KR20200072545A - 말초 혈액으로부터 중간엽 줄기 세포 집단을 생성하는 방법 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

미분화된 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC)의 집단을 제공하는 방법이 본원에 개시된다. 상기 방법은 기증자로부터 말초 혈액을 수득하는 단계, 말초 혈액에 글리세린을 첨가하는 단계, 말초 혈액 내 다른 체세포의 줄기 세포로부터 hMSC를 분리하는 단계, 및 글리세린을 함유하는 배지에서 hMSC를 배양함으로써 이식에 적합한 미분화된 hMSC의 집단을 생성하는 단계를 포함한다.

Description

말초 혈액으로부터 중간엽 줄기 세포 집단을 생성하는 방법 및 그의 용도

본 개시는 중간엽 줄기 세포 (MSC)를 단리 및 확장하는 방법 및 이로부터 유래된 세포 집단에 관한 것이다.

중간엽 줄기 세포 (MSC)는 신생아 조직 (예를 들어, 인간 제대의 와튼 제대 교질), 골수, 말초 혈액, 태반, 제대혈 및 지방 조직을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 조직으로부터 단리될 수 있다. 그중에서도 말초 혈액은 MSC를 얻기 위한 가장 용이한 공급원이다. 그러나, MSC는 말초 혈액에 매우 낮은 수준으로 존재하고, 시험관 내에서 확장된 경우에도 후속 분화 및 사용을 위해 충분한 양의 MSC를 수확할 수 없어 그 기술은 제한적이다.

따라서, 관련 업계에서는 후속 치료 용도에 충분한 풍부한 MSC 집단의 생성을 가능케 하는, 말초 혈액으로부터 MSC를 수득하기 위한 개선된 방법이 요구된다.

다음은 독자에게 기본적인 이해를 제공하기 위해 본 개시의 간략화된 요약을 제시한다. 이 요약은 본 개시의 포괄적인 개요가 아니며, 본 발명의 핵심/주요 요소를 밝히거나 본 발명의 범위를 정확하게 서술하지 않는다. 그것의 유일한 목적은 본원에 개시된 일부 개념을 이후에 제시되는 보다 상세한 설명에 대한 서두로서 간략화된 형태로 제시하기 위함이다.

본 발명은 일반적으로 중간엽 줄기 세포 (MSC)가 인간 대상의 말초 혈액으로부터 단리되고 글리세린을 함유하는 배지에서 시험관 내에서 확장될 수 있으며, 따라서 자가 이식에 적합한 실질적으로 순수한 단리된 미분화 인간 MSC (hMSC)의 집단을 생성할 수 있다는 발견에 관한 것이다.

따라서, 본 개시의 제1 측면은 미분화된 hMSC 집단을 제공하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은

(a) 인간 대상으로부터 말초 혈액을 수득하는 단계;

(b) 단계 (a)에서의 말초 혈액에 글리세린을 첨가하는 단계;

(c) 단계 (b)의 말초 혈액에서 다른 체세포의 줄기 세포에 대해 hMSC를 분리하는 단계; 및

(d) 단계 (c)의 분리된 hMSC를 글리세린 함유 배지에서 배양하여 미분화된 hMSC 집단을 생성하는 단계;를 포함하며;

상기 배지는 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어떤 이동제도 함유하지 않는다.

본 개시의 실시양태에 따라, 단계 (a)에서, 말초 혈액은 어떤 용혈제도 함유하지 않는 튜브에 수집된다.

본 개시의 실시양태에 따라, 단계 (b)에서, 글리세린은 말초 혈액에 약 1 내지 10 mg/mL의 농도로 존재한다.

본 개시의 실시양태에 따라, 단계 (d)에서, 배지는 적어도 20% 혈청 (v/v)을 포함하고, 글리세린은 배지에 약 0.1 내지 1 mg/mL의 농도로 존재하며, hMSC는 37 ℃에서 적어도 12 시간 동안 글리세린 함유 배지를 포함하는 배양 플레이트에서 배양된다.

본 개시의 선택적인 실시양태에 따라, 상기 방법은 추가로

(e) 배양된 hMSC를 단계 (d)에서의 것보다 적어도 16 배 더 큰 표면적을 갖는 다른 배양 플레이트로 옮기고 적어도 4 일 동안 글리세린 함유 배지에서 배양을 계속하여 미분화된 hMSC 집단을 생성하는 단계를 포함한다.

본 개시의 실시양태에 따라, 단계 (e)에서, hMSC는 미분화된 hMSC의 집단을 생성하기 위해 적어도 6 일 동안 배양된다.

본 개시의 실시양태에 따라, 이렇게 생성된 미분화된 hMSC의 집단은 CD34-, CD45-, 및 HLA-DR 세포 표면 마커에 대해 음성이고 CD73+, CD90+, 및 CD 105+ 세포 표면 마커에 대해 양성이다.

따라서, 본 개시는 본 개시의 방법에 따라 생성된 실질적으로 순수한 미분화된 hMSC 집단을 포함하는 클론 세포주의 발견에 관한 것이다.

추가로, 본 개시는 또한 치료를 필요로 하는 대상의 질환 또는 장애의 치료를 위한, 본 개시의 방법에 의해 생성된 미분화된 hMSC 또는 그의 분화된 자손의 집단의 용도의 발견에 관한 것이다.

본 개시의 실시양태에 따라, hMSC 집단은 실질적으로 순수한 hMSC이다.

본 개시의 실시양태에 따라, 실질적으로 순수한 hMSC는 연골 세포, 연골 및 지방 세포로 분화되도록 유도될 수 있다.

따라서, 자가 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC)의 이식을 필요로 하는 대상의 질환 또는 장애를 치료하는 방법이 제공된다. 이 방법은 질환 또는 장애를 치료하기 위해 대상에게 본 개시의 방법에 따라 생성된 미분화된 hMSC 집단의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

본 개시의 실시양태에 따라, hMSC의 자가 이식에 의해 치료 가능한 질환 또는 장애는 골 또는 연골 질환, 신경퇴행성 질환, 심장 질환, 간 질환, 암, 자가면역 질환, 이식편대 숙주 질환 (GvHD), 및 상처 치유 및 조직 재생으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 개시의 특정 실시양태에 따라, 미분화된 hMSC 또는 그의 분화된 자손의 집단의 유효량은 3 일 이하의 기간, 2 일 이하의 기간, 또는 1 일 이하의 기간 동안 대상에게 투여된다.

본 개시의 많은 수반되는 특징 및 이점은 첨부 도면과 관련하여 고려되는 다음의 상세한 설명을 참조함으로써 더 잘 이해될 것이다.

특허 또는 출원 파일은 컬러로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)과 함께 이 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청시 필요한 비용을 지불하면 해당 청에서 제공받을 수 있을 것이다.
본 설명은 첨부 도면에 비추어 다음의 상세한 설명을 읽음으로써 더 잘 이해될 것이며, 이들 도면에서,
도 1A 내지 1C는 각각 본 개시의 일 실시양태에 따라 (A) CD90, (B) CD 105에 대해 양성이고 (C) CD34에 대해 음성인 실시예 1의 hMSC를 도시하고;
도 2A는 본 개시의 일 실시양태에 따라 알칼리성 포스파타제 염색으로 확인된 실시예 1의 hMSC로부터 분화된 연골 세포를 나타내는 사진이며;
도 2B는 본 개시의 일 실시양태에 따라 알시안 블루 (Alcian Blue)에 의해 염색된 실시예 1의 hMSC로부터 분화된 연골을 나타내는 사진이고;
도 2C는 본 개시의 일 실시양태에 따라 오일 레드 O로 염색된 실시예 1의 hMSC로부터 분화된 지방 세포를 나타내는 사진이다.

첨부된 도면과 관련하여 아래에 제공되는 상세한 설명은 본 실시예의 설명으로서 의도된 것이며 본 실시예로 구성되거나 이용될 수 있는 유일한 형태를 나타내도록 의도되지 않는다. 본 설명은 실시예의 기능과 실시예를 구성하고 동작시키기 위한 일련의 단계들을 설명한다. 그러나, 동일하거나 동등한 기능 및 순서가 상이한 실시예로 달성될 수 있다.

1. 정의

편의상, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에 사용된 특정 용어를 여기에 모아 놓았다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명에 속해 있는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가진다.

단수 형태 "a", "and" 및 "the"는 문맥상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함하기 위해 본원에서 사용된다.

"줄기 세포"라는 용어는 넓은 의미로 사용되며 전통적인 줄기 세포, 전구 세포, 전 전구 세포 등을 포함한다. 용어 "줄기 세포"는 증식할 수 있고 분화되거나 분화 가능한 딸 세포를 야기할 수 있는 다수의 모 세포를 생성할 능력이 있는 더 많은 전구 세포를 발생시킬 수 있는 미분화 세포를 지칭한다. 딸 세포 자체가 하나 이상의 성숙한 세포 유형으로 분화되는 자손을 증식시키고 생성하도록 유도될 수 있다. 따라서, "줄기 세포"라는 용어는 특정 상황 하에서 보다 특수화 또는 분화된 표현형으로 분화될 수 있는 능력 또는 잠재력을 가지며, 특정 상황 하에서 실질적으로 분화하지 않고 증식하는 능력을 보유하는 세포를 지칭한다.

용어 "중간엽 줄기 세포 (MSC)"는 지방, 골성, 기질, 연골, 탄성 및 섬유성 결합 조직과 같은 복수의 특정 유형의 결합 조직으로 분화될 수 있는 다능성 줄기 세포를 지칭한다. 식별을 위해, 인간 MSC는 CD34^-, CD45^-, CD73⁺, CD90⁺, 및 CD105⁺의 표현형 마커 발현; 및 연골 세포, 연골 및 지방 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 특별한 요소를 지원하는 조직으로 분화하는 능력에 기초하여 식별될 수 있다.

단리된 hMSC 집단과 관련하여 용어 "집단"은 혼합 또는 이종 세포 집단으로부터 제거되고 분리된 hMSC 집단을 지칭한다. 일부 실시양태에서, hMSC 집단은 세포가 단리되거나 풍부화되는 이종 집단과 비교하여 실질적으로 순수한 hMSC의 집단이다.

특정 세포 집단과 관련하여 용어 "실질적으로 순수한"은 총 세포 집단을 구성하는 세포와 관련하여 적어도 약 70%, 바람직하게는 약 80%, 보다 바람직하게는 약 90%, 및 가장 바람직하게는 약 95% 순수한 세포 집단을 지칭한다. 본 개시에 기재된 방법에 따라 생성된 hMSC 집단과 관련하여 용어 "실질적으로 순수한"은 다른 비-hMSC를 약 30% 이하, 보다 바람직하게는 약 20%, 15%, 10%, 8% 이하, 가장 바람직하게는 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 이하 또는 1% 미만으로 함유하는 hMSC 집단을 지칭한다. 일부 실시양태에 따라, 본 개시는 말초 혈액으로부터 단리된 hMSC 집단을 확장시키는 방법을 포함하며, 여기서 말초 혈액 유래 hMSC의 확장된 집단은 실질적으로 순수한 hMSC 집단이다.

용어 "클론 세포주"는 배양시 유지될 수 있고 무한 증식할 수 있는 세포 계통을 지칭한다. 클론 세포주는 줄기 세포주 (예를 들어, 본 개시의 말초 혈액으로부터 유래된 hMSC)이거나 말초 혈액 유래 hMSC로부터 유래될 수 있고, 여기서 클론 세포주는 적어도 1 개월 동안 분화없이 증식을 가능하게 하는 시험관 내 조건 하에서 배양된, 본 개시의 말초 혈액으로부터 유래된 hMSC를 포함하는 클론 세포주의 맥락으로 사용된다. 이러한 클론 줄기 세포주 (예를 들어, 본 개시의 말초 혈액으로부터 유래된 hMSC)는 기원 줄기 세포로부터 여러 세포 계통을 따라 분화할 잠재성을 가질 수 있다.

세포 개체 발생과 관련하여, 형용사 "분화된"은 상대적인 용어이다. "분화된 세포"는 비교되는 세포보다 발생 경로를 더 지나 진행된 세포이다. 따라서, 줄기 세포는 계통 제한 전구체 세포로 분화될 수 있으며, 이는 차례로 경로를 더 지나 다른 유형의 전구체 세포로 분화될 수 있고, 이어서 특정 조직 유형에서 특징적인 역할을 하는 말기 분화 세포로 분화될 수 있고, 추가 증식 능력을 보유하거나 보유하지 않을 수 있다.

본원에 사용된 용어 "치료"는 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과, 예를 들어 조직 재생을 얻는 것을 의미하고자 한다. 그 효과는 질환 또는 그의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 관점에서 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기인할 수 있는 부작용을 부분적 또는 완전히 치유하는 관점에서 치료적일 수 있다. 본원에 사용된 "치료"는 포유동물, 특히 인간에서 질환의 방지적 (예를 들어, 예방적), 치유적 또는 완화적 치료를 포함하고; (1) 질환에 취약할 수 있으나 아직 그에 걸린 것으로 진단되지 않은 개체에서 발생하는 질환 또는 상태 (예를 들어, 상처)의 방지적 (예를 들어, 예방적), 치유적 또는 완화적 치료; (2) 질환의 억제 (예를 들어, 발달을 정지시킴으로써); 또는 (3) 질환 경감 (예를 들어, 질환과 관련된 증상 감소)을 포함한다.

용어 "투여된", "투여하는" 또는 "투여", 또는 "이식하는"은 본 발명의 hMSC 집단을 대상의 원하는 위치에 정맥 내, 근육 내, 복강 내, 동맥 내, 두개 내, 또는 피하 투여하여 hMSC의 적어도 일부가 생존 가능하게 유지되는 것을 제한없이 포함하는 임의의 적절한 경로를 지칭하기 위해 본원에서 상호호환적으로 사용된다. 대상에 투여 후 세포의 생존 기간은 짧게는 수 시간, 예를 들어 24 시간에서 수 일, 길게는 수 개월일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "유효량"은 혈소판 응집으로 인한 질환의 치료와 관련하여 원하는 결과를 달성하기 위해 필요한 투여량과 시간에서 효과적인 hMSC의 양을 지칭한다. 예를 들어, 상처의 치료에서, 피부 및 관련된 연조직의 재생을 촉진하는 작용제 (즉, 본 개시의 hMSC)가 효과적일 것이다. 유효량의 작용제는 질환 또는 상태를 치유하는데 필수적이지 않지만, 질환 또는 상태의 발병을 지연, 방해 또는 예방하거나 질환 또는 상태 증상이 개선되도록 질환 또는 상태에 대한 치료를 제공할 것이다. 특정 유효량 또는 충분량은 치료되는 특정 상태, 환자의 신체 상태 (예를 들어, 환자의 체질량, 연령 또는 성별), 치료되는 포유동물 또는 동물의 타입, 치료 기간, 동반 요법 (존재하는 경우)의 특성, 사용된 특정 제형 등과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 유효량은 지정된 기간 동안 1 회, 2 회 또는 그 이상 투여하기에 적합한 형태로 1, 2 또는 그 이상의 용량으로 분할될 수 있다.

용어 "대상" 또는 "환자"는 본원에서 상호호환적으로 사용되며 본 발명의 화합물에 의해 치료될 수 있는 인간 종을 포함하는 포유동물을 의미하도록 의도된다. "포유동물"이라는 용어는 인간, 영장류, 토끼, 돼지, 양 및 소와 같은 가축 및 농장 동물뿐만 아니라; 동물원, 스포츠 또는 애완 동물; 및 마우스 및 래트와 같은 설치류를 포함하는 포유동물류의 모든 구성원이다. 또한, 용어 "대상" 또는 "환자"는 하나의 성별이 구체적으로 지시되지 않는 한 남성 및 여성 성별을 모두 지칭하는 것으로 의도된다. 따라서, 용어 "대상" 또는 "환자"는 본 개시의 치료 방법으로부터 혜택을 받을 수 있는 임의의 포유동물을 포함한다. "대상" 또는 "환자"의 예는 인간, 래트, 마우스, 기니피그, 원숭이, 돼지, 염소, 소, 말, 개, 고양이, 조류 및 닭을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 바람직한 실시양태에서, 대상은 인간이다.

용어 "매질"은 조직 또는 세포 집단을 유지하거나 세포 집단을 배양하기 위한 것 (예를 들어, 배양 배지)으로, 세포 생존력을 유지하고 증식을 지원하는 영양소를 함유하는 배지를 지칭한다. 세포 배양 배지는 염, 완충제, 아미노산, 글루코스 또는 다른 당, 항생제, 혈청 또는 혈청 대체물 및 성장 인자와 같은 다른 성분 등의 임의의 것을 적절한 조합으로 함유한다. 특히 특정 세포 유형에 일반적으로 사용되는 세포 배양 배지는 당업자에게 공지되어 있다.

본원에 사용된 용어 "이동"은 세포가 그들의 상주 틈새 (예를 들어, 골수)를 떠나 혈액으로 들어가는 과정을 지칭한다. 따라서, 용어 "이동제"는 말초 조직 및 골수의 줄기 세포 틈새에 상주하는 줄기 세포 (예를 들어, MSC)의 풀 또는 집단의 부착성을 상실시키는 작용제를 지칭한다.

2. 말초 혈액으로부터 유래된 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC)의 단리 및 배양

중간엽 줄기 세포 (MSC)는 보통 골수로부터 수득되는 비조혈 줄기 세포이다. MSC는 말초 혈액에 매우 낮은 수준으로 존재하며 말초 혈액으로부터의 수확은 시험관 내에서 확장된 경우에도 치료적 용도로 충분한 양의 세포를 생산하지 못하는 경우가 빈번하다. 본 연구의 발명자는 예기치 않게 말초 혈액으로부터 유래된 MSC를 단리 및 확장시켜 재생 요법에서 향후 자가 치료 적용, 예컨대 상처 치유 및 골 수복 및 기타 정형외과 적응증을 위해 단독으로 또는 다른 세포와 함께 사용될 수 있는 실질적으로 순수한 hMSC 집단을 생성하는 방법을 발견하였다.

따라서, 본 개시의 제1 측면은 미분화된 hMSC 집단을 제공하는 방법을 제공하는 것을 목표로 한다. 이 방법은

(a) 인간 대상으로부터 말초 혈액을 수득하는 단계;

(b) 단계 (a)에서의 말초 혈액에 글리세린을 첨가하는 단계;

(c) 단계 (b)의 말초 혈액에서 다른 체세포의 줄기 세포에 대해 hMSC를 분리하는 단계; 및

(d) 단계 (c)의 분리된 hMSC를 글리세린 함유 배지에서 배양하여 hMSC 집단을 생성하는 단계;를 포함하고,

상기 배지는 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어떤 작용제도 함유하지 않는다.

일부 실시양태에 따라, 본 방법의 단계 (a)에서, 말초 혈액은 인간 대상으로부터 채취되어 항응고제 (예를 들어, 헤파린)를 함유하는 튜브에 수집된다. 본 개시의 실시양태에 따라, 대상은 건강한 대상 또는 hMSC의 이식을 요하는 질환 또는 장애로 고통받는 대상일 수 있다. 또한, 본 hMSC의 생성을 위해 말초 혈액이 채취되는 대상은 연령에 특별한 제한이 없다. 특정 실시양태에 따라, 말초 혈액은 각각 20 내지 30 세의 인간 대상으로부터 채취된다. 다른 실시양태에 따라, 말초 혈액은 각각 50 내지 60 세의 인간 대상으로부터 채취된다. 추가의 실시양태에 따라, 말초 혈액은 각각 70 내지 80 세의 인간 대상으로부터 채취된다.

말초 혈액을 수집하고 바로 글리세린과 혼합한 후, 37 ℃에서 적어도 4 시간, 바람직하게는 적어도 6 시간 동안 인큐베이션한다 (본 방법의 단계 (b)). 본 개시의 실시양태에 따라, 글리세린은 바람직하게는 말초 혈액에 약 1 내지 10 mg/mL, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10 mg/mL; 보다 바람직하게는 약 2 내지 8 mg/mL, 예컨대 2, 3, 4, 5, 6, 7, 및 8 mg/mL; 가장 바람직하게는 약 5 mg/mL의 양으로 존재한다.

인큐베이션 후, 글리세린 함유 말초 혈액 내의 hMSC를 세포 분류기 또는 원심 세정과 같은 적합한 수단에 의해 다른 체세포의 줄기 세포로부터 분리한다 (본 방법의 단계 (c)).

본 개시의 일부 실시양태에 따라, 본 방법의 단계 (c)에서, 말초 혈액 내의 hMSC를 레이저 스캐닝 유세포 분석기와 같은 세포 분류기에 의해 다른 체세포의 줄기 세포로부터 분리한다. 유세포 분석기는 전형적으로 레이저 광원, 유량 측정 챔버와 렌즈, 필터 및 광 검출기로 구성된 광학 시스템으로 이루어져 있다. 레이저에 대해 하나는 180도, 다른 하나는 90도에 위치한 두 광전자 증배관을 전방 (FSC) 및 직각 산란 (SCC)을 각각 측정하는 데 사용하였다. 순방향 튜브에 필터 및 광전자 증배기로 각각 구성된 세 형광 검출기를 형광을 검출하는데 사용하였다. 형광 활성화 세포 분류 (FACS) 기를 특정 전방 산란 및/또는 측면 산란의 셀이 선택되는 방식으로 설정하였다. FSC는 세포 표면적 또는 크기에 비례한다. FSC는 주로 회절된 광의 측정치이며 광다이오드에 의해 순방향으로의 입사 레이저 빔의 축에서 바로 검출된다. FSC는 형광과 상관없이 주어진 크기보다 큰 입자를 검출하는데 적절한 방법을 제공한다. 측면 산란광 (SCC)은 입도 또는 내부 복잡성에 비례한다. SSC는 굴절률의 변화가 있는 셀 내 임의의 계면에서 발생하는 주로 굴절 및 반사광의 측정치이다. SSC는 수집 렌즈에 의해 레이저 빔에 대해 약 90도에서 수집된 후, 빔 스플리터에 의해 적절한 검출기로 재지향된다. 따라서, 특정 FSC 및 SSC를 게이팅함으로써 세포를 선택할 수 있다. 본 개시의 작업 실시양태에 따라, 말초 혈액 내 hMSC는 세포 표면의 발현 수준에 기초하여 다른 체세포의 줄기 세포로부터 분리되는데, 이때 상이한 형광 강도로 염색된 이벤트에 대해 게이팅된 세포 집단이 선택된다.

선택적으로 또는 부가적으로, 단계 (c)에서는, 단계 (b)에서 수득된 글리세린 함유 말초 혈액을 COBE Spectra Apherasis System과 같은 세포 분류기에 유입시키고, 이 절차 동안 혈액이 응고되지 않도록 임의로 항응고제를 첨가한다. 이어서, 혼합물을 원심분리기를 통해 순환시켜 말초 혈액에서 MSC 집단 및 단핵 세포를 다른 혈액 성분 및 혈장으로부터 분리한다. 이렇게 분리된 MSC는 저장을 위해 수집 백으로 펌핑되고, 반면 다른 혈액 성분 및 혈장은 폐기되거나 대상으로 복귀된다.

선택적으로 또는 부가적으로, 본 방법의 단계 (c)에서, 글리세린 함유 말초 혈액 중의 hMSC를, 크기가 더 큰 줄기 세포로부터 더 작은 줄기 세포를 분획화하는 원심 세정에 의해 다른 체세포의 줄기 세포로부터 분리한다. 특정 실시양태에서, 단계 (b)에서의 글리세린 함유 말초 혈액을 회전 원심분리기에 위치한 일반적으로 깔때기형 분리 챔버로 도입한다. 액체 세정 완충액의 흐름을 말초 혈액을 함유하는 챔버로 도입한다. 액체 세정 완충액의 유량이 챔버를 통해 증가함에 따라, 액체는 더 작은 크기의 느리게 침강하는 세포를 챔버 내의 세정 경계를 향해 쓸어내고, 더 크고 빠르게 침강하는 세포는 챔버 영역으로 이동하게 하여 원심력과 침강력은 균형을 이룬다. 따라서, 말초 혈액은 많은 상이한 줄기 세포 집단을 포함하기 때문에, 이들은 작은 줄기 세포를 더 큰 줄기 세포로부터 분획화하는 세정을 사용함으로써 상이한 집단으로 분리될 수 있다. 말초 혈액으로부터 유래된 MSC를 수득 및/또는 단리하기 위해 임의의 세정 장치가 사용될 수 있다.

본 방법의 단계 (d)에서, 단계 (c)에서 생성된 hMSC를 단리된 hMSC의 증식을 증대시키는 조건에서 배양하여 추가로 확장시킨다. 본 개시의 바람직한 실시양태에 따라, 단계 (c)에서 수득된 hMSC를 글리세린을 포함하고, 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF), 및 이들의 조합이 포함되나 이에 제한되지 않는 임의의 공지된 줄기 세포 이동제를 포함하지 않는 성장 배지에서 페트리 접시 (표면적 약 10 ㎠)에서 배양한다. 특정 성분을 함유하지 않는 매질을 언급할 때, 본 개시는 매질이 이 성분을 포함하지만 그의 최소 활성 미만의 농도로 포함하는 것을 고려한다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 예를 들어, 특정 배지는 상기 기재된 미량의 줄기 세포 이동제 (즉, G-CSF, GM-CSF 또는 이들의 조합)를 포함할 수 있지만, 본 개시의 방법은 상업적 배지 형식에 포함되거나 배지 성분 농도의 전체적인 조정으로 인한 것 이상으로 외인적으로 첨가된 성장 배지를 포함하지 않는 배지에 관한 것이다.

본 발명의 hMSC를 배양하기에 적합한 전형적인 배지는 적어도 20% (v/v) 혈청, 바람직하게는 적어도 30% (v/v) 혈청, 보다 바람직하게는 적어도 50% 혈청을 함유하는 완전 배지 (예를 들어, DMEM)일 수 있으며, 여기서 글리세린은 바람직하게는 약 0.1 내지 1.0 mg/mL, 예컨대 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 및 1.0 mg/mL; 보다 바람직하게는 약 0.2 내지 0.8 mg/mL, 예컨대 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 및 0.8, mg/mL; 가장 바람직하게는 약 0.5 mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 실시양태에서, 0.1 내지 1.0 mg/mL 글리세린이 첨가될 수 있는 100% (v/v) 혈청이 hMSC를 배양하기 위한 성장 배지로서 사용된다. 배양 동안, 아미노산, 비타민, 미네랄, 및 트랜스페린 등의 유용한 단백질과 같은, 세포 대사에 필요한 보충제가 배지에 첨가될 수 있다. 배지는 또한 효모, 박테리아 및 진균에 의한 오염을 방지하기 위해 페니실린, 스트렙토마이신, 젠타마이신 등과 같은 항생제를 함유할 수 있다. 본 개시의 한 실시양태에 따라, 배양 배지는 뇌하수체 추출물, 혈장 및 소 태아 혈청을 포함한다. 배양은 충분한 양의 hMSC가 생성되도록 hMSC의 확장을 허용하기 위한 일정 기간 동안 수행될 수 있다. 하나의 특정 실시양태에 따라, 단계 (c)에서 수득된 hMSC를 30% (v/v) 혈청 및 0.5 mg/mL의 글리세린을 함유하는 배지에서 37 ℃에서 적어도 12 시간, 바람직하게는 적어도 16 시간, 보다 바람직하게는 적어도 24 시간 배양하여 자가 이식에 적합한 hMSC 집단을 생성한다.

본 개시의 실시양태에 따라, 본 방법에서 생성된 hMSC 집단은 조혈 줄기 세포 마커 CD34 및 CD45뿐만 아니라 이식편대 숙주 질환 (GvHD)을 매개하는 것으로 알려진 인간 백혈구 항원-항원 D 관련 (HLA-DR) 세포 표면 마커에 대해 음성 염색을 나타내고; CD73, CD90 및 CD 105 세포 표면 마커에 대해 양성 염색을 나타낸다. 세포 표면 마커 발현을 결정하는 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 예로는 FACS와 같은 면역학적 방법 및 생화학적 방법 (예를 들어, 방사성, 형광 또는 아비딘-비오틴을 통한 세포 표면 표지)을 포함한다. 대안적으로, 세포를 식별하기 위해 자기 세포 분류 (MACS) 또는 면역패닝이 사용될 수 있다.

본 방법에 의해 생성된 hMSC 집단에 대한 세포 표면 마커의 패턴 발현은 이들이 자가 줄기 세포 이식을 요하는 재생 요법에 사용될 수 있는 미분화된 성숙 hMSC의 풍부화된 집단임을 입증한다.

3. 인간 MSC 클론 세포주

따라서, 본 개시의 다른 측면은 상기 기재된 임의의 방법에 따라 생성된 실질적으로 순수한 미분화된 hMSC 집단을 포함하는 클론 세포주에 관한 것이다

본 개시의 이러한 측면에 따라, 상기 기재된 방법에 의해 새로 단리되거나 생성된 hMSC는 분화를 유도하지 않는 조건, 예를 들어 임의의 분화 인자가 없는 조건에서 배양함으로써 추가로 확장된다. 일반적으로, hMSC를 그의 숙주로부터 단리하거나 hMSC 집단 (예를 들어, 본 방법의 단계 (d)에서 생성된 hMSC)을 생성하도록 선택한 후 (이는 이종 세포 집단 또는 정제된 hMSC 집단일 수 있다), 단계 (d)에서의 것보다 적어도 16 배, 적어도 17 배, 적어도 18 배 또는 적어도 20 배 큰 표면적을 갖는 배양 플레이트에서 더 배양하고, 상기 기재된 글리세린 함유 배지 (즉, 단계 (d)에서의 배지)에서 배양을 계속한다. 선택적으로 또는 대안적으로, hMSC는 다수의 세포를 생성하기 위해 생물 반응기에서 배양된다. 본 개시의 실시양태에 따라, 본 단계에서 사용하기에 적합한 배지는 G-CSF, GM-CSF 및 이들의 조합과 같은 임의의 세포 이동제를 함유하지 않고; 글리세린을 바람직하게는 약 0.1 내지 1.0 mg/mL, 예컨대 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 및 1.0 mg/mL; 보다 바람직하게는 약 0.2 내지 0.8 mg/mL, 예컨대 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 및 0.8, mg/mL; 가장 바람직하게는 약 0.5 mg/mL의 농도로 포함한다. 배양은 바람직하게는 적어도 70%의 hMSC, 보다 바람직하게는 적어도 80%의 hMSC, 및 가장 바람직하게는 적어도 90%의 hMSC를 포함하는 미분화된 hMSC의 균질 집단을 생성하기 위해 바람직하게는 적어도 7 일, 바람직하게는 적어도 10 일, 및 보다 바람직하게는 적어도 14 일의 기간 동안 수행된다.

본 개시의 실시양태에 따라, hMSC는 적어도 2 집단 배가, 적어도 4 집단 배가, 적어도 6 집단 배가, 적어도 8 집단 배가, 적어도 10 집단 배가, 적어도 12 집단 배가, 적어도 15 집단 배가, 적어도 20 집단 배가, 적어도 30 집단 배가, 또는 적어도 40 집단 배가 동안 확장될 수 있다.

상기 단계 (d)에서의 발견과 유사하게, 이렇게 생성된 hMSC의 균질 집단은 미분화 상태로 유지되고 조혈 줄기 세포 마커 CD34 및 CD45뿐만 아니라 HLA-DR 세포 표면 마커에 대해 음성 염색을 나타내고; CD73, CD90, 및 CD 105 세포 표면 마커에 대해 양성 염색을 나타낸다.

본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 hMSC의 배양 집단은 신선한 채로 사용되거나, 글리세롤, 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 동결 보존제의 존재하에 동결 보존되는 것과 같이 추가 사용시까지 저장될 수 있다.

4. 본 hMSC를 포함하는 조성물

본 개시의 hMSC는 그 자체로 배양 배지와 함께 제공될 수 있고, 약학적으로 허용되는 담체 및 세포 생착 및/또는 기관 기능을 촉진할 수 있는 기타 추가 제제 (예를 들어, 면역억제제, 항생제, 성장 인자 등)와 조합될 수 있다. 따라서, 본 개시의 hMSC는 멸균 식염수 및 완충 수용액과 같은 약학적 담체 또는 희석제와 혼합된 약학적 조성물로 대상에게 투여될 수 있다.

투여에 적합한 경로는 경구, 직장, 경점막 (예를 들어, 경비), 장내 또는 근육 내, 피하 및 뇌실 내 주사뿐만 아니라 경막 내, 심실 내, 정맥 내, 복강 내 또는 안구 내 주사를 포함한 비경구 전달을 포함할 수 있지만 이에만 제한되지는 않는다.

대안적으로, 약학적 조성물은 전신 방식이 아닌 국소 방식으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 약학적 조성물은 표적 부위 (예를 들어, 기관)에 직접 주사된다.

본 개시에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 제형화될 수 있다. 적절한 제형은 투여 경로에 따른다.

주사를 위해, 본 개시의 hMSC는 수용액, 바람직하게는 링거액과 같은 생리학적으로 허용되는 완충제 또는 생리학적으로 허용되는 염 용액에서 제형화될 수 있다.

본 개시의 맥락에서 사용하기에 적합한 약학적 조성물은 활성 성분 (예를 들어, hMSC)이 의도된 목적을 달성하기에 효과적인 양으로 함유된 조성물을 포함한다. 유효량의 결정은 특히 본 개시의 설명에 비추어 당업자의 능력 내에 있다.

본 개시의 약학적 조성물은 본 hMSC를 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유할 수 있는 키트로서 제공될 수 있다. 키트는 키트 상에 또는 키트와 관련된 라벨 또는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 키트가 특정 질환 및/또는 장애를 치료하기 위한 것임을 제시한다. 대안적으로 또는 부가적으로, 키트는 인산염 완충 식염수와 같은 완충제 또는 링거액을 추가로 포함할 수 있다. 키트는 본 hMSC를 의도된 표적 부위에 투여하는 방법에 대한 지시 사항을 추가로 포함할 수 있다.

일 실시양태에 따라, 키트는 적어도, (a) 본 hMSC를 함유하는 제1 용기; 및 선택적으로, (b) 완충제를 함유하는 제2 용기, 및 (c) 키트의 사용 방법을 사용자에게 설명하기 위해 키트와 결합된 설명서를 포함할 수 있다. 설명서는 팜플렛, 테이프, CD, VCD 또는 DVD 형태일 수 있다.

5. 본 hMSC 또는 그의 분화된 자손의 용도

상기 기재된 본 방법에 의해 생성된 미분화된 hMSC 또는 그의 분화된 자손의 집단은 자가 이식에 의해 유리한 효과가 달성되는 많은 질환 및/또는 장애를 치료 및/또는 예방하기 위해 자가 이식에 사용될 수 있다.

따라서, 본 개시의 또 다른 측면은 본 방법에 의해 생성된 hMSC 또는 그의 분화된 자손의 집단의 유효량을 대상에게 수 일 내지 수 주 범위에 이르는 기간 동안 투여하는, 대상에서 질환 및/또는 장애를 치료하는 방법에 관한 것이다.

MSC는 다양한 세포 계통으로 분화될 수 있다. 분화는, 원하는 표현형, 예를 들어, 조골 세포, 지방 세포 등을 갖는 세포를 풍부하게 하는 성장 환경에서 MSC를 배양함으로써 달성할 수 있다. 배양은 특정 계통으로의 분화를 증대시키는 작용제를 포함할 수 있다. 본 개시의 한 실시양태에 따라, hMSC 집단은 연골 세포로 분화되며, 여기서 세포는 덱사메타손, 아스코르브산, 인슐린, 트랜스페린 및 셀레노우스산을 함유하는 배지에서 합류될 때까지 배양된다 (Williams et al. (2003) Tissue Engineering. 9(4), 679 참조). 분화된 연골 세포는 알칼리성 포스파스타제를 염색함으로써 확인된다. 본 개시의 다른 실시양태에 따라, hMSC 집단은 상업적 연골 발생 배지에서 배양시킴으로써 연골로 분화된다. 분화된 연골은 알시안 블루로 프로테오글리칸을 염색하여 확인된다. 본 개시의 추가 실시양태에 따라, hMSC 집단은 지방 세포로 분화된다. 지방 발생 분화를 유도하기 위해, hMSC는 하이드로코르티손 및 인도메타신을 함유하는 지방 발생 배지로 처리되고; 대안적으로 또는 추가적으로, StemCell Technologies Inc (Vancouver, CA)로부터 입수 가능한 것과 같은 임의의 상업적 MSC 지방 발생 자극 보충제가 사용될 수 있다. 지방 발생 분화는 오일-레드 염색으로 확인된다.

본 개시의 실시양태에 따라, hMSC 또는 그의 분화된 자손의 집단은 골 또는 연골 질환, 신경퇴행성 질환, 심장 질환, 간 질환, 암, 자가면역 질환, 이식편대 숙주 질환 (GvHD), 및 상처 치유 및 조직 재생으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 및/또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.

본 방법에 의해 생성된 hMSC 또는 그의 분화된 자손의 집단을 사용하는 치료에 적합한 골 결함은 골형성부전증, 골절, 선천성 골 결함 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

본 방법에 의해 생성된 hMSC 또는 그의 분화된 자손의 집단은 또한 관절 치환 및/또는 치아 임플란트와 같은 정형 외과 및 다른 (예를 들어, 치과) 보철 장치를 위한 골수 및 결합 조직 지지를 제공하기 위해 대상에 이식될 수 있다.

MSC는 연골로 분화될 수 있기 때문에, 본 방법에 의해 생성된 hMSC 또는 그의 분화된 자손의 집단은 골관절염, 류마티스 관절염, 염증성 관절염, 연골연화증, 무혈관성 괴사, 외상성 관절염 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 관절 상태를 치료하는데 적합하다.

본 방법에 의해 생성된 hMSC 집단은 또한 CNS 장애를 치료하는데 사용될 수도 있다. CNS 장애의 예로는 통증 장애, 운동 장애, 해리 장애, 기분 장애, 정서 장애, 신경퇴행성 질환 및 경련성 장애가 포함되나, 이에 제한되지는 않는다. 이러한 장애의 보다 구체적인 예는 파킨슨병, 근 위축성 측삭 경화증 (ALS), 다발성 경화증, 헌팅턴병, 자가면역 뇌척수염, 당뇨병성 신경병증, 녹내장성 신경병증, 황반변성, 활동 진전 및 지발성 안면 마비, 공황, 불안 우울증, 알코올 중독, 불면증, 조증 행동, 알츠하이머병 및 간질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

MSC는 조혈 줄기 세포 및 면역 세포와 상호작용하고, 동종이형 조혈 생착을 증대시키고 이식편대 숙주 질환 (GvHD)을 예방하기 위한 잠재적인 세포 요법을 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서, 본 방법에 의해 생성된 hMSC 집단은 또한 GvHD를 치료하는 데에도 사용될 수 있다.

본 방법에 의해 생성된 hMSC 또는 그의 분화된 자손의 집단은 또한 조직 재생을 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 hMSC의 이식은 자가면역 질환, 염증성 질환, 급성 및 만성 허혈성 상태, 조직 공학, 새로운 조직 재생 및 자연 치유 이환 또는 손상 기관을 치료하는데 유용하다.

MSC가 경색된 심장에 도입되는 경우, 이는 유해한 리모델링을 방지하고 회복을 개선할 수 있는 것으로 알려져 있다. MSC는 경색 부위로 직접 주사되거나, 또는 정맥 내로 투여되어 부상 부위로 가는 것으로 나타났다. 따라서, 본 hMSC 또는 그의 분화된 자손의 집단은 또한 심장 질환, 특히 심근경색의 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 hMSC 또는 그의 분화된 자손의 집단에 의해 치료될 수 있는 암의 예는 유방암, 뇌종양, 흑색종, 폐암, 림프종, 신경상피종, 신장암, 전립선암, 위암, 결장암, 직장암, 췌장암 및 자궁암을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 암은 전이성이다.

hMSC 또는 그의 분화된 자손의 집단은 다양한 이식 접근법을 사용하여 치료 개체에게 투여될 수 있으며, 상기 접근법의 특성은 이식 부위에 따른다. 세포는 조직의 손상되거나 건강한 부위에 이식될 수 있다. hMSC가 건강한 부위에 투여되는 경우, 이는 손상 부위로 이동할 것이다.

hMSC 또는 그의 분화된 자손의 집단은 기관으로의 직접 주사, 혈류로의 주사, 복강 내 주사, 림프 기관으로의 직접 주사에 의해 이식될 수 있다. 적합한 이식 방법은 이식된 세포의 원하는 기관으로의 호밍 (homing) 및 생착, 원하는 기관 특이적 마커의 발현, 및 대상의 유래 기관의 기능을 모니터링함으로써 결정될 수 있다.

hMSC 또는 그의 분화된 자손의 집단은 대상에서 원하는 치료 효과를 달성할 양으로 투여된다. 본 방법에 사용될 hMSC의 유효량은 처음에 생체 내 및/또는 시험관 내 세포 배양 분석으로부터 추정될 수 있다. 예를 들어, 용량은 바람직한 농도를 달성하기 위해 실험 동물에서 공식화될 수 있으며, 이러한 정보는 이후 인간 용량을 보다 정확하게 결정하기 위해 사용된다. 투여량은 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 투여량 및 투여 경로는 환자의 상태 및 병력을 고려하여 주치의가 결정할 수 있다.

치료될 상태에 따라, 본 hMSC의 유효량은 단일 용량 또는 다중 투여량일 수 있으며, 치료 과정은 수 일 내지 수 주 동안 지속되거나, 또는 치유가 효과적이거나 질환 증상이 감소될 때까지 지속될 수 있다.

본 개시의 추가 목적, 장점 및 특징은 제한하고자 하지 않는 하기 실시예를 검토시에 당업자에게 명백할 것이다.

실시예

재료 및 방법

표면 항원 분석

0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 배양 플레이트로부터 세포를 분리하였다. 세포를 1% BSA를 함유하는 PBS 용액으로 세척하고, 플루오레세인 이소티오시아나이드 (FITC) 또는 피코에리트린 (PE) 접합 항체로 4 ℃에서 30 분 동안 염색하였다. MSC 마커: 항-CD29 (인테그린 β1 쇄), 항-CD105 (SH2, 엔도글린 CD73(+) 및 조혈 줄기 세포 마커: 항-CD34 (음성 대조군); 및 백혈구 마커: 항-CD45 (백혈구 공통 항원) 이어서, 세포를 PBS로 세척하고, FACS 캘리버 유세포 분석기 (FACSCanto, BD Biosciences, Becton, Dickinson and Company, San Jose, CA)를 사용하여 분석하였다. 이 세포를 여기 광원으로서 488 nm 아르곤 레이저 빔을 사용하여 최대 1,000 세포/초의 속도로 통과시켰다. FITC 및 PE-접합된 이소타입 제어 항체로 염색된 세포를 사용하여 배경 형광을 계산하였다.

STEMPRO 골 발생 분화 키트 (Gibco)를 사용하여 골 세포로의 hMSC의 분화, STEMPRO 지방 발생 분화 키트 (Gibco) 및 연골 발생 배지 (Gibco)를 사용하여 지방 세포 및 연골 세포로의 hMSC의 분화를 유도하였다. 이어서, 이들 세포를 95% 공기 및 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 37 ℃로 유지하였다. 14 일의 기간 동안 2 내지 5 일마다 배지를 교체하였다. 분화된 연골을 표준 절차에 따라 알시안 블루 염색으로 평가하였다. 분화된 지방 세포는 표준 절차에 따라 오일-레드-O로 염색하여 평가하였다.

실시예 1: 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC)의 생성 및 배양

15 명의 인간 대상자가 본 연구에 사전 서면 동의하에 포함되었다. 이들을 연령에 따라 50-60 세, 70-80 세 또는 20-30 세의 각 그룹에 각 그룹 당 5 명의 대상자씩 배정하였다. 각 대상자로부터 혈액 (10 mL)을 채취하여 헤파린을 함유한 튜브에 수집한 후, 0.5 mL의 글리세린 (100 mg/mL)을 첨가하고, 글리세린 함유 혈액을 37 ℃의 인큐베이터에서 6 시간 동안 보관하였다. 이어서, 글리세린 함유 혈액을 3,500 rpm의 속도로 18 분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후, 튜브의 중간층에 있는 세포를 추출하고, PBS 용액 (8 mL)에 재현탁시켰다. 세포 현탁액을 18×g의 속도로 13 분 동안 다시 원심분리하고, 상등액을 버린 후, 튜브의 중간층에 있는 세포를 추출하여 케라틴세포-SFM 500 mL, 소 뇌하수체 추출물 2.5 mL, 13% 인간의 신선한 냉동 혈장 (FFP), 30% 소 태아 혈청, 15 mL의 글리세린 (100 mg/mL) 및 표피 성장 인자 (EGF, 2.5 ㎍)로 이루어진 10 mL thermo-life 배지를 함유하는 배양 플레이트 (표면적 약 10 ㎠)에 시딩하였다. 이어서, 세포 시딩 배양 플레이트를 16-18 시간 동안 37 ℃, 70% RH (상대 습도), 5% CO₂의 조건에서 인큐베이터에 두었다. 이어, 세포를 수확하고 상기 기재된 바와 같이 10 mL thermo-life 배지를 함유하는 다른 배양 플레이트 (표면적 약 175 ㎠)에 시딩하였다. 3 일마다 배지를 교체하고, 배지 교체를 적어도 1 회 반복하였다. 중간엽 줄기 세포가 5 일째에 나타나기 시작하여 마침내 약 7 일에 합류에 도달하였다. 이렇게 수득된 hMSC를 단리하여 추가 사용시까지 동결 온도에서 보관하였다.

또한, hMSC는 고령 대상자, 예를 들어 70 내지 80 세 대상자의 말초 혈액으로부터 시험관 내에서 성공적으로 수득되고 확장될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

실시예 2: 실시예 1의 hMSC의 특성화

2.1 세포 표면 항원 분석

실시예 1의 접착성 세포를 트립신/EDTA를 사용하여 단리하고 "재료 및 방법"에 기재된 절차에 따라 유세포 분석기에서 표면 항원 분석을 실시하였다. 결과는 도 1에 도시되어 있다.

실시예 1의 세포는 CD73 (데이터 미도시), CD90 (도 1A) 및 CD 105 (도 1B) 세포 표면 마커에 대해 양성이고, CD34 (도 1C), CD45 (데이터 미도시) 및 HLA-DR (데이터 미도시)에 대해서는 음성이었으며; 이들은 실제로 중간엽 줄기 세포인 것으로 확인되었다.

2.2 실시예 1의 hMSC의 분화

본 실시예에서는, 실시예 1의 hMSC가 여전히 분화 능력을 보유한다는 것을 입증하기 위해, 이들을 hMSC의 후속 분화를 유발하는 작용제를 각각 함유하는 배지에서 배양하였다. 실시예 1의 hMSC로부터 분화된 연골 세포, 연골 및 지방 세포는 각각 알칼리 포스파타제 (도 2A), 알시안 블루 (도 2B) 및 오일 레드 O (도 2C)로 표준 절차에 따라 염색함으로써 확인되었다.

상기 실시양태들에 대한 설명은 단지 예로서 주어진 것이고 다양한 변형이 당업자에 의해 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 상기 명세서, 실시예 및 데이터는 본 발명의 예시적인 실시양태의 구조 및 사용에 대한 완전한 설명을 제공한다. 본 발명의 다양한 실시양태가 어느 정도 특정하게, 또는 하나 이상의 개별 실시양태를 참조하여 위에서 설명되었지만, 당업자라면 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 개시된 실시양태를 상당히 변경시킬 수 있을 것이다.

Claims (15)

1. 미분화된 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC)의 집단을 제공하는 방법으로서,
   (a) 인간 대상으로부터 말초 혈액을 수득하는 단계;
   (b) 단계 (a)에서의 말초 혈액에 글리세린을 첨가하는 단계;
   (c) 단계 (b)의 말초 혈액에서 다른 체세포의 줄기 세포에 대해 hMSC를 분리하는 단계; 및
   (d) 단계 (c)의 분리된 hMSC를 글리세린 함유 배지에서 배양하여 hMSC 집단을 생성하는 단계;를 포함하고,
   상기 배지는 과립구 콜로니 자극 인자 (G-CSF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어떤 작용제도 함유하지 않는,
   미분화된 인간 중간엽 줄기 세포 (hMSC)의 집단을 제공하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 단계 (a)에서, 말초 혈액이 어떤 용혈제도 함유하지 않는 튜브에서 수집되는, 방법.
3. 제1항에 있어서, 단계 (b)에서, 글리세린이 말초 혈액에 약 1 내지 10 mg/mL의 농도로 존재하는, 방법.
4. 제1항에 있어서, 단계 (d)에서, 배지가 적어도 20% (v/v) 혈청을 포함하고, 글리세린은 배지에 약 0.1 내지 1.0 mg/mL의 농도로 존재하며, hMSC는 37 ℃에서 적어도 16 시간 동안 글리세린 함유 배지를 포함하는 배양 플레이트에서 배양되는, 방법.
5. 제4항에 있어서,
   (e) 배양된 hMSC를 단계 (d)에서의 것보다 표면적이 적어도 20 배 더 큰 다른 배양 플레이트로 옮기고, 미분화된 hMSC 집단을 생성하기 위해 글리세린 함유 배지에서 배양을 계속하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
6. 제5항에 있어서, 단계 (e)에서, hMSC가 미분화된 hMSC의 집단을 생성하기 위해 적어도 4 일 동안 배양되는, 방법.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 생성된 미분화된 hMSC의 집단이 CD34-, CD45-, 및 HLA-DR 세포 표면 마커에 대해 음성이고, CD73+, CD90+, 및 CD 105+ 세포 표면 마커에 대해 양성인, 방법.
8. 제5항 또는 제6항의 방법에 따라 생성된 실질적으로 순수한 hMSC 집단을 포함하는 클론 세포주.
9. 치료를 필요로 하는 대상의 질환 또는 장애의 치료를 위한, 미분화된 hMSC 또는 그의 분화된 자손의 집단의 용도로서, 여기서 미분화된 hMSC의 집단은 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성되고, 미분화된 hMSC 또는 그의 분화된 자손의 집단이 질환 또는 장애의 치료를 위해 대상에게 투여되는, 용도.
10. 제9항에 있어서, 미분화된 hMSC 집단이 연골 세포, 연골 또는 지방 세포로 분화될 수 있는, 용도.
11. 제9항에 있어서, 질환 또는 장애가 골 또는 연골 질환, 신경퇴행성 질환, 심장 질환, 간 질환, 암, 자가면역 질환, 이식편대 숙주 질환 (GvHD) 및 상처 치유 및 조직 재생으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 용도.
12. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 미분화된 hMSC 집단의 유효량을 질환 또는 장애를 치료하기 위해 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상의 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
13. 제12항에 있어서, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생성된 미분화된 hMSC 집단이 실질적으로 순수한 hMSC 집단인, 방법.
14. 제13항에 있어서, 미분화된 hMSC 집단이 연골 세포, 연골 또는 지방 세포로 분화될 수 있는 방법.
15. 제12항에 있어서, 질환 또는 장애가 골 또는 연골 질환, 신경퇴행성 질환, 심장 질환, 간 질환, 암, 자가면역 질환, 이식편대 숙주 질환 (GvHD) 및 상처 치유 및 조직 재생으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.

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