TW202319536A - 用於治療慢性腎病之間葉幹細胞 - Google Patents

Abstract

本發明係關於間葉幹細胞(MSC)或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其用於治療貓科動物及犬科動物之慢性腎病。本發明亦關於一種包含衍生自周邊血液之MSC之醫藥組合物。

Description

用於治療慢性腎病之間葉幹細胞

本發明係關於用於治療犬科動物及貓科動物之慢性腎病之間葉幹細胞。

慢性腎病(CKD)為隨著時間的推移腎功能的持續喪失。其係影響年歲較大的貓及狗之最常見的病況之一，但其在任何年齡之動物中均可見。健康的腎執行許多重要功能，最值得注意的是過濾血液及製造尿液以排泄廢物，維持體內流體平衡，產生某些激素以及調節電解質。在CKD中，所有此等調節過程皆可能會受到干擾，且因此可能會導致動物的各種健康問題。

患有CKD之動物可能會經歷血流中廢物及其他化合物之堆積，該等廢物及其他化合物通常由腎去除或調節。此積聚可能會使動物感覺到生病且呈現嗜睡、蓬頭垢面及體重減輕。動物亦可能會喪失適當地濃縮其尿液之能力，且因此其排尿體積可能較大且飲用更多的水以進行補償。其尿液中重要蛋白質及維生素之損失可能會造成異常代謝及食慾不振。其亦可能會經歷血壓升高(高血壓)，此可能會影響包括眼睛、腦及心臟之許多重要系統之功能。患有CKD之貓及狗之嗜睡之另一病因為其血液中酸之堆積。其受影響之腎可能不會適當地排泄此等化合物，從而使得動物易於出現血液酸化或酸中毒，血液酸化或酸中毒係可能會顯著地影響體內各種器官系統之功能的病況。CKD亦可能會使動物產生紅血球之能力減弱，此可能會導致貧血，亦即其血液中之紅血球濃度降低。此可能會使其齒齦呈現為淡粉色，或在嚴重情況下，略帶白色，且可能會使其嗜睡。

目前，對CKD還沒有確定的治癒方法，然而，一些治療可改善且延長此等罹患CKD之動物的生命。療法一般旨在使血流中毒性廢物之堆積減至最少，維持足夠的水分，解決電解質濃度紊亂，支持適當營養，控制血壓，及減緩腎病發展。

膳食改良為CKD治療之重要且已證實的態樣。然而，許多貓及狗難以接受治療性膳食，因此主人必須有耐心且致力於堅持計劃。患有CKD之貓或狗之貧血可藉由用刺激紅血球產生之紅血球生成素(或用相關化合物)進行之替代療法加以治療。在一些情況下，可能需要輸血，此可用於使用獲自供體動物之血液來恢復正常紅血球濃度。

迄今為止，尚未鑑別到終止疾病發展或修復受影響腎之已知治療方法。正在研究間葉幹細胞(MSC)作為人及動物之CKD治療方法，此係由於MSC能夠調節發炎反應且介導細胞-細胞相互作用以促進組織修復。若干貓科動物及犬科動物研究已研究MSC在治療中之安全性及功效且顯示引起關注的結果。

此等研究中之大部分使用衍生自脂肪組織或骨髓(BM)之自體MSC，該等自體MSC係藉由經由腎動脈進行關節內注射來投與。然而，用於治療之自體MSC之產生要求自各個別患者侵入性收取MSC，接著耗時培養此等貓科動物或犬科動物MSC，已知該等MSC具有相對低的培養能力。另外，關節內注射為侵入性程序，該程序要求鎮靜、經驗及靶向診斷。因此，已提議靜脈內投與(IV)。然而，嚙齒動物模型顯示，大部分靜脈內投與之幹細胞被困在肺部，此係因為肺毛細管係注射後第一個接受細胞的地方。MSC之此「首渡效應(first-pass effect)」加上歸巢能力將其吸引至體內各種發炎部位，可使腎所接受之MSC總數減少。經IV投與之MSC治療之貓雖然已證實細胞療法之安全性，但未顯示腎功能改善。因此，研究方向已自IV投與再次轉向將基質血管部分(SVF)中之間葉幹細胞(MSC)動脈內遞送至患有CKD之貓之腎(Thomson, Abigail L等人, 2019)。

因此，此項技術中仍需要改良MSC之使用以減緩貓科及犬科慢性腎病之疾病惡化及/或甚至逆轉病理病況。本發明之目標在於解決前述缺點中之至少一者。

本發明及其實施例用以提供針對上文所提及之缺點中之一或多者的解決方案。為此目的，本發明係關於如技術方案1之間葉幹細胞(MSC)或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其用於治療貓科動物及犬科動物之慢性腎病(CKD)。

在實施例中，該等MSC係靜脈內投與的。在實施例中，該等MSC係原生MSC。在實施例中，所投與之該等MSC係異種MSC。用於本發明之MSC之較佳實施例示於技術方案2至18中之任一者中。在如技術方案17之尤其較佳實施例中，在該治療中，經診斷患有或罹患慢性腎病之貓科動物及犬科動物之肌酸酐含量與未經該等MSC或該組合物治療之貓科動物或犬科動物相比降低。

在第二態樣中，本發明係關於如技術方案19之包含原生、周邊血液衍生之MSC之醫藥組合物，該等MSC為動物衍生的且存在於無菌液體中。

靜脈內投與為非侵入性程序且不需要鎮靜。該等侵入性程序及/或鎮靜可能會涉及風險，尤其對於已處於罹患慢性腎病之較高風險下之年歲較大的患者。因此，經由靜脈內(IV)注射進行之MSC全身投與在療法應用中提供實質效益。

本發明係關於用於治療貓科動物及犬科動物之慢性腎病(CKD)之原生MSC，其中該等MSC可藉由靜脈內注射來投與。靜脈內注射為非侵入性程序且不需要鎮靜。該等侵入性程序及/或鎮靜可能會涉及風險，尤其對於已處於罹患慢性腎病之較高風險下之年歲較大的哺乳動物患者。因此，經由靜脈內(IV)注射進行之MSC全身投與在療法應用中提供實質效益。

定義除非另外定義，否則包括技術及科學術語之用於揭示本發明之所有術語皆具有如本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解之含義。藉助於進一步導引，將術語定義包括在內以更好地瞭解本發明之教示內容。

如本文所使用之以下術語具有以下含義：

除非上下文另外清楚地指示，否則如本文所使用之「一(a/an)」及「該」係指單數個提及物及複數個提及物。舉例而言，「一腔室(a compartment)」係指一個或超過一個腔室。

如本文所使用之「約」係指諸如參數、量、時距及其類似者之可量測值，意圖涵蓋規定值之+/- 20%或更低、較佳+/- 10%或更低、更佳+/- 5%或更低、甚至更佳+/- 1%或更低且仍更佳+/- 0.1%或更低及相對於規定值之變化，到目前為止，該等變化適合於在本發明中執行。然而，應理解，修飾語「約」所指之值自身亦為特定揭示的。

如本文所使用之「包含(comprise/comprising/comprises/comprised of)」與「包括(including/includes)」或「含有(contain/containing/contains)」同義且為包括性或開放式術語，其規定例如組分跟隨者之存在且不排除或妨礙此項技術中已知或其中揭示之額外非敍述組分、特點、要素、成員、步驟之存在。

此外，除非規定，否則本說明書及申請專利範圍中之術語第一、第二、第三及其類似術語用於區分類似要素且未必描述連續或時間次序。應理解，如此使用之術語在適當情況下可互換，且本文所描述之本發明之實施例能夠以本文所描述或說明之順序以外的順序操作。

以端點敍述數值範圍包括含於該範圍內之所有數值及分數以及所敍述之端點。

鑒於術語「一或多個」或「至少一個」，諸如一組成員中之一或多個成員或至少一個成員，藉助於進一步例證說明而使得本身為清楚的，該術語尤其涵蓋對以下之提及：該等成員中之任一者或該等成員中之任何兩者或更多者，諸如該等成員中之任何≥3、≥4、≥5、≥6或≥7個等，及至多所有該等成員。

除非另外定義，否則包括技術及科學術語之用於揭示本發明之所有術語皆具有如本發明所屬領域之一般熟習此項技術者通常所理解之含義。藉助於進一步導引，將本說明書中所使用之術語之定義包括在內以更好地瞭解本發明之教示內容。本文所使用之術語或定義係僅提供用於輔助理解本發明。

本說明書通篇提及「一個實施例(one embodiment)」或「一實施例(an embodiment)」意謂結合實施例描述之特定特點、結構或特徵包括於本發明之至少一個實施例中。因此，片語「在一個實施例中」或「在一實施例中」出現在本說明書通篇各處未必全部指代同一實施例，但可全部指代同一實施例。此外，如熟習此項技術者將自本發明顯而易見，在一或多個實施例中，特定特點、結構或特徵可以任何適合方式組合。此外，如熟習此項技術者所理解，當本文所描述之一些實施例包括一些而非其他包括於其他實施例中之特點時，不同實施例之特點組合意圖在本發明之範疇內且形成不同實施例。舉例而言，在隨附申請專利範圍中，所主張之實施例中之任一者可以任何組合形式使用。

術語「間葉幹細胞」、「MSC」或「間葉基質細胞」係指表現特定集合之表面抗原且可當活體外培養時或當活體內存在時分化成包括但不限於脂肪細胞、軟骨細胞及骨細胞之各種細胞類型的富潛能、自身更新細胞。

術語「分離(isolated)」係指自細胞培養物或如血液之生物樣本物理上鑑別及分離細胞，此可藉由應用適當的細胞生物學技術來執行，該等技術係基於對應於準則之細胞培養物檢驗及細胞表徵(及當可能及需要時之物理分離)，或基於根據抗原之存在/不存在及/或細胞大小的細胞自動化分選(諸如利用FACS)。在一些實施例中，術語「分離(isolating/isolation)」可包含物理上分離及/或定量細胞，尤其藉由進行流動式細胞測量術之另一步驟。

如本文所使用之術語「活體外」指示在身體之外或外部。如本文所使用之術語「活體外」應理解為包括「離體」。術語「離體」通常指組織或細胞自身體移除且維持或在身體之外，例如在培養容器或生物反應器中繁殖。

術語「繼代(passage/passaging)」在此項技術中常見且係指經培養(間葉幹)細胞自培養受質及彼此剝離及解離。為簡單起見，在貼壁培養條件下首次生長細胞之後執行之繼代一般稱為「第一代」(或第1代，P1代)。細胞可繼代至少一次且較佳兩次或更多次。在第1代之後的各代係以數值加1提及，例如第2代、第3代、第4代、第5代或P1、P2、P3、P4、P5等。

術語「細胞培養基(cell medium/cell culture medium)」或「培養基(medium)」係指包含可用於維持細胞或使細胞生長之營養物的水性液體或膠狀物質。細胞培養基可含血清或不含血清。細胞培養基可包含或補充有生長因子。

如本文所使用之術語「生長因子(growth factor)」係指單獨或當藉由其他物質調節時影響各種細胞類型之增殖、生長、分化、存活及/或遷移且可影響生物體之發育、形態及功能變化的生物活性物質。生長因子通常可藉由以配位體形式結合至存在於細胞中之受體(例如表面或胞內受體)而起作用。

「自體(autologous)」投與MSC在本上下文中係指將來自供體之MSC投與接受者，其中接受者及供體係相同的。

「異體(allogeneic)」投與MSC在本上下文中係指將來自供體之MSC投與接受者，其中接受者及供體屬於相同物種，但不相同。

「異種(xenogeneic)」投與MSC在本上下文中係指將來自供體之MSC投與接受者，其中接受者及供體係來自不同物種。

「原生MSC (native MSC)」在本發明之上下文中係指尚未暴露於諸如發炎介質之刺激環境的MSC。如本文所使用之「發炎環境(inflammatory environment)」或「發炎病況(inflammatory condition)」係指特徵在於以下之狀態或病況：(i)至少一種促炎性免疫細胞、促炎性細胞介素或促炎性趨化因子增多；及(ii)至少一種抗炎性免疫細胞、抗炎性細胞介素或抗炎性趨化因子減少。

術語「抗炎性(anti-inflammatory)」、「抗炎(anti-inflammation)」、「免疫抑制性(immunosuppressive)」及「免疫抑制劑(immunosuppressant)」係指特徵在於局部發炎之至少一種適應症(諸如但不限於發熱、疼痛、腫脹、發紅及功能喪失)減輕之任何狀態或病況及/或特徵在於(i)至少一種促炎性免疫細胞、促炎性細胞介素或促炎性趨化因子減少及(ii)至少一種抗炎性免疫細胞、抗炎性細胞介素或抗炎性趨化因子增多之全身狀態變化。

本發明之「群體倍增時間(population doubling time)」或「PDT」係藉由下式計算：PDT = T/(ln(N _f/N _i)/ln(2))，其中T為達到80%匯合度之細胞培養時間(以天為單位)，N _f為細胞剝離後之最終細胞數目且其中N _i為零時間點之初始細胞數目。

術語「抗凝劑」意謂可抑制血液凝固之組合物。用於本發明中之抗凝劑之實例包括EDTA或肝素。

在本發明中，術語「膚色血球層(buffy coat)」應理解為較佳藉助於密度梯度離心獲得之未凝固血液之溶離份，其中該溶離份富含白血球及血小板。

術語「血液中間相(blood-inter-phase)」應理解為較佳藉助於密度梯度而獲得、位於主要由紅血球及多形核細胞組成之底部溶離份與主要由血漿組成之上部溶離份之間的血液之溶離份。血液中間相為包含單核球、淋巴球及MSC之血液單核細胞(BMC)之來源。

如本文所使用之術語「懸浮直徑(suspension diameter)」理解為當處於懸浮液中時細胞之平均直徑。量測直徑之方法為此項技術中已知的。可能方法為流動式細胞測量術、共焦顯微術、影像細胞儀或此項技術中已知之其他方法。

術語「治療有效量(therapeutically effective amount)」為化合物或組合物有效減輕疾病症狀或改善疾病病況之最低量或濃度。

術語「治療(treatment)」係指用於減輕病理病況或病症、或防止罹患病理病況或病症、或防止病理病況或病症惡化之治療性、防治性或預防性措施。

「慢性腎病」(CKD)為一種經數月至數年時段腎功能逐步喪失之腎病。慢性腎病(CRD)、慢性腎衰竭(CRF)及慢性腎機能不全係指相同病況。對於諸如貓或狗之動物，CKD之典型視覺徵象可包括嗜睡、體重減輕、排尿體積較大及飲用更多的水以進行補償，此係歸因於適當地濃縮其尿液之能力喪失、食慾不振、影響眼睛、腦及/或心臟之高血壓(elevated blood pressure/hypertension)及/或因紅血球減少(貧血)所致之蒼白齒齦。

在診斷CDK之後，可進行CDK分段以促進適當治療及患者監測。「IRIS (國際腎利益協會)階段」最初基於在補水穩定患者中在至少兩個時刻評估之空腹血液肌酸酐濃度來確定。在第1階段，患者具有正常血液肌酸酐含量，且在最終第4階段，患者具有增加之全身性臨床徵象及尿中毒危象之風險(參見表1)。

術語「患者(patient)」、「受試者(subject)」、「動物(animal)」或「哺乳動物(mammal)」可互換使用且係指待治療之哺乳動物受試者。較佳地，哺乳動物為貓科動物或犬科動物，諸如貓或狗。

本發明中之「貓科動物(feline/felines)」係指貓科中之貓。此科中之成員亦稱為貓類。將活貓科劃分為兩個亞科：豹亞科(Pantherinae)及貓亞科(Felinae)。豹亞科包括五個豹物種及兩個雲豹物種，而貓亞科包括十個屬中之其他34個物種，尤其包括家貓、獵豹、藪貓、猞猁及美洲獅。

本發明中之「犬科動物(canine/canines)」係指犬科中之類狗食肉目。此科中之成員稱為犬類。犬科內存在三個亞科，亦即滅絕的恐犬亞科(Borophaginae)及黃昏犬亞科(Hesperocyoninae)以及尚存的犬亞科(Caninae)。犬亞科稱為犬科動物，且包括家狗、狼、狐狸、郊狼、胡狼以及其他尚存的物種及滅絕的物種。

「混合淋巴球反應(Mixed Lymphocyte Reaction；MLR)」分析傳統上用於研究外部試劑是否刺激或抑制T細胞增殖。可藉由使用MLR分析研究MSC之免疫調節特性。對於此MLR分析，反應者T細胞經螢光染料標記，當其暴露於特定光頻率時會發出綠光。隨後，此等反應者T細胞經植物促分裂原刀豆球蛋白A (ConA)刺激以誘導或刺激增殖。ConA為抗原非依賴性促分裂原且可用作替代性T細胞刺激物。此凝集素常常用作T細胞刺激實驗中之抗原呈現細胞之替代物。刀豆球蛋白A不可逆地結合至細胞表面上之醣蛋白且提交T細胞進行增殖。此係用於刺激轉錄因子及細胞介素產生之快速方式。當T細胞開始分裂時，染料分佈於其子細胞上，因此染料在每一細胞分裂之情況下連續稀釋。因此，T細胞增殖量可藉由察看顏色減退來量測。因此，為了研究MSC之免疫調節特性，將此等MSC添加至經刺激之反應者T細胞中且共同培育若干天。包括適當的陽性對照及陰性對照以查看是否成功地執行測試。在培育期結束時，使用流動式細胞測量術來量測T細胞增殖量，從而使得能夠查看MSC是否抑制T細胞增殖。

描述在第一態樣中，本發明係關於間葉幹細胞(MSC)或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其用於治療貓科動物及犬科動物之慢性腎病(CKD)，或用作用於治療貓科動物及犬科動物之CKD之方法，或用於製備用以治療貓科動物及犬科動物之CKD的藥劑，其中該等MSC較佳為原生的且較佳靜脈內投與。

由於MSC有免疫調節特性，因此提議其用於治療發炎相關疾病。此等免疫調節特性可抑制尤其慢性腎病之擴大發炎過程，且減緩其短期內惡化。先前(貓科動物)研究已研究MSC在慢性腎病治療中之安全性及功效且顯示引起極大關注的結果。此等動物研究中之大部分使用衍生自脂肪組織或骨髓(BM)之自體MSC，該等自體MSC係藉由經由腎動脈進行關節內注射來投與。然而，用於治療之自體MSC之產生要求自各個別患者侵入性收取MSC，接著耗時培養此等貓科動物或犬科動物MSC，已知該等MSC具有相對低的培養能力。另外，關節內注射為侵入性程序，該程序要求鎮靜、經驗及靶向診斷。

因此，MSC之全身投與可有利地經由靜脈內(IV)投與，例如經由注射或輸注來達成，其在療法應用中提供實質效益。然而，如上文所闡述，嚙齒動物模型顯示，大部分靜脈內投與之幹細胞被困在肺部，此係因為肺毛細管係注射後第一個接受細胞的地方。MSC之此「首渡效應」加上歸巢能力將其吸引至體內各種發炎部位，可使腎所接受之MSC總數減少。在先前研究中，經IV投與之MSC治療之貓不顯示腎功能改善。因此，研究方向已自IV投與再次轉向將基質血管部分(SVF)中之間葉幹細胞(MSC)侵入性動脈內遞送至患有CKD之貓之腎(Thomson, Abigail L等人, 2019)。

該貓科動物可為貓科、較佳貓亞科中之任何貓，更佳為家貓(domestic cat) (家貓( Felis catus))。該犬科動物可為犬科、較佳犬亞科中之任何類狗食肉目，更佳為家狗(domestic dog) (家犬( Canis familiaris))。

在一實施例中，所使用之該等MSC為原生的。該等原生MSC首先不活體外暴露於諸如發炎介質或發炎環境之刺激劑。該發炎環境係指特徵在於以下之狀態或病況：(i)至少一種促炎性免疫細胞、促炎性細胞介素或促炎性趨化因子增多；及(ii)至少一種抗炎性免疫細胞、抗炎性細胞介素或抗炎性趨化因子減少。使用原生MSC為有利的選項，此係因為其允許在最少製造及操作之情況下產生即用型產品，藉此降低生產成本。

較佳地，MSC具有在10 µm與100 μm之間、更佳在15 µm與80 µm之間、更佳在20 µm與75 μm之間、更佳在25 µm與50 μm之間的細胞大小。在一實施例中，用於本發明之MSC係藉助於過濾器系統選擇大小，其中使用40 μm過濾器使細胞經歷雙重過濾步驟。雙重或多重過濾步驟係較佳的。後者提供高單細胞群體且避免細胞聚集體之存在。該等細胞聚集體可在藉由冷凍保存細胞期間造成細胞死亡且可全部對細胞之另外下游應用具有影響。舉例而言，當靜脈內投與細胞聚集體時，其可能會有較高的出現毛細管栓塞之風險。

用於本發明之MSC可源自各種組織或體液，特定言之，源自血液、骨髓、脂肪組織或羊膜組織。已報導自骨髓收取MSC與出血、慢性疼痛、神經血管損傷及甚至死亡相關。作為MSC來源之脂肪組織視為安全選項。然而，自脂肪組織收取MSC仍要求在供體動物中進行切開，因此，此仍為侵入性程序。衍生自血液之MSC與衍生自骨髓及脂肪組織之MSC顯示類似形態。因此，較佳地，MSC源自血液，包括但不限於臍帶血及周邊血液。更佳地，MSC源自周邊血液。血液不僅為非侵入性且無痛的來源，且亦具有收集簡單性及安全性，且因此可易於獲得。MSC或包含MSC之血液可源自所有哺乳動物，包括但不限於人類、家養動物及農場動物、動物園動物、運動型動物、寵物動物、伴生動物及實驗動物，諸如小鼠、大鼠、兔、狗、貓、母牛、馬、豬及例如猴及猿之靈長類動物；尤其馬、人類、貓、狗、嚙齒動物等。在一實施例中，該來源為馬。特定言之，MSC可衍生自周邊血液，較佳馬周邊血液，此允許每年以對供體動物最低程度的不適或發病率多次收集MSC。

在一些情況下，使用異體或異種MSC為更有利的選項，此係因為其向健康且高品質幹細胞供體提供嚴格選擇。其允許產生即用型產品，從而避免自各個別患者侵入性收取及耗時性培養MSC。由於貓科動物及犬科動物MSC之培養物容量與例如馬或人類MSC相比相對低，因此使用異種(例如人類或馬) MSC相比異體貓科動物或犬科動物MSC較佳，尤其用於商業應用，諸如用於治療貓科動物及犬科動物之CKD。

因此，在一特定實施例中，本發明之MSC可用於異體或異種投與受試者。如已指示，異體或異種用法允許更好地控制MSC之品質，此係因為可篩檢不同供體，且可選擇最佳供體。鑒於製備功能性MSC，後者為必不可少的。此與使用自體MSC時相反，如在此情況下，較難以確保細胞品質。儘管如此，自體用法亦可具有其效益。在一種情況下，分離血液MSC，此時所使用之血液來自後來亦成為該經分離MSC之接受者的供體。在另一情況下，使用來自供體之血液，其中供體較佳與自供體血液分離之MSC之接受者屬於相同科、性別或人種。特定言之，將針對常見的當前可傳染疾病或病變對此等供體進行測試，以避免經由幹細胞水平傳染此等病變或疾病之風險。較佳地，供體/供體動物保持隔離。當使用馬供體時，可例如針對以下病變、病毒或寄生蟲對其進行測試：馬感染性貧血(EIA)、馬鼻肺炎(EHV-1、EHV-4)、馬病毒性動脈炎(EVA)、西尼羅河病毒(West Nile virus；WNV)、非洲馬疫(African horse Sickness；AHS)、馬媾疫(錐蟲)、馬梨形蟲病、鼻疽(馬鼻疽(malleus)、鼻疽)、馬流感、萊姆疏螺旋體病(Lyme borreliosis；LB) (伯氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi)、萊姆病(Lyme disease))。

在一實施例中，用於本發明之MSC之特徵在於出現以下中之一或多者之存在表徵/經量測之以下中之一或多者呈陽性：標記物CD29、CD44、CD90、CD105、波形蛋白、纖維連接蛋白、Ki67、CK18或其任何組合。在另一實施例中，用於本發明之MSC可藉由間葉標記物CD29、CD44及CD90之存在表徵。藉助於後者，可分析所獲得MSC之純度，且可測定MSC之百分比。

CD29為由整合素β 1基因編碼之細胞表面受體，其中受體與其他蛋白質形成複合物以在配位體結合後調節生理活性。CD44抗原為參與細胞-細胞相互作用、細胞黏附及遷移之細胞表面醣蛋白。另外，CD44為玻糖醛酸之受體且亦可與諸如骨橋蛋白、膠原蛋白及基質金屬蛋白酶(MMP)之其他配位體相互作用。CD90抗原為視為如MSC之幹細胞之標記物的保守細胞表面蛋白。對CD29/CD44/CD90呈三陽性之本發明之MSC使得熟習此項技術者能夠快速且明確地選擇MSC且提供對另外下游應用有益之MSC生物特性。

在一實施例中，用於本發明之MSC之特徵在於不存在以下/量測之以下呈陰性：II類主要組織相容複合體(MHC)分子，較佳為所有當前已知的II類MHC分子，從而將細胞分類為可用於諸如貓科動物及犬科動物細胞療法之哺乳動物細胞療法中的細胞。即使當MSC部分分化時，MSC對II類MHC分子仍呈陰性。可使用流動式細胞測量術對MHC II分子之存在或不存在執行偵測及對MHC II分子之表現執行定量。

在另一實施例中，MSC量測之作為造血細胞之標記物之CD45抗原呈陰性。

在一實施例中，MSC量測之II類MHC分子及CD45均呈陰性。

在一尤其較佳實施例中，用於本發明之MSC量測之間葉標記物CD29、CD44及CD90呈陽性且量測之II類MHC分子及CD45呈陰性。

一般而言，MSC在其表面上表現I類MHC抗原。在一特定實施例中，用於本發明之MSC具有低含量或不可偵測含量之I類MHC標記物。在一最佳實施例中，該等MSC量測之II類MHC標記物呈陰性且具有低含量或不可偵測含量之I類MHC標記物，其中該細胞展現極低免疫原性表現型。出於本發明起見，該低含量應理解為小於所有表現該MHC I或MHC II之細胞之25%，更佳小於15%。可使用流動式細胞測量術對MHC I及MHC II分子之存在或不存在執行偵測及對MHC I及MHC II分子之表現執行定量。

MSC之此等免疫特性限制接受者免疫系統在細胞移植之後辨識及排斥細胞、較佳異體或異種細胞之能力。MSC產生的因子會調節免疫反應連同其在局部刺激下會分化成適當細胞類型之能力，使其成為細胞療法所需之幹細胞。

在一實施例中，當用於本發明之MSC存在於發炎環境或條件中時，會分泌免疫調節性前列腺素E2細胞介素。

發炎環境或條件之特徵在於募集血液之免疫細胞。發炎介質包括前列腺素、諸如IL-1β、TNF-α、IL-6及IL-15之發炎性細胞介素、諸如IL-8之趨化因子及如TNF-α、IFN-γ之其他發炎性蛋白質。此等介質主要由單核球、巨噬細胞、T細胞、B細胞產生以在發炎部位處募集白血球，且隨後刺激具有刺激性及抑制性相互作用之複雜網狀物，以同時破壞組織且使該組織自發炎過程中治癒。

前列腺素E2 (PgE2)為前列腺素家族之亞型。PgE2由經由連續酶反應自膜磷脂釋放之二十碳四烯酸(AA)合成。稱為前列腺素-內過氧化酶合成酶之環氧合酶-2 (COX-2)將AA轉化成前列腺素H2 (PgH2)，且PgE2合成酶將PgH2異構化成PgE2。作為速率限制酶，COX-2因應包括生長因子、發炎性細胞介素及腫瘤啟動子刺激之生理條件控制PgE2合成。

在一特定實施例中，存在於發炎環境中之該等MSC以範圍在10 ³皮克/毫升至10 ⁶皮克/毫升之間的濃度分泌可溶性免疫因子前列腺素E2 (PgE2)，從而誘導或刺激經MSC調節之免疫抑制。

MSC以彼等特定濃度範圍分泌之PgE2在活體外刺激了抗炎過程且連同其分化成適當細胞類型之能力一起成為細胞移植所需之MSC。

在一較佳實施例中，用於本發明之MSC量測為： -   對間葉標記物CD29、CD44及CD90呈陽性； -   對由波形蛋白、纖維連接蛋白、Ki67或其組合組成之群中所包含之一或多種標記物呈陽性； -   對II類MHC分子呈陰性； -   對造血標記物CD45呈陰性，及 -   較佳地具有低含量或不可偵測含量之I類MHC分子，其中該低含量應理解為小於所有表現MHC I之細胞之25%，更佳小於15%。

在一最佳實施例中，用於本發明之MSC量測為： -   對間葉標記物CD29、CD44及CD90呈陽性； -   對由波形蛋白、纖維連接蛋白、Ki67或其組合組成之群中所包含之一或多種標記物呈陽性； -   對II類MHC分子呈陰性； -   對造血標記物CD45呈陰性；及 -   較佳地具有低含量或不可偵測含量之I類MHC分子，其中該低含量應理解為小於所有表現MHC I之細胞之25%，更佳小於15%， 其中當該細胞存在於發炎環境或條件中時，其以範圍在10 ³皮克/毫升至10 ⁶皮克/毫升之間的濃度分泌免疫調節性PgE2細胞介素。

在另一實施例中，當用於本發明之MSC存在於發炎環境或條件中時且與具有相同特徵，但未接受該發炎環境或條件之MSC相比具有增加之選自IL-6、IL-10、TGF-β、NO或其組合中之至少一種分子的分泌及減少之IL-1之分泌。

在一較佳實施例中，當MSC存在於發炎環境或條件中時具有增加之選自IL-6、IL-10、TGF-β、NO或其組合中之至少一種分子的分泌及減少之IL-1之分泌。可與具有如上文呈現之相同特徵，但未接受該發炎環境或條件之間葉幹細胞進行比較。

較佳地，MSC具有增加之PgE2以及上文所提及之因子中之兩者或更多者的分泌。

PgE2、IL-6、IL-10、TGF-B及NO幫助抑制如T細胞及B細胞之主要免疫細胞群體的增殖及功能。另外，MSC表現低含量之I類MHC分子及/或對其表面上之II類MHC分子呈陰性，從而逃脫免疫原性反應。另外，當前MSC可藉由其增加之上文所提及之因子之分泌來抑制白血球增殖，再次幫助避免宿主之免疫原性反應。

在另一實施例中，MSC在存在外周血液單核細胞(PBMC)之情況下刺激PgE2、IL-6、IL-10、NO或其組合之分泌及/或抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1、IL-13或其組合之分泌。在另一實施例中，MSC在存在PBMC之情況下抑制TGF-β1之分泌。

在發炎環境中，MSC分泌多種調節宿主免疫反應之因子。另外，MSC具有刺激作用以誘導或刺激一或多種選自由PgE2、IL-6、IL-10、NO或其組合組成之群之因子的分泌。緊接於MSC在發炎環境中對PBMC之刺激作用，MSC亦對PBMC之分泌具有抑制作用，從而引起一或多種選自由TNF-α、IFN-γ、IL-1、TGF-β1、IL-13或其組合組成之群之因子減少。MSC在發炎環境中具有調節作用，從而使其可用於治療所有類別之疾病，尤其免疫系統病症。

一般而言，文獻中公佈之用於鑑別及表徵用於特定細胞類型(例如間葉、肝、造血、上皮、內皮標記物)或具有特定定位(例如胞內、在細胞表面上或經分泌)之細胞標記物的任何技術可視為適合於表徵MSC。該等技術可分組成兩類：允許在分析期間維持細胞完整性之技術及基於使用該等細胞產生之提取物(包含蛋白質、核酸、膜等)之技術。在用於鑑別該等標記物且量測其為陽性或陰性之技術中，細胞培養基之免疫細胞化學或分析係較佳的，此係因為此等技術即使在低量細胞之情況下亦允許進行標記物偵測而不對其造成破壞(在西方墨點法或流動式細胞測量術之情況下將如此)。

MSC之免疫調節特性可使用MLR分析來分析。對於此MLR分析，反應者T細胞經螢光染料標記，當其暴露於特定光頻率時會發出綠光。隨後，此等反應者T細胞經植物促分裂原刀豆球蛋白A(ConA)刺激以誘導或刺激增殖。當T細胞開始分裂時，染料分佈於其子細胞上，因此染料在每一細胞分裂之情況下連續稀釋。因此，T細胞增殖量可藉由察看顏色減退來量測。因此，為了研究MSC之免疫調節特性，將此等MSC添加至經刺激之反應者T細胞中且共同培育若干天。包括適當的陽性對照及陰性對照以查看是否成功地執行測試。在培育期結束時，使用流動式細胞測量術來量測T細胞增殖量，從而使得吾等能夠查看MSC是否抑制T細胞增殖。

MSC之相關生物特點可藉由使用諸如以下之技術來鑑別：流動式細胞測量術、免疫細胞化學、質譜法、凝膠電泳、免疫分析(例如免疫墨點法、西方墨點法、免疫沈澱、ELISA)、核酸擴增(例如即時RT-PCR)、酶活性、體學技術(蛋白質體學、脂質體學、醣體學、轉譯體學、轉錄體學、代謝體學)及/或其他生物活性。

本發明之MSC可藉由此項技術中已知之任何標準方案衍生。在一實施例中，該等MSC可經由其中自血液或血液相分離MSC且其中在基礎培養基、較佳低葡萄糖培養基中培養且擴增該等細胞之方法來獲得。

如此項技術中已知之基礎培養基調配物包括但不限於伊格爾氏(Eagle's)最低必需培養基(MEM)、杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium；DMEM)、α改良最低必需培養基(α-MEM)、必需基礎培養基(BME)、伊斯科夫氏改良杜爾貝科氏培養基(Iscove's Modified Dulbecco's Medium；IMDM)、BGJb培養基、F-12營養物混合物(漢姆(Ham))、李博維茲(Liebovitz) L-15、DMEM/F-12、必需改良伊格爾氏培養基(EMEM)、RPMI-1640、培養基199、威茅斯氏(Waymouth's) 10 MB 752/1或威廉姆斯培養基E (Williams Medium E)及改良培養基及/或其組合。以上基礎培養基之組成一般在此項技術中已知且熟習此項技術者可在其技能範圍內，視所培養細胞之需要修改或調節培養基及/或培養基補充物之濃度。較佳基礎培養基調配物可為市售基礎培養基調配物中之一者，諸如DMEM，據報導其維持MSC之活體外培養，且包括生長因子之混合物，供其等適當生長、增殖、維持所需標記物及/或生物活性、或長期儲存。

該等基礎培養基調配物含有本身已知之哺乳動物細胞發育所需之成分。藉助於說明而非限制，此等成分可包括無機鹽(特定言之，含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P及可能地Cu、Fe、Se及Zn之鹽)、生理緩衝液(例如HEPES、碳酸氫鹽)、核苷酸、核苷及/或核酸鹼、核糖、去氧核糖、胺基酸、維生素、抗氧化劑(例如麩胱甘肽)及碳來源(例如葡萄糖；丙酮酸鹽，例如丙酮酸鈉；乙酸鹽，例如乙酸鈉)等。亦將顯而易見，許多培養基可以具有或不具有丙酮酸鈉之低葡萄糖調配物形式獲得。

用於自血液或血液相分離MSC且培養且擴增該等細胞之方法係此項技術中已知及例如WO2014053418或WO2014053420中所描述。

在一實施例中，該用於自血液或血液相分離MSC且在低葡萄糖培養基中培養且擴增該等細胞之方法可包含以下步驟： a) 在經抗凝劑塗佈之樣本小瓶中自供體收集一或多個血液樣本； b)將血液樣本離心以獲得由血漿相、膚色血球層及紅血球相組成之3相分佈； c) 收集膚色血球層且將其裝載於密度梯度上； d)收集自步驟c)之密度梯度獲得之血液中間相； e) 藉由離心自血液中間相分離MSC； f) 以在2.5 × 10 ⁵個MSC/cm ²與5 × 10 ⁵個MSC/cm ²之間在培養物中接種且將其保持在補充有地塞米松(dexamethasone)、抗生素及血清之低葡萄糖生長培養基中。

在一實施例中，可將抗凝劑補充至MSC中。非限制性實例為EDTA或肝素。

接種次數對於最終獲得呈可接受濃度之純且活的MSC群體為關鍵的，此係因為過於密集接種將會在擴增期間導致大規模細胞死亡及產生不均勻的MSC群體，而過於分散接種將會導致極少或無MSC群落形成，以使得擴增不可能或幾乎不可能，或其將花費過多時間。在兩種情況下，細胞活力將受到負面影響。

在本發明之一較佳實施例中，MSC具有高細胞活力，其中該等細胞之至少90%、更佳至少95%、最佳100%為活的。

血液中間相為包含單核球、淋巴球及MSC之血液單核細胞(BMC)之來源。較佳地，在37℃下洗掉淋巴球，而在不存在保持單核球存活所需之細胞介素之情況下單核球在2週內死亡。以此方式純化MSC。自血液中間相分離MSC較佳藉助於將血液中間相離心，之後用諸如磷酸鹽緩衝液之適合的緩衝液洗滌細胞集結粒至少一次來進行。

在另一實施例中，本發明之MSC對單核球及巨噬細胞呈陰性，兩者均在0%與7.5%之間的範圍內。

特定言之，間葉細胞在生長培養基中保持至少2週。較佳地，使用具有1%地塞米松之生長培養基，此係因為MSC之特定特徵保持於該培養基中。

在最少2週(14天)、較佳3週(21天)時段之後，MSC群落將在培養瓶中變得可見。在後續步驟g)中，出於擴增MSC之目的，將至少6 × 10 ³個幹細胞/cm ²轉移至含有低葡萄糖、血清及抗生素之擴增培養基中。較佳地，MSC之擴增將在最少五個細胞繼代中發生。以此方式可獲得充足細胞。較佳地，細胞在70%至80%匯合度下分裂。MSC可在培養物中維持高達50個繼代。此後，出現活力損失、衰老或突變形成之風險。

在另一實施例中，在擴增MSC期間各繼代之間的群體倍增時間(PDT)應在胰蛋白酶處理之後0.7天與3天之間。在擴增MSC期間各繼代之間的該PDT較佳在胰蛋白酶處理之後0.7天與2.5天之間。

在一較佳實施例中，用於本發明之MSC具有軸狀形態。本發明之MSC之形態表徵將細胞分類為延長型、纖維母細胞樣、軸狀細胞。此類型之細胞為不同形式之具有大部分顯露類三角形或星形細胞形狀之小的自身更新型細胞的其他MSC群體及具有含突出核之大的立方形或扁平化圖案之MSC群體。具有此特定形態特徵以及生物標記物之MSC之選擇使得熟習此項技術者能夠分離本發明之MSC。細胞之形態分析可易於由熟習此項技術者使用相差顯微鏡執行。此外，可使用流動式細胞測量術或熟習此項技術者已知之其他技術中的正向及側面散射圖評估MSC之大小及粒度。

在另一較佳實施例中，MSC具有在10 μm與100 μm之間的懸浮直徑。用於本發明之MSC已基於大小/懸浮直徑進行選擇。較佳地，MSC具有在10 µm與100 μm之間、更佳在15 µm與80 µm之間、更佳在20 µm與75 μm之間、更佳在25 µm與50 μm之間的細胞大小。較佳地，基於細胞大小之細胞之選擇係藉由過濾步驟進行。舉例而言，細胞濃度範圍在10 ³至10 ⁷個MSC/毫升之間的MSC係藉助於過濾器系統來選擇大小，其中該等細胞較佳稀釋於低葡萄糖DMEM培養基中，其中使用40 μm過濾器使細胞經歷雙重過濾步驟。雙重或多重過濾步驟係較佳的。後者提供高單細胞群體且避免細胞聚集體之存在。該等細胞聚集體可在藉由冷凍保存細胞期間造成細胞死亡且可全部對細胞之另外下游應用具有影響。舉例而言，當靜脈內投與細胞聚集體時，其可能會有較高的出現毛細管栓塞之風險。

在一實施例中，在該組合物中MSC之該治療有效量係在10 ⁵-10 ⁷個MSC之間。

在一較佳實施例中，用於本發明之MSC經調配用於藉助於靜脈內注射或輸注在個體中投與。

在一實施例中，向貓科動物或犬科動物患者投與治療有效量之MSC，較佳地投與每患者10 ⁵-10 ⁷個MSC之劑量。在一實施例中，投與單次劑量。

對受試者產生治療效益之最小治療有效劑量為至少10 ⁵個MSC/次投與。較佳地，各投與係藉由靜脈內注射進行且包含在10 ⁵至5 × 10 ⁵個MSC/次投與之間，其中該等MSC較佳為原生及/或異種的。

在一實施例中，該等MSC投與至少兩次、至少三次、至少四次、至少五次，較佳以間隔投與。

在另一實施例中，治療進一步包含：多次投與，例如多次靜脈內投與10 ⁵-10 ⁷個MSC/貓科動物或犬科動物患者之劑量的MSC或包含MSC之組合物，其中在各種時間點投與該等多次劑量，該等時間點包括但不限於以下時間點中之一或多者：間隔1天、間隔2天、間隔3天、間隔4天、間隔5天、間隔6天、間隔7天(1週)、間隔2週、間隔3週、間隔4週、間隔5週、間隔6週、間隔7週、間隔8週、間隔3個月、間隔6個月、間隔9個月及/或間隔1年。較佳地，各劑量間隔至少2週、更佳間隔至少3週、甚至更佳間隔至少4週且最佳間隔至少6週投與。

在一實施例中，該組合物包含存在於無菌液體中之該等MSC。該無菌液體之非限制性實例為最低必需培養基(MEM)，諸如杜爾貝科氏改良伊格爾培養基(DMEM)。該無菌液體對於例如經由注射或輸注來靜脈內投與哺乳動物患者而言應為安全的。

作為非限制性實例，該無菌液體為諸如基礎培養基之最低必需培養基。如此項技術中已知之基礎培養基調配物包括但不限於伊格爾氏最低必需培養基(MEM)、杜爾貝科氏改良伊格爾氏培養基(DMEM)、α改良最低必需培養基(α-MEM)、必需基礎培養基(BME)、伊斯科夫氏改良杜爾貝科氏培養基(IMDM)、BGJb培養基、F-12營養物混合物(漢姆)、李博維茲L-15、DMEM/F-12、必需改良伊格爾氏培養基(EMEM)、RPMI-1640、培養基199、威茅斯氏10 MB 752/1或威廉姆斯培養基E及改良培養基及/或其組合。以上基礎培養基之組成一般在此項技術中已知且視所培養細胞之需要修改或調節培養基及/或培養基補充物之濃度係在熟習此項技術者之技能範圍內。較佳基礎培養基調配物可為市售基礎培養基調配物中之一者，諸如DMEM，據報導其維持MSC之活體外培養，且包括生長因子之混合物以用於其適當生長、增殖、所需標記物及/或生物活性之維持或長期儲存。

該等基礎培養基調配物含有本身已知之哺乳動物細胞發育所需之成分。藉助於說明而非限制，此等成分可包括無機鹽(特定言之，含有Na、K、Mg、Ca、Cl、P及可能地Cu、Fe、Se及Zn之鹽)、生理緩衝液(例如HEPES、碳酸氫鹽)、核苷酸、核苷及/或核酸鹼、核糖、去氧核糖、胺基酸、維生素、抗氧化劑(例如麩胱甘肽)及碳來源(例如葡萄糖；丙酮酸鹽，例如丙酮酸鈉；乙酸鹽，例如乙酸鈉)等。亦將顯而易見，許多培養基可以具有或不具有丙酮酸鈉之低葡萄糖調配物形式獲得。

較佳地，該組合物包含至少75%、更佳至少80%、甚至更佳至少85%、最佳至少90%單一細胞，且其中該等單一細胞具有在10 μm與100 μm之間、更佳在15 µm與80 µm之間、更佳在20 µm與75 μm之間、更佳在25 µm與50 μm之間的懸浮直徑。如先前所提及，細胞直徑以及其單一細胞性質對於任何下游應用，例如靜脈內投與，及細胞活力而言為關鍵的。

較佳地，該組合物包含至少90% MSC，更佳地，其將包含至少95% MSC、更佳至少99% MSC、最佳100% MSC。

呈包含MSC之無菌液體形式之組合物的體積及濃度較佳適於靜脈內注射。在一實施例中，醫藥組合物可以無菌液體形式投與動物，該無菌液體在最終調整之後包含呈10 ⁵-10 ⁷個細胞/毫升之濃度的MSC。

在一實施例中，在各靜脈內注射或輸注之情況下，投與治療有效量之MSC，較佳地，各注射或輸注包含10 ⁵至10 ⁷個該等MSC之劑量。

在一實施例中，醫藥組合物包含在10 ⁵-10 ⁷個MSC/毫升該組合物之間、較佳10 ⁵至10 ⁶個MSC/毫升該組合物、更佳10 ⁵-5×10 ⁵個MSC/毫升該組合物、最佳3×10 ⁵個MSC/毫升該組合物的治療有效量之MSC。

在一實施例中，該組合物之一個劑量具有約0.5 ml至5 ml、較佳約0.5 ml至5 ml、較佳約0.5 ml至3 ml、較佳約0.5 ml至2 ml、更佳約0.5 ml至1.5 ml、最佳約1 ml之體積。在另一實施例中，該組合物之一個劑量具有最大限度地約5 ml、較佳最大限度地約4 ml、更佳最大限度地約3 ml、更佳最大限度地約2 ml之體積，最佳地，該體積為約1 ml。此量適用於靜脈內投與。

該劑量可於小瓶或預填充注射器中調配。

在一實施例中，每次注射向患者投與之組合物之體積係根據患者體重來進行調適。在另一實施例中，投與10 ⁵-10 ⁷個MSC、較佳10 ⁵至10 ⁶個MSC、更佳10 ⁵- 5 × 10 ⁵個MSC、最佳3 × 10 ⁵個MSC/位患者之固定劑量。

本發明人已進一步發現，特別有效的治療係藉由包含至少兩個劑量之如上文在實施例中之任一者中所描述的所使用之MSC或所使用之醫藥組合物的給藥方案來達成。

因此，另一實施例係關於用於治療貓科動物及犬科動物之CKD之醫藥組合物，其中： -   該治療包含投與，較佳靜脈內投與第一量之該組合物之步驟，該第一量包含10 ⁵-10 ⁷個MSC/位患者之總劑量，且 -   該治療進一步包含投與，較佳靜脈內投與第二量之該組合物之步驟，該第二量包含10 ⁵-10 ⁷個MSC之第二總劑量，其中該等MSC較佳為原生及/或異種的，且 其中該第二劑量係在第一量之後1天、在第一量之後2天、在第一量之後3天、在第一量之後4天、在第一量之後5天、在第一量之後6天、在第一量之後7天(1週)、在第一量之後2週、在第一量之後3週、在第一量之後4週、在第一量之後5週、在第一量之後6週、在第一量之後7週、在第一量之後8週、在第一量之後3個月、在第一量之後6個月、9個月及/或在第一量之後1年投與。較佳地，各劑量係在第一量之後至少2週、更佳在第一量之後至少3週、甚至更佳在第一量之後至少4週且最佳在第一量之後至少6週投與。

在一實施例中，該第二劑量與該第一劑量相同。在另一實施例中，該第二劑量低於該第一劑量。在又另一實施例中，該第二劑量高於該第一劑量。

在一實施例中，第三、第四及/或甚至第五量之該組合物可投與，較佳靜脈內投與該患者，其中該第三、第四及/或第五量包含10 ⁵-10 ⁷個MSC之第三、第四及/或第五總劑量，其中該等MSC較佳為原生及/或異種的。

在一實施例中，第六或更多量之該組合物可投與，較佳靜脈內投與該患者，其中該第六或更多量包含10 ⁵-10 ⁷個MSC之第六或更多總劑量，其中該等MSC較佳為原生及/或異種的。

在診斷貓科動物及犬科動物之CDK之後，可進行CDK分段以促進適當治療及患者監測。IRIS階段最初基於在補水穩定患者中在至少兩個時刻評估之空腹血液肌酸酐濃度來確定。在第1階段，患者具有正常血液肌酸酐含量(對於貓＜ 1.6 mg肌酸酐/dl，對於狗＜ 1.4 mg肌酸酐/dl)，且在最終第4階段(＞ 5.0 mg肌酸酐/dl)，患者具有增加之全身性臨床徵象及尿中毒危象之風險。

因此，本發明亦關於如先前實施例中之任一者中所描述之所使用之MSC或包含有效量之MSC之醫藥組合物，其中經診斷患有或罹患慢性腎病之貓科動物及犬科動物之肌酸酐含量與未經該等MSC或該組合物治療之貓科動物或犬科動物相比降低。該等MSC或該組合物較佳靜脈內投與，且該等MSC較佳為原生及/或異種的。

在一實施例中，該等接受MSC或醫藥組合物之貓科動物或犬科動物之平均肌酸酐含量與未經該等MSC或該組合物治療之貓科動物或犬科動物之平均肌酸酐含量相比降低至少1%、較佳至少2%、較佳至少3%、較佳至少4%、較佳至少5%、較佳至少6%、較佳至少7%、較佳至少8%、較佳至少9%、較佳至少10%、較佳至少11%、較佳至少12%、較佳至少13%、較佳至少14%、較佳至少15%、較佳至少16%、較佳至少17%、較佳至少18%、較佳至少19%、較佳至少20%、較佳至少21%、較佳至少22%、較佳至少23%、較佳至少24%、較佳至少25%、較佳至少30%。

藉由向經診斷患有或罹患CDK之貓科動物及犬科動物投與MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，該等罹患CDK之患者的諸如肌酸酐含量增加之CDK之一或多種症狀與在向該等患者投與該等MSC或該包含MSC之醫藥組合物之前的該等症狀相比可減輕、緩解、改善及/或逆轉。

在一實施例中，該等貓科動物或犬科動物之平均肌酸酐含量與在投與該等MSC或該包含MSC之醫藥組合物之前的該等貓科動物或犬科動物之平均肌酸酐含量相比降低至少1%、較佳至少2%、較佳至少3%、較佳至少4%、較佳至少5%、較佳至少6%、較佳至少7%、較佳至少8%、較佳至少9%、較佳至少10%、較佳至少11%、較佳至少12%、較佳至少13%、較佳至少14%、較佳至少15%、較佳至少16%、較佳至少17%、較佳至少18%、較佳至少19%、較佳至少20%、較佳至少21%、較佳至少22%、較佳至少23%、較佳至少24%、較佳至少25%、較佳至少30%。

在一實施例中，藉由向經診斷患有或罹患CDK之貓科動物或犬科動物投與MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，該貓科動物或犬科動物之生活品質(QoL)與在投與該等MSC或該包含MSC之醫藥組合物之前的該貓科動物或犬科動物之生活品質相比有所改善。

該生活品質可例如藉助於線性類比量表，要求主人將其寵物之QoL按照1-10之等級分級來測定。當1為最佳生活品質且10為最差生活品質時，因此改善生活品質係指按照該等級獲得較低評分。當1為最差生活品質且10為最佳生活品質時，因此改善生活品質係指按照該等級獲得較高評分。

在一實施例中，該貓科動物或犬科動物之生活品質(QoL)係藉由線性類比量表來量測，且因此獲得之值與在投與該等MSC或該包含MSC之醫藥組合物之前的該貓科動物或犬科動物之值相比改善至少10%、較佳至少15%、較佳至少20%、較佳至少25%、較佳至少30%、較佳至少35%、較佳至少40%、較佳至少45%、較佳至少50%、較佳至少55%、較佳至少60%、較佳至少65%、較佳至少70%、較佳至少75%、較佳至少80%、較佳至少85%，諸如86%。「改善值」係指更佳生活品質。

該生活品質亦可藉由評分方案或問卷來計算。

在一實施例中，貓科動物之生活品質係藉助於Bijsmans等人之文章( Bijsmans ES, Jepson RE, Syme HM, Elliott J, Niessen SJ. Psychometric Validation of a General Health Quality of Life Tool for Cats Used to Compare Healthy Cats and Cats with Chronic Kidney Disease. J Vet Intern Med. 2016 年 1 月 -2 月 ;30(1):183-91. doi: 10.1111/jvim.13656. 電子版 2015 年 11 月 14 日 . PMID: 26567089 ； PMCID: PMC4913638.)中所論述之生活品質(QoL)工具來計算。簡言之，將問卷劃分成4個域：一般健康(GH)、進食(E)、行為(B)及管理(M)。各項目係根據其影響貓生命之頻率或嚴重性來進行評分，且包括所有問題之重要性等級以捕捉個別差異。頻率或嚴重性等級範圍為-3至+3，且重要性等級範圍為0至+3。在計算系列結束時，此得到平均加權評分，從而提供貓之生活品質之總體定量量度。

在一實施例中，犬科動物之生活品質係藉助於Lavan文章( Lavan RP. Development and validation of a survey for quality of life assessment by owners of healthy dogs. Vet J. 2013 年 9 月 ;197(3):578-82. doi: 10.1016/j.tvjl.2013.03.021. 電子版 2013 年 4 月 29 日 . PMID: 23639368.)中所論述之生活品質(QoL)問卷來計算。在一實施例中，犬科動物之生活品質係藉助於前述Lavan文章中所論述之生活品質(QoL)問卷之調適版來計算。

在一實施例中，該貓科動物或犬科動物之生活品質(QoL)係藉由評分方案來量測，且因此獲得之評分與在投與該等MSC或該包含MSC之醫藥組合物之前的該貓科動物或犬科動物之生活品質評分相比改善至少10%、較佳至少15%、較佳至少20%、較佳至少25%、較佳至少30%、較佳至少35%、較佳至少40%、較佳至少45%、較佳至少50%、較佳至少55%、較佳至少60%、較佳至少65%、較佳至少70%、較佳至少75%、較佳至少80%、較佳至少85%，諸如86%。「改善評分」係指更佳生活品質。

在一實施例中，該經診斷患有或罹患CDK之貓科動物之生活品質(QoL)係藉助於Bijsmans等人之文章中所論述之生活品質(QoL)工具來計算，且因此獲得之評分與在投與該等MSC或該包含MSC之醫藥組合物之前的該貓科動物之生活品質評分相比改善至少10%、較佳至少15%、較佳至少20%、較佳至少25%、較佳至少30%、較佳至少35%、較佳至少40%、較佳至少45%、較佳至少50%、較佳至少55%、較佳至少60%、較佳至少65%、較佳至少70%、較佳至少75%、較佳至少80%、較佳至少85%，諸如86%。「改善評分」係指更佳生活品質。

在一實施例中，藉由向經診斷患有或罹患CDK之貓科動物或犬科動物投與MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，該貓科動物或犬科動物之生活品質(QoL)與未經該等MSC或該組合物治療之貓科動物或犬科動物之生活品質相比有所改善。

在一實施例中，該等貓科動物或犬科動物之生活品質(QoL)係藉由線性類比量表(linear analog scale)來量測，且因此獲得之平均值與未經該等MSC或該組合物治療之該等貓科動物或犬科動物之平均值相比改善至少10%、較佳至少15%、較佳至少20%、較佳至少25%、較佳至少30%、較佳至少35%、較佳至少40%、較佳至少45%、較佳至少50%、較佳至少55%、較佳至少60%、較佳至少65%、較佳至少70%、較佳至少75%、較佳至少80%、較佳至少85%，諸如86%。

在一實施例中，該等貓科動物或犬科動物之生活品質(QoL)係藉由評分方案來量測，且因此獲得之平均評分與未經該等MSC或該組合物治療之該等貓科動物或犬科動物之平均生活品質評分相比改善至少10%、較佳至少15%、較佳至少20%、較佳至少25%、較佳至少30%、較佳至少35%、較佳至少40%、較佳至少45%、較佳至少50%、較佳至少55%、較佳至少60%、較佳至少65%、較佳至少70%、較佳至少75%、較佳至少80%、較佳至少85%，諸如86%。

在一實施例中，該等經診斷患有或罹患CDK之貓科動物之生活品質(QoL)係藉助於Bijsmans等人之文章中所論述之生活品質(QoL)工具來量測，且因此獲得之平均評分與未經該等MSC或該組合物治療之該等貓科動物之平均生活品質評分相比改善至少10%、較佳至少15%、較佳至少20%、較佳至少25%、較佳至少30%、較佳至少35%、較佳至少40%、較佳至少45%、較佳至少50%、較佳至少55%、較佳至少60%、較佳至少65%、較佳至少70%、較佳至少75%、較佳至少80%、較佳至少85%，諸如86%。

在最後一個態樣中，本發明係關於包含周邊血液衍生之MSC的特定醫藥組合物。該組合物包含原生周邊血液衍生之MSC，該等MSC為動物衍生的，較佳為哺乳動物衍生的，且以在10 ⁵-10 ⁷個MSC/毫升該組合物之間的濃度存在於無菌液體中，其中該組合物之一個劑量具有約0.5 ml至5 ml之體積，其中該等MSC量測之間葉標記物CD29、CD44及CD90呈陽性且量測之II類MHC分子及CD45呈陰性，且其中該等MSC具有在10 μm與100 μm之間的懸浮直徑。

在一實施例中，該醫藥組合物係靜脈內投與的。在一較佳實施例中，該等MSC為馬衍生的。

在一實施例中，該組合物之一個劑量具有約0.5 ml至5 ml、較佳約0.5 ml至5 ml、較佳約0.5 ml至3 ml、較佳約0.5 ml至2 ml、更佳約0.5 ml至1.5 ml、最佳約1 ml之體積。在另一實施例中，該組合物之一個劑量具有最大限度地約5 ml、較佳最大限度地約4 ml、更佳最大限度地約3 ml、更佳最大限度地約2 ml之體積，最佳地，該體積為約1 ml。此量適用於靜脈內投與。

在另一較佳實施例中，MSC具有在15 μm與80 μm之間、更佳在20 μm與75 μm之間、更佳在25 μm與50 μm之間的懸浮直徑。

一般技術者應瞭解，用於治療慢性腎病之MSC或醫藥組合物或用於其中經診斷患有或罹患慢性腎病之貓科動物及犬科動物之肌酸酐含量與未經如上文所描述之該等MSC或該組合物治療之貓科動物及犬科動物相比降低的MSC或醫藥組合物的態樣的要素在本發明之醫藥組合物的態樣中恢復。因此，本發明之所有態樣係相關的。如上文所描述之態樣中之一者中所描述的所有特點及優點可關於此等態樣中之任一者，即使其結合特定態樣進行描述。

用於本發明之MSC或包含MSC之醫藥組合物以及可能的如上文所描述之另外組分將較佳地經冷凍以便允許長時間儲存MSC或組合物。較佳地，MSC或組合物將在低且恆定的溫度，諸如低於-20℃之溫度下經冷凍。此等條件允許安全儲存MSC或組合物，且使得MSC能夠在儲存期間及解凍後保持其生物及形態特徵以及其高細胞活力。

在一更佳實施例中，用於本發明之MSC或包含MSC之醫藥組合物可在-80℃之最高溫度下，視情況在液氮中儲存至少6個月。MSC冷凍中之關鍵因素為低溫培養基，特定言之，包含DMSO之低溫培養基。DMSO防止在冷凍過程期間在培養基中形成冰晶體，但在高濃度下可能對細胞具有毒性。在一較佳實施例中，在低溫劑中，DMSO之濃度包含至多20%、更佳至多15%，更佳地，DMSO之濃度包含10%。低溫培養基進一步包含低葡萄糖培養基，諸如低葡萄糖DMEM (杜爾貝科氏改良伊格爾培養基)。

之後，用於本發明之MSC或醫藥組合物較佳在投與之前在約室溫之溫度下、較佳在20℃與37℃之間的溫度下、更佳在25℃與37℃之間的溫度下且以最大20分鐘、較佳最大10分鐘、更佳最大5分鐘之時間跨度進行解凍。

此外，MSC或組合物較佳在解凍之後的2分鐘內投與以便保護MSC之活力。

本發明藉由以下非限制性實例進一步描述，該等實例進一步說明本發明且其不意欲、其亦不解釋為限制本發明之範疇。

實例 現將參考以下實例進一步例示本發明。本發明絕不限於既定實例。

實例 1 ： 健康貓之混合淋巴球反應 (MLR) 設定 ：為了研究貓中ePB (馬周邊血液衍生的)-MSC之免疫調節特性，在三個時間點(T0、T1及T2)向十隻健康貓靜脈內(IV)注射1 ml體積之根據本發明之一實施例之包含於低葡萄糖及10% DMSO DMEM中之3×10 ⁵個ePB-MSC的組合物，其中各次注射間隔2週。十隻健康貓中有4隻雄性及6隻雌性，係不同品種，特定言之，歐洲短毛貓、歐洲長毛貓及緬因貓(Maine Coon)，其中平均年齡為6±4歲。

分離且培養 ePB-MSC根據先前所描述之方法，自靜脈血分離ePB-MSC，該靜脈血係自一隻供體馬之頸靜脈收集。如Broeckx等人2012所描述，在培養ePB-MSC之前，測試血清中是否存在多種可傳染疾病。隨後，在優良製造規範(GMP)認證之生產場所根據GMP指南培養幹細胞直至第5代(P)，且以活力、形態、細胞表面標記物之存在及群體倍增時間表徵。藉由使用流動式細胞測量術實現對特定細胞表面標記物之存在(分化簇CD29、CD44及CD90)及不存在(主要組織相容複合體(MHC) II及CD45)的評估，如先前所描述(Spaas等人，2013)。然而，詳細表現及分泌模式先前已描述於WO 2020/182935中。

使用錐蟲藍(trypan blue)評估細胞活力。之後，在低葡萄糖及10%二甲亞碸(DMSO)杜爾貝科氏改良伊格爾培養基(DMEM)中進一步培養細胞直至P10，進行胰蛋白酶處理且再懸浮，最終濃度為300.000個細胞/毫升。將ePB-MSC儲存於-80℃下之冷凍小瓶中直至進一步使用。根據好氧細菌、厭氧細菌、真菌、內毒素及黴漿菌之不存在測試最終產物之無菌性。

研究所有貓每天由護理人檢驗，且在第0天(T0)、第2週(T1)、第4週(T2)及第6週(T3)經歷由獸醫進行之由直腸溫度、心率、呼吸率、黏膜外觀及毛細管再充盈時間評估組成之全面體檢以及血液學及生物化學分析。

此外，在T0 (在投藥治療前)及T3 (在最後一次(第三次)治療後兩週)用來自各個別貓之新鮮周邊血液單核細胞(PBMC)執行改良混合淋巴球反應(MLR)。此分析研究ePB-MSC之免疫調節(經由經刺激PBMC)特性。為了刺激PBMC，將其與刀豆球蛋白A (ConA)共同培育。

在T0、T1及T2時，在一般體檢之後，向貓靜脈內(i.v.)注射3×10 ⁵個ePB-MSC。在手掌中解凍冷凍小瓶之後，檢查內容物之透明度及清晰度，且緊接著使用22G i.v.導管注射細胞懸浮液。

在MLR分析期間，藉由將此等細胞與經刀豆球蛋白A (ConA)刺激之貓科動物PBMC共同培育四天且評估貓科動物PBMC之增殖來研究ePB-MSC之免疫調節特性。未經刺激貓科動物PBMC或經刺激貓科動物PBMC分別用作陰性對照及陽性對照。因此，使用流動式細胞測量術，使用羧基螢光素丁二醯亞胺基酯7-胺基放線菌素D (CFSE-7-AAD)標記來評估PBMC增殖(%)。在治療之前及之後對所有貓執行此分析。

對此，在EDTA血液收集管中自各個別貓收集靜脈貓科動物血液，且用HBSS稀釋且在等量Percoll密度梯度上分層。在Percoll上離心之後，收集含有PBMC之中間相。洗滌PBMC 3次。接下來，使來自各貓之PBMC達到1×10 ⁶個細胞/毫升之濃度。隨後，用CFSE標記PBMC，每毫升PBMC細胞懸浮液使用1微升CFSE溶液。洗滌經CFSE標記之PBMC且再懸浮於MLR培養基(DMEM，補充有20% FBS、1% AB/AM (抗生素/抗黴劑)及1% BME (B-巰基乙醇) 100×)中，達到2×10 ⁶個PBMC/毫升之最終濃度。隨後，除陰性對照樣本以外，將ConA溶液添加至盤之所有孔中。最後，將指定貓之PBMC添加至相關孔中。在培育4天之後，將所有樣本轉移至FACS管中，離心且用7-AAD染色以用於流動式細胞測量術分析。

結果 ：在兩個時間點(T0及T3)，與相關陰性對照(T0：3.4±2.7%，T3: 4.9±1.3%)相比，與經刺激貓科動物PBMC共同培養之ePB-MSC之增殖(T0：12.6±10%，T3: 26.2±9.8%)顯著地較高(對應地，p值=0.05及0.008)。然而，共同培養物之增殖在基線時(79.7±4.7%) (p值=0.008)及在治療後(83.2±5.7%) (p值=0.008)顯著地低於陽性對照。與基線(12.6±10%)相比，在治療之後(26.2±9.8%)在ePB-MSC與經刺激貓科動物PBMC之共同培養物中可能未發現平均PBMC增殖的顯著差異(p值=0.017) (圖1)。

結論 ：當前研究之結果確認ePB-MSC對貓科動物PBMC之免疫調節特性。此指示異種ePB-MSC可用於治療貓。

實例 2 ： 在用 ePB-MSC 進行之治療之前及之後健康狗之混合淋巴球反應 (MLR) ： 設定 ：為了研究狗中ePB (馬周邊血液衍生的)-MSC之免疫調節特性，在三個時間點(T0、T1及T2)向十二隻健康狗靜脈內(IV)注射1 ml體積之根據本發明之一實施例之包含於低葡萄糖及10% DMSO DMEM中之3×10 ⁵個ePB-MSC的組合物，其中各次注射間隔2週。

如上文實例1中所描述執行ePB-MSC之分離及培養。

研究所有狗每天由護理人檢驗且在第0天(T0)、第2週(T1)、第4週(T2)及第6週(T3)經歷由獸醫進行之由直腸溫度、心率、呼吸率、黏膜外觀及毛細管再充盈時間評估組成之全面體檢以及血液學及生物化學分析。

此外，在T0 (在投藥治療前)及T3 (在最後一次(第三次)治療後兩週)用來自各個別狗之新鮮周邊血液單核細胞(PBMC)執行改良混合淋巴球反應(MLR)。此分析研究ePB-MSC之免疫調節(經由經刺激PBMC)特性。為了刺激PBMC，將其與刀豆球蛋白A (ConA)共同培育。

在T0、T1及T2時，在一般體檢之後，向貓靜脈內(i.v.)注射3×10 ⁵個ePB-MSC。在手掌中解凍冷凍小瓶之後，檢查內容物之透明度及清晰度，且緊接著使用22G i.v.導管注射細胞懸浮液。

在MLR分析期間，藉由將此等細胞與經刀豆球蛋白A (ConA)刺激之犬科動物PBMC共同培育四天且評估犬科動物PBMC之增殖來研究ePB-MSC之免疫調節特性。未經刺激犬科動物PBMC或經刺激犬科動物PBMC分別用作陰性對照及陽性對照。因此，使用流動式細胞測量術，使用羧基螢光素丁二醯亞胺基酯7-胺基放線菌素D (CFSE-7-AAD)標記來評估PBMC增殖(%)。在治療之前及之後對所有狗執行此分析。

對此，在EDTA血液收集管中自各個別狗收集靜脈犬科動物血液，且用HBSS稀釋且在等量Percoll密度梯度上分層。在Percoll上離心之後，收集含有PBMC之中間相。洗滌PBMC 3次。接下來，使來自各狗之PBMC達到1×10 ⁶個細胞/毫升之濃度。隨後，用CFSE標記PBMC，每毫升PBMC細胞懸浮液使用1微升CFSE溶液。洗滌經CFSE標記之PBMC且再懸浮於MLR培養基(DMEM，補充有20% FBS、1% AB/AM (抗生素/抗黴劑)及1% BME (B-巰基乙醇) 100×)中，達到2×10 ⁶個PBMC/毫升之最終濃度。隨後，除陰性對照樣本以外，將ConA溶液添加至盤之所有孔中。最後，將指定狗之PBMC添加至相關孔中。在培育4天之後，將所有樣本轉移至FACS管中，離心且用7-AAD染色以用於流動式細胞測量術分析。

結果 ：在兩個時間點(T0及T3)，與相關陰性對照相比，與經刺激犬科動物PBMC共同培養之ePB-MSC之增殖顯著地較高。然而，在基線時及在治療之後，共同培養物之增殖顯著地低於陽性對照。與基線相比，在治療之後在ePB-MSC與經刺激犬科動物PBMC之共同培養物中可能未發現平均PBMC增殖之顯著差異。

結論 ：當前研究之結果確認ePB-MSC對犬科動物PBMC之免疫調節特性。此指示異種ePB-MSC可用於治療狗。

實例 3 ： ePB-MSC 在貓科動物慢性腎病中之安全性及功效 設定 ：向13歲罹患慢性腎病(CKD)之貓靜脈內(IV)注射1 ml於低葡萄糖及10% DMSO DMEM中之3×10 ⁵個本發明之ePB-MSC。貓每天由護理人檢驗且在第0天、第7天、第14天、第21天及第3個月經歷由獸醫進行之全面體檢。在研究開始之後4個月獸醫藉由電話聯繫貓之護理人以對動物進行隨訪。在第0天，基於血液肌酸酐濃度確定IRIS (國際腎利益協會)階段(參見表1) (在「處於風險下」至作為末期之第4階段範圍內)。 表1：貓及狗之慢性腎病之IRIS階段

階段	血液肌酸酐(mg/dl)
貓	狗
1	＜ 1.6	＜ 1.4	正常血液肌酸酐。存在一些其他腎異常(諸如尿液濃縮能力不充分且無可鑑別的非腎、異常腎觸診或腎成像發現、腎來源之蛋白尿、異常腎生檢結果、連續收集之樣本中血液肌酸酐濃度增加)。
2	1.6 - 2.8	1.4 - 2.8	正常或輕度增加之肌酸酐、輕度腎氮質血症(範圍下端處於許多實驗室之肌酸酐之參考範圍內，但作為篩選試驗之肌酸酐濃度不敏感性意謂肌酸酐值接近參考上限之患者常常患有排泄障礙)。
3	2.9 - 5.0	2.9 - 5.0	中度腎氮質血症。可存在許多腎外徵象，但其程度及嚴重性可變化。若不存在徵象，則病例可視為早期第3階段，而許多或明顯全身性徵象之存在可證明分類為後期第3階段。
4	＞ 5.0	＞ 5.0	增加之全身性臨床徵象及尿中毒危象之風險。

結果 ：在第0天確定出貓之IRIS階段為2。在研究3個月之後在貓中見到血液肌酸酐濃度降低，從而產生IRIS第1階段。在第一次注射之後4個月，貓之生活品質與研究之前相比有所改善且其體重已增益10%。

結論 ：臨床病例研究表明，向貓靜脈內注射ePB-MSC引起生活品質評分及體重顯著地改善，此指示ePB-MSC係用於貓之慢性腎病治療之有前景的解決方案。

實例 4 ： ePB-MSC 在犬科動物慢性腎病中之安全性及功效 設定 ：向罹患慢性腎病(CKD)之狗靜脈內(IV)注射1 ml於低葡萄糖及10% DMSO DMEM中之3×10 ⁵個本發明之ePB-MSC。狗每天由護理人檢驗且在第0天、第7天、第14天、第21天及第3個月經歷由獸醫進行之全面體檢。在研究開始之後4個月獸醫藉由電話聯繫狗之護理人以對動物進行隨訪。在第0天，基於血液肌酸酐濃度確定IRIS階段(在「處於風險下」至作為末期之第4階段範圍內)。

結果 ：在第0天確定出狗之IRIS階段為2。在研究3個月之後在狗中見到血液肌酸酐濃度降低，從而產生IRIS第1階段。在第一次注射之後4個月，狗之生活品質與研究之前相比有所改善且其體重有所增益。

結論 ：臨床病例研究表明，向狗靜脈內注射ePB-MSC引起生活品質評分及體重顯著地改善，此指示ePB-MSC係用於狗之慢性腎病治療之有前景的解決方案。

實例 5 ： 健康貓中 ePB-MSC 之 生物分佈 設定 ：此為用於評估在靜脈內(IV)注射之後健康貓中馬周邊血液衍生之間葉幹細胞(ePB-MSC)之生物分佈的先導研究。向三隻貓(至少10月齡，2隻雄性及1隻雌性)注射在此實例中進一步稱為研究獸醫產品(IVP)之經 ^99mTc標記之ePB-MSC (在低葡萄糖DMEM培養基中)及對照產品(CP，低葡萄糖DMEM培養基)。向三隻健康貓靜脈內注射(T1：第0天，及T3：第14天) CP (溶解於DMEM中之新鮮溶離之 ^99mTc，T1)及經 ^99mTc標記之ePB-MSC (T3)兩者。使用雙頭伽馬攝影機主觀評估整個身體中之CP及ePB-MSC分佈。第一次獲取係在注射放射性化合物之後一小時內開始。接下來，在安慰劑對照及經標記ePB-MSC投與之後6 h及24 h執行一次全身掃描。

結果 ：用IVP (= ePB-MSC)靜脈內治療所有三隻貓且控制其之不良事件。在注射IVP之後在動物中未觀測到嚴重不良事件、未觀測到疑似不良藥物反應且未觀測到異常臨床徵象。

CP靜脈內注射引起游離99mTc在心臟、肺、胃、膀胱、甲狀腺及唾液腺中積聚。在一隻貓中，亦觀測到肝中之吸收增加，且對於另一貓，在腸中量測到放射性積聚。在胃中見到最高吸收。

IVP (ePB-MSC)靜脈內注射引起肺、肝、腎及膀胱中之放射性藥物吸收增加(圖2，箭頭標記腎之位置)。

結論 ：IV注射之後的ePB-MSC生物分佈主要在肺中觀測到且存在於肝及腎中。此等結果解決在靜脈內注射之後ePB-MSC至貓腎之天然導向行為，且進一步支持其用於治療貓科動物慢性腎病。

實例 6 ： 健康狗中 ePB-MSC 之 生物分佈 設定 ：此為用於評估在靜脈內(IV)注射之後健康狗中馬周邊血液衍生之間葉幹細胞(ePB-MSC)之生物分佈的先導研究。向四隻狗(至少10月齡，2隻雄性及2隻雌性)注射在此實例中進一步稱為研究獸醫產品(IVP)之經 ^99mTc標記之ePB-MSC (在低葡萄糖培養基及10% DMSO DMEM中)及對照產品(CP，低葡萄糖培養基及10% DMSO DMEM)。向四隻健康狗靜脈內注射(T1：第0天，及T2：第7天) CP (溶解於DMEM中之新鮮溶離之 ^99mTc，T1)及經 ^99mTc標記之ePB-MSC (T2)。使用雙頭伽馬攝影機評估整個身體中之CP及ePB-MSC分佈。第一次獲取係在注射放射性化合物之後一小時內開始。接下來，在安慰劑對照及經標記ePB-MSC投與之後10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、3 h、4 h、6 h、8 h、12 h及24 h執行整體身體掃描。在經標記ePB-MSC投與之後36 h執行額外掃描。

結果 ：用IVP (= ePB-MSC)靜脈內治療所有四隻狗且評估其之不良事件。在注射IVP或CP之後在動物中未觀測到嚴重不良事件、未觀測到疑似不良藥物反應且未觀測到異常臨床徵象。IVP (ePB-MSC)靜脈內注射引起肝中放射性藥物吸收之主導性增加。此外，在心臟、肺及膀胱中觀測到放射性藥物吸收增加，且另外，在腎及脾中觀測到放射性藥物吸收少量增加。

CP靜脈內注射引起游離99mTc在心臟、肺、肝、胃、膀胱、甲狀腺及唾液腺中積聚。

結論 ：IV注射之後的ePB-MSC生物分佈主要在肝中觀測到且亦存在於心臟、肺、脾及腎中。此等結果解決在靜脈內注射之後ePB-MSC至狗腎之天然導向行為，且進一步支持其用於治療慢性腎病。

實例 7 ： ePB-MSC 在罹患 CKD 之 貓中之功效及安全性評估 設定 ：在靜脈內(IV)注射之後評估馬周邊血液衍生之間葉幹細胞(ePB-MSC)在罹患第2階段或第3階段慢性腎病之貓中之安全性及功效。用在此實例中進一步稱為研究獸醫產品(IVP)之ePB-MSC (在補充有10% DMSO之低葡萄糖DMEM培養基中)治療四隻貓，且用安慰劑(9 mg/mL Vetivex)治療兩隻貓。向所有貓靜脈內注射，與治療類型無關(ePB-MSC相對於Vetivex)。在12週隨訪期期間，執行血液學及血清生物化學分析、尿液分析、一般臨床評估、生活品質評估及注射部位觀測。生活品質係基於衍生自經驗證問卷之生活品質問卷來加以評估，如Bijsmans等人所報導( Bijsmans ES, Jepson RE, Syme HM, Elliott J, Niessen SJ. Psychometric Validation of a General Health Quality of Life Tool for Cats Used to Compare Healthy Cats and Cats with Chronic Kidney Disease. J Vet Intern Med. 2016 年 1 月 -2 月 ;30(1):183-91. doi: 10.1111/jvim.13656. 電子版 2015 年 11 月 14 日 . PMID: 26567089 ； PMCID: PMC4913638.)。需要考慮之重要參數為血液中之肌酸酐濃度，此係因為CKD係基於此肌酸酐濃度來進行分段(較高CKD階段由血液中之較高肌酸酐濃度界定)。

結果 ：用IVP (= ePB-MSC)靜脈內治療四隻貓且評估其之不良事件。在注射IVP或安慰劑之後在動物中未觀測到IVP或安慰劑相關之嚴重不良事件，未觀測到疑似不良藥物反應且未觀測到異常臨床徵象。IVP (= ePB-MSC) IV注射引起生活品質提高(表3)。此外，經安慰劑(= Vetivex)治療之貓顯示肌酸酐值增加，而經IVP (= ePB-MSC)治療之貓顯示肌酸酐濃度略微降低，此指示更佳發展(表2)。經IVP (= ePB-MSC)治療之貓之平均體重保持穩定(表4)。 表 2 ： 每組之平均肌酸酐值 (µmol/l)

肌酸酐值(µmol/l)
	ePB-MSC	安慰劑
第0天	208	221
第12週	196	241

表 3 ：每組之平均生活品質 ( 分 )

生活品質(分)
	ePB-MSC	安慰劑
第0天	3	-7
第12週	10	-4

表 4 ：每組之平均體重 (kg)

體重(kg)
	ePB-MSC	安慰劑
第0天	4.6	4.4
第12週	4.6	4.3

結論：經ePB-MSC治療之罹患第2階段或第3階段CKD之貓顯示動物生活品質改善。另外，此等經治療貓之肌酸酐值顯示略微降低，此與經安慰劑治療貓形成對比。此等結果顯示在靜脈內注射之後罹患第2階段或第3階段CKD之貓中之ePB-MSC的初始功效資料，且進一步支持其用於治療慢性腎病。

本發明絕不限於實例中所描述及/或圖式中所顯示之實施例。相反地，本發明之方法可在不脫離本發明之範疇之情況下以許多不同方式實現。

圖 1顯示在用經刀豆球蛋白A刺激之貓科動物周邊血液單核細胞(PBMC)進行之混合淋巴球反應(MLR)分析中在向十隻健康貓靜脈內注射300.000個根據本發明之一實施例之ePB-MSC之前(第0天，T0)及之後(第6週，T3)的平均PBMC增殖。 圖 2顯示在靜脈內注射根據本發明之一實施例之經 ^99mTc標記之ePB-MSC (在低葡萄糖DMEM中)之後在不同時間點使用雙頭伽馬攝影機(two-headed gamma camera)主觀評估之貓整個身體中之經量測放射性。

Claims (19)

1. 一種間葉幹細胞(MSC)或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其用於治療貓科動物及犬科動物之慢性腎病。
2. 如請求項1之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC係靜脈內投與。
3. 如請求項1至2中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC係原生的。
4. 如請求項1至3中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC衍生自血液，較佳衍生自周邊血液。
5. 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC為異體或異種MSC，較佳為異種MSC。
6. 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC為動物衍生的，較佳為哺乳動物衍生的，更佳為馬衍生的。
7. 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中投與之劑量為10 ⁵-10 ⁷個MSC/隻貓科動物及犬科動物。
8. 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中投與單次劑量。
9. 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中投與多次劑量，其中各劑量係在不同時間點投與。
10. 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該組合物之一個劑量具有最大約5 ml之體積，較佳地，該體積為約1 ml。
11. 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC量測之II類MHC分子及/或CD45呈陰性。
12. 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC量測之間葉標記物CD29、CD44及CD90呈陽性且量測之II類MHC分子及CD45呈陰性。
13. 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中當該等MSC存在於發炎環境或條件中時，會分泌免疫調節性前列腺素E2細胞介素。
14. 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中當該等MSC存在於發炎環境或條件中時且與具有相同特徵，但未接受該發炎環境或條件之細胞相比具有增加之選自IL-6、IL-10、TGF-β、NO或其組合中之至少一種分子的分泌；及/或減少之IL-1之分泌。
15. 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中當在存在PBMC之情況下時該等MSC刺激PgE2、IL-6、IL-10、NO或其組合之表現及/或當在存在PBMC之情況下時該等MSC抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1、TGF-β、IL-13或其組合之分泌。
16. 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC存在於無菌液體中。
17. 如前述請求項中任一項之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中經診斷患有或罹患慢性腎病之貓科動物及犬科動物之肌酸酐含量比未經該等MSC或該組合物治療之貓科動物或犬科動物相比降低。
18. 如請求項18之MSC或包含治療有效量之MSC之醫藥組合物，其中該等MSC或該醫藥組合物係靜脈內投與。
19. 一種醫藥組合物，其包含周邊血液衍生之MSC，該等MSC為動物衍生的，較佳為哺乳動物衍生的，且以在10 ⁵-10 ⁷個MSC/毫升該組合物之間的濃度存在於無菌液體中，其中該組合物具有約0.5 ml至5 ml之體積，其中該等MSC量測之間葉標記物CD29、CD44及CD90呈陽性且量測之II類MHC分子及CD45呈陰性，且其中該等MSC具有在10 μm與100 μm之間的懸浮直徑。

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