CN112725266B - 一种仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法，属于生物医学技术领域，包括以下步骤：S1分离原代钙化的VICs；S2配制条件诱导培养基；S3分离培养正常VICs；S4钙化诱导。本发明通过收集的钙化病人VICs原代细胞源性条件培养基，对人或大鼠原代VICs进行诱导，使其由VICs细胞转换为成骨样细胞。由此建立出一套能够反映临床CAVD病人病理进程的模型，为研究人员提供了更有利的条件，并且本发明稳定性好，易于保存，制备简单，更大程度的模仿临床病理模型，仿真性更强。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及到一种仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法。
背景技术
钙化性主动脉瓣疾病(calcific aortic valve disease,CAVD)是涉及脂质沉积、慢性炎症调控及进展性钙化的病理过程，其特征为主动脉瓣小叶增厚、主动脉瓣环狭窄、左心室的机械应力增加引起严重并发症。CAVD是老年人群中最常见的心脏瓣膜疾病，5年内患者发生心力衰竭、主动脉瓣置换或死亡的风险非常高。CAVD诱因多样、发病机制复杂，分子和细胞过程尚未被清楚表征。
但近来主动脉瓣的主要细胞成分瓣膜间质细胞(valve interstitial cells,VICs)发生纤维性活化并向成骨细胞分化(即钙化)被认为是CAVD的关键环节。在正常的成人瓣膜中，VICs大部分处于静止状态，主要分泌适度的细胞外基质维持瓣膜稳态；而在CAVD病人的瓣膜中则鉴定出成纤维细胞样VICs及成骨细胞样VICs，主要介导钙盐沉积。且目前而言，在体诱导瓣膜钙化需要配合基因敲除鼠进行，方法繁琐且耗时久，而相比而言，细胞钙化模型变量易于控制且耗时较短，成为阐述CAVD的发病机制的新思路。因此，成功诱导VICs钙化模型是所有CAVD研究的基础，对从VICs层面探索CAVD的发病机制并寻求治疗靶点至关重要。
主动脉瓣钙化模型形成的基础理论为转录生长因子-β1(TGF-β1)介导的VICs活化和VICs发生表型转换成为成骨样细胞。现有技术中，最常见的VICs钙化模型的诱导方式为将VICs与成骨培养基共培养7～20天。成骨诱导培养基根据其所含有的主要成分分为以β-甘油磷酸为主成骨诱导培养基与以无机磷酸盐为主的成骨诱导培养基，或联合为混合含有β-甘油磷酸、地塞米松、抗坏血酸、氯化钙等成分的。尽管目前报道的几种钙化诱导培养基可以诱导VICs发生钙化，但其简化了每个因素对CAVD的影响，难以细致研究各因素之间的相互关系，以至于基于此得出的研究结论可能与真正的钙化途径不甚相关。
发明内容
本发明的目的是提供一种仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法，可以根据所建立的瓣膜间质细胞钙化模型有效的研究临床上钙化性主动脉瓣疾病的特点、发病机制及治疗策略。
为达上述目的，本发明提供了一种仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法，包括以下步骤：
S1制备原代钙化的VICs
获取临床钙化主动脉标本，通过酶消化法制备原代钙化的VICs；
S2配制条件诱导培养基
将S1所得原代钙化的VICs于5％CO2，37℃条件下培养2-4d，收集上清液，用于配制条件诱导培养基；
S3分离培养
分离培养大鼠主动脉瓣原代VICs，或分离培养病人术后获取的正常主动脉瓣VICs原代细胞；
S4诱导
将步骤S3所得原代细胞加入步骤S2中的条件诱导培养基中，诱导2-8d，完成。
采用上述方案的有益效果是：获得活力较高的钙化的VICs、具备钙化诱导能力的条件培养基及被成功诱导钙化的仿真型瓣膜间质细胞钙化模型。
进一步地，步骤S1具体包括以下过程：
S1.1取得CAVD病人术后钙化的瓣膜组织；
S1.2将步骤S1.1所得的瓣膜组织于缓冲液中漂洗3-5次，使用II型胶原酶消化液于30-40℃条件下消化20-40min；
S1.3将S1.2所得物擦拭干净后移入新的II型胶原酶消化液中，于30-40℃条件下摇床转动过夜，其中转速为60-100rpm/min；
S1.4将S1.3所得物与等体积的完全培养基混合后，终止消化后过滤并离心处理，取沉淀；离心的转速为950-1050rpm/min；
S1.5将S1.4得到的沉淀重悬，形成细胞悬液，将细胞悬液于5％CO2，37℃条件下接种培养2-4d；
采用上述方案的有益效果是：首先通过II型胶原酶消化液对瓣膜组织进行消化，将瓣膜组织中的连接部分消化，而形成单个细胞；再将单个细胞通过擦拭去除外层细胞后，使用新的II型胶原酶消化液对其进行继续消化，转动摇床上转动可以增加II型胶原酶消化液与细胞的接触面积，提高消化效率。将停止消化的消化液与完全培养基混合均匀，过滤离心后，取细胞沉淀和完全培养基的混合物做重悬处理，将细胞重新悬浮后，接种培养，可以获得足量、活力较高的钙化的VICs，是后续所有实验有效进行的基础。
进一步地，缓冲液为PBS缓冲液与1％青霉素-链霉素溶液按体积比为98-100：1混合后制得。
采用上述方案的有益效果是：该缓冲液配制简单，能够达到在维持细胞渗透压平衡的同时能够有效防止细胞污染。
进一步地，步骤S1.3中II型胶原酶消化液，其浓度为2mg/mL。
采用上述方案的有益效果是：对于钙化的瓣膜组织，具有瓣叶增厚，钙盐沉积等特点，浓度较高的消化液能够更大限度的使组织消化充分，得到更多的细胞。
进一步地，完全培养基为DMEM高糖培养基与胎牛血清、青霉素-链霉素按体积比为83-85：14-16：1-2的比例进行混合，制得。
采用上述方案的有益效果是：能够更大程度的提高原代细胞贴壁率，从而提高细胞得率。
进一步地，步骤S2具体包括以下过程：
S2.1将S1.6所得的细胞于5％CO2，37℃条件下培养2-4d，收集上清液；
S2.2将S2.1所得上清液与胎牛血清、青霉素-链霉素按照体积比为83-85：14-16：1-2的比例进行混合，即得条件诱导培养基。
采用上述方案的有益效果是：除添加必要的细胞培养支持所需试剂外，尽量保证条件诱导培养基的可控性，以便既能达到诱导钙化的目的，也利于进行下游机制的分析。
进一步地，步骤S3具体包括以下过程：
S3.1取得大鼠心脏三叶瓣膜小叶，或者取得主动脉夹层患者的主动脉瓣瓣叶组织，漂洗；
S3.2向S3.1获得的瓣膜小叶或主动脉瓣中加入II型胶原酶消化液，于30-40℃条件下转动消化20-40min，其中转速为60-100rpm/min；
S3.3向S3.2处理过的瓣膜小叶或主动脉瓣中再次加入新的II型胶原酶消化液，于30-40℃条件下转动消化，其中转速为60-100rpm/min；其中瓣膜小叶的转动时间为100-140min，主动脉瓣的转动时间为直至过夜；
S3.4将S3.3所得物与等体积的完全培养基混合后，终止消化后过滤并离心处理，取沉淀；离心的转速为950-1050rpm/min；
S3.5将S3.4所得沉淀重悬，形成细胞悬液，将细胞悬液于5％CO2，37℃条件下接种培养6-8d；
S3.6将S3.5培养所得细胞以细胞消化液消化后进行传代处理，待细胞融合度达到70％时，备用。
采用上述方案的有益效果是：获得足量、活力较高的正常VICs，为诱导钙化的步骤实施提供基础。
进一步地，步骤S3.3中II型胶原酶消化液，其浓度为1.5mg/mL。
采用上述方案的有益效果是：大鼠心脏瓣膜小叶较薄，人正常主动脉瓣瓣膜小叶组织亦薄如蝉翼，故采用浓度稍低的酶消化液能够保证在得到较多细胞的同时保留细胞活力。
综上所述，本发明具有以下优点：
本发明提供的仿真瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法所建立的VICs钙化模型能够反映临床CAVD病人的病理进程，基于此得出的研究结论更贴近真正的钙化途径。这给研究人员根据所建立的VICs钙化模型研究临床上CAVD病人的病理进程提供了有利条件。与其他现有技术相比，本发明稳定性好，易于保存，制备简单，更大程度的模仿临床病理模型，仿真性更强。
附图说明
图1为来源于CAVD病人钙化的VICs的细胞形态图；
图2为来源于钙化VICs的条件培养基；
图3为实施例1所使用的健康原代大鼠VICs的细胞形态图；
图4为实施例1所使用的健康原代大鼠VICs经条件培养基诱导4d后成骨标志性基因的PCR结果图；
图5为实施例1所使用的健康原代大鼠VICs经条件培养基诱导4d后成骨标志性基因的WB结果及统计分析图；
图6为实施例1所使用的健康原代大鼠VICs经条件培养基诱导4d后炎症因子的WB结果及统计分析图；
图7为实施例1所使用的健康原代大鼠VICs经条件培养基诱导7d茜素红染色下的钙结节结果；
图8为实施例2所使用的健康原代人VICs的细胞形态图；
图9为实施例2所使用的健康原代人VICs经条件培养基诱导7d后茜素红染色下的钙结节结果。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明的具体实施方式做进一步的解释说明，但不表示将本发明的保护范围限制在实施例所述范围内。
本发明所用的仪器及试剂，除实施例中明确给出的外，其余试剂均为普通市售产品。
实施例1与实施例2涉及的试剂及配置方法如下：
试剂1：50毫升磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline，PBS，不含钙镁，Gibco，C10010500BT)+1％青霉素-链霉素溶液(100X，碧云天，C0222)；
试剂2：15毫升2mg/mL的II型胶原酶消化液：15mL PBS+30mg II型胶原酶(Collagenase Type II，Worthington，LS004176)；
试剂3：100毫升完全培养基：84mL DMEM高糖培养基(Dulbecco's modified eaglemedium，Gibco，C11995500BT)+15mL胎牛血清(Foetal Bovine Serum，FBS，Gibco，10099141C)+1mL 1％青霉素-链霉素溶液；
试剂4：100毫升细胞消化液(Gibco，0.25％Trypsin-EDTA，2186972)；
试剂5：100毫升条件诱导培养基：84mL试剂3+15mL胎牛血清+1％青霉素-链霉素溶液；
试剂6：20毫升1.5mg/mL的II型胶原酶消化液：20mL PBS+30mg II型胶原酶(Collagenase Type II，Worthington，LS004176)。
实施例1
本发明提供了一种仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法，用于建立大鼠VICs仿真钙化模型，包括以下步骤：
S1制备原代钙化的VICs
S1.1遵循我国相关法律、法规和规章(《涉及人的生物医学研究伦理审查办法》)以及《赫尔辛基宣言》和CIOMS《人体生物医学研究国际道德指南》，遵循伦理要求，于CAVD病人术后获得患者不再需要的钙化的瓣膜组织，保持无菌性，置入预冷的试剂1中冰上运输至实验室；
S1.2将S1.1中所获瓣膜组织以预冷的试剂1漂洗3次，以去除血液细胞的影响，随后将每张瓣膜小叶置入装有3ml试剂2的培养皿(直径为35mm)中，于37℃条件下消化30min；
S1.3将S1.2中的瓣膜小叶以无菌棉签(日用棉签高温高压灭菌处理)按逆时针方向擦拭瓣膜，确保每个部位都被擦拭到，以去除表面内皮层细胞，将擦拭后的瓣膜移入13毫升试剂2中，于37℃摇床中以80rpm/min转速摇晃消化过夜；
S1.4次日晨，将S1.3所得到的消化液与等体积的试剂3混合，终止消化，用移液枪轻柔吹打均匀，以200目筛网过滤混合液去除未完全消化的组织等杂质，将过滤后的混合液在1000rpm条件下离心5min，弃上清；
S1.5将S1.4得到的沉淀以48毫升试剂3重悬，用移液枪轻柔吹打均匀，形成1*105个细胞/毫升的细胞悬液，接种至12孔板中，每孔1毫升，5％CO2，37℃条件下培养3d。
S2配制条件诱导培养基
S2.1于5％CO2，37℃条件下培养钙化的VICs 3d后，普通相差显微镜下观察细胞形态，细胞密度，发现钙化病人的VICs原代细胞呈梭形，且培养基中弥散大量微粒及细胞碎片(见图1)，将上清液收集至50mL离心管；
S2.2将S2.1所获上清与FBS、青霉素-链霉素溶液按照体积比为84：15：1的比例进行混合，即为条件诱导培养基，也就是试剂5(见图2)，该培养基静置数小时后可在离心管低观察到沉淀，沉淀中包含各种微粒、钙盐及细胞碎片。
S3分离培养健康大鼠VICs
S3.1购买SPF级体重为320g左右的健康成年Wistar-SD大鼠，颈椎脱臼法处死，备皮后以75％酒精消毒手术区域，沿胸骨中线1/3处快速剪开胸腔取出心脏，保留主动脉；
S3.2体式显微镜下，小心剪开主动脉，在主动脉根部剥离3叶几近透明状的瓣膜小叶，放入预冷的试剂1中；
S3.3漂洗三次后将瓣膜小叶移入1.5mL的EP管；
S3.4以试剂6于37℃摇床中以80rpm/min转速摇晃消化20min，以移液枪轻柔吹打以清除外层内皮层细胞，此时注意不要将瓣膜小叶吸掉，轻柔将瓣膜小叶转移至新的EP管中；
S3.5继续以试剂6于37℃摇床中以80rpm/min转速摇晃消化120min，观察瓣膜小叶消失即可停止消化；
S3.6将S3.5所得到的消化液与等体积的试剂3混合，用移液枪轻柔吹打均匀，终止消化，以200目筛网过滤混合液，并在1000rpm条件下离心5min，弃上清；
S3.7将S3.6得到的沉淀以6毫升试剂3重悬，用移液枪轻柔吹打均匀，形成1*105个细胞/毫升的细胞悬液，接种至2个T25中，每个T25中3毫升，5％CO2，37℃条件下培养7d，期间更换培养基以提供营养支持；
S3.8将S3.7所得细胞以试剂4消化并进行传代处理，接种至12孔板中，待细胞融合度达到70％时备用(见图3)。
S4诱导分析
将步骤S2所配置的试剂5加入S3.8所获的细胞中，于5％CO2，37℃条件下培养2d、4d或7d。
试验例1
对实施例1中步骤S4中诱导4d后的成骨细胞进行鉴定：
一、将步骤S4中的细胞以PBS进行漂洗，以TRIzol(Invitrogen，15596026)进行细胞裂解释放总RNA，以总RNA提取试剂盒(天漠生物，TR205-50)提取细胞总RNA，以反转录试剂盒(东洋纺，FSQ-101)将总RNA逆转录成为cDNA，以荧光定量试剂iQ SYBR GreenSupermix超混液(Bio-Rad，1708882AP)对成骨成骨相关指标RUNX2、OPN、ALP、BMP2、CTNNB进行定量分析(图4)；
二、将步骤S4.1中的细胞以PBS进行漂洗，以RIPA裂解液(碧云天，P0013c)裂解细胞提取总蛋白，蛋白定量、蛋白变性后以SDS-PAGE进行电泳分离蛋白后孵育一抗和二抗、曝光、成像分析RUNX2、OPN、ALP、BMP2、CTNNB(见图5)、IL1-β、NLRP3、ASC、Caspase1(见图6)的表达变化；
试验例2
对步骤S4中诱导7d后的成骨细胞进行鉴定：
将步骤S4中的细胞以PBS进行漂洗，以4％多聚甲醛固定液(碧云天，P0099)固定30min，以茜素红染色液(碧云天，C0140)染色20min，以PBS进行漂洗，拍照成像(见图7)。
实施例2
本发明提供了一种仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法，用于人VICs仿真钙化模型，包括以下步骤：
S1制备原代钙化的VICs
S1.1遵循我国相关法律、法规于CAVD病人术后获得患者不再需要的钙化的瓣膜组织，保持无菌性，置入预冷的试剂1中冰上运输至实验室；
S1.2将S1.1中所获瓣膜组织以预冷的试剂1漂洗3次，以去除血液细胞的影响，随后将每张瓣膜小叶置入装有3ml试剂2的培养皿(直径为35mm)中，于37℃条件下消化30min；
S1.3将S1.2中的瓣膜小叶以无菌棉签(日用棉签高温高压灭菌处理)按逆时针方向擦拭瓣膜，确保每个部位都被擦拭到，以去除表面内皮层细胞，将擦拭后的瓣膜移入13毫升试剂2中，于37℃摇床中以80rpm/min转速摇晃消化过夜；
S1.4次日晨，将S1.3所得到的消化液与等体积的试剂3混合，终止消化，用移液枪轻柔吹打均匀，以200目筛网过滤混合液去除未完全消化的组织等杂质，将过滤后的混合液在1000rpm条件下离心5min，弃上清；
S1.5将S1.4得到的沉淀以48毫升试剂3重悬，用移液枪轻柔吹打均匀，形成1*105个细胞/毫升的细胞悬液，接种至12孔板中，每孔1毫升，5％CO2，37℃条件下培养3d。
S2配制条件诱导培养基
S2.1于5％CO2，37℃条件下培养钙化的VICs 3d后，普通相差显微镜下观察细胞形态，细胞密度，发现钙化病人的VICs原代细胞呈梭形，且培养基中弥散大量微粒及细胞碎片，将上清液收集至50mL离心管；
S2.2将S2.1所获上清与FBS、青霉素-链霉素溶液按照体积比为84：15：1的比例进行混合，即为条件诱导培养基，也就是试剂5，该培养基静置数小时后可在离心管低观察到沉淀，沉淀中包含各种微粒、钙盐及细胞碎片。
S3分离培养人原代VICs
S3.1根据伦理许可，于主动脉夹层病人术后取得人主动脉瓣瓣膜组织，冰上运输至实验室；
S3.2将步骤S3.1中所获瓣膜组织以预冷的试剂1漂洗3次，以去除血液细胞的影响，随后将每张瓣膜小叶置入装有3ml试剂6的培养皿(直径为35mm)中，于37℃条件下消化30min；
S3.3将步骤S3.2中的瓣膜小叶以无菌棉签(日用棉签高温高压灭菌处理)按逆时针方向擦拭瓣膜，确保每个部位都被擦拭到，以去除表面内皮层细胞，将擦拭后的瓣膜移入13毫升试剂6中，于37℃摇床中以80rpm/min转速摇晃消化过夜；
S3.4次日晨，将步骤S3.3所得到的消化液与等体积的试剂3混合，终止消化，用移液枪轻柔吹打均匀，以200目筛网过滤混合液去除未完全消化的组织等杂质，将过滤后的混合液在1000rpm条件下离心5min，弃上清；
S3.5将步骤S3.4得到的沉淀以48毫升试剂3重悬，用移液枪轻柔吹打均匀，形成1*105个细胞/毫升的细胞悬液，接种至12孔板中，每孔1毫升，5％CO2，37℃条件下培养3d，待细胞融合度达到70％时备用(见图8)。
S4诱导分析
于5％CO2，37℃条件下培养7d。
试验例3
对实施例2中步骤S4中诱导7d后的成骨细胞进行鉴定：
将实施例2中步骤S4中诱导7d后的成骨细胞以PBS进行漂洗，以4％多聚甲醛固定液(碧云天，P0099)固定30min，以茜素红染色液(碧云天，C0140)染色20min，以PBS进行漂洗，拍照成像(见图9)。
由图1-9可知：本发明中所获得的成骨样细胞：
RNA水平：使用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)方法明确其能够高表达成骨相关蛋白如Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨桥蛋白(OPN)、碱性磷酸酶(ALP)、重组人骨形态发生蛋白2(BMP2)、β-连环蛋白(β-catenin，又名CTNNB)；
蛋白水平：通过蛋白印迹(Western-blot)方法检测RUNX2、OPN、ALP、BMP2、CTNNB水平发现上述蛋白表达显著上调；
钙盐沉积染色：使用茜素红染色评估钙化结节的形成情况验证了钙化结节阳性显著增多。
并且本发明建立的仿真瓣膜间质细胞钙化模型中，多种炎症相关蛋白如含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase 1)，白细胞介素1-β(IL1-β)，NOD样受体家族蛋白3(NLRP3)炎性小体，接头蛋白ASC表达显著上调。因此本发明提供的瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法所建立的VICs钙化模型能够反映临床CAVD病人的病理进程，基于此得出的研究结论更贴近真正的钙化途径。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。
Claims (6)
1.一种仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1分离原代钙化的VICs
获取临床钙化主动脉瓣标本，通过酶消化法制备原代钙化的VICs；
所述步骤S1具体包括以下过程：
S1.1获得CAVD病人术后钙化的瓣膜组织；
S1.2将步骤S1.1所得的瓣膜组织于缓冲液中漂洗3-5次，使用II型胶原酶消化液于37℃条件下消化20-40min；
S1.3将S1.2所得物擦拭后移入新的II型胶原酶消化液中，于30-40℃条件下摇床上转动过夜，其中转速为60-100rpm/min；
S1.4将S1.3所得物与等体积的完全培养基混合，终止消化后过滤并离心处理，取沉淀；离心的转速为950-1050 rpm/min；
S1.5将S1.4得到的沉淀重悬，形成细胞悬液，将细胞悬液于5%CO2，37℃条件下接种培养2-4d；
S2配制条件诱导培养基
将S1所得原代钙化的VICs于5%CO2，37℃条件下培养2-4d，收集上清液，用于配制条件诱导培养基，包括以下步骤：
S2.1收集S1.5所得的上清液；
S2.2将S2.1所得上清液与胎牛血清、青霉素-链霉素按照体积比为83-85：14-16：1-2的比例进行混合，即得条件诱导培养基；
S3分离培养正常VICs
分离培养大鼠主动脉瓣原代VICs，或分离培养病人术后获取的正常主动脉瓣VICs原代细胞；
S4钙化诱导
将步骤S3所得原代细胞加入步骤S2中的条件诱导培养基中，诱导2-8d，完成。
2.如权利要求1所述的仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法，其特征在于，所述缓冲液为PBS缓冲液与1%青霉素-链霉素溶液按体积比为99：1混合后制得。
3.如权利要求1所述的仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法，其特征在于，所述步骤S1.2和S1.3中II型胶原酶消化液的浓度为2mg/mL。
4.如权利要求1所述的仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法，其特征在于，所述完全培养基为DMEM高糖培养基与胎牛血清、青霉素-链霉素按体积比为83-85：14-16：1-2的比例进行混合，制得。
5.如权利要求1所述的仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括以下过程：
S3.1取得大鼠心脏三叶瓣膜小叶，或者取得主动脉夹层患者的主动脉瓣瓣膜小叶，漂洗；
S3.2向S3.1获得的瓣膜小叶中加入II型胶原酶消化液，于30-40℃条件下摇床转动消化20-40min，其中转速为60-100rpm/min；
S3.3向S3.2处理过的瓣膜小叶中再次加入新的II型胶原酶消化液，于30-40℃条件下摇床转动消化，其中转速为60-100rpm/min；其中大鼠瓣膜小叶的摇床转动时间为100-140min，人主动脉瓣瓣膜小叶的摇床转动时间则过夜；
S3.4将S3.3所得物与等体积的完全培养基混合，终止消化后过滤并离心处理，取沉淀；离心的转速为950-1050rpm/min；
S3.5将S3.4所得沉淀重悬，形成细胞悬液，将细胞悬液于5%CO2，37℃条件下接种培养6-8d；
S3.6将S3.5培养所得细胞以细胞消化液消化后进行传代处理，待细胞融合度达到70%时，备用。
6.如权利要求5所述的仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法，其特征在于，所述步骤S3.2和S3.3中II型胶原酶消化液的浓度为1.5mg/mL。
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| 钙化性心脏瓣膜间质细胞培养方法的应用与改进;张伯尧等;《中华实验外科杂志》;20130531;第1005-1006页 * |
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