CN115873789A

CN115873789A - 人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基及其应用

Info

Publication number: CN115873789A
Application number: CN202310037633.9A
Authority: CN
Inventors: 徐道俊; 吴茂友; 古松海; 赵琼英; 周巧; 李美玲
Original assignee: Saidete Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Saidete Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2023-01-09
Filing date: 2023-01-09
Publication date: 2023-03-31

Abstract

本发明提供了一种人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基及其应用。本发明提供一种用于人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养的培养基组合物，所述培养基组合物的组成包括：基础培养基、诱导因子和添加因子；其中基础培养基的组成包括：青霉素、链霉素、谷氨酰胺、胎牛血清FBS和DMEM低糖培养基；所述DMEM低糖培养基的含糖量为1000mg/L以下；诱导因子包括：地塞米松、3‑异丁基‑1‑甲基黄嘌呤、吲哚美辛和胰岛素；添加因子为：硫酸锌。本发明向经典成脂诱导分化完全培养基中添加一定量的七水硫酸锌，所得诱导分化培养基可以显著增加脂细胞的分化数量。

Description

人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基及其应用

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，具体是关于人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基及其应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是在正常组织中发现的一种多能祖细胞，因其具有独特的自我更新能力和分化成脂肪细胞、骨细胞、心肌细胞、神经元细胞等组织特异性细胞的潜能，广泛用于再生医学研究，MSCs在组织损伤修复、缺血性心肌病、急性心肌梗死、肝纤维化等疾病治疗中发挥着重要作用。目前，面临的主要挑战是实现MSCs的大量来源及保证安全性，MSCs定义的主要特征是它的自我更新潜力、表面标记的表达以及多谱系分化能力，因此，向成脂肪细胞分化是鉴别MSCs不可少的部分。此外，MSCs的脂肪分化在再生医学研究中具有重要意义。从临床的角度来看，外科医生面临着患者软组织吸收重建的挑战。例如，烧伤患者经常遭受软组织萎缩问题。利用MSCs分化成脂肪细胞，能很好的重建患者不足的脂肪组织。

人脐带来源间充质干细胞(human umbilical cordblood-derived stem cells，hUCBMSCs)是一类含量丰富的多能干细胞，能从产后废弃的脐带中获取、不会使供体受到损伤，患者容易接受，且低免疫原性不会引起排斥反应、无社会伦理问题等使得人脐带来源的间充质干细胞较其他成体干细胞更具有临床应用价值，因此，hUCBMSCs将会成为组织修复、整形治疗中极具优势的种子细胞。

hUCBMSCs能定向成脂肪细胞分化，这主要与PPARγ和C/EBP的表达变化有关，这两个因子都是调节MSCs细胞向脂肪细胞分化的关键因子。传统的体外培养MSCs向成脂细胞分化的方法就是通过添加生长因子促进PPARγ和C/EBP的表达，从而增强干细胞成脂分化能力。如高浓度地塞米松(dexamethasone，Dex)能够促进脂肪生成，同时抑制成骨分化；3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)调节C/EBPβ，单独或与DEX联合调节PPARγ活性；胰岛素广泛用于诱导前脂肪细胞的增殖和分化；TGF-β能够抑制前脂肪细胞系中的脂肪生成，当TGF-β过表达时降低了体内脂肪细胞的分化。趋化因子CXCL3通过诱导C/EBPb和C/EBPd以自分泌或旁分泌的方式促进脂肪生成。但是传统的诱导hUCBMSCs成脂分化的效果一般，诱导出的脂肪粒较少，这不利于hUCBMSCs成脂分化的临床研究，寻找一种新的诱导方法，诱导hUCBMSCs更好的向脂肪细胞分化迫在眉睫。

发明内容

本发明提供人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基、制备方法及其应用。

本发明第一方面提供一种用于人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养的培养基组合物，所述培养基组合物的组成包括：基础培养基、诱导因子和添加因子；

其中基础培养基的组成包括：青霉素、链霉素、谷氨酰胺、胎牛血清FBS和DMEM低糖培养基；所述DMEM低糖培养基的含糖量为1000mg/L以下；

诱导因子包括：地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛和胰岛素；

添加因子为：硫酸锌。

根据本发明的具体实施方案，所述青霉素、链霉素、胎牛血清FBS以及谷氨酰胺在基础培养基中的用量分别为：

青霉素：90-110U/ml，链霉素：90-110μg/ml，FBS:总体积的10％，谷氨酰胺：1-3mM/L；优选为：青霉素：100U/ml，链霉素：100μg/ml，谷氨酰胺：2mM/L。

根据本发明的具体实施方案，所述地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛和胰岛素在用于人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养的培养基中的用量分别为：

地塞米松：0.5-1.5μmol/L，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤：0.3-0.7mmol/L，吲哚美辛：180-220μmol/L，胰岛素：8-12μg/ml；优选为：地塞米松：1μmol/L，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤：0.5mmol/L，吲哚美辛：200μmol/L，胰岛素：10μg/ml。

根据本发明的具体实施方案，所述硫酸锌可以包括硫酸锌的水合物；优选地，所述硫酸锌包括一水硫酸锌、六水硫酸锌和七水硫酸锌；更优选为七水硫酸锌。

根据本发明的具体实施方案，所述添加因子为七水硫酸锌；

优选地，所述添加因子在用于人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养的培养基中的用量为0.060-0.068mmol/L；更优选为0.064mmol/L。

本发明的培养基除特别注明外，余量组分为水。

本发明第二方面提供一种配制含有所述的人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基组合物的培养基的方法，该方法包括：

向低糖DMEM培养基中加入胎牛血清FBS、青霉素、链霉素和谷氨酰胺，混合均匀；

向添加胎牛血清FBS、青霉素、链霉素和谷氨酰胺的低糖DMEM培养基中加入地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛和胰岛素，混匀，得到混合培养基；

在混合培养基中加入硫酸锌并混匀，得到人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基；

本配制方法中，涉及到的各组分的用量如前面所述；

优选地，所述方法包括：

向低糖DMEM培养基中加入10％比例的胎牛血清FBS、100U/ml的青霉素、100μg/ml的链霉素和2mM/L的谷氨酰胺，混合均匀；

向添加胎牛血清FBS、青霉素、链霉素和谷氨酰胺的低糖DMEM培养基中加入1μmol/L的地塞米松、0.5mmol/L的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、200μmol/L的吲哚美辛和10μg/ml的胰岛素，混匀，得到混合培养基；

在混合培养基中加入0.064mmol/L的硫酸锌并混匀，得到人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基。

本发明的配制方法优选在无菌环境下进行操作。

为证明本发明提供培养基适用于该干细胞的定向分化诱导，配制的培养基根据实验需要设置10个不同分组，并记为A-F5，每一个组别，用相对应的培养基对人脐带间充质干细胞进行诱导分化培养，培养到21-28天时用油红O染色液对其进行染色，并在荧光倒置显微镜下观察不同组分培养基对人脐带间充质干细胞成脂诱导分化的分化程度。该方法操作简单，能从直观上得到不同诱导组的诱导结果图，并通过对比得到最优的培养基组合方案。

本发明第三方面提供一种人脐带间充质干细胞体外成脂诱导分化的方法，该方法包括：

将人脐带间充质干细胞接种于由所述的培养基组合物配制的培养基中并进行诱导培养，得到成脂细胞。

根据本发明的具体实施方案，所述方法还包括人脐带间充质干细胞的体外分离、培养和确认过程：

1)进行人脐带间充质干细胞的体外分离及培养；

具体地，取来自18-26周岁、健康、首次妊娠、夫妻两家均无遗传病史以及大病史、剖腹产的孕妇的脐带，无菌条件下分离脐带华通氏胶，用无血清无酚红间充质干细胞培养基培养扩增人脐带间充质干细胞，待细胞长出并增值一定数量后用重组胰酶消化细胞，并进行多次传代培养，直至传代培养到P10代；

2)采用流式细胞技术鉴定细胞表面抗原：取传代培养的人脐带间充质干细胞，对其进行表面抗体标记，通过流式细胞技术确定标记抗体所占的比例，以对人脐带间充质干细胞进行确认。具体地，所述表面抗体标记位点为CD90、CD105、CD73、CD34、CD19、CD45、CD11b和HLA-DR。

本发明中细胞的培养条件为37℃、5％CO₂。

本发明从新生儿脐带中分离培养得人脐带间充质干细胞，并通过流式细胞技术鉴定培养得到的间充质干细胞纯度，通过流式细胞技术鉴定后的细胞具有更高的纯度且对后续分化结果具有更高的可靠性及准确度。

根据本发明的具体实施方案，所述方法还包括人脐带间充质干细胞的预处理的过程；

其中，对人脐带间充质干细胞进行预处理的过程包括：将传代培养至P3-P6代的人脐带间充质干细胞融合度达到80-90％时，用胰酶进行消化处理，清洗，离心，弃上清，再将沉淀重悬，得到预处理好的人脐带间充质干细胞；优选地，所述清洗和重悬时采用人脐带间充质干细胞培养基；

预处理后的培养：将预处理好的人脐带间充质干细胞接种在人脐带间充质干细胞培养基中，继续培养。

预处理过程中所用的人脐带间充质干细胞培养基为可商购来源；预处理后的培养过程中所用的培养基为可商购来源。优选地，预处理及预处理后的培养过程中所用到的人脐带间充质干细胞培养基的组分包括：人脐带间充质干细胞基础培养基和添加因子；其中：

人脐带间充质干细胞基础培养基包括：重组人血白蛋白、非必需氨基酸、丙酮酸钠、硫辛酸、维生素B₁₂、生物素和抗坏血酸；

添加因子为：胎牛血清FBS。

上述人脐带间充质干细胞培养基的组分中，各组分用量在本领域的常规用量范围内即可。

根据本发明的具体实施方案，接种在人脐带间充质干细胞培养基中继续培养到间充质干细胞的融合度达到100％时，将培养基更换为以所述的成脂诱导分化培养基组合物配制的培养基，继续培养，完成人脐带间充质干细胞的成脂诱导分化；

优选地，更换为成脂诱导分化培养基后培养时，每隔3-4天更换新鲜的成脂诱导分化培养基；

优选地，诱导分化的周期为18-21天，诱导分化完成后得到成脂细胞。

本发明第四方面提供一种成脂细胞，所述成脂细胞是采用由所述的培养基组合物配制得到的培养基诱导分化间充质干细胞而得到的；或者，所述成脂细胞是由所述人脐带间充质干细胞体外成脂诱导分化的方法制备得到的。

本发明的有益效果：

1)本发明提供的人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基，通过重新组合培养基配方、添加硫酸锌，得到的成脂诱导分化培养基培养出的成脂细胞中脂肪粒更多，分化效果更好。

2)本发明为提高人脐带间充质干细胞向成脂细胞分化提供了一种新的方法，该方法不仅使得人脐带间充质干细胞向成脂细胞分化的程度更高并且可量化，而且操作简单，实验材料及结果容易获得。

3)本发明为人脐带间充质干细胞用于组织修复、整形治疗等临床应用提供了更好的参考。

附图说明

图1是本发明从人脐带中分离培养得到的间充质干细胞结果图。

图2为流式细胞技术鉴定的从脐带分离出的间充质干细胞表面标记物结果图。

图3为人脐带间充质干细胞成脂诱导分化油红O染色结果图；图3中A为基础培养基培养的人脐带间充质干细胞阴性对照组；图3中B为经典成脂诱导培养基诱导组；图3中C-E为商业化培养基诱导组；图3中F1-F5为含锌诱导组。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

为了实现本发明的目的，本发明从人脐带中分离培养得到间充质干细胞，通过流式细胞技术鉴定人脐带间充质干细胞表面抗原以确定其为间充质干细胞，然后通过配制不同组分成脂分化培养基对人脐带间充质干细胞进行成脂诱导分化培养，通过比较不同培养基对人脐带间充质干细胞的成脂诱导分化情况，确定培养基的最优组合及制备方法。

实施例1：人脐带间充质干细胞的分离及培养。

将采集的新鲜脐带置于145培养皿中，用PBS清洗除去脐带表面的血渍，将脐带放入含1％双抗(青霉素和链霉素)的PBS中浸泡10min，用镊子顺着脐带轻轻刮动除去脐带里面的血块；将脐带浸泡于PBS中，用剪刀剪成2cm左右的小段，顺着静脉一边将脐带剪开，用镊子剥离里面的静脉和动脉，随后将华通氏胶分离出来，置于一个新的含有少量PBS的培养皿中；将华通氏胶剪碎成1mm大小的组织，用少量的间充质干细胞完全培养基重悬后平铺于T75培养瓶中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养；培养2天后添加5ml完全培养基，期间持续观察，待有细胞长出后继续添加5ml完全培养基，直至细胞足够传代；倒掉培养上清，用PBS清洗细胞表面1次，尽可能除去组织块，加入4ml重组胰酶置于37℃消化4min，然后加入5ml完全培养基终止消化，收集细胞，同时用PBS清洗1次继续收集细胞，将收集的细胞悬液过70μm细胞筛网，收集滤液400×g/min、20℃离心5min，弃上清，将细胞用完全培养基重悬后取100μl用台盼蓝染色法进行计数，按8000个/cm²密度接种于T75培养瓶置于37℃、5％CO₂培养箱中培养，待细胞汇合度达到90％左右时用胰酶将细胞消化并进行传代培养，按照相同的传代方式将细胞传至P10代。

图1显示了本实施例中人脐带间充质干细胞P2、P4、P5和P10代结果。可以看出，本实施例成功从人脐带中分离培养得到间充质干细胞，并进行多次传代培养得到不同代次的细胞，且该细胞在培养过程中生长状况良好，成规则的梭形结构。

实施例2：流式细胞技术鉴定从人脐带中分离得到的间充质干细胞表面抗原。

选取P5代细胞，用胰酶进行消化后制成细胞悬液，取100μl用台盼蓝染色法进行细胞计数。用PBS清洗细胞悬液两次，1500rpm离心5分钟，弃上清。用PBS重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至1×10⁷个/ml，并用200目70um的细胞筛过滤除去未消化充分的细胞团块。

取8支2ml离心管，分别标记1-8号，往每支离心管中加入100μl过滤好的细胞悬液。并按照表1所示加入人脐带间充质干细胞流式检测试剂盒中(BD)的相应组分进行抗体标记。

表1.人脐带间充质干细胞表面抗体标记

将各管组分混合均匀后，避光2-8℃孵育30min。孵育结束用PBS清洗两次，1500rpm离心5分钟，弃上清。再用500μl PBS重悬细胞沉淀，随后用BD Accuri C6流式细胞仪进行上样检测。

上样前打开BD Accuri C6 Plus软件，并温和的重悬流式管中的细胞，将样品管放在上样针处。根据细胞光散射特性设门，门内收集至少20000个细胞。

1-4号单染管作为调节流式细胞仪各通道阈值和补偿及阴阳性界定参考，5号为空白对照调节细胞、仪器背景，6为阳性阴性同型抗体对照，确定荧光抗体非特异性信号及阴阳性界定参考,7号和8号为供试品检测管。

样品上样结束后，对上样结果进行分析，根据所汇门创建散点图及直方图，计算阳性细胞所占百分数及阴性细胞所占百分数。

图2显示了本实施例中人脐带间充质干细胞表面标记物流式检测结果。从图中可知，该细胞中含有间充质干细胞的特异性抗原标记物CD90、CD105和CD73，且不含有CD34、CD19、CD45、CD11b和HLA-DR等标记物，可以确认其是间充质干细胞。

实施例3：人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养

本实施例提供不同组分的诱导分化培养基。

配制不同组分的成脂细胞诱导分化培养基。根据实验需要，设置了A-F5共10组含有不同组分的培养基配制方法。其中A组为阴性对照组，B组为经典成脂诱导分化完全培养基组，C-E组为商业化成脂诱导培养基组，F1-F5组为本发明提供的培养基作为实验组(七水硫酸锌诱导组)。设置了F1、F2、F3、F4、F5共5组。F1-F5组成分除七水硫酸锌含量不同外，其余成分含量均相同，F1-F5各组七水硫酸锌的含量分别为：F1组所含七水硫酸锌为0.060mmol/L、F2组为0.062mmol/L、F3组为0.064mmol/L、F4组为0.066mmol/L、F5组为0.068mmol/L。具体各组培养基的成分及配制方法如下：

(1)A组为阴性对照组(基础培养基组)，其组分如表2所示：

表2.基础培养基

成分	用量
		胎牛血清(FBS)	5％
青霉素	100U/ml
		链霉素	100ug/ml
谷氨酰胺	2mM/L
		低糖DMEM培养基	45ml

无菌环境下进行操作。将80万单位的青霉素粉末溶于2ml生理盐水中，并分装保存于-20℃。称取1g链霉素粉末溶于4ml生理盐水中，分装后保存于-20℃。吸取45ml低糖DMEM培养基于50ml离心管中，随后按照表2所示加入相应比例的FBS、双抗和谷氨酰胺，用移液枪吹打混匀后备用。

(2)B组为经典成脂诱导分化完全培养基组，其组分如表3所示：

表3.经典成软骨诱导分化完全培养基

成分	用量
		胎牛血清(FBS)	5％
青霉素	100U/ml
		链霉素	100ug/ml
谷氨酰胺	2mM/L
		低糖DMEM培养基	45ml
地塞米松	1μmol/L
		3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	0.5mmol/L
吲哚美辛	200μmol/L
		胰岛素	10μg/ml

无菌环境下进行操作。先配制基础培养基，随后往里加入相应比例的地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛和胰岛素，用移液枪吹打混匀后备用。

(3)C-E组为商业化成脂诱导培养基培养组。其中

C组：为从promcell购买的试剂盒配制的成脂诱导培养基组(所得结果如图3中C)；

D组：为从sciencell购买的试剂盒配制的成脂诱导培养基组(所得结果如图3中D)；

E组：为从赛业生物购买的试剂盒配制的成脂诱导培养基组(所得结果如图3中E)。

C-E组分别按照对应试剂盒说明书操作方法，配制商业化成脂细胞分化培养基。

(4)F组为本次实验的实验组(含锌组)。F1其组分如表4所示：

表4.实验组F1培养基

成分	用量
		胎牛血清(FBS)	5％
青霉素	100U/ml
		链霉素	100ug/ml
谷氨酰胺	2mM/L
		低糖DMEM培养基	45ml
地塞米松	1μmol/L
		3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	0.5mmol/L
吲哚美辛	200μmol/L
		胰岛素	10μg/ml
七水硫酸锌	0.060mmol/L

F2组为本次实验的实验组(含锌组)。其组分如表5所示：

表5.实验组F2培养基

成分	用量
		胎牛血清(FBS)	5％
青霉素	100U/ml
		链霉素	100ug/ml
谷氨酰胺	2mM/L
		低糖DMEM培养基	45ml
地塞米松	1μmol/L
		3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	0.5mmol/L
吲哚美辛	200μmol/L
		胰岛素	10μg/ml
七水硫酸锌	0.062mmol/L

F3组为本次实验的实验组(含锌组)。其组分如表6所示：

表6.实验组F3培养基

成分	用量
		胎牛血清(FBS)	5％
青霉素	100U/ml
		链霉素	100ug/ml
谷氨酰胺	2mM/L
		低糖DMEM培养基	45ml
地塞米松	1μmol/L
		3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	0.5mmol/L
吲哚美辛	200μmol/L
		胰岛素	10μg/ml
七水硫酸锌	0.064mmol/L

F4组为本次实验的实验组(含锌组)。其组分如表7所示：

表7.实验组F4培养基

成分	用量
		胎牛血清(FBS)	5％
青霉素	100U/ml
		链霉素	100ug/ml
谷氨酰胺	2mM/L
		低糖DMEM培养基	45ml
地塞米松	1μmol/L
		3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	0.5mmol/L
吲哚美辛	200μmol/L
		胰岛素	10μg/ml
七水硫酸锌	0.066mmol/L

F5组为本次实验的实验组(含锌组)。其组分如表8所示：

表8.实验组F5培养基

成分	用量
		胎牛血清(FBS)	5％
青霉素	100U/ml
		链霉素	100ug/ml
谷氨酰胺	2mM/L
		低糖DMEM培养基	45ml
地塞米松	1μmol/L
		3-异丁基-1-甲基黄嘌呤	0.5mmol/L
吲哚美辛	200μmol/L
		胰岛素	10μg/ml
七水硫酸锌	0.068mmol/L

F1-F5组为本实施例中实验组，其培养基配制方法为：先配置经典成脂诱导分化完全培养基，按照B组配制方法进行配制。最后再分别加入0.060mmol/L、0.068mmol/L0.062mmol/L、0.064mmol/L、0.066mmol/L、0.068mmol/L的七水硫酸锌，并用移液枪将组分混匀后备用。

实施例4：不同培养基对人脐带间充质干细胞进行成脂细胞诱导分化

本实施例提供成脂诱导分化结束后，采用油红O染色液进行染色的方法。

(1)为避免诱导过程人脐带间充质干细胞出现漂浮现象，在对细胞进行诱导培养前需对六孔板进行明胶包被。加2ml 0.1％明胶到六孔板中，摇匀液体使其覆盖整个六孔板底部后，放置在超净台30min，然后弃去明胶，晾干后备用。

(2)成脂细胞诱导分化。传代培养至P5代的人脐带间充质干细胞融合度达到80-90％时，用胰酶进行消化处理，用间充质干细胞培养基清洗两遍，1500rpm离心5分钟，弃上清。再用间充质干细胞培养基将沉淀重悬，取100μl用台盼蓝染色法进行细胞计数；

设置A-F5共十组分组，每个分组分别设置三个生物学重复。将处理好的人脐带间充质干细胞按照1×10⁵cells/孔的细胞密度接种在六孔板中，向孔内加入2ml间充质干细胞培养基。于37℃，5％CO₂的培养箱中培养；

当细胞融合度达到100％时，小心将孔内培养基吸走，在A组孔中加入2ml基础培养基，在B组孔中加入2ml经典成脂诱导分化培养基，在C组孔中加入promcell成脂诱导试剂盒配制的培养基，在D组孔中加入sciencell成脂诱导试剂盒配制的培养基，在E组孔中加入赛业生物成脂诱导试剂盒配制的培养基，在F-F5组孔中加入添加了七水硫酸锌的成脂诱导分化完全培养基。其中A组作为阴性对照组，其余各组均为样品组。将六孔板置于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。每隔3-4天换预热至37℃的各组所对应的培养基。诱导18-21天后，视细胞的形态变化及生长情况，用油红O进行染色。

实施例5：油红O染色鉴定

油红O染色液进行染色步骤如下：

(1)按油红O贮存液:蒸馏水＝3:2的比例，配制油红O染色液，混匀后用中性滤纸过滤备用。

(2)成脂诱导分化结束后，吸走六孔板中的培养基，用1×PBS冲洗2次。每孔加入2ml4％中性甲醛溶液，固定30min。吸走中性甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次。每孔中加入1ml油红O染料工作液染色30min吸走油红O染液，用1×PBS冲洗2次。

(3)将可计数六孔板置于显微镜下观察成脂染色效果。

实施例6

本实施例提供实施例3中不同组分培养基诱导分化制得的成脂细胞的染色结果。

染色后的成脂细胞通过可计数的六孔细胞培养板，在倒置显微镜或正置显微镜下观察成脂染色效果并进行计数。

(1)成脂染色结果

图3显示了本实施例中各组人脐带间充质干细胞成脂诱导分化结果，由图中结果可知，除普通培养基组培养的人脐带间充质干细胞不能分化出成脂细胞外，其余几组均能使人脐带间充质干细胞分化为成脂细胞，但是分化程度各不相同。

(2)成脂细胞的计数结果

进行2个区域左上、右上、左下、右下，共8大格脂细胞的计数，并取平均数。各组的计数结果如表9所示。

表9.通过可计数的六孔细胞培养板对成脂细胞的计数结果

组别	A	B	C	D	E	F1	F2	F3	F4	F5
											成脂细胞数量(个/平方毫米)	0	42	58	47	42	62	132	237	159	141

通过可计数六孔板计数，其中经典诱导培养基诱导组和商业化培养基诱导组相比，诱导程度相当；含锌组诱导效果最好。通过表9中的计数结果可知，F1比经典培养基诱导组分化的成脂细胞多了约0.5倍。F2比经典培养基诱导组分化的成脂细胞多了约3倍。F3比经典培养基诱导组分化的成脂细胞多了约5倍。F4比经典培养基诱导组分化的成脂细胞多了约4倍。F5比经典培养基诱导组分化的成脂细胞多了约3.5倍。从数值上看好于其他任何一组诱导的情况。这之中，F3组又比其余组分化的最好。

综上可知，添加了0.064mmol/L七水硫酸锌培养基培养的人脐带间充质干细胞向成脂细胞分化最好。比经典培养基诱导组分化的成脂细胞多了约5倍。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养的培养基组合物，所述培养基组合物的组成包括：基础培养基、诱导因子和添加因子；

添加因子为：硫酸锌。

2.根据权利要求1所述的培养基组合物，其中，所述青霉素、链霉素、胎牛血清FBS以及谷氨酰胺在基础培养基中的用量分别为：

青霉素：90-110U/ml，链霉素：90-110μg/ml，胎牛血清FBS:总体积的10％，谷氨酰胺：1-3mM/L；优选为：青霉素：100U/ml，链霉素：100μg/ml，谷氨酰胺：2mM/L。

3.根据权利要求1或2所述的培养基组合物，其中，所述地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤、吲哚美辛和胰岛素在用于人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养的培养基中的用量分别为：

4.根据权利要求1-3中任一项所述的培养基组合物，其中，所述添加因子为七水硫酸锌；

5.一种配制含有权利要求1～4中任一项所述的人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基组合物的培养基的方法，该方法包括：

在混合培养基中加入硫酸锌并混匀，得到人脐带间充质干细胞成脂诱导分化培养基。

6.一种人脐带间充质干细胞体外成脂诱导分化的方法，该方法包括：

将人脐带间充质干细胞接种于由权利要求1-4中任一项所述的培养基组合物配制的培养基中并进行诱导培养，得到成脂细胞。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述方法还包括人脐带间充质干细胞的体外分离、培养和确认过程：

进行人脐带间充质干细胞的体外分离及培养；

采用流式细胞技术鉴定细胞表面抗原：取传代培养的人脐带间充质干细胞，对其进行表面抗体标记，通过流式细胞技术确定标记抗体所占的比例，以对人脐带间充质干细胞进行确认。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述方法还包括人脐带间充质干细胞的预处理的过程；

其中，对人脐带间充质干细胞进行预处理的过程包括：将传代培养至P3-P6代的人脐带间充质干细胞融合度达到80-90％时，用胰酶进行消化处理，清洗，离心，弃上清，再将沉淀重悬，得到预处理好的人脐带间充质干细胞；

9.根据权利要求8所述的方法，其中，接种在人脐带间充质干细胞培养基中继续培养到细胞融合度达到100％时，将培养基更换为权利要求1～4任一项所述的成脂诱导分化培养基组合物配制的培养基，继续培养；

10.一种成脂细胞，所述成脂细胞是采用由权利要求1-4任一项所述的培养基组合物配制得到的培养基诱导分化间充质干细胞而得到的；或者，所述成脂细胞是由权利要求6-9任一项所述的方法制备得到的。