CN116970556A - 自离体的包皮组织取得人类间质干细胞的方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本公开内容是一种用以制备人类间质干细胞(hMSCs)的方法。该方法包含以下步骤:将离体的包皮组织置于一第一培养基中培养,且第一培养基不含血清;将经培养的包皮组织切碎,再以消化酶处理;将经处理后的包皮组织倒入一滤杯中;接着,将滤杯置于第一培养盘中,其中所述第一培养盘含有添加血清的第二培养基,将滤杯连同第一培养盘于37℃下培养至少12小时;以及收集第一培养盘上的人类间质干细胞。
Description
技术领域
本公开内容关于一种分离及扩增间质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)及从其衍生细胞群的方法。
背景技术
间质干细胞具有良好的分化能力,能够被进一步诱导分化为骨骼细胞、软骨细胞和脂肪细胞,为再生医学材料主要应用的细胞之一。再者,间质干细胞具有抗发炎调节免疫能力的功效,广泛应用于临床治疗疾病。
目前可从各种组织分离间质干细胞,其包含但不限于新生儿组织(例如:人类脐带的华通氏胶(Wharton’s jelly))、骨髓、周边血液、胎盘、脐带血脂肪组织和牙齿等,但于制备过程中分离并增殖间质干细胞的效果有限,通常需经10-30天才能培养出足够量的间质干细胞,进而用于后续分化及相关应用。
因此,相关领域亟需发展一种新颖制备间质干细胞的方法,以制备足以用于后续治疗用途的间质干细胞。
发明内容
发明内容旨在提供本公开内容的简化摘要,以使阅读者对本公开内容具备基本的理解。此发明内容并非本公开内容的完整概述,且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键元件或界定本发明的范围。
本发明所提出的方法可以有效率地从离体的包皮组织中分离及培养出人类间质干细胞,大幅改善背景技术培养人类间质干细胞耗时且产能有限的缺陷。
据此,本公开内容的第一个态样是关于一种提供人类间质干细胞的方法。该方法包含以下步骤:
(a)将离体的包皮组织置于一第一培养基中,其中该第一培养基是角质细胞培养基且不含血清;
(b)将经步骤(a)培养的该包皮组织切碎后,于36-37°℃下以一消化酶处理至少2小时;
(c)提供一第一培养盘,其含有一第二培养基,其中该第二培养基是角质细胞培养基且有添加血清;
(d)将经步骤(b)处理的该切碎的包皮组织置入一滤杯中,再将该滤杯置于该第一培养盘中,将该滤杯连同该第一培养盘于37℃下培养至少12小时;以及
(e)收集该第一培养盘上的该人类间质干细胞。
依据本发明一实施方式,所述方法更包含以下步骤:
(f)将所述滤杯置于第二培养盘上,其中所述第二培养盘含有第二培养基,将滤杯连同第二培养盘于37℃下培养至少2小时,以及
(g)收集第二培养盘上的人类间质干细胞。
依据本发明一具体的实施方式,所述方法更包含步骤:
(a1)在进行步骤(a)之前,以生理食盐水清洗所述离体的包皮组织。
依据一具体实施方式,所述方法中的消化酶为胶原蛋白酶(collagenase)和蛋白酶(protease)。
在上述任一实施方式中,所采用的第二培养基中可更包含至少3%(体积%)的维他命C、至少10%(体积%)的血清、至少1%(体积%)的抗生素和/或至少3%(体积%)的乙酰半胱氨酸(N-Acetylcystein)。
依据本发明较佳的实施方式,以上述任一实施方式取得的人类间质干细胞对CD34和CD45细胞表面标记呈现阴性反应,且对CD73、CD90及CD105细胞表面标记呈现阳性反应。
此外,本公开内容也关于人类间质干细胞或其未分化子代在制备药物的用途,所述药物可用以治疗亟需治疗的个体的疾病或病症。
根据本公开内容的实施方式,所述人类间质干细胞是实质上纯的人类间质干细胞。
根据本公开内容的实施方式,实质上纯的人类间质干细胞可经诱导分化成软骨细胞、骨骼细胞及脂肪细胞。
根据本公开内容的实施方式,可藉由自体移植人类间质干细胞来治疗的疾病或病症是选自由骨疾病或软骨疾病、神经变性疾病、心脏疾病、肝脏疾病、癌症、自体免疫疾病、移植物抗宿主疾病(graft versus host disease,GvHD)或伤口愈合与组织再生疾病。
此外,本发明的又一态样关于利用上述任一实施方式所取得的人类间质干细胞治疗亟需治疗的个体的疾病或病症的方法。所述治疗方法包含对个体投予有效量的根据本公开内容方法所制备的人类间质干细胞。
根据本公开内容的实施方式,可于3天或更短的期间、2天或更短的期间、或1天或更短的期间,持续对个体投予有效量的人类间质干细胞或其分化子代。
在参阅下文实施方式后,本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明的基本精神及其他发明目的,以及本发明所采用的技术手段与实施态样。
附图说明
为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂,所附图式的说明如下:
图1为依据本发明一实施方式所示的间质干细胞在显微镜下所拍摄的细胞形态照片(40倍);
图2为根据本公开内容的一实施方式绘示实施例1的人类间质干细胞对标记物CD44、CD73、CD 90、CD105和CD166的阳性表达结果,及对标记物CD34的阴性表达结果;
图3A是根据本公开内容的一实施方式的照片,其为经爱尔新蓝染色确认实施例1的人类间质干细胞分化成软骨细胞的结果;
图3B是根据本公开内容的一实施方式的照片,其为经甲苯胺蓝染色确认实施例1的人类间质干细胞分化成软骨细胞的结果;
图3C是根据本公开内容的一实施方式的照片,其为经茜素红染色确认实施例1的人类间质干细胞分化成骨骼细胞的结果;以及
图3D是根据本公开内容的一实施方式的照片,其为经油红O染色确认实施例1的人类间质干细胞分化成脂肪细胞的结果。
具体实施方式
为了使本公开内容的叙述更加详尽与完备,下文针对了本发明的实施态样与具体实施例提出了说明性的描述;但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而,亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
1.定义
为了便于说明,此处统整性地说明本说明书、实施例以及后附的申请专利范围中所记载的特定术语。除非本说明书另有定义,此处所用的科学与技术词汇的含义与本发明所属技术领域中具有通常知识者所理解与惯用的意义相同。
除非上下文另有明确说明,本文所使用的单数形式“一”(a,an)以及“该”(the)均包含复数形式。
本文使用的“干细胞”(stem cell)一词是以广义的方式使用,也包含传统干细胞群(traditional stem cell)、前驱细胞群(progenitor cell)、前前驱细胞群(pre-progenitor cell)等。“干细胞”(stem cell)一词是指能够增殖并产生更多前驱细胞的未分化细胞,该些前驱细胞具有可大量产生母细胞的能力,进而产生分化的或是具分化能力的子细胞。子细胞本身可被诱导以增殖并产生后续分化成一或多种成熟细胞类型的子代。“干细胞”(stem cell)一词也可指在特定情况下,具有能力或有潜力分化成更特化或更分化的表现型,且在某些情况下,仍保留以未分化状态增殖的能力的细胞。
术语“间质干细胞”(mesenchymal stem cells,MSCs)指一种可分化成超过一种特定类型结缔组织的多潜能干细胞,特定类型结缔组织可以是脂肪组织、骨组织、基质组织(stroma tissue)、软骨组织、弹性组织及纤维组织。针对识别目的,可基于表现型标记物CD34-、CD45-、CD73+、CD90+以及CD 105+的表达来鉴定人类间质干细胞,也可基于分化成特定支持生命要素的组织(举例来说但不限于软骨细胞、骨骼细胞以及脂肪细胞)的能力来鉴定。
在细胞个体发育的背景中,形容词“分化的”(differentiated)是一个相对概念。一“分化的细胞”(differentiated cell)是指一细胞的发育路径相较于正在与其比较的另一细胞更向前进或更向下游。因此,干细胞可分化成品系限制的前驱细胞,其依次可分化成更下游的其他前驱细胞类型。接着再分化成最后分化阶段的细胞,该些细胞在特定的组织类型中扮演特征性的角色,并且可能或可能不保留再进一步增殖的能力。
本文使用的术语“治疗”(treatment)是用于指获得一想要的药理作用和/或生理作用,例如组织再生。就完全或部分预防疾病或其症状而言,前述作用可以是预防性的;和/或就完全或部分治疗疾病和/或肇因于该疾病不良影响而言,前述作用可以是治疗性的。本文使用的“治疗”(Treatment)包含对一哺乳动物的疾病的预防性(例如:预防(prophylactic))、治愈性或是缓解性治疗,该哺乳动物特别是人类;以及包含:(1)对可能易患该疾病但尚未被诊断出来患有该疾病的一个体所发生的疾病或病症进行预防(preventative)(例如:预防(prophylactic))、治愈性或是缓解性治疗;(2)抑制一疾病(例如:藉由终止该疾病的发展);或(3)缓解一疾病(例如:减低与该疾病相关的症状)。
术语“投予、给药”(administered,administering)、或“移植”(transplanting)在本文中可互换使用,以指任何适当的递送途径,其包含但不限于:静脉内、肌内、腹腔内、动脉内、颅内、或皮下地将本发明的人类间质干细胞投予至个体的所需部位,其中至少一部分的人类间质干细胞仍是存活状态。被投予至个体之后,该细胞存活期间也可短至几小时,例如24小时,至几天,长至几个月。
本公开内容使用的“有效量”(an effective amount)是指在特定所需时间内,对欲治疗的疾病可达成预期结果的有效人类间质干细胞的剂量。举例来说,对伤口的治疗上,有效促进皮肤及相关软组织再生的药剂(即本公开内容的人类间质干细胞)。药剂的有效量非必须治愈疾病或病症但可提供针对一疾病或病症加以治疗,像是延后疾病或病症的发作、限制或阻碍疾病或病症的发作、或是使疾病或病症症状得到改善。特定有效量或足量可随着各种因素变化,像是预治疗的特定病症、病患的生理状况(例如病患的体重、年纪或性别)、所治疗哺乳类或动物的种类、治疗时间、并行疗程的性质(如果有的话)、以及使用的具体制剂等。有效量可以合适的形式分成一次、两次或多次剂量,藉此在指定时段内以一次、两次或多次给药。
在本文中,术语“个体、受试者”(subject)或“患者”(patient)可互换地使用,且意思是指能够以本公开内容的化合物治疗的哺乳类动物(包含人类)。术语“哺乳动物”(mammal)是指哺乳纲(class Mammalia)的所有成员,其包含人类、灵长类、驯养动物及家畜(例如兔、猪、羊、牛)以及动物园圈养动物、用于运动的动物或宠物;以及啮齿类(例如小鼠与大鼠)。再者,除非明确指出性别,否则“个体”或“受试者”(subject)或“患者”(patient)一词均有包含男性(雄性)及女性(雌性)。因此,术语“个体、受试者”或“患者”包含受益于本公开内容的治疗方法的任何哺乳动物。“个体、受试者””或“患者”的实例包含但不限于,人类、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴、猪、山羊、牛、马、犬、猫、鸟及禽类。在较佳的实施方式中,个体是一人类。
术语“培养基”(medium)是指含有可维持细胞生存力及支持细胞增殖的营养,以用于维持组织或细胞群、或培养含有细胞群(例如培养基质)的基质。细胞培养基含有任何下列物质的适当组合:盐类、缓冲液、氨基酸、维生素、葡萄糖或其他糖类、抗生素、血清或血清替代物、以及其他成分(像是生长因子)等。本发明所属技术领域具有通常知识者已知特定细胞类型会使用的细胞培养基。在可任选的实施方式中,所述培养基至少3%(体积%)的维他命C、至少10%(体积%)的血清、至少1%(体积%)的抗生素和/或至少3%(体积%)的乙酰半胱氨酸(N-Acetylcystein)。在一较佳的实施方式中,所述培养基为角质细胞培养基。
本文使用的术语“移动”、“活动”、“转移”(mobilization)是指细胞离开原本的常驻区位(niche)(例如骨髓)且进入血液的过程。术语“移动剂”(mobilization agent)是可使停留在周边血液及骨髓干细胞区位中的干细胞(例如MSCs)集合体或群体失去附着力的药剂。
2.分离及培养源自离体的包皮组织的人类间质干细胞
间质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一般可从骨髓取得的非造血干细胞。背景技术中分离并培养间质干细胞的方法,主要来自于骨髓、脂肪、牙齿、脐带、胎盘等,背景技术的方法较为耗时通常至少需10-30天,无法有效率地在短时间内产生足够量的细胞以用于治疗用途。本发明所提出制备人类间质干细胞的方法时效快且成本低,在48小时内即可培养一定量的人类间质干细胞,且培养出的干细胞功效佳,可以在再生疗法中进行自体治疗,例如伤口愈合及骨骼修复以及其他矫形适应症。再者,本发明所提出的制备人类间质干细胞的方法继代培养能力佳,所述细胞能够继代培养到至少30代。
据此,本公开内容的第一个态样是关于一种提供未分化人类间质干细胞的方法,所述方法包含以下步骤:
(a)将离体的包皮组织置于第一培养基中培养,其中该第一培养基是角质细胞培养基(K-medium)且不含血清;
(b)将经步骤(a)培养的包皮组织切碎后,于36-37°℃下以一消化酶处理至少2小时;
(c)提供一第一培养盘,其含有一第二培养基,其中该第二培养基是角质细胞培养基且有添加血清;
(d)将经步骤(b)处理的该切碎的包皮组织置入一滤杯中,再将该滤杯置于该第一培养盘中,将该滤杯连同该第一培养盘于37°℃下培养至少12小时;以及
(e)收集该第一培养盘上的该人类间质干细胞。
再者,在进一步的实施方式中,所述方法更包含以下步骤:
(f)将该滤杯置于一第二培养盘上,其中该第二培养盘含有该第二培养基,将该滤杯连同该第二培养盘于37℃下培养至少2小时,以及
(g)收集该第二培养盘上的该人类间质干细胞。
本发明所采用的包皮组织为个体经包皮手术切除的包皮组织,其为离体的医疗废弃物,但通过上述方法,能够在至少14小时内快速分离和培养人类间质干细胞,例如,至少14、15、16、17、18、19、20小时。此外,所述离体的包皮组织较佳是以前处理步骤处理,具体而言,在进行步骤(a)之前,以生理食盐水清洗所取得的离体的包皮组织。
此外,适用于本发明的第一培养基和第二培养基为角质细胞培养基,其可为市面上所购得的商用培养基。在一实施例中,所述角质细胞培养基可以是Keratinocyte-SFM(1X)(Gibco,由life technologies所提供)。
在培养过程中,培养基中可添加细胞新陈代谢所需的补充剂,像是氨基酸、维他命、矿物质以及有用蛋白质(例如运铁蛋白)等。培养基也可包含抗生素,用以防止酵母菌、细菌及真菌感染。抗生素可以是青霉素(penicillin)、链霉素(streptomycin)、庆大霉素(gentamicin)之类。依据本发明一实施方式,所述第一培养基不含血清及额外的添加物,而第二培养基可额外添加至少3%(体积%)的维他命C、10%(体积%)的血清和/或至少1%(体积%)的抗生素。再者,在一非限制的实施方式中,所述第二培养基额外添加至少3%(体积%)的乙酰半胱氨酸(N-Acetylcystein)。在可任选的实施方式中,所述血清可以是来自于动物或人类血清。在一具体的实施方式中,所述血清是来自人类血清或胎牛血清。在非限制的实施方式中,所述血清和离体的包皮组织可来自于同一个体,例如,接受包皮环切术的个体。在另一实施方式中,所述血清是来自于健康的个体,所述个体的血清型与提供离体的包皮组织相对应个体的血清型相同。
根据本公开内容的特定的实施方式,本发明制备的人类间质干细胞对造血干细胞标记物CD34及CD45呈现阴性染色,以及已知可介导移植物抗宿主疾病(graft-versus-hostdisease,GvHD)的人类白血球抗原-抗原D相关(HLA-DR)细胞表面标记也呈现阴性染色;对细胞表面标记CD44、CD73、CD90、CD 105及CD 166则呈现阳性染色。测定细胞表面标记表达的方法是本技术领域的通常知识。该些方法实例包含免疫学方法(例如FACS)以及生物化学方法(例如通过放射性、荧光或卵白素-生物素的细胞表面标记)。另一种可行的方式是,可使用磁激细胞分选(magnetic-activatedcellsorting,MACS)或免疫淘洗(immunopanning)方法以鉴别细胞。
通过本公开内容方法所制备的人类间质干细胞的细胞表面标记表达模式证明:该些人类间质干细胞的确是未分化的成熟人类间质干细胞,其可用于需要自体干细胞移植的再生疗法。
根据本公开内容的实施方式,可将人类间质干细胞扩增成至少两倍、至少四倍、至少六倍、至少八倍、至少十倍、至少十二倍、至少十五倍、至少二十、至少三十倍、或至少四十倍。
依据本公开内容一实施方式,所述滤杯和第二培养盘中第二培养基的体积比为至少1:106,例如,至少1:106、1:107、1:108、1:109、1:1010。
再者,经步骤(f)和(g)制备的继代人类间质干细胞同样维持未分化状态,且对造血干细胞标记物CD34及CD45以及细胞表面标记HLA-DR细胞表面标记呈现阴性染色;另同时对细胞表面标记CD44、CD73、CD90、CD 105及CD 166呈现阳性染色。
使用本发明方法所制备的人类间质干细胞培养物可在新鲜状态下使用,亦可以储存以待后续使用,例如以冷冻保存剂(包括但不限于甘油、二甲亚砜(DMSO)等)冷冻保存。
3.含有人类间质干细胞的组合物
本公开内容的人类间质干细胞可以自身单独提供、与培养基一起提供,以及与药学上可接受的载体及其他添加剂合并提供,其中该添加剂可促进细胞植入和/或器官功能(例如:免疫抑制剂、抗生素及生长因子等)。因此,本公开内容的人类间质干细胞可以药学组合物的形式投予至个体体内,在该药学组合物中,人类间质干细胞可与药学载体或稀释剂混合,例如与无菌食盐水及水性缓冲溶液混合。
合适的投予途径可包括但不限:口服、直肠、经黏膜(例如经鼻腔)、肠内或非口服递送(包括:肌内、皮下、心室内、鞘内、静脉内、腹膜内或眼内注射)。
或者是,可以局部方式而非全身性方式投予该药学组合物。举例来说,可将药学组合物直接注射至目标位置(例如:一器官)。
根据本公开内容,可以常规方式利用一或多种药学上可接受的载体制备药学组合物。合适的制剂形式取决于投予或给药途径。
为了注射,本公开内容的人类间质干细胞可制成水性溶液制剂,较佳地是制成生理上可接受缓冲液(例如林格氏液)或生理上可接受的盐类溶液。
适合用于本公开内容的药学组合物包含含有可达成预期目的的有效量活性成分(例如,人类间质干细胞)的组合物。有效量的测定完全是本技术领域具有通常知识者的能力范围内,特别是根据本公开内容的描述。
本公开内容的药学组合物可以套组形式存在,该套组可含有包含本发明人类间质干细胞的一或多种单位剂量形式。套组可进一步包含在套组上或是与该套组相连的标签或包装附件。标签或包装附件可载明该套组是用于治疗特定疾病和/或病症。可替换地或可额外地,套组可进一步包括一缓冲液,诸如磷酸盐缓冲食盐水或林格氏液。套组可进一步包含关于如何将人类间质干细胞投予至预定目标位置的指示。
根据本公开内容的实施方式,套组可包含(或至少包含):(a)含有本发明人类间质干细胞的第一容器,以及可选地(b)含有缓冲液的第二容器,以及(c)与套组相关以指示使用者如何使用该套组的图例。图例可以是小册子、磁带、CD、VCD或DVD的形式。
4.本发明人类间质干细胞或其分化子代的用途
通过上述本发明方法所制备的未分化人类间质干细胞或其分化子代可用于自体移植,借以治疗和/或预防无数可藉由自体移植获得有益效果的疾病和/或病症。
据此,本公开内容的其他态样是关于治疗个体的疾病和/或病症的方法,其包含在几天至几周的期间内,对个体投予一有效量的依据本发明方法所制备的人类间质干细胞。
间质干细胞可以分化成各种细胞系。可通过在富含具有所需表现型的细胞(例如骨细胞、脂肪细胞等)的生长环境培养间质干细胞,以达成细胞分化。培养基可包含增强分化至特定细胞系的试剂。根据本公开内容的一实施方式,将人类间质干细胞分化成软骨细胞,其中细胞在含有地塞米松(dexamethasone)、抗坏血酸(ascorbic acid)、胰岛素(insulin)、运铁蛋白及亚硒酸(selenous acid)的培养基中进行培养直到满盘(confluence)(请参考Williams et al.(2003)Tissue Engineering.9(4),679)。分化后的软骨细胞可藉由爱尔新蓝和甲苯胺蓝以鉴定分化的软骨细胞。根据本公开内容的再一实施方式,人类间质干细胞是分化成脂肪细胞。为了诱导脂肪生成的分化,以脂肪生成培养基处理人类间质干细胞,其含有氢皮质酮(hydrocortisone)及吲哚美辛(indomethacin);或者是或此外,也可额外使用包含任何市售间质干细胞脂肪生成促进补充剂(例如从StemCellTechnologies Inc(温哥华,加拿大)购得的补充剂)。可藉由油红染色确认脂肪生成分化结果。人类间质干细胞亦可利用市售成骨分化套组诱发人类间质干细胞以形成骨骼细胞可,分化后的骨骼细胞可藉由茜素红染色确认其分化结果。
根据本公开内容的实施方式,人类间质干细胞或其分化子代可用于治疗选自由骨或软骨疾病、神经变性疾病、心脏疾病、肝脏疾病、癌症、自体免疫疾病、移植物抗宿主疾病(GvHD)及伤口愈合与组织再生所组成的群组的疾病和/或病症。
利用本发明方法制备的人类间质干细胞或其分化子代可适合用于治疗骨缺陷,其包含,但不限于:骨发生不全(osteogenesis imperfecta)、骨折(fracture)、先天骨缺损(congenital bone defects)等。
也可将通过前述本发明方法获得的人类间质干细胞或其分化子代植入一个体中以提供骨头及其他(例如牙齿)人工装置的骨性及结缔性支持,像是关节植入物和/或牙齿植入物。
由于间质干细胞可分化成软骨,因此,以本发明方法制备的人类间质干细胞或其分化子代可适合用于治疗关节病症,其包含但不限于:骨关节炎(osteoarthritis)、类风淫性关节炎(rheumatoid arthritis)、发炎性关节炎(inflammatory arthritis)、软骨软化(chondromalacia)、缺血性坏死(avascular necrosis)、外伤性关节炎(traumaticarthritis)等。
本发明方法制备的人类间质干细胞也可用于治疗中枢神经系统(CNS)疾病。中枢神经系统疾病的实例包含但不限于:一疼痛疾病、一运动障碍、一多重人格障碍(dissociative disorder)、一情感疾病(mood disorder)、一情绪失调(affectivedisorder)、一神经变性疾病以及一痉挛性障碍(convulsive disorder)。这类的疾患的更多特定实例包含,但不限于:帕金森氏症(Parkinson’s disease)、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、亨丁顿氏症(Huntington’s disease)、自体免疫脑脊髓炎(autoimmune encephalomyelitis)、糖尿病性神经病变(diabetic neuropathy)、青光眼型神经病变(glaucomatousneuropathy)、黄斑点退化(macular degeneration)、动作性震颤(action tremors)以及迟发性运动障碍(tardive dyskinesia)、恐慌、焦虑忧郁、酒精中毒(alcoholism)、失眠(insomnia)、狂躁行为(manic behavior)、阿兹海默症(Alzheimer’s disease)以及癫痫(epilepsy)。
已知间质干细胞可与造血干细胞与免疫细胞交互作用,并展现可增进自体造血植入及避免移植物抗宿主疾病(GvHD)的细胞疗法潜能。据此,通过本发明方法制备的人类间质干细胞也可用于治疗GvHD。
本发明方法制备的人类间质干细胞或其分化子代也可用于促进组织再生。如此一来,人类间质干细胞的移植可用于治疗自体免疫疾病、发炎性疾病、急性及慢性缺血性病症、组织工程;也可重生新组织并自然地治愈发病器官或受损器官。
已知的是当将间质干细胞导入梗塞心脏时,该些细胞可防止有害的(心室)重构(remodeling)并增进其复原。直接将间质干细胞注入梗塞的心脏,或将该些细胞经静脉投予,均可使细胞回到损伤位置。据此,本发明的人类间质干细胞或其分化子代也可用于治疗心脏疾病,特别是心脏梗塞的形成。
本发明人类间质干细胞或其分化子代可治疗的癌症的实例包括但不限于,乳癌(breast cancer)、脑肿瘤(brain tumor)、黑色素瘤(melanoma)、肺癌(1ung cancer)、淋巴瘤(1ymphoma)、神经上皮细胞瘤(neuroepithelioma)、肾脏癌(kidney cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、胃癌(stomach cancer)、大肠癌(colon cancer)、直肠癌(rectalcancer)、胰脏癌(pancreatic cancer)以及子宫癌(uterus cancer)。在一些实施方式中,癌症是转移性癌症。
可使用各种移植方法对治疗的个体投予本发明的人类间质干细胞或其分化子代,其性质取决于植入部位。可将细胞移植入组织的损伤或健康区域。将人类间质干细胞投予至健康区域的情况下,该些细胞将会移动至损伤区域。
可藉由直接注射至一器官、直接注射至血流、腹腔注射、直接注射至淋巴器官的手段移植本发明人类间质干细胞或其分化子代。合适的移植方法可藉由监控植入细胞对预定器官的回溯及植入情况、预定器官特定标记物的表达、以及该个体的预定器官功能来决定。
以在个体中可达成预期治疗效果的前提投予的本发明有效量的人类间质干细胞或其分化子代。在本发明中使用的人类间质干细胞有效剂量可从体内和/或体外细胞培养测定中初步估计。举例来说,可在实验动物中调配可达成期望浓度的剂量,然后使用该些信息来更准确地确定用于人类的剂量。剂量可取决于投予或给药途径。确切的剂量以及给药/投予途径可以由主治医师根据患者的状况及病史来确定。
取决待治疗的病症,本发明有效量的人类间质干细胞可以是单一剂量或多剂量,治疗过程可持续数天至数周,或直到有效治愈或疾病的症状减少为止。
对本领域具有通常知识者来说,通过以下非限制性的实施例的检验,本发明的额外目的、优点及特征将会显而易见。
实施例
材料与方法
表面抗原分析
使用0.25%的胰蛋白酶(trypsin)-EDTA从细胞培养皿上收取细胞。以含有1%的BSA的磷酸盐缓冲生理食盐水(Phosphate buffered saline,PBS)溶液洗涤细胞,并以荧光素异硫氰酸酯(fluorescein isothiocyanide,FITC)或藻红素(phycoerythrin,PE)-复合抗体于4℃下染色30分钟。间质干细胞标记物:抗-CD 44、抗-CD73、抗-CD 90、抗-CD105、抗-CD166,以及造血干细胞标记物:抗-CD34、抗-CD45(负控制组)。接着以PBS洗涤细胞并使用流式细胞仪(产品名:FACS calibur flow cytometer,购自FACSCanto,BD Biosciences,Becton,Dickinson and Company,San Jose,CA)分析。细胞以高达1,000细胞/秒的速率穿过,并使用488nm的氩气激光束作为激发光源。经FITC与PE-复合的同型控制组抗体染色的细胞可用于计算背景荧光值。
细胞诱导分化
使用成骨分化试剂盒(商品名:STEMPRO osteogenesis differentiation kit,Gibco)诱发人类间质干细胞以形成骨骼细胞,以及使用脂肪生成分化试剂盒(商品名:STEMPRO adipogenic differentiation kit,Gibco)以及软骨诱导培养基(Chondrogenicinduction medium,Gibco)诱导以形成脂肪细胞及软骨细胞。接着在37℃的温度下,于95%的空气及5%的CO2加湿培养箱中维持该些细胞生存状态。14天的期间内,每2至5天更换培养基。根据标准流程以爱尔新蓝染色及甲苯胺蓝染色以评估分化的软骨细胞;以油红-O染色以评估分化的脂肪细胞;以及以茜素红(Alzarin Red S)评估分化的骨骼细胞。
实施例1:制备及培养人类间质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)
取得经切除的包皮组织,所述包皮组织可以是经环状包皮切割法(circumcision)所切下的包皮。离体的包皮组织为医疗废弃物,通过本发明的方法,能够将其再利用再培养出医药领域中有价值的生物材料。具体而言,将离体的包皮组织(约1.5-2公分宽)置入含生理食盐水(50毫升)的无菌玻璃烧杯中,摇晃冲洗。接着,将清洗后的包皮组织移入至不含血清及任何添加物的角质细胞培养基(5毫升)(即,Keratinocyte-SFM(1X);Gibco,由lifetechnologies所提供)。在落尘量0.5μm Class 100以内的生物无菌操作台(biosafetycabinet,简称BSC)(laminar flow)内,将包皮组织剪碎并以含胶原蛋白酶和蛋白酶的角质细胞培养基处理,置于36-37℃恒温箱培处理2小时,以13x g离心9分钟,去除上清液。将处理过后的包皮组织碎片加入至滤杯(筛网孔径尺寸:70微毫米;直径0.5公分,高1公分)中,将滤杯置于无菌培养盘(直径9公分)上,其中所述无菌培养盘含8毫升的角质细胞培养基(含10%血清、3%Vit C、3%乙酰半胱氨酸和1%抗生素),接着于温度37℃、湿度60-70%、5%CO2的细胞培养箱内培养12小时,至无菌培养盘上的细胞满盘(confluence)(大于80%汇合度),即制得间质干细胞。接着,将无菌培养盘上的滤杯(70微毫米)放入另一无菌培养盘上,所述无菌培养盘含角质细胞培养基(含10%血、3%VitC、3%乙酰半胱氨酸和1%抗生素),培养于温度36-37度、湿度60-70%、5%CO2的细胞培养箱中,培养2-3小时,待无菌培养盘上的细胞满盘(confluence)(大于80%汇合度)后,即可收成所述人类间质干细胞。重复前述步骤,待培养完成后将滤杯移至另一干净的无菌培养盘上,即可有效率地制备人类间质干细胞。藉由此方式,本发明所提出的方法在24小时内可以扩增培养至少30盘,较佳为至少40盘。本实施例所制得的人类间质干细胞利用相位差显微镜于40倍下观察的细胞型态结果请参见图1,由显微镜下所拍摄的照片显示,利用本发明方法制备而成的间质干细胞形态是呈长梭状且具备贴附性。
实施例2:实施例1的人类间质干细胞的特性分析
2.1细胞表面抗原分析
使用胰蛋白酶/EDTA分离实施例1的黏附细胞,并根据“材料与方法”一节所描述的流程,使该些细胞于流式细胞仪中接受表面抗原分析,实验结果示于图2。
利用实施例1所制得的人类间质干细胞对表面标记物CD44、CD73、CD90、CD105、CD166呈现阳性反应,而对CD34、CD45以及HLA-DR呈现阴性反应(图2);这些结果证实该些细胞的确是间质干细胞。
2.2实施例1的人类间质干细胞的分化
在本实施例中,为了证实实施例1的人类间质干细胞仍具备分化的能力,将该些细胞分别于含有可诱发后续人类间质干细胞分化的试剂的培养基中进行培养。可根据标准流程,将从实施例1分化而来的软骨细胞、骨骼细胞以及脂肪细胞,分别以爱尔新蓝染色及甲苯胺蓝染色、茜素红,以及油红-O染色来确认其细胞型态,该结果分别显示于图3A、图3B、图3C及图3D。
应当理解的是,前述对实施方式的描述仅是以实施例的方式给出,且本领域所属技术领域中具有通常知识者可进行各种修改。以上说明书、实施例及实验结果提供本发明的例示性实施方式的结构与用途的完整描述。虽然上文实施方式中揭露了本发明的各种具体实施例,然其并非用以限定本发明,本发明所属技术领域中具有通常知识者,在不悖离本发明的原理与精神的情形下,当可对其进行各种更动与修饰,因此本发明的保护范围当以附随申请专利范围所界定者为准。
Claims (12)
1.一种自一离体的包皮组织取得人类间质干细胞(mesenchymal stem cells)的方法,包含:
(a)将所述离体的包皮组织置于一第一培养基中,其中所述第一培养基是角质细胞培养基(Keratinocyte medium)且不含血清;
(b)将经步骤(a)培养的所述包皮组织切碎后,于36-37°℃下以一消化酶处理至少2小时;
(c)提供一第一培养盘,其含有一第二培养基,其中所述第二培养基是角质细胞培养基且有添加血清;
(d)将经步骤(b)处理的所述切碎的包皮组织置入一滤杯中,再将所述滤杯置于所述第一培养盘中,将所述滤杯连同所述第一培养盘于37°℃下培养至少12小时;以及
(e)收集所述第一培养盘上的所述人类间质干细胞。
2.如权利要求1所述的方法,还包含:
(f)将所述滤杯置于一第二培养盘上,其中所述第二培养盘含有所述第二培养基,将所述滤杯连同所述第二培养盘于37℃下培养至少2小时,以及
(g)收集所述第二培养盘上的所述人类间质干细胞。
3.如权利要求1所述的方法,还包含:
(a1)在进行步骤(a)之前,以生理食盐水清洗所述离体的包皮组织。
4.如权利要求1所述的方法,其中所述消化酶为胶原蛋白酶(collagenase)和蛋白酶(protease)。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述第二培养基还包含至少3%(体积%)的维他命C。
6.如权利要求5所述的方法,其中所述第二培养基还包含至少10%(体积%)的血清。
7.权利要求5所述的方法,其中所述第二培养基还包含至少1%(体积%)的抗生素。
8.如权利要求5所述的方法,其中所述第二培养基还包含至少3%(体积%)的乙酰半胱氨酸(N-Acetylcystein)。
9.如权利要求1至8所述的任一种方法,其中所述人类间质干细胞对CD34和CD45细胞表面标记呈现阴性反应,且对CD73、CD90及CD 105细胞表面标记呈现阳性反应。
10.一种人类间质干细胞或其未分化子代在制备一药物的用途,所述药物可用以治疗一亟需治疗的个体的一疾病或病症,其中所述人类间质干细胞是依据权利要求1至9所述的任一种方法制备而成。
11.如权利要求10所述的用途,其中所述人类间质干细胞可分化成软骨细胞、骨骼细胞或脂肪细胞。
12.如权利要求10所述的用途,其中所述疾病或病症是骨或软骨疾病、神经变性疾病、心脏疾病、肝脏疾病、癌症、自体免疫疾病、移植物抗宿主疾病(graft versus hostdisease,GvHD)或伤口愈合与组织再生疾病。
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