型及其表达率分别为HLA-DR-0.19％、CD19-0.02％、CD11b-0.01％、CD34-0.15％、CD45-0.24％。
所示时间点的CD90、CD73、CD105阳性表型表达率皆≥95％，CD19、CD34、CD45、CD11b、HLA-DR阴性表型表达率皆≤2％，符合间充质干细胞表型检测标准，说明本发明组合物以及本发明方法制备的保存液不影响间充质干细胞的表型表达。
对比例3
每100ml细胞保存液中，含有人血白蛋白10ml、复方电解质注射液89ml、复方氨基酸注射液(14AA-SF)1ml。
按配方加入复方电解质注射液、复方氨基酸注射液、人血白蛋白混合均匀，再加入复方电解质注射液定容至100ml，调整pH值为7.12，渗透压检测为278mOsmol/kg。
对比例4
每100ml细胞保存液中，含有人血白蛋白10ml、复方电解质注射液90ml、L-谷氨酰胺0.05g。
按配方将L-谷氨酰胺于复方电解质注射液中溶解，加入复方氨基酸注射液充分混合，再加入人血白蛋白混合均匀，加入复方电解质注射液定容至100ml，调整pH值为7.01，渗透压检测为276mOsmol/kg。
对比例5
每100ml细胞保存液中，含有人血白蛋白10ml、复方电解质注射液90ml、无水葡萄糖0.5g。
按配方将无水葡萄糖于复方电解质注射液中溶解，加入复方氨基酸注射液充分混合，再加入人血白蛋白混合均匀，加入复方电解质注射液定容至100ml，调整pH值为7.03，渗透压检测为299mOsmol/kg。
对比例6
每100ml细胞保存液中，含有人血白蛋白10ml、复方电解质注射液89ml、复方氨基酸注射液(14AA-SF)1ml、L-谷氨酰胺0.05g。
按配方将无水葡萄糖于复方电解质注射液中溶解，加入复方氨基酸注射液充分混合，再加入人血白蛋白混合均匀，加入复方电解质注射液定容至100ml，调整pH值为6.97，渗透压检测为286mOsmol/kg。
对比例7
每100ml细胞保存液中，含有人血白蛋白10ml、复方电解质注射液89ml、复方氨基酸注射液(14AA-SF)1ml、无水葡萄糖0.5g。
按配方将无水葡萄糖于复方电解质注射液中溶解，加入复方氨基酸注射液充分混合，再加入人血白蛋白混合均匀，加入复方电解质注射液定容至100ml，调整pH值为6.98，渗透压检测为308mOsmol/kg。
对比例8
每100ml细胞保存液中，含有人血白蛋白10ml、复方电解质注射液90ml、L-谷氨酰胺0.05g、无水葡萄糖0.5g。
按配方将无水葡萄糖于复方电解质注射液中溶解，加入复方氨基酸注射液充分混合，再加入人血白蛋白混合均匀，加入复方电解质注射液定容至100ml，调整pH值为7.03，渗透压检测为307mOsmol/kg。
实施例9
临床用间充质干细胞制剂的制备。
1.选择生长状态良好的P4代的间充质干细胞，待细胞融合度到80％以上时，用胰蛋白酶消化制备成单细胞悬液，离心，用3％HPL完全培养基换液培养。
2.12h后，用PBS洗涤细胞沉淀3次，分别用对比例1、对比例3-8、实施例1制备得到的保存液调整细胞浓度为5.0×105个/ml，分装密封，20ml/袋，保存于2-8℃条件下，每隔24h用AO/PI染料染色及计数仪(上海睿钰生物科技有限公司，Count Star)计数，检测细胞活率、结团率、总细胞浓度、活细胞浓度，结果见表5-8。
3.表5：间充质干细胞制剂的细胞活率
Figure BDA0002985312180000131
注：表格中的“/”表示活率低于80％，不再进行活率检测。
4.表6：间充质干细胞制剂的细胞结团率
Figure BDA0002985312180000132
Figure BDA0002985312180000141
注：表格中的“/”表示活率低于80％，不再进行结团率检测。
5.表7:间充质干细胞制剂的总细胞浓度
Figure BDA0002985312180000142
注：表格中的“/”表示活率低于80％，不再进行总细胞浓度检测。
6.表8:间充质干细胞制剂的活细胞浓度
Figure BDA0002985312180000143
注：表格中的“/”表示活率低于80％，不再进行活细胞浓度检测。
上述结果表明，在2-8℃的低温条件下，间充质干细胞在对比例1制备的细胞保存液可维持细胞活率80％达48h，对比例4、对比例5、对比例8制备的细胞保存液可维持细胞活率80％达72h，对比例3、对比例6、对比例7制备的细胞保存液可维持细胞活率80％达96h，说明随着组合物中成分的添加，活率随之提高，且复方氨基酸的加入对于活率维持至关重要。其次，对比例1和对比例3的结团率较其它组高，说明无水葡萄糖、L-谷氨酰胺对结团率有一定改善作用。更为重要的是，在实施例1制备的细胞保存液中保存288h后，活率仍可维持80％，结团率可达12％以下，说明本发明组合物以及本发明方法制备的保存液维持细胞高活率、低结团率效果最显著，同样的，以上各组数据说明本发明方法制备的上述保存液都可以有效维持细胞高活率和低结团率。除此之外，活率在80％以上的各组的总细胞浓度和活细胞浓度可满足质控标准(总细胞浓度的有效范围为不低于4.0E+05个/ml，活细胞浓度的有效范围为不低于3.2E+05个/ml)，说明符合要求的各组数值皆为有效剂量。
实施例10
对含有细胞的细胞保存液的稳定性进行考证，应用LC-MS考证细胞上清中人血白蛋白和氨基酸含量变化情况，及细胞破碎是否对细胞保存液稳定性产生影响。
1.细胞上清样品处理：
按照实施例1配方制备细胞制剂，放置2天(2d)，另配制新鲜细胞制剂(0d)作为对照，分别取700ul细胞制剂悬液，于1800rpm离心10min，取600ul上清，再各取100ul分装于6个1.5ml EP管中。3d、7d的样品是同样的处理过程。
氨基酸前处理：100ul样品加入500ul乙腈和10ul内标，涡旋5min，于1800rpm离心10min，取450ul上清，挥干、复溶、进样；
人血白蛋白前处理：采用BCA法对白蛋白进行定量，取100ug蛋白先后进行酶切和固相萃取，挥干、复溶、进样。
结果如图7-10所示，上述结果表明，含有细胞的保存液在2-8℃的低温条件下放置2、3、7d，氨基酸和人血白蛋白稳定无降解。
2.细胞裂解样品处理：
按照实施例1配方制备细胞制剂，放置2d，另配制新鲜细胞制剂(0d)作为对照，分别取700ul细胞制剂悬液，于冰上超声破碎，于1800rpm离心10min，取600ul上清，再各取100ul分装于6个1.5ml EP管中。3d、7d的样品是同样的处理过程。
氨基酸前处理：100ul样品加入500ul乙腈和10ul内标，涡旋5min，于1800rpm离心10min，取450ul上清，挥干，复溶，进样；
人血白蛋白前处理：采用BCA法对白蛋白进行定量，取100ug白蛋白先后进行酶切和固相萃取，挥干，复溶，进样。
结果如图11-14所示，含有细胞的保存液在2-8℃的低温条件下放置2、3、7d，而后对细胞进行裂解处理，以上结果表明即使细胞破碎，仍对氨基酸和白蛋白稳定性无影响。
综上所述，充分说明间充质干细胞在细胞保存液中的存放环境极为稳定，氨基酸和人血白蛋白可长达7天稳定无降解。
实施例11
为考察细胞培养残留物对细胞保存液的影响，对不含细胞的实施例1细胞保存液与PBS、HPL、DMEM/F12的交互作用进行考证，主要检测人血白蛋白和氨基酸含量变化情况。
试剂处理：
将PBS、HPL、DMEM/F12按体积比1:10与细胞保存液混合，并于0、2、3、7d取样检测氨基酸和白蛋白。
结果如图15-18所示，以上结果显示，在2、3、7d的交互作用考察中，人血白蛋白和氨基酸具有良好的稳定性，说明PBS、HPL、DMEM/F12对细胞保存液无影响。
实施例12
对不含细胞的细胞保存液的长期稳定性进行考证，主要检测保存液中的人血白蛋白和氨基酸含量变化情况。
按照实施例1先后配制放置180、90、60、28、14d的四种细胞保存液，分别取100ul分装于5个1.5ml EP管中。
氨基酸前处理：100ul样品加入500ul乙腈和10ul内标，涡旋5min，于1800rpm离心10min，取450ul上清，挥干，复溶，进样；
人血白蛋白：采用BCA法对白蛋白进行定量，取100ug蛋白先后进行酶切和固相萃取，挥干，复溶，进样。
结果如图19-24所示，含14AA-SF的细胞保存液在2-8℃的低温条件下放置14、28、60、90、180d后，人血白蛋白和氨基酸稳定无降解，说明本发明中的细胞保存液有效期可长达180d。
实施例13
对不含细胞的实施例1细胞保存液的稳定性试验进一步考察，分别进行稳定性影响因素试验、加速试验。
稳定性影响因素试验包括高温、高湿、强光照射试验，因本发明的细胞保存液为液体制剂，无需考察高湿试验。
强光照射试验和高温试验结果如下：
表9:影响因素试验数据(50mL)
Figure BDA0002985312180000171
Figure BDA0002985312180000181
《中国药典》中指出进行加速试验的供试品应在温度40℃±2℃、相对湿度7 5％±5％的条件下放置6个月。本发明制备的细胞保存液分别于该条件下的0天、1个月、2个月、3个月、6个月取样检测。
加速试验结果如下：
表10:加速试验数据
Figure BDA0002985312180000182
Figure BDA0002985312180000191
Figure BDA0002985312180000201
以上结果显示，细胞保存液在强光照射及高温条件下放置30天后各成分稳定，加速试验进行6个月后各成分仍然稳定无降解，说明本发明的细胞保存液稳定性较好。

Claims (14)

1.一种细胞保存液，其特征在于，每100ml所述的细胞保存液由人血清白蛋白制剂5-15ml、复方电解质注射液80-90ml、复方氨基酸注射液1-5ml、L-谷氨酰胺0.01-1g、无水葡萄糖0.1-1g组成；所述的复方氨基酸注射液为不含亚硫酸盐类抗氧化剂的十四复方氨基酸注射液14AA-SF。
2.权利要求1所述的细胞保存液的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：按配方将无水葡萄糖、L-谷氨酰胺于复方电解质注射液中溶解，加入复方氨基酸注射液充分混合，再加入人血清白蛋白混合均匀，加入复方电解质注射液定容至100ml，调整pH值为6.0-8.0，渗透压为275-345mOsmol/kg。
3.权利要求1所述的细胞保存液的制剂,其特征在于所述的制剂为权利要求1所述的细胞保存液的冻干粉或浓缩液。
4.权利要求1所述的细胞保存液在制备间充质干细胞制剂、NK细胞制剂、CART细胞制剂中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于权利要求1所述的细胞保存液在制备低温保存的间充质干细胞制剂、NK细胞制剂、CART细胞制剂中的应用；所述的低温为2-8℃。
6.权利要求3所述的制剂在制备间充质干细胞制剂、NK细胞制剂、CART细胞制剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于权利要求3所述的制剂在制备低温保存的间充质干细胞制剂、NK细胞制剂、CART细胞制剂中的应用；所述的低温为2-8℃。
8.权利要求1所述的细胞保存液在保存间充质干细胞、NK细胞、CART细胞中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于权利要求1所述的细胞保存液在低温条件下保存间充质干细胞、NK细胞、CART细胞中的应用，所述的低温为2-8℃。
10.权利要求3所述的制剂在保存间充质干细胞、NK细胞、CART细胞中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于权利要求3所述的制剂在低温条件下保存间充质干细胞、NK细胞、CART细胞中的应用，所述的低温为2-8℃。
12.一种低温保存的间充质干细胞制剂,其特征在于,由间充质干细胞和权利要求1所述的间充质干细胞保存液组成；所述的低温为2-8℃。
13.一种低温保藏的NK细胞制剂,其特征在于,由NK细胞和权利要求1所述的细胞保存液组成；所述的低温为2-8℃。
14.一种低温保藏的CART细胞制剂,其特征在于,由CART细胞和权利要求1所述的细胞保存液组成；所述的低温为2-8℃。
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