CN115786252A - 人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其应用，属于干细胞技术领域。本发明提供一种用于人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养的培养基组合物，所述培养基组合物的组成包括：基础培养基、诱导因子和添加因子；其中：基础培养基包括：胎牛血清FBS、青霉素、链霉素和无血清无酚红间充质干细胞培养基；诱导因子包括：地塞米松、β‑甘油磷酸钠、维生素C；添加因子包括：17β‑雌二醇和补骨脂素。本发明的培养基可用于人脐带间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的培养，可缩短人脐带间充质干细胞分化为成骨细胞的培养时间，增加成骨细胞分化数量。

Description

人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其应用

技术领域

本发明属于干细胞技术领域，具体是关于一种人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其应用。

背景技术

骨缺损、骨关节炎、骨坏死等是临床上常见的骨病病症，通过自体骨移植、异体骨移植、人工骨替代品移植是骨病治疗的主要手段，但是这些方法均有局限性，导致临床效果不佳。自体骨取骨量有限且创伤较大，容易导致术后感染和并发症。异体骨移植虽来源不受限，但是具有潜在的免疫应答风险，引起免疫排斥的可能性极大，大大降低了骨移植的成功率。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种多能干细胞，可定向分化成骨骼肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。它很少表达主要组织相容性复合体Ⅱ(MHC-Ⅱ)和共刺激分子，因此可不被免疫系统识别，具有免疫特赦特点可成功进行同种异体或异种异体移植。同时间充质干细胞具有分化能力强、来源广泛、方便获取等优点，在治疗骨骼肌损伤中具有非常重要的临床应用价值。因其以上优点，间充质干细胞近几年来已经成为医学界用于治疗骨病研究的热点。

间充质干细胞一般来源于胎盘、脂肪、牙髓、骨髓以及脐带和胎儿内脏等器官组织。且各有其功能特点,如骨髓来源MSCs具有较强的分化潜能，脂肪来源MSCs在传代培养后可以分化成不同的群落，脐带来源MSCs治疗骨折后不愈合具有非常好的效果。其中，人脐带间充质干细胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）较于易受供体的年龄因素影响的骨髓间充质干细胞和易受到医学伦理限制的胎儿来源的间充质干细胞而言，具有增殖效率高、供体广泛、病毒感染率低等优点，这可能是临床用于骨病治疗的更好选择。

体外诱导MSCs进行成骨分化，是MSCs用于骨病治疗研究的第一步。MSCs在体外成骨分化很大程度上依赖于成骨诱导培养基，其基本辅料包括地塞米松（dexamethasone，Dex）、β－甘油磷酸钠（β-sodium glycerophosphate,β-GP）和维生素C（vitamin,Vit C）。Dex可有效增强骨形态蛋白－2（BMP－2）的成骨能力，诱导骨髓间充质干细胞（bone marrowderived mesenchymal stemcells, BMSCs）选择性增殖，刺激核心结合因子α1（RUNX2）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、骨桥蛋白（osteopontin, OPN）和骨钙素（osteocalcin,OCN）的表达，增加ALP的mRNA表达水平。β－GP作为羟基磷灰石中磷酸盐的来源，提供磷离子，诱导激活ALP，并影响细胞内信号分子。Vit C是胶原脯氨酰羟化酶的辅助因子，调控细胞外基质胶原稳态，并增强DNA活性，促进细胞分化。在此培养基的基础上进行其他组分的添加，或许可以更好的增强MSCs的成骨分化能力。

已有大量研究通过组合不同组分配制成骨诱导培养基，用于不同种类干细胞的成骨分化研究，并取得了不同的成效。一项研究中通过将莪术内酯A、莪术双环烯酮、表玫瑰萜醛D添加到成骨诱导基础培养基中配成成骨分化培养基，增强了骨髓间充质干细胞的成骨分化能力；另一项研究中，在培养基中添加氨甲环酸、G-CSF、10～20ng/mlEGF、抗坏血酸、地塞米松和β-甘油磷酸钠这几种成分，制备成骨诱导分化培养基，此培养基能使骨髓间充质干细胞迅速生长，且诱导出的骨钙素含量较高；还有研究表明，在成骨诱导基础培养基中添加胰岛素生长因子能促进成骨细胞增殖，从而提高人间充质干细胞成骨分化效率及特异性。

发明内容

本发明提供一种人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基及其应用。

本发明第一方面提供一种用于人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养的培养基组合物，所述培养基组合物的组成包括：基础培养基、诱导因子和添加因子；其中：

基础培养基包括：胎牛血清FBS、青霉素、链霉素和无血清无酚红间充质干细胞培养基；

诱导因子包括：地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C；

添加因子包括：17β-雌二醇和补骨脂素。

根据本发明的具体实施方案，所述青霉素、链霉素和胎牛血清FBS在基础培养基中的用量分别为：

青霉素：90-110U/ml，链霉素：90-110μg/ml，胎牛血清FBS:总体积的10%；优选地，青霉素：100U/ml，链霉素：100μg/ml。

根据本发明的具体实施方案，所述地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C在用于人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养的培养基中的用量为：

地塞米松：0.05-0.3μmol/L，β-甘油磷酸钠：8-12mmol/L，维生素C：20-60μmol/L；优选地，地塞米松：0.2μmol/L，β-甘油磷酸钠：10mmol/L，维生素C：50μmol/L；

根据本发明的具体实施方案，所述培养基组合物的组成还包括抗坏血酸钠；所述抗坏血酸钠在用于人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养的培养基中的用量为：40-60mg/L；优选为50mg/L。

根据本发明的具体实施方案，所述17β-雌二醇和补骨脂素在用于人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养的培养基中的用量为：

17β-雌二醇：0.0005-0.0015nmol/L，优选为0.001nmol/L；补骨脂素：0.0005-0.0015nmol/L，优选为0.001nmol/L。

本发明的培养基除特别注明外，余量组分为水。

本发明第二方面提供一种配制含有所述的人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基组合物的培养基的方法，所述方法包括：

向无血清无酚红间充质干细胞培养基中分别加入胎牛血清FBS、青霉素和链霉素，混均；本配制方法中，涉及到的各组分的用量如前面所述；优选地，胎牛血清FBS：总体积的10%，青霉素：100U/ml，链霉素：100μg/ml；

向添加胎牛血清FBS、青霉素和链霉素的无血清无酚红间充质干细胞培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C，混匀，得到混合培养基；任选地，同时添加抗坏血酸钠；本配制方法中，涉及到的各组分的用量如前面所述；优选地，地塞米松：0.2μmol/L，β-甘油磷酸钠：10mmol/L，维生素C：50μmol/L；优选地，所述培养基还包括抗坏血酸钠；优选地，所述抗坏血酸钠的用量为50mg/L。

向混合培养基中加入17β-雌二醇和补骨脂素并混匀，得到人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基；本配制方法中，涉及到的各组分的用量如前面所述；优选地，17β-雌二醇：0.001nmol/L；补骨脂素：0.001nmol/L。

本发明的配制方法优选在无菌环境下进行操作。

为证明本发明提供培养基适用于该干细胞的定向分化诱导，配制成的培养基根据实验需要设置10个不同分组，并记为A-F5，每一个组别，用相对应的培养基对人脐带间充质干细胞进行培养，培养到21-28天时用茜素红染色液对其进行染色，并在显微镜下观察不同组分对人脐带间充质干细胞成骨诱导分化的分化程度。该方法操作简单，能从直观上得到不同诱导组的诱导结果图，并通过对比得到最优的培养基组合方案。

本发明第三方面提供一种人脐带间充质干细胞体外成骨诱导分化的方法，该方法包括：将人脐带间充质干细胞接种于由所述的培养基组合物配制的培养基中并进行诱导培养，得到成骨细胞。

根据本发明的具体实施方案，所述方法还包括人脐带间充质干细胞的体外分离、培养和确认过程：

进行人脐带间充质干细胞的体外分离及培养；

具体地，取来自18-26周岁、健康、首次妊娠、夫妻两家均无遗传病史以及大病史、剖腹产的孕妇的脐带，无菌条件下分离脐带华通氏胶，用无血清无酚红间充质干细胞培养基培养扩增人脐带间充质干细胞，待细胞长出并增值一定数量后用重组胰酶消化细胞，并进行传代培养；

采用流式细胞技术鉴定细胞表面抗原：取传代培养的人脐带间充质干细胞，对其进行表面抗体（CD90、CD105、CD73、CD34、CD19、CD45、CD11b和HLA-DR）标记，通过流式细胞技术确定标记抗体所占的比例，以对人脐带间充质干细胞进行确认。

根据本发明的具体实施方案，所述方法还包括人脐带间充质干细胞的预处理的过程；

其中，对人脐带间充质干细胞进行预处理的过程包括：将传代培养至P3-P6代的人脐带间充质干细胞融合度达到80-90%时，用胰酶进行消化处理，清洗，离心，弃上清，再将沉淀重悬，得到预处理好的人脐带间充质干细胞；优选地，所述清洗和重悬时采用人脐带间充质干细胞培养基；

预处理后的培养：将预处理好的人脐带间充质干细胞接种在人脐带间充质干细胞培养基中，继续培养。

预处理过程中所用的人脐带间充质干细胞培养基为可商购来源；预处理后的培养过程中所用的培养基为可商购来源。优选地，预处理及预处理后的培养过程中所用到的人脐带间充质干细胞培养基的组分包括：人脐带间充质干细胞基础培养基和添加因子；

其中：

人脐带间充质干细胞基础培养基包括：重组人血白蛋白、非必需氨基酸、丙酮酸钠、硫辛酸、维生素B₁₂、生物素和抗坏血酸钠；

添加因子为：血小板裂解物、生长因子，粘附因子，荷尔蒙，结合蛋白，维生素，微量矿物元素。

上述人脐带间充质干细胞培养基的组分中，各组分用量在本领域的常规用量范围内即可。

根据本发明的具体实施方案，接种在人脐带间充质干细胞培养基中继续培养到细胞融合度达到60-70%时，将培养基更换为以所述的成骨诱导分化培养基组合物配制的培养基，继续培养。

本发明中细胞的培养条件为37℃、5%CO₂。

根据本发明的具体实施方案，更换为所述培养基组合物配制的培养基后培养时，每隔2天更换新鲜的所述培养基组合物配制的培养基；

优选地，诱导分化周期为14-28天，诱导分化完成后得到成骨细胞。

本发明第四方面提供一种成骨细胞，所述成骨细胞是采用由所述的培养基组合物配制得到的培养基诱导分化间充质干细胞而得到的；或者，所述成骨细胞是由所述的诱导分化的方法制备得到的。

本发明的有益效果：

1）本发明通过在成骨诱导基础培养基中添加17β-雌二醇和补骨脂素，制备成骨诱导完全培养基，与其他成品培养基进行比较，结果显示本发明提供的培养基具有更好的诱导分化效果，干细胞的诱导成骨细胞分化时间更短，成骨分化程度更大。

2）本发明为提高人脐带间充质干细胞向成骨细胞分化提供了一种新的方法，该方法使得人脐带间充质干细胞向成骨分化的程度更高，分化为成骨细胞的时间更短，而且操作简单，实验材料及结果容易获得。

附图说明

图1是本发明从人脐带中分离培养得到的人脐带间充质干细胞结果图；图1中A为人脐带间充质干细胞P2代结果；图1中B为人脐带间充质干细胞P4代结果；图1中C为人脐带间充质干细胞P5代结果；图1中D为人脐带间充质干细胞P10代结果。

图2为流式细胞技术鉴定从脐带分离出的间充质干细胞表面标记物结果图。

图3是人脐带间充质干细胞成骨诱导分化茜素红染色结果；图3中A为普通培养基培养的人脐带间充质干细胞阴性对照组；图3中B为经典成骨诱导培养基诱导组；图3中C-E为商业化培养基诱导组；图3中F1-F5为17B-雌二醇和补骨脂素诱导组。

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

本发明通过体外分离培养得到人脐带间充质干细胞，通过流式细胞技术鉴定细胞表面抗原以确定其纯度，然后通过配制不同成骨分化培养基对人脐带间充质干细胞进行成骨诱导分化培养，通过比较不同培养基对人脐带间充质干细胞的成骨诱导分化情况，确定了培养基的最优组合及制备方法。

实施例1：人脐带间充质干细胞的分离及培养

本实施例提供人脐带间充质干细胞的分离及培养的方法。

将采集的新鲜脐带置于145培养皿中，用PBS清洗除去脐带表面的血渍，将脐带放入含1%双抗（青霉素和链霉素）的PBS中浸泡10min，用镊子顺着脐带轻轻刮动除去脐带里面的血块；将脐带浸泡于PBS中，用剪刀剪成2cm左右的小段，顺着静脉一边将脐带剪开，用镊子剥离里面的静脉和动脉，随后将华通氏胶分离出来，置于一个新的含有少量PBS的培养皿中；将华通氏胶剪碎成1mm大小的组织，用少量的间充质干细胞完全培养基重悬后平铺于T75培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养；培养2天后添加5ml完全培养基，期间持续观察，待有细胞长出后继续添加5ml完全培养基，直至细胞足够传代；倒掉培养上清，用PBS清洗细胞表面1次，尽可能除去组织块，加入4ml重组胰酶置于37℃消化4min，然后加入5ml完全培养基终止消化，收集细胞，同时用PBS清洗1次继续收集细胞，将收集的细胞悬液过70µm细胞筛网，收集滤液400×g/min、20℃离心5min，弃上清，将细胞用完全培养基重悬后取100μl用台盼蓝染色法进行计数，按8000个/cm²密度接种于T75培养瓶置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，待细胞汇合度达到90%左右时用胰酶将细胞消化并进行传代培养，按照相同的传代方式将细胞传至P10代。

图1显示了本实施例从人脐带中分离培养得到的人脐带间充质干细胞结果，其中：A为人脐带间充质干细胞P2代结果、B为人脐带间充质干细胞P4代结果、C为人脐带间充质干细胞P5代结果、D为人脐带间充质干细胞P10代结果。可以看出，本实施例成功从人脐带中分离培养得到间充质干细胞，并进行多次传代培养得到不同代次的细胞，且该细胞在培养过程中生长状况良好，成规则的梭形结构。

实施例2：流式细胞技术鉴定从人脐带中分离得到的间充质干细胞表面抗原

本实施例提供采用流式细胞技术鉴定从人脐带中分离得到的间充质干细胞表面抗原的方法。

选取P5代细胞，用胰酶进行消化后制成细胞悬液，取100μl用台盼蓝染色法进行细胞计数。用PBS清洗细胞悬液两次，1500rpm离心5分钟，弃上清。用PBS重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至1×10⁷个/ml，并用200目70μm的细胞筛过滤除去未消化充分的细胞团块。

取8支2ml离心管，分别标记1-8号，往每支离心管中加入100μl过滤好的细胞悬液。并按照表1所示加入人脐带间充质干细胞流式检测试剂盒中（BD）的相应组分进行抗体标记。

表1 人脐带间充质干细胞表面抗体标记

将各管组分混合均匀后，避光2-8℃孵育30min。孵育结束用PBS清洗两次，1500rpm离心5分钟，弃上清。再用500μl PBS重悬细胞沉淀，随后用BD Accuri C6流式细胞仪进行上样检测。

上样前打开BD Accuri C6 Plus软件，并温和的重悬流式管中的细胞，将样品管放在上样针处。根据细胞光散射特性设门，门内收集至少20000个细胞。

1-4号单染管作为调节流式细胞仪各通道阈值和补偿及阴阳性界定参考，5号为空白对照调节细胞、仪器背景，6为阳性阴性同型抗体对照，确定荧光抗体非特异性信号及阴阳性界定参考，7号和8号为供试品检测管。

样品上样结束后，对上样结果进行分析，根据所汇门创建散点图及直方图，计算阳性细胞所占百分数及阴性细胞所占百分数。

图2显示了本实施例中人脐带间充质干细胞表面标记物流式检测结果。从图中可知，该细胞中含有间充质干细胞的特异性抗原标记物CD90、CD105和CD73，且不含有CD34、CD19、CD45、CD11b和HLA-DR等标记物，可以确认其是间充质干细胞。

实施例3：人脐带间充质干细胞的成骨诱导分化培养

本实施例提供不同组分的诱导分化培养基。

配制不同组分的成骨细胞诱导分化培养基。根据实验需要，设置了6组含有不同组分的培养基配制方法。其中A组为阴性对照组，B组为经典成骨诱导分化完全培养基组，C-E组为商业化成骨诱导培养基培养组，F1-F5组为本发明提供的培养基作为实验组（17β-雌二醇和补骨脂素诱导组）。设置了F1、F2、F3、F4、F5共5组。F1组所含17β-雌二醇和补骨脂素分别为0.0005nmol/L、0.0005nmol/L；F2组为0.0007nmol/L、0.0007nmol/；F3组为0.0010nmol/L、0.0010nmol/L；F4组为0.0012nmol/L、0.0012nmol/L；F5组为0.0015nmol/L、0.0015nmol/L具体各组培养基的成分及配制方法如下：

（1）其中A组为阴性对照组（基础扩增培养基组），其组分如表2所示：

表2 基础扩增培养基

无菌环境下进行操作。将80万单位的青霉素粉末溶于2ml生理盐水中，并分装保存于-20℃。称取1g链霉素粉末溶于4ml生理盐水中，分装后保存于-20℃。吸取45ml无血清无酚红间充质干细胞培养基于50ml离心管中，随后加入5ml FBS、12.5μl青霉素和20μl链霉素溶液，用移液枪吹打混匀后备用。

（2）B组为诱导组（经典成骨诱导分化完全培养基组），其组分如表3所示：

表3 经典成骨诱导分化完全培养基

无菌环境下进行操作。吸取45ml无血清无酚红间充质干细胞培养基于50ml离心管中，随后加入5ml FBS、12.5μl青霉素和20μl链霉素溶液，用移液枪吹打混匀后备用。称取3.9mg地塞米松溶于10mlPBS溶液中，用0.22μm滤膜过滤，并分装保存。取10μl地塞米松溶液加入到上述培养基中混匀，随后继续往里加入0.108g β-甘油磷酸钠、0.25mg维生素C和2.5mg抗坏血酸钠，并用移液枪吹打混匀。

（3）C-E组为商业化成骨诱导培养基培养组。其中C组为从promcell购买的试剂盒配制的成骨诱导培养基组，D组为从sciencell购买的试剂盒配制的成骨诱导培养基组，E组为从赛业生物购买的试剂盒配制的成骨诱导培养基组。按照对应试剂盒说明书操作方法，配制成骨细胞诱导培养基。

（4）F1组为本次实验的实验组（17B-雌二醇和补骨脂素组）。其组分如表4所示：

表4 实验组F1培养基

F2组为本次实验的实验组（17B-雌二醇和补骨脂素组）。其组分如表5所示：

表5 实验组F2培养基

F3组为本次实验的实验组（17B-雌二醇和补骨脂素组）。其组分如表6所示：

表6 实验组F3培养基

F4组为本次实验的实验组（17B-雌二醇和补骨脂素组）。其组分如表7所示：

表7 实验组F4培养基

F5组为本次实验的实验组（17B-雌二醇和补骨脂素组）。其组分如表8所示：

表8 实验组F5培养基

F1-F5组为本实施例中实验组，其培养基配制方法为：先配置经典成骨诱导分化完全培养基，按照B组配制方法进行配制。最后再分别加入0.0005nmol/L、0.0007nmol/L、0.0010nmol/L、0.0012nmol/L、0.0015nmol/L17β-雌二醇及0.0005nmol/L、0.0007nmol/L、0.0010nmol/L、0.0012nmol/L、0.0015nmol/L补骨脂素，并用移液枪将组分混匀后备用。

实施例4：不同培养基对人脐带间充质干细胞进行成骨细胞诱导分化

本实施例提供人脐带间充质干细胞成骨诱导分化的方法。

（1）为避免诱导过程人脐带间充质干细胞出现漂浮现象，在对细胞进行诱导培养前需对可计数六孔板进行明胶包被。加适量（能覆盖整个培养器皿底部的量即可）0.1%明胶到可计数六孔板中，摇匀液体使其覆盖整个可计数六孔板底部后，放置在超净台30min，然后弃去明胶，晾干后备用。

（2）成骨细胞诱导分化。传代培养至P5代的人脐带间充质干细胞融合度达到80-90%时，用胰酶进行消化处理，用间充质干细胞培养基清洗两变，1500rpm离心5分钟，弃上清。再用间充质干细胞培养基将沉淀重悬，取100μl用台盼蓝染色法进行细胞计数；

设置A-F5，共十组分组，每个分组分别设置三个生物学重复。将处理好的人脐带间充质干细胞按照2×10⁵cells/孔的细胞密度接种在可计数六孔板中，向孔内加入2ml无血清无酚红间充质干细胞培养基。于37℃，5%CO₂的培养箱中培养；

当细胞融合度达到60%-70%时，小心将孔内培养基吸走，在A组孔中加入2ml对阴性照组培养基（普通培养基），在B组孔中加入2ml经典成骨诱导培养基，在C组孔中加入promcell成骨诱导试剂盒配制的培养基，在D组孔中加入sciencell成骨诱导试剂盒配制的培养基，在E组孔中加入赛业生物成骨诱导试剂盒配制的培养基，在F1-F5组孔中加入添加了17B-雌二醇和补骨脂素的成骨诱导培养基。其中A组作为阴性对照组，其余各组均为样品组。将可计数六孔板置于37℃，5%CO₂的培养箱中培养。每隔2天更换预热至37℃的各组所对应的培养基。诱导14-28天后，视细胞的形态变化及生长情况，用茜素红进行染色。

实施例5：茜素红染色鉴定

本实施例提供成骨诱导分化结束后，采用茜素红染色液进行染色的方法。

茜素红染色液进行染色步骤如下：

（1）茜素红染色。称取0.1g茜素红粉末溶于100ml PBS溶液中，调节pH至4.2。待成骨诱导分化培养结束后，吸走可计数六孔板中的培养基，用1×PBS冲洗2次。

（2）每孔加入2ml 4%中性甲醛溶液，固定30min。吸走中性甲醛溶液，用1×PBS冲洗2次。每孔中加入1ml pH为4.2的茜素红染液染3-5min。吸走茜素红染液，用1×PBS冲洗2次。

（3）置于显微镜下观察成骨细胞染色结果。

实施例6

本实施例提供采用实施例3中提供的不同组分的诱导分化培养基得到的成骨细胞的染色结果。

染色后的成骨细胞通过可计数的六孔细胞培养板，在倒置显微镜或正置显微镜下观察成骨染色效果并进行计数。

（1）成骨染色效果

图3显示了本实施例中各组人脐带间充质干细胞成骨诱导分化结果，由图中结果可知，除普通培养基组培养的人脐带间充质干细胞不能分化出成骨细胞外，其余几组均能使人脐带间充质干细胞分化为成骨细胞，但是分化程度各不相同。

（2）成骨细胞的计数结果

进行2个区域左上、右上、左下、右下8大格骨细胞的计数，并取平均数。各组的计数结果如表9所示。

表9 通过可计数的六孔细胞培养板对成骨细胞的计数结果

通过可计数的六孔板计数，其中经典诱导培养基诱导组能使人脐带间充质干细胞向成骨细胞分化，但分化程度一般；商业化培养基诱导组诱导程度相当，比经典培养基诱导组诱导效果好；17β-雌二醇和补骨脂素诱导组诱导分化出的成骨细胞数量明显多于以上几组诱导的成骨细胞数量。通过表9中的计数结果可知，F1比经典培养基诱导组分化的成骨细胞多了约5倍。F2比经典培养基诱导组分化的成骨细胞多了约6倍。F3比经典培养基诱导组分化的成骨细胞多了约10倍。F4比经典培养基诱导组分化的成骨细胞多了约8倍。F5比经典培养基诱导组分化的成骨细胞多了约4倍。从数值上看好于其他任何一组诱导的情况。而在F1-F5组内，F3组又比其余组分化的最好。

综上可知，添加了17β-雌二醇和补骨脂素的诱导培养基培养的人脐带间充质干细胞向成骨细胞分化比其余组分化更好。

本发明从新生儿脐带中分离培养得人脐带间充质干细胞，并通过流式细胞技术鉴定培养得到的干细胞纯度，通过流式细胞技术鉴定后的细胞具有更高的纯度且对后续分化结果具有更高的可靠性及准确度。随后通过设置不同诱导组培养基培养人脐带间充质干细胞诱导其向成骨细胞进行分化，通过茜素红染色后在倒置显微镜下观察成骨细胞分化效果，该方法操作简单，能从直观上得到不同诱导组的诱导结果图，并通过对比得到最优的培养基组合方案。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种用于人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养的培养基组合物，其特征在于，所述培养基组合物的组成包括：基础培养基、诱导因子和添加因子；其中：

基础培养基包括：胎牛血清FBS、青霉素、链霉素和无血清无酚红间充质干细胞培养基；

诱导因子包括：地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C；

添加因子包括：17β-雌二醇和补骨脂素。

2.根据权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，所述青霉素、链霉素和胎牛血清FBS在基础培养基中的用量分别为：

青霉素：90-110U/ml，链霉素：90-110μg/ml，胎牛血清FBS：总体积的10%。

3.根据权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，所述地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C在用于人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养的培养基中的用量为：

地塞米松：0.05-0.3μmol/L，β-甘油磷酸钠：8-12mmol/L，维生素C：20-60μmol/L。

4.根据权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，所述培养基组合物的组成还包括抗坏血酸钠；所述抗坏血酸钠在用于人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养的培养基中的用量为：40-60mg/L。

5.根据权利要求1所述的培养基组合物，其特征在于，所述17β-雌二醇和补骨脂素在用于人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养的培养基中的用量为：

17β-雌二醇：0.0005-0.0015nmol/L；

补骨脂素：0.0005-0.0015nmol/L。

6.一种配制含有权利要求1-5任一项所述的人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养的培养基组合物的培养基的方法，其特征在于，所述方法包括：

向无血清无酚红间充质干细胞培养基中分别加入胎牛血清FBS、青霉素和链霉素，混均；

向添加胎牛血清FBS、青霉素和链霉素的无血清无酚红间充质干细胞培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C，混匀，得到混合培养基；

向混合培养基中加入17β-雌二醇和补骨脂素并混匀，得到人脐带间充质干细胞成骨诱导分化培养基。

7.一种人脐带间充质干细胞体外成骨诱导分化的方法，其特征在于，该方法包括：将人脐带间充质干细胞接种于由权利要求1-5中任一项所述的培养基组合物配制的培养基中并进行诱导培养，得到成骨细胞。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括人脐带间充质干细胞的体外分离、培养和确认过程：

进行人脐带间充质干细胞的体外分离及培养；

采用流式细胞技术鉴定细胞表面抗原：取传代培养的人脐带间充质干细胞，对其进行表面抗体标记，通过流式细胞技术确定标记抗体所占的比例，以对人脐带间充质干细胞进行确认。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括人脐带间充质干细胞的预处理的过程；

其中，对人脐带间充质干细胞进行预处理的过程包括：将传代培养至P3-P6代的人脐带间充质干细胞融合度达到80-90%时，用胰酶进行消化处理，清洗，离心，弃上清，再将沉淀重悬，得到预处理好的人脐带间充质干细胞；

预处理后的培养：将预处理好的人脐带间充质干细胞接种在人脐带间充质干细胞培养基中，继续培养。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，接种在人脐带间充质干细胞培养基中继续培养到细胞融合度达到60-70%时，将培养基更换为以权利要求1-5任一项所述的培养基组合物配制的培养基，继续培养。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，更换为以权利要求1-5任一项所述的培养基组合物配制的培养基后培养时，每隔2天更换新鲜的以权利要求1-5任一项所述的培养基组合物配制的培养基；

诱导分化的周期为14-28天，诱导分化完成后得到成骨细胞。

12.一种成骨细胞，其特征在于，所述成骨细胞是采用由权利要求1-5任一项所述的培养基组合物配制得到的培养基诱导分化间充质干细胞而得到的；或者，所述成骨细胞是由权利要求7-11任一项所述的方法制备得到的。

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