CN110885783B

CN110885783B - 一种消化液、其制备方法及应用

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Publication number: CN110885783B
Application number: CN201811055050.4A
Authority: CN
Inventors: 袁惟芯; 张钰; 邵小燕; 王春慧; 赵雅宁; 戴果鲜; 张光辉; 严小敏
Original assignee: Beijing Victory Biotechnology Co ltd; Chongqing United Stem Cell Technology Co ltd; Guangzhou Victory Biotechnology Co ltd; Xuzhou Cell Medical Co ltd; Shanghai Icell Biotechnology Co ltd
Current assignee: Beijing Victory Biotechnology Co ltd; Chongqing Saiao Biotechnology Co.,Ltd.; Guangzhou Victory Biotechnology Co ltd; Shanghai Icell Biotechnology Co ltd; Xuzhou Cell Medical Co ltd
Priority date: 2018-09-11
Filing date: 2018-09-11
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2038-09-11
Also published as: CN110885783A

Abstract

本发明提供一种消化液，所述消化液组分包含：0.1％～0.5％胶原酶Ⅰ，0.1％～0.5％DispaseⅡ，63.47μg/ml～126.94μg/ml氯化镁，其余为DMEM培养液；以上为重量百分比。本发明还提供该消化液的制备方法和应用。利用本发明消化液所得细胞具有产量高和活性高的特点，且具有快速、省时、操作性和可控性好等优势。

Description

一种消化液、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于干细胞制备领域，具体的涉及一种组合物。

背景技术

脂肪干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现ADSCs适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一。在脂肪干细胞培养中，通常使用胶原酶消化方法，但有关消化酶的浓度、消化时间及其他培养条件，每个实验室使用的参数各不相同。例如，在2018年发表的文献《Improved GMPcompliant approach to manipulate lipoaspirates,to cryopreserve stromalvascular fraction,and to expand adipose stem cells in xeno-free media》(Agostini et al.Stem Cell Research&Therapy(2018)9:130)中，只使用一种胶原酶作为消化液，消化时间需要60分钟。该方法每毫升得到的有核细胞数为：185.4±19.3×10³，得到的细胞存活率为：77.1±3.9％。

因此，本领域迫切需要开发出消化时间更短，效果更好的消化液，以探索脂肪干细胞培养最佳的条件，为大规模细胞培养和临床应用提供方便。

发明内容

本发明提供一种消化时间短、效果更加好的消化液，以有利于大规模培养脂肪干细胞等细胞。

本发明第一方面，提供一种消化液，所述消化液组包含：

0.1％～0.5％胶原酶Ⅰ，

0.1％～0.5％DispaseⅡ，

1.5％～3％白蛋白，其余为DMEM培养液；

以上为重量百分比。

上述胶原酶Ⅰ的浓度为0.1％。

上述DispaseⅡ的浓度为0.1％。

上述消化液还包含63.47μg/ml～126.94μg/ml的氯化镁。

上述氯化镁的浓度为63.47μg/ml。

上述白蛋白的浓度为3％。

本发明第二方面同提供上述消化液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括步骤：

(1)将适量胶原酶Ⅰ，DispaseⅡ分别完全溶解于生理盐水或DMEM培养液中；

(2)按照上述百分比，将步骤(1)中溶解的各组分加入DMEM培养液中。

在具体实施例中，步骤(2)前还有一步骤：

将步骤(1)中溶解的胶原酶Ⅰ，DispaseⅡ按照需要比例混匀，并经0.22μm过滤器过滤。

本发明第三方面同提供上述消化液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括步骤：

(1)将适量胶原酶Ⅰ，DispaseⅡ，氯化镁分别完全溶解于生理盐水或DMEM培养液中；

在具体实施例中，步骤(2)前还有一步骤：

上述生理盐水为0.85-0.9％的氯化钠溶液。

本发明第三方面，提供上述消化液在培养脂肪干细胞中的应用。

所述脂肪干细胞为脂肪间充质干细胞。

本发明组合物使用胶原酶和Dispase分散酶两种消化酶来消化脂肪组织，加入适量的白蛋白来保护细胞免受过度消化。本发明组合物消化脂肪组织只需20分钟左右即可，大大节约了时间。从其他指标看，本发明组合物每毫升得到的有核细胞数可为：5.12±0.34×10⁵NC，所以该组合物得到的有核细胞数量更高。且加入白蛋白来保护细胞，使得到的细胞存活率更高，可为：93.2±5.9％。另外，加入酶激活剂(氯化镁溶液)来促进消化酶的消化作用，获得的消化液消化效果显著高于原来的消化液。因此，本发明组合物可以有效分离脂肪干细胞，获得更多细胞，存活率也更高。

附图说明

图1为7种酶消化组合下P0代细胞生长至80％～90％融合所需时间比较。

图2为7种酶消化组合下P0代细胞生长至第7天收获细胞数量。

图3为酶消化组合2所得P0代细胞CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-DR的流式检测结果。

图4为酶消化组合4所得P0代细胞CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-DR的流式检测结果。

图5为酶消化组合7所得P0代细胞CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-DR的流式检测结果。

图6为酶消化组合4所得P1代细胞向成骨(左)、成脂肪(中)、成软骨细胞(右)诱导分化结果。

具体实施方式

以下，参照实施例对本发明进行更详细和具体地描述，但该实施例并不意在限制本发明。本发明中百分比均为重量百分比。

实施例1消化液的配置

称取1g的胶原酶Ⅰ(Sigma公司)于15ml离心管中，移液管吸取10ml生理盐水(0.85～0.9％氯化钠溶液)溶解，溶解后静置15分钟，使粉剂完全溶解于溶液中。称取1g的DispaseⅡ(Sigma公司)于15ml离心管中，移液管吸取10ml生理盐水溶解，溶解后静置15分钟，使粉剂完全溶解于溶液中，也可以取适量酶溶解于DMEM培养液中。20ml注射器吸取配置好的胶原酶及Dispase混匀后经0.22μm过滤器过滤。原浓度为1M(即95.21mg/mL)的氯化镁溶液购于Gibco，使用时直接按下表加入至消化液中即可。配置出消化液组合物如下表，均为重量百分比浓度：

表一：消化液组合物配比图

实施例2消化液使用效果对比

表二：消化液使用的效果数据

注：表二中细胞数量单位均为×10⁵NC/mL脂肪

实施例3细胞生长速度和产量对比

在生长速度对比研究中，将上述7种酶消化组合分离得到的脂肪有核细胞以2×10⁵/cm²的细胞密度接种于T75培养瓶中，72h后首次换液，以后每2天换液一次，每日观察细胞生长状况，记录和比较细胞生长至80％～90％融合所需时间(图1)。组合5消化液分离得到的细胞生长至80％～90％融合所需时间最长，平均需要17天；组合1、2、3、6消化液分离所得细胞生长时间低于组合5，大约需要11～12天；组合7的生长速度较快，达到融合所需时间为10天左右；组合4分离所得细胞生长速度最快，仅需8天左右时间即可融合。分析原因，可能是因为组合5的酶浓度最高，对细胞损伤最大，因此细胞活率最低，生长状态最差；组合1、2、3、6分离得到的细胞高于组合5，细胞活力略高，生长状态更好，生长速度更快；组合4的酶浓度最低、消化时间也较短，且有白蛋白保护，因此细胞活率最高，细胞生长状态最好，生长速度最快。在细胞产量研究中，将上述7种酶消化组合分离得到的脂肪有核细胞以2×10⁵/cm²的细胞密度接种于T75培养瓶中，72h后首次换液，以后每2天换液一次，待细胞生长至第7天时，去除原培养基，PBS漂洗一次，加入3mL 0.05％胰酶，置于培养箱中消化2～3min，5mL完全培养基终止消化，将消化下来的细胞转移至15mL离心管中，以300g离心5min，去除培养基，加入1mL PBS重悬细胞，计数，并计算每个T75瓶子中细胞数量(图2)。由于一开始的接种数量一样，因此相同时间内获得的细胞产量与细胞生长速度有关。结果显示，组合4的细胞生长至7天所得细胞数量最高，组合7次之，组合1、2、3、6细胞生长至第7天所得细胞数量较低，组合5所得细胞数量最少，这与细胞生长对比研究中结果吻合。

实施例4脂肪干细胞的表型检测

由于酶消化组合液2、4、7所得的活细胞数量/mL脂肪最高，这3个组合是较为理想的脂肪组织酶消化液。因此，本发明对组合2、4、7分离得到的P0代脂肪干细胞进行表型的鉴定。(图3-5)

具体实施例操作为：分离得到的脂肪有核细胞以2×10⁵/cm²的细胞密度接种于T75培养瓶中，72h后首次换液，以后每2天换液一次，待细胞生长至第7天时，去除原培养基，PBS漂洗一次，加入3mL 0.05％胰酶，置于培养箱中消化2～3min，5mL完全培养基终止消化，将消化下来的细胞转移至15mL离心管中，以300g离心5min，去除培养基，加入5mL PBS重悬细胞，300g×5min离心洗涤1次，去上清，1mL PBS重悬细胞，计数，PBS调整细胞浓度为1×10⁶/100μL，根据要检测的表型，将细胞分装至EP管中，每管100μL细胞，再分别加入5μL的CD73、CD90、CD105、CD34、CD45、HLA-DR流式抗体，4℃避光孵育30min，加入1mL PBS，300g×5min离心洗涤1次，重复清洗1次后，500μL PBS重悬细胞，流式上机检测(图3)。流式检测结果显示，组合2、4、7分离得到的P0代脂肪干细胞的CD73、CD90、CD105阳性率均高于95％，而CD34、CD45、HLA-DR阳性率均低于2％，符合国际细胞治疗协会对MSC的定义和要求，表明本分离方法可以获得满足要求且合格的脂肪干细胞。

实施例5脂肪干细胞的分化功能检测

具体实施例中，取酶消化组合7分离得到且已长满的P0代细胞，用于检测脂肪干细胞的成骨、成脂、成软骨分化能力。

具体操作为：0.05％胰酶消化获得P0代细胞，以1×10⁴/cm²的细胞密度接种于6孔板中，待细胞生长至70％～80％融合时，去除原培养基，分别换成诱导培养基OsteogenesisDifferentiation Medium(成骨)、Adipogenesis Differentiation(成脂)、Chondrogenesis Differentiation Medium(成软骨)，每孔加入1mL诱导培养基，以后每3天换液1次，诱导培养至21天时，分别采用茜素红S染色、油红O染色、Alcian blue染色，检测脂肪干细胞的成骨、成脂、成软骨分化能力。

成骨细胞分化21天后，细胞内出现钙沉积，并被茜素红S染成红色，表面脂肪干细胞具有向成骨细胞分化的能力(图6左)。

成骨细胞分化21天后，细胞内的脂滴被油红O染成红色，表面脂肪干细胞具有向成脂细胞分化的能力(图6中)。

成软骨细胞分化21天后，细胞内的胶原蛋白沉积被Alcian blue染成蓝色，表面脂肪干细胞具有向成软骨细胞分化的能力(图6右)。

此外，应理解，在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所描述的组合物和试剂盒可以做各种修改和变化，只要对于细胞生物学或相关领域的技术人员来说，这种修改是显而易见的，都应属于本发明的保护范围。虽然已经结合具体的优选实施方案描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明技术方案不应该过度限于这些具体实施方案。实际上，对于显而易见的用于实施本发明的所述组分的各种修改均在所附权利要求书的范围内。

Claims

1.一种消化液，其特征在于，所述消化液组分包含：

0.1％～0.5％胶原酶Ⅰ，

0.1％～0.5％DispaseⅡ，

1.5-3％白蛋白，

63.47μg/ml～126.94μg/ml氯化镁，其余为DMEM培养液；

以上为重量百分比浓度。

2.如权利要求1所述消化液，其特征在于，所述胶原酶Ⅰ的浓度为0.1％。

3.如权利要求1所述消化液，其特征在于，所述DispaseⅡ的浓度为0.1％。

4.如权利要求2所述消化液，其特征在于，所述DispaseⅡ的浓度为0.1％。

5.如权利要求2所述消化液，其特征在于，所述白蛋白的浓度为3％。

6.如权利要求4所述消化液，其特征在于，所述白蛋白的浓度为3％。

7.如权利要求1-6任一权利要求所述消化液，其特征在于，所述氯化镁溶液的浓度为63.47μg/ml。

8.如权利要求1-6任一权利要求所述消化液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括步骤：

(1)将适量胶原酶Ⅰ，DispaseⅡ,氯化镁分别完全溶解于生理盐水或DMEM培养液中；

(2)按照所述百分比，将各组分加入适量DMEM培养液中。

9.如权利要求8所述消化液的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)前还有一步骤：

(3)将步骤(1)中溶解的胶原酶Ⅰ，DispaseⅡ按照需要比例混匀，并经0.22μm过滤器过滤。

10.如权利要求1-6任一权利要求所述消化液在培养脂肪干细胞中的应用。