CN109576215A - 一种诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于干细胞领域，公开了一种诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的组合物及方法。本发明所述诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的组合物，由5‑氮杂胞苷和PFT‑a组成。本发明所述诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的方法，为牙髓干细胞预培养后更换含FBS和本发明所述诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的组合物的DMEM/F12培养基诱导培养，然后更换含FBS的DMEM/F12培养基维持培养。所述牙髓干细胞自体取材方便，来源丰富，易于体外扩增，可以用于自体移植，从而避免了免疫排斥反应。实验表明本发明采用5‑氮杂胞苷和PFT‑a两种诱导因子联合应用作用于牙髓干细，能有效的诱导DPSCs向心肌样细胞分化。

Description

一种诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的方法

技术领域

本发明属于干细胞领域，具体涉及一种诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的方法。

背景技术

心肌梗死是由于冠状动脉循环改变引起冠脉血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损坏，是临床上一种严重的缺血性心脏病。坏死后的心肌细胞逐渐被瘫痕组织所取代，由于瘫痕组织缺乏弹性，难以满足心脏收舒功能的要求，为代偿损失心肌细胞的功能，心脏逐渐发生退行性左心室重塑，心功能下降，最终导致充血性心力衰竭，甚至猝死。临床药物和介入治疗虽可以改善症状，但却不能挽回受损的心肌细胞。心脏移植虽可以从根本上解决心室重构问题，但因为其供体受限，医疗费用太高而难以广泛应用。

近年来的研究表明，心肌细胞也具有再生能力，在心肌梗死后，心肌细胞也可以发生分裂和增值，但是，由于其增值能力较弱，不能满足弥补丧失心肌细胞数量的要求而逆转心室重构过程。近年来随着干细胞技术和组织工程学研究的不断深入，干细胞移植治疗心肌梗死成为临床研究的热点。干细胞的多向分化潜能及可塑性使心肌梗死心肌细胞再生成为可能。在人体的微环境作用下，干细胞定向归巢至损伤处，可以多项分化成各种组织细胞及血管。目前用于心肌梗死治疗研究的干细胞主要有骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪干细胞等。

牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔内，是牙体组织中唯一的软组织。牙髓干细胞(dental pulp stem cell，DPSCs)为成体组织干细胞，Gronthos等人于2000年首次次报道从人的第三磨牙牙髓组织中提取，经体外培养获得集落状生长，形态呈梭形，可自我更新和体外可诱导分化形成成牙本质样结构一类间充质干细胞。DPSCs与骨髓来源等间充质干细胞相类似，具有多向分化的潜能，它除了能形成矿化结节能力的细胞外，经过不同细胞因子的诱导，还能够分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、神经等细胞系类型。DPSCs取材方便、增值速度快，作为成体间充质干细胞中的一员，在体外使用合适的诱导剂同样具有分化为心肌样细胞的能力。DPSCs这种功能特性极大地吸引了来自基础医学和临床医学的研究者，给基础科学的研究者们提供了一种研究发展生物学的模式，DPSCs所具有的修复、替代和再生能力也为临床医学提供了一个发展新疗法的机会。目前对于DPSCs向心肌样细胞分化诱导的研究报道尚少，未见有效的诱导DPSCs向心肌样细胞分化的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的方法，以促使牙髓干细胞向心肌样细胞分化诱导。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的组合物，由5-氮杂胞苷和PFT-a组成。

5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-aza)是一种可改变基因的去甲基化药物,作为一种诱导剂常用于体外实验研究。5-aza是胞苷类似物，为DNA甲基转移酶抑制剂，当其作用于MSC时能整合进入DNA中，通过抑制DNA甲基转移酶使低DNA甲基化，而DNA的甲基化程度和基因调节密切相关。

P53作为重要的抑癌基因之一，在肿瘤研究领域中被广泛关注，同时在间充质干细胞的生物学领域中也备受瞩目。如果药物或者DNA损伤引起的P53蛋白积聚，则可以通过线粒体途径诱导人胚胎干细胞的凋亡，减少P53表达，减少人胚胎干细胞的DNA损伤诱导的凋亡及自分化性能。间充质干细胞抑制P53蛋白表达同样可以促进细胞生长，促进骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化。而Pifithrin-α(PFT-α)是一种常用的p53抑制剂，可逆抑制p53介导的细胞凋亡和p53依赖性的基因转录活性如细胞周期蛋白G、p21/waf1/cipl和mdm2蛋白的表达。

由于生物体是一个复杂的存在多诱导因素的有机体，因此在心肌组织再生的复杂微环境中，多种诱导因子在心肌组织再生的过程中可能会起到相互协同或拮抗的作用。本发明所述组合物包括5-氮杂胞苷和PFT-a，两种诱导因子联合应用作用于DPSCs，有效的诱导DPSCs向心肌样细胞分化。5-氮杂胞苷和控制向心肌分化的特异启动子基因上阻遏蛋白结合，使其去甲基化而发生构型改变，从而启动细胞向心肌分化，使转变成心肌细胞。PFT-a和5-氮杂胞苷组合物诱导可进一步促进细胞增殖和分化率。

作为优选，所述的组合物中所述5-氮杂胞苷与所述PFT-a的摩尔比为1:1.5～1:5。更优选为，1:1.5～1:2。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷与所述PFT-a的摩尔比1:1.5；在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷与所述PFT-a的摩尔比1:2；在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷与所述PFT-a的摩尔比1.5:2.5。

本发明还提供了一种诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的方法，牙髓干细胞预培养后更换含FBS和本发明所述诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的组合物的DMEM/F12培养基诱导培养，然后更换含FBS的DMEM/F12培养基维持培养。

其中，所述预培养为牙髓干细胞接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的培养板中，加入含FBS和EGF的DMEM/F12培养基，静置培养。

作为优选，所述预培养时所述牙髓干细胞为第3-5代牙髓干细胞。

作为优选，所述预培养时所述接种密度为1-5×10⁴cell/mL。

作为优选，所述预培养时所述含FBS和EGF的DMEM/F12培养基中FBS体积为10％，所述EGF的浓度为10ng/ml。

作为优选，所述静置培养具体为37℃、5％CO₂、饱和湿度静置培养24h。

作为优选，所述诱导培养的培养基中为所述FBS体积为10％，所述5-氮杂胞苷的浓度为5μmol/L-15μmol/L，所述PFT-α的浓度为10μmol/L-25μmol/L。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷的浓度为5μmol/L，所述PFT-α的浓度为10μmol/L。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷的浓度为10μmol/L，所述PFT-α的浓度为15μmol/L。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷的浓度为10μmol/L，所述PFT-α的浓度为20μmol/L。在一些实施方案中，所述5-氮杂胞苷的浓度为15μmol/L，所述PFT-α的浓度为25μmol/L。

作为优选，所述诱导培养的条件为37℃、5％CO₂、饱和湿度诱导培养24h。

作为优选，所述维持培养的培养基中所述FBS体积为15％。

作为优选，所述维持培养的条件为37℃、5％CO₂、饱和湿度维持培养4周，每隔2-3天更换新的培养液。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的组合物及方法。本发明所述诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的组合物，由5-氮杂胞苷和PFT-a组成。5-氮杂胞苷和PFT-a两种诱导因子联合应用作用于DPSCs，有效的诱导DPSCs向心肌样细胞分化。本发明所述诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的方法，为牙髓干细胞预培养后更换含FBS和本发明所述诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的组合物的DMEM/F12培养基诱导培养，然后更换含FBS的DMEM/F12培养基维持培养。所述牙髓干细胞自体取材方便，来源丰富，幼年自然脱落的牙齿、成年拔掉的智齿中都含有丰富的牙髓干细胞。牙髓干细胞易于体外扩增，可以用于自体移植，从而避免了免疫排斥反应。实验表明本发明采用5-氮杂胞苷和PFT-a两种诱导因子联合应用作用于牙髓干细，能有效的诱导DPSCs向心肌样细胞分化，DPSCs保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为心肌样细胞，有望成为心肌梗死替代治疗的种子细胞。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示DPSCs细胞表面标志物流式检测结果图；

图2示DPSCs细胞形态图(P3，左：40×；右：100×)；

图3示各组细胞诱导分化率结果统计图。

具体实施方式

本发明公开了一种诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。其中，DPSCs原代分离培养、鉴定及传代的方法如下：

漂洗：用含3倍双抗的PBS清洗牙体，彻底清除血污，重复3次。

牙髓分离提取：将牙齿包在无菌纱布中用钳夹裂牙齿，暴露牙髓组织；用无菌镊子夹取牙髓组织，切除根尖部1mm的牙髓组织。用眼科弯剪将牙髓组织剪成1mm³左右大小组织块。

消化：加入5-20倍体积胶原酶-Dispase酶1:1混合消化液(胶原酶3g/L，Dispase酶4g/L)，置37℃恒温摇床中消化45-50min。消化结束后，1500r/min离心5min，弃上清。加入5-20倍体积PBS重悬，1500r/min离心5min，弃上清。

接种：加入培养液(含体积分数10％FBS的DMEM/F12培养液)重悬细胞，接种于六孔板，5％CO₂培养箱37℃培养。

纯化：待细胞长满80-90％，收集细胞，用磁珠分选法纯化细胞。将收集的细胞与STRO-1单抗4℃孵育30min，用含0.1％血清的PBS清洗3次，去除残留的抗体，再次重悬，加入磁珠，4℃孵育15min，在磁力设备作用下筛选出STRO-1+DPSCs，接种于新的六孔板中，5％CO₂培养箱37℃培养。

DPSCs鉴定：待细胞长满80-90％，收集细胞(约1×10⁶个)，加入3g/L Triton浸泡20min，PBS洗3遍，10％山羊血清室温封闭2h，分别滴加1:200稀释的CD105、CD90、CD73、CD34、CD45、HLA-DR抗体各50μL，同时对照组滴加单纯PBS 50μL，4℃处理16h。次日室温放置30min，PBS漂洗3遍，各组分别滴加1:500稀释的FITC标记二抗IgG，常温避光孵育1h，PBS漂洗2遍，4％多聚甲醛固定细胞，上机测定抗原的阳性率。结果见表1，图1。

表1 DPSCs细胞表面标志物表达率结果

细胞表型

CD105

CD90

CD73

CD34

CD45

HLA-DR

阳性表达率(％)

98.65％

100.00％

99.98％

0.02％

0.02％

0.02％

流式细胞仪结果显示，克隆细胞表面抗原CD105、CD90、CD73表达阳性，而CD34、CD45、HLA-DR表达阴性，说明本发明中得到的DPSCs属来源于中胚层的间充质干细胞。

传代：待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入1-5mL 0.25％胰蛋白酶，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量含10％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量含10％FBS的DMEM/F12培养液，进行细胞记数，按5×10⁴cell/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO₂培养箱37℃培养，每隔2-3天换液一次。观察P3代细胞形态，结果见图2。

实施例1、

选取第3代DPSCs，按1×10⁴cell/mL密度接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的六孔板中，每孔加入2ml含10％FBS、10ng/ml EGF的DMEM/F12培养基，放置于37℃、5％CO₂、饱和湿度静置培养，培养24h后，更换含10％FBS、5μmol/L 5-aza、10μmol/L PFT-α的DMEM/F12培养基，诱导培养24h后，更换含15％FBS的DMEM/F12培养基维持培养4周，每隔2-3天更换新的培养液。培养4周后取出细胞爬片，按照免疫组化染色试剂盒的说明书进行肌间线蛋白(desmin)、心肌肌钙蛋白I(troponin I)和心肌肌钙蛋白T(troponin T)的免疫组化染色，DAB显色。

实施例2

选取第3代DPSCs，按1×10⁴cell/mL密度接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的六孔板中，每孔加入2ml含10％FBS、10ng/ml EGF的DMEM/F12培养基，放置于37℃、5％CO₂、饱和湿度静置培养，培养24h后，更换含10％FBS、10μmol/L 5-aza、15μmol/L PFT-α的DMEM/F12培养基，诱导培养24h后，更换含15％FBS的DMEM/F12培养基维持培养4周，每隔2-3天更换新的培养液。培养4周后取出细胞爬片，按照免疫组化染色试剂盒的说明书进行肌间线蛋白(desmin)、心肌肌钙蛋白I(troponin I)和心肌肌钙蛋白T(troponin T)的免疫组化染色，DAB显色。

实施例3

选取第3代DPSCs，按1×10⁴cell/mL密度接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的六孔板中，每孔加入2ml含10％FBS、10ng/ml EGF的DMEM/F12培养基，放置于37℃、5％CO₂、饱和湿度静置培养，培养24h后，更换含10％FBS、10μmol/L 5-aza、20μmol/L PFT-α的DMEM/F12培养基，诱导培养24h后，更换含15％FBS的DMEM/F12培养基维持培养4周，每隔2-3天更换新的培养液。培养4周后取出细胞爬片，按照免疫组化染色试剂盒的说明书进行肌间线蛋白(desmin)、心肌肌钙蛋白I(troponin I)和心肌肌钙蛋白T(troponin T)的免疫组化染色，DAB显色。

实施例4

选取第3代DPSCs，按1×10⁴cell/mL密度接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的六孔板中，每孔加入2ml含10％FBS、10ng/ml EGF的DMEM/F12培养基，放置于37℃、5％CO₂、饱和湿度静置培养，培养24h后，更换含10％FBS、15μmol/L 5-aza、25μmol/L PFT-α的DMEM/F12培养基，诱导培养24h后，更换含15％FBS的DMEM/F12培养基维持培养4周，每隔2-3天更换新的培养液。培养4周后取出细胞爬片，按照免疫组化染色试剂盒的说明书进行肌间线蛋白(desmin)、心肌肌钙蛋白I(troponin I)和心肌肌钙蛋白T(troponin T)的免疫组化染色，DAB显色。

对比例1

选取第3代DPSCs，按1×10⁴cell/mL密度接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的六孔板中，每孔加入2ml含10％FBS、10ng/ml EGF的DMEM/F12培养基。在37℃、5％CO₂、饱和湿度静置培养，每隔2-3天更换新的培养液。培养4周后取出细胞爬片，按照免疫组化染色试剂盒的说明书进行肌间线蛋白(desmin)、心肌肌钙蛋白I(troponin I)和心肌肌钙蛋白T(troponin T)的免疫组化染色，DAB显色。

对比例2

选取第3代DPSCs，按1×10⁴cell/mL密度接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的六孔板中，每孔加入2ml含10％FBS、10ng/ml EGF的DMEM/F12培养基，放置于37℃、5％CO₂、饱和湿度静置培养，培养24h后，更换含10％FBS、20μmol/L PFT-α的DMEM/F12培养基，诱导培养24h后，更换含15％FBS的DMEM/F12培养基维持培养4周，每隔2-3天更换新的培养液。培养4周后取出细胞爬片，按照免疫组化染色试剂盒的说明书进行肌间线蛋白(desmin)、心肌肌钙蛋白I(troponin I)和心肌肌钙蛋白T(troponin T)的免疫组化染色，DAB显色。

对比例3

选取第3代DPSCs，按1×10⁴cell/mL密度接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的六孔板中，每孔加入2ml含10％FBS、10ng/ml EGF的DMEM/F12培养基，放置于37℃、5％CO₂、饱和湿度静置培养，培养24h后，更换含10％FBS、10μmol/L 5-aza的DMEM/F12培养基，诱导培养24h后，更换含15％FBS的DMEM/F12培养基维持培养4周，每隔2-3天更换新的培养液。培养4周后取出细胞爬片，按照免疫组化染色试剂盒的说明书进行肌间线蛋白(desmin)、心肌肌钙蛋白I(troponin I)和心肌肌钙蛋白T(troponin T)的免疫组化染色，DAB显色。

试验例1、DPSCs诱导分化后细胞形态观察

对各自诱导后的细胞进行观察，结果显示对比例1细胞形态无变化，实施例4细胞形态变化不明显，偶见杆状细胞；对比例2、对比例3、实施例1、实施例2和实施例3细胞形态出现明显变化，诱导后1-2周，细胞多紧密平行排列生长，细胞体积变大，纺锤形细胞比例下降，多数细胞呈杆状，少部分细胞呈不规则外形、长梭形或椭圆形；3-4周，细胞增殖减慢，部分细胞脱壁死亡，细胞数量较同期其他各组明显减少，相邻细胞间胞膜有接触，逐渐相连呈肌管状，细胞核质比例明显降低，胞质内有细小的颗粒样结构，且颗粒样结构多聚集于细胞核周围，部分细胞胞质内可见细丝样结构。

试验例2、免疫组化染色

将各组放有盖玻片6孔培养板内培养液吸出，PBS缓冲液漂洗细胞铺片5分钟，重复3次。用4％多聚甲醛固定15分钟，PBS缓冲液漂洗后甩干，中性树胶粘附于载玻片上，4℃冰箱过夜。滴加3％过氧化氢孵育15分钟，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次。分别滴加适量一抗(desmin、troponin I、troponin T)，37℃湿盒内孵育1小时，4℃过夜。次日取出后PBS缓冲液漂洗5分钟，滴加二抗，37℃湿盒内孵育40分钟，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次，滴加新鲜配制的DAB溶液显色5-10分钟，在光镜下观察，用自来水进行冲洗终止显色。将甩干片子后，苏木素复染1分钟，分化返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。结果如表2、图3显示。

对比例1为阴性对照组，细胞无着色；其余各组中，三种蛋白均有细胞着色，表明desmin、troponin I、troponin T均表达阳性。其中各实施例与各对比例之间分化率有极显著性差异(**，p<0.01)；实施例3与实施例1、实施例2、实施例4均有显著性差异(**，p<0.01)，实施例3中细胞着色最多，诱导分化率为45.34±1.84％，显著高于其他各组，说明本发明所用分化培养基能有效的诱导DPSCs向心肌样细胞分化。

表2各组细胞分化率(**表示p<0.01)

Claims (10)

1.一种诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的组合物，包括5-氮杂胞苷和PFT-a。

2.根据权利要求1所述的组合物，所述5-氮杂胞苷与所述PFT-a的摩尔比为1:1.5～1:5。

3.根据权利要求1所述的组合物，所述5-氮杂胞苷与所述PFT-a的摩尔比为1:1.5～1:2。

4.一种诱导牙髓干细胞向心肌样细胞分化的方法，牙髓干细胞预培养后更换含FBS和权利要求1-3任意一项所述组合物的DMEM/F12培养基诱导培养，然后更换含FBS的DMEM/F12培养基维持培养。

5.根据权利要求4所述的方法，所述预培养为牙髓干细胞接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的培养板中，加入含FBS和EGF的DMEM/F12培养基，静置培养。

6.根据权利要求5所述的方法，所述牙髓干细胞为第3-5代牙髓干细胞；所述接种密度为1-5×10⁴cell/mL；所述含FBS和EGF的DMEM/F12培养基中FBS体积为10％，所述EGF的浓度为10ng/ml；所述静置培养具体为37℃、5％CO₂、饱和湿度静置培养24h。

7.根据权利要求4所述的方法，所述诱导培养的培养基中为所述FBS体积为10％，所述5-氮杂胞苷的浓度为5μmol/L-15μmol/L，所述PFT-α的浓度为10μmol/L-25μmol/L。

8.根据权利要求4所述的方法，所述诱导培养的条件为37℃、5％CO₂、饱和湿度诱导培养24h。

9.根据权利要求4所述的方法，所述维持培养的培养基中所述FBS体积为15％。

10.根据权利要求4所述的方法，所述维持培养的条件为37℃、5％CO₂、饱和湿度维持培养4周，每隔2-3天更换新的培养液。