JP2012525377A - 瘻孔治療のための自家及び同種異系の脂肪由来間質幹細胞組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の方法は、従来の標準的培養法を改善することによって、臨床的に有効な数の脂肪組織由来間質細胞を短期間に効率よく製造できる。本発明の方法により得られる脂肪組織由来間質細胞を含む脂肪幹細胞組成物は、従来の方法により製造された細胞組成物を越える優れた多分化能及び免疫調節活性を示すので、瘻孔治療にさらに適している。特に同種異系の脂肪由来幹細胞においては免疫応答が抑制されるので、本発明の細胞組成物は優れた臨床的用途を有している。
【選択図】図1
Description
(2)外肛門括約筋を貫通して形成された瘻管を有している括約筋貫通タイプの痔瘻(trans-sphincteric type);
(3)外肛門括約筋の上部に形成された瘻管を有している括約筋上部タイプの痔瘻(supra-sphincteric type);及び
(4)肛門腺窩に形成されず、直腸上部付近に形成された1次瘻孔を有している括約筋外部タイプの痔瘻(extra-sphincteric type)。
(a) 対象から脂肪組織を採取すること;
(b) 脂肪組織から間質血管分画(stromal vascular fraction、SVF)を単離すること;
(c) SVFを間質培地で培養すること;
(d) SVFを成長因子であるEGFまたはbFGFを含む増殖培地で培養して、脂肪由来間質幹細胞を培養すること;及び
(e) 脂肪由来間質幹細胞を少なくとも1継代培養すること。
脂肪組織をKRB溶液で洗浄して、コラゲナーゼで処理した後、遠心分離を行う。脂肪の上層を除去し、下層に生理学的に適した食塩水溶液(すなわち、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を加えて懸濁液を形成する。続いて、遠心分離によってSVFを含有している下層を回収する。
SVFを間質培地に懸濁させた後、懸濁液を10,000〜40,000cells/cm2の濃度で培養容器に接種して、そこで培養する。間質培地は10%ウシ胎仔血清を含んでいるDMEM又はDMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Broth)を含有する培地であって、、SVFを約24時間培養するために用いる。
間質培地を除去した後、増殖培地を加えて接着(又は付着)細胞を増殖する。増殖培地は10%ウシ胎仔血清、及び0.1〜100ng/ml濃度のEGF又は0.1〜100ng/ml濃度のbFGFを含むDMEM又はDMEM/F12であって、脂肪由来の(接着性又は付着性)間質幹細胞を迅速に増殖させて、それによって細胞の数を短期間に大幅に増加させるように機能する。
細胞が培養容器の底部の80〜90%を満たしたら、増殖培地を除去して、トリプシン処理を行って、細胞を培養容器から採取する。継代培養のために、細胞を1:3〜1:4の比で希釈し、次いで新たな培養容器において増殖培地を用いて培養する。上記と同様の方法により、さらに継代培養を実施できる。
同種異系の脂肪由来間質幹細胞はそのタイプ(個体)によって異なった免疫調節活性を有しているので、少なくとも1継代の継代培養後に得られた脂肪由来間質幹細胞の免疫調節活性を観察して確認した後、優れた免疫抑制能を有する同種異系の脂肪由来間質幹細胞を選択して使用することができ、それによって自家細胞を越える優れた臨床効果が実現する。
脂肪組織は通常脂肪吸引術により得られるが、これに特に限定されない。
次の表1は培養培地による倍加時間(doubling time)及び細胞収量を示す。
前記実施例1と同様な方法で取得した脂肪由来間質細胞を1.5mlの遠心分離用チューブに移し入れた。FACS染色溶液(1%ウシ胎仔血清を含むPBS)1mlをそこに加えて、均一になるまでよく混ぜ合わせて、10,000rpmで5秒間遠心分離した。上澄液を除去した後、残留する生成物をFACS染色溶液1mlに懸濁して、10,000rpmで5秒間遠心分離した。上澄液を除去した後、残留する生成物をFACS染色溶液300μlに再懸濁した。サンプルの数を考慮して、得られたサンプルをそれぞれの遠心分離用チューブに約0.5〜1.0×106個の細胞が含まれるように、新たな遠心分離用チューブに分注した。そこに抗体を添加した後、チューブの内容物を4℃で30分間反応させた。次いで、反応生成物をFACS染色溶液1mlに再懸濁して、10,000rpmで5秒間遠心分離した後、上澄液を除去した。そこにFACS固定液400〜500μlを添加して残留生成物を再懸濁した。得られた懸濁液をフローサイトメータを用いる分析に付した。
実施例2と同様な方法で培養した脂肪由来間質幹細胞が、培養容器の80〜90%に生育したときに、培養した細胞をトリプシン処理して単離し、単一細胞を取得した。
ヒト白血球抗原(Human Leukocyte Antigen;HLA)の分析結果に従って、HLAタイプI及びIIの多様な組み合わせを有する7種類のヒト抹消血単核細胞(Peripheral Blood Mononuclear Cell; PBMC)と脂肪由来間質幹細胞を選択し、次いで混合リンパ球反応(Mixture Lymphocyte Reaction; MLR)を行った。U底96ウェルプレートの各ウェルに、キラー細胞(responder cell)として、各ロットのPBMCを2×105細胞/ウェルになるように添加した。次いで刺激細胞(stimulator)として、各ロットの脂肪由来間質幹細胞を各ウェルに2×104 細胞の量で添加した。陽性対照として、PBMC2×104個をマイトマイシンCを用いて処理してウェルに添加した。反応後3日目に、上澄液を収集して、分泌されたIFN−γの量をELISA法を用いて測定した。
同種異系及び自家の脂肪由来間質幹細胞の免疫抑制活性を確認するため、相異なる4名のドナーから得たPBMCを植物性血球凝集素(PHA)で活性化して、IFN−γ又はTNF−α分泌の量を測定した。96ウェルプレートのそれぞれに自家又は同種異系の脂肪由来間質幹細胞を10,000細胞の量で接種した後、1×105細胞/ウェルのPBMCをウェルに添加して、次いでPHAを用いて免疫応答を誘発した。72時間後に、上澄液を採取して、IFN−γ又はTNF−α分泌の量を測定した。
間質培地または増殖培地で産生したヒト脂肪由来間質幹細胞の免疫調節活性を比較するために、相異なる3名のドナーから得た脂肪幹細胞をそれぞれに間質培地または本発明で開示した増殖培地で培養した。3名の別々のドナーから得たPBMCをPHAを用いて活性化した後、前記の脂肪幹細胞を活性化したPBMCに添加して、IFN−γ及びTNF−αの分泌量を測定した。96ウェルプレートの各ウェルに脂肪由来間質幹細胞を10,000細胞の量で接種した後、1×105細胞/ウェルのPBMC(抹消血単核球)をウェルに添加して、次いでPHAを用いて免疫応答を誘発した。72時間後に、上澄液を採取して、IFN−γ又はTNF−αの分泌量を測定した。
実施例1において培養した脂肪由来間質細胞を4ウェルプレートの各ウェルに接種して培養容器に入れた。細胞をPBSで3回洗浄して、4%のフォルムアルデヒドを含むPBSを30分間用いて固定した。次いで、固定した細胞をPBSで3回洗浄した後、洗浄した生成物を5%正常山羊血清及び0.1%トリトンX−100を含むPBSを30分間用いて透化処理及びブロッキングした。処理した物質に1次抗体を含むPBSを添加して37℃で1時間反応させた後、反応生成物をPBSで3回洗浄し、2次抗体で30分間反応させた。生成物をPBS(リン酸塩緩衝溶液)で再度3回洗浄した後、洗浄した生成物はマウント溶液をそれに適用してマウントし、蛍光顕微鏡で観察した。
実施例1に記載と同様の方法により培養した脂肪由来間質細胞の臨床的適用のため、クローン性瘻孔患者を対象にして臨床試験を施した。調製した細胞を1〜3継代培養した。1〜2×107細胞/ml濃度の細胞を瘻孔のサイズによって4〜14ml容量で瘻孔壁に沿って移植した。細胞移植後に、瘻孔をフィブリン糊で充填した。
本患者は24歳の女性患者であって、10年前にクローン病の診断を受け、2年前に瘻孔切除術を受けた。しかし、術後1年6ヶ月に、患者は疾患の再発により、外科的切除手術を受けた。アザチオプリン(Azathioprine)、レミケード(Remicade)などを投与されたが、病状は改善しなかった。痔瘻の継続的な再発とその炎症によって、対象である痔瘻サイズが5.5cm(深さ)×2cm(直径)で、膿瘍の排出が多く、相当に悪化していた(図11のAを参照されたい)。患者の腹部から約50mlの脂肪組織を採取し、脂肪組織を3継代まで培養して、総数2.8×108個の細胞を得た。総産生期間は21日であった。細胞移植前に、掻爬を施して炎症組織を除去して、2×107細胞/ml濃度で細胞を瘻孔管の最深部から瘻孔管に沿って移植した。移植後に、フィブリン糊を利用して瘻孔管を充填した。細胞移植後2週間の追跡観察から、瘻孔管が殆ど閉鎖して、外部開口の殆どに上皮化が起こったことが分かった。8週間追跡観察の結果、痔瘻部位が完全に閉鎖して、外部開口が完全に上皮化されたことが観察された(上皮化した部分を少し擦って内部瘻孔管が完全に閉鎖したことを確認した)。
本患者は24歳の男性患者であって、10年前にクローン病と診断されて、過去3年の間に3回瘻孔切除術を受けた。しかし、病気の継続的な再発と外科的切除手術を繰り返した。ステロイド、レミケードなどを投与されたが、病状は改善しなかった。痔瘻の継続的な再発とその炎症によって、対象である痔瘻は肛門から1cmの距離の10時の方向に位置し、サイズが7cm(深さ)×1cm(直径)で、膿瘍の排出が多く、相当に悪化していた(図11のBを参照されたい)。患者の腹部から約70mlの脂肪組織を採取し、脂肪組織を3継代まで培養して、総数3×108個の細胞を得た。総培養期間は20日であった。細胞移植の前に、掻爬を施して炎症組織を除去し、2×107細胞/ml濃度で細胞を瘻孔管の最深部から瘻孔管に沿って移植した。移植後に、フィブリン糊を利用して瘻孔管を充填した。細胞移植後、2週間の追跡観察から、細胞移植前に元々約7cmの深さであった瘻孔管の少なくとも半分が閉鎖して、約3cmの深さになっていた。8週間の追跡観察の結果、痔瘻部位が完全に閉鎖し、その外部開口が完全に上皮化されたことが観察された(上皮化した部分を少し擦って内部瘻孔管が完全に閉鎖したことを確認した)。
図11は脂肪幹細胞移植の前及び後の痔瘻を示す写真である。
Claims (11)
- 同種異系の脂肪由来間質幹細胞を含有してなる、瘻孔治療のための脂肪幹細胞組成物。
- 前記幹細胞が、少なくとも1継代培養して製造される、請求項1に記載の組成物。
- 前記脂肪幹細胞組成物の少なくとも50%が、CD10、CD13、CD29、CD44、CD59、CD71、CD90、CD105及びOct4に対して陽性であるが、CD34、CD45、CD104、CD106及びStro−1には陰性である、請求項1に記載の組成物。
- 前記脂肪幹細胞組成物の少なくとも80%が、CD10、CD13、CD29、CD44、CD59、CD71、CD90、CD105及びOct4に対して陽性であるが、CD34、CD45、CD104、CD106及びStro-1には陰性である、請求項1に記載の組成物.
- 方法が次の工程:
(a)対象から脂肪組織を採取すること;
(b)脂肪組織から間質血管分画(SVF)を単離すること;
(c)SVFを間質培地で培養すること;
(d)SVFを、成長因子としてEGF又はbFGFを含む増殖培地で培養して、脂肪由来間質幹細胞を培養すること;及び
(e)脂肪由来間質幹細胞を少なくとも1継代培養すること;
を含有してなる、脂肪由来間質幹細胞を含む脂肪幹細胞組成物を製造する方法。 - 工程(d)の増殖培地が、0.1〜100ng/mlの濃度でEGF又はbFGFを含む、請求項5に記載の方法。
- 増殖培地が、1〜10ng/mlの濃度でEGF又はbFGFを含む、請求項6に記載の方法。
- 脂肪組織を同種異系の対象から採取する、請求項5に記載の方法。
- 少なくとも1継代培養して得た脂肪由来間質幹細胞の免疫調節活性を確認して、優れた免疫抑制活性を有する同種異系の脂肪由来間質幹細胞を選択する工程をさらに含んでなる、請求項8に記載の方法。
- 請求項5〜9のいずれか1項に記載の方法によって製造した、脂肪幹細胞組成物。
- 請求項10に記載の脂肪幹細胞組成物を患者の瘻孔に投与する工程を含有してなる、瘻孔を治療する方法。
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