CN102421444B

CN102421444B - 用于治疗瘘的自体和异体脂肪来源的基质干细胞组合物

Info

Publication number: CN102421444B
Application number: CN200980158931.1A
Authority: CN
Inventors: 李圣求; 金美亨
Original assignee: Anterogen Co Ltd
Current assignee: Anterogen Co Ltd
Priority date: 2009-04-28
Filing date: 2009-06-09
Publication date: 2016-08-03
Anticipated expiration: 2029-06-09
Also published as: EP2425844B1; DK2425844T3; KR20100118491A; US20120020937A1; KR101328604B1; IL215491A0; CN102421444A; IL215491A; WO2010126194A1; JP5647230B2; EP2425844A1; JP2012525377A; US20150376573A1; KR20120055509A; EP2425844A4; HK1164144A1; ES2479621T3

Abstract

本发明涉及生产用于治疗瘘的临床有效量的人脂肪组织来源的基质干细胞的方法和由该方法制备的组合物。本发明的方法通过改良常规的标准培养方法，可在短期内有效生产临床有效量的脂肪组织来源的基质干细胞。与那些通过常规方法制备的细胞组合物相比，通过本发明方法获得的含有脂肪组织来源的基质干细胞的脂肪干细胞组合物表现出优异的多能性与免疫调节活性，因而更适于治疗瘘。特别是，由于在异体脂肪来源的干细胞中，免疫反应被抑制，因而本发明的细胞组合物具有极佳的临床用途。

Description

用于治疗瘘的自体和异体脂肪来源的基质干细胞组合物

技术领域

本发明涉及生产用于治疗瘘的临床有效量的人脂肪组织来源的基质干细胞的方法，以及由该方法制备的组合物，其中，基质干细胞可获自自体和异体脂肪组织。

背景技术

再生医学是指治疗损伤组织或功能恶化的组织和/或器官的方法，通常涉及利用多能干细胞的细胞疗法。骨髓来源的干细胞，为用于再生医学的成体干细胞主要类型中的一种，可在体外增殖并分化成各种细胞类型，包括例如肌细胞、心肌细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等。此外，骨髓来源的干细胞具有免疫调节活性，因而可用于异体骨髓移植或用作自身免疫病的免疫抑制剂。

由于脂肪组织也含有大量的干细胞，目前已经开展了大量的脂肪干细胞作为移植物的的应用研究。与其它种类的组织相比，脂肪组织含有相当大量的干细胞(即分离自脂肪组织的干细胞是分离自相同量的骨髓的约1,000倍)，并且脂肪来源的干细胞像骨髓来源的干细胞一样，是多能的，可分化成软骨细胞、骨细胞、脂肪细胞、肌细胞等。此外，脂肪来源的基质干细胞表现出与骨髓来源的干细胞类似的细胞表面标志的表达，并且具有体内和体外的自体或异体免疫反应的免疫调节活性。

瘘是体内不正常产生的通道，并且可在体内的各个位置由不同原因产生。最经常发生的瘘通常存在于肠系统中，包括肛门和直肠。肛门瘘通常由炎症性疾病引起，其中炎症发生在肛门腺，传播到皮肤外部，渗出分泌物，如脓液，是约20％的肛门痔疮的发病原因。

肛门瘘实质上是指直肠道和肛周皮肤之间的不正常通道，并且诱发粪便通过开放位点而不是肛门的不正常排泄。这主要是由于发生肛门直肠脓肿，其反过来形成分泌脓液的瘘。这种形成的瘘被称为‘肛瘘’。也即，肛瘘是肛门直肠脓肿爆发时，形成于直肠或肛管内部至肛周皮肤的细长孔。肛瘘还可分为下述与在肛门性能中发挥重要作用的外肛门括约肌有关的4类：

(1)内括约肌肛瘘，其具有形成于内肛门括约肌和外肛门括约肌之间的瘘束；

(2)经括约肌肛瘘，其具有穿透外括约肌的瘘束；

(3)括约肌上肛瘘，其具有形成于外括约肌上部的瘘束；和

(4)括约肌外肛瘘，其具有在直肠附近肛门腺窝上部而不是肛门腺窝本身形成的原发性瘘束。

通常已知引起肛瘘的主要原因是肛周腺体的感染，此外，有时肛瘘的发生是由于肺结核、克罗恩氏病、癌症、白血病、白细胞减少症等引起。克罗恩氏病的特征是慢性的和复发性的肠道炎症，并被定为罕见病。由克罗恩氏病引起的瘘可包括，如与阴道相连的直肠-阴道瘘、肠道附近形成的肠道瘘等，以及以上所述的肛瘘。

大部分的瘘可通过外科手术进行治疗。治疗肛周和直肠内的瘘的重要目的在于彻底治疗疾病同时保留肛门括约肌的正常功能。然而，外科手术后瘘通常会复发，并可导致如肛门功能紊乱引起的大便失禁等。因此，目前手术的方法不能提供满意的治疗效果。

瘘手术可包括，如瘘切开术、泄液线、应用推进皮瓣(advancedflap)、肌肉加注法(musclefillingprocedure)、应用纤维蛋白胶等。这些中，纤维蛋白胶已在一般的手术中被用作外科手术密封剂，通过混合纤维蛋白原和凝血酶而形成纤维蛋白凝块。对于肛瘘，通过外部开口将纤维蛋白胶注入到瘘束中，从而填满瘘束以及肛瘘的内部开口。

最近几年中，随着与干细胞有关的研究的广泛开展，已经开展了通过移植干细胞到瘘位置治疗肛瘘的方法。例如，Mizuno等人(Plast.Reconstr.Surg.2002，109：199-209)证实了分离自脂肪组织的成体干细胞可分化成肌肉细胞，而Damian等人(DisColonRectum2005，48：1416-1423)在临床试验的第I阶段，证实了脂肪干细胞可安全地应用于治疗患有克罗恩氏病的患者的肛瘘。此外，据报道，当患有克罗恩氏病的患者进行成体干细胞移植以治疗直肠肛瘘时，即使在移植3个月后也没有发生大便失禁。

已知体外培养脂肪来源的基质干细胞是易于实现的。然而，为获得临床有效量的细胞，通常需要相对较大数量的脂肪组织和较长期的培养阶段。特别是，治疗患有慢性的和/或复发性的疾病，如克罗恩氏病患者的瘘，需要大量的细胞以及改良的细胞培养方法。此外，如果允许使用异体脂肪来源的基质细胞，那它们在临床上是非常有用的。

WO2006/136244(2006年12月28日)公开了应用脂肪来源的基质干细胞的瘘治疗及其应用。然而，由于治疗中所用的脂肪干细胞获自患者本身，如果患者没有足够的脂肪组织、脂肪组织中所含的干细胞的数量相当低、或者不能培养自体干细胞，那么就有可能无法提供临床适合的治疗。特别是，在患有克罗恩氏瘘的患者的情况下，会遇到重大的肠道炎症，引起患者的体重减轻以及体质指数的降低。对于这种病人，就很难保证足够量的脂肪来源的基质干细胞。此外，由于疾病持续了很长时间并恶化，通常引起人体中多个瘘的发生，而且瘘的尺寸也会相对增加，就需要大量的干细胞来治疗患者。

同时，对于体外培养脂肪来源的基质细胞，当实施现有专利(WO2007/011797、US6,777,231等)或发表的文献((组织工程学)TissueEngineering7(2)，211-228，2001等)中所公开的标准细胞培养方法时，体外培养细胞需要较长的时间，使得难以获得临床有效量的细胞。因此，会降低临床应用中的实际效率。尽管还不知道确切的理由，脂肪干细胞的增殖率因个体不同而有差异，并且由于脂肪干细胞在体外培养中不能活跃增殖而使细胞培养经常失败。此外，脂肪干细胞的生物学功能，包括如多能型、免疫调节活性等可根据其供体不同而有差异。因此，应用具临床有效特征的异体脂肪干细胞可改善治疗瘘的效果。

技术问题

因此，本发明涉及在瘘治疗中的分离自人脂肪组织的基质干细胞的应用，本发明的一个目的在于提供生产临床有效量的基质干细胞的改良方法，以及用前述方法生产的脂肪干细胞组合物。

技术方案

为实现上述目的，本发明提供用于治疗瘘的脂肪干细胞组合物，其含有异体脂肪组织来源的基质干细胞。

为实现上述的另一个目的，本发明提供制备含有脂肪来源的基质干细胞的脂肪干细胞组合物的方法，该方法包括如下步骤：

(a)从目标体(subject)中收集脂肪组织；

(b)从脂肪组织中分离基质血管成分(‘SVF’)；

(c)在基质培养中培养SVF；

(d)在含有作为生长因子的EGF或bFGF的扩增培养基中培养SVF，以培养脂肪来源的基质干细胞；和

(e)培养脂肪来源的基质干细胞至少一代(passage)。

根据本发明，还提供由上述方法制备的脂肪干细胞组合物，以及治疗瘘的方法，该方法包括给瘘患者施用前述组合物的步骤。

本发明大体上涉及生产用于治疗瘘的临床有效量的人脂肪组织来源的基质干细胞的方法，以及由该方法制备的组合物。移植中所用的脂肪来源的基质细胞可分离自自体和/或异体脂肪组织。更具体地，根据本发明，在治疗中可应用异体脂肪来源的基质细胞而不用从目标患者中分离脂肪组织，并且可选择具有更加优异的治疗效果的脂肪干细胞，从而具备临床适用性。

此外，对于分离自自体或异体脂肪组织的基质血管成分(下文中，通常被称为‘SVF’)的培养，本发明可适当地应用基质培养基和扩增培养基来进行培养，从而在短时间内有效生产出临床有效量的基质干细胞。更具体地，本发明可利用含特定生长因子，如碱性成纤维细胞生长因子(下文中，被称为‘bFGF’)或表皮生长因子(下文中，被称为‘EGF’)的扩增培养基，从而显著地减少干细胞的培养时间和易于控制干细胞因个体而不同的生长速率。此外，由本发明方法生产的脂肪干细胞与现有的细胞培养方法生产的干细胞相比，表现出优异的分化速率和免疫调节活性。

如果通过抽脂从患者中分离而提供大量脂肪组织，可纯化和使用该脂肪来源的干细胞。然而，在多数情况下，为获得足量的用于移植的脂肪来源的干细胞，需要有增殖阶段。即，在计算抽脂获得的脂肪组织的量、分离自脂肪组织的脂肪组织来源的基质干细胞的数目和移植所需的细胞的数目后，应该进行细胞的培养和继代培养以获得临床有效量的干细胞。为进行异体移植，可进行继代培养以充分去除一系列可诱发免疫反应的细胞，如免疫细胞、成纤维细胞等，以生产同质的基质干细胞群。优选地，应该进行至少一次继代培养。

在本申请中，“基质培养基”是指用于培养SVF的培养基，可通过添加10％FBS和1％抗生素至适合的细胞培养基，如DMEM或DMEM/F12中而制备。另一方面，“扩增培养基”是指用于增殖脂肪来源的干细胞的培养基，并可在基质培养基中额外含有bFGF或EGF。

与常规培养方法(WO2007/011797)所需的约72～120小时的平均倍增时间相比，根据本发明的培养方法，脂肪来源的干细胞的平均倍增时间为约48小时，从而达到显著增加的效果。如图1所示，在本发明的设定的培养条件下，每个传代中的平均培养时间为4天，而常规方法的每个传代的平均培养时间为7天，因此本发明显著减少了细胞生产的时间，即生产足量细胞数所需的时间。例如，为利用50ml提供的脂肪抽吸细胞(lipoaspirate)获得1×10⁸脂肪干细胞，现有的培养方法需要至少30天。相比之下，当提供的脂肪干细胞培养于本发明的在常规基质培养基中含有bFGF或EGF的扩增培养基中时，可在约15天内获得预期的产物。根据另一个实施例，如果提供的脂肪干细胞少于50ml，现有的培养方法难以生产临床有效量的脂肪干细胞，然而本发明提供改良的培养方法以克服这种困难。

对于培养基质干细胞，不同供体的脂肪组织其倍增时间有很大不同，然而，本发明可最小化因供体个体差异而导致的培养时间差异。因此，本发明的细胞培养方法可适于确保用于治疗瘘的临床有效量的细胞。

通常，已知随着体外培养世代数的增加，干细胞的多能性降低。因此，需要能维持所需的干细胞多能性的培养方法。与现有的培养方法相比，当使用本发明的培养方法时，干细胞表现出优异的分化成肌细胞、骨细胞等的多能性。此外，本发明获得的脂肪来源的基质干细胞顺利地保留固有的多能性和免疫调节活性，甚至表现出更优异的效果。即，根据本发明，如果干细胞培养于含有bFGF或EGF的扩增培养基中，作为干细胞固有特性的多能性和免疫调节活性能更好地被维持，因而获得优异的临床效果。

已知脂肪来源的基质干细胞不诱发对异体细胞的免疫反应，但具有免疫调节活性以抑制诱发的免疫反应。本发明提出异体脂肪干细胞可用于瘘的治疗。例如，当在活化克罗恩氏病患者的外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell)的条件下加入脂肪干细胞时，免疫反应可被抑制(或被控制)。这种情况下，异体干细胞基本上具有与自体干细胞相同或优于自体干细胞的功能。因此，自体脂肪干细胞可有效地用于治疗克罗恩氏病引起的瘘或其它类型的瘘。

本发明中用于移植的基质干细胞可通过培养1～10个传代制备，并且优选这种干细胞的50％，更优选80％对CD10、C13、CD29、CD44、CD59、CD71、CD90、CD105和Oct4呈阳性，对CD34、CD45、CD104、CD106和Stro-1呈阴性。

从下述的详细描述中可更清楚的知晓本发明的细节。

在本申请上下文中，“基质血管成分(SVF)”是指分离自脂肪组织的细胞，是指脂肪组织用胶原酶处理和离心去除大多数成熟脂肪细胞后剩下的细胞群。

“脂肪来源的基质干细胞”是指获自SVF的间充质干细胞，且还可被称为“脂肪来源的干细胞(ASC)”、“脂肪来源的成体干细胞(ADAS)”、“脂肪干细胞”等。

本申请所用的“瘘”是指体内产生的不正常通道。这种瘘的实例包括肛瘘、肛门直肠瘘、直肠阴道瘘、膀胱瘘、肠道瘘、粪瘘等，但不具体限于此。

“异体移植”是指移植同一物种的其它或另一个体的特定组织、器官或细胞，更具体地，在自体组织、器官或细胞不能使用的情况下，移植另一个人或其它动物的特定组织、器官或细胞。

本发明主要包括从自体或异体脂肪组织中收集SVF，并培养来自于SVF的脂肪来源的基质干细胞，而这一方法已经有报道。本发明通过改良美国专利No.6,777,231中提出的常规方法，提出用于治疗瘘的临床有效量的细胞的生产方法。更具体地，美国专利No.6,777,231公开的方法包括：使用胶原酶处理抽脂获得的脂肪组织并制备SVF、培养所获得的细胞群，即在含有10％牛血清的由DMEM或DMEM/F12(达尔伯克氏改良伊格尔培养基/汉姆F-12营养培养基)组成的基质培养基中的SVF，培养孵育的细胞至少一个传代直到它们生长至覆盖培养皿的80％～90％。另一方面，本发明包括：在基质培养基中孵育SVF24小时，然后，将孵育的细胞转接至还含有bFGF或EGF及基质培养基的扩增培养基中。根据本发明，可通过往基质培养基中添加0.1～100ng/ml，优选1～10ng/ml的bFGF或EGF制备扩增培养基，从而增加了细胞分化速率，并维持多能性和免疫调节活性。因此，本发明提供改良的细胞生产方法。

本发明中的脂肪来源的基质干细胞可通过抽脂或手术切除从人皮下脂肪组织中获得，但不具体限于此。

假如细胞培养的基本培养基没有特别限定为下面的描述，本发明中用于移植的自体或异体脂肪来源的基质干细胞可根据下述的方法获得。

(1)从抽脂获得的脂肪组织中分离SVF。

用KRB溶液洗涤并用胶原酶处理脂肪组织后，继续进行离心。去除上层液体，往下层加入生理上适合的盐水溶液(如磷酸缓冲液)形成悬浮液。接下来，进行离心，恢复成含有SVF的下层。

(2)在基质培养基中孵育SVF。

用基质培养基中悬浮SVF后，将浓度为10,000～40,000个细胞/cm²的悬浮液接种到培养皿中，并在那进行培养。基质培养基为含有10％牛血清的由DMEM或DMEM/F12(达尔伯克氏改良伊格尔培养基/汉姆F-12营养培养基)组成的培养基，并用于培养SVF24小时。

(3)在扩增培养基中进行孵育

去除基质培养基后，加入扩增培养基用于增殖粘附(或凝集)的细胞。扩增培养基含有10％牛血清和0.1～100ng/ml的EGF或0.1～100ng/ml的bFGF的DMEM或DMEM/F12，其作用为加速脂肪来源的(粘附或凝集的)基质干细胞的增殖，从而在短时间内显著增加细胞的数量。

(4)继代培养

当细胞充满80～90％的培养皿底部时，去除扩增培养基，用胰蛋白酶进行处理从培养皿中收获细胞。为了继代培养，细胞应当以1∶3～1∶4的比例进行稀释，然后在新的培养皿中用扩增培养基进行培养。通过如上所述的步骤，可进行进一步的继代培养。

(5)确认免疫调节活性

由于异体脂肪来源的基质干细胞根据其种类(个体)的不同而具有不同的免疫调节活性，因此在观察和鉴定获自至少一代继代培养的脂肪来源的基质干细胞的免疫调节活性后，可选择和使用具有优异免疫调节活性的异体脂肪来源的基质细胞，从而实现比自体细胞更优良的临床效果。

附图简述

通过下述的详细说明以及所附附图，将能更加清楚地知晓本发明的上述和其它目的、特征和其它优点，其中：

图1所示为基质培养基或扩增培养基中孵育的脂肪干细胞的CPDL；

图2所示为基质培养基或扩增培养基中孵育20天后的脂肪干细胞的产量；

图3为基质培养基或扩增培养基中孵育的脂肪干细胞进行肌细胞分化的照片(×40)；

图4为基质培养基或扩增培养基中孵育的脂肪干细胞进行骨细胞分化的照片(×40)；

图5所示为脂肪干细胞的免疫原性；

图6所示为脂肪干细胞在MLR中的免疫抑制活性；

图7所示为PHA-刺激的免疫反应中，自体和异体脂肪干细胞IFN-γ的分泌抑制活性；

图8所示为PHA-刺激的免疫反应中，自体和异体脂肪干细胞TNF-α的分泌抑制活性；

图9所示为PHA-刺激的免疫反应中，基质培养基和扩增培养基培养的脂肪干细胞的IFN-γ和TNF-α的分泌抑制活性(n＝9)；

图10为脂肪干细胞的细胞外基质蛋白分泌活性的照片(×40)；以及

图11为移植脂肪干细胞前后肛瘘的照片。

最佳实施方式

接下来，将详细描述本发明优选的实施方案和实施例。然而，这些实施例仅用作说明，并非旨在限制本发明。

实施例1人脂肪来源的基质干细胞的培养方法

通常通过抽脂获得脂肪组织，但不特别限于此。

根据下述方法从抽脂获得的脂肪组织中分离脂肪来源的基质细胞：用等体积的KRB溶液洗涤获得的脂肪组织3～4次以去除脂肪组织中的血液。往脂肪组织中加入等体积的胶原酶溶液，在37℃水浴中进行反应。将反应产物置于离心管中，20℃、1200rpm离心10分钟。去除作为上清液的脂肪层，不加振荡轻柔地分离出剩下的下层胶原酶溶液。将基质培养基加入到胶原酶溶液中制备悬浮液，然后于20℃、1200rpm离心5分钟。这里，沉淀部分为基质血管成分，也即SVF，而将上清液弃去。

在基质培养基中悬浮SVF，接种到培养皿中，在培养箱中于37℃、5％CO₂下培养24小时。去除培养基并用磷酸盐缓冲液(下称‘PBS’)洗涤SVF后，将SVF在含有1ng/ml浓度的bFGF或含有5ng/ml浓度的EGF的基质培养基中进行增殖。当脂肪来源的基质细胞生长至覆盖培养皿80～90％时，用胰蛋白酶处理细胞，以分离和获得单个类型的细胞。获得的单个细胞以1∶3～1∶4的比例用扩增培养基进行稀释，接下来进行继代培养。

图1所示为基质培养基或扩增培养基中孵育的脂肪干细胞的CPDL，图2所示为基质培养基或扩增培养基中孵育20天后脂肪干细胞的产量。如这些图中所示，发现如果脂肪干细胞在含bFGF或EGF及基质培养基的扩增培养基中进行孵育，细胞的生长速率是使用标准培养基，即单纯的基质培养基时的3倍。当1.5×10⁶个细胞在前述的每个培养基中孵育20天，基质培养基和扩增培养基中的平均细胞产量分别为9.7×10⁶和1.9×10⁸。因此，可以看出扩增培养基中收集的细胞约为基质培养基中的20倍。

下述表1示出了不同培养基的倍增时间和细胞产量。

表1

	基质培养基	基质培养基+bFGF
			倍增时间	122小时	48小时
细胞产量^*	9.7×10⁶	1.9×10⁸

(^*)通过在每个培养基中孵育1.5×10⁶个细胞20天后所获得的细胞平均数。

已知脂肪干细胞能继代10代或10代以上而不改变增殖速率和表型。当使用基质培养基的标准培养方法用于继代1×10⁶个脂肪干细胞时，获得的细胞数目约为3.8×10⁹个。另一方面，根据本发明，使用扩增培养基获得的细胞数目约为1.5×10¹³个，其约为用前述的基质培养基获得的细胞数目的4,000倍。

在50ml和100ml抽脂获得的脂肪组织用各自的培养基进行培养的情况下，生产1×10⁸个细胞所需的培养时间示于下表2中。

表2

	基质培养基	基质培养基+bFGF
			50ml	最少30天	15天以内
100ml	最少20天	13天以内

尽管确切的理由和/或原因还不是十分清楚，脂肪干细胞的增殖速率存在个体差异，并且由于在体外培养过程中脂肪来源的基质细胞没有活跃地增殖，细胞培养有时会失败。

下述表3所示为脂肪干细胞的培养结果，其中50ml脂肪组织获自7个不同的供体，从脂肪组织中制备脂肪干细胞并培养于各自的培养基中。用使用本发明的扩增培养基进行培养时，获得1×10⁸个细胞所需的培养时间为13～18天。另一方面，当使用标准培养方法的基质培养基时，4个批次中培养时间为约25～35天。此外，有3个批次，由于增殖不足而导致不能进行细胞生产。

表3

实施例2人脂肪来源的基质干细胞的细胞表面标志

将根据实施例1所述的相同方法获得的脂肪来源的基质细胞置于1.5ml离心管中。向其中加入1ml的FACS染色液(含有1％的胎牛血清的PBS)后，混合均匀，10,000rpm离心5秒。去除上清液后，剩下的产物用1ml的FACS染色液进行悬浮，10,000rpm离心5秒。去除上清液后，剩下的产物用300μl的FACS染色液进行重悬。将生成的样品加入到新的离心管中，考虑到样品的数量，将约0.5～1.0×10⁶个细胞置于每个离心管中。向其中加入抗体后，离心管中的物质在4℃下反应30分钟。然后，反应产物用1ml的FACS染色液进行重悬，10,000rpm离心5秒，在去除上清液。向其中加入400～500μl的FACS混合溶液将剩下的产物进行重悬。获得的悬浮液用流式细胞仪进行分析。

如下表4中所示，从分析的结果中发现至少95％的本发明增殖的脂肪干细胞对CD10、CD13、CD29、CD44、CD59、CD71、CD90、CD105和Oct4呈阳性反应，对STRO-1、CD34、CD45、CD104和CD106呈阴性反应。然而，在CD34这种情况下，取决于所提供的脂肪组织批次，约5～10％的脂肪干细胞在p0代有时呈阳性反应。没有观察到基于培养条件的差异。

表4

实施例3人脂肪来源的基质干细胞的分化能力

当根据实施例2中所述的相同方法培养的脂肪来源的基质干细胞生长至覆盖80～90％的培养皿时，将培养的细胞用胰蛋白酶进行处理以分离和获得单个细胞。

为了鉴定用各自不同的培养基培养的脂肪来源的基质干细胞肌原性分化能力，将细胞孵育于4个孔中，这样每个孔含有约5,000个细胞/cm²。将孵育的细胞培养至覆盖约80％的培养皿时更换培养基。当脂肪来源的基质干细胞覆盖100％的培养皿时，将所用的培养基弃去，替换成Promocell生产的肌细胞分化培养基，诱导干细胞分化成肌细胞2周。为了测定肌细胞分化率，用下述方法进行免疫-荧光染色：用PBS洗涤干细胞三次，用含4％甲醛的PBS固定30分钟。然后，用PBS洗涤固定后的细胞三次，将洗涤后的产物进行透化(permeabilization)，再用含5％普通山羊血清和0.1％的曲拉通(Triton)X-100的PBS封闭30分钟。往细胞中加入含有特异性地抗肌肉细胞的结蛋白和肌球蛋白一抗的PBS，在37℃下反应1小时，将反应产物用PBS洗涤三次，再用二抗反应30分钟。反应产物再用PBS洗涤三次，向其中加入封固溶液并用荧光显微镜进行观察。

图3为基质培养基或扩增培养基中培养的脂肪干细胞进行肌细胞分化的照片(×40)。如图3所示，与用基质培养基培养相比，在用含bFGF的扩增培养基培养获得的脂肪来源的基质干细胞中观察到更多的细胞对结蛋白和肌球蛋白呈阳性。也即，根据本发明，当脂肪来源的基质干细胞孵育于通过向基质培养基加入bFGF而制备的培养基中时，可以看出肌细胞的分化率得到了提高。

为了鉴定用不同的培养基培养的脂肪来源的基质干细胞骨细胞的分化，将细胞孵育于12个孔中，这样每个孔含有约20,000个细胞/cm²。将孵育的细胞培养至覆盖约100％的培养皿时更换培养基。当脂肪来源的基质干细胞覆盖100％的培养皿时，将所用的培养基弃去，替换成含有100μg/Ml抗坏血酸、10nM甘油磷酸酯、100nM地塞米松和10nM的维生素D3的骨细胞分化培养基，诱导干细胞分化成骨细胞4周。为了测定骨细胞分化率，用下述方法进行von-Kossa染色：用PBS洗涤干细胞三次，用含4％甲醛的PBS固定20分钟。然后，用蒸馏水洗涤固定后的细胞三次，向其中加入5％的硝酸银溶液，再在紫外线下暴露1小时。用蒸馏水将暴露后的材料洗涤三次，向其中加入5％的硫代硫酸钠溶液，反应2分钟。将反应产物用蒸馏水洗涤三次，向其中加入封固溶液并用显微镜观察细胞。

图4为基质培养基或扩增培养基中孵育的脂肪干细胞进行骨细胞分化的照片(×40)。如图4中所示，与用基质培养基培养相比，用含EGF或bFGF的扩增培养基培养获得的脂肪来源的基质干细胞表现出大大提高von-Kossa染色。也即，根据本发明，当脂肪来源的基质干细胞孵育于通过向基质培养基加入bFGF或EGF而制备的培养基中时，干细胞的分化率得到了提高。

实施例4人脂肪来源的基质干细胞的免疫调节活性

根据人白细胞抗原(HLA)的分析结果，选择7种具有I型和II型HLAs和脂肪来源的基质干细胞的不同组合的人外周血单个核细胞(PBMC)，再进行混合淋巴反应(MLR)。每个批次所含的PBMC作为反应细胞加入到U型底的96孔板的每个孔中，2×10⁵个细胞/孔。然后，每个批次的脂肪来源的基质干细胞作为刺激物以2×10⁴个细胞的量加入到每个孔中。作为阳性对照，2×10⁴个PBMC用丝裂霉素C处理后加入到孔中。反应后第3天，收集上清液，用ELISA方法测定分泌的IFN-γ的量。

图5所示为脂肪干细胞的免疫原性。如图中所示，对于作为阳性对照的PBMC，它们与异体PBMC反应，导致生产大量的IFN-γ。另一方面，与根据实施例1培养的脂肪来源的基质干细胞反应的前述PBMC没有分泌IFN-γ或与表现出与自体PBMC基本相同的IFN-γ分泌水平。也即，可以看出，脂肪来源的基质干细胞没有诱发对异体PBMC的免疫反应。

根据另一个实施方案，含有不同PBMC的2批次以2×10⁵个细胞/孔的量接种U型底的96-孔板中的各个孔中以诱发免疫反应，然后，向孔中分别以5,000个、10,000个和20,000个的量加入根据实施例1培养的异体脂肪来源的基质干细胞。孵育72小时后，从各个孔中收集上清液，测定IFN-γ的分泌量。

图6所示为脂肪干细胞在MLR中的免疫抑制活性。如图中所示，可以看出，当根据实施例1培养的脂肪来源的基质干细胞加入到孔中时，免疫反应被抑制(或被控制)与加入的细胞的量成比例。换言之，脂肪来源的基质干细胞没有被异体的T细胞诱发免疫反应，且IFN-γ的分泌量显著降低，从而具有免疫抑制活性，其中，IFN-γ是免疫反应发生时为促进免疫活性由免疫细胞大量分泌。

实施例5异体人脂肪来源的基质干细胞的免疫调节活性

为了鉴定自体和异体脂肪来源的基质干细胞的免疫抑制活性，获自4个不同供体的PBMC用植物-血细胞凝集素(PHA)进行活化，测定IFN-γ或TNF-α的分泌量。在自体或异体脂肪来源的基质干细胞以每孔10,000个细胞的量接种到96-孔板中后，以1×10⁵个细胞/孔向孔中的加入PBMC，再用PHA诱导免疫反应。72小时后，收集上清液，测定IFN-γ或TNF-α的分泌量。

图7所示为PHA-刺激的免疫反应中，自体和异体脂肪干细胞IFN-γ的分泌抑制活性，图8所示为PHA-刺激的免疫反应中，自体和异体脂肪干细胞TNF-α的分泌抑制活性。如图7和图8所示，当根据实施例1培养的脂肪来源的基质干细胞加入到孔中后，在自体和异体脂肪来源的基质干细胞中都显著减少了IFN-γ或TNF-α的分泌。特别是，与自体基质细胞相比，由于异体脂肪来源的基质干细胞根据其类型(个体)表现出极为不同的免疫调节活性，因此，在筛选并使用具有优良免疫调节活性的脂肪来源的基质细胞的情况下，可实现有益的临床效果。

换言之，异体脂肪来源的干细胞可控制由活化免疫细胞的分裂素诱发的免疫反应，因而具有免疫调节活性，并且这种免疫调节活性基本上同自体脂肪来源的干细胞相同或更优。

实施例6基质培养基或扩增培养基生产的人脂肪来源的基质干细胞的免疫调节活性

为了比较基质培养基或扩增培养基培养的人脂肪来源的基质干细胞的免疫调节活性，获自3个不同供体的脂肪干细胞分别用本发明公开的基质培养基或扩增培养基进行培养。三个不同供体提供的PBMC用PHA进行活化，然后向活化的PBMC中加入前述的脂肪干细胞测定IFN-γ和TNF-α的分泌量。在脂肪来源的基质干细胞以10,000个细胞的量接种到96-孔板的各个孔后，向孔中加入1×10⁵个细胞/孔的PBMC，再用PHA诱导免疫反应。72小时后，收集上清液，测定IFN-γ或TNF-α的分泌量。

图9所示为PHA-刺激的免疫反应中，基质培养基和扩增培养基培养的脂肪干细胞的IFN-γ和TNF-α的分泌抑制活性(n＝9)。如图9所示，可以看出，与用基质培养基生产的干细胞相比，当根据实施例1的扩增培养基培养的脂肪来源的基质干细胞加入后，IFN-γ和TNF-α的分泌抑制活性显著增加。即，与现有的标准培养方法相比，根据本发明生产的脂肪来源的干细胞能更有效地抑制(或控制)由分裂素诱导的免疫反应。

实施例7人脂肪来源的基质干细胞的ECM蛋白分泌活性

将实施例1培养的脂肪来源的基质细胞接种到4-孔板的各个孔中，置于培养箱中。用PBS洗涤细胞三次，用含有4％甲醛的PBS固定30分钟。然后，用PBS洗涤固定后的细胞三次，洗涤后的产物进行透化并用含5％普通山羊血清和0.1％的曲拉通X-100的PBS封闭30分钟。向处理后的细胞中加入含有一抗的PBS，在37℃下反应1小时，将反应产物用PBS洗涤三次，再用二抗反应30分钟。产物再用PBS洗涤三次，向其中加入封固溶液并用荧光显微镜进行观察。

图10为脂肪干细胞的细胞外基质(ECM)蛋白分泌活性的照片。如照片中所示，本发明培养的脂肪干细胞对胶原蛋白I、III、IV和V型、纤连蛋白、层粘连蛋白。也即，根据本发明培养的脂肪来源的基质细胞可表达各种类型的ECM，如胶原蛋白I、III、IV和V型、纤连蛋白、层粘连蛋白等，从而当前述的细胞移植到体内后，使细胞的移植和/或新组织的形成更加容易。

实施例8用脂肪来源的基质细胞治疗克罗恩氏瘘的示例性实施例

为了将根据实施例1中所述的相同方法培养的脂肪来源的基质细胞进行临床应用，对克罗恩氏瘘患者进行临床试验。所制备的细胞培养1～3代。然后，根据瘘的大小，将浓度为1～2×10⁷个细胞/ml的细胞沿着瘘壁移植4～14ml。细胞移植后，用纤维蛋白胶填充瘘。

病例1：

24岁的女性患者，10年前被诊断出患有克罗恩氏病，并于2年前进行瘘管切除术。然而，手术后的1年半，由于疾病的复发，患者又进行了手术切除。尽管施用咪唑硫嘌呤、英利昔单抗等，也没有改善疾病的状态。由于肛瘘及其炎症的持续复发，目标肛瘘的大小约为5.5cm(深度)×2cm(直径)，具有分泌大量脓液的脓肿，并严重恶化(见图11A)。从患者的腹部获取约50ml的脂肪组织，将脂肪组织培养直至第3代，从而获得总量为2.8×10⁸个细胞。总生产周期为21天。细胞移植前，应用刮除术去除发炎的组织，将浓度为2×10⁷个细胞/ml的细胞从瘘束的内侧沿着瘘束进行移植。细胞移植后，用纤维蛋白胶填充瘘。细胞移植后，进行3周的后续观察，发现瘘束基本闭合，大多数的外部开口形成上皮。8周的后续观察结果发现，肛瘘部分彻底闭合，外部开口彻底地形成上皮(通过轻轻拆开上皮形成部分鉴定瘘束内部的彻底闭合)。

病例2：

24岁男性患者，10年前被诊断为患有克罗恩氏病，在过去的3年中进行过3次瘘管切除术。然而，他还是持续复发该疾病并重复进行手术切除。尽管施用类固醇、英利昔单抗等，疾病的状态也没有改善。由于肛瘘及其炎症的持续复发，目标肛瘘位于离肛门1cm处10点钟的位置，大小为7cm(深度)×1cm(直径)，具有分泌大量脓液的脓肿，并严重恶化(见图11B)。从患者的腹部获取约70ml的脂肪组织，将脂肪组织培养直至第3代，从而获得总量为3×10⁸个细胞。总生产周期为20天。细胞移植前，应用刮除术去除发炎的组织，将浓度为2×10⁷个细胞/ml的细胞从瘘束的内侧沿着瘘束进行移植。细胞移植后，用纤维蛋白胶填充瘘。细胞移植后，进行2周的后续观察，发现至少一半移植前原始深度约为7cm的瘘束闭合，剩下的深度为约3cm。8周的后续观察结果发现，肛瘘部分彻底闭合，其外部开口彻底地形成上皮(通过轻轻拆开上皮形成部分鉴定瘘束内部的彻底闭合)。

图11为移植脂肪干细胞前后肛瘘的照片。

如前述临床实施例中举例说明，可以看出对药物没有响应并持续复发难以用常规方法治疗的肛瘘，可用本发明方法培养的脂肪干细胞进行有效的治疗。特别是，如移植病例1和2中所述，还未有公开的治疗严重肛瘘如直径大于1cm和/或深度大于5cm的大尺寸的瘘束的方法。为了生产移植到肛瘘的细胞，可应用实施例1提出的改良培养方法培养大量的脂肪干细胞。根据本发明的培养方法，通过培养2或3代，可提供比WO2006/136244(2006年12月28日)公开的常规方法多10倍的脂肪组织来源的基质细胞。此外，治疗结果是显著的，从而提高临床效果。

工业实用性

本发明的培养方法通过改良常规的培养方法，可在短期内有效生产临床有效量的脂肪组织来源的基质干细胞。

与通过常规方法生产的细胞组合物相比，通过本发明方法获得的含有脂肪组织来源的基质干细胞的脂肪干细胞组合物表现出优异的多能性与免疫调节活性，因而更适于治疗瘘。特别是，考虑到临床应用，异体脂肪来源的干细胞是极佳的。

Claims

1.制备含有脂肪来源的基质干细胞的脂肪干细胞组合物的方法，该方法包括如下步骤：

(a)从目标体中收集脂肪组织；

(b)从脂肪组织中分离基质血管成分(SVF)；

(c)在基质培养基中培养SVF；

(d)在含有浓度为1-10ng/ml的EGF或bFGF作为生长因子的扩增培养基中培养SVF，以培养脂肪来源的基质干细胞；和

(e)培养脂肪来源的基质干细胞至少一代。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述脂肪组织收集自异体目标体。

3.根据权利要求2所述的方法，其还包括测定通过培养至少一代获得的脂肪来源的基质干细胞的免疫调节活性，以及选择具有极佳的免疫抑制活性的异体脂肪来源的基质干细胞。