CN110402286B - 自周边血液制备间质干细胞群的方法及其用途 - Google Patents

自周边血液制备间质干细胞群的方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110402286B
CN110402286B CN201780085565.6A CN201780085565A CN110402286B CN 110402286 B CN110402286 B CN 110402286B CN 201780085565 A CN201780085565 A CN 201780085565A CN 110402286 B CN110402286 B CN 110402286B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mesenchymal stem
stem cells
human mesenchymal
cells
peripheral blood
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201780085565.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110402286A (zh
Inventor
熊仲川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of CN110402286A publication Critical patent/CN110402286A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110402286B publication Critical patent/CN110402286B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0665—Blood-borne mesenchymal stem cells, e.g. from umbilical cord blood
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/35—Polyols, e.g. glycerin, inositol

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Addiction (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本揭示内容是一种用以制备未分化之人类间质干细胞群(hMSCs)的方法。该方法包含以下步骤：从一供体取得周边血液；添加甘油于该周边血液中；在该周边血液中，从其他成体干细胞分离出人类间质干细胞；以及将该人类间质干细胞培养于含有甘油的培养液中，藉以制备适合用于移植的未分化人类间质干细胞群。

Description

自周边血液制备间质干细胞群的方法及其用途
技术领域
本揭示内容关于一种分离及扩增间质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)及从其衍生细胞群的方法。
先前技术
可从各种组织分离间质干细胞，其包含但不限于新生儿组织(例如：人类脐带的华通氏胶(Wharton’s jelly))、骨髓、周边血液、胎盘、脐带血以及脂肪组织。在该些组织中，周边血液是最容易取得的间质干细胞来源。然而，周边血液中间质干细胞的含量相当低，即便于活体外扩增间质干细胞，相关领域仍无法取足量之间质干细胞，进而用于后续分化及相关应用。
因此，相关领域亟需发展一种可自周边血液取得间质干细胞的改善方法，以制备足以用于后续治疗用途的间质干细胞群。
发明内容
为了给读者提供基本的理解，以下提供本揭示内容的简要发明内容。此发明内容不是本揭示内容的广泛概述，同时非用来定义本发明的关键/必需组件或勾勒本发明的范围。其唯一目的是以简化的形式呈现本揭示内容的一些概念，以作为呈现于后文中更详细描述的序言。
本发明发现可从人类个体之周边血液取得间质干细胞(mesenchymal stemcells，MSCs)，并于含有甘油的培养液中进行体外扩增，从而制备一经分离之、实质上纯的、未分化人类间质干细胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)群，其适用于进行自体移植。
据此，本揭示内容的第一个态样是关于一种提供未分化之人类间质干细胞群的方法。该方法包含以下步骤：
(a)从人类个体取得周边血液；
(b)将甘油添加至步骤(a)之该周边血液中；
(c)分离步骤(b)之该周边血液中，相对于其他成体干细胞的人类间质干细胞；以及
(d)将步骤(c)之经分离的人类间质干细胞培养于一包含甘油的培养液中，藉以制备该人类间质干细胞群；
其中该培养液不含选自由颗粒性白血球群落刺激因子(granulocyte colonystimulating factor，G-CSF)、颗粒性白血球-巨噬细胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)以及其组合所组成的群组之任何移动剂(mobilization agent)。
根据本揭示内容的实施方式，在步骤(a)中，将该周边血液收集于不含任何溶血剂的试管中。
根据本揭示内容的实施方式，在步骤(b)中，甘油于周边血液中的浓度约为每毫升1至10毫克。
根据本揭示内容的实施方式，在步骤(d)中，该培养液包含至少20％(体积比)的血清，且甘油于该培养液中的浓度约为每毫升0.1至1.0毫克，且于37℃下，将该人类间质干细胞培养于一包含该含甘油培养液的培养盘中至少16小时。
根据本揭示内容的替选实施方式，方法更可包含：
(e)将该人类间质干细胞转移至另一培养盘中，其表面积至少为步骤(d)之培养盘表面积的至少16倍大，且持续培养于包含甘油的培养液中，以制备未分化之人类间质干细胞群。
根据本揭示内容之实施方式，在步骤(e)中，将人类间质干细胞至少培养6天，以制备未分化之人类间质干细胞群。
根据本揭示内容之实施方式，所制备的未分化之人类间质干细胞群是对CD34-、CD45-及HLA-DR细胞表面标记呈现阴性反应，而对CD73+、CD90+及CD 105+细胞表面标记呈现阳性反应。
据此，本揭示内容是关于一单羣性细胞株(clonal cell line)，该单羣性细胞株包含根据本揭示内容方法制备的实质上纯的未分化人类间质干细胞群。
此外，本揭示内容也关于未分化之人类间质干细胞群或其分化子代用途，其可藉由本揭示内容方法进行制备，据以治疗一有需要之个体的疾病或病症。
根据本揭示内容之实施方式，该人类间质干细胞群是实质上纯的人类间质干细胞。
根据本揭示内容之实施方式，实质上纯的人类间质干细胞可经诱导分化成软骨细胞、软骨及脂肪细胞。
据此，本揭示内容亦提供一种用以治疗亟需移植自体人类间质干细胞之个体的疾病或病症的方法。该方法包含对个体投予有效量之根据本揭示内容方法所制备的未分化之人类间质干细胞群，据以治疗该疾病或病症。
根据本揭示内容的实施方式，可藉由自体移植人类间质干细胞来治疗的疾病或病症系选自由一骨疾病或软骨疾病、一神经变性疾病、一心脏疾病、一肝脏疾病、一癌症、一自体免疫疾病、移植物抗宿主疾病(graft versus host disease，GvHD)及伤口愈合与组织再生所组成之群组。
根据本揭示内容的实施方式，可于3天或更短的期间、2天或更短的期间、或1天或更短的期间，持续对个体投予有效量之未分化人类间质干细胞群或其分化子代。
在参阅下文实施方式后，本发明所属技术领域中具有通常知识者当可轻易了解本发明之基本精神及其他发明目的，以及本发明所采用之技术手段与实施态样。
图式简单说明
该专利或申请文件至少包含一幅彩色附图。附有彩色附图的本专利或专利申请公开文本将在申请和支付相应的费用后由主管局提供。
为让本发明的上述与其他目的、特征、优点与实施例能更明显易懂，所附图式之说明如下：
第1A图及第1C图分别根据本揭示内容之一实施方式绘示实施例1的人类间质干细胞对(A)标记物CD90、(B)CD105之阳性表现结果和对(C)标记物CD34之阴性表现结果；
第2A图系根据本揭示内容之一实施方式之照片，其为经碱性磷酸酶染色确认实施例1之人类间质干细胞分化成软骨细胞之结果；
第2B图系根据本揭示内容之一实施方式之照片，其为经爱尔新蓝染色确认实施例1之人类间质干细胞分化成软骨之结果；以及
第2C图系根据本揭示内容之一实施方式的照片，其为经油红O染色确认实施例1的人类间质干细胞分化成脂肪细胞之结果。
实施方式
为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本发明的实施态样与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本发明具体实施例的唯一形式。实施方式中涵盖了多个具体实施例的特征以及用以建构与操作这些具体实施例的方法步骤与其顺序。然而，亦可利用其他具体实施例来达成相同或均等的功能与步骤顺序。
1.定义
为了便于说明，此处统整性地说明本说明书、实施例以及后附的申请专利范围中所记载的特定术语。除非本文另有定义，本文所有的技术及科学术语与本发明所属技术领域具有通常知识者习知的术语的意思相同。
除非上下文另有明确说明，本文所使用的单数形式「一」(a,an)以及「该」(the)均包含复数形式。
本文使用的「干细胞」(stem cell)一词是以广义的方式使用，也包含传统干细胞群(traditional stem cell)、前驱细胞群(progenitor cell)、前前驱细胞群(pre-progenitor cell)等。「干细胞」(stem cell)一词是指能够增殖并产生更多前驱细胞的未分化细胞，该些前驱细胞具有可大量产生母细胞的能力，进而产生分化的或是具分化能力的子细胞。子细胞本身可被诱导以增殖并产生后续分化成一或多种成熟细胞类型的子代。「干细胞」(stem cell)一词也可指在特定情况下，具有能力或有潜力分化成更特化或更分化的表现型，且在某些情况下，仍保留以未分化状态增殖之能力的细胞。
术语「间质干细胞」(mesenchymal stem cells，MSCs)指一种可分化成超过一种特定类型结缔组织的多潜能干细胞，特定类型结缔组织可以是脂肪组织、骨组织、基质组织(stroma tissue)、软骨组织、弹性组织及纤维组织。针对识别目的，可基于表现型标记物CD34-、CD45-、CD73+、CD90+以及CD105+的表现来鉴定人类间质干细胞，也可基于分化成特定支持生命要素的组织(举例来说但不限于软骨细胞、软骨以及脂肪细胞)的能力来鉴定。
关于分离的人类间质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)族群，「族群」、「群体」或「群」(population)一词是指已经被移除且从一群混合或异质细胞族群中分离的人类间质干细胞(hMSCs)的群体。在一些实施方式中，相较于从异质细胞族群分离或增殖的细胞而言，人类间质干细胞群(thepopulation of hMSCs)是实质上纯的人类间质干细胞群。
本揭示内容中关于特定细胞族群的「实质上纯的」(substantially pure)一词，是指一群体中，相较于总细胞族群的组成，有至少70％、较佳地约80％、更佳地约90％、以及最佳地约95％的细胞是纯的。关于根据本揭示内容中描述的方法所制备的人类间质干细胞族群的术语「实质上纯的」，是指含有少于约30％、较佳地少于约20％、15％、10％、8％，更佳地少于约5％、4％、3％、2％、1％或少于1％的非人类间质干细胞的人类间质干细胞族群。根据一些实施方式，本揭示内容包含将从周边血液分离的一群人类间质干细胞扩增的方法，其中该从周边血液衍生的人类间质干细胞扩增族群是一群实质上纯的人类间质干细胞群。
「单羣性细胞株」(clonal cell line)一词是指可在一培养液中培养且具有无限继代之潜能的细胞系(cell lineage)。单羣性细胞株可以是干细胞株(例如：本揭示内容从周边血衍生的人类间质干细胞)或是从该周边血衍生的人类间质干细胞中衍生的干细胞株。在单羣性细胞株的背景下所使用的单羣性细胞株包含从本揭示内容之周边血液衍生的人类间质干细胞，其在体外条件下培养并允许在不分化至少一个月的情况下增殖。这类的单羣性干细胞株(例如：从本揭示内容周边血液获得的人类间质干细胞)可具有从原始干细胞沿着几个细胞系分化的潜力。
在细胞个体发育的背景中，形容词「分化的」(differentiated)是一个相对概念。一「分化的细胞」(differentiated cell)是指一细胞的发育路径相较于正在与其比较的另一细胞更向前进或更向下游。因此，干细胞可分化成品系限制的前驱细胞，其依次可分化成更下游的其他前驱细胞类型。接着再分化成最后分化阶段的细胞，该些细胞在特定的组织类型中扮演特征性的角色，并且可能或可能不保留再进一步增殖的能力。
本文使用的术语「治疗」(treatment)是用于指获得一想要的药理作用及/或生理作用，例如组织再生。就完全或部份预防疾病或其症状而言，前述作用可以是预防性的；及/或就完全或部份治疗疾病及/或肇因于该疾病不良影响而言，前述作用可以是治疗性的。本文使用的「治疗」(Treatment)包含对一哺乳动物之疾病的预防性(例如：预防(prophylactic))、治愈性或是缓解性治疗，该哺乳动物特别是人类；以及包含：(1)对可能易患该疾病但尚未被诊断出来患有该疾病的一个体所发生的疾病或病症进行预防(preventative)(例如：预防(prophylactic))、治愈性或是缓解性治疗；(2)抑制一疾病(例如：藉由终止该疾病的发展)；或(3)缓解一疾病(例如：减低与该疾病相关的症状)。
术语「投予、给药」(administered,administering)、或「移植」(transplanting)在本文中可互换使用，以指任何适当的递送途径，其包含但不限于：静脉内、肌内、腹腔内、动脉内、颅内、或皮下地将本发明的人类间质干细胞群投予至该个体的所需部位，其中至少一部份的人类间质干细胞仍是存活状态。被投予至个体之后，该细胞存活期间也可短至几小时，例如24小时，至几天，长至几个月。
本揭示内容使用的「有效量」(an effective amount)是指在特定所需时间内，对治疗血小板聚集造成的疾病可达成预期结果的有效人类间质干细胞之剂量。举例来说，对伤口的治疗上，有效促进皮肤及相关软组织再生的药剂(即本揭示内容的人类间质干细胞)。药剂的有效量非必须治愈疾病或病症但可提供针对一疾病或病症加以治疗，像是延后疾病或病症的发作、限制或阻碍疾病或病症的发作、或是使疾病或病症症状得到改善。特定有效量或足量可随着各种因素变化，像是预治疗的特定病症、病患的生理状况(例如病患的体重、年纪或性别)、所治疗哺乳类或动物的种类、治疗时间、并行疗程的性质(如果有的话)、以及使用的具体制剂等。有效量可以合适的形式分成一次、两次或多次剂量，藉此在指定时段内以一次、两次或多次给药。
在本文中，术语「个体、受试者」(subject)或「患者」(patient)可互换地使用，且意思是指能够以本揭示内容的化合物治疗的哺乳类动物(包含人类)。术语「哺乳动物」(mammal)是指哺乳纲(class Mammalia)的所有成员，其包含人类、灵长类、驯养动物及家畜(例如兔、猪、羊、牛)以及动物园圈养动物、用于运动的动物或宠物；以及囓齿类(例如小鼠与大鼠)。再者，除非明确指出性别，否则「个体」或「受试者」(subject)或「患者」(patient)一词均有包含男性(雄性)及女性(雌性)。因此，术语「个体、受试者」或「患者」包含受益于本揭示内容的治疗方法的任何哺乳动物。「个体、受试者」」或「患者」的实例包含但不限于，人类、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴、猪、山羊、牛、马、犬、猫、鸟及禽类。在较佳的实施方式中，个体是一人类。
术语「培养液」(medium)是指含有可维持细胞生存力及支持细胞增殖的营养，以用于维持组织或细胞群、或培养含有细胞群(例如培养基质)的基质。细胞培养液含有任何下列物质的适当组合：盐类、缓冲液、胺基酸、葡萄糖或其他醣类、抗生素、血清或血清替代物、以及其他成分(像是生长因子)等。本发明所属技术领域具有通常知识者已知特定细胞类型会使用的细胞培养液。
本文使用的术语「移动」、「活动」、「转移」(mobilization)是指细胞离开原本的常驻区位(niche)(例如骨髓)且进入血液的过程。术语「移动剂」(mobilization agent)是可使停留在周边血液及骨髓干细胞区位中的干细胞(例如MSCs)集合体或群体失去附着力的药剂。
2.分离及培养源自周边血液之人类间质干细胞
间质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一般可从骨髓取得的非造血干细胞。周边血液中的间质干细胞含量较低，且即便该些细胞是在体外进行扩增，从周边血液获取的间质干细胞通常无法产生足够量的细胞以用于治疗用途。本研究的发明人意外地发现从周边血液分离及扩增间质干细胞的方法，从而可制备实质上纯的人类间质干细胞群，其可单独使用或与其他细胞合并使用，以于再生疗法中进行自体治疗，例如伤口愈合及骨骼修复以及其他矫形适应症。
据此，本揭示内容的第一个态样是关于一种提供未分化人类间质干细胞群体的方法。该方法包含：
(a)从人类个体取得周边血液；
(b)将甘油添加至步骤(a)之该周边血液中；
(c)分离步骤(b)之周边血液中，相对于其他成体干细胞的人类间质干细胞；以及
(d)将步骤(c)之经分离的人类间质干细胞培养于一包含甘油的培养液中，藉此制备人类间质干细胞群；
其中培养液不含任何选自由颗粒性白血球群落刺激因子(granulocyte colonystimulating factor，G-CSF)、颗粒性白血球-巨噬细胞群落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)以及其组合所组成的群组之药剂。
根据一些实施方式，在本发明之步骤(a)中，是从一人类个体抽出周边血液，且将该周边血液收集于含有抗凝血剂(例如肝素(heparin))之试管中。根据本揭示内容的一实施方式，个体可以是健康个体或罹患亟需人类间质干细胞移植之疾病或病症的个体。此外，可用于制备本揭示内容人类间质干细胞的周边血液的来源个体不限特定年龄。根据本揭示内容之某些实施方式，周边血液可以从年龄分别介于20岁至30岁之间的人类个体抽取。根据本揭示内容之其他实施方式，周边血液可以从年龄分别介于50岁至60岁之间的人类个体抽取。根据本揭示内容之其他实施方式，周边血液可以从年龄分别介于70岁至80岁之间的人类个体抽取。
收集周边血液之后，随即将其与甘油混合，并于37℃至少培养4小时，较佳的是至少培养6小时(本揭示内容方法的步骤(b))。根据本揭示内容的实施方式，周边血液中所含的甘油量较佳地可以是约每毫升1-10毫克，例如每毫升1、2、3、4、5、6、7、8、9及10毫克；更佳的是约每毫升2-8毫克(例如每毫升2、3、4、5、6、7及8毫克；更佳的是约每毫升5毫克。
培养之后，可藉由合适的方式将人类间质干细胞从含有甘油之周边血液中的成体干细胞分离，合适的方式像是细胞分选仪(cellsorter)或离心淘洗(centrifugalelutriation)(本方法的步骤(c))。
根据本揭示内容之某些实施方式，在本方法之步骤(c)，是藉由细胞分选仪(像是雷射扫描流式细胞仪(laser scanning Flow Cytometer))将周边血液中的人类间质干细胞从成体干细胞分离。典型的流式细胞仪是由雷射光、流体测量室(flow measurementchamber)以及光学系统(由镜片、滤光镜与光侦测器所组成)构成。两个光电倍增管(一与雷射夹角为180度且一为90度)是分别用于测量前向散射光(forward scattered light，FSC)及直角散射(侧向散射光(sidescattered light，SCC))。在前向管中，分别由滤光镜及光电倍增管组成的三个荧光侦测器可用于侦测荧光。荧光活性细胞分选仪(fluorescenceactivated cell sorting，FACS)设置以选择特定的前向散射及/或侧向散射之细胞。FSC与细胞表面积或尺寸成比例。FSC大多测量绕射光且其藉由光二极管在正向方向上正好位于入射激光束之轴上来侦测。FSC适合用于侦测大于给定尺寸之目标颗粒，而与颗粒的荧光无关。侧向散射光(side-scattered light，SCC)是与粒性或内部复杂性成比例。SSC是用以测量在具有折射率变化的细胞内部任何表面(interface)上发生的光折射及光反射。SSC是在与激光束夹角约90度之角度，透过一收集透镜收集该激光束，接着透过光束分离器重新定向至合适的侦测器。藉此，可藉由控制特定FSC及SSC网关来挑选细胞。根据本揭示内容的实施方式，是基于细胞表面标记之表现量将周边血液的人类间质干细胞从成体干细胞中分离，其中细胞群是以不同荧光强度染色的门闸来挑选。
在步骤(c)中，非必要性地或另外地，将从步骤(b)取得的含有甘油之周边血液注入细胞分选仪(例如COBE Spectra Apheresis System)中，且可选择性地添加抗凝血剂以在该流程中使血液免于凝集。将混合物通过离心机循环以将周边血液分离成间质干细胞群和来自其他血液成分及血浆的单核细胞。接着将分离的间质干细胞泵入收集袋中储存，而将其他血液成分及血浆丢弃或归还给个体。
在本发明方法的步骤(c)中，可选择性地或另外地，藉由离心淘洗将含有甘油之周边血液中的人类间质干细胞从其他成体干细胞分离出，其中较小尺寸的干细胞可从较大尺寸干细胞中分离出。在特定实施方式，步骤(b)中含有甘油之周边血液被置入位在自旋离心机中的常规漏斗形分离室(funnel-shaped separation chamber)中。将液体淘洗缓冲液流引入含有周边血液的分离室中。当液体淘洗缓冲液溶液通过该分离室的流速增加时，液体会将较小尺寸、较慢沉降的细胞扫向分离室的淘洗边界，而较大较快沉降的细胞会移动至分离室中离心力与沉降力达成平衡之区域。据此，周边血液可包含许多不同群体的干细胞，可再透过淘洗将该些干细胞区分成独特的群体，其中较小的干细胞可从具有较大尺寸的干细胞中分离出。可使用任何淘洗装置获得及/或分离从周边血液衍生的间质干细胞。
在本发明之步骤(d)中，使该些从步骤(c)中制备的人类间质干细胞于可增强该些分离之人类间质干细胞增殖之培养条件下接受培养，以进一步扩增该些细胞。根据本揭示内容较佳的实施方式，可在培养皿(表面积约10平方公分)中包含甘油的生长培养液里培养从步骤(c)获得的人类间质干细胞，且该生长培养液中缺乏任何已知的干细胞移动剂(包括，但不限于：颗粒性白血球群落刺激因子(G-CSF)，颗粒性白血球-巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)以及其组合)。应当理解的是，当说到培养液缺发特定成分时，本揭示内容也预期培养液仍包含该成分，但其浓度远低于其具有最小活性的浓度。举例来说，特定培养液可包含微量的前述干细胞移动剂(即，G-CSF、GM-CSF或其组合)，然而，本揭示内容的方法是关于一种除了原本存在于市售培养液之配方中或由整体调整培养液成分浓度而产生的生长因子之外，不再外源性地添加生长因子的培养液。
本揭示内容适合用于培养人类间质干细胞的典型培养液可为完全培养液(例如：DMEM)，其含有至少20％(体积比)的血清，较佳是至少30％(体积比)的血清，更佳是至少50％(体积比)的血清。完全培养液中的甘油浓度可以是约每毫升0.1-1.0毫克(例如每毫升0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9及1.0毫克)；更可以是约每毫升0.2-0.8毫克(例如每毫升0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7及0.8毫克)；最佳的是约每毫升0.5毫克。在一些实施方式中，用于培养人类间质干细胞的生长培养液是使用100％(体积比)之血清，再加入每毫升0.1-1.0毫克的甘油。在培养过程中，也可在培养液中添加细胞新陈代谢所需的补充剂，像是胺基酸、维他命、矿物质以及有用蛋白质(例如运铁蛋白)等。培养液也可包含抗生素，用以防止酵母菌、细菌及真菌感染。抗生素可以是青霉素(penicillin)、链霉素(streptomycin)、建它霉素(gentamicin)之类。根据本揭示内容之一实施方式，培养液包含脑垂腺萃取物、血浆及胎牛血清。可经一段时间的培养，以有效地使人类间质干细胞扩增，藉此以制备足量的人类间质干细胞。根据一特定的实施方式，可以含有30％(体积比)之血清及每毫升0.5毫克甘油之培养液，将步骤(c)取得的人类间质干细胞在37℃至少培养12小时，较佳是至少16小时，更佳的是至少24小时，从而制备适合用于自体移植的人类间质干细胞群。
根据本揭示内容的特定的实施方式，本发明制备的人类间质干细胞群对造血干细胞标记物CD34及CD45呈现阴性染色，以及已知可介导移植物抗宿主疾病(graft-versus-host disease，GvHD)的人类白血球抗原–抗原D相关(HLA-DR)细胞表面标记也呈现阴性染色；对细胞表面标记CD73、CD90及CD 105则呈现阳性染色。测定细胞表面标记表现的方法是本技术领域的通常知识。该些方法实例包含免疫学方法(例如FACS)以及生物化学方法(例如透过放射性、荧光或卵白素-生物素的细胞表面标记)。另一种可行的方式是，可使用磁激细胞分选(magnetic-activated cell sorting，MACS)或免疫淘洗(immunopanning)方法以鉴别细胞。
透过本揭示内容方法所制备的人类间质干细胞群之细胞表面标记表现模式证明：该些人类间质干细胞群的确是未分化的成熟人类间质干细胞之富集群，其可用于需要自体干细胞移植的再生疗法。
3.人类间质干细胞单羣性细胞株
本揭示内容的另一态样是关于包含实质上纯的未分化人类间质干细胞群之单羣性细胞株，其中可根据任何前述方法制备未分化之人类间质干细胞群。
根据本揭示内容的实施方式，藉由前述方法制备或分离的新鲜人类间质干细胞在无分化的条件下(例如缺乏任何分化因子)培养，以使人类间质干细胞进一步扩增。通常，人类间质干细胞从其宿主分离或被挑选以制备一人类间质干细胞群(例如：在本揭示内容方法的步骤(d)中所制备的人类间质干细胞)之后，该些细胞(可以是一异质细胞群或一纯的人类间质干细胞群)可在具有一预定表面积的培养皿(该预定表面积是步骤(d)培养皿表面积的至少16倍大、至少17倍大、至少18倍大或至少20倍大)中接受后续培养，也可以前述的含甘油培养液(即，步骤(d)的培养液)继续培养。可选地或可替换地，可在生物反应器中培养人类间质干细胞，从而生产大量的细胞。根据本揭示内容的实施方式，适合用于本发明方法步骤的培养液是缺乏任何细胞移动剂(例如G-CSF、GM-CSF及其组合)；同时该培养液包含具特定浓度的甘油，特定浓度较佳是约每毫升0.1-1.0毫克，例如每毫升0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9及1.0毫克；更佳地是约每毫升0.2-0.8毫克，诸如每毫升0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7及0.8毫克；最佳是约每毫升0.5毫克。对培养物进行培养一段时间，较佳地是至少培养7天、更佳是至少培养10天，及更佳是至少培养14天，以制备同质未分化之人类间质干细胞群，其包含较佳至少70％的人类间质干细胞、更佳是至少80％的人类间质干细胞，及最佳是至少90％之人类间质干细胞。
根据本揭示内容的实施方式，可将人类间质干细胞扩增成至少两倍、至少四倍、至少六倍、至少八倍、至少十倍、至少十二倍、至少十五倍、至少二十、至少三十倍、或至少四十倍。
与前述步骤(d)的发现相似的是，所制备的同质人类间质干细胞群维持未分化状态，且对造血干细胞标记物CD34及CD45以及细胞表面标记HLA-DR细胞表面标记呈现阴性染色；另同时对细胞表面标记CD73、CD90及CD 105呈现阳性染色。
使用发明之方法所制备的人类间质干细胞群培养物可在新鲜状态下使用，亦可以储存以待后续使用，例如以冷冻保存剂(包括但不限于甘油、二甲亚砜(DMSO)等)冷冻保存。
4.含有人类间质干细胞的组合物
本揭示内容的人类间质干细胞可以自身单独提供、与培养液一起提供，以及与药学上可接受的载体及其他添加剂合并提供，其中该添加剂可促进细胞植入及/或器官功能(例如：免疫抑制剂、抗生素及生长因子等)。因此，本揭示内容的人类间质干细胞可以药学组合物的形式投予至个体体内，在该药学组合物中，人类间质干细胞可与药学载体或稀释剂混合，例如与无菌食盐水及水性缓冲溶液混合。
合适的投予途径可包括但不限：口服、直肠、经黏膜(例如经鼻腔)、肠内或非口服递送(包括：肌内、皮下、心室内、鞘内、静脉内、腹膜内或眼内注射)。
或者是，可以局部方式而非全身性方式投予该药学组合物。举例来说，可将药学组合物直接注射至目标位置(例如：一器官)。
根据本揭示内容，可以常规方式利用一或多种药学上可接受的载体制备药学组合物。合适的制剂形式取决于投予或给药途径。
为了注射，本揭示内容的人类间质干细胞可制成水性溶液制剂，较佳地是制成生理上可接受缓冲液(例如林格氏液)或生理上可接受的盐类溶液。
适合用于本揭示内容的药学组合物包含含有可达成预期目的之有效量活性成分(例如，人类间质干细胞)之组合物。有效量的测定完全是本技术领域具有通常知识者的能力范围内，特别是根据本揭示内容的描述。
本揭示内容的药学组合物可以套组形式存在，该套组可含有包含本发明人类间质干细胞的一或多种单位剂量形式。套组可进一步包含在套组上或是与该套组相连的卷标或包装附件。卷标或包装附件可载明该套组是用于治疗特定疾病及/或病症。可替换地或可额外地，套组可进一步包括一缓冲液，诸如磷酸盐缓冲食盐水或林格氏液。套组可进一步包含关于如何将人类间质干细胞投予至预定目标位置的指示。
根据本揭示内容之实施方式，套组可包含(或至少包含)：(a)含有本发明人类间质干细胞的第一容器，以及可选地(b)含有缓冲液的第二容器，以及(c)与套组相关以指示使用者如何使用该套组的图例。图例可以是小册子、磁带、CD、VCD或DVD之形式。
5.本发明人类间质干细胞或其分化子代之用途
透过上述本发明方法所制备的未分化人类间质干细胞群或其分化子代可用于自体移植，藉以治疗及/或预防无数可藉由自体移植获得有益效果的疾病及/或病症。
据此，本揭示内容的其他态样是关于治疗个体的疾病及/或病症的方法，其包含在几天至几周的期间内，对个体投予一有效量之依据本发明方法所制备之人类间质干细胞群。
间质干细胞可以分化成各种细胞系。可透过在富含具有所需表现型的细胞(例如骨细胞、脂肪细胞等)之生长环境培养间质干细胞，以达成细胞分化。培养液可包含增强分化至特定细胞系的试剂。根据本揭示内容之一实施方式，将人类间质干细胞群分化成软骨细胞，其中细胞在含有地塞米松(dexamethasone)、抗坏血酸(ascorbic acid)、胰岛素(insulin)、运铁蛋白及亚硒酸(selenous acid)之培养液中进行培养直到满盘(confluence)(请参考Williams et al.(2003)Tissue Engineering.9(4),679)。分化后的软骨细胞可藉由碱性磷酸酶染色以鉴定。根据本揭示内容的另一实施方式，是透过将人类间质干细胞群在市售软骨培养液中进行培养，以使人类间质干细胞分化成软骨。以爱尔新蓝(Alcian Blue)进行蛋白多醣染色以确认分化的软骨。根据本揭示内容的再一实施方式，人类间质干细胞群是分化成脂肪细胞。为了诱导脂肪生成的分化，以脂肪生成培养液处理人类间质干细胞，其含有氢皮质酮(hydrocortisone)及吲哚美辛(indomethacin)；或者是或此外，也可额外使用包含任何市售间质干细胞脂肪生成促进补充剂(例如从StemCellTechnologies Inc(温哥华，加拿大)购得的补充剂)。可藉由油红染色确认脂肪生成分化结果。
根据本揭示内容之实施方式，人类间质干细胞群或其分化子代可用于治疗选自由骨或软骨疾病、神经变性疾病、心脏疾病、肝脏疾病、癌症、自体免疫疾病、移植物抗宿主疾病(GvHD)及伤口愈合与组织再生所组成之群组的疾病及/或病症。
利用本发明方法制备的人类间质干细胞群或其分化子代可适合用于治疗骨缺陷，其包含，但不限于：骨发生不全(osteogenesis imperfecta)、骨折(fracture)、先天骨缺损(congenital bone defects)等。
也可将透过前述本发明方法获得的人类间质干细胞群或其分化子代植入一个体中以提供骨头及其他(例如牙齿)人工装置的骨性及结缔性支持，像是关节植入物及/或牙齿植入物。
由于间质干细胞可分化成软骨，因此，以本发明方法制备的人类间质干细胞群或其分化子代可适合用于治疗关节病症，其包含但不限于：骨关节炎(osteoarthritis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、发炎性关节炎(inflammatory arthritis)、软骨软化(chondromalacia)、缺血性坏死(avascular necrosis)、外伤性关节炎(traumaticarthritis)等。
本发明方法制备的人类间质干细胞群也可用于治疗中枢神经系统(CNS)疾病。中枢神经系统疾病的实例包含但不限于：一疼痛疾病、一运动障碍、一多重人格障碍(dissociative disorder)、一情感疾病(mood disorder)、一情绪失调(affectivedisorder)、一神经变性疾病以及一痉挛性障碍(convulsive disorder)。这类的疾患的更多特定实例包含，但不限于：帕金森氏症(Parkinson’s disease)、肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、亨丁顿氏症(Huntington’s disease)、自体免疫脑脊髓炎(autoimmune encephalomyelitis)、糖尿病性神经病变(diabetic neuropathy)、青光眼型神经病变(glaucomatousneuropathy)、黄斑点退化(macular degeneration)、动作性震颤(action tremors)以及迟发性运动障碍(tardive dyskinesia)、恐慌、焦虑忧郁、酒精中毒(alcoholism)、失眠(insomnia)、狂躁行为(manic behavior)、阿兹海默症(Alzheimer’s disease)以及癫痫(epilepsy)。
已知间质干细胞可与造血干细胞与免疫细胞交互作用，并展现可增进自体造血植入及避免移植物抗宿主疾病(GvHD)的细胞疗法潜能。据此，透过本发明方法制备的人类间质干细胞群也可用于治疗GvHD。
本发明方法制备的人类间质干细胞群或其分化子代也可用于促进组织再生。如此一来，人类间质干细胞的移植可用于治疗自体免疫疾病、发炎性疾病、急性及慢性缺血性病症、组织工程；也可重生新组织并自然地治愈发病器官或受损器官。
已知的是当将间质干细胞导入梗塞心脏时，该些细胞可防止有害的(心室)重构(remodeling)并增进其复原。直接将间质干细胞注入梗塞的心脏，或将该些细胞经静脉投予，均可使细胞回到损伤位置。据此，本发明的人类间质干细胞群或其分化子代也可用于治疗心脏疾病，特别是心脏梗塞之形成。
本发明人类间质干细胞群或其分化子代可治疗的癌症的实例包括但不限于，乳癌(breast cancer)、脑肿瘤(brain tumor)、黑色素瘤(melanoma)、肺癌(lung cancer)、淋巴瘤(lymphoma)、神经上皮细胞瘤(neuroepithelioma)、肾脏癌(kidney cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、胃癌(stomach cancer)、大肠癌(colon cancer)、直肠癌(rectalcancer)、胰脏癌(pancreatic cancer)以及子宫癌(uterus cancer)。在一些实施方式中，癌症是转移性癌症。
可使用各种移植方法对治疗的个体投予本发明的人类间质干细胞群或其分化子代，其性质取决于植入部位。可将细胞移植入组织的损伤或健康区域。将人类间质干细胞投予至健康区域的情况下，该些细胞将会移动至损伤区域。
可藉由直接注射至一器官、直接注射至血流、腹腔注射、直接注射至淋巴器官的手段移植本发明人类间质干细胞群或其分化子代。合适的移植方法可藉由监控植入细胞对预定器官的回溯及植入情况、预定器官特定标记物的表现、以及该个体的预定器官功能来决定。
以在个体中可达成预期治疗效果的前提投予的本发明有效量之人类间质干细胞群或其分化子代。在本发明中使用的人类间质干细胞有效剂量可从体内及/或体外细胞培养测定中初步估计。举例来说，可在实验动物中调配可达成期望浓度的剂量，然后使用该些信息来更准确地确定用于人类的剂量。剂量可取决于投予或给药途径。确切的剂量以及给药/投予途径可以由主治医师根据患者的状况及病史来确定。
取决待治疗的病症，本发明有效量之人类间质干细胞可以是单一剂量或多剂量，治疗过程可持续数天至数周，或直到有效治愈或疾病的症状减少为止。
对本领域具有通常知识者来说，透过以下非限制性的实施例的检验，本发明的额外目的、优点及特征将会显而易见。
实施例
材料与方法
表面抗原分析
使用0.25％的胰蛋白酶(trypsin)-EDTA从细胞培养皿上收取细胞。以含有1％的BSA之磷酸盐缓冲生理食盐水(Phosphate buffered saline，PBS)溶液洗涤细胞，并以荧光素异硫氰酸酯(fluorescein isothiocyanide，FITC)或藻红素(phycoerythrin，PE)-复合抗体于4℃下染色30分钟。间质干细胞标记物：抗-CD29(整联蛋白β1链(integrinβ1chain))、抗-CD105(SH2，内皮蛋白(endoglin)CD 73(+))、以及造血干细胞标记物：抗-CD34(负控制组)；以及白血球标记物：抗-CD45(白血球共同抗原)。接着以PBS洗涤细胞并使用流式细胞仪(产品名：FACS calibur flow cytometer，购自FACSCanto,BD Biosciences,Becton,Dickinson and Company,San Jose,CA)分析。细胞以高达1,000细胞/秒的速率穿过，并使用488nm的氩气激光束作为激发光源。经FITC与PE-复合的同型控制组抗体染色的细胞可用于计算背景荧光值。
使用成骨分化套组(商品名：STEMPRO osteogenesis differentiation kit，Gibco)诱发人类间质干细胞以形成骨细胞，以及使用脂肪生成分化套组(商品名：STEMPROadipogenic differentiation kit，Gibco)以及软骨诱导培养液(Chondrogenicinduction medium,Gibco)诱导以形成脂肪细胞及软骨细胞。接着在37℃之温度下，于95％的空气及5％的CO 2加湿培养箱中维持该些细胞生存状态。14天的期间内，每2至5天更换培养液。根据标准流程以爱尔新蓝染色以评估分化的软骨。根据标准流程以油红-O染色以评估分化的脂肪细胞。
实施例1：制备及培养人类间质干细胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)
本研究包含15位人类受试者个体，皆均获得其书面同意。将该些受试者根据年龄分成不同的组别，分别是：50至60岁一组、70至80岁一组或20至30岁一组，每组五位受试者。对每位受试者抽血(10毫升)，并将血液收集于含有肝素的试管中，接着添加0.5毫升的甘油(每毫升100毫克)，将含有甘油的血液置于37℃培养6小时。接着，以3,500rpm之转速离心含有甘油的血液18分钟。离心之后，萃取试管中层的细胞并于PBS溶液(8毫升)中再悬浮。以18×g之转速再次离心细胞悬浮液13分钟，丢弃上清液，萃取试管中层的细胞并种植于含10毫升市售培养液(thermo-life)之细胞培养盘中(表面积约10平方公分)，该市售培养液包含：500毫升的角质细胞(keratinocyte)-SFM、2.5毫升的牛脑下垂体萃取液、13％的人类新鲜冷冻血浆(fresh frozen plasma，FFP)、30％的胎牛血清、15毫升的甘油(每毫升100毫克)以及表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF，2.5微克)。将种满细胞的培养盘置于条件为37℃温度、相对湿度(RH)70％、5％CO 2的培养箱中，培养16至18小时。将细胞收取下来并重新种植至另一个含有前述培养液(thermo-life)的培养盘(表面积约175平方公分)上。每三天更换培养液，培养液的更换至少重复一次。间质干细胞在第5天时开始出现，最后在约第7天时达到满盘(confluence)。将获得的人类间质干细胞分离并储存于零下温度直到后续使用。
进一步，发现到人类间质干细胞可成功地从一高龄受试者(诸如介于70至80岁的个体)的周边血液中离体取得并扩增。
实施例2：实施例1之人类间质干细胞的特性分析
2.1细胞表面抗原分析
使用胰蛋白酶/EDTA分离实施例1之黏附细胞，并根据「材料与方法」一节所描述的流程，使该些细胞于流式细胞仪中接受表面抗原分析。第1图绘示该实验结果。
实施例1的细胞对表面标记物CD73(数据未示出)、CD90(第1A图)以及CD105(第1B图)呈现阳性反应，而对CD34(第1C图)、CD45(数据未示出)以及HLA-DR(数据未示出)呈现阴性反应；这些结果证实该些细胞的确是间质干细胞。
2.2实施例1之人类间质干细胞之分化
在本实施例中，为了证实实施例1的人类间质干细胞仍具备分化的能力，将该些细胞分别于含有可诱发后续人类间质干细胞分化之试剂的培养液中进行培养。可根据标准流程，将从实施例1分化而来的软骨细胞、软骨以及脂肪细胞，分别以碱性磷酸酶染色、以爱尔新蓝染色以及油红-O染色来确认其细胞型态，该结果分别显示于第2A图、第2B图以及第2C图。
应当理解的是，前述对实施方式的描述仅是以实施例的方式给出，且本领域所属技术领域中具有通常知识者可进行各种修改。以上说明书、实施例及实验结果提供本发明之例示性实施方式之结构与用途的完整描述。虽然上文实施方式中揭露了本发明的各种具体实施例，然其并非用以限定本发明，本发明所属技术领域中具有通常知识者，在不悖离本发明之原理与精神的情形下，当可对其进行各种更动与修饰，因此本发明之保护范围当以附随申请专利范围所界定者为准。

Claims (1)

1.一种提供未分化之人类间质干细胞(mesenchymal stem cells，hMSCs)群的方法，其特征在于，包含：取得一离体人类周边血液；将甘油添加至离体人类周边血液中培养6h后，以3500rpm之转速离心含有甘油的血液18分钟；离心之后，萃取试管中层的细胞并于PBS溶液再悬浮；以18×g之转速再次离心细胞悬浮液13分钟，萃取试管中层的细胞，并将获得的中层细胞在含有keratinocyte-SFM、牛脑下垂体萃取液、13%的人类新鲜冷冻血浆、30%的胎牛血清、15毫升的100mg/mL的 甘油以及2.5μg的 表皮生长因子的培养基中培养7天后可获得足量纯的未分化的间充质干细胞。
CN201780085565.6A 2017-11-28 2017-11-28 自周边血液制备间质干细胞群的方法及其用途 Active CN110402286B (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2017/113305 WO2019104466A1 (en) 2017-11-28 2017-11-28 Methods of producing populations of mesenchymal stem cells from peripheral blood and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110402286A CN110402286A (zh) 2019-11-01
CN110402286B true CN110402286B (zh) 2023-05-26

Family

ID=66663699

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780085565.6A Active CN110402286B (zh) 2017-11-28 2017-11-28 自周边血液制备间质干细胞群的方法及其用途

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20210403871A1 (zh)
EP (1) EP3717629A1 (zh)
JP (1) JP7003283B2 (zh)
KR (1) KR102376432B1 (zh)
CN (1) CN110402286B (zh)
WO (1) WO2019104466A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112294844A (zh) * 2019-07-14 2021-02-02 丰泽康生物医药（深圳）有限公司 多潜能细胞活性物联合富血小板血浆的骨关节炎治疗药物及制法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011069121A1 (en) * 2009-12-04 2011-06-09 Neostem, Inc. Mesenchymal stem cells (mscs) isolated from mobilized peripheral blood
CN104487568A (zh) * 2012-07-11 2015-04-01 爱姆斯坦生物技术公司 人胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞、方法及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012020566A1 (ja) * 2010-08-10 2012-02-16 国立大学法人旭川医科大学 Ape1遺伝子導入による高機能化幹細胞・前駆細胞
CN104471059B (zh) * 2012-07-12 2018-04-17 珠海横琴爱姆斯坦生物科技有限公司 人胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞、方法及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2011069121A1 (en) * 2009-12-04 2011-06-09 Neostem, Inc. Mesenchymal stem cells (mscs) isolated from mobilized peripheral blood
TW201130977A (en) * 2009-12-04 2011-09-16 Neostem Inc Mesenchymal stem cells (MSCs) isolated from mobilized peripheral blood
CN104487568A (zh) * 2012-07-11 2015-04-01 爱姆斯坦生物技术公司 人胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞、方法及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cold exposure stimulates lipid metabolism, induces inflammatory response in the adipose tissue of mice and promotes the osteogenic differentiation of BMMSCs via the p38 MAPK pathway in vitro;Yizhen Nie et al.;《Int J Clin Exp Pathol》;20150915;第8卷(第9期);第10875-10886页 *
人血源性间充质干细胞培养与体外成骨研究;曹聪等;《中国修复重建外科杂志》;20051231;第19卷(第8期);第642-647页 *
表皮生长因子对外周血间充质干细胞原代克隆形成的影响及其传代后多向分化潜能;陈燕玲等;《中国组织工程研究与临床康复》;20090305;第13卷(第10期);第1891-1895页 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20210403871A1 (en) 2021-12-30
KR20200072545A (ko) 2020-06-22
WO2019104466A1 (en) 2019-06-06
JP2021503949A (ja) 2021-02-15
KR102376432B1 (ko) 2022-03-17
JP7003283B2 (ja) 2022-02-04
CN110402286A (zh) 2019-11-01
EP3717629A1 (en) 2020-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20140341863A1 (en) Adult mesenchymal stem cell (msc) compositions and methods for preparing the same
US11447748B2 (en) Encapsulated adipose-derived stem cells, methods for preparation and theraputic use
US9415072B2 (en) Expansion of haemopoietic precursors
WO2007065927A1 (en) Use of adipose tissue derived mesenchymal stem cells for the treatment of graft versus host disease
CN113181215B (zh) 一种骨髓间充质干细胞外泌体制剂及促进造血损伤恢复的用途
EP3984596A1 (en) Cell population including mesenchymal cells, pharmaceutical composition including same, and method for producing same
US20160287642A1 (en) Methods of treating or preventing a lung disorder
JP5388297B2 (ja) アディポクラスター
CN110402286B (zh) 自周边血液制备间质干细胞群的方法及其用途
TW202319536A (zh) 用於治療慢性腎病之間葉幹細胞
TWI656215B (zh) 自周邊血液製備間質幹細胞群的方法及其用途
EP2929016A1 (en) A method of generating multilineage potential cells
TWI810918B (zh) 自包皮組織取得人類間質幹細胞的方法及其用途
TWM638487U (zh) 用於分離人類間質幹細胞的採樣管
WO2022210574A1 (ja) 筋ジストロフィー治療剤
KR20070113694A (ko) 조혈모세포 생착 촉진용 조성물
Shailaja et al. Study of Stem Cells in Human Milk
Alfaifi Cell therapy for acute liver injury-in vivo efficacy of mesenchymal stromal cells in toxic and immune-mediated murine hepatitis
US20230355681A1 (en) Prevention of menopause associated osteoporosis by intra-ovarian administration of regenerative cells
JP2024509023A (ja) 肝線維化および／または肝硬変の予防および治療における使用のための、脂肪組織由来再生細胞（ＡＤＲＣｓ）を含む医薬組成物
CN105796598A (zh) 一种用于治疗慢性阻塞性肺疾病的脂肪间充质祖细胞复合物
Götherström Characterisation of human fetal mesenchymal stem cells
Siemionow et al. The Role of Stem Cells in Plastic Surgery

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant