CN106538513B - 一种人间充质干细胞保存运输液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人间充质干细胞保存运输液，包含1‑15mg/ml氯化钠、1‑15mg/ml葡萄糖酸钠、1‑10mg/ml醋酸钠、0.1‑9.9v/v％人AB血清、0.1‑25mg/ml人参皂苷Rb1、1‑100ng/ml转铁蛋白、1‑100ng/ml还原型谷胱苷肽、0.01‑1mmol/l谷氨酰胺。本发明还公开了其在保存运输人间充质干细胞中的应用。本发明人间充质干细胞保存运输液可减少人间充质干细胞在运输过程中的成团现象，保持高的贴壁率和活力，从而可以通过飞机等现代化交通工具送达全国各地以及周边国家，大大增加了临床使用人间充质干细胞的范围。

Description

一种人间充质干细胞保存运输液及其应用

技术领域

本发明涉及组织保存技术领域，具体涉及一种人间充质干细胞保存运输液及其应用。

背景技术

人间充质干细胞(MSCs)是当我们身体的某个器官组织受损之后能使其自我再生的细胞，利用干细胞技术能再造一种全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官。由此人们可以用自身或他人的干细胞和干细胞衍生组织、器官替代病变或衰老的组织、器官，并可以广泛用于治疗传统医学方法难以医治的多种顽症，诸如白血病、早老性痴呆、帕金森氏病、糖尿病、中风、原因未明的慢性病如炎咽等一系列目前尚不能治愈的疾病。从理论上说，应用干细胞技术能治疗各种疾病，且其较很多传统治疗方法具有无可比拟的优点。

干细胞治疗中一个重要问题是如何解决干细胞的运输问题，因为干细胞从制备到使用中间有一个过程，而这一问题又演生三个关键技术问题：一是如何在运输过程中保证细胞活力，能使目前人间充质干细胞只能在市内小范围应用扩展到全国，乃至周边国家；二是运输工具与材质，要求安全与稳定；三是间充质干细胞是贴壁细胞，制备成悬液以后很容易聚集成团，通过血液输注间充质干细胞很容易发生细胞团栓塞血管，造成胸闷、头昏，严重导致死亡。目前需要把细胞处理完成以后马上输注(6小时)，在目前的输液方法中，新鲜制备的间充质干细胞在生理盐水中3小时后再培养贴壁能力下降40％以上，即有40％的细胞不能再培养，尽管活力检测数据变化不大。6小时后贴壁能力下降60－70％。而且放置几个小时之后，会出现间充质干细胞大量聚集成团，给病人输注带来危险。今后间充质干细胞加速在临床应用是大势所趋，所以研究一种有效的间充质干细胞保存运输液是非常重要的。

发明内容

本发明目的是提供一种人间充质干细胞保存运输液及其应用，以解决现有技术的不足。

本发明采用以下技术方案：

一种人间充质干细胞保存运输液，包含1-15mg/ml氯化钠、1-15mg/ml葡萄糖酸钠、1-10mg/ml醋酸钠、0.1-9.9v/v％人AB血清、0.1-25mg/ml人参皂苷Rb1、1-100ng/ml转铁蛋白、1-100ng/ml还原型谷胱苷肽、0.01-1mmol/l谷氨酰胺。

进一步地，所述人AB血清为2-5v/v％。

进一步地，所述保存运输液无细菌、病毒、支原体污染，内毒素含量＜5EU/ml。

进一步地，所述保存运输液pH值为7.1-7.6。

上述人间充质干细胞保存运输液在保存运输人间充质干细胞中的应用。

进一步地，用于保存来源包括骨髓、血液、脂肪、脐带、胎盘、羊水、皮肤、肝、肌肉、血管、神经、肺、肾、脑、流产胚胎/胎儿的全部或部分组织器官的间充质干细胞。

进一步地，所述保存运输液放于运输箱中保存运输人间充质干细胞，运输箱的冷冻芯控温温度0-4℃，保持时间大于24h。

本发明的有益效果：

本发明人间充质干细胞保存运输液包含氯化钠、葡萄糖酸钠、醋酸钠、人AB血清、人参皂苷Rb1、转铁蛋白、还原型谷胱苷肽、谷氨酰胺，适宜浓度的人AB血清中的蛋白与因子维持一个非常适合细胞活性的外在环境；葡萄糖酸钠与醋酸钠构成一个缓冲体系，维持PH在7.1-7.6；转铁蛋白与还原型谷胱苷肽用于维持细胞的氧化还原环境，降低ROS对细胞的伤害；谷氨酰胺用于维持细胞一定的营养；氯化钠溶液用于维持一定的渗透压；人参皂苷Rb1是从人参中提取的生物活性成分，有抑制细胞凋亡，提高生物活性的功能。这些成份都是临床充许使用的成份，共同构成了本发明的人间充质干细胞保存运输液，用于保存运输人间充质干细胞，可减少人间充质干细胞在运输过程中的成团现象，保持高的贴壁率和活力，从而可以通过飞机等现代化交通工具送达全国各地以及周边国家，大大增加了临床使用人间充质干细胞的范围。

附图说明

图1为实施例1各组保存运输液中贴壁的细胞数。

图2为实施例2各组保存运输液中细胞荧光染色图。

图3为实施例3各组保存运输液中细胞ATP含量。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做更进一步地解释。下列实施例仅用于说明本发明，但并不用来限定本发明的实施范围。

一种人间充质干细胞保存运输液，包含1-15mg/ml氯化钠、1-15mg/ml葡萄糖酸钠、1-10mg/ml醋酸钠、0.1-9.9v/v％人AB血清、0.1-25mg/ml人参皂苷Rb1、1-100ng/ml转铁蛋白、1-100ng/ml还原型谷胱苷肽、0.01-1mmol/l谷氨酰胺，其中，人AB血清优选为2-5v/v％；人参皂苷Rb1纯度不低于98％。所述保存运输液无细菌、病毒、支原体污染，内毒素含量＜5EU/ml，pH值为7.1-7.6。

细胞在培养环境后面临几个主要问题：一是膜稳定性，二是溶液PH的改变，三是溶液氧化还原环境，特别是细胞在缺少营养物质供应与胞外刺激信号的刺激下，胞内会发生一系列的应激反应，特别是氧化应激产生高浓度的ROS，诱导细胞凋亡失活。AB血清中富含血清白蛋白、免疫球蛋白、胶原蛋白原、生长因子与无机盐等，这些蛋白与因子维持一个非常适合细胞活性的外在环境，高浓度的血清适合细胞在低温(－80度以上)长期保存，复性时稀释到10％以下培养。高浓度的血清不适合常温保存，会使细胞互相粘连成团，细胞因子局部浓度过高，对细胞造成过度刺激，常温保存最合适的血清浓度在2-5v/v％之间。AB血清相较于纯人血清白蛋白又有更明显的优点，纯的人血清白蛋白更容易使细胞成团，阻止细胞粘壁。葡萄糖酸钠与醋酸钠构成一个缓冲体系，维持pH在7.1-7.6，pH值的微小改变都对细胞活性构成较大影响，肿瘤细胞适合物偏酸性pH环境下生长，而干细胞等正常细胞系必需维持7.1-7.6之间的pH，过高与过低都抑制生长，降低活性。转铁蛋白与还原型谷胱苷肽用于维持细胞的氧化还原环境，降低ROS对细胞的伤害。谷氨酰胺用于维持细胞一定的营养。氯化钠溶液用于维持一定的渗透压。人参皂苷Rb1是从人参中提取的生物活性成分，有抑制细胞凋亡，提高生物活性的功能。这些成份都是临床充许使用的成份。

将上述人间充质干细胞保存运输液用于保存运输人间充质干细胞，人间充质干细胞为来源包括骨髓、血液、脂肪、脐带、胎盘、羊水、皮肤、肝、肌肉、血管、神经、肺、肾、脑、流产胚胎/胎儿的全部或部分组织器官的间充质干细胞。保存运输液放于运输箱中保存运输人间充质干细胞，运输箱的冷冻芯控温温度0-4℃，保持时间大于24h。运输箱的冷冻芯及部件材料必需通过了MSDS认证及航空认证，可以上飞机过安检。将上述人间充质干细胞保存运输液用于保存运输人间充质干细胞，可减少人间充质干细胞在运输过程中的无成团现象，保持高的贴壁率和活力，从而可以通过飞机等现代化交通工具送达全国各地以及周边国家，大大增加了临床使用人间充质干细胞的范围。

若无特别指明，以下实施例涉及的实验材料、试剂和仪器均可市售获得；若无具体指明，以下实施例涉及的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1

人AB血清浓度对细胞贴壁的影响

用组织块贴壁法制备脐带间充质干细胞，传三代后，离心收集细胞，去上清。配制5组干细胞保存运输液，5组中均含5.26mg/ml氯化钠、5.02mg/ml葡萄糖酸钠、3.68mg/ml醋酸钠、2.5mg/ml人参皂苷Rb1、10ng/ml转铁蛋白、10ng/ml还原型谷胱苷肽、0.1mmol/l谷氨酰胺，其中A组中2v/v％人AB血清；B组：5v/v％人AB血清；C组：20v/v％人AB血清；D组：50v/v％人AB血清；E组：20v/v％人血清白蛋白。除血清浓度不同外，各组其它成分相同。用这些不同组合的保存运输液稀释上述制备的脐带间充质干细胞成5х10⁷/ml。每组1ml在4℃保温箱中静态保存24小时，再转移到T75干细胞培养瓶中，37℃，5％二氧化碳培养箱中培养6小时，去掉上清，用生理盐水漂洗两次，再用胰蛋白酶消化，收集细胞，细胞计数仪测定细胞数量。结果如图1所示。图1中A、B、C、D、E分别表示不同的配方组合；纵坐标表示贴壁的细胞数，结果显示，AB血清在2％时几乎全贴壁，5％时绝大部分贴壁，而在高浓度时明显观察到成团的细胞漂浮在培养基中，仅有部分细胞贴壁。高浓度的AB血清与血清白蛋白使细胞成团，再培养时贴壁率下降，2－5％时为最适浓度。

实施例2

转铁蛋白、还原型谷胱苷肽对细胞ROS水平的影响

用组织块贴壁法制备脐带间充质干细胞，传三代后，离心收集细胞，去上清。配制2组干细胞保存运输液，2组中均含5.26mg/ml氯化钠、5.02mg/ml葡萄糖酸钠、3.68mg/ml醋酸钠、2v/v％人AB血清、2.5mg/ml人参皂苷Rb1、0.1mmol/l谷氨酰胺，其中A：不加转铁蛋白、还原型谷胱苷肽；B：加10ng/ml转铁蛋白、10ng/ml还原型谷胱苷肽。除转铁蛋白、还原型谷胱苷肽不同外，两组其它成分相同。用这些不同组合的保存运输液稀释上述制备的脐带间充质干细胞成5х10⁷/ml。每组1ml在4℃保温箱中静态保存24小时，离心去保存液，PBS洗涤细胞三次，每次3min。甩片法将细胞贴于载玻片，分别用10μM DCFH对细胞质基质中ROS进行指示，用2μM DHR123对线粒体ROS进行染色，用DAPI对细胞核进行标记。在共聚焦显微镜中对这两种荧光强度进行分析，DHR123激发光507nm，散射光529nm，DCFH激发光488nm，散射光525nm。结果如图2所示：A1与B1为DAPI染色标记细胞核，A1与B2为DCFH染色，A3与B3为DHR123染色；A中无论是细胞质中的DCFH染色还是线粒体中的DHR123染色荧光强度均较强，表明A中细胞质中与线粒体中的ROS水平均较高。表明在保存运输液中添加转铁蛋白、还原型谷胱苷肽能有效降低细胞质与线粒体中的ROS水平，降低细胞的氧化应激，有利于提高细胞活性。

实施例3

人参皂苷Rb1能有效维持细胞活力与代谢水平

常规的MTT法与PI染色法只能测定已调亡坏死的细胞与未凋亡的细胞，其实很多细胞由于环境条件的不适，并且自身的调节机制不足以调节时，凋亡信号将不可逆，细胞就会从正常状态逐步走向凋亡，由开始凋亡到坏死还有一个过程，一般依据处理条件的不同从几个小时到一两天不等。在这个过程中，细胞膜依然保护完整，PI不能染色，细胞活力会发生改变，但还能维持一定的代谢能力，但此时，细胞内ATP的合成能力与含量会发生明显的改变，因此，ATP的含量改变最能精细反映细胞代谢状态的改变。

用组织块贴壁法制备脐带间充质干细胞，传三代后，离心收集细胞，去上清。配制2组干细胞保存运输液，2组中均含5.26mg/ml氯化钠、5.02mg/ml葡萄糖酸钠、3.68mg/ml醋酸钠、2v/v％人AB血清、10ng/ml转铁蛋白、10ng/ml还原型谷胱苷肽、0.1mmol/l谷氨酰胺，其中A：不加人参皂苷Rb1；B：加2.5mg/ml人参皂苷Rb1。除人参皂苷Rb1不同外，两组其它成分相同。用这些不同组合的保存运输液稀释上述制备的脐带间充质干细胞成5х10⁷/ml。每组各1ml在4℃保温箱中静态保存24小时，离心去保存液，参照LuminescentCell Viability Assay发光法细胞活力检测试剂盒)的方法测定两组保存液中细胞ATP的含量，用酶标仪测定两个样品孔中的吸光值。发光法细胞活力检测试剂盒是通过对ATP进行定量测定来检测培养物中活细胞数目的一种均质检测方法。以A的吸光值为基准并定为1，B的ATP含量定义为B的吸光值/A的吸光值。如图3所示A组的ATP含量明显高于B组，表示Rb1有利于保持细胞正常代谢活力。

Claims (5)

1.一种人间充质干细胞保存运输液，其特征在于，包含1-15mg/ml氯化钠、1-15mg/ml葡萄糖酸钠、1-10mg/ml醋酸钠、2-5v/v％人AB血清、0.1-25mg/ml人参皂苷Rb1、1-100ng/ml转铁蛋白、1-100ng/ml还原型谷胱苷肽、0.01-1mmol/l谷氨酰胺；所述保存运输液pH值为7.1-7.6。

2.根据权利要求1所述的人间充质干细胞保存运输液，其特征在于，所述保存运输液无细菌、病毒、支原体污染，内毒素含量＜5EU/ml。

3.权利要求1-2任一权利要求所述的人间充质干细胞保存运输液在保存运输人间充质干细胞中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用于保存来源包括骨髓、血液、脂肪、脐带、胎盘、羊水、皮肤、肝、肌肉、血管、神经、肺、肾、脑、流产胚胎/胎儿的全部或部分组织器官的间充质干细胞。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述保存运输液放于运输箱中保存运输人间充质干细胞，运输箱的冷冻芯控温温度0-4℃，保持时间大于24h。