CN106244530A - 一种细胞培养液及其应用和诱导骨骼肌干细胞向心肌样细胞分化的方法 - Google Patents

一种细胞培养液及其应用和诱导骨骼肌干细胞向心肌样细胞分化的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种细胞培养液及其应用和诱导骨骼肌干细胞向心肌样细胞分化的方法。本发明提供的培养液中包括基础培养液、FBS、5‑aza和TGFβ。本发明提供的培养液能够诱导骨骼肌干细胞分化为心肌样细胞，且能够提高骨骼肌干细胞向心肌样细胞分化的分化率并缩短分化的时间。诱导四周后，对各组细胞的分化率进行计算，结果显示实验组细胞的分化率显著高于对照组，(p<0.05，或p<0.01)。

Description

一种细胞培养液及其应用和诱导骨骼肌干细胞向心肌样细胞 分化的方法
技术领域
本发明涉及干细胞培养技术领域，尤其涉及一种细胞培养液及其应用和诱导骨骼肌干细胞向心肌样细胞分化的方法。
背景技术
心肌梗死是由于冠状动脉循环改变引起冠脉血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损坏，是临床上一种严重的缺血性心脏病。坏死后的心肌细胞逐渐被瘫痕组织所取代，由于瘫痕组织缺乏弹性，难以满足心脏收舒功能的要求，为代偿损失心肌细胞的功能，心脏逐渐发生退行性左心室重塑，心功能下降，最终导致充血性心力衰竭，甚至猝死。临床药物和介入治疗虽可以改善症状，但却不能挽回受损的心肌细胞。心脏移植虽可以从根本上解决心室重构问题，但因为其供体受限，医疗费用太高而难以广泛应用。近年来的研究表明，心肌细胞也具有再生能力，在心肌梗死后，心肌细胞也可以发生分裂和增值，但是，由于其增值能力较弱，不能满足弥补丧失心肌细胞数量的要求而逆转心室重构过程。近年来随着干细胞技术和组织工程学研究的不断深入，干细胞移植治疗心肌梗死成为临床研究的热点。
干细胞的多向分化潜能及可塑性使心肌梗死心肌细胞再生成为可能，在人体的微环境作用下，干细胞定向归巢至损伤处，可以多项分化成各种组织细胞及血管。目前用于心肌梗死治疗研究的干细胞主要有骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、脐带间充质干细胞、脂肪干细胞等。目前研究表明，在体外常用5-氮杂胞普，骨形态发生蛋白-2等作为诱导剂诱导间充质干细胞向心肌样细胞分化，取得了良好分化效率。
骨骼肌肌源性干细胞(muscle-derived stem cells，MDSCs)是成年动物或人肌肉组织中特有的干细做为中胚层起源的一种成体间充质干细胞，具有自我更新能力和多项分化的潜能，并且，肌肉来源的细胞，取材方便、肌肉组织中细胞含量大、增值速度快。研究表明，MDSCs可在体外分化为血细胞、骨细胞、内皮细胞等系的细胞。
骨骼肌干细胞这种功能特性极大地吸引了来自基础医学和临床医学的研究者，给基础科学的研究者们提供了一种研究发展生物学的模式，骨骼肌干细胞所具有的修复、替代和再生能力也为临床医学提供了一个发展新疗法的机会。但是，目前的培养方法中，骨骼肌干细胞向心肌样细胞的转化效率仍非常低，亟待研究开发新的促进骨骼肌干细胞向心肌样细胞分化的方法。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种细胞培养液及其应用和诱导骨骼肌干细胞向心肌样细胞分化的方法。
本发明提供的细胞培养液，包括基础培养液、FBS、5-aza和TGFβ。
胎牛血清(fetal calf serum，FBS)是血清中的一种，能够提供维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。
5-氮杂胞苷(5-azacytidine，5-aza)是一种可改变基因的去甲基化药物，作为一种诱导剂常用于体外实验研究。5-aza是胞苷类似物，为DNA甲基转移酶抑制剂，当其作用于MSC时能整合进入DNA中，通过抑制DNA甲基转移酶使低DNA甲基化,而DNA的甲基化程度和基因调节密切相关。5-aza诱导MSC心肌化，可能是它和控制向心肌分化的特异启动子基因上阻遏蛋白结合，使其去甲基化而发生构型改变,从而启动细胞向心肌分化,使转变成心肌细胞。
转录生长因子β(TGFβ)是多功能生长因子家族，与增殖、分化和死亡等多种细胞应答有关，在干细胞自我更新修复中起到关键作用，TGFβ1在调节细胞生长、分化和组织修复中起到重要作用，并与心肌梗死后心肌重构等许多心脏疾病相关，它可以刺激肌肉和肌成纤维细胞的增殖。
本发明利用FBS、5-aza和TGFβ诱导骨骼肌干细胞分化为心肌样细胞。诱导获得的细胞不仅具有了心肌细胞的典型形态，并表达心肌细胞的标志物：肌间线蛋白(desmin)、心肌肌钙蛋白I(troponin I)和心肌肌钙蛋白T(troponin T)，表明骨骼肌干细胞保留了跨胚层分化为非间充质细胞的能力，可跨胚层分化为心肌样细胞。
本发明提供的培养基提高了骨骼肌干细胞向心肌样细胞分化的分化率并缩短分化的时间。实验表明，诱导后1周～2周，细胞多紧密平行排列生长，细胞体积变大，纺锤形细胞比例下降，多数细胞呈杆状，少部分细胞呈不规则外形、长梭形或椭圆形；3～4周，细胞增殖减慢，部分细胞脱壁死亡，细胞数量较对照组1明显减少，相邻细胞间胞膜有接触，逐渐相连呈肌管状，细胞核质比例明显降低，胞质内有细小的颗粒样结构，且颗粒样结构多聚集于细胞核周围，部分细胞胞质内可见细丝样结构。对各组细胞的分化率进行计算，结果显示实验组细胞的分化率显著高于对照组，(p<0.05，或p<0.01)。
在本发明的实施例中，FBS的体积分数为10％。
在本发明的实施例中，5-aza的浓度为5μmol/L～15μmol/L；TGFβ的浓度为1μg/mL～10μg/mL。
在本发明的实施例中，包括基础培养基、体积分数为10％的FBS、浓度为5μmol/L的5-aza、浓度为1μg/mL的TGFβ。
在一些实施例中，细胞培养液包括基础培养基、体积分数为10％的FBS、浓度为10μmol/L的5-aza、浓度为5μg/mL的TGFβ。
在一些实施例中，细胞培养液包括基础培养基、体积分数为10％的FBS、浓度为5μmol/L的5-aza、浓度为10μg/mL的TGFβ。
在一些实施例中，细胞培养液包括基础培养基、体积分数为10％的FBS、浓度为15μmol/L的5-aza、浓度为10μg/mL的TGFβ。
在一些具体实施例中，基础培养基为DMEM/F12。
本发明所用的基础培养液可为自制也可为购买获得，本发明对此不做限定，其实施皆在本发明的保护范围之内。本发明采用的人干细胞无血清培养基为DMEM/F12无血清培养液。本发明提供的培养液中不含有抗生素，而是通过更加适宜的培养条件，促进骨骼肌干细胞向心肌样细胞的分化，增强目标细胞的生长势，降低感染风险。
本发明提供的细胞培养液在诱导骨骼肌干细胞向心肌样细胞分化中的应用。
本发明还提供了诱导骨骼肌干细胞向心肌样细胞分化的方法，骨骼肌干细胞以基础培养基培养至70％～80％融合后以本发明提供的细胞培养液诱导。
在本发明的实施例中，诱导的时间为28d。
在本发明的实施例中，骨骼肌干细胞为3～5代的骨骼肌干细胞。
一些实施例中，骨骼肌干细胞为第3代的骨骼肌干细胞。
所述诱导骨骼肌干细胞向神经样细胞分化的容器为无菌六孔板，优选的，所述六孔板经多聚赖氨酸处理。
本发明中，骨骼肌干细胞的分离方法包括：
步骤1：将骨骼肌破碎后，经Dispase II和I型胶原酶消化后，以胰蛋白酶消化，获得细胞以培养基重悬；
步骤2：差速贴壁法对步骤1中所得细胞进行分离，获得骨骼肌干细胞。
在本发明中，骨骼肌为颞肌。
差速贴壁具体为：将细胞悬液接种于培养瓶中，放置于37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养。2h后的贴壁细胞记为PP1，其中未贴壁细胞吸出后移入新的培养瓶中进行培养，并记为PP2。24h后将PP2中未贴壁的细胞吸出后移入新的培养瓶中培养，标记为PP3。以后每24h进行差速贴壁培养，直到获得PP6，记为骨骼肌干细胞。
骨骼肌干细胞培养3天后换液，以后每2-3天换液，待细胞生长融合至70％-80％后传代培养。
骨骼肌干细胞(MDSCs)原代培养8-10天，待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，加入含20％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量含20％FBS的DMEM/F12培养液，进行细胞记数，按8×104cell/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO2培养箱37℃培养，每隔2-3天换液一次。
在本发明中，诱导骨骼肌干细胞向神经样细胞分化前，骨骼肌细胞以基础培养基培养的接种密度为1×104cell/mL。
基础培养基为DMEM/F12培养液。
本发明提供的培养液中包括基础培养液、FBS、5-aza和TGFβ。本发明提供的培养液能够诱导骨骼肌干细胞分化为心肌样细胞，且能够提高骨骼肌干细胞向心肌样细胞分化的分化率并缩短分化的时间。实验表明，诱导后1周～2周，细胞多紧密平行排列生长，细胞体积变大，纺锤形细胞比例下降，多数细胞呈杆状，少部分细胞呈不规则外形、长梭形或椭圆形；3～4周，细胞增殖减慢，部分细胞脱壁死亡，细胞数量较对照组1明显减少，相邻细胞间胞膜有接触，逐渐相连呈肌管状，细胞核质比例明显降低，胞质内有细小的颗粒样结构，且颗粒样结构多聚集于细胞核周围，部分细胞胞质内可见细丝样结构。诱导四周后，对各组细胞的分化率进行计算，结果显示实验组细胞的分化率显著高于对照组，(p<0.05，或p<0.01)。
附图说明
图1示MDSCs P2代形态；其中，图1-a的放大倍数为40×；图1-b的放大倍数为100×。
具体实施方式
本发明提供了一种细胞培养液及其应用和诱导骨骼肌干细胞向心肌样细胞分化的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1MDSCs的分离和传代
1、取材：
取成人正常颞肌标本(取自于开颅手术患者)，用含双抗的PBS缓冲液冲洗后转入无菌培养皿中，用眼科剪剪成1mm3左右大小的碎块，然后移入50ml离心管中，PBS缓冲液吹打冲洗3次，静置1分钟后弃上层液及漂浮组织。
2、酶解：
向上述获得的肌肉碎块加入2倍的体积的混合酶，包括2.4u/ml Dispase II、1％I型胶原酶，2.5mmol/L CaCl2，混匀后置37℃恒温摇床中消化60min左右，直到试管中的肌肉碎块消化为肌糜，肉眼看不到肌块。消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入2～3倍体积的0.25％胰蛋白酶-EDTA，混匀后置37℃恒温摇床中消化15min，消化结束后，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量PBS重悬，1000r/min离心5min，弃上清。加入约3倍肌糜体积的PBS反复吹打后经200目滤网过滤，收集的滤液1000r/min离心5min，弃上清。生长培养基(含20％FBS的DMEM/F12)重悬细胞。
3、分离与纯化：
采用差速贴壁分离技术对MDSCs进行分离。将细胞悬液接种于25ml培养瓶中，放置于37℃、体积分数为5％的CO2培养箱中培养。2h后的贴壁细胞记为PP1，其中未贴壁细胞吸出后移入新的培养瓶中进行培养，并记为PP2。24h后将PP2中未贴壁的细胞吸出后移入新的培养瓶中培养，标记为PP3。以后每24h进行差速贴壁培养，直到获得PP6，期间根据细胞的生长情况进行换液。PP6培养3天后换液，以后每2-3天换液，倒置显微镜下观察记录细胞生长以及形成集落后每日扩增情况，待细胞生长融合至70-80％后传代培养。
4、MDSCs的传代培养：
MDSCs原代培养8-10天，待细胞长满80-90％，用吸管吸弃旧培养液，加入适量0.25％胰蛋白酶-EDTA，消化1-3分钟，镜下观察细胞收缩变圆时，立即加入适量含20％FBS的DMEM/F12培养液终止消化，收集细胞，1000r/min离心5min，弃上清。加入适量含20％FBS的DMEM/F12培养液，进行细胞记数，按8×104cell/mL密度接种于培养皿中进行传代培养，5％CO2培养箱37℃培养，每隔2-3天换液一次。
5、MDSCs的鉴定:
1)细胞爬片制作：将无菌盖玻片放置于6孔培养板中，对数生长期细胞制备成细胞悬液，按5×104cell/mL密度接种于6孔培养板中，每孔2ml，生长培养基为含20％FBS的DMEM/F12，培养24-48小时，使细胞生长于盖玻片上。
2)Desmin、Sca-1免疫细胞化学染色:将放有盖玻片6孔培养板内培养液吸出，PBS缓冲液漂洗细胞铺片5分钟，重复3次。用4％多聚甲醛固定15分钟，PBS缓冲液漂洗后甩干，中性树胶粘附于载玻片上，4℃冰箱过夜。滴加3％过氧化氢孵育15分钟，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次。分别滴加一抗兔抗人结蛋白(Desmin)抗体(1:200稀释)、兔抗人Sca-1抗体(1:100稀释)，37℃湿盒内孵育1小时，4℃过夜。次日取出后PBS缓冲液漂洗5分钟，滴加二抗，37℃湿盒内孵育40分钟，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次，滴加新鲜配制的DAB溶液显色5-10分钟，在光镜下观察，用自来水进行冲洗终止显色。将甩干片子后，苏木素复染1分钟，分化返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在镜下观察，胞膜和/或胞浆内出现棕黄色颗粒，说明成功分离获得MDSCs(图1为MDSCs P2代形态图)。
实施例2MDSCs的分化
各受试组培养液的配方如表1：
表1各组分化诱导液配方
组别 基础培养基 FBS 5-aza TGFβ
实验组1 DMEM/F12 10％ 5umol/L 1ug/L
实验组2 DMEM/F12 10％ 10umol/L 5ug/L
实验组3 DMEM/F12 10％ 5umol/L 10ug/L
实验组4 DMEM/F12 10％ 15umol/L 10ug/L
对照组1 DMEM/F12 10％ —— ——
对照组2 DMEM/F12 10％ 10umol/L ——
对照组3 DMEM/F12 10％ —— 5ug/L
为了验证本发明分化诱导的效果，同时设置3组对照组和4组实验组，选取第3代MDSCs，按1×104cell/mL密度接种于放有多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片的六孔板中，每孔加入2ml含10％FBS的DMEM/F12培养基。24h后更换各组对应的培养液，在37℃、5％CO2、饱和湿度静置培养，每隔2-3天更换新的培养液。
观察培养过程中细胞形态：对照组1为阴性对照组，细胞形态无变化，实验组4细胞状态较差，细胞增殖缓慢，部分细胞脱壁死亡，细胞数量逐渐减少，3-4周偶见部分细胞呈不规则外形、长梭形或椭圆形；对照组2、对照组3、实验组1、实验组2和实验组3细胞形态出现明显变化，诱导后1-2周，细胞多紧密平行排列生长，细胞体积变大，纺锤形细胞比例下降，多数细胞呈杆状，少部分细胞呈不规则外形、长梭形或椭圆形；3-4周，细胞增殖减慢，部分细胞脱壁死亡，细胞数量较对照组1明显减少，相邻细胞间胞膜有接触，逐渐相连呈肌管状，细胞核质比例明显降低，胞质内有细小的颗粒样结构，且颗粒样结构多聚集于细胞核周围，部分细胞胞质内可见细丝样结构。
培养4周后取出细胞爬片,按照免疫组化染色试剂盒的说明书进行肌间线蛋白(desmin)、心肌肌钙蛋白I(troponin I)和心肌肌钙蛋白T(troponin T)的免疫组化染色,DAB显色。
将各组放有盖玻片6孔培养板内培养液吸出，PBS缓冲液漂洗细胞铺片5分钟，重复3次。用4％多聚甲醛固定15分钟，PBS缓冲液漂洗后甩干，中性树胶粘附于载玻片上，4℃冰箱过夜。滴加3％过氧化氢孵育15分钟，消除内源性过氧化物酶的活性，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次。分别滴加适量一抗(desmin、troponin I、troponin T)，37℃湿盒内孵育1小时，4℃过夜。次日取出后PBS缓冲液漂洗5分钟，滴加二抗，37℃湿盒内孵育40分钟，PBS缓冲液漂洗5分钟，重复3次，滴加新鲜配制的DAB溶液显色5-10分钟，在光镜下观察，用自来水进行冲洗终止显色。将甩干片子后，苏木素复染1分钟，分化返蓝，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。对各组所得细胞经免疫组化检测后，对desmin、troponin I、troponin T染色的细胞按公式：
诱导分化率＝染色阳性细胞数/细胞总数×100％
进行计数，计算出各组的分化率进行比较。每组取样3次，分别检测后统计数据。统计结果如表2。
表2各组细胞分化率
其中，*示与对照组1相比存在显著性差异，p<0.05
**示与对照组1～3相比皆存在极显著差异，p<0.01
表2结果显示，对照组1为阴性对照组，细胞无着色；其余各组中，三种蛋白均有细胞着色，表明desmin、troponin I、troponin T均表达阳性。其中对照组2、对照组3和实验组1之间分化率无显著性差异(p>0.05)，说明5-aza与TGFβ单独诱导MDSCs向心肌样细胞分化效果作用无差异。
实验组4虽有细胞少量着色，但由于5-aza浓度过高，对细胞毒性较大，细胞活性受到较大影响，分化效率也为最差；实验组2中细胞着色最多，诱导分化率为41.49±1.09％，显著高于其他各组(p<0.01)，说明本发明所用分化培养基能有效的诱导MDSCs向心肌样细胞分化。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种细胞培养液，其特征在于，包括基础培养液、FBS、5-aza和TGFβ。
2.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，所述FBS的体积分数为10％。
3.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，
所述5-aza的浓度为5μmol/L～15μmol/L；
所述TGFβ的浓度为1μg/mL～10μg/mL。
4.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，包括基础培养基、体积分数为10％的FBS、浓度为5μmol/L的5-aza、浓度为1μg/mL的TGFβ。
5.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，包括基础培养基、体积分数为10％的FBS、浓度为10μmol/L的5-aza、浓度为5μg/mL的TGFβ。
6.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，包括基础培养基、体积分数为10％的FBS、浓度为5μmol/L的5-aza、浓度为10μg/mL的TGFβ。
7.根据权利要求1所述的细胞培养液，其特征在于，包括基础培养基、体积分数为10％的FBS、浓度为15μmol/L的5-aza、浓度为10μg/mL的TGFβ。
8.根据权利要求1～7任一项所述的细胞培养液，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F12。
9.权利要求1～8任一项所述的细胞培养液在诱导骨骼肌干细胞向心肌样细胞分化中的应用。
10.一种诱导骨骼肌干细胞向心肌样细胞分化的方法，其特征在于，骨骼肌干细胞以基础培养基培养至70％～80％融合后以权利要求1～8任一项所述的细胞培养液诱导。
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