KR20080063406A - 태반 줄기세포를 이용한 면역 조절 - Google Patents

Abstract

본 발명은 태반 줄기세포와 태반 줄기세포군의 면역 조절 방법을 제공한다. 본 발명은 면역 조절에 의하여 또한 태반 세포와 태반 세포군을 생산하고 선별하는 방법을 제공하고 그러한 세포와 세포군을 함유하는 조성물을 제공한다.

태반 줄기세포, 면역 조절, 림프구 혼합 배양, 회귀 분석

Description

태반 줄기세포를 이용한 면역 조절{IMMUNOMODULATION USING PLACENTAL STEM CELLS}

본 발명은 태반 줄기세포를 이용하여 면역계와 항원에 대한 면역 반응을 조절하는 방법을 제공한다. 이 발명은 또한 면역 조절을 위한 태반 줄기세포를 함유하는 조성물을 제공하고, 면역 매개 거부 반응을 방지하거나 억제하기 위하여 태반 줄기세포를 투여하는 단계를 포함하는, 조직과 기관의 이식 방법을 제공한다.

사람 줄기세포는 여러 종류의 성숙한 세포 계통을 생성할 수 있는 전능성(totipotent)이거나 다능성(pluripotent)인 전구세포(precursor cell)이다. 줄기세포는 모든 조직이 아니라면 수많은 조직을 재성하고, 생체적·해부학적 기능을 되살리는데 쓰일 수 있다는 것을 밝혀주는 증거들이 있다.

수많은 서로 다른 포유류 줄기세포들의 특성이 분석된 바 있다. 예를 들어 Caplan 외 미국 특허 제5,486,359호(사람 중간엽 줄기세포); Boyse 외 미국 특허 제5,004,681호(태아와 신생아 조혈줄기세포와 전구세포); Boyse 외 미국 특허 제5,192,553호 (상동); Beltrami 외, Cell 114(6):763-766 (2003) (심근 줄기세포); Forbes 외, J. Pathol 197(4):510-518 (2002) (간 줄기세포)를 보라. 제대혈과 제대혈에서 유래한 모든 유핵세포는 절제 시술을 받은 환자들의 조혈 기능을 완전히 또는 부분적으로 회복하기 위한 이식에 쓰인 바 있다.

태반은 줄기세포원으로서 특히 매력적이다. 포유류 태반은 풍부하고 보통 의료 폐기물로 버려지기 때문에 의학적으로 유용한 줄기세포원으로서 독특한 자리를 차지하고 있다. 본 발명은 그러한 분리된 태반 줄기세포, 이 태반 줄기세포군, 그리고 이들의 이용 방법을 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 복수의 태반 줄기세포 또는 제대혈 줄기세포, 태반 줄기세포군 또는 제대혈 줄기세포군 및 이들 줄기세포를 포함하는 조성물 및/또는 이들 줄기세포에 의하여 제조된 조성물을 이용하는 면역억제법을 제공한다. 본 발명은 또한 태반 줄기세포 또는 제대혈 줄기세포를 함유하고 면역억제 특성이 있는 조성물을 포함하여 조성물도 제공한다. 본 발명은 나아가 면역 반응을 조절하는 능력에 따라 선택된 태반 줄기세포군 또는 제대혈 줄기세포군을 제공하며, 면역조절 특성을 갖춘 조성물도 제공한다.

본 발명의 한 측면에서는 복수의 면역 세포를 복수의 태반 줄기세포와 상기 태반 줄기세포가 면역 반응을 검출 가능한 정도로 억제하기에 충분한 시간 동안 접촉시키는 단계를 포함하는 면역 반응의 억제 또는 저하 방법을 제공하는데, 여기서 상기 태반 줄기세포는 림프구 혼합 배양 반응 분석(mixed lymphocyte reaction assay, MLR)으로 T 세포 증식을 검출가능한 정도로 억제하게 된다. 특정 실시태양에서 상기 태반 줄기세포는 각각의 경우, CD200과 HLA-G를, CD73, CD105와 CD200을, CD200과 OCT-4를, CD73, CD105와 HLA-G를, CD73과 CD105를 발현하고, 배아유사체(embryoid-like body)의 형성이 가능한 조건하에서 상기 복수의 태반 줄기세포를 함유하는 태반 줄기세포군(stem cell population)을 배양하였을 때, 하나 이상의 배아유사체의 형성을 촉진하거나/하는 것 외에, OCT-4를 발현하면서 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 복수의 태반 줄기세포를 함유하는 태반 줄기세포군을 배양하였을 때, 하나 이상의 배아유사체의 형성을 촉진한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 복수의 면역 세포는 T 세포 또는 자연세포독성(NK) 세포이다. 더욱 특정한 실시 태양에서, 상기 T 세포는 CD4⁺ T 세포이다. 다른 더욱 특정한 실시 태양에서 상기 T 세포는 CD8⁺ T 세포이다. 또 다른 특정 실시 태양에서 상기 접촉은 시험관내에서 이루어진다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 접촉은 생체내에서 이루어진다. 더욱 특정한 다른 실시 태양에서 상기 생체내 접촉은 포유류 대상(subject), 예를 들어 인간 대상 안에서 이루어진다. 더더욱 특정한 실시 태양에서 상기 접촉은 상기 태반 세포를 정맥내, 근육내 또는 상기 대상의 장기(예를 들어 이자) 속으로 투여하는 단계를 포함한다. 면역 반응을, 특히 생체내에서, 억제하는 방법은 또한 (예를 들어 포유류) 상기 대상에게 항-포식세포 염증성 단백질 1α 항체(anti-macrophage inflammator protein 1α, anti-MIP-1α) 또는 항MIP-1β 항체 등을 투여하는 단계를 더 포함하되, 상기 항체는 MIP-1α 또는 MIP-1β의 양, 예를 들어 상기 대상의 혈중 농도를 측정가능한 정도로 감소시키기에 충분한 양으로 투여하는 것이 특징이다.

본 발명의 더 구체적인 실시 태양에서, CD200과 HLA-G를 발현하는 상기 태반 줄기세포는 또한 CD73과 CD105를 발현하는데, 즉 CD73⁺이고 CD105⁺이다. 본 발명의 다른 측정 실시 태양에서, 상기 태반 세포는 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 더 구체적인 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺이고 CD105⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 복수의 태반 줄기세포는 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군으로부터 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진한다.

본 발명 방법의 다른 특정 실시 태양에서 CD73, CD105와 CD200을 발현하는 상기 태반 줄기세포는 또한 HLA-G⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 더욱 특정한 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군으로부터 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진한다.

본 발명 방법의 다른 더 구체적인 실시 태양에서 있어서, CD200과 OCT-4를발현하는 상기 태반 줄기세포는 또한 CD73과 CD105를 발현한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 HLA-G⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다 더욱 특정한 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군으로부터 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진한다.

본 발명 방법의 다른 특정 실시 태양에서 CD73, CD105와 HLA-G를 발현하는 상기 태반 줄기세포는 또한 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD200⁺이다 더욱 특정한 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺와 CD200⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군으로부터 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진한다.

본 발명의 더욱 특정한 다른 실시 태양에서 CD73과 CD105를 발현하는 상기 태반 줄기세포는 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하면서 또한 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD200⁺이다 더욱 특정한 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺, CD200⁺, CD38^- 또는 CD45^-이다.

본 발명의 더욱 특정한 다른 실시 태양에서 OCT-4를 발현하는 상기 태반 줄기세포는 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하면서 또한 CD73⁺이면서 CD105⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD200⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^- 이면서 CD45^-이다.

면역 반응을 감소시키거나 억제하는 방법의 다른 특정 실시 태양에서, 상기 면역 반응은 이식 대 숙주 질환(graft-versus-host disease)이다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 면역 반응은 자가면역 질환, 예를 들어 당뇨병, 전신 홍반 루프스(lupus erythematosus) 또는 류마티스성 관절염이다.

본 방법 발명의 다른 특정 실시 태양에서, 상기 복수의 면역 세포는 또한 복수의 비태반 세포와 접촉하게 된다. 이러한 비태반 세포는 예를 들어 CD34⁺ 세포를 포함할 수 있다. 더 특정한 실시 태양에서, 상기 CD34⁺ 세포는 말초 혈액 조혈 전구세포, 제대혈 조혈 전구세포 또는 태반 혈액 조혈 전구세포이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 비태반 세포는 중간엽 줄기세포를 포함한다. 더 특정한 다른 실시 태양에서, 상기 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 비태반 세포는 동종이식물 내에 포함되어 있다.

본 발명의 방법은 면역 반응을 측정 가능한 수준으로 억제하기 위하여 필요한 만큼의 태반 줄기세포를 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 복수의 면역 세포와 접촉하는 상기 복수의 태반 줄기세포는 1×10⁵ 개의 태반 줄기세포, 1×10⁶ 개의 태반 줄기세포, 1×10⁷ 개의 태반 줄기세포 또는 1×10⁸ 개의 태반 줄기세포 또는 더 많은 수의 줄기세포를 포함할 수 있다.,

본 발명은 나아가 면역 반응을 조절(억제 등)하는 능력에 따라 선택된 태반 줄기세포를 포함하는 세포군을 얻는 방법을 제공한다. 예를 한 실시 태양에서 본 발명은 (a) 림프구 혼합 배양 반응(MLR) 분석으로 복수의 태반 세포를 분석하는 단계와 (b) 상기 복수의 태반 줄기세포가 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 측정 가능한 수준으로 억제하는 경우 상기 복수의 태반 줄기세포를 선택하는 단계를 포함하는 태반 세포군의 선택 방법을 제공하는데, 여기서 상기 태반 줄기세포는 (i) 기질(substrate)에 부착하며, (ii) CD200과 HLA-G를 발현하거나 CD73, CD105와 CD200을 발현하거나 CD200과 OCT-4를 발현하거나 CD73, CD105와 HLA-G를 발현하거나 CD73과 CD105를 발현하면서, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나,

OCT-4를 발현하면서 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진한다.

본 발명은 또한 복수의 세포 속에서 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD200과 HLA-G를 발현하고 (c) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 선택하는 단계와 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 형성 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 복수의 세포 속에서 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73, CD105와 CD200을 발현하고 (c) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 선택하는 단계와 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 형성 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD200과 OCT-4를 발현하고 (c) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 선택하는 단계와 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 형성 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 복수의 세포 속에서 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73과 CD105를 발현하고, (c) 배아유사체 형성이 가능한 조건하에서 배양되었을 때 배아유사체를 형성하며 (d) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 선택하는 단계와 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 형성 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 복수의 세포 속에서 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73, CD105와 HLA-G를 발현하고 (c) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 선택하는 단계와 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 형성 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 복수의 세포 속에서 (a) 기질에 부착하면서 (b) OCT-4를 발현하고, (c) 배아유사체 형성이 가능한 조건하에서 배양되었을 때 배아유사체를 형성하며 (d) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 선택하는 단계와 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 형성 방법을 제공한다.

본 명세서의 모든 특정 실시 태양에서 상기 T 세포와 상기 태반 줄기세포는 상기 MLR 분석에 따를 때 예를 들어, 약 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 2:2, 1:1, 1:2, 1:5, 1:10 또는 1:20의 비율로 존재하며, 바람직하게는 5:1로 존재한다.

다른 특정 실시 태양에서 본 발명의 방법은 ABC-p를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서 본 발명의 방법은 중간엽 줄기세포에 특이적인 적어도 하나의 특성을 나타내는 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 더욱 특정한 실시 태양에서, 중간엽 줄기세포에 특이적인 상기 특성은 CD29의 발현, CD44의 발현, CD90의 발현 또는 이들을 조합하여 발현하는 특성이다. 본 발명 방법의 다른 특정 실시 태양에서 상기 선택은 항체를 이용하여 이루어진다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 선택은 흐름세포 측정(Flow cytometry)을 통하여 이루어진다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 선택은 자석 비드(magnetic bead)를 이용하여 이루어진다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 선택은 형광 표지 세포 분리(FACS)를 통하여 이루어진다. 상기 방법의 다른 특정 실시 태양에서 상기 세포군은 증폭(expansion)된다.

본 발명 방법에서 쓰이는 태반 줄기세포는 태반 전체 또는 그 모든 부분으로부터 유래할 수 있다. 예를 들어 다양한 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 주로 혹은 전적으로 양막, 아니면 양막과 융모막으로부터 유래하거나, 혹은 태반 관류시에 수집한 태반 관류물로부터 유래할 수 있다. 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 MLR 분석 기준으로 상기 태반 줄기세포가 부재하에 T 세포가 증식하는 경우와 비교하여 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 적어도 50%, 70%, 90% 또는 95%억제한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 추가적으로 자연세포독성 세포의 활성을 측정 가능하게 억제한다.

면역 조절성 태반 세포군을 선별하기 위하여 본 발명은 나아가 본 명세서에서 기술한 모든 상기 방법을 택하여 제조한 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공하는데, 여기서 상기 세포군은 MLR 분석에서 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 측정 가능하게 억제한다. 예를 들어 한 실시 태양에서 본 발명은 분리된 태반 줄기세포를 함유하는 세포군을 제공하는데, 상기 태반 줄기세포는 (a) 기질(substrate)에 부착하며, (b) CD200과 HLA-G를 발현하거나 CD73, CD105와 CD200을 발현하거나, CD200과 OCT-4를 발현하거나 또는 CD73, CD105와 HLA-G를 발현하거나 혹은 CD73과 CD105를 발현하면서, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나,

OCT-4를 발현하면서 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하는데, 이때 상기 세포군은 MLR 분석에서 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 측정 가능하게 억제하는 것으로 확인된 것이다.

본 발명은 또한 a) 기질에 부착하며, (b) CD200과 HLA-G를 발현하고, (c) MLR 분석에서 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 측정 가능하게 억제하는 것으로 확인된 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공한다. 본 발명은 또한 a) 기질에 부착하며, (b) CD73, CD105와 CD200을 발현하고, (c) MLR 분석에서 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 측정 가능하게 억제하는 것으로 확인된 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공한다. 본 발명은 또한 a) 기질에 부착하며, (b) CD200과 OCT-4를 발현하고, (c) MLR 분석에서 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 측정 가능하게 억제하는 것으로 확인된 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공한다. 본 발명은 또한 a) 기질에 부착하며, (b) CD73과 CD105를 발현하고, (c) 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 배양하였을 때 배아유사체를 형성하며, (d) MLR 분석에서 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 측정 가능하게 억제하는 것으로 확인된 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공한다. 본 발명은 또한 a) 기질에 부착하며, (b) CD73, CD105와 HLA-G를 발현하고, (c) MLR 분석에서 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 측정 가능하게 억제하는 것으로 확인된 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공한다. 본 발명은 또한 a) 기질에 부착하며, (b) OCT-4를 발현하고, (c) 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 배양하였을 때 배아유사체를 형성하며, (d) MLR 분석에서 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 측정 가능하게 억제하는 것으로 확인된 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공한다.

본 발명 조성물의 더욱 특정한 실시 태양에서는 CD200과 HLA-G를 발현하는 상기 태반 줄기세포는 또한 CD73과 CD105를 발현하는데, 즉 CD73⁺, CD105⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 더 특정한 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^- , CD45^-, CD73⁺ 및 CD105⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 복수의 태반 줄기세포는 상기 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군이 배아유사체의 형성을 허용하는 조건하에서 배양될 때, 상기 세포군으로부터 하나 이상의 배아유사체가 발생하는 것을 촉진한다.

본 발명 조성물의 다른 더 특정한 실시 태양에서 CD73, CD105와 CD200을 발현하는 상기 태반 줄기세포는 또한 HLA-G⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 더 특정한 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^- , CD45^- 및 HLA-G⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 복수의 태반 줄기세포는 상기 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군이 배아유사체의 형성을 허용하는 조건하에서 배양될 때, 상기 세포군으로부터 하나 이상의 배아유사체가 발생하는 것을 촉진한다.

본 발명 조성물의 다른 더 특정한 실시 태양에서 CD200과 OCT-4를 발현하는 상기 태반 줄기세포는 또한 CD73⁺이고 CD105⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 HLA-G⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 더 특정한 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^- , CD73⁺, CD105⁺ 및 HLA-G⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 복수의 태반 줄기세포는 상기 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군이 배아유사체의 형성을 허용하는 조건하에서 배양될 때, 상기 세포군으로부터 하나 이상의 배아유사체가 발생하는 것을 촉진한다.

본 발명 조성물의 다른 더 특정한 실시 태양에서 CD73, CD105와 HLA-G를 발현하는 상기 태반 줄기세포는 또한 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD200⁺이다. 더 특정한 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺ 및 CD200⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 복수의 태반 줄기세포는 상기 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군이 배아유사체의 형성을 허용하는 조건하에서 배양될 때, 상기 세포군으로부터 하나 이상의 배아유사체가 발생하는 것을 촉진한다.

본 발명 조성물의 다른 더 특정한 실시 태양에서, 상기 태반 줄기세포로서 CD73과 CD105를 발현하고, 배아유사체의 형성을 허용하는 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군이 배양될 때, 상기 세포군에서 하나 이상의 배아유사체가 발생하는 것을 촉진하는 것들은 또한, CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺이다. 또 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD200⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 OCT-4⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다.

본 발명 조성물의 다른 더 특정한 실시 태양에서, 상기 태반 줄기세포로서 OCT-4를 발현하고, 배아유사체의 형성을 허용하는 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군이 배양될 때, 상기 세포군에서 하나 이상의 배아유사체가 발생하는 것을 촉진하는 것들은 또한, CD73⁺이고 CD105⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 또 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD200⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다.

본 발명은 나아가 면역 조절성 조성물을 제공한다. 한 실시 태양에서 본 발명은 본 명세서에서 기술된 어떤 세포군이어도 좋은 세포군의 배양액에서 유래한 상청액을 함유하는 조성물을 제공한다. 다른 실시 태양에서 본 발명은 배양된 태반 줄기세포의 배양 배지를 함유하는 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 태반 세포는 (a) 기질(substrate)에 부착하며, (b) CD200과 HLA-G를 발현하거나 CD73, CD105와 CD200을 발현하거나, CD200과 OCT-4를 발현하거나 또는 CD73, CD105와 HLA-G를 발현하거나 혹은 CD73과 CD105를 발현하면서, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나,

OCT-4를 발현하면서 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하고, (c) MLR 속에서 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 측정 가능하게 억제하는데, 여기서 사기 태반 줄기세포의 배양은 상기 배양 배지 속에서 24시간 이상 이루어진 것이다. 특정 실시 태양에서 상기 조성물은 복수의 상기 태반 줄기세포를 함유한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 조성물은 복수의 비태반 세포를 함유한다. 더 구체적인 실시 태양에서 상기 복수의 비태반 세포는 CD34⁺ 세포를 함유한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 비태반 세포는 중간엽 줄기세포를 함유한다. 더 구체적인 실시 태양에서 상기 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포이다. 다른 특정 시 태양에서 상기 조성물은 항MIP-1α 항체 또는 항MIP-1β 항체를 더 함유한다.

다른 특정 실시 태양에서 상기의 모든 조성물은 매트릭스를 포함할 수 있다. 더 구체적인 실시 태양에서 상기 매트릭스는 3차원 골격(scaffold)이다. 다른 더 특정한 실시 태양에서 상기 매트릭스는 콜라겐, 젤라틴, 라미닌, 피브로넥틴, 펙틴, 오르니틴 또는 비트로넥틴을 함유한다. 다른 더욱 특정한 실시 태양에서, 상기 매트릭스는 양막 또는 양막 유래 생물질이다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서 상기 매트릭스는 세포외 막단백질(extracelluar membrane protein)을 함유한다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서 상기 매트릭스는 합성 화합물을 함유한다. 다른 구체적인 실시 태양에서 상기 매트릭스는 생활성 화합물을 함유한다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서 상기 생활성 화합물은 성장 인자, 사이토킨, 항체 또는 5,000 달톤 미만의 유기 물질이다.

본 발명은 나아가 냉동보존된 줄기세포군, 예를 들어 태반 줄기세포를 함유하는 세포군을 제공하는데, 여기서 상기 세포군은 본 명세서에서 기술하는 바와 같이 면역 조절성이다. 예를 들어 본 발명은 CD200⁺, HLA-G⁺ 태반 줄기세포군을 제공하는데, 이들은 MLR 분석에서 T 세포 증식을 측정 가능하게 억제하는 것으로 밝혀진 것이며, 냉동보존되어 용기 속에 담겨 있는 것이다. 본 발명은 또한 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺ 태반 줄기세포를 제공하는데, 이들은 MLR 분석에서 T 세포 증식을 측정 가능하게 억제하는 것으로 밝혀진 것이며, 냉동보존되어 용기 속에 담겨 있는 것이다. 본 발명은 또한 CD200⁺, OCT-4⁺ 태반 줄기세포군을 제공하는데, 이들은 MLR 분석에서 T 세포 증식을 측정 가능하게 억제하는 것으로 밝혀진 것이며, 냉동보존되어 용기 속에 담겨 있는 것이다. 본 발명은 또한 CD73⁺, CD105⁺ 태반 줄기세포군을 제공하는데, 이들은 MLR 분석에서 T 세포 증식을 측정 가능하게 억제하는 것으로 밝혀진 것이며, 냉동보존되어 용기 속에 담겨 있는 것이고, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 태반 세포군과 함께 배양되었을 때, 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하는 것이다. 본 발명은 또한 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺ 태반 줄기세포군을 제공하는데, 이들은 MLR 분석에서 T 세포 증식을 측정 가능하게 억제하는 것으로 밝혀진 것이며, 냉동보존되어 용기 속에 담겨 있는 것이다. 본 발명은 또한 OCT-4⁺ 태반 줄기세포군을 제공하는데, 이들은 MLR 분석에서 T 세포 증식을 측정 가능하게 억제하는 것으로 밝혀진 것이며, 냉동보존되어 용기 속에 담겨 있는 것이고, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 태반 세포군과 함께 배양되었을 때, 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하는 것이다.

전술한 냉동 보존된 세포군에 관한 특정 실시 태양 중 어느 것이라도 상기 용기는 백(bag)일 수 있다. 많은 특정 실시 태양에서, 상기 세포군은 약, 적어도 또는 최대 1×10⁶ 줄기세포, 5×10⁶ 줄기세포, 1×10⁷ 줄기세포, 5×10⁷ 줄기세포, 1×10⁸ 줄기세포, 5×10⁸ 줄기세포, 1×10⁹ 줄기세포, 5×10⁹ 줄기세포 또는 1×10¹⁰ 줄기세포를 함유한다. 다른 실시 태양에서는 전술할 냉동보존 세포군 중 아무 것이나 선택하되, 그 줄기세포는 약 5회, 적어도 5회 또는 5회가 못 되도록 계대 배양한 것이고, 10회, 15회 또는 20회가 못 되도록 계대 배양한 것이다. 다른 구체적 실시 태양에서는 상기 냉동보존된 세포군 중 아무 것이나 선택하되, 그 줄기세포는 상기 용기 속에서 증폭된다.

용어의 정의

본 명세서에서 "SH2"라는 용어는 CD105 표지 분자 표면의 항원 결정기에 결합하는 항체를 일컫는다.

본 명세서에서 "SH3"과 "SH4"라는 용어는 CD73 표지 분자 표면의 항원 결정기에 결합하는 항체들을 일컫는다. 즉 SH3⁺ 및/또는 SH4⁺라고 나타낸 세포는 CD73⁺이다.

본 명세서에서 "분리된 줄기세포"라는 용어는 상기 줄기세포가 유래한 조직, 예를 들어 태반의 다른 비줄기세포로부터 실질적으로 분리된 줄기세포를 말한다. 줄기세포는 그 줄기세포와 자연 상태에서 결부된 비줄기세포 중 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%가 예를 들어 상기 줄기세포의 수집 및/또는 세포 배양 과정에서 제거되었을 때 "분리된" 세포이다.

본 명세서에서 "분리된 세포군(isolated population of cells)"이라는 용어는 상기 세포군이 유래한 조직, 예를 들어 태반의 다른 세포들로부터 실질적으로 분리된 줄기세포를 말한다. 세포군, 예를 들어 줄기세포군은 그 줄기세포와 자연 상태에서 결부된 비줄기세포 중 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%가 예를 들어 상기 줄기세포군의 수집 및/또는 세포 배양 과정에서 제거되었을 때 "분리된" 세포군이다.

본 명세서에서, "태반 줄기세포"라는 용어는 형상, 세포 표면 표지 또는 1차 배양 후 계대 수에 무관하게 포유류 태반에서 유래한 주기세포 또는 전구세포로서 조직 배양 기질(tissue culture substrate), 예를 들어 조직 배양 플라스틱 또는 피브로넥틴 피복 조직 배양판에 부착하는 것을 말한다. 그러나 본 명세서에서 "태반 줄기세포"라는 용어는 영양막 세포(trophoblast)를 가리키는 것은 아니다. 세포는 줄기세포의 특징 중 적어도 하나, 예를 들어 적어도 하나의 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력 등을 갖추고 있으면 "줄기세포"이다.

본 명세서에서 줄기세포는 특정 표지를 검출할 수 있으면 그 표지에 대하여 "양성"이다. 이를 테면 태반 줄기세포는 예를 들어 CD73에 대하여 양성인데, 이는 태반 줄기세포에서 CD73 신호가 배경 신호보다 측정 가능하게 더 큰 신호를 나타내기 때문(이를 테면 동종 세포 유형 대조군에 견주어)이다. 세포는 또한 어느 표지를 이용하여 그 세포를 적어도 하나의 다른 세포 유형과 구별할 수 있거나 그 표지가 세포 표면에 나타나거나, 발현될 때 그 표지를 이용하여 그 세포를 선별 또는 분리할 수 있으면 그 표지에 대하여 양성이 된다.

본 명세서에서, "면역 조절(immunomodulation)"과 "면역 조절성(immunomodulatory)"은 면역 반응에 측정 가능한 변화를 일으키거나 일으킬 수 있는 능력을 갖춘 것, 그리고 그 능력을 뜻한다.

본 명세서에서, "면역 억제(immunosuppression)"과 "면역 억제성(immunosuppressive)"은 면역 반응에 측정 가능한 저하를 일으키거나, 일으킬 수 있는 능력을 갖춘 것, 그리고 그 능력을 의미한다.

1. 태반 줄기세포를 이용한 면역 조절

본 발명은 면역 세포의 조절, 예를 들어 한 면역 세포 또는 복수의 면역 세포에 대하여 증식 등의 활성 억제 방법을 제공하는데, 면역 세포를 복수의 태반 줄기세포와 접촉시킴으로써 이루어진다. 한 실시 태양에서, 본 발명은 복수의 면역세포를 복수의 태반 줄기세포와 접촉시키되, 상기 태반 줄기세포가 면역 반응을 측정 가능한 수준으로 억제하기에 충분한 시간 동안 접촉시키는 단계를 포함하는 면역 반응 억제 방법을 제공하는데, 여기서 상기 태반 줄기세포는 림프구 혼합 배양 반응(mixed lymphocyte reaction, MLR) 분석에서 T 세포 증식을 측정 가능한 수준으로 억제한다.

태반 줄기세포는 예를 들어 본 명세서의 다른 곳에서 기술하는 태반 줄기세포(발명의 상세한 설명 단락 2를 참조)이다. 태반 줄기세포는 면역억제를 위하여 사용되며 하나의 태반 또는 복수의 태반에서 유래하거나 얻을 수 있다. 면역 억제에 쓰이는 태반 줄기세포는 하나의 종, 예를 들어 줄기세포를 수혈받을 종 또는 면역 세포의 기능을 저하시키거나 억제하여야 할 종에서 유래하거나 여러 종으로부터 유래할 수 있다.

본 발명 방법의 맥락에서 "면역 세포"란 면역계의 어떠한 세포라도 의미하지만, 특히 T 세포와 자연세포독성(NK) 세포를 의미한다. 즉 본 발명의 다양한 실시 태양에서 태반 줄기세포는 복수의 면역 세포와 접촉하게 되는데, 여기서 상기 복수의 면역 세포는 복수의 T 세포(예를 들어 복수의 CD3⁺ T 세포, CD4⁺ T 세포 및/또는 CD8⁺ T 세포) 및/또는 자연세포독성 세포이거나 이들을 포함한다. 본 발명 방법의 맥락에서 "면역 반응"이란 면역 세포가 정상적으로 받을 있는 자극에 대하여 면역 세포가 일으키는 모든 반응, 예를 들어 항원의 존재에 따른 반응을 의미한다. 많은 실시 태양에서 면역 반응은 T 세포(CD3⁺ T 세포, CD4⁺ T 세포 및/또는 CD8⁺ T 세포 등)가 외부 항원, 예를 들어 수혈이나 이식시 존재하는 항원, 또는 자가 면역 질환에서와 같은 자가 항원에 대한 반응으로서 증식하는 것일 수 있다. 면역 반응은 이식 부위 안의 T 세포가 증식하는 것일 수도 있다. 면역 반응은 또한 자연세포독성 세포의 모든 활성, 가지상 세포의 성숙 등일 수도 있다. 면역 반응은 하나 이상의 유(class)의 면역 세포의 활성에 의한 국소적, 조직 또는 장기 특이적 또는 전신적 효과일 수 있는데, 예를 들어 이식 대 숙주 질환의 면역 반응, 염증, 염증 관련 상처 조직의 형성, 자가면역 상태(류마티스성 관절염, 제1형 당뇨병, 전신 홍반 루프스 등) 등이 있다.

본 명세서의 맥락에서 "접촉"이란 태반 줄기세포와 면역 세포를 함께 한 용기(예를 들어 배양 접시, 플라스크, 비알 등)에 넣거나 생체, 예를 들어 동일한 개체(예를 들어 사람 등의 포유류)에 넣는 것을 망라한다. 바람직한 실시 태양에서 이러한 접촉은 상기 면역 세포의 면역 기능이 측정 가능한 정도로 변화하는데 충분한 수의 태반 줄기세포와 면역 세포를 충분한 시간 동안 이루어진다. 더 바람직스럽게는, 여러 실시 태양에서 상기 접촉은 상기 태반 줄기세포의 부재하에 면역 기능과 비교했을 때, 면역 기능(예를 들어 항원에 반응하여 T 세포가 증식)을 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 억제하는데 충분한 것이다. 생체 내에서 일어나는 이러한 억제는 시험관내 분석(이하를 참조하라)을 통하여 측정할 수 있는데, 즉 시험관내 분석에서 밝힌 억제도를 특정 수의 태반 줄기세포와 특정 수의 면역 세포를 가지는 대상 개체의 면역 억제도로 외삽할 수 있다.

본 발명은 몇몇 실시 태양에서 면역 반응 또는 하나 이상 종류로 이루어지는 복수의 면역 세포의 활성을 시험관 내에서 조절하기 위하여 태반 줄기세포를 이용하는 방법을 제공한다. 상기 태반 줄기세포와 복수의 면역 세포를 접촉시키는 것은 다음 단계들을 포함할 수 있다. 상기 태반 줄기세포와 면역 세포를 같은 물리적 공간에 모아서 적어도 상기 복수의 태반 줄기세포의 일부분이 상기 복수의 면역 세포의 적어도 일부분과 상호작용하도록 하는 단계; 상기 태반 줄기세포와 면역 세포를 같은 배지를 이용하는 물리적으로 분리된 공간 속에서 유지하는 단계. 혹은 상기 접촉은 상기 태반 줄기세포와 면역 세포 중 어느 하나의 배양 배지 또는 배양물을 나머지 세포에 접촉시키는 단계(예를 들어 태반 줄기세포 배양물로부터 배양 배지를 얻은 다음 이 배양 배지에 분리된 면역 세포를 재현탁하는 것)를 포함할 수도 있다. 특정 실시예에서 상기 접촉은 림프구 혼합 배양 반응이다.

이러한 접촉은, 예를 들어, 특정한 복수의 태반 줄기세포가 어느 정도만큼 면역 조절성, 예를 들어 면역 억제성을 가지는지 측정하기 위한 실험 조건하에서 일어날 수 있다. 이러한 실험 조건은 예를 들어 MLR 또는 회귀 분석일 수 있다. MLR과 회귀 분석법을 수행하기 위한 절차는 종래 기술에 잘 알려져 있다. 예를 들어 Schwarz의 "The Mixed Lymphocyte Reaction: An In Vitro Test for Tolerance," J Exp. Med. 127(5):879-890 (1968); Lacerda 외, "Human Epstein-Barr Virus (EBV)- Specific Cytotoxic T Lymphocytes Home Preferentially to and Induce Selective Regressions of Autologous EBV-Induced B Lymphoproliferations in Xenografted CB- 17 Scid/Scid Mice," J Exp. Med. 183:1215-1228 (1996)을 보라. 한 바람직한 실시 태양에서는 MLR 분석에서 복수의 태반 줄기세포가 복수의 면역 세포(예를 들어 림프구, 예를 들어 CD3⁺, CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 림프구)와 접촉하게 된다.

이러한 MLR은 복수의 태반 줄기세포의 면역 억제능을 측정하는데 쓰일 수 있다. 예를 들어, CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포, 가지상 세포(DC)와 태반 줄기세포를 약 10:1:2의 비율로 혼합하여 복수의 태반 줄기세포를 MLR 분석할 수 있는데, 여기서 상기 T 세포는 딸세포로 분획되는 염료, 예를 들어 CFSE로 염색되며, 또한 상기 T 세포는 약 6일 동안 증식이 허용된다. 6일 동안 태반 줄기세포 존재하에서 상기 T 세포가 증식한 정도가 상기 태반 줄기세포의 부재와 가지상 세포 존재하에서의 T 세포 증식보다 측정 가능한 수준으로 떨어져 있다면 상기 복수의 태반 줄기세포는 면역 억제성이다. 이러한 MLR에서 태반 줄기세포는 해동되거나 아니면 배양물로부터 수집된다. 약 20,000 개의 태반 줄기세포가 100 μL의 배지(RPMI 1640, 1 mM HEPES 완충액, 항생제와 5% 사람 혼주 혈청(混住血淸))에 재현탁한 다음, 웰의 바닥에 달라붙도록 2시간 동안 놓아 두었다. CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포는 Miltenyi 자기 비드를 이용하여 온말초 혈액(whole peripheral blood) 단핵 세포로부터 분리해 내었다. 이 세포를 CFSE로 염색하고, 웰 당 총 100,000 개의 T 세포(CD4⁺ T 세포 단독, CD8⁺ T 세포 단독, 같은 분량의 CD4⁺와 CD8⁺ T 세포)를 가하였다. 상기 웰 속의 부피를 200 μL까지 끌어올린 다음 MLR 반응을 진행한다.

따라서 본 발명의 한 실시 태양에서는 복수의 태반 줄기세포가 림프구 혼합 배양 반응에서 측정 가능한 정도로 T 세포 증식을 억제하기에 충분한 시간 동안 상기 복수의 태반 줄기세포와 복수의 면역 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 면역 반응의 억제법을 제공한다. 한 실시 태양에서, 상기 MLR에서 쓰인 상기 태반 줄기세포는 더 큰 태반 줄기세포군의 한 시료 또는 한 부분일 수 있다.

서로 다른 태반 또는 같은 태반의 서로 다른 조직에서 얻은 태반 줄기세포군은 면역 세포의 활성을 조절하는 능력, 예를 들어 T 세포 활성, 증식이나 NK 면역 세포 활성의 억제 능력에 차이가 있을 수 있다. 따라서 사용 전에, 특정 태반 줄기세포군의 면역 억제능을 측정하는 것이 바람직하다. 이러한 억제능은 예를 들어, 상기 태반 줄기세포군의 시료를 MLR 또는 회귀 분석법으로 조사하여 측정할 수 있다. 한 실시 태양에서는 시료의 MLR을 수행하여, 상기 태반 줄기세포에 의항 면역 억제 정도를 측정한다. 이 면역 억제 정도는 시료를 채취한 상기 태반 줄기세포군의 억제도로 볼 수 있다. 따라서 이러한 MLR은 특정 태반 줄기세포군의 절대적이고 상대적인 면역 기능 억제 능력을 측정하는 방법으로 쓸 수 있다. MLR 파라미터는 더 많은 데이터를 얻기 위해 또는 태반 줄기세포 시료의 면역 억제능을 가장 잘 측정하기 위하여 조정될 수 있다. 예를 들어, 태반 줄기세포에 의한 면역 억제는 분석법에 쓰인 태반 줄기세포의 수에 따라 대략 비례하는 것처럼 나타나기 때문에, 본 발명의 한 실시 태양에서는 둘 이상의 수의 태반 줄기세포, 예를 들어 반응 당 1×10³, 3×10³, 1×10⁴ 및/또는 3×10⁴ 개의 태반 줄기세포를 가지고 MLR을 수행할 수 있다. 분석법에서 T 세포수에 대한 태반 줄기세포수 역시 바뀔 수 있다. 예를 들어 분석법에서 태반 줄기세포와 T 세포는 모든 비율, 예를 들어 약 10:1 내지 약 1:10, 바람직하게는 약 1:5로 쓰일 수 있는데, 태반 줄기세포 또는 T 세포를 상대방에 대하여 약간 더 많이 사용할 수도 있다.

회귀 분석법 역시 비슷한 방식으로 이루어질 수 있다.

본 발명은 또한 태반 줄기세포를 이용하여 생체 내에서 면역 반응, 또는 복수이고, 하나 이상의 종류인 면역 세포의 활성을 조절하는 방법을 제공한다. 태반 줄기세포와 면역 세포는 접촉할 수 있는데, 예를 들어 복수의 태반 줄기세포를 공여받는 대상 개체 안에서 접촉할 수 있다. 상기 접촉이 한 개체 내에서 이루어지는 실시 태양에서는 이 접촉은 외래 태반 줄기세포(즉 그 개체에서 유래하지 않은 태반 줄기세포)와 상기 개체에 내생적인 복수의 면역 세포 사이에서 이루어진다. 특정 실시 태양에서 상기 개체에 내생하는 면역 세포는 CD3⁺ T 세포, CD4⁺ T 세포, CD8⁺ T 세포 및/또는 NK 세포이다.

태반 줄기세포를 이용한 이러한 면역 억제는 부적합하거나 바람직하지 않은 면역 반응에 의하여 일어나거나 악화되거나 관련된 모든 상태에 유익하게 쓰일 수 있다. 태반 줄기세포 매개 면역 조절, 예를 들어 면역 억제는 일례로 한 개체의 면역계가 자신의 한 조직 또는 그 이상에 대하여 일으키는 부적합한 면역 반응을 억제하는데 유용할 것이다. 따라서 많은 실시 태양에서 본 발명은 면역 반응의 억제 방법을 제공하는데, 여기서 상기 면역 반응은 자가 면역 질환, 예를 들어 전신 홍반 루프스, 당뇨병, 류마티스성 관절염 또는 다발성 경화증이다.

상기 복수의 태반 줄기세포를 복수이고 하나 또는 그 이상의 종류에 속하는 면역 세포에 접촉시키는 단계는 생체 내에서 예를 들어 하나 이상의 조직을 이식받는 이에게 이식하는 맥락에서 혹은 이식편 옆에서 이루어질 수 있다. 이러한 조직은 예를 들어 골수 또는 혈액, 장기, 특정 조직(예를 피부 이식), 복합 조직 동종 이식편(즉 둘 이상의 다른 유형의 조직을 포함하는 이식편) 등일 수 있다. 이러한 방식으로 상기 태반 줄기세포는 이식받는 개체 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 면역 세포가 상기 이식 조직 속에서 일으키는 하나 또는 그 이상의 면역 반응을 억제하는데 쓰일 수 있다. 이러한 접촉은 상기 이식 과정 이전, 도중 및/또는 이후에 이루어질 수 있다. 일례로 태반 줄기세포는 이식시에 투여될 수 있다. 상기 태반 줄기세포는 또한 혹은 대안적으로 이식 전에, 예를 들어 이식하기 약 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일 전에 투여될 수 있다. 상기 태반 줄기세포는 또한 혹은 대안적으로 이식 후에, 예를 들어 이식한 약 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7 일 후에 투여될 수 있다. 상기 복수의 태반 줄기세포는 이식받는 개체 또는 이식편 조직에서 측정 가능한 면역 반응의 증세나 신호, 예를 들어 이식 대 숙주 질환 또는 측정 가능한 염증이 관측되기 전에 상기 복수의 면역 세포와 접촉하는 것이 바람직하다.

다른 실시 태양에서, 상기 개체 내 접촉은 주로 외생 태반 줄기세포와 외생 전구세포 또는 줄기세포, 예를 들어 면역 세포로 분화하는 외생 전구세포 또는 줄기세포 사이에서 이루어진다. 예를 들어, 항암 치료에 병행하여 부분적 또는 전체적 면역 절제 또는 골수 절제를 받는 개체는 태반 줄기세포를 하나 또는 그 이상의 유형의 줄기 또는 전구세포와 함께 투여받을 수 있다. 예를 들어, 상기 태반 줄기세포는 CD34⁺ 조혈 줄기세포 등의 복수의 CD34⁺ 세포와 함께 쓰일 수 있다. 이러한 CD34⁺ 세포는 말초 혈액, 제대혈, 태반 혈액 또는 골수와 같은 조직 공급원에서 얻은 CD34⁺ 세포를 예로 들 수 있다. 이 CD34⁺ 세포는 상기와 같은 조직 공급원 또는 온조직 공급원(예를 들어, 제대혈 또는 골수의 단위들)으로부터 분리하거나, 상기 조직 공급원(제대혈에서 얻은 백혈구 등)으로부터 부분적으로 정제되어 상기 태반 줄기세포와 함께 쓰일 수 있다. 태반 줄기세포와 제대혈 또는 제대혈에서 얻은 줄기세포의 조합은 Hariri의 미국 특허 출원 공보 제2003/0180269호에 기재되어 있다.

이러한 태반 줄기세포는 바람직하게는 어떠한 비율로 투여되는데, 상기 개체 속에 있는 알려진 혹은 예상되는 T 세포 등의 면역 세포 수에 대하여 약 10:1 내지 약 1:10의 비율 바람직하게는 약 1:5의 비율로 상기 개체에 투여된다. 그러나 비제한적인 실시예에서, 복수의 태반 줄기세포는 개체에 약 10,000:1, 약 1,000:1, 약 100:1, 약 10:1, 약 1:1, 약 1:10, 약 1:100, 약 1:1000, 약 1:10,000의 비율로 투여될 수 있다. 일반적으로 투여받을 개체 체중 1 kg 당 약 1×10⁵ 내지 1×10⁸개의 태반 줄기세포, 바람직하게는 약 1×10⁶ 내지 1×10⁷개의 태반 줄기세포를 투여하여 면역 억제를 이룰 수 있다. 많은 실시 태양에서 개체 또는 대사에 투여된 복수의 태반 줄기세포는 적어도 1×10⁵, 3×10⁵, 1×10⁶, 3×10⁶, 1×10⁷, 3×10⁷, 1×10⁸, 3×10⁸, 1×10⁹, 3×10⁹개 혹은 그 이상의 수로 태반 줄기세포를 포함하거나, 대략 이 정도 수의 태반 줄기세포를 포함하거나 혹은 이 정도 이하의 갯수로 포함한다.

상기 태반 줄기세포는 하나 이상의 2차 줄기세포, 예를 들어 골수 유래의 중간엽 줄기세포와 함께 투여될 수 있다. 이러한 2차 줄기세포는 태반 줄기세포와 함께 개체에 예를 들어 약 1:10 내지 10:1의 비율로 투여될 수 있다.

생체 내에서 상기 태반 줄기세포와 면역 세포의 접촉을 촉진하기 위하여 상기 태반 줄기세포와 면역 세포가 서로 접촉하도록 하는데 충분한 모든 경로를 통하여 상기 태반 줄기세포를 개체에 투여할 수 있다. 예를 들어, 상기 태반 줄기세포는 정맥 투여, 근육 투여, 복강 투여 또는 이자 등의 장기에 직접 투여와 같은 방식으로 개체에 투여될 수 있다. 생체내 투여를 위하여, 상기 태반 줄기세포는 아래 6.1 단원에서 기술하는 것처럼 약학 조성물 제형으로 만들어질 수 있다.

상기 면역 억제 방법은 하나 또는 그 이상의 면역 억제제를 가하는 단계를 더 포함할 수 있는데, 특히 생체 내 맥락에서 그러하다. 한 실시 태양에서 복수의 태반 줄기세포는 한 개체의 생체 내에서 상기 복수의 면역 세포와 접촉하게 되며, 면역 억제제를 함유하는 조성물이 이 개체에 투여된다. 면역 억제제는 이 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어 항-T 세포 수용체 항체(모노클론 또는 다중클론 또는 항체 조각 또는 그 유도체), 항-IL-2 수용체 항체(예를 들어 Basilizimab(등록상표 Simulect) 또는 daclizumab(등록상표 Zenapax)), 항 T 세포 수용체 항체(Muromonab-CD3 등), 아자티오프린(azathioprine), 코르티코이드계 스테로이드, 사이클로스포린, 타크롤리무스(tacrolimus), 미코페놀산모페틸(mycophenolate mofetil), 시롤리무스(sirolimus), 칼시뉴린 억제제 등이 있다. 특정 실시 태양에서 상기 면역 억제제는 포식 세포 염증 단백질(macrophage inflammatory protein) MIP-1α 또는 MIP-1β에 대한 중화 항체이다. 바람직하게는 상기 항MIP-1α 또는 항MIP-1β 항체는 상기 개체에서 MIP-1α 및/또는 MIP-1β의 양을, 이를 테면 이식 시점에서, 측정 가능한 수준으로 감소시키기에 충분한 양으로 투여된다.

2. 태반 줄기세포와 태반 줄기세포군

본 발명의 면역 억제법은 태반 줄기세포를 이용한다. 즉 태반 혹은 그 일부로부터 얻을 수 있는 줄기세포로서 (1) 조직 배양 기질에 부착하고, (2) 비태반 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖추고 있으며, (3) 충분한 수일 때, CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ 줄기세포가 림프구 혼합 배양 반응에서 증식하는 것 등의 면역 기능을 측정 가능한 정도로 억제하는 능력을 가지는 줄기세포이다. 태반 줄기세포는 태반 혈액 또는 제대혈 등의 혈액에서 유래하지 않는다. 본 발명의 방법과 조성물에서 쓰이는 태반 줄기세포는 개체의 면역계를 억제하는 능력을 갖추고 있으며, 이러한 능력을 가지는 세포가 선택된다.

태반 줄기세포는 태아 또는 모체에서 유래한 것(즉 태아 아니면 모체의 유전형을 띨 수 있음)이다. 태반 줄기세포군 또는 태반 줄기세포를 함유하는 세포군은 오로지 태아 유래 또는 오로지 모체 유래인 태반 줄기세포를 포함할 수 있고, 또 태아와 모체 유래가 섞인 혼합 태반 줄기세포군을 포함할 수도 있다. 상기 태반 줄기세포와 태반 줄기세포를 함유하는 태반 줄기세포군은 아래에 기술하는 형태학적 표지와 배양 특성에 따라 동정되고 선택될 수 있다.

2.1 물리적·형태학적 특성

본 발명에서 사용되는 태반 줄기세포는 1차 배양되거나 세포 배양되었을 때조직 배양 기질, 예를 들어 조직 배양 용기의 표면(조직 배양용 플라스틱 등)에 부착한다. 배양 중인 태반 줄기세포는 일반적으로 섬유모세포 형상이며 별 모양이고 세포체의 중심에서 세포질 돌기가 몇 군데 불거져 나온다. 이 태반 줄기세포는 그러나 같은 조건하에서 배양된 섬유 모세포와 형태학적으로 구별이 가능한데, 태반 줄기세포는 섬유모세포보다 그러한 돌기를 더 많이 나타내기 때문이다. 형태학적으로 태반 줄기세포는 조혈 줄기세포와도 구별할 수 있는데, 조혈 줄기세포는 배양시 더 둥글거나 조약돌 모양을 나타낸다.

2.2 세포 표면, 분자 표지와 유전적 표지

본 발명의 방법과 조성물에 유용한 태반 줄기세포와 태반 줄기세포군은 상기 줄기세포 또는 이 줄기세포를 함유하는 세포군의 동정 및/또는 분리에 쓰일 수 있는 표지를 여러 개 발현한다. 이 태반 줄기세포와 본 발명의 줄기세포군(즉 둘 이상의 태반 줄기세포)은 태반으로부터 직접 얻거나 태반의 어느 일부분(예를 들어 양막, 융모막, 태반의 태반엽 등)에서 얻은 줄기세포와 줄기세포 함유 세포군을 포함한다. 태반 줄기세포군은 또한 배양 중인 태반 줄기세포와 백과 같은 용기 안에 든 세포의 군(즉 둘 이상의 태반 줄기세포)을 포함한다. 태반 줄기세포는 하지만 영양막 세포가 아니다.

태반 줄기세포는 일반적으로 CD73, CD105, CD200, HLA-G 및/또는 OCT-4를 발현하고, CD34, CD38 또는 CD45를 발현하지 않는다. 태반 줄기세포는 또한 HLA-ABC(MHC-1)와 HLA-DR을 발현한다. 이들 표지는 태반 줄기세포를 동정하고 태반 줄기세포를 다른 줄기세포로부터 구별하는데 쓰인다. 상기 태반 줄기세포가 CD73과 CD105를 발현할 수 있기 때문에, 이들은 중간엽 줄기세포와 유사한 특성을 지닐 수 있다. 그러나 이 태반 줄기세포는 태아 특이적 표지인 CD200과 HLA-G를 발현할 수 있기 때문에 중간엽 줄기세포, 예를 들어 골수 유래 중간엽 줄기세포와 같이 CD200과 HLA-G를 발현하지 않는 것들과는 구별할 수 있다. 마찬가지 방식으로 CD34, CD38 및/또는 CD45의 미발현으로부터 이 태반 줄기세포가 비조혈 줄기세포임을 알 수 있다.

한 실시 태양에서 본 발명은 CD200⁺, HLA-G⁺인 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공하는데, 상기 복수의 태반 줄기세포는 MLR 분석에서 T 세포 증식을 측정 가능한 정도로 억제한다. 분리된 세포군에 관한 특정 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 또한 CD73⁺이고 CD105⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 또한 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 더 특정한 실시 태양에서 상기 줄기세포는 또한 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺이고 CD105⁺이다. 다른 실시 태양에서 상기 분리된 세포군은 배아유사체의 형성을 허용하는 조건하에서 배양될 때, 하나 이상의 배아유사체를 발생한다.

본 발명 방법의 다른 실시 태양에서는 CD73⁺, CD105⁺와 CD200⁺인 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공하는데, 상기 복수의 줄기세포는 MLR에서 T 세포의 증식을 측정 가능한 정도로 억제한다. 상기 세포군의 특정 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 또한 HLA-G⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 더욱 특정한 실시 태양에서 상기 줄기세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 세포군은 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때, 하나 이상의 배아유사체를 형성한다.

본 발명은 또한 CD200⁺이고 OCT-4⁺인 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공하는데, 여기서 상기 복수의 줄기세포는 MLR에서 T 세포의 증식을 측정 가능한 정도로 억제한다. 특정 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD73⁺이고 CD105⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 HLA-G⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 CD34^-, CD38^- 이고 CD45^-이다. 다른 더 특정한 실시 태양에서 상기 줄기세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 세포군은 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때,하나 이상의 배아유사체를 형성한다.

본 발명은 또한 CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공하는데, 여기서 상기 복수의 줄기세포는 MLR에서 T 세포의 증식을 측정 가능한 정도로 억제한다. 특정 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 특정 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 OCT-4⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 CD200⁺이다. 다른 더 특정한 실시 태양에서 상기 줄기세포는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺이고 CD200⁺이다.

본 발명은 또한 CD73⁺, CD105⁺인 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공하는데, 여기서 상기 복수의 줄기세포는 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때, 하나 이상의 배아유사체를 형성하고, MLR에서 T 세포의 증식을 측정 가능한 정도로 억제한다. 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 또한 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 또한 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 또한 OCT-4⁺이다. 더 특정한 실시 태양에서 상기 줄기세포는 OCT-4⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다.

본 발명은 또한 OCT-4⁺인 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공하는데, 여기서 상기 복수의 줄기세포는 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 배양하였을 때, 하나 이상의 배아유사체를 형성하고, MLR에서 T 세포의 증식을 측정 가능한 정도로 억제한다. 다양한 실시 태양에서 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%의 상기 분리된 태반 세포는 OCT-4⁺ 줄기세포이다. 상기 세포군의 특정 실시 태양에서, 상기 줄기세포는 CD73⁺이고 CD105⁺이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 또한 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 줄기세포는 CD200⁺이다. 더 특정한 실시 태양에서 상기 줄기세포는 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-이다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 세포군은 증폭된 것, 예를 들어 적어도 한 차례, 적어도 세 차례, 절도 다섯 차례, 적어도 열 차례, 절어도 열다섯 차례, 적어도 스무 차례 계대(passage)된 것이다.

다른 실시 태양에서 본 발명은 CD29⁺, CD44⁺, CD73⁺, CD90⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-이고 CD133^-인 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 세포군을 제공한다.

상술한 태반 줄기세포의 한 구체적 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 IL-6, IL-8과 단핵구 화학주성 단백질(MCP-1)을 구성적으로(constitutively) 분비한다.

각각의 상기 언급한 복수의 태반 줄기세포는 포유류 태반에서 직접 분리하여 얻은 태반 줄기세포 또는 배양되고 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30 또는 그 이상 계대되고 배양된 태반 줄기세포 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

상술한 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포는 적어도 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹ 또는 이보다 많은 수의 태반 줄기세포를 함유하거나, 적어도 이 정도의 줄기세포를 함유하거나, 혹은 이 정도 수 이하의 줄기세포를 함유한다.

2.3 태반 줄기세포군의 선별과 제조

다른 실시 태양에서 본 발명은 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 태반 세포군의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%가 CD200⁺, HLA-G⁺ 태반 줄기세포인 태반 세포군을 선별하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 태반 줄기세포는 T 세포 증식을 MLR 분석에서 측정 가능하게 억제한다. 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD73⁺이면서 CD105⁺인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 CD73⁺, CD105⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성하는 복수의 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다.

다른 실시 태양에서 본 발명은 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%가 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺인 태반 줄기세포를 선별하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 태반 줄기세포는 T 세포 증식을 MLR 분석에서 측정 가능하게 억제한다. 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 HLA-G⁺ 인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 CD34^-, CD38^-, CD45^-이고 HLA-G⁺인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성하는 태반 세포군을 선별하는 것을 더 포함한다.

다른 실시 태양에서 본 발명은 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%가 CD200⁺, OCT-4⁺인 태반 줄기세포를 선별하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 태반 줄기세포는 T 세포 증식을 MLR 분석에서 측정 가능하게 억제한다. 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD73⁺, CD105⁺ 인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 HLA-G⁺인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, CD73⁺, CD105⁺이고 HLA-G⁺인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다.

다른 실시 태양에서 본 발명은 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%가 CD73⁺, CD105⁺, HLA-G⁺인 태반 줄기세포를 선별하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 태반 줄기세포는 T 세포 증식을 MLR 분석에서 측정 가능하게 억제한다. 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD200⁺인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 CD34^-, CD38^-, CD45^-, OCT-4⁺이고 CD200⁺인 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다.

다른 실시 태양에서 본 발명은 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%가 CD73⁺, CD105⁺인 태반 줄기세포를 선별하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 복수의 태반 세포는 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-인 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD34^-, CD38^-이고 CD45^-인 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 OCT-4⁺인 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 OCT-4⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-인 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다.

다른 실시 태양에서 본 발명은 복수의 면역 억제성 태반 줄기세포를 복수의 태반 세포로부터 선별하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 세포의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%가 OCT-4⁺인 줄기세포를 선별하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 복수의 태반 세포는 배아유사체 형성을 허용하는 조건하에서 배양하였을 때 하나 이상의 배아유사체를 형성한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD73⁺이고 CD105⁺인 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 선별 단계는 CD34^-, CD38^- 또는 CD45^-인 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 또한 CD200⁺인 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 선별 단계는 CD73⁺, CD105⁺, CD200⁺, CD34^-, CD38^-, CD45^-인 태반 줄기세포를 선별하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 면역 억제성인 세포군 또는 복수의 태반 줄기 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 세포군의 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 앞서 설명한 복수의 태반 줄기세포 중 아무 것이라도 선별하는 단계, 상기 복수의 태반 줄기세포를 다른 세포, 예를 들어 다른 태반 세포로부터 분리하는 단계를 포함한다. 특정 실시 태양에서, 본 발명은 세포군의 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 태반 세포를 선별하는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 태반 세포는 (a) 기질(substrate)에 부착하며, (b) CD200과 HLA-G를 발현하거나, CD73, CD105와 CD200을 발현하거나, CD200과 OCT-4를 발현하거나 CD73, CD105와 HLA-G를 발현하거나 혹은 CD73과 CD105를 발현하면서, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나,

OCT-4를 발현하면서 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하며, (c) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제한다. 이 방법은 또한 상기 태반 세포를 다른 세포로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다.

더 구체적인 실시 태양에서 본 발명은 세포군의 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 태반 줄기세포를 선별하는 단계를 포함하고, 이때 이 태반 줄기세포는 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD200과 HLA-G를 발현하고 (c) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제한다. 이 방법은 또한 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함한다. 다른 구체적 실시 태양에서 본 발명은 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73, CD105와 CD200을 발현하고 (c) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 선택하는 단계와 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 형성 방법을 제공한다. 다른 특정 실시 태양에서, 본 발명은 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD200과 OCT-4를 발현하고 (c) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 선택하는 단계와 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 형성 방법을 제공한다. 다른 특정 실시 태양에서, 본 발명은 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73과 CD105를 발현하고, (c) 배아유사체 형성이 가능한 조건하에서 배양되었을 때 배아유사체를 형성하며 (d) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 선택하는 단계와 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 형성 방법을 제공한다. 다른 특정 실시 태양에서, 본 발명은 (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73, CD105와 HLA-G를 발현하고 (c) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 선택하는 단계와 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 형성 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 (a) 기질에 부착하면서 (b) OCT-4를 발현하고, (c) 배아유사체 형성이 가능한 조건하에서 배양되었을 때 배아유사체를 형성하며 (d) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 선택하는 단계와 상기 태반 줄기세포를 나머지 세포로부터 분리하여 세포군(cell population)을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 형성 방법을 제공한다.

면역 억제성 태반 줄기세포군을 제조하는 방법의 한 특정 실시 태양에서, 상기 T 세포와 상기 태반 세포는 상기 MLR 속에서 약 5:1의 비율로 포함되어 있다. 이 방법에 사용되는 상기 태반 세포는 온전한 태반으로부터 유래하거나, 혹은 주로 양막, 또는 양막과 융모막으로부터 유래할 수 있다. 다른 특정 실시 태양에서, 이 태반 세포는 상기 MLR 분석에서 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 태반 세포가 없는 경우와 비교하였을 때, 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 억제한다. 이 방법은 다른 면역 세포의 활성, 예를 들어 자연세포독성(NK) 세포의 활성을 억제하는 등의 면역 조절이 가능한 태반 세포군의 선별 및/또는 제조 단계를 더 포함할 수 있다.

2.4 세포 배양하의 성장

본 명세서에서 기술하는 태반 줄기세포의 성장은, 모든 포유류 세포와 마찬가지로 세포 성장용으로 선택한 특정 배지에 부분적으로 달려있다. 최적 조건 하에서 태반 줄기세포는 3~5 일만에 배증하는 것이 전형적이다. 세포 배양 중에 본 발명에 따른 상기 태반 줄기세포는 배양 기질, 예를 들어 조직 배양 용기의 표면(조직 배양 접시 플라스틱, 피브로넥틴 피복 플라스틱 등)에 부착하여 단일 세포층을 이룬다.

본 발명의 태반 줄기세포를 함유하는 분리된 태반 세포군은 적절한 조건 하에서 배양되었을 때 배아유사체(embryoid-like body), 즉 상기 부착 줄기세포층 위로 세포가 자란 3차원적 덩어리를 형성한다. 상기 배아유사체 내부의 세포는 배양 기질에 부착하지 않는 것이 전형적인 경우이고, 이는 본 명세서에서 기술하는 태반 줄기세포도 마찬가지이지만, 배양 도중에서는 부착 세포에 달라붙은 채로 있다. 배아유사체 세포는 생존을 위하여 부착 태반 줄기세포에 의존하는데, 배아유사체는 부착 줄기세포의 부재하에서는 형성되지 않는다. 상기 부착 태반 줄기세포는 따라서 부착 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군 속에서 하나 또는 그 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진한다. 어떤 이론에 구애받고자 하는 것은 아니지만, 이 배아유사체 세포는 배아 줄기세포가 피더(feeder) 세포층 위에 자라는 것처럼 부착 태반 줄기세포 위에서 성장하는 것으로 생각된다. 골수 유래 중간엽 줄기세포 등의 중간엽 줄기세포는 배양시 배아유사체를 형성하지 않는다.

2.5 세포 분화

본 발명의 방법에 유용한 태반 줄기세포는 다른 수임 세포 계통(committed cell lineage)로 세포 분화할 수 있다. 예를 들어, 이 태반 줄기세포는 지방 세포 형성(adipogenic), 연골 형성(chondrogenic), 신경 형성(neurogenic) 또는 골 형성(osteogenic) 세포 계통의 세포로 분화할 수 있다. 이러한 분화는 이 분야 종래 기술의 어떠한 분화 방법, 예를 들어, 골수 유래 중간엽 줄기세포를 비스한 세포 계통으로 분화하는 방법을 이용하여 달성하더라도 무방하다.

3. 태반 줄기세포를 얻는 방법.

3.1 줄기세포 수집용 조성액

본 발명은 나아가 태반 줄기세포를 수집하고 분리하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 줄기세포는 생리학적으로 적합한 용액, 예를 들어 줄기세포 수집용 조성액(stem cell collection composition)을 포유류 태반으로부터 얻게 된다. 줄기세포 수집용 조성액은 2005년 12월 29일자 관련 미국 예비 출원 제60/754,969호 "Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition"에 자세하게 기재되어 있다.

줄기세포 수집용 조성액은 줄기세포의 수집 및/또는 배양에 적당한 모든 생리학적으로 적합한 용액을 함유할 수 있는데, 여기에는 식염수(예를 들어 인산염 완충 식염수, Kreb 용액, 변형 Kreb 용액, Eagle 용액, 0.9% NaCl 등), 배양 배지(DMEM, H.DMEM 등) 등이 있다.

줄기세포 수집용 조성액은 태반 줄기세포를 보존하는 성질이 있는 성분을 하나 이상 갖추고 있을 수 있는데, 보존이란 즉 수집으로부터 시작하여 배양시까지 태반 줄기세포의 사멸을 막거나, 사멸을 지연하거나, 세포군 속에서 사멸하는 태반 줄기세포의 수를 줄이거나 하는 등의 특성이다. 이러한 성분으로는 세포자멸사 억제제(예를 들어 카스파제(caspase) 억제제, JNK 억제제), 혈관 확장제(vasodilator, 예를 들어 황산마그네슘, 혈압 강하제, 심방 나트륨 이뇨 펩티드(atrial natriuretic peptide, ANP), 아드레노코르티코트로핀(adrenocorticotropin), 코르티코트로핀 방출 호르몬, 니트로프러시드나트륨(sodium nitroprusside), 히드랄라진(hydralazine), 아데노신 삼인산, 아데노신, 인도메타신 또는 황산마그네슘, 인산디에스테르 가수분해 효소 억제제 등), 세포 괴사 억제제(예를 들어 2-(1H-인돌-3-일-3-펜틸아미노말레이미드, 디티오카르밤산피롤리딘 또는 클론아제팜), TNF-α 억제제 및/또는 산소 운반성 퍼플루오로카본(브롬화퍼플루오로옥틸, 브롬화퍼플루오로데실 등)을 들 수 있다.

줄기세포 수집용 조성액은 금속단백 분해효소, 세린 단백질 가수분해 효소, 중성 단백질 가수분해 효소, 리보핵산 가수분해효소, 디옥시리보핵산 가수분해 효소 등의 조직 분해 효소를 하나 이상 갖출 수 있다. 이러한 효소에는 콜라겐 분해 효소(예를 들어 콜라겐 분해효소 I, II, III 또는 IV, Clostridium histolyticum 유래 콜라겐 분해 효소 등), 디스파제(dispase), 터모리신(thermolysis), 엘라스타제, 트립신, 리버라제(LIBERASE), 히알루로니다제(hyaluronidase) 등이 포함되지만 이들로 한정되는 것은 아니다.

줄기세포 수집용 조성액은 살균 또는 정균(靜菌 bacteriostatic) 용도에 유효한 분량의 항생제를 포함할 수 있다. 몇몇 비제한적 실시 태양에서, 이 항생제는 마크롤리드(macrolide, 예를 들어 토브라마이신(tobramycin)), 세팔로스포린(세팔렉신(cephalexin), 세프라딘(cephradine), 세프록심(cefuroxime), 세프로질(cefprozil), 세파클로(cefaclor), 세픽심(cefixime) 또는 세파드록실(cefadroxil), 클라리트로마이신(clarithromycin), 에리드로마이신, 페니실린(페니실린 V 등) 또는 퀴놀론(오플록사신(ofloxacin), 시프로플락신(ciproflaxin) 또는 노르플록사신(norfloxacin)), 테트라사이클린, 스트렙토마이신이다. 특정 실시 태양에서, 이 항생제는 그램 양성 및/또는 그램 음성 세균, 예를 들어 Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus 등에 대한 활성이 있다.

줄기세포 수집용 조성액은 다음 화합물을 하나 이상 갖추고 있을 수 있다:

아데노신(약 1 mM에서 약 50 mM로), D-포도당(약 20 mM에서 약 100 mM), 마그네슘 이온(약 1 mM에서 약 50 mM), 분자량 20,000 달톤을 넘는 거대분자(예를 들어 합성 또는 천연 콜로이드, 덱스트란 등의 다당류 도는 폴리에틸렌 글리콜)로서 한 실시 태양에서는 내피의 정상적인 상태와 세포 생존능을 유지하기에 충분한 분량(약 25 g/L에서 약 100 g/L, 또는 약 40 g/L에서 약 60 g/L), 항산화제(예를 들어 약 25 μM 내지 약 100 μM 농도의 부틸화 수산화아니솔, 부틸화 수산화톨루엔, 글루타티온, 비타민 C 또는 비타민 E), 환원제(약 0.1 mM 내지 약 5 mM 농도의 N-아세틸시스테인), 세포로의 칼슘 유입을 방지하는 제제(약 2 μM 내지 약 25 μM의 베라파밀(verapamil)), 니트로글리세린(예를 들어 약 0.05 g/L 내지 약 0.2 g/L), 항응고제로서 한 실시 태양에서는 잔류 혈액의 응고를 막기에 충분한 양(예를 들어 헤파린 또는 히루딘 약 1000 단위/L 내지 약 100,000 단위/L), 또는 아밀로리드(amiloride) 함유 화합물(예를 들어 아밀로리드, 아밀로리드에틸이소프로필, 아밀로리드헥사메틸렌, 아밀로리드디메틸 또는 아밀로리드이소부틸 약 1.0 μM 내지 약 5 μM).

3.2 태반의 수집과 취급

일반적으로 사람 태반은 출산 후 태반을 압박 방출한 직후에 회수된다. 바람직한 실시 태양에서 이러한 태반은 환자의 완전한 병력을 얻은 후 이를 그 태반에 연관지은 다음 환자에게 충분한 설명 이후 동의를 받아서 회수된다. 이러한 병력 기록은 분만 이후에도 계속 기록되는 것이 바람직하다. 이러한 병력 기록은 태반 또는 그로부터 얻은 줄기세포의 후속 이용을 조화시키는데 쓰일 수 있다. 예를 들어, 살마 태반 줄기세포는 병력을 감안하여, 상기 태반에 관련된 신생아 또는 그 신생아의 부모, 형제나 다른 친척의 개인화된 의료(personalized medicine)에 쓰일 수 있다.

태반 줄기세포의 회수 전에 제대혈과 태반 혈액을 제거하게 된다. 몇몇 실시 태양에서 분만 후 태반 속 제대혈을 제거하게 된다. 이러한 태반에 대해서는 통상적인 제대혈 회수 방법을 사용할 수 있다. 바늘 또는 카뉼라(cannula)를 써서, 중력을 이용하여 태반을 실혈(exsanguination)하는 것이 전형적이다(Anderson의 미국 특허 제5,372,581호, Hessel 외 미국 특허 제5,415,665호를 보라). 이 바늘 또는 카뉼라는 탯줄 정맥에 대개 놓이고 되고, 태반을 부드럽게 마사지하여 제대혈이 태반으로부터 빠져나오는 것을 돕는다. 이러한 제대혈 회수법은 상업적으로, 예를 들어 미국 뉴저지주 Cdear Knolls의 LifeBank Inc., ViaCord, Cord Blood Registry나 Cryocell을 통하여 이루어질 수 있다. 바람직하게는, 이러한 태반을 다른 조작 없이 중력만으로 방혈시켜 제대혈 회수 과정에서의 조직 손상을 최소화한다.

태반은 제대혈을 회수하고 줄기세포를 수집하기 위한 예를 들어 관류 또는 조직 분리를 위하여 분만 장소나 분만실로부터 다른 장소, 예를 들어 실험실로 운반되는 것이 전형적인 경우이다. 이러한 태반은 멸균되고, 단열된 운반 장비(태반 온도를 20~28℃로 유지), 예를 들어 멸균 집록(zip-lock) 플라스틱백에 태아에 가까운 부위의 탯줄을 집게로 집은 태반을 단열 용기에 담아서 운반되는 것이 바람직하다. 다른 실시 태양에서 이러한 태반은 2005년 9월 19일 출원 미국 특허 출원 제11/230,760에 기술된 것과 실질적으로 같은 제대혈 수집 키트에 담겨 운반된다. 이 태반은 분만 후 4~24 시간 안에 실험실로 운반되는 것이 바람직하다. 몇몇 실시 태양에서 태아에 가까운 쪽 탯줄을 집게로 집게 되는데, 이때 제대혈 회수 전에 태반 원반(placental disk)의 삽입 지점으로부터 4~5 cm 내 위치를 집는 것이 바람직하다. 다른 실시 태양에서 태아에 가까운 쪽 탯줄은 제대혈 회수 후이고 태반의 후속 처리 전에 집게로 집히게 된다.

줄기세포 수집 전에 태반을 멸균 조건에서 실온 또는 5~25℃의 온도에서 저장할 수 있다. 이러한 태반은 48 시간보다 더 긴 기간 동안 저장될 수도 있으며, 바람직하게는 잔류 제대혈을 모두 제거하기 위한 태반 관류 4~24 시간 전까지 저장하게 된다. 이 태반은 5~25℃ 온도에서 항응고제 용액 속에 저장되는 것이 바람직하다. 적절한 항응고제 용액은 이 분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 헤파린 또는 워페린나트륨(warfarin sodium)을 쓸 수 있다. 바람직한 실시 태양에서, 이 항응고제 용액은 헤파린 용액(예를 들어 1:1000 희석 용액에서 1% w/w)을 포함한다. 이렇게 실혈된 태반의 저장 시간은 태반 줄기세포를 수집하기 36 시간 전을 넘기지 않는 것이 바람직하다.

위에 기술한 취지대로 수집과 준비를 마친 포유류 태반 또는 그의 일부분으로부터 종래 기술에 따른 모든 방법, 예를 들어 관류 또는 하나 이상의 조직 파괴 효소를 이용한 소화 등의 파괴에 의하여 줄기세포를 얻을 수 있다.

3.3 태반 조직의 물리적 파괴와 효소 소화

한 실시 태양에서, 줄기세포는 물리적 파괴, 예를 들어 태반의 효소 소화에 의하여 포유류 태반으로부터 얻어진다. 본 발명에 따른 줄기세포 수집용 조성액에 접촉하고 있는 채로이 태반 또는 그 일부분을 예를 들어, 갈거나, 잡아 떼거나, 저미거나, 네모난 조각으로 썰거나, 잘게 썰거나, 액체에 담그어 연화시키는 등으로 처리할 수 있고 이어 하나 이상의 효소로 조직을 소화할 수 있다. 이러한 태반 또는 그 일부분을 하나 이상의 효소로 물리적으로 파괴하고 소화하여, 얻은 물질을 본 발명의 상기 줄기세포 수집용 조성액에 담그거나 섞을 수 있다. 예를 들어 트리판블루 배제법에 의하여 측정한 상기 장기 속의 세포 중 생존 세포 비율이 다수인 한, 바람직하게는 과반수인 한, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%인 한 어떠한 물리적 파괴법도 사용할 수 있다.

태반은 물리적 파괴 및/또는 효소 소화와 줄기세포 회수 단계 전에 구성 성분들로 나뉠 수 있다. 예를 들어, 태반 줄기세포는 양막, 융모막, 태반엽, 또는 이들의 모든 조합으로부터 얻을 수 있다. 태반 줄기세포는 양막과 융모막을 함유한 태반 조직에서 얻는 것이 바람직하다. 태반 줄기세포는 태반 조직의 작은 덩어리, 예를 들어 부피가 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80. 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1000 ㎣인 태반 조직의 덩어리를 파괴하여 얻는 것이 전형적인 경우이다.

바람직한 줄기세포 수집용 조성액은 조직 파괴 효소를 하나 이상 갖추고 있다. 효소 소화는 여러 효소의 조합, 예를 들어 매트릭스 금속단백 분해 효소와 중성 단백질 분해 효소나 예를 들어 콜라겐 분해 효소와 디스파제의 조합을 이용하면 바람직하다. 한 실시 태양에서 태반 조직의 효소 소화에서는 금속단백 분해 효소, 중성 단백 분해 효소, 히알루론산의 소화를 위한 콜라겐 분해 효소의 조합과 같은 점액 용해성(mucolytic) 효소, 디스파제와 히알루로니다제 또는 LIBERASE(미국 인디아나주 인디아나폴리스 소재 베링거 만하임 회사)과 히알루로니다제의 조합으로 이루어진 효소 조합을 사용한다. 태반 조직 파괴에 쓰일 수 있는 다른 효소로는 파파인, 디옥시리보핵산 가수분해효소, 트립신, 키모트립신 또는 엘라스타제와 같은 세린 단백 분해 효소를 들 수 있다. 세린 단백 분해 효소는 혈청 속 알파-2-마이크로글로불린에 의하여 억제될 수 있으므로 소화에 사용되는 배지는 혈청이 포함되어 있지 않아야 한다. EDTA와 디옥시리보핵산 분해 효소는 세포 회수율을 높이기 위하여 효소 소화에 흔히 사용된다. 끈적한 소화물 속에 줄기세포가 갇히는 일을 막기 위하여 소화물을 희석하는 것이 바람직하다.

조직 소화 효소의 모든 조합 역시 사용될 수 있다. 조직 소화 효소의 전형적인 농도로는 예를 들어 콜라겐 분해 효소 I과 IV의 경우 50~200 단위/mL, 디스파제의 경우 10 단위/mL, 엘라스타제의 경우 10~100 단위/mL을 들 수 있다. 태반 줄기세포를 방출하기 위하여 단백질 분해 효소를 조합하여, 즉 둘 이상의 단백질 분해 효소를 같은 효소 소화 반응에 사용하거나, 순서대로 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 실시 태양에서는 태반 또는 그 일부분을 30 분 동안 적절한 양의 2 mg/mL 콜라겐 분해 효소 I로 먼저 소화시킨 다음, 37℃에서 10 분 동안 0.25% 트립신으로 소화한다. 다른 효소를 사용한 다음 이어서 세린 단백 분해 효소를 이용하는 것이 바람직하다.

다른 실시 태양에서 상기 줄기세포를 함유하는 상기 줄기세포 수집용 조성액 또는 줄기세포 수집용 조성액에서 줄기세포를 분리하기 전에 이 조직을 파괴 및/또는 소화한 용액에, 킬레이트제, 예를 들어 에틸렌글리콜 비스(2-아미노에틸에테르)-N,N, N' , N'-테트라아세트산(EGTA) 또는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 가하여 이 조직을 더 파괴할 수 있다.

온전한 태반 또는 태아와 모체 세포 양쪽을 포함하는 그 태반의 일부(예를 들어, 태반에서 융모막과 태반엽을 함유하는 부분)를 이용하는 경우, 수집한 상기 태반 줄기세포는 모체와 태아 양쪽에서 유래한 태반 줄기세포를 포함한다는 것을 이해할 필요가 있다. 모체 세포(양막 등)를 전혀 가지고 있지 않거나 또는 무시할 수 있는 정도로 가지고 있는 태반의 일부분이 쓰인 경우는 수집한 상기 태반 줄기세포가 거의 전적으로 태아 태반 줄기세포이다.

3.4 태반 관류

태반 줄기세포는 또한 포유류 태반을 관류하여 얻을 수 있다. 포유류 태반을 관류하여 줄기세포를 얻는 방법, 예를 들어 Hariri의 미국 출원 공보 제2002/0123141호와 2005년 12월 29일자의 관련 미국 예비출원 제60/754,969호 "Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition"에 개시되어 있다.

태반 줄기세포는 관류, 이를 테면 관류 용액으로서 줄기세포 수집용 조성액을 이용하여 태반 혈관계를 관통하여 이루어질 수 있다. 한 실시 태양에서는 배꼽 동맥과 배꼽 정맥 중 어느 한쪽 또는 양쪽에 관류 용액을 흘려보냄으로써 포유류 태반을 관류할 수 있다. 관류 용액을 태반에 흘려보내는 것은 예를 들어 중력을 이용하여 태반으로 흐르게 함으로써 이룰 수 있다. 바람직하게는, 이 관류 용액을 연동(連動 peristaltic) 펌프 등의 펌프를 이용하여 강제로 태반에 주입한다. 배꼽 정맥은 예를 들어 멸균 도관(tubing)과 같은 살균된 연결부에 이어진 테플론 또는 플라스틱 재질 카뉼라 등의 카뉼라로 삽관될 수 있다. 이러한 살균된 연결부는 관류 매니폴드(manifold)에 연결된다.

관류를 준비하면서 태반은 배꼽 동맥과 배꼽 정맥이 태반의 가장 높은 지점에 자리하도록 놓는(예를 들어 매달아 두는) 것이 바람직하다. 이 태반은 본 발명의 줄기세포 수집용 조성액 등의 관류 용액을 태반 혈관계 또는 태반 혈관계와 주변 조직에 통과시켜 관류할 수 있다. 한 실시 태양에서는 배꼽 동맥과 배꼽 정맥이 동시에 피펫에 연결되어 있는데, 이 피펫은 유연한 연결부를 통하여 관류 용액 저장소에 이어져 있다. 이 관류 용액은 배꼽 정맥과 동맥으로 흘러간다. 이 관류 용액은 상기 혈관들로부터 태반 주변 조직으로 스며나오고/스며나오거나 이들 혈관을 따라 주변 조직으로 흘러들어가며, 태반 표면으로부터 임신 도중 자궁에 붙인 적당한 열린 용기 속에 모이게 된다. 이 관류 용액은 한편 탯줄의 구멍을 통하여 주입할 수도 있으며, 모체 자궁벽에 접하고 있는 태반의 벽에 있는 구멍 속으로 흘러들어가거나 구멍으로부터 걸러나올 수 있다. 다른 실시 태양에서는 이 관류 용액으로 하여금 배꼽 정맥을 지나게 하여 배꼽 동맥에서 모으거나 배꼽 동맥을 지나게 하여 배꼽 정맥에서 모을 수 있다.

한 실시 태양에서 태아쪽 탯줄은 관류 동안 집게로 집히게 되며, 더 바람직하게는 태반 원반에 탯줄이 삽입되는 지점에서 4~5 cm 이내 위치에서 집게로 집히게 된다.

실혈(exsanguination) 과정에서 포유류 태반으로부터 처음 얻은 관류액은 제대혈 및/또는 태반 혈액의 잔류 적혈구 때문에 색깔을 띠는 것이 일반적이다. 이 관류액은 관류가 진행됨에 따라서 색깔이 옅어지며, 잔류 제대혈 세포들은 태반에서 씻겨 나간다. 일반적으로 태반을 처음에 실혈하는데는 30에서 100 mL의 관류액이면 충분하지만 관측된 결과에 따라 관류액의 양을 가감할 수 있다.

태반 줄기세포를 수집하는데 쓰이는 관류액의 양은 수집할 줄기세포의 수, 태반의 크기, 한 태반에서 수집할 회수 등에 따라 달라진다. 많은 실시 태양에서, 관류액의 양은 50 mL 내지 5000 mL, 50 mL 내지 4000 mL, 50 mL 내지 3000 mL, 100 mL 내지 2000 mL, 250 mL 내지 2000 mL, 500 mL 내지 2000 mL 또는 750 mL 내지 2000 mL이다. 실혈 후 700~800 mL의 관류액으로 태반을 관류하는 것이 전형적인 경우이다.

태반을 여러 시간 또는 여러 날에 걸쳐서 여러 번 관류할 수 있다. 여러 번 태반을 관류하는 경우, 무균 조건하의 용기 또는 적절한 담체 속에서 태반을 유지하고 배양하고 항응고제(예를 들어 헤파린, 워페린나트륨, 쿠마린, 비스히드록시쿠마린)를 포함하거나 포함하지 않은 줄기세포 수집용 조성액 또는 표준 관류 용액(예를 들어 인산염 완충 식염수(PBS)와 같은 정상적인 식염수)으로 관류할 수 있는데, 이 조성액 또는 관류 용액은 항생제(예를 들어 β-메르캅토에탄올(0.1 mM), 스트렙토마이신(예를 들어 40~100 μg/mL 농도로), 페니실린(예를 들어 40 단위/mL), 암포테리신 B(예를 들어 0.5 μg/mL))를 더 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 한 실시 태양에서 분리된 태반은 관류된 액체를 수집하지 않은 채로 일정 기간 유지되거나 배양되는데, 여기서 이 태반은 관류와 관류물 수집 이전에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간 동안, 혹은 이틀, 사흘 또는 더 오랜 동안 유지되거나 배양된다. 이렇게 관류된 태반은 한 번 또는 여러 번에 걸쳐 유지될 수 있는데, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24 시간 동안 혹은 더 오랜 동안 유지할 수 있고, 이어서 두 번째 관류, 예를 들어 700~800 mL의 관류액으로 관류될 수 있다. 이 태반을 1, 2, 3, 4, 5회 또는 더 많이 관류할 수 있는데, 예를 들어 매 1, 2, 3, 4, 5 또는 6시간마다 관류할 수 있다. 바람직한 실시 태양에서 이러한 태반의 관류와 관류 용액, 예를 들어 줄기세포 수집용 조성액의 수집은 회수한 유핵 세포 수가 100 세포/mL보다 아래로 떨어질 때까지 반복된다. 서로 다른 시점에서 얻은 관류물을 개별적으로 더 처리하여 시간 의존적인 세포군, 예를 들어 줄기세포군을 회수할 수도 있다. 서로 다른 시점에서 얻은 관류물을 한 데 모을 수도 있다.

특정 이론에 구애받고자 하는 것은 아니지만, 태반을 실혈하 충분한 시간 동안 관류한 다음에 태반 줄기세포는 실혈되고 관류된 태반의 미세혈액순환 속으로 옮겨가서 본 발명의 방법에 따라 채집되는 것으로 생각되는데, 채집은 관류에 의하여 수집 용기 속으로 씻어넣는 방식이 바람직하다. 분리된 태반을 관류하면 잔류 제대혈을 제거할 수 있을 뿐 아니라 태반에 산소를 포함하는 적절한 양분을 공급할 수 있다. 이 태반은 배양되거나 제대혈을 제거하는데 쓰인 것과 유사한 용액으로 관류될 수 있는데, 이 용액에는 항응고제를 넣지 않는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법으로 관류하면 포유류 태반을 상기 용액으로 관류하지 않고, 줄기세포를 얻기 위하여 다른 처리(예를 들어 효소 소화 등의 조직 파괴)를 하지도 않은 경우와 견주었을 때보다 유의미하게 더 많은 수의 줄기세포를 포유류 태반에서 얻을 수 있다. 여기서 "유의미하게 더 많은"이란 적어도 10% 이상 더 많은 것을 뜻한다. 본 발명에 따라 관류하면 유의미하게 더 많은 태반 줄기세포를 얻을 수 있는데, 예를 들어 태반 또는 그 일부분이 배양된 배양 배지로부터 djedfm 수 있는 태반 줄기세포 수보다 더 많다.

줄기세포는 하나 이상의 단백 분해 효소 또는 다른 조직 파괴성 효소를 갖추고 있는 용액으로 관류하여 분리할 수 있다. 특정 실시 태양에서, 태반 또는 그 일부분(예를 들어 양막, 양막과 융모막, 태반 소엽(placental lobule) 또는 태반엽 혹은 이들의 모든 조합)의 온도는 25~37℃로 조절되고, 이를 200 mL의 배양 배지 속에서 하나 이상의 조직 파괴성 효소와 30 분 동안 배양하게 된다. 이 관류물로부터 세포를 수집하고, 4℃로 식힌 다음, 5 mM EDTA, 2 mM 디티오트레이톨과 2 mM 베타메르캅토에탄롤을 함유하는 차가운 억제제 혼합물로 세척한다. 몇 분 후 줄기세포를 찬(예를 들어 4℃) 본 발명의 줄기세포 수집용 조성액으로 세척한다.

이러한 걸러냄(pan) 방식, 즉 관류물이 태반의 모체쪽을 통하여 스며나오면 이를 수집하는 방식은 모체와 태아세포가 섞여 나오게 된다는 것을 이해할 필요가 있다. 그 결과, 이 방법에 의하여 수집한 세포는 태아와 모체 유래 태반 줄기세포를 모두 가지는 혼합 집단을 포함한다 반면에 오로지 태반 혈관계만을 통하여 관류하는 방식에서는 관류액을 하나나 두 개의 태반 혈관을 따라 흘려 보내게 되고 남아 있는 혈관을 통하여 이를 수집하게 되는데, 이 방식은 거의 전적으로 태아에서 유래한 태반 줄기세포군을 얻게 하여 준다.

3.5 태반 줄기세포의 분리, 분류와 특성 파악

효소 소화 방식이건 관류에 의하여 얻은 것이건 관계 없이, 포유류 태반에서 얻은 줄기세포는 처음에 피콜(Ficoll) 농도구배 원심분리를 하여 다른 세포로부터 정제할 수 있다. 이러한 원심분리는 원심분리 속도 등에 관한 모든 표준적인 실험 방법에 따라 이루어질 수 있다. 예를 들어 한 실시 태양에서는 태반에서 수집한 세포를 관류물에서 5000×g로 15분 동안 실온에서 원심분리하여 회수하는데, 이러한 원심분리로 파편이나 혈소판 등으로부터 줄기세포를 분리해낸다. 다른 실시 태양에서 태반 관류물은 약 200 mL로 농축되어, 피콜 위에 가해져 층을 이루고, 22℃에서 20분 동안 약 1100×g로 원심분리되어, 세포의 저밀도 계면층을 후속 처리를 위하여 수집하게 된다.

세포 펠렛은 신선한 줄기세포 수집용 조성액 또는 줄기세포 유지에 적합한 배지, 예를 들어 2 단위/mL 헤파린과 2 mM EDTA(미국 뉴욕주 GibcoBRL)를 함유한 IMDM 무혈청 배지에 재현탁된다. 단핵 세포 총분획을 Lymphoprep(노르웨이 오슬로Nicomed Pharma사) 등으로 (제조사의 설명에 따라) 분리한다.

본 명세서에서 태반 줄기세포의 "분리"란 처리하지 않은 포유류 태반 속에서 줄기세포와 정상적으로 결부되어 있는 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%를 제거하는 것을 뜻한다. 한 장기에서 얻은 줄기세포를 포함하는 세포군은 처리하지 않은 상태의 그 장기 속에서 그 줄기세포와 정상적으로 결부되어 있는 다른 세포가 전체 세포의 50% 미만일 때 "분리"되었다고 할 수 있다.

관류나 소화에 의하여 얻은 태반 세포는 예를 들어 차등 트립신 처리(differential trypsinization)로 더 분리되거나, 처음에 이를 이용하여 분리할 수 있는데, 여기서는 0.2% EDTA(미국 미주리주 세인트루이스 Sigma사)를 함유한 0.05% 트립신 용액을 사용한다. 차등 트립신 처리는 태반 줄기세포가 플라스틱 표면으로부터 약 5분 이내에 탈착하는데 반하여 다른 부착 세포군은 20~30 분보다 더 많은 배양 시간을 요하는 것이 전형적인 경우이기 때문에 가능하다. 탈착된 태반 줄기세포는 트립산 처리와 트립신 중화 용액(Cambrex사의 TNS) 등을 이용한 트립신 중화 처리 후에 수집할 수 있다. 부착 세포를 분리하는 한 실시 태양에서는 예를 들어, 5~10×10⁶ 개의 세포를 담은 분액을 여러 개의 T-75 플라스크에 각각 나누어 담게 되는데, 피브로넥틴 피복 T-75 플라스크가 바람직하다. 이 실시 태양에서는 세포를 시판되는 중간엽 줄기세포 성장 배지(Cambrex사의 MSCGM)으로 배양하고 조직 배양기(37℃, 5% CO₂) 속에 놓을 수 있다. 10~15 일 후 PBS 세척으로 비부착 세포를 상기 플라스크로부터 제거한다. 이어 PBS를 MSCGM으로 대체한다. 바람직하게는 플라스크를 날마다 점검하여 다양한 부착 세포 유형을 확인하는데, 특히, 섬유모세포 유형의 세포를 확인하고 세포군의 증폭 여부를 점검한다.

포유류 태반에서 수집한 세포의 수와 종류는 예를 들어 흐름세포 측정법, 세포 분류법, 면역세포화학(예를 들어 조직 특이적 또는 세포 표지 특이적 항체로 세포를 염색하는 것), 형광표지 세포 분리(FACS), 자기 활성화 세포 분류(magnetic activated cell sorting, MACS)와 같은 표준적인 세포 검출법을 이용한 세포 형태와 세포 표면 표지의 변화를 측정함으로써, 빛이나 공초점 현미경을 이용한 세포 형태 분석 및/또는 PCR과 유전자 발현 분석(profiling) 등의 공지 기술을 이용한 유전자 발현 변화 측정으로써 감시할 수 있다. 이러한 방법은 하나 또는 그 이상 의 특정 표지에 대하여 양성인 세포를 확인하는데에도 쓰일 수 있다. 예를 들어 상기 방법에 따라 CD34에 대한 항체를 이용하면 어느 세포가 CD34를 측정 가능한 양으로 함유하는지 알 수 있는데, 그러할 경우 이 세포는 CD34⁺이다. 마찬가지로 어느 세포가 역전사 PCR로 측정할 수 있는 양의 OCT-4 RNA를 생산하거나, 성체 세포보다 유의미하게 더 많은 양의 OCT-4 RNA를 생산하는 경우, 이 세포는 OCT-4⁺이다. 세포 표면 표지(예를 들어 CD34와 같은 CD 표지)와 OCT-4와 같이 줄기세포에 특이적인 유전자의 서열은 이 분야에 잘 알려져 있다.

태반 세포, 특히 피콜 분리, 차등 부착 또는 이들을 조합하여 분리한 세포는 형광표지 세포 분리 장치(FACS)를 이용하여 분류할 수 있다. FACS는 세포를 포함한 입자를 분류하는 공지의 방법으로서, 입자의 형광 특성에 바탕을 두고 있다(Kamarch의 Methods Enzymol, 151:150~165(1987)). 개별 입자의 형광부를 레이저로 들뜨게 하면 작은 전하가 발생하여 양과 음의 입자를 혼합물로부터 전자기적으로 분리할 수 있다. 한 실시 태양에서는 세포 표면 표지에 특이적인 항체 또는 리간드를 서로 다른 형광 표지로 표지한다. 이어서 사용된 항체에 결합하는지 여부에 따라 세포를 세포 분리기로 처리하여 분리한다. FACS로 분류된 입자들은 분리와 클로닝을 더 용이하게 하기 위하여 곧바로 96-웰 또는 384-웰 플레이트의 개별 웰 속으로 운반될 수 있다.

한 세포 분류법에서는 태반에서 온 줄기세포를 CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD105, OCT-4 및/또는 HLA-G 표지의 발현 여부에 따라 분류한다. 이러한 분류는 배양시 세포 부착 특성에 따라 줄기세포를 선별하는 방법과 함께 이루어질 수도 있다. 예를 들어 세포 부착 선별 단계는 표면 표지 발현에 따른 세포 분류 단계 전 또는 후에 수행할 수 있다. 일례로 한 실시 태양에서는 세포를 먼저 CD34의 발현 여부에 따라 분류하는데, CD34^- 세포는 남기고, CD200⁺HLA-G⁺인 세포는 다른 모든 CD34^- 세포로부터 분리한다. 다른 실시 태양에서는 태반에서 얻은 세포를 CD200 및/또는 HLA-G 표지의 발현 여부에 따라 분류하는데, 예를 들어 이들 표지 중 어느 하나라도 나타내는 세포는 후속 용도를 위하여 분리한다. 특정 실시 태양에서는 예를 들어 CD73 및/또는 CD105의 발현 여부 혹은 항체 SH2, SH3 또는 SH4가 인식하는 항원 결정기의 존부 또는 CD34, CD38 또는 CD45의 미발현 여부에 따라 CD200 및/또는 HLA-G를 발현하는 세포를 추가적으로 분류할 수 있다. 한 실시 태양에서는 예를 들어, 태반 세포를 CD200, HLA-G, CD73, CD105, CD34, CD38과 CD45의 발현 또는 미발현에 의거하여 분류하고, CD200⁺, HLA-G⁺, CD73⁺, CD105⁺, CD34^-, CD38^-이고 CD45^-인 태반 세포를 후속 용도를 위하여 다른 태반 세포로부터 분리한다.

한 실시 태양에서는 자기 비드를 이용하여 세포를 분리한다. 입자가 자기 비드(지름 0.5~100 ㎛)에 결합하는 능력에 따라 입자를 분리하는 방법인 자기 활성화 세포 분류(MACS)에 의하여 이 세포들을 분류할 수 있다. 이 자성의 미세구에는 유용한 변형을 다양하게 가할 수 있는데, 특정 세포 표면 분자 또는 불완전 항원(hapten)을 인식하는 항체를 공유 결합으로 연결하는 것 역시 이 변형에 포함된다. 이어서 이러한 비드를 세포와 섞어 주어 결합을 유도한다. 이 세포를 자기장 속에 통과시켜 특정 세포 표면 표지를 가지는 세포를 분리해 낸다. 한 실시 태양에서는 이들 세포를 이어서 분리한 다음 다른 세포 표면 표지들에 특이적인 항체와 결합한 자기 비드와 다시 섞어주게 된다. 이들 세포를 다시 자기장 속에 통과시켜 상기 항체 양쪽에 결합한 세포를 분리한다. 이러한 세포는 클론 분리를 위하여 각각의 미량역가판(microtiter dish)에 희석해 넣을 수 있다.

한편 세포 형태와 성장 특성을 바탕으로 하여 태반 세포를 특성화 및/또는 분류할 수 있다. 예를 들어 태반 세포는 배아시 섬유모세포 유사(fibroblastoid) 형상을 나타내는 것으로 특성 파악 및/또는 상기 유사 형상을 근거로 선별될 수 있다. 태반 줄기세포는 또한 배아유사체 형성 능력에 따라 특성 파악 및/또는 선별할 수 있다. 예를 들어 한 실시 태양에서는, 섬유모세포 유사 형상이고, CD73 및CD105를 발현하며, 배양시 하나 또는 그 이상의 배아유사체를 형성하는 태반 세포를 나머지 태반 세포로부터 분리한다. 다른 실시 태양에서는, 배양시 하나 이상의 배아유사체를 생성하는 OCT-4⁺ 태반 세포를 나머지 태반 세포로부터 분리한다.

다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 콜로니 형성 단위 분석(colony forming unit assay)를 이용하여 확인하고 특성 파악하게 된다. 콜로니 형성 단위 분석은 이 분양에서 널리 알려져 있는데, Mesen Cult(캐나다 브리티시 콜럼비아 주 밴쿠버의 Stem Cell Technologies, Inc.의 상표) 배양 배지를 예로 들 수 있다.

태반 줄기세포의 생존능, 증식 잠재성과 수명은 이 분야에 알려진 표준적인 기법을 이용하여 평가할 수 있는데, 이들 기법의 예는 다음과 같다: 트리판블루 배제 분석, 디아세트산플루오레사인 흡수 분석, (생존능 평가를 위한)요오드화프로피듐 흡수 분석, 티미딘 흡수 분석, (증식을 평가하는)MTT 세포 증식 분석. 수명도 장기 배양시 세포군 배증의 최대값을 측정하는 등의 이 분야에 잘 알려진 방법으로 알아낼 수 있다.

태반 줄기세포는 이 분야에 잘 알려진 기법을 이용하여 나머지 태반 세포로부터 분리할 수 있는데, 이러한 기법은 다음과 같은 것이 있다: 원하는 세포의 선택적인 성장(적극적 선별), 원하지 않는 세포의 선택적 파괴(소극적 선별), 대두 응집소(agglutinin) 등에 대한 혼합 세포군 내의 차별적 응집성에 바탕을 둔 분리법, 냉동-해동 과정, 여과, 통상적인 원심분리와 구역 원심분리, 원심분리 세정(centrifugal elutriation, counter-streaming centrifugation), 단위 중량(unit gravity) 분리, 대향류 분포법(countercurrent distribution), 전기 영동 등.

4. 태반 줄기세포의 배양

4.1 배양 배지( Culture media )

분리된 태반 줄기세포 또는 태반 줄기세포군 또는 태반 줄기세포가 자라나오는 태반 조직은 세포 배양을 개시하거나 파종하는데 쓰일 수 있다. 세포는 라미닌, 콜라겐(예를 들어 천연 또는 변성), 젤라틴, 피브로넥틴, 오르니틴, 비트로넥틴과 세포외 막 단백질(미국 매사추세츠주 Bedford의 BD Discovery Labware사의 MATRIGEL)과 같은 세포외 매트릭스 또는 리간드로 피복되거나 무피복인 무균 조직 배양 용기로 옮겨진다.

이 분야에서 줄기세포 배양 용도로 적합하다고 인정받은 모든 배양 배지 또는 배양 조건을 이용하여 태반 줄기세포를 배양할 수 있다. 배양 배지는 혈청을 함유하는 것이 바람직하다. 태반 줄기세포는 예를 들어 다음 배양 배지를 이용할 수 있다: ITS(인슐린-트랜스페린-셀렌) 함유 DMEM-LG(Dulbecco's Modified Essential Medium, 저포도당)/MCDB 201(병아리 섬유모세포 기저(basal) 배지), LA+BSA(리놀레산+소 혈청 알부민), 포도당, L-아스코르브산, PDGF, EGF, IGF-I와 페니실린/스트렙토마이신

: 10% 소 태아 혈청(FBS) 함유 DMEM-HG(고 포도당), 15% FBS 함유 DMEM-HG, 10% FBS 함유 IMDM (Iscove 변형 Dulbecco 배지), 10% 말 혈청과 하이드로코르티손

: 10% FBS 함유 Ml99, EGF와 헤파린

: 10% FBS 함유 [α]-MEM(최소 필수 배지), 글루타맥스(상표)와 겐타마이신

: 10% FBS 함유 DMEM, 글루타맥스와 겐타마이신 등.

바람직한 배지는 2% FBS 함유 DMEM-LG/MCDB-201, ITS, LA+BSA, 포도당, L-아스코르브산, PDGF, EGF와 페니실린/스트렙토마이신이다.

태반 줄기세포 배양에 쓰일 수 있는 다른 배양 배지에는 DMEM(고농도 또는 저농도의 포도당), Eagle 기본 배지, Ham FlO 배지(FlO), Ham F-12 배지(F12), Iscove 변형 Dulbecco 배지, 중간엽 줄기세포 성장 배지(MSCGM), Liebovitz L-15 배지, MCDB, DMIEM/F12, RPMI 1640, 개량 DMEM (Gibco), DMEM/MCDB201(시그마사)와 CELL-GRO FREE가 포함된다.

이 배양 배지는 하나 또는 그 이상의 성분을 보충받을 수 있는데 이러한 성분으로는 혈청[예를 들어 바람직하게는 약 2~15%(v/v)인 소 태아 혈청, 소 혈청(ES), 사람 혈청(HS)], 바람직하게는 약 0.001%(v/v)인 베타-메르캅토에탄올(BME), 하나 이상의 성장 인자, 예를 들어 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 표피 성장 인자(EGF), 염기성 섬유모세포 성장 인자(bFGF), 인슐린 유사 성장 인자-1(IGF-I), 백혈병 억제 인자(LIF), 혈관내피 성장 인자(VEGF)와 에리드로포이에틴이 있으며, L-발린을 포함하는 아미노산, 그리고 미생물 오염을 조절하기 위한 하나 또는 그 이상의 항생제 및/또는 항진균약(antimycotic)이 있는데 항생제 및/또는 항진균약에는 페니실린 G, 황산스트렙토마이신, 암포테리신 B, 겐타마이신과 니아스타틴이 있으며 단독으로 또는 이들을 조합하여 쓸 수 있다.

4.2 태반 줄기세포의 증폭과 증식

분리된 태반 줄기세포 또는 분리된 줄기세포군(예를 들어 생체 내에서 줄기세포 또는 줄기세포군에 정상적으로 결부되어 있는 태반 세포들을 적어도 50% 떼어낸 줄기세포 또는 줄기세포군)을 얻은 뒤에는 이 줄기세포 또는 줄기세포군을 시험관내에서 증식시키고 증폭시킬 수 있다. 예를 들어 태반 줄기세포군은 배양 접시, 플라스크, 다중웰 플레이트 등의 조직 배양 용기에서 그 태반 줄기세포가 세포 합류(confluence) 조건의 70~90%에 이르는데 충분한 시간, 즉 이 줄기세포와 그 자손이 조직 배양 용기 표면적의 70~90%를 차지할 때까지 배양할 수 있다.

태반 줄기세포는 세포 성장을 허용하는 밀도로 배양 용기에 파종할 수 있다. 예를 들어 이 세포들을 낮은 밀도(예를 들어 1 ㎠ 당 약 100에서 약 5000 세포) 내지 높은 밀도(1 ㎠ 당 약 50,000 세포 또는 그 이상)로 파종할 수 있다. 한 바람직한 실시 태양에서는 이들 세포를 공기 중 부피비 약 0 내지 5% 이산화탄소 속에서 배양한다. 몇몇 바람직한 실시 태양에서는 이들 세포를 공기 중 부피비 약 2 내지 약 25% 산소 속에서 배양하고, 바람직하게는 약 5 내지 약 20퍼센트 산소를 사용한다. 이들 세포는 약 25℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 37℃에서 배양하게 된다. 이들 세포는 배양기 속에서 배양하는 것이 바람직하다. 배양 배지는 정지상이거나 교반될 수 있는데, 예를 들어 생반응기를 이용할 수 있다. 태반 줄기세포는 낮은 산화성 스트레스(글루타티온의 첨가, 아스코르브산, 카탈라아제, 토코페롤, N-아세틸시스테인 등) 하에서 성장하는 것이 바람직하다.

70%~90% 세포 합류를 이룬 다음에는 이들 세포를 계대할 수 있다. 예를 들어, 공지 기술을 이용하여 이들 세포를 효소 처리, 이를 테면 트립신 처리하여 조직 배양 표면으로부터 떼어낼 수 있다. 피펫으로 세포를 떼어내고 그 세포 수를 세어 약 20,000~100,000 줄기세포, 바람직하게는 약 50,000 줄기세포를 신선한 배양 배지를 담고 있는 새 배양 용기에 옮겨 계대한다. 이 새로운 배양 배지는 상기 줄기세포를 들어낸 배양 배지과 같은 종류인 것이 전형적인 경우이다. 본 발명은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20 회, 또는 그 이상 계대한 태반 줄기세포군도 망라하고 있다.

4.3 태반 줄기세포군

본 발명은 태반 줄기세포군을 제공한다. 태반 줄기세포군은 하나 이상의 태반으로부터 곧바로 분리해 낼 수 있다. 즉, 이 태반 줄기세포군은 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군으로서, 관류물(perfusate)로부터 얻은, 혹은 관류물 안에 포함된 것이거나, 효소 소화물(digestate)로부터 얻은, 혹은 소화물 안에 포함된 것(즉 태반 또는 그 일부분을 효소 소화하여 수집한 세포)일 수 있다. 본 발명의 분리된 태반 줄기세포를 배양하고 증폭하여 태반 줄기세포군을 얻는데 사용할 수도 있다. 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군은 또한 배양하고 증폭하여 태반 줄기세포군을 얻는데 사용할 수도 있다.

본 발명의 태반 줄기세포군은 태반 줄기세포를 포함하는데, 예를 들어 본 명세서에서 기술하는 태반 줄기세포를 포함한다. 많은 실시 태양에서는 분리된 태반 줄기세포군의 세포 중 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%가 태반 줄기세포이다. 즉 한 태반 줄기세포군에는 예를 들어 최대 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 80%, 90%의 비줄기세포가 포함될 수 있다.

본 발명은 효소 소화 방식이건 관류에 의하여 얻은 것이든 관계 없이, 특정 표지 및/또는 특정 배양 또는 형태적 특성을 띠는 태반 줄기세포를 선별함으로써 분리된 태반 줄기세포군을 제조하는 방법을 제공한다. 예를 들어 한 실시 태양에서는 세포군의 제조 방법을 제공하는데, 이 방법은 (a) 기질(substrate)에 부착하고, (b) CD200과 HLA-G를 발현하는 태반 세포를 선별하는 단계와, 상기 세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 다른 실시 태양에서 이 세포군의 제조 방법은 (a) 기질에 부착하고, (b) CD73, CD105와 CD200을 발현하는 태반 세포를 선별하는 단계와, 상기 세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 세포군을 제조하는 본 발명은 (a) 기질에 부착하고, (b) CD200과 OCT-4를 발현하는 태반 세포를 선별하는 단계와, 상기 세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 세포군을 제조하는 본 발명의 방법은 (a) 기질에 부착하고, (b) CD73과 CD1054를 발현하면서 (c) 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 태반 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하는 태반 세포를 선별하는 단계와, 상기 세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 세포군을 제조하는 상기 방법은 (a) 기질에 부착하고, (b) CD73, CD105와 HLA-G를 발현하는 태반 세포를 선별하는 단계와, 상기 세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 다른 실시 태양에서, 세포군을 제조하는 상기 방법은 (a) 기질에 부착하고, (b) OCT-4를 발현하며, (c) 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 태반 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하는 태반 세포를 선별하는 단계와, 상기 세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함한다. 상기 실시 태양 중 어느 것이라도, 이 방법은 ABC-p(태반 특이적인 ABC 운반(transporter) 단백질. Allikments 외 Cancer Res. 58(23): 5337~9(1998) 등을 참조하라)를 발현하는 태반 세포를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 방법은 또한 예를 들어 중간엽 줄기세포에 특이적인 특성, 이를 테면 CD29의 발현, CD22의 발현, CD90의 발현 또는 이들 특성의 조합을 적어도 하나 갖추고 있는 세포를 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.

상기 실시 태양 중에서 기질은 세포 배양 및/또는 세포, 예를 들어 태반 줄기세포의 선별이 이루어질 수 있는 어떠한 표면이라도 좋다. 전형적인 경우, 기질은 플라스틱, 예를 들어 조직 배양 접시 또는 다중웰 플레이트의 플라스틱이다. 조직 배양 플라스틱은 라미닌 또는 피브로넥틴 등의 생분자로 피복될 수 있다.

태반 줄기세포 등의 세포를 선별하여 태반 줄기세포군을 얻는데 세포 선별 분야에서 알려진 모든 수단을 쓸 수 있다. 예를 들어, 흐름 세포 측정 또는 FACS에서 하나 이상의 세포 표면 표지에 대하여 특이적인 항체(들)를 이용하여 세포를 선별할 수 있다. 항체와 자기 비드를 같이 사용하여 선별할 수도 있다. 특정 줄기세포 관련 표지에 대하여 특이적인 항체가 이 분야에서 알려져 있다. 그 예로는 OCT-4(미국 매사추세츠주 캠브리지 Abcam), CD200(Abcam), HLA-G(Abcam), CD73(미국 캘리포니아주 샌디에고 BD Biosciences Pharmaingen), CD105(Abcam, 미국 메인주 Saco의 BioDesign International)에 특이적인 항체 등을 들 수 있다. 다른 표지에 대한 항체 역시 시판 중인데, 예를 들어 CD34, CD38과 CD45에 대한 항체를 StemCell Technologies 또는 BioDesign International로부터 구할 수 있다.

분리된 태반 줄기세포군은 줄기세포가 아닌 태반 세포나 태반 세포가 아닌 세포를 함유할 수 있다.

분리된 태반 줄기세포군을 하나 이상의 비줄기세포 또는 비태반 세포 세포군과 혼합할 수 있다. 예를 들어 분리된 태반 줄기세포군을 혈액(예를 들어 태반 혈액 또는 제대혈), 혈액 유래 줄기세포(예를 들어 태반 혈액 또는 제대혈 유래 줄기세포), 혈액 유래 유핵 세포군, 골수 유래 중간엽 세포, 골수 유래 줄기세포군, 미정제 골수, 성체(체세포) 줄기세포, 조직 내에 포함된 줄기세포군, 배양된 줄기세포, 완전 분화된 세포군(예를 들어 연골세포, 섬유모세포, 양막 세포, 뼈모세포, 근육 세포, 심근 세포 등) 등과 혼합할 수 있다. 분리된 태반 줄기세포군 속의 세포와 다수의 다른 유형 세포를, 각 세포군의 총 유핵세포수를 비교하여 혼합할 수 있는데 그 혼합 비율은 약 100,000,000:1, 50,000,000:1, 20,000,000:1, 10,000,000:1, 5,000,000:1, 2,000,000:1, 1,000,000:1, 500,000:1, 200,000:1, 100,000:1, 50,000:1, 20,000:1, 10,000:1, 5,000:1, 2,000:1, 1,000:1, 500:1, 200:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1 :1; 1 :2; 1:5; 1:10; 1:100; 1:200; 1:500; 1:1,000; 1:2,000; 1 :5,000; 1 :10,000; 1:20,000; 1:50,000; 1:100,000; 1 :500,000; 1:1,000,000; 1:2,000,000; 1:5,000,000; 1:10,000,000; 1:20,000,000; 1:50,000,000 또는 약 1:100,000,000이다. 분리된 태반 줄기세포군 속의 세포를 복수의 세포 유형을 가지는 복수의 세포들과 혼합할 수도 있다.

한 실시 태양에서는 분리된 태반 줄기세포군을 복수의 조혈 줄기세포와 혼합한다. 이러한 조혈 줄기세포는 예를 들어 다음 세포원으로부터 얻을 수 있다: 미처리된 태반 혈액, 제대혈 또는 말초 혈액 내, 태반 혈액·제대혈·말초 혈액 유래 총 유핵세포 속, 태반 혈액·제대혈·말초 혈액 유래 분리된 CD34⁺ 세포군, 미처리 골수, 골수 유래 총 유핵세포 속, 골수 유래 분리된 CD34⁺ 세포군 등.

5. 태반 줄기세포의 보존

태반 줄기세포는 보존될 수 있는데, 요컨대 장기 저장을 허용하는 조건 또는 세포 자멸사 또는 세포 괴사 등에 의한 세포 사멸을 억제하는 조건하에 둘 수 있다.

태반 줄기세포는 예를 들어 2005년 12월 29일자의 관련 미국 예비출원 제60/754,969호 "Improved Composition for Collecting and Preserving Placental Stem Cells and Methods of Using the Composition"에 개시된 조성물인 세포 자멸사 억제제, 세포 괴사 억제제 및/또는 산소 운반성 퍼플루오로카본 함유 조성물을 이용하여 보존할 수 있다. 본 발명의 한 실시 태양에서는, 줄기세포군의 보존 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 줄기세포군을 세포 자멸사 억제제와 산소 운반성 퍼플루오로카본을 함유하는 줄기세포 수집용 조성액에 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포자멸사 억제제는 상기 세포자멸사 억제제로 처리하지 않은 줄기세포군과 비교하였을 때 상기 줄기세포군의 세포자멸사를 방지하거나 감소시키는데 충분한 양으로 존재한다. 한 특정 실시 태양에서, 상기 세포자멸사 억제제는 JNK 억제제이다. 더 특정한 실시 태양에서, 상기 JNK 억제제는 상기 줄기세포의 분화 또는 증식을 조절하지 못한다. 다른 실시 태양에서 상기 줄기세포 수집용 조성액은 상기 세포자멸사 억제제와 상기 산소 운반성 퍼플루오로카본을 별도의 층에 함유한다. 다른 실시 태양에서, 상기 줄기세포 수집용 조성액은 상기 세포자멸사 억제제와 상기 산소 운반성 퍼플루오로카본을 유탁액으로 함유한다. 다른 실시 태양에서, 상기 줄기세포 수집용 조성액은 유화제, 예를 들어 레시틴을 더 함유한다. 다른 실시 태양에서 상기 세포자멸사 억제제와 상기 산소 운반성 퍼플루오로카본은 상기 줄기세포와 접촉할 때 약 0℃ 내지 약 25℃에 있다. 다른 더 특정한 실시 태양에서, 상기 세포자멸사 억제제와 상기 산소 운반성 퍼플루오로카본은 상기 줄기세포와 접촉할 때 약 2℃ 내지 약 10℃, 또는 약 2℃ 내지 약 5℃에 있다. 다른 더 특정한 실시 태양에서, 상기 접촉은 상기 줄기세포군의 운송시 이루어진다. 다른 더 특정한 실시 태양에서, 상기 접촉은 상기 줄기세포군의 냉동과 해동시에 이루어진다.

다른 실시 태양에서, 본 발명은 태반 줄기세포군의 보존 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 줄기세포군을 세포 자멸사 억제제와 장기 보존용(organ-preserving) 화합물에 접촉시키는 단계를 포함하며, 여기서 상기 세포자멸사 억제제는 상기 세포자멸사 억제제로 처리하지 않은 줄기세포군과 비교하였을 때 상기 줄기세포군의 세포자멸사를 방지하거나 감소시키는데 충분한 양으로 존재한다. 특정 실시 태양에서 상기 장기 보존용 화합물은 UW 용액(ViaSpan으로도 알려져 있으며 미국 특허 제4,798,824호에 기재됨. 또한 Southard 외, Transplantation 49(2):251-257 (1990))이거나 Stern 외, 미국 특허 제5,552,267호에 기재된 용액이다. 다른 실시 태양에서 상기 장기 보존용 화합물은 히드록시에틸 전분, 락토비온산(lactobionic acid), 라피노스(raffinose) 또는 이들의 조합이다. 다른 실시 태양에서 상기 줄기세포 수집용 조성액은 산소 운반성 퍼플루오로카본을 2개의 층 또는 유탁액 형태로 더 포함한다.

본 발명 방법의 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 관류시 세포 자멸사 억제제, 산소 운반성 퍼플루오로카본, 장기 보존용 화합물 및 이들의 조합을 함유하는 줄기세포 수집용 조성액과 접촉시킨다. 다른 실시 태양에서는 상기 줄기세포를 효소 소화 등의 조직 파괴 과정 중에 접촉시킨다. 다른 실시 태양에서는 태반 줄기세포를 관류에 의한 세포 수집 또는 효소 소화 등의 조직 파괴에 의한 세포 수집 이후에 상기 줄기세포 수집용 조성액에 접촉시킨다.

전형적인 경우, 태반 세포의 수집 과정, 농축 과정과 분리시에는 저산소증과 기계적 응력에 말미암은 세포 스트레스를 없애거나 최소화하는 것이 바람직하다. 본 방법의 다른 실시 태양에서는 따라서 줄기세포 또는 줄기세포군이 세포 수집, 농축 또는 분리 중에 저산소 조건에 노출되는 시간을 해당 보존 과정 도중에 6 시간 미만으로 줄이는데, 여기서 저산소 조건이란 정상적인 혈액 산소 농도보다 낮은 산소 농도이다. 더 구체적인 실시 태양에서, 상기 줄기세포군은 상기 보존 과정 도중 상기 저산소 조건에 노출되는 시간이 2시간 미만이다. 다른 더 구체적인 실시 태양에서 상기 줄기세포군은 세포 수집, 농축 또는 분리 도중 상기 저산소 조건에 노출되는 시간이 1 시간 미만 또는 30 분 미만이거나 저산소 조건에 노출되지 않는다. 다른 구체적인 실시 태양에서 상기 줄기세포군은 세포 수집, 농축 또는 분리 도중 전단 응력을 받지 않는다.

본 발명의 태반 줄기세포는 냉동보존될 수 있는데, 예를 들어 냉동보존용 배지가 담긴 앰퓰 등의 소형 용기 속에 보존될 수 있다. 적절한 냉동보존용 배지로는 이를 테면 성장 배지 또는 시판되는 세포 냉동 배지 C2695, C2639, C60939(Sigma) 등의 세포 냉동 배지를 포함하는 배양 배지를 들 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. 냉동보존용 배지는 DMSO(디메틸술폭사이드)를 이를테면 약 10%(v/v) 농도로 포함하는 것이 바람직하다. 냉동보존용 배지는 메틸셀룰로오스 및/또는 글리세롤 등의 추가적 성분을 갖추고 있을 수 있다. 태반 줄기세포는 냉동보존시 분당 섭씨 1도씩 냉각하는 것이 바람직하다. 바람직한 냉동보존용 온도는 약 -80℃ 내지 약 -180℃, 바람직하게는 약 -125℃ 내지 약 -140℃이다. 냉동보존된 세포를 사용하기 위하여 해동하기 전에 액체 질소 속으로 옮길 수 있다. 예를 들어 몇몇 실시 태양에서는 앰퓰의 온도가 약 -90℃에 이르면 이를 액체 질소 저장 공간으로 옮긴다. 냉동보존된 세포는 약 25℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃의 온도에서 해동하는 것이 바람직하다.

6. 태반 줄기세포의 용도

6.1 태반 줄기세포 함유 조성물

본 발명의 면역 억제 방법은 태반 줄기세포 또는 그들로부터 얻은 생분자를 함유하는 조성물을 사용할 수 있다. 마찬가지 방식으로 본 발명에 따른 복수의 태반 줄기세포와 줄기세포군은 예를 들어 연구 또는 치료 용도의 생리학적으로 적합 또는 의학적으로 적합한 모든 화합물, 조성물 또는 장치와 결합하여 쓰일 수 있다.

6.1.1 냉동보존된 태반 줄기세포

본 발명의 면역억제성 태반 줄기세포군은 보존될 수 있는데, 이를테면 나중에 사용하기 위하여 냉동보존될 수 있다. 줄기세포와 같은 세포의 냉동 보존을 위한 방법은 잘 알려져 있다. 태반 줄기세포군은 개체에게 쉽게 투여할 수 있는 형태로 제조할 수 있다. 예를 들어 본 발명은 의학 용도에 적합한 용기에 담긴 태반 줄기세포군을 제공한다. 이러한 용기의 예로는 무균 플라스틱백, 플라스크, 단지(jar) 또는 상기 태반 줄기세포군을 쉽게 꺼낼 수 있는 다른 용기를 들 수 있다. 예를 들어 이 용기는 혈액백 또는 다른 플라스틱, 수용 대상에게 정맥 투여하기 적합한, 의학적으로 허용되는 백일 수 있다. 이 용기는 통합한 줄기세포군의 냉동보존을 지원하는 것이 바람직하다.

냉동보존된 면역억제성 태반 줄기세포군은 한 기증자 또는 여러 기증자로부터 유래한 태반 줄기세포를 포함할 수 있다. 이 태반 줄기세포군은 의도한 수용자와 완벽하게 HLA 유형이 맞거나, 부분적 또는 완전히 HLA-불일치할 수 있다.

따라서 본 발명의 한 실시 태양에서는 면역억제성 태반 줄기세포군을 용기에 담은 조성물을 제공한다. 한 특정 실시 태양에서는 이 줄기세포군을 냉동보존한다. 다른 특정 실시 태양에서는 이 용기가 백, 플라스크 또는 단지이다. 더 구체적인 실시 태양에서는 상기 백이 무균 플라스틱 백이다. 더 구체적인 실시 태양에서는 상기 백이 상기 태반 줄기세포군의 정맥 투여에 적합하거나, 이를 허용하거나 촉진한다. 이 백은 투여 전 또는 도중에 약물 등의 용액이 하나 이상 상기 태반 줄기세포와 섞일 수 있도록 서로 연결된 내부 빈 공간(lumen) 또는 구획을 여러 가지고 있을 수 있다. 다른 구체적 실시 태양에서는 이 조성물이 통합 줄기세포군의 냉동보존을 촉진하는 화합물을 하나 이상 함유한다. 다른 구체적 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포군이 생리적으로 허용되는 수용액 속에 함유되어 있다. 더 특정한 실시 태양에서는 상기 생리적으로 허용되는 수용액이 0.9% NaCl 용액이다. 다른 구체적 실시 태양에서, 상기 태반 줄기세포군은 상기 줄기세포군의 투여 대상자와 HLA 유형이 일치하는 태반 세포를 함유한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 통합 줄기세포군은 적어도 부분적으로 상기 줄기세포군의 투여 대상자와 HLA-불일치하는 태반 세포를 함유한다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 태반 줄기세포는 복수의 기증자에서 유래한 것이다.

6.1.2 약학 조성물

면역 억제성 태반 줄기세포군 또는 태반 줄기세포를 함유하는 세포군을 생체 내에서 사용하기 위한 약학 조성물로 제형화할 수 있다. 이러한 약학 조성물은 태반 줄기세포군 또는 태반 줄기세포를 함유하는 세포군을 약학적으로 허용되는 담체속에 포함하고 있는데, 이러한 담체로는 식염수 또는 생체내 투여에 적합한 다른 생리적으로 허용되는 용액을 들 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 태반 줄기세포군 또는 본 명세서에서 언급한 태반 줄기세포 유형 중 아무 것이나 함유하여도 좋다. 본 발명의 약학 조성물은 태아, 모체 또는 양쪽 태반 줄기세포를 모두 갖추고 있을 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 나아가 단일 기증자 또는 그 태반이나 여러 기증자 또는 그 태반들에서 유래한 태반 줄기세포를 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 면역억제성 태반 줄기세포를 얼마든지 함유할 수 있다. 예를 들어 여러 실시 태양에서 태반 줄기세포 1회 투여량은 적어도 1×10⁵, 5×10⁵, 1×10⁶, 5×10⁶, 1×10⁷, 5×10⁷, 1×10⁸, 5×10⁸, 1×10⁹, 5×10⁹, 1×10¹⁰, 5×10¹⁰, 1×10¹¹ 또는 이보다 더 많은 수의 태반 줄기세포를 함유하거나, 적어도 이 정도 수의 줄기세포를 함유하거나, 혹은 이 정도 수 이하의 줄기세포를 함유한다.

본 발명의 약학 조성물은 생존능이 있는 세포를 50% 이상(즉 세포군 속의 세포 중 적어도 50%가 기능을 발휘하거나 살아 있음) 갖춘 세포군을 포함한다. 적어도 세포군 속 세포의 60%가 생존능을 가지고 있는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 상기 약학 조성물 속 세포군의 세포 중 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99%가 생존능을 가지고 있다.

본 발명의 약학 조성물은 예를 들어 줄기세포 생착(engraftment)을 촉진하는 화합물(항-T 세포 수용체 항체, 면역 억제제 등), 알부민, 덱스트란 40, 젤라틴, 히드록시에틸 전분 등의 안정제를 하나 이상 함유할 수 있다.

6.1.3 태반 줄기세포의 조건 배지

본 발명의 태반 줄기세포를 이용하여 면역 억제성 조건 배지(conditioned medium), 즉 상기 줄기세포가 분비 또는 배설하는 생분자로서, 한 종류 또는 여러 종류인 복수의 면역 세포에 대하여 측정 가능한 면역 억제 효과를 가지는 생분자를 하나 이상 함유하는 배지를 제조할 수 있다. 많은 실시 태양에서, 이 조건 배지는 태반 줄기세포가 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14일 또는 더 오래 동안 성장한 배지를 포함하고 있다. 다른 실시 태양에서 조건 배지는 태반 줄기세포가 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 세포 합류하거나 100% 세포 합류에 이른 배지를 포함하고 있다. 이러한 조건 배지는 별도의 태반 줄기세포군 또는 다른 종류의 줄기세포의 배양을 지원할 수 있다. 다른 실시 태양에서 조건 배지는 태반 줄기세포가 성체 세포 유형으로 분화한 배지를 포함하고 있다. 다른 실시 태양에서 본 발명의 조건 배지는 태반 줄기세포와 비태반 줄기세포가 배양된 배지를 포함한다.

따라서 본 발명의 한 실시 태양에서는 태반 줄기세포 배양물로부터 얻은 배양 배지를 포함하는데, 여기서 상기 태반 줄기세포는 (a) 기질(substrate)에 부착하며, (b) CD200과 HLA-G를 발현하거나 CD73, CD105와 CD200을 발현하거나 CD200과 OCT-4를 발현하거나 CD73, CD105와 HLA-G를 발현하거나 CD73과 CD105를 발현하면서, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나,

OCT-4를 발현하면서 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하고, (c) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는데, 여기서 상기 태반 줄기세포의 배양은 상기 배지 속에서 24 시간 이상 이루어진 것이다. 특정 실시 태양에서 이 조성물은 복수의 상기 태반 줄기세포를 더 포함한다. 다른 특정 실시 태양에서 이 좃어물은 복수의 비태반 세포를 포함한다. 더 구체적인 실시 태양에서는 상기 비태반 세포가 CD34⁺ 세포, 예를 들어 말초 혈액 조혈 전구세포, 제대혈 전구세포 또는 태반 혈액 전구세포와 같은 조혈 전구세포를 포함한다. 상기 비태반 세포는 또한 골수 유래 중간엽 줄기세포와 같은 중간엽 줄기세포 등의 다른 줄기세포를 포함할 수 있다. 상기 비태반 세포는 또한 하나 이상의 종류의 성체 세포 또는 성체 세포주일 수 있다. 다른 특정 실시 태양에서 이 조성물은 항증식제, 예를 들어 항MIP-1α 또는 항MIP-1β 항체를 포함한다.

6.1.4 태반 줄기세포를 함유하는 매트릭스

본 발명은 면역 억제성 태반 줄기세포군을 함유하는 매트릭스, 하이드로겔, 3차원 골격(scaffold) 등을 더 포함한다.

본 발명의 태반 줄기세포는 천연 매트릭스, 예를 들어 양막 소재와 같은 태반의 생물질에 파종할 수 있다. 이러한 양막 소재로는 포유류 태반에서 바로 절제된 양막, 고정되거나 열처리된 양막, 실질적으로 건조(즉 <20% H₂O)한 양막, 융모막, 실질적으로 건조한 융모막, 실질적으로 건조한 양막과 융모막 등을 들 수 있다. 태반 줄기세포를 파종할 수 있는 바람직한 태반 생물질은 Hariri의 미국 출원 공보 제2004/0048796호에 기재되어 있다.

본 발명의 태반 줄기세포는 주사 등에 적합한 하이드로겔 용액 속에 현탁할 수 있다. 이러한 조성물에 적합한 하이드로겔로는 RAD16과 같은 자가 조립(self-assembling) 펩티드를 들 수 있다. 한 실시 태양에서는 상기 세포를 함유하는 하이드로겔 용액을, 예를 들어 틀 속에서 굳혀서 착상(implantation)을 위하여 그 속에 세포를 함유하는 매트릭스를 형성할 수 있다. 이러한 매트릭스 속의 태반 줄기세포를 배양하여 착상 전에 체세포분열로 세포를 증폭할 수도 있다. 상기 하이드로겔은 예를 들어 유기 고분자(천연 또는 합성)로서 공유, 이온 또는 수소 결합을 통하여 가교되어 물을 가둘 수 있는 열린 3차원 격자를 만듦으로써 겔을 이룬다. 하이드로겔 형성 물질로는 알긴산과 그 염과 같은 다당류, 펩티드, 폴리포스파진(polyphosphazine)과 폴리아크릴레이트 등 이온결합으로 가교되는 것들 혹은 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글리콜 블록 공중합체와 같이 각각 온도, pH에 의하여 가교되는 블록 공중합체를 들 수 있다. 몇몇 실시 태양에서 본 말명의 상기 하이드로겔 또는 매트릭스는 생분해성이다.

본 발명의 몇몇 실시 태양에서는 상기 제형에 제자리(in situ) 중합성 겔이 포함된다(예를 들어 미국 특허 출원공보 제2002/0022676호, Anseth 외, J. Control Release, 78(l-3):199-209 (2002) 또는 Wang 외, Biomaterials, 24(22):3969-80(2003)을 보라).

몇몇 실시 태양에서 이 고분자는 적어도 수용액 속에서 부분적으로 용해성인데, 수용액으로는 물, 완충 염 용액 또는 하전된 측쇄를 가지는 수성 알코올 용액 또는 그의 단일가 이온염을 들 수 있다. 양이온과 반응할 수 있는 산성 측쇄를 가지는 고분자의 예로는 폴리(포스파젠), 폴리(아크릴산), 폴리(메트아크릴산), 아크릴산과 메트아크릴산의 공중합체, 폴리(아세트산비닐)과 술폰화 폴리스티렌과 같은 술폰화 고분자를 들 수 있다. 산성 측쇄를 가지는 공중합체로서 아크릴산 또는 메트아크릴산과 비닐에테르 모노머 또는 고분자를 반응시켜 얻는 공중합체도 사용할 수 있다. 산성 측쇄의 예로는 카르복시기, 술폰산기, 할로겐화(바람직하게는 플루오르화) 알코올기, 페놀성 OH기와 산성 OH기가 있다.

본 발명의 태반 줄기세포 또는 이들의 공배양물을 3차원 구조 또는 골격에 파종된 다음 생체 내에서 착상(implant)시킬 수 있다. 이러한 구조는 하나 이상의 아무 성장 인자, 세포, 약물 혹은 조직 형성을 촉진시키거나 본 발명의 실시를 다른 방식으로 향상·개선하는 다른 성분과 조합함으로써 착상될 수 있다.

본 발명에 쓰일 수 있는 3차원 골격의 예로는 부직 매트, 다공성 포말 또는 자가 조립 펩티드를 들 수 있다. 부직 매트는 글리콜산과 락트산의 합성 흡수성 공중합체(PGA/PLA 등)를 포함하는 섬유(미국 뉴저지주 Somerville의 Ethicon Inc.사의 Vicryl)로부터 만들 수 있다. 포말은 예를 들어 동결건조 또는 냉동진공건조(미국 특허 제6,355,699호 등을 보라)와 같은 공정에 의하여 제조된 폴리(ε-카프롤락탐)/폴리(글리콜산)(PCL/PGA) 공중합체로 구성된 포말을 3차원 골격으로 쓸 수도 있다.

본 발명의 태반 줄기세포는 생리적으로 허용되는 세라믹 소재에 파종하거나 접촉시킬 수 있는데, 이러한 세라믹 소재에는 인산모노-, 인산디-, 인산트리-, 인산알파트리-, 인산베타트리- 와 인산테트라칼슘, 수산화인회석, 불소인회석, 황산칼슘, 플루오르화칼슘, 산화칼슘, 탄산칼슘, 인산마그네슘칼슘, BIOGLASS(등록상표)와 같이 생활성이 있는 유리 및 이들의 혼합물이 포함되지만 여기에 한정되는 것은 아니다. 현재 시판 중인 생체적합한 다공성 세라믹 소재에는 SURGIBONE(캐나다 CanMedica Corp.의 등록상표), ENDOBON(프랑스 Merck Biomaterial France의 등록상표), CEROS(스위스 Bettlach의 Mathys AG의 등록상표), 그리고 HEALOS(미국 매사추세츠주 Raynham의 DePuy, Inc.의 상표) VITOSS, RHAKOSS 및 CORTOSS(미국 펜실베니아주 Malvern의 Orthovita의 등록상표들)와 같은 광물화 콜라겐 뼈 이식 제품 들이 포함된다. 이러한 구조는 천연 및/또는 합성 재료의 혼합물, 블렌드 또는 복합물일 수 있다.

다른 실시 태양에서 태반 줄기세포는 펠트에 파종하거나 접촉시킬 수 있는데, 이러한 펠트는 예를 들어 PGA, PLA, PCL 공중합체 또는 블렌드 혹은 히알루론산과 같은 생흡수성 소재로부터 제조한 다중 필라멘트사(multifilament yarn)로 구성될 수 있다.

본 발명의 다른 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포를 복합 구조일 수 있는 포말 골격(foam scaffold)에 파종할 수 있다. 이러한 포말 골격은 체내에서 수리, 교체, 보강되어야 할 특정 구조 부분의 모양처럼 유용한 형태로 성형할 수 있다. 몇몇 실시 태양에서는 이 구조를 본 발명의 세포를 접종하기 전에 예를 들어 0.1M 아세트산 처리하고, 이어 폴리리신, PBS 및/또는 콜라겐과 배양하여 세포 부착을 향상시킬 수 있다. 매트릭스의 외부면을 변형하여 세포의 부착과 성장 및 조직의 분화를 향상할 수 있는데, 이러한 변형에는 매트릭스의 혈장 피복 또는 하나 이상의 단백질(예를 들어 콜라겐, 탄성 섬유, 망상 섬유), 당단백질, 글리코스아미노글리칸(예를 들어 황산헤파린, 황산-4-콘드로이틴, 황산-6-콘드로이틴, 황산데르마탄, 황산케라틴 등), 세포 매트릭스 및/또는 다른 물질의 부가 있으며, 상기 물질은 젤라틴, 알긴산염, 한천, 아가로스와 식물 검 등이 있지만 이에 한정되는 것은 아니다.

몇몇 실시 태양에서는 이 3차원 골격을 혈전 형성을 방지하는 물질로 처리하거나, 이 3차원 골격이 그러한 물질을 함유한다. 이러한 물질과 그 처리는 내피 성장, 이동과 세포외 매트릭스 축적을 촉진하고 유지한다. 이러한 물질과 처리법의 예로는 라미닌과 제IV형 콜라겐과 같은 기저막 단백질, EPTFE 등의 합성 물질, PURSPAN(미국 캘리포니아주 버클리의 The Polymer Technonolgy Group Inc.의 상표) 등의 분절된 폴리우레탄요소 실리콘을 들 수 있지만 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 3차원 골격은 또한 헤파린과 같은 항혈전 형성제를 함유할 수 있다. 태반 줄기세포의 파종 전에 상기 골격을 처리하여 표면 전하를 변화(예를 들어 혈장으로 피복)시킬 수 있다.

6.2 무한증식화된 태반 줄기세포주

포유류 태반 세포는 성장 촉진 유전자를 함유하는 모든 적절한 벡터를 이용하여 전환(transfection)됨으로써 조건부로 무한 증식(conditionally immortalized)할 수 있는데, 여기서 성장 촉진 유전자는 적절한 조건 하에서 전환된 세포의 성장을 촉진하여, 상기 성장 촉진 단백질의 제조 및/또는 활성을 외부 인자로 조절할 수 있게 하는 것이다. 상기 성장 촉진 유전자의 바람직한 실시 태양은 종양유전자인데, 예를 들면 v-myc, N-myc, c-myc, p53, SV40 대형 T 항원, 폴리오마 대형 T 항원, E1a 아데노바이러스 또는 사람 파필로마바이러스의 E7 단백질이 있지만 여기에 한정되지는 않는다.

상기 성장 촉진 단백질의 외부 조절은 상기 성장 촉진 유전자를 외부 조절 가능한 프로모터, 예를 들어 전환된 세포의 온도를 조절하거나 세포와 접촉하는 배지의 조성을 바꿈으로써 그 활성을 조절할 수 있는 프로모터의 조절하에 둠으로써 이룰 수 있다. 한 실시 태양에서는 테트라사이클린(tet) 조절 유전자 발현 시스템(Gossen 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551, 1992 또는 Hoshimaru 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:1518-1523, 1996을 보라)을 이용할 수 있다. tet의 부재 하에서는 이 벡터 내부에 자리잡은, tet에 의하여 조절되는 트랜스 활성화 인자(tTA)가 ph _CMV ^* _-1 로부터 전사를 강하게 활성화하는데, ph _CMV ^* _{- 1} 는 사람 사이토메갈로바이러스의 최소 프로모터와 tet 조절 유전자 서열에 연결된 것이다. tTA는 대장균의 전위유전단위(transposon)-10 유래 tet 저항 오페론의 억제자(tetR)와 헤르페스 심플렉스 바이러스 VP16의 산성 영역을 융합한 단백질이다. 낮고 독성이 없는 tet 농도(약 0.01~1.0 ㎍/mL)에서는 tTA에 의한 트랜스 활성화가 거의 중단된다.

한 실시 태양에서 이 벡터는 선별용 표지, 예를 들어 약물 내성을 부여하는 단백질을 암호화하는 유전자를 더 포함한다. 세균 네오마이신 내성 유전자(neo ^R )는 본 발명에 쓰일 수 있는 표지의 한 예이다. neo ^R 을 가진 세포는 100~200 ㎍/mL의 G418을 성장 배지에 부가하는 것과 같이 당업자에게 잘 알려진 수단을 써서 선별할 수 있다.

세포의 전환은 역전사 바이러스 감염과 같이 당업자에게 잘 알려진(하지만 이것만으로 제한되지는 않는) 모든 수단을 사용하여 이루어질 수 있다. 일반적으로 세포 배양물의 전환은 상기 벡터를 생산하는 세포주로부터 수집한 조절 배지와 N2 보강 물질을 함유하는 DMEM/F12의 혼합물 속에서 세포를 배양함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어 상술한 바에 따라 마련한 태반 세포 배양물을 예를 들어 닷새 동안 시험관내 배양 후 상기 조절 배지 1부피와 N2 보강 물질을 함유한 DMEM/F12 2부피의 혼합물 속에서 약 20시간 동안 배양함으로써 감염시킬 수 있다. 선별용 표지를 갖춘 전환 세포는 앞서 설명한 바와 같이 선별할 수 있다.

세포 전환 후에 배양물을 세포 증식을 허용하는 표면, 예를 들어 24 시간 동안 적어도 30%의 세포가 배증하도록 허용하는 표면 위에 계대한다. 이때 기질은 폴리오르니틴(10 ㎍/mL) 및/또는 라미닌(10 ㎍/mL)으로 피복한 조직 배양 플라스틱으로 이루어진 폴리오르니틴/라미닌 기질, 폴리리신/라미닌 기질 또는 피브로넥틴으로 처리한 표면인 것이 바람직하다. 이어서 이 배양물에 3~4 일마다 성장 배지를 가하여 주는데, 이 배지는 하나 이상의 증식 향상 인자로 보강되었거나 보강되지 않았을 수 있다. 증식 향상 인자는 배양물이 50% 세포 합류 수준 미만일 때 성장 배지에 추가한다.

80~95% 세포 합류 수준일 때 트립신 처리와 같은 표준적인 방법을 이용하여 조건부 무한 증식 태반 줄기세포주를 계대할 수 있다. 약 스무번째 계대까지는 몇몇 실시 태양에서는 선별(예를 들어 네오마이신 내성 유전자를 가지는 세포를 선별용 G418 부가에 의한)을 유지하는 것이 바람직하다. 세포를 액체 질소에 얼려서 장기간 보존할 수 있다.

앞서 설명한 방법에 따라 마련한 조건부 무한 증식 사람 태반 줄기세포주로부터 클론 세포주를 분리할 수 있다. 일반적으로 한계 희석(limit dilution)이나 클로닝 고리(cloning ring) 등의 표준적인 방법을 이용하여 이러한 클론 세포주를 분리하고 증폭할 수 있다. 클론 세포주는 일반적으로 앞서 기술한 방식에 따라 영양분을 공급하고 계대해 줄 수 있다.

조건부 무한증식 사람 태반 줄기세포주는 클론성(clonal)일 수 있지만 반드시 그럴 필요는 없으며, 분화를 촉진하는 배양 조건하에서 상기 성장 촉진 단백질의 제조 및/또는 활성을 억제함으로써 분화하도록 유도할 수 있는 것이 일반적인 경우이다. 예를 들어, 상기 성장 촉진 단백질을 암호화하는 유전자가 외부 조절 가능한 프로모터 조절을 받는 경우, 배지의 온도 또는 조성을 변화시켜 성장 촉진 유전자의 전사를 억제할 수 있다. 앞서 논한 테트라사이클린 조절 유전자 발현 시스템에서는 테트라사이클린을 가하여 상기 성장 인자의 전사를 억제함으로써 분화를 이룰 수 있다. 일반적으로 1 ㎍/mL 테트라사이클린을 4~5일 동안 처리하면 분화를 일으키기에 충분하다. 더 분화를 일으키려면 성장 배지에 추가적인 성분을 넣을 수 있다.

6.3 분석 방법

본 발명의 태반 줄기세포는 분석 방법에서 이용하여 배양 조건, 환경 요인, 분자(예를 들어 생분자, 소형 무기 분자 등) 등이 줄기세포 증식, 증폭 및/또는 분화에 미치는 영향을 그러한 조건에 노출되지 않은 태반 줄기세포와 비교하여 살펴볼 수 있다.

한 바람직한 실시 태양에서는 본 발명의 태반 줄기세포를 분자에 접촉시켜 세포 증식, 증폭 또는 분화의 변화를 분석한다. 예를 들어 본 발명의 한 실시 태양에서는 복수의 태반 줄기세포의 증식을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 복수의 줄기세포를 증식을 허용하는 조건 하에서 상기 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 화합물과 접촉하지 못한 상기 복수의 줄기세포와 비교하였을 때 상기 화합물이 상기 복수의 줄기세포의 증식에 측정 가능한 변화를 일으키는 경우, 상기 화합물을 태반 줄기세포의 증식을 조절하는 화합물로 동정한다. 특정 실시 태양에서는 상기 화합물을 증식 억제제로 동정한다. 다른 특정 실시 태양에서는 상기 화합물의 증식 촉진제로 동정한다.

다른 실시 태양에서 본 발명은 복수의 태반 줄기세포의 증폭을 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 복수의 줄기세포를 증폭을 허용하는 조건 하에서 상기 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 화합물과 접촉하지 못한 상기 복수의 줄기세포와 비교하였을 때 상기 화합물이 상기 복수의 줄기세포의 증폭에 측정 가능한 변화를 일으키는 경우, 상기 화합물을 태반 줄기세포의 증폭을 조절하는 화합물로 동정한다. 특정 실시 태양에서는 상기 화합물을 증폭 억제제로 동정한다. 다른 특정 실시 태양에서는 상기 화합물의 증폭 촉진제로 동정한다.

다른 실시 태양에서, 본 발명은 태반 줄기세포의 분화를 조절하는 화합물을 동정하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 줄기세포를 분화를 허용하는 조건 하에서 상기 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 화합물과 접촉하지 못한 상기 줄기세포와 비교하였을 때 상기 화합물이 상기 줄기세포의 분화에 측정 가능한 변화를 일으키는 경우, 상기 화합물을 태반 줄기세포의 분화를 조절하는 화합물로 동정한다. 특정 실시 태양에서는 상기 화합물을 분화 억제제로 동정한다. 다른 특정 실시 태양에서는 상기 화합물을 분화 촉진제로 동정한다.

6.4 태반 줄기세포 은행

출산 후 태반으로부터 얻는 줄기세포를 수많은 다른 방식으로 배양하여 태반 줄기세포 롯(lot)의 집단, 예를 들어 개별적으로 투여 가능한 용량의 집단을 이룰 수 있다. 이러한 롯은 예를 들어 태반 관류물 또는 효소 소화된 태반 조직으로부터 얻을 수 있다. 복수의 태반으로부터 얻은 태반 줄기세포 롯의 집단은 예를 들어 장기 저장을 위한 태반 줄기세포의 은행 속에 정렬할 수 있다. 일반적으로 부착 줄기세포는 태반 재료의 초기 배양으로부터 파종 배양물(seed culture)을 형성하여 얻게 되고, 이를 통제된 조건 하에서 증폭시켜 대략 횟수로 배증시켜 세포군을 제조하게 된다. 롯들은 한 태반 조직으로부터 유래하는 것이 바람직하지만, 복수의 태반 조직으로부터 유래할 수도 있다.

한 실시 태양에서 줄기세포 롯은 다음과 같이 얻을 수 있다. 태반 조직을 먼저 파괴, 예를 들어 잘게 썰고 콜라겐 분해 효소 등(앞의 2.3을 보라)의 적절한 효소로 소화하여 파괴한다. 이 태반 조직은 예를 들어 하나의 태반에서 얻은 양막 전체, 융모막 전체 또는 양자 모두를 포함하는 것이 바람직하지만 양막 또는 융모막의 일부만 포함할 수도 있다. 소화된 조직은 예를 들 어 1~3 주 동안 배양되는데, 바람직하게는 2 주가 좋다. 비부착성 세포를 제거한 다음, 형성되는 고밀도 콜로니를 수집, 예를 들어 트립신 처리를 통하여 수집한다. 이들 세포는 수집되어 편리한 분량의 배양 배지 속에 재현탁화되는데 이를 제0 계대(Passage 0) 세포라고 정의한다.

제0 계대 세포는 증폭 배양물(expansion culture)을 파종하는데 쓰인다. 증폭 배양물은 별개의 세포 배양 장치, 예를 들어 NUNC(상표)의 Cell Factory의 모든 배열일 수 있다.

제0 계대 배양물 속의 세포는 증폭 배양물을 파종하기 위하여 얼마든지 나뉠 수 있는데, 1×10³, 2×10³, 3×10³, 4×10³, 5×10³, 6×10³, 7×10³, 8×10³, 9×10³, 1×10⁴, 2×10⁴, 3×10⁴, 4×10⁴, 5×10⁴, 6×10⁴, 7×10⁴, 8×10⁴, 9×10⁴, 10×10⁴ 개의 줄기세포로 증폭 배양물을 파종할 수 있다. 바람직하게는 약 2×10⁴ 내지 약 3×10⁴개의 제0 계대 세포를 이용하여 증폭 배양물을 파종한다. 증폭 배양물의 수는 제0 계대 세포의 수에 달려 있는데, 이 수의 다소는 상기 줄기세포를 얻은 특정 태반(들)에 달려 있다.

증폭 배양물은 배양물 속 세포 농도가 일정한 값, 예를 들어 약 1×10⁵ 세포/㎠에 이를 때까지 성장시키게 된다. 이 시점에서는 세포를 수집하거나 냉동보존할 수 있고, 아니면 앞서 설명한 바와 같이 새로운 증폭 배양물로 계대할 수도 있다. 세포는 사용 전에 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19회 또는 20회 계대될 수 있다. 증폭 배양 도중에는 세포군 배증의 누적 횟수에 대한 기록을 가지고 있는 것이 바람직하다. 제0 계대 배양에서 얻은 세포는 배증 회수를 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38회 또는 40회, 혹은 60회까지로 하여 증폭할 수 있다. 그러나 개별 투여량 별로 세포군을 나누기 전의 세포군 배증 횟수는 약 15 내지 약 30회, 바람직하게는 약 20회인 것이 적당하다. 이들 세포는 증폭 과정 내내 연속적으로 배양되거나, 증폭 도중 1회 이상 냉동될 수 있다.

개별 투여에 쓰일 세포는 나중에 쓰기 위하여 냉동, 예를 들어 냉동보존될 수 있다. 개별 투여량에는 예를 들어 1 mL 당 약 1백만 내지 약 1억개의 세포가 포함될 수 있고, 그 총수는 약 10⁶ 내지 10⁹개이다.

본 방법의 특정 실시 태양에서는 제0 계대 세포를 4회까지 배증하게 한 다음 1차 세포 은행 속에 냉동하여 둔다. 1차 세포 은행에서 나온 세포는 언 채로 있고 2차 세포 은행을 파종하는데 쓰이는데, 2차 세포 은행의 세포들은 약 8차례 더 배증하게끔 증폭된다. 이 단계의 세포를 수집하고 냉동한 다음 이를 이용하여 새로운 증폭 배양물을 파종하는데, 여기서 약 8차례 더 배증하도록 하여 누적 세포 배증 횟수를 약 20회로 한다. 계대 도중의 중간 시점에서 얻은 세포는 후속 증폭 배양을 위하여 1 mL 당 약 100,000 내지 약 1천만 세포, 바람직하게는 1백만 세포 단위로 냉동할 수 있다. 약 20 차례 배증한 세포는 투여 또는 줄기세포 함유 조성물을 제조하기 위하여 1 mL 당 약 1백만에서 약 1억개의 세포에 해당하는 용량의 개별 투여량으로 얼릴 수 있다.

한 바람직한 실시 태양에서는 태반을 기증한 기증자(예를 들어 모체)에 대하여 적어도 한 가지 병원체의 존부를 검사하게 된다. 검사 병원체에 대하여 산모가 양성이면 그 태반에서 얻은 전체 롯을 파기한다. 이러한 검사는 태반 줄기세포 롯의 제조 도중 어느 때이건 할 수 있고, 예를 들어 제0 계대 세포의 수립 전후 또는 증폭 배양 도중도 가능하다. 존부를 검사하는 병원체의 예로는 A형 간염, B형 간염, C형 간염, D형 간염, E형 간염, 사람 면역결핍 바이러스(I형과 II형), 사이토메갈로바이러스, 헤르페스 바이러스 등이 있지만 이들로 제한되는 것은 아니다.

6.5. 다발성 경화증의 치료

본 발명의 다른 측면에서는 다발성 경화증 또는 다발성 경화증 관련 증상이 있는 환자를 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 환자에게 그 환자의 면역 반응을 조절, 예를 들어 억제하기에 충분한 양의 복수의 태반 줄기세포를 충분한 기간 동안 투여하는 단계를 포함한다.

다발성 경화증(MS)은 중추신경계의 만성, 재발성 염증 질환이다, 이 질환은 중추 신경계와 PNS 액손을 감싸는 미엘린 수초와 희소돌기 아교세포 및 신경 세포 자체의 손상을 가져 온다. 이 질환은 자가 반응성 T 세포, 특히 CD4⁺ T 세포가 매개하는데, 이 세포는 세포 부착 분자(adhesion molecule)와 염증 유발(pro-inflammatory) 사이토킨의 영향 아래 증식하고, 혈뇌 장막을 넘어 중추 신경계에 진입한다. 다발성 경화증의 증상은 사지의 감각 장애, 시각 신경 기능 장애, 추체로 기능 장애, 방광 기능 장애, 창자의 기능 장애, 성 기능 장애, 조화 운동 불능과 겹보임을 포함한다.

네가지 다른 임상 경로가 다발성 경화증에서 확인되었다. 첫째인 재발/완화 MS(RRMS)는 며칠 또는 몇 주에 걸쳐 급성으로 나타나는 자기 제한성(self-limiting) 신경 기능 장애의 발작과 이에 이어지는 몇 달에 걸친, 때로 불완전한 회복기로 특징지을 수 있다. 둘째인 2차 진행성 MS(SPMS)는 RRMS로 시작하지만 경로가 바뀌면서 급성 발작과 무관하게 일어나는 지속적인 기능 황폐로 특징지을 수 있다. 셋째인 1차 진행성 MS(PPMS)는 급성 발작 없이 발병시부터 지속적으로 일어나는 기능 저하로 특징지을 수 있다. 넷째인 진행/완화 MS(PRMS)는 진행성 경로를 따라 시작하지만, 기능 저하의 진행과 간헐적인 발작이 겹쳐 일어난다.

다발성 경화증 보유자는 운동 능력 평가, 선택적으로는 MRI를 이용하여 평가한다. 예를 들어 한 운동 능력 평가인 확장된 장애 상태 척도(expanded disability scale)에서는 보유자의 능력을 아래와 같이 순차적으로 점수화한다.

0.0 정상적인 신경학적 진단 결과

1.0 장애 없음. 한 FS에 최저 수준의 징후

1.5 장애 없음. 하나 이상의 FS에 최저 수준의 징후

2.0 한 FS에 최저 수준의 장애

2.5 한 FS에 사소한 장애 또는 두 FS에 최저 수준의 장애

3.0 한 FS에 중간 수준의 장애 또는 세네 FS에 사소한 장애. 완전한 보행 능력.

3.5 보행 완전하지만 한 FS에 중간 수준의 장애가 있고 몇몇 FS에 최저 수준보다 심한 장애.

4.0 비교적 심한 장애가 있으나 도움 필요 없고 하루에 약 12 시간 정도 스스로 완전한 보행 능력을 가짐. 약 500 미터 정도 도움이나 휴식 없이 걸음.

4.5 하루 대부분을 도움 없이 완전한 보행 능력을 가짐. 하루 종일 일할 수 있으며 완전한 활동에는 어떤 제약이 있거나 최저 수준의 도움이 필요할 수 있음. 비교적 심한 장애가 특징적이고 300 미터 정도 도움이나 휴식 없이 걸음.

5.0 약 200 미터 정도 도움이나 휴식 없이 걸음. 완전한 일상적 활동(특별한 준비 없이 하루 종일 일할 수 있는 상태)을 하는데 방해가 될 만큼 심한 장애

5.5 약 100 미터 정도 도움이나 휴식 없이 걸음. 완전한 일상적 활동을 배제할 만큼 심한 장애.

6.0 약 100미터를 휴식 없이 또는 쉬면서 걷는데 간헐적이거나 한 쪽 방향으로 고정적인 도움(지팡이, 목발, 고정기)을 요함.

6.5 약 20미터를 휴식 없이 또는 쉬면서 걷는데 양 방향으로 고정적인 도움(지팡이, 목발, 고정기)을 요함.

7.0 도움을 받아도 5미터를 넘어 걸을 수 없음. 실질적으로 휠체어에 매임. 표준 휠체어에서는 바퀴질을 혼자 하며 휠체어를 스스로 갈아탈 수 있음. 약 하루 12시간 동안 휠체어 사용 가능.

7.5 몇 발자국 이상 걸을 수 없음. 휠체어에 매임. 갈아탈 때 도움이 필요할 수 있음. 스스로 바퀴질을 하지만 표준 휠체어서 하루 종일 있을 수는 없음. 전동 휠체어가 필요할 수 있음.

8.0 실질적으로 의자 또는 침대에 매여 있거나 휠체어로 천천히 돌아다니 지만 침대로부터 하루 대부분 일어나 있을 수 있음. 스스로 돌보는 많은 기능을 유지하고 있으며 팔의 사용은 대개 효과적임.

8.5 하루 대부분 침대에 매여 있음. 몇가지는 팔을 효과적으로 사용하며 얼마간 스스로를 돌보는 기능이 있음.

9.0 침대를 떠날 수 없음. 대화와 식사가 가능.

9.5 가망 없는 침상 위의 환자. 효과적인 대화할 수 없거나 먹고 삼킬 수 없음.

10.0 다발성 경화증으로 인한 사망.

이 점수 체계에서 "FS"는 측정 대상인 여덟 가지 기능 체계(functional system)를 가리키는데, 추체계, 소뇌계, 뇌간계, 감각계, 대소장과 방광계, 시각계, 대뇌계와 기타 계를 포함한다.

다른 유사한 평가 체계도 알려져 있는데, Scripps 신경학적 평가 척도, 보행성 지표, 다발성 경화증 기능 복합 평가(MSFC) 등이 있다.

다발성 경화증의 진행은 발작 빈도를 측정함으로써 평가할 수도 있다.

다발성 경화증의 진행은 자기 공명 영상법을 이용하여 평가할 수도 있는데, 여기서는 다발성 경화증과 관련된 신경 손상(예를 들어 새로운 손상, 인핸싱 뇌 결절(enhancing brain nodule) 또는 통합 고유 활성 손상(combined unique active lesion))을 검출할 수 있다.

따라서 본 발명의 한 실시 태양에서는 다발성 경화증을 가지는 개인, 예를 들어 다발성 경화증 진단을 받은 개인을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 개인의 면역 반응을 억제하기에 충분한 수의 복수의 태반 줄기세포를 상기 개인에게 투여하는 단계를 포함한다. 한 특정 실시 태양에서 상기 투여는 이 개인의 다발성 경화증 증상을 하나 이상 측정 가능한 정도로 개선한다. 더 특정한 실시 태양에서 이 증상은 예를 들어, 사지의 하나 이상의 감각 장애, 시각 신경 기능 장애, 추체로 기능 장애, 방광 기능 장애, 창자 기능 장애, 성 기능 장애, 조화 운동 불능 및 겹보임이다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 투여는 EDSS 척도에서 적어도 1.5점 이상의 점수 향상을 가져온다. 다른 특정 실시 태양에서, 상기 투여는 EDSS 척도에서 2점 이상의 점수 향상을 가져온다. 다른 특정 실시 태양에서 상기 투여는 다발성 경화증 평가 척도 또는 자기 공명 영상법상으로 측정 가능한 증상 완화를 가져 온다.

다발성 경화증에 대하여 다른 치료제를 시도한 바 있다. 예를 들어 IFNβ-1a와 IFNβ-1b를 포함한 인터페론 베타 등의 면역 조절제 또는 면역 억제제, 아세트산글리아트리아머(Copaxone), 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트, 아자티오프린(Imuran), 클라드리빈(Leustatin), 사이클로스포린, 미톡산트론 등이다. 다발성 경화증에 대하여 부신피질자극호르몬(ACTH), 메틸프레드니솔론, 덱사메타손 등을 포함하는 당질 코르티코이드와 같은 항염증 치료제를 시도한 적도 있다. 다발성 경화증에 대해서는 정맥하 면역 글로불린, 혈장 교환술 또는 술파살라진(sulfasalazine) 등의 기타 치료제를 시도한 바도 있다.

따라서 본 발명은 나아가 다발성 경화증을 가지는 개인, 예를 들어 다발성 경화증 진단을 받은 개인을 치료하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 상기 개인의 면역 반응을 억제하기에 충분한 수의 복수의 태반 줄기세포 및 하나 이상의 치료제를 상기 개인에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 투여는 상기 개인의 다발성 경화증의 하나 이상의 증상을 측정 가능한 수준으로 개선한다. 한 실시 태양에서 이 치료제는 당질 코르티코이드이다. 한 특정한 실시 태양에서 이 당질 코르티코이드는 부신피질 자극호르몬, 메틸프레드니솔론 또는 덱사메타손이다. 다른 실시 태양에서 이 치료제는 면역 조절제 또는 면역 억제제이다. 많은 특정 실시 태양에서 이 면역 억제제 또는 면역 조절제는 IFNβ-1a, IFNβ-1b, 아세트산글리아트리아머, 사이클로포스파미드, 메토트렉세이트, 아자티오프린, 클라드리빈, 사이클로스포린 또는 미톡산트론이다. 다른 실시 태양에서 이 치료제는 정맥하 면역 글로불린, 혈장 교환술 또는 술파살라진이다. 다른 실시 태양에서 이 개인은 상기 치료제의 모든 조합을 투여받을 수 있다.

다발성 경화증의 진행 중 어느 시점에서라도 다발성 경화증을 가지는 개인, 예를 들어 다발성 경화증 진단을 받은 개인은 복수의 태반 줄기세포 치료를 받을 수 있고, 선택적으로는 하나 이상의 치료제도 투여받을 수 있다. 예를 들어, 이 개인은 진단 후 곧바로, 혹은 진단을 받은 시점으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6 일내에, 혹은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50주 또는 더 오랜 기간 안에, 혹은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10년 또는 더 오랜 기간 안에 치료를 받을 수 있다. 이 개인은 병의 임상 경과 도중에 한 번 또는 여러 번 치료받을 수 있다. 이 개인은 적절할 경우 급성 발작 도중, 증상 완화시 또는 만성 퇴행기 도중에 치료받을 수 있다. 다른 실시 태양에서는 상기 태반 줄기세포를 다발성 경화증을 앓고 있는 여성에게 분만 후에 투여하여, 임신 도중 경험한 증상 완화 또는 재발 빈도 감소를 유지할 수 있다.

한 실시 태양에서는 이 개인에게 약 3억개의 태반 줄기세포를 투여한다. 투여량은 그러나, 체중 등의 상기 개인의 신체적 특성에 따라 달라질 수 있어서, 투여량은 1회 투여 당 태반 줄기세포 1백만 내지 100 억개, 바람직하게는 1000만개와 10억개 사이, 또는 태반 줄기세포 5천만개와 1억개 사이 범위에 포함될 수 있다. 이러한 투여는 정맥 투여가 바람직하지만 살아있는 세포를 투여하는데 있어서 종래 기술에서 인정받은 어떠한 경로를 사용하여도 좋다. 한 실시 태양에서는 세포 은행에서 구한 태반 줄기세포를 사용한다.

도 1은 (A) 관류, (B) 양막, (C) 융모막 또는 (D) 양막-융모막판(amnion- chorion plate) 또는 (E) 제대 줄기세포에서 유래한 태반 줄기세포의 생존능(viability)을 나타낸다. x축의 숫자는 상기 줄기세포를 얻은 태반을 가리킨다.

도 2는 A) 관류, (B) 양막, (C) 융모막 또는 (D) 양막-융모막판(amnion-chorion plate) 또는 (E) 제대 줄기세포 중 HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺ 세포의 백분율을 FACSCalibur로 측정한 것을 나타낸다. x축의 숫자는 상기 줄기세포를 얻은 태반을 가리킨다.

도 3은 A) 관류, (B) 양막, (C) 융모막 또는 (D) 양막-융모막판(amnion-chorion plate) 또는 (E) 제대 줄기세포 중 HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺ 세포의 백분율 FACSAria로 측정한 것을 나타낸다. x축의 숫자는 상기 줄기세포를 얻은 태반을 가리킨다.

도 4는 태반 관류물에서 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 발현을 나타낸다.

도 5는 양막에서 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 발현을 나타낸다.

도 6은 융모막에서 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 발현을 나타낸다.

도 7은 양막-융모막판에서 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 발현을 나타낸다.

도 8은 제대에서 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 발현을 나타낸다.

도 9는 A) 관류, (B) 양막, (C) 융모막 또는 (D) 양막-융모막판(amnion-chorion plate) 또는 (E) 제대 유래한 줄기세포에서 HLA-G, CD10, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200의 평균 발현을 나타낸다.

도 10A와 10B. 림프구 혼합 배양 반응(MLR)은 미경험(naive) 면역 반응의 모형이며 태반 줄기세포에 의하여 억제된다. "생존(live)" 게이트를 통과한 비율과 CD8⁺과 CD4⁺ T 세포 게이트를 통과한 비율로부터 저농도 카복시플루오레사인 숙신이미드 에스테르 세포(CFSE^low 세포)의 백분율을 측정하였다(각각 도 10A와 10B). 이 백분율은 6일 동안의 MLR(도 10C와 10D, MLR 선) 그리고 태반 줄기세포의 부가시(도 3C와 3D, PMLR 선)에 증가하였고, 이 효과는 CD8⁺과 CD4⁺ T 세포 구역 양쪽 모두에서 역전되었다.

도 11. 양막-융모막판(AC)과 제대 버팀질(umbilical cord stroma, UC)로부터 얻은 태반 유래 줄기세포는 동종간 림프구 혼합 배양 반응(allo-MLR)을 억제한다. MLR 분석은 CD4⁺ T 세포 또는 CD8⁺ T 세포 또는 같은 수의 CD4⁺와 CD8⁺ T 세포를 가지고 수행하였다. 가로축: 증식 억제의 백분율

도 12는 태반 줄기세포와 제대 줄기세포가 동종간 림프구 혼합 배양 반응을 억제한다는 것을 나타낸다. 둥근 바닥 96-웰 플레이트를 이용한 6일간의 분석 결과이다. 태반 세포: T 세포: 가지상 세포(dendritic cell) = 약 1:10:1. 줄기세 포는 양막-융모막(AC), 양막(AM) 또는 제대(UC)에서 얻었다. FB: 섬유모세포. BM: 골수 유래 중간엽 줄기세포.

도 13은 서로 다른 기증자 유래의 태반 줄기세포가 동종간 림프구 혼합 배양 반응을 다른 정도로 억제한다는 것을 나타낸다. 이 그림은 61665와 63450으로 표시한 태반 기증자 두 명으로부터 얻은 태반 줄기세포의 MLR 억제도를 비교한다. 63450 태반에서 얻은 줄기세포는 61665 태반에서 얻은 줄기세포보다 MLR를 더 크게 억제하는 것처럼 보인다.

도 14는 14일간 회귀 분석(regression assay)과 변형 태반 줄기세포 회귀 분석을 나타낸다. x축은 분석시 부가된 태반 줄기세포의 수를 나타낸다. 생존한 CD23⁺ 림프모구 유사 세포주(lymphoblastoid cell line, LCL. 인공적으로 생산된 전환 B 세포주)의 수는 y축에 나타나 있다.

도 15는 6일간 회귀 분석에서 태반 줄기세포의 T 세포 증식 억제를 나타낸다. 카복시플루오레사인 숙신이미드 에스테르(CFSE) 염색된 T 세포를 이용하여 회귀 분석을 수행하였다. 6일 후 T 세포 증식을 평가하였다. 양막-융모막판(AC), 제대(UC), 양막(AM) 또는 골수(BM) 줄기세포의 T 세포 증식의 상대적인 억제 정도를 나타내었다.

도 16은 배양 배지 교체를 허용하는 조건에서 트랜스웰 삽입막(transwell insert)을 MLR에 도입하여 T 세포로부터 태반 세포를 분리하였을 때 억제도의 백분율 변화값을 나타낸다. MLR 당 제대 줄기세포수를 25,000, 50,000, 75,000 또는 100,000개로 하였을 때는 상대적으로 높은 수준의 억제가 이루어진다는 것과 높은 역가(titre)에서 억제를 이루기 위하여 세포 대 세포 접촉의 필요성이 상대적으로 높다는 점을 모두 보여준다.

도 17에서 12,500(UC OP/TW 12.5) 내지 100,000(UC OP/TW 100)개로 부가한 제대 버팀질 줄기세포(UC)는 MLR로부터 막(TW)에 의하여 분리되거나 또는 MLR과 접촉 상태(OP)에 있었다. CD4⁺ T 세포와 CD8⁺ T 세포를 같은 수로 사용하였고, MLR 억제도의 백분율(CFSE^low 89%)을 계산하였다.

도 18은 태반 줄기세포 용량과 세포 대 세포 접촉 의존성은 선형 관계가 아니라는 것을 나타낸다. 삽입막 도입시 MLR 억제의 변화는 도 17에 나타낸 값으로부터 계산하였다.

도 19는 태반 줄기세포와 BMSC가 T 세포 반응을 차별적으로 억제하는 것을 나타낸다. PDAC 또는 BMSC에 의한 억제도는 MLR에서 CFSE^low 게이트를 통과한, 70%를 넘는 수의 T 세포 백분율과 부착 세포 MLR를 비교하여 계산하였다. 이 MLR은 부착세포로부터 분리되어 수행되거나(트랜스웰) 또는 개방형 웰(open)에서 수행되었다. x 축은 500,000개의 T 세포와 50,000개의 가지상 세포에 더해진 부착세포의 수를 1000 단위로 나타낸다. 부착세포와 T 세포의 비율은 1:5 내지 1:40이다.

도 20은 태반 줄기세포와 골수 유래 줄기세포에 의한 면역 억제에 있어서 세포 대 세포 접촉 조건의 차이를 나타낸다. 도 15에 나타낸 억제 데이터로부터 접촉 의존도를 계산하여 부착세포/T 세포 비(n=2인 UC를 제외하고 n=3)에 대하여 표 시하였다.

도 21은 T 조절세포는 PDAC T 세포 억제에 필요하지 않다는 것을 나타낸다. 회귀 분석은 온전한 PBMC(붉은색과 푸른색 그래프) 또는 T 조절세포가 고갈된 PBMC(녹색 그래프)에 대하여 수행하였는데, 두 경우 모두 CFSE 염색을 하였고, 몇몇 조건(푸른색과 녹색 그래프)에서는 UC PDAC를 부가하였다. n=1.

도 22는 보조 MLR에서 CFSE^hi 세포는 증식한다. CFSE 염색한 PDAC MLR을 통하여 상기 CFSE^hi 세포fmf FACS Aria로 분리하였다. 이 세포를 MLR에서 이용하였다. n=1.

도 23은 줄기세포 MLR의 상청액이 75% 교체율에서 MLR을 억제하지 않는다는 것을 나타낸다. UC(PUC), AC(PAC)와 BMSC(PBM) MLR을 수행하였고, 모두 MLR을 50% 넘게 억제하였다. 실험에서 얻은 상청액을 이용하여 신선한 MLR에 쓸 배지 200 μL 중 10 내지 150 μL를 대체하였다. 대조군으로서 T 세포와 AC(T/AC) 또는 T 세포와 골수 유래 줄기세포(T/BM) 공동배양액의 배지를 같은 방식(n=2)으로 이용하였다.

도 24A, 24B. 전배양한 T 세포와 부착세포는 MLR 억제에 영향을 미치지 못한다. 두 기증자로부터 얻은 T 세포를 두 차례의 독립적인 실험에 이용하였다. 숙성한 가지상 세포(A) 또는 CFSE 염색한 CD3⁺ T 세포(B)를 제대 줄기세포(UC) 또는 골수 유래 줄기세포와 표시한 만큼의 날짜 동안 가지상 세포(제0일, A) 또는 CFSE⁺ CD3⁺ T 세포(B, 이로써 MLR을 개시함)의 부가 전까지 같이 배양하였다. 이어서 부착세포 MLR을 6일 동안 정상적으로 진행하였다. n=2.

도 25A, 25B: A. MLR에서 MIP-1α와 MIP-1β의 분비, 그리고 태반 줄기세포 또는 골수 유래 줄기세포의 MLR은 MLR 억제와 역방향 상관 관계가 있다. B. 같은 실험의 T 세포와 자연세포독성 세포 CFSE 데이터. 상청액은 MLR로부터 도 14B와 같이 채취하였고, MIP-1α와 MIP-1β의 존부를 분석하였다. B. MLR을 상술한 대로 수행하였고, CFSE^low 세포는 평균 55%(T 세포) 또는 83%(자연세포독성 세포) 수준에서 관측되었다. 줄기세포 부가시의 억제 효과를 계산하였다. n=2(자연세포독성 세포 부분은 n=1).

도 26. 변형 회귀 분석과 MLR 상청액에서, MCP-1을 측정하였다. 상기 태반 줄기세포에 의한 MLR 억제와 회귀 분석은 화학주성 물질(chemoattractant) MCP-1의 분비와 상관 관계가 있다. AC: 양막-융모막판에서 얻은 줄기세포. UC: 제대에서 얻은 줄기세포. 옅은 색 막대: MLR 분석법 결과. 짙은 색 막대: 회귀 분석 결과. y축: 분석 용액 속 MCP-1(pg).

도 27은 변형 MLR과 회귀 분석 시험의 상청액 속 IL-6 측정 결과를 나타낸다. 상기 태반 줄기세포에 의한 MLR 억제와 회귀 분석은 IL-6 분비와 상관 관계를 가진다. AC: 양막-융모막판에서 얻은 줄기세포. UC: 제대에서 얻은 줄기세포. 옅은 색 막대: MLR 분석법 결과. 짙은 색 막대: 회귀 분석 결과. y축: 분석 용액 속 IL-6 (pg).

1. 태반 줄기세포의 배양

분만 후의 포유류 태반으로부터 관류 혹은 효소 소화 등의 물리적 파괴에 의하여 태반 줄기세포를 얻을 수 있다. 이 세포를 60% DMEM-LG(Gibco), 40% MCDB-201(Sigma), 2% 소 태아 혈청(FCS) (Hyclone Laboratories), 1×인슐린-트랜스페린-셀렌(ITS), 1×리놀렌산-소 혈청 알부민(LA-BSA), 10⁹ M 덱사메타손(Sigma), 10⁴ M 아스코르브산 2-인산(Sigma), 표피 성장 인자(EGF) 10 ng/mL(R&D Systems), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF-BB) lO ng/mL(R&D Systems)과 1OO 단위 penicillin/100O 단위 스트렙토마이신을 함유하는 배양 배지 속에서 배양한다.

이 세포들이 배양되는 배양 플라스크는 다음과 같이 마련할 수 있다. 피브로넥틴(FN) 피복 T75 플라스크는 5 ng/mL 사람 피브로넥틴(Sigma F0895)을 함유하는 PBS 5 mL를 이 플라스크에 가하여 마련할 수 있다. 이 피브로넥틴 용액을 담은 플라스크를 37℃에서 30 분 동안 방치한다. 이어서 세포 배양 전 이 피브로넥틴 용액을 덜어낸다. 이러한 처리 이후 플라스크를 건조할 필요는 없다. 혹은 이 플라스크를 4℃에서 하룻밤 동안 또는 더 오랜 동안 피브로넥틴 용액과 접촉시킬 수 있다. 세포 배양 전 이 플라스크를 덥히고 피브로넥틴 용액을 덜어낸다.

관류에 의한 태반 줄기세포의 분리

태반 관류물로부터 태반 줄기세포 배양을 확립하는 절차는 다음과 같다. 피콜 농도구배에서 얻은 세포를 상기와 같이 하여 얻은 피브로넥틴 피복 T75 플라스 크에 플라스크 당 50~100×10⁶ 개 세포를 15 mL 배양 배지 속에 담아 파종한다. 5개에서 10 개의 플라스크가 필요한 것이 전형적인 경우이다. 이 플라스크를 12~18 시간 동안 37℃에서 배양하여 세포가 부착하도록 한다. 따뜻한 PBS 10 mL를 각 플라스크에 가하여 세포를 현탁하여 제거하고 천천히 섞어 준다. 이 배지 15 mL를 덜어낸 다음 새 배양 배지 15 mL를 가한다. 배지 전부를 배양 시작 후 3~4일 후에 갈아준다. 그 다음 배지 교체에서는 배지의 50% 또는 7.5 mL를 꺼내어 갈아준다.

대략 제12일째에 이 세포 배양액을 현미경으로 확인하여 부착 세포 콜로니가 성장했는지 점검한다. 세포 배양이 약 80% 세포 합류 수준, 전형적으로는 배양 시작 후 제13일 내지 제18일째에 이르면 부착 세포를 트립신 소화에 의하여 수확한다. 이 1차 배양으로부터 수확한 세포를 제0 계대로 일컫는다.

물리적 파괴와 효소 소화에 의한 태반 줄기세포의 분리

소화된 태반 조직으로부터 태반 줄기세포 배양을 확립하는 절차는 아래와he 같다. 관류된 태반을 무균 종이 시트 위에 모체 쪽을 위로 하여 올려 놓는다. 모체 쪽 태반 표면층의 약 0.5 cm를 칼날로 제거하고, 그 칼날을 이용하여 대략 1×2×1 cm 크기의 태반 조직 절편을 떼어낸다. 이 태반 조직을 다시 잘게 썰어 약 1 ㎣ 크기 조각으로 나눈다. 이들 조각을 50 mL 팔콘(Falcon) 튜브에 모으고 콜라겐 분해 효소 IA(2 mg/ml, Sigma)로 30분 동안 소화한 다음 트립신-EDTA (0.25%, GIBCO BRL)로 37℃ 물 중탕에서 10분 동안 처리한다. 이렇게 얻은 용액을 40O g에 서 10분 동안 실온 원심분리하여 효소 소화 용액을 덜어낸다. 이 펠렛으로부터 약 10 부피의 PBS 현탁액(예를 들어 5 mL 펠렛은 45 mL PBS에 현탁하게 된다)을 얻은 다음, 이 튜브를 40O g에서 10분 동안 실온 원심분리한다. 이 조직/세포 펠렛을 130 mL의 배양 배지 속에 재현탁한 다음, 피브로넥틴 피복 T75 플라스크마다 13 mL의 세포를 파종한다. 세포를 37℃의 5% 이산화탄소 농도 가습 공기 속에서 배양한다. 이 단계에서는 선택적으로 태반 줄기세포를 냉동보존할 수 있다.

태반 줄기세포의 계대 배양과 증폭

37℃ 물 중탕으로 냉동보존된 세포를 급히 해동한다. 따뜻한 배지 10 mL로 냉동 비알로부터 태반 줄기세포를 곧바로 꺼내어 15 mL 짜리 무균 튜브로 옮긴다. 이 세포를 40O g에서 10분 동안 실온 원심분리한다. 이 세포를 피펫을 통하여 10 mL의 따뜻한 배지 속에 조심스레 현탁하고, 트리판블루 배제 실험으로 생존능이 있는 세포 수를 센다. 상술한 대로 준비한 피브로넥틴 피복 플라스크에 6000~7000 세포/㎠의 비율(T-75 플라스크 당 약 5×10⁵ 세포)로 세포를 파종한다. 이 세포를 37℃로 5% 이산화탄소와 90% 습도 하에서 배양한다. 세포가 75~85% 세포합류 수준에 이르르면 사용된 배지 전부를 플라스크에서 무균 제거한 다음 버린다. 0.25% 트립신/EDTA(w/v) 용액 3 mL를 가하여 세포층을 덮고, 이 세포를 5분 동안 37℃, 5% 이산화탄소와 90% 습도 하에서 배양한다. 이 플라스크를 한 두 차례 가볍게 건드려 세포 탈착을 돕는다. 95%를 넘는 수의 세포가 탈착하고 구형이 되면, 각 T-75 플라스크에 따뜻한 배양 배지 7 mL를 가하고 이 용액을 세포층 표면에 몇 차례 피펫질하여 분산시킨다.

상술한 것처럼 세포 수를 세고 생존능을 측정한 다음, 이 세포를 분당 회전수 1000으로 실온에서 5분 동안 원심분리한다. 하나의 T-75 플라스크에서 나온 세포 펠렛을 배양 배지 속에 부드럽게 현탁하고 이를 두 개의 피브로넥틴 피복 T-75 플라스크 표면에 골고루 나눠 편다.

상기 방법을 이용하여 CD105, CD117, CD33, CD73, CD29, CD44, CD10, CD90과 CD133을 발현하는 부착성 태반 줄기세포군들을 동정하였다. 이 세포군은 CD34 또는 CD45를 발현하지 않는다. 이 태반 줄기세포 배양 중 전부가 아닌 일부는 HLA-ABC 및/또는 HLA-DR를 발현하였다.

2. 태반 구조로부터 태반 줄기세포의 부리

2.1 실험 재료와 방법

2.1.1 관심 대상 표현형의 분리

정상적인 만기 임신으로부터 서로 다른 다섯 종류의 태반 세포군을 얻었다. 모든 기증자는 연구 목적을 위하여 자신의 태반이 사용되는데 대하여 완전하게 서면으로 동의하였다. 다섯 종류의 세포군을 분석하였다: (1) 태반 관류물(태반 혈관계를 관류하여 얻음) (2) 양막 효소 소화물 (3) 융모막 효소 소화물 (4) 양막-융모막판 효소 소화물과 (5) 효소 소화로 얻은 탯줄 세포. 다양한 이들 조직을 무균 PBS(미국 캘리포니아주 Carlsbad의 Gibco-Invitrogen Corporation)로 세척하고 무균 페트리 접시 위에 각각 올려 놓았다. 이들 조직을 무균 수술용 작은칼(scalpel)로 잘게 썬 다음 50 mL 원추형 Falcon 튜브 속에 담았다. 잘게 썬 조 직을 37℃ 물 중탕 속에서 1× 콜라겐 분해 효소(미국 미주리주 세인트루이스 Sigma- Aldrich)로 20분 동안 소화한 다음 0.25% 트립신-EDTA(Gibco-Invitrogen Corp)으로 37℃ 물 중탕 속에서 10분 동안 소화하였다. 다양한 이들 조직을 소화 후 원심분리하고 무균 PBS(Gibco-Invitrogen Corp)로 헹구어 주었다. 재구성한 세포를 두 차례 걸러주었는데 한 번은 100 ㎛ 세포 체(strainers)로써 한 번은 30㎛ 분리용 필터로 걸러 잔류 세포외 매트릭스 또는 세포 파편을 없앴다.

2.1.2 세포 생존능 평가와 세포 수 세기

수동 방식의 트리판블루 배제법을 이용하여 소화 후 세포 수와 그 생존능을 측정하였다. 세포를 트리판블루 염료(Sigma-Aldrich)와 1:1 비율로 섞은 다음 이 세포를 혈구계로 세었다.

2.1.3 세포 표면 표지의 특성 분석

HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺인 세포를 특성 분석을 위하여 선별하였다. 이 표현형을 갖춘 세포를 동정하고, 수를 센 다음, 두 대의 Becton-Dickinson사의 흐름세포 측정 장치인 FACSCalibur와 FACS Aria(미국 캘리포니아주 산호세 Becton-Dickinson)로 특성을 분석하였다. 이들 다양한 태반 세포를 세포 1백만 개당 약 10 μL 항체의 비율로 교반기 위에서 30 분 동안 실온에서 염색하였다. 다음에 나타낸 항-사람 항체를 사용하였다: 이소티오시안산플루오레사인(FITC) 결합 단일 클론항체로서 HLA-G(미국 노스캐롤라이나주 Raleigh의 Serotec), CD1O(미국 캘리포니아주 산호세의 BD Immunocytometry Systems), CD44(미국 캘리포니아주 산호세의 BD Biosciences Pharmingen)와 CD105(미국 미네소타주 미니아폴리스의 R&D Systems Inc.)에 대한 항체; 피코에리드린(PE) 결합 단일클론 항체로서 CD44, CD200, CD117 및 CD13에 대한 항체(BD Biosciences Pharmingen); 피코에리드린-CY5(PE Cy5) 결합 스트렙아비딘과 CD117에 대한 단일클론 항체(BD Biosciences Pharmingen); 피코에리드린-Cy7(PE Cy 7) 결합 단일클론 항체로서 CD33과 CD1O 에 대한 항체(BD Biosciences); 알로피코시아닌(APC) 결합 스트렙아비딘과 단일클론 항체로서 CD38에 대한 것(BD Biosciences Pharmingen); 그리고 바이오틴화 CD90 (BD Biosciences Pharmingen). 배양 후, 이 세포를 한 번 헹구어 주어 결합하지 않은 항체를 씻어내고, 하룻밤 동안 4℃에서 4% 파라포름알데히드(미국 오하이오주 클리블랜드의 USB)로 고정하였다. 다음 날, 이 세포를 두 차례 헹구어 준 다음, 30 μm 필터로 여과하였다. 이어서 세포를 흐름 세포측정 장치에 넣고 실험하였다.

항 마우스 IgG 항체(BD Biosciences Pharmingen)로 염색한 시료를 음성 대조군으로 사용하여 광증전 증배관(PMTs)을 조정하였다. 항 사람 항체 하나만으로 염색한 시료는 양성 대조군으로 사용하여 스펙트럼의 겹침/보상(overlaps/compensation) 정도를 보정하였다.

2.1.4 세포 분류와 배양

한 집단의 태반 세포(관류물, 양막 또는 융모막 유래)를 7-아미노-악티노마이신 D(7AAD, BD Biosciences Pharmingen)과 관심 대상 표현형에 특이적인 단일클론 항체로 염색하였다. 이 세포를 세포 백만 개 당 항체 10 mL의 비율로 염색하고 실온에서 30분 동안 교반기 위에서 배양하였다. 이어서 BD FACS Aria를 이용하여 이들 세포 중 관심 대상 표현형을 발현하는 살아 있는 세포를 분류하고 배지에 고루 발라주었다. 분류(sorted, 관심 대상 세포군)와 "전체"(all, 분류되지 않은 세포) 태반 세포군을 배지에 발라주어 비교하였다. 세포는 피브로넥틴(Sigma- Aldrich) 피복 96 웰 플레이트에 표 1에 나타낸 세포 밀도(세포/cm²)로 발라주었다. 이 세포 밀도, 그리고 해당 세포 유형을 이중으로 혹은 삼중으로 배지에 발라주는지 여부는 해당 관심 표현형을 발현하는 세포의 수에 따라 결정하였다.

배지에 바른 세포의 밀도

96 웰 플레이트 배양
배지 표면에 발라준 세포의 밀도
조 건	분 류(sorted)	전체(all)	전체 최고 밀도
세포원	A
제1집합	40.6×103/㎠	40.6×103/㎠	93.8×103/㎠
제2집합	40.6×103/㎠	40.6×103/㎠	93.8×103/㎠
제3집합	40.6×103/㎠	40.6×103/㎠	93.8×103/㎠
조건	B
제1집합	6.3×103/㎠	6.3×103/㎠	62.5×103/㎠
제2집합	6.3×103/㎠	6.3×103/㎠	62.5×103/㎠
조건	C
제1집합	6.3×103/㎠	6.3×103/㎠	62.5×103/㎠
제2집합	6.3×103/㎠	6.3×103/㎠	62.5×103/㎠

완전 배지(60% DMEM-LG (Gibco)와 40% MCDB-201(Sigma); 2% 소 태아 혈청(Hyclone Labs.); 1x인슐린-트랜스페린-셀렌(ITS); 1x리놀렌산-소 혈청 알부민(LA-BSA); 10⁹ M 덱사메타손(Sigma); 10 ⁴ M 아스코르브산 2-인산(Sigma); 표피 성장 인자 10 ng/mL (R&D Systems); 혈소판 유래 성장 인자(PDGF-BB) 10 ng/mL (R&D Systems)) 를 상기 96 웰플레이트의 각 웰에 가하고 이 플레이트를 5% CO₂/37℃ 배양기 속에 놓았다. 제7일에 완전 배지 100 mL를 각 웰에 부가하였다. 이 96 웰 플레이트를 약 2주 동안 감시하고, 제12일에 배양물의 최종 평가를 마무리하였다.

2.1.5 데이터 분석

표준적 게이트 기법을 이용하여 FASCalibur 데이터를 FlowJo (Tree star, Inc) 소프트웨어로 분석하였다. BD FACS Aria 데이터는 FACSDiva 소프트웨어(Becton- Dickinson)로 분석하였다. FACS Aria 데이터는 표준적인 게이트 조절법 뿐 아니라 중복신호 구별 게이트 조절법(doublet discrimination gating)을 사용하여 중복신호(doublet)를 최소화하였다. 모든 결과는 마이크로소프트 엑셀에 정리하였고, 본 명세서의 모든 수치는 평균±표준편차(수치, 평균 표준오차 standard error of mean, SEM) 형태로 나타내었다.

2.2 결과

2.2.1 세포 생존률

소화 후 생존률은 수동 트리판블루 배제법(도 1)을 이용하여 평가하였다. (양막, 융모막 또는 양막-융모막 판에서 유래한) 소화된 조직의 평균 세포 생존률은 약 70%였다. 양막 유래 세포는 평균 세포 생존률이 74.35%±10.31% (n=6, SEM=4.21), 융모막 유래 세포는 평균 생존률이 78.18%±12.65% (n=4, SEM=6.32), 양막-융모막 판은 평균 생존률이 69.05%±10.80% (n=4, SEM=5.40)이었고 탯줄은 평균 생존률이 63.30%±20.13% (n=4, SEM=1O.06)였다. 관류물 유래의 세포로서 소화 처리하지 않은 세포는 가장 높은 생존률인 89.98±6.39% (n=5, SEM=2.86)을 나타내었다.

2.2.2 세포 계량

태반에서 유래한 5 종류의 서로 다른 세포군을 분석하여 HLA ABC^-/CD45^-/CD34^-/CD133⁺ 세포의 수를 결정하였다. BD FACSCalibur 데이터 분석 결과, 양막, 관류물 그리고 융모막에서 이들 세포의 총수가 가장 많았다. 각각 30.72±21.80 세포 (n=4, SEM=10.90), 26.92±22.56 세포 (n=3, SEM=13.02)와 18.39±6.44 세포 (n=2, SEM=4.55)였다(데이터 미표시). 양막-융모막판과 탯줄은 이러한 관심 대상 표현형을 발현하는 세포의 총수가 가장 적었다. 각각 4.72±4.16 세포(n=3, SEM=2.40)와 3.94±2.58 세포(n=3, SEM=1.49)였다(데이터 미표시).

마찬가지로 이러한 관심 대상 표현형을 발현하는 세포의 총수를 백분율 분석하자, 양막과 태반 관류물이 이러한 표현형을 발현하는 세포를 가장 높은 비율로 함유하였다(각각 0.0319%±0.0202%(n=4, SEM=0.0101)와 0.0269%±0.0226%(n=3, SEM=0.0130)였다. 도 2 참조). 비록 탯줄은 이러한 관심 대상 표현형을 발현하는 세포를 조금밖에 가지고 있지 않았지만(도 2), 이 관심 대상 표현형을 발현하는 세포의 비율은 세번째로 높았다. 0.020±0.0226%(n=3, SEM=0.0131)(도 2). 융모막과 양막-융모막판은 이 관심 대상 표현형을 발현하는 세포의 비율이 가장 낮았는데, 각각 0.0184±0.0064%(n=2, SEM=0.0046)와 0.0177±0.0173%(n=3, SEM=0.010)이었다(도 2).

BD FACS Aria 데이터에서도 또한 양막, 관류물과 융모막이 HLA ABC^- /CD45^-/CD34^-/CD133⁺ 세포를 나머지 세포원보다 더 많이 제공하는 세포원으로 나타나 상기 BD FACSCalibur 분석 결과와 부합하였다. 양막, 관류물, 융모막에서 관심 대상 표현형을 발현하는 세포 총수의 평균은 각각 126.47±55.61 세포(n=15, SEM=14.36), 81.65±34.64 세포(n=20, SEM=7.75)와 51.47±32.41 세포(n=15, SEM=8.37)였다(데이터 미표시). 양막-융모막판과 탯줄은 이 관심 대상 표현형을 발현하는 세포의 비율이 가장 낮았는데, 각각 44.89±37.43 세포(n=9, SEM=12.48)와 11.00±4.03 세포(n=9, SEM=1.34)였다(데이터 미표시).

BD FACS Aria 데이터는 B와 A 세포원이 가장 높은 비율로 HLA ABC^- /CD45^-/CD34^-/CD133⁺ 세포를 함유하며, 각각 0.1523±0.0227%(n=15, SEM=0.0059)와 0.0929±0.0419%(n=20, SEM=0.0094)임을 나타내었다(FIG. 3). D 세포원은 관심 대상 표현형을 발현하는 비율이 세번째로 높았는데, 0.0632±0.0333%(n=9, SEM=0.0111)였다(도 3). C와 E 세포원은 관심 대상 표현형을 발현하는 비율이 가장 낮았는데, 각각 0.0623±0.0249%(n=15, SEM=0.0064)와 0.0457±0.0055%(n=9, SEM=0.0018)였다(도 3).

각 세포원으로부터 HLA ABC^- /CD45^-/CD34^-/CD133⁺ 세포들을 동정하고 그 수를 계량한 다음에, 세포가 세포 표면 표지 HLA-G, CD1O, CD13, CD33, CD38, CD44, CD90, CD105, CD117, CD200와 CD105를 발현하는지 여부를 나아가 분석하고 특성 파악하였다.

2.2.3 태반 관류물 유래 세포

관류물 유래 세포는 일관되게 HLA-G, CD33, CD1 17, CD1O, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105와 표지에 대하여 양성이었다(도 4). 관류물 유래 세포에서 각 표지의 평균 발현은 다음과 같다: 세포 중 37.15%±38.55%(n=4, SEM=19.28)가 HLA-G 발현; 세포 중 36.37%±21.98%(n=7, SEM=8.31)가 CD33 발현; 세포 중 39.39%±39.91%(n=4, SEM=19.96)가 CD117 발현; 세포 중 54.97%±33.08%(n=4, SEM=16.54)가 CD10 발현; 세포 중 36.79%±11.42%(n=4, SEM=5.71)가 CD44 발현; 세포 중 41.83%±19.42%(n=3, SEM=1 1.21)가 CD200 발현; 세포 중 74.25%±26.74%(n=3, SEM=15.44)가 CD90 발현; 세포 중 35.10%±23.10%(n=3, SEM=13.34)가 CD38 발현; 세포 중 22.87%±6.87%(n=3, SEM=3.97)가 CD105 발현; 세포 중 25.49%±9.84%(n=3, SEM=5.68)가 CD13 발현.

2.2.4 양막 유래 세포

양막 유래 세포는 일관되게 HLA-G, CD33, CD1 17, CD1O, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105와 CD13에 대하여 양성이었다(도 5). 양막 유래 세포에서 각 표지의 평균 발현은 다음과 같다: 세포 중 57.27%±41.11%(n=3, SEM=23.73)가 HLA-G 발현; 세포 중 16.23%±15.81%(n=6, SEM=6.46)가 CD33 발현; 세포 중 62.32%±37.89%(n=3, SEM=21.87)가 CD117 발현; 세포 중 9.71%±13.73%(n=3, SEM=7.92)가 CD1O 발현; 세포 중 27.03%±22.65%(n=3, SEM=13.08)가 CD44 발현; 세포 중 6.42%±0.88%(n=2, SEM=0.62)가 CD200 발현; 세포 중 57.61%±22.10%(n=2, SEM=15.63)가 CD90 발현; 세포 중 63.76%±4.40%(n=2, SEM=3.11)가 CD38 발현; 세포 중 20.27%±5.88%(n=2, SEM=4.16)가 CD105 발현; 세포 중 54.37%±13.29%(n=2, SEM=9.40)가 CD13 발현.

2.2.5 융모막 유래 세포

융모막 유래 세포는 일관되게 HLA-G, CD1 17, CD1O, CD44, CD200, CD90, CD38와 CD13에 대하여 양성이었지만 CD33와 CD105의 발현은 가변적이었다(도 6). 융모막 유래 세포에서 각 표지의 평균 발현은 다음과 같다: 세포 중 53.25%±32.87%(n=3, SEM=18.98)가 HLA-G 발현; 세포 중 15.44%±11.17%(n=6, SEM=4.56)가 CD33 발현; 세포 중 70.76%±11.87%(n=3, SEM=6.86)가 CD117 발현; 세포 중 35.84%±25.96%(n=3, SEM=14.99)가 CD1O 발현; 세포 중 28.76%±6.09%(n=3, SEM=3.52)가 CD44 발현; 세포 중 29.20%±9.47%(n=2, SEM=6.70)가 CD200 발현; 세포 중 54.88%±0.17%(n=2, SEM=0.12)가 CD90 발현; 세포 중 68.63%±44.37%(n=2, SEM=31.37)가 CD38 발현; 세포 중 23.81%±33.67%(n=2, SEM=23.81)가 CD105 발현; 세포 중 53.16%±62.70%(n=2, SEM=44.34)가 CD13 발현.

2.2.6 양막- 융모막판 태반 세포

양막-융모막판 유래 세포는 일관되게 HLA-G, CD33, CD117, CD1O, CD44, CD200, CD90, CD38, CD105와 CD13에 대하여 양성이었다(도 7). 양막-융모막판 유래 세포에서 각 표지의 평균 발현은 다음과 같다: 세포 중 78.52%±13.13%(n=2, SEM=9.29)가 HLA-G 발현; 세포 중 38.33%±15.74%(n=5, SEM=7.04)가 CD33 발현; 세포 중 69.56%±26.41%(n=2, SEM=18.67)가 CD117 발현; 세포 중 42.44%±53.12%(n=2, SEM=37.56)가 CD1O 발현; 세포 중 32.47%±31.78%(n=2, SEM-22.47)가 CD44 발현; 세포 중 5.56%(n=1)가 CD200 발현; 세포 중 83.33%(n=1)가 CD90 발현; 세포 중 83.52%(n=1)가 CD38 발현; 세포 중 7.25%(n=1)가 CD105 발현; 세포 중 81.16%(n=1)가 CD13 발현.

2.2.7 탯줄 유래 세포

탯줄 유래 세포는 일관되게 HLA-G, CD33, CD90, CD38, CD105와 CD13에 대하여 양성이었지만 CD117, CD1O, CD44와 CD200의 발현은 가변적이었다(도 8). 탯줄 유래 세포에서 각 표지의 평균 발현은 다음과 같다: 세포 중 62.50%±53.03%(n=2, SEM=37.50)가 HLA-G 발현; 세포 중 25.67%±11.28%(n=5, SEM=5.04)가 CD33 발현; 세포 중 44.45%±62.85%(n=2, SEM=44.45)가 CD117 발현; 세포 중 8.33%±11.79%(n=2, SEM=8.33)가 CD1O 발현; 세포 중 21.43%±30.30%(n=2, SEM=21.43)가 CD44 발현; 세포 중 0.0%(n=1)가 CD200 발현; 세포 중 81.25%(n=1)가 CD90 발현; 세포 중 64.29%(n=1)가 CD38; 세포 중 6.25%(n=1)가 CD105 발현; 세포 중 50.0%(n=1)가 CD13 발현.

모든 표지 발현의 평균을 정리한 결과는 도 9에 나타내었다.

2.2.8 BD FACS Aria 분류 결과 보고서

HLA ABC, CD45, CD34와 CD133을 가장 높은 비율로 발현하는 세가지 서로 다른 세포군(관류물, 양막과 융모막 유래 세포)를 7AAD와 다른 이들 표지에 대한 항체로 염색하였다. 이 세 종류의 세포군에 대하여 관심 대상 표현형을 발현하는 세포를 적극적으로 세포 분류하였다. BD FACS Aria 세포 분류 결과는 표 2에 나타나 있다.

BD FACS Aria 세포 분류 보고서
세포원	처리한 이벤트 수	분류한 이벤트 수 (관심 대상 표현형)	전체에 대한 %
관류물	135540110	51215	0.037786
양막	7385933	4019	0.054414
융모막	108498122	4016	0.003701

적극적 세포 분류에 따라 얻은 세 종류의 서로 다른 세포군("분류")과 그에 대응하는 비분류 세포군을 배지 표면에 발라준 다음 배양하여 그 결과를 제12일째에 평가하였다(표 3). 분류된 관류물 유래 세포는 세포 밀도 40,600 세포/cm²로 발라주었는데, 작고 둥근 비부착 세포를 낳았다. 관류물 유래 비분류 세포 세 세포군 중 둘은 대부분 작고, 둥글며 웰 가장자리에 몇몇 부착세포를 가지는 비부착성 세포를 낳았는데, 이들은 세포 밀도를 40,600 세포/cm²로 하여 배지에 발라주었다. 관류물 유래 비분류 세포는 배지에 93,800 세포/cm²로 발라주었는데, 대부분 작고, 둥글며 웰 가장자리에 몇몇 부착세포를 가지는 비부착성 세포를 낳았다.

양막 유래 분류 세포는 배지에 6,300 세포/cm²로 발라주었는데, 작고, 둥근 비부착 세포를 낳았다. 양막 유래 비분류 세포는 밀도를 6,300 세포/cm²로 하여 배지에 발라주었는데, 작고, 둥근 비부착 세포를 낳았다. 양막 유래 비분류 세포 중 밀도를 62,500 세포/cm²로 하여 발라준 것은 작고 둥근 비부착 세포를 낳았다.

융모막 유래 분류 세포는 배지에 6,300 세포/cm²로 발라주었는데, 작고, 둥근 비부착 세포를 낳았다. 융모막 유래 비분류 세포는 밀도를 6,300 세포/cm²로 하여 배지에 발라주었는데, 작고, 둥근 비부착 세포를 낳았다. 융모막 유래 비분류 세포 중 밀도를 62,500 세포/cm²로 하여 발라준 것은 작고 둥근 비부착 세포를 낳았다.

3. 실시예 3 : 태반 줄기세포의 분화

부착성 태반 줄기세포를 몇 가지 서로 세포 계통으로 분화하였다. 부착 태반 줄기세포는 양막, 융모막, 태반엽 또는 이들의 조합을 포함하는 태반 내 해부 자리의 조직을 물리적으로 파괴하여 태반에서 얻었고, 제대 줄기세포는 제대 조직을 물리적으로 파괴하여 얻었다.

태반 줄기세포와 제대 줄기세포를 낮은 농도의 소 태아 혈청과 제한적인 분량의 성장 인자가 들어 있는 배지 속에서 수립하였다. 흐름 세포 측정 결과, 전형적인 태반 줄기세포는 CD200⁺CD105⁺CD73⁺CD34^-CD45^- 표현형이 70% 이상인 것으로 나타났다. 태반 줄기세포는 지방세포, 연골세포와 골세포 계통으로 분화한 것으로 밝혀졌다.

IBMX, 인슐린, 덱사메타손과 인도메타신이 함유된 유도 배지(induction medium) 속에서 줄기세포는 3 내지 5 주만에 지방이 축적된 지방세포로 바뀌었다. 골 형성 유도 배양 조건에서는 태반 줄기세포가 골 결절(bone nodule)을 형성하고 세포외 매트릭스에 칼슘 침착을 일으킨 것으로 드러났다. 태반 유래 부착 세포(placenta-derived adherent cell, PDAC)의 연골 형성 분화는 미세펠렛(micropellet) 형태로 이루어졌으며 조직 덩어리(tissue aggregate) 속의 글리코스아미노글리칸 생성을 통하여 확인되었다.

4. 실시예 4 : 태반 줄기세포를 이용한 면역 조절

태반 줄기세포는 T 세포와 자연세포독성 세포의 증식 억제를 포함하는 면역 조절 효과를 지닌다. 이하의 실험은 태반 줄기세포가 림프구 혼합 배양 반응 분석과 회귀 분석의 두 가지 분석에서 자극에 대한 T 세포 반응을 조절하는 능력을 지닌다는 점을 밝혀준다.

4.1 림프구 혼합 배양 분석

MLR은 표적 세포군에 대한 작동 세포군(effector population)의 반응을 측정한다. 여기서 작동 세포는 림프구 또는 CD8⁺ T 세포 또는 NK 세포와 같은 정제된 부분 세포군일 수 있다. 표적 세포군은 동종 이형인 피조사(allogeneic irradiated) 말초혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)이거나, 본 발명의 명세서에서 처럼 성숙한 가지상세포이다. 반응 세포군(responder population)은 전체 T 세포의 20%로 추산되는 동종이형 특이(allo-specific) 세포로 이루어진다. 변형 태반줄기세포 MLR은 반응에서 태반 줄기세포를 이용한다.

태반 줄기세포를 96 웰 플레이트 웰 속에 발라준 다음 작용체 세포군을 가하였다. 태반 줄기세포와 아세트산5(6)-카르복시플루오레사인 N-숙신이미드 에스테르(CFSE)로 염색한 작용체를 표적물인 성숙한 가지상세포의 부가 전에 24시간 동안 전배양하였다. 6일 후에 상청액과 비부착 세포를 수확하였다. 상청액을 Luminex 비드 분석법으로 분석하고, 세포를 흐름 세포 측정법으로 분석하였다.

고전적인 MLR은 CD8⁺과 CD4⁺ T 세포 구역(compartment)에서 증식 반응을 나타낸다. 이 반응은 두 동종이형 기증자끼리 서로 만난 적이 없기 때문에 미경험 T 세포의 반응이다. 표준 MLR에서는 CD8⁺과 CD4⁺ T 세포가 양쪽 모두 맹렬하게 증식하였다. 태반 줄기세포를 MLR에 가하자, CFSE^Low 반응 세포(responder cell)의 비율로써 측정한 상기 CD8⁺과 CD4⁺ T 세포 증식은 저하되었다.

태반 줄기세포를 MLR에 가했을 때 일어나는 효과(PMLR)는 도 3A와 3B(PMLR 그래프), 그리고 도 4에서 볼 수 있다. CD4⁺만을 또는 CD8⁺ T 세포만을 각각 사용하건, CD4⁺와 CD8⁺ T 세포를 같은 양으로 함께 사용하건 결과는 비슷하였다. 양막-융모막판 또는 탯줄 버팀질(umbilical cord stroma)로부터 얻은 태반 줄기세포는 MLR에서 비슷한 정도로 면역 반응을 억제하였으며, CD8⁺과 CD4⁺ T 세포 사이에 차이는 나타나지 않았다. 이는 전체 T 세포 반응(bulk T cell reaction)도 마찬가지였다.

CD8⁺ T 세포, CD8⁺ T 세포, CD8⁺과 CD4⁺ T 세포, 그리고 동종 이형 가지상 세포(DC)에 대하여 별도의 MLR을 수행하였다. 태반 줄기세포를 MLR에 가하고, 태반 줄기세포가 없는 MLR을 대조군으로 삼아 T 세포 증식 정도를 평가하였다.

CD4⁺와 CD8⁺ T 세포와 CD14⁺ 단핵세포를 백혈구 연층(軟層 buffy coat)으로부터 Miltenyi MACS 컬럼과 비드를 써서 제조사의 설명에 따라 분리하였다. 가지상 세포는 단핵 세포를 1% 헌혈 혈장(donor plasma), IL-4와 GM-CSF이 보충된 RPMI 1640 속에서 6일 동안, 그리고 IL- lβ, TNF-α와 IL-6로 보강된 RPMI 1640 속에서 이틀 동안 배양하여 얻었다. 동종 이형(allogeneic) T 세포와 가지상 세포(DC)를 T 세포:DC= 10:1의 비율로 배양하여 고전적인 6일 MLR을 달성하였다. T 세포 증식은 T 세포를 MLR 분석에 부가하기 전에 CFSE(Carboxy-fluorescein diacetate, succinimidyl ester)로 염색하여 평가하였다. CFSE는 염색이 딸세포군 속에서 희석되는 정도를 측정하여 증식 정도를 평가하는데 쓰인다.

MLR 분석에 태반 줄기세포(PSC)를 T 세포:DC:PSC=10:1 :2의 비율로 가하였다. 이 반응에서는 96 웰 플레이트 속에서 5% 사람 혼주혈청(R5)이 보강된 RPMI 1640 최종 부피가 200 μL가 되도록 하였다. 엿새 뒤, 비부착세포를 간단하게 재현탁한 다음 RPMI로 세척한 5 mL 튜브로 옮기고, CD4와 CD8 항체로 염색하였다. CD4와 CD8 구역의 증식은 BD FACS Calibur로 평가하였다.

태반 줄기세포 태반 줄기세포는 앞서 실시예 1과 2에 기술한 대로 획득하였다. 다음 태반 조직으로부터 태반 줄기세포를 획득하였다: 양막(AM) 또는 양막/융모막(AC). 탯줄 줄기세포는 탯줄을 소화시켜 얻었다(UC). 섬유모세포(FB)와 골수 유래 중간엽 줄기세포(MSCs)를 첨가하여 대조군으로 삼았다.

결과 태반 줄기세포를 MLR에 가하면, T 세포 증식이 저하된다(도 10). 도 10에 나타낸 실험에 쓰인 태반 줄기세포는 61665로 표시한 하나의 태반으로부터 유래하였다. CD4⁺ T 세포 또는 CD8⁺ T 세포가 쓰이고 양 T 세포를 모두 사용하지 않은 실험에서, 실험한 모든 태반 줄기세포에 대하여 CD4⁺ 구역은 CD8⁺ 구역보다 더 많이 억제되었다(도 10A). 양막(AM)과 탯줄(UC) 태반 줄기세포의 CD4⁺ 활성화 억제는 약 60%-75%로서 중간엽 줄기세포(MSC)에 의한 억제와 대충 비슷한 수준이었다. CD4⁺와 CD8⁺ T 세포를 함께 MLR 실험한 경우, 태반 줄기세포는 CD4⁺ 구역의 증식을 CD8⁺ 구역보다 훨씬 더 많이 억제하였다(도 10B). 특히 AM 태반 줄기세포에 의한 CD4⁺ T 세포 증식 억제는 90%에 접근하여 MSC가 나타내는 억제도를 뛰어넘었다. 이 두 구역 사이의 억제도 차이는 AM과 AC 태반 줄기세포의 경우에 가장 컸다.

서로 다른 기증자로 얻은 태반 줄기세포는 T 세포 증식 억제 정도를 달리한다(도 11). 65450으로 표시한 다른 태반에서 온 태반 줄기세포는 MLR 상에서 CD4⁺와 CD8⁺ T 세포 증식을 61665 태반과는 다르게 억제하였다. 놀랍게도 태반 65450으로부터 얻은 AC와 UC PSC는 T 세포 증식을 80% 내지 95%로 억제하여, 이 분석법에서 MSC에 의한 수준을 뛰어넘었다. 태반 65450에서 얻은 AC 태반 줄기세포는 그러나 그다지 T 세포 증식을 억제하지 않았다(도 10A의 AC 태반 줄기세포의 억제도와 비교하라).

태반 줄기세포는 MLR에서 자연세포독성 세포(NK)의 활성도 억제하였다.

4.2 회귀 분석

태반 줄기세포는 회귀 분석에서 엡스타인 바 바이러스(Epstein-Barr virus, EBV) 항원을 발현하는 B 세포주에 대한 T 세포 반응을 억제하는 것이 드러났다. 이 회귀 분석은 면역 회상(recall) 분석법으로서, EBV 항원 펩티드를 표면에 전시하는 EBV-전환 MHC 클래스 I과 II B 세포에 의하여 일어나는 작동 T 세포(effector T cell) 메커니즘을 측정한다. 이 분석법은 T 세포와 인공적으로 만든 전환 B 세포(transformed B cell)인, 같은 기증자로부터의 림프모구 유사 세포주(lymphoblastoid cell line, LCL)를 섞어 줌으로써 수행한다. 이 LCL은 다양한 범위의 T 세포와 B 세포 적응 반응을 일으키는 9 가지의 엡스타인 바 바이러스 항원을 발현하는데, 고전적 회귀 분석에서는 오로지 작동 T 세포 메커니즘만을 측정하였다. 이 회귀 분석법은 LCL이 활성 B 세포 표지인 CD23을 발현한다는 점에서 자연적으로 발생하는 병원체에 감염된 표적에 대한 세포 독성(cytotoxicity)을 측정하는 편리한 수단이 된다. 따라서 CD23 발현 세포의 수는 이 분석에서 살아남은 LCL 수의 척도가 된다.

17일간의 고전적 회귀 분석 결과는 도 5의 첫번째 막대 그래프에 나타낸 것과 비슷하였다. CD23⁺ 세포는 나타나지 않았는데, 그것은 CD4⁺와 CD8⁺ T 세포가 이들을 모두 사멸시켰기 때문이다. 다음 두 막대 그래프에서 보이는 바와 같이, 태반 줄기세포를 부가하면 생존하는 CD23⁺ 세포의 수가 늘어났다. 특정 이론에 구애받고자 하는 것은 아니지만, 관측된 이러한 효과에 대한 두 가지 설명이 있을 수 있다. T 세포가 죽어서 남은 LCL이 마음대로 증폭할 수 있도록 되었거나, 아니면 태반 줄기세포가 T 세포에 영향을 미치기보다는 주로 LCL의 수명을 늘린 것일 수 있다.

별도의 회귀 분석에서는 실험실 기증자로부터 T 세포와 가지상 세포를 얻었다. 엡스타인 바 바이러스 전환 B 세포주인 LCL은 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 용균성(lytic) EBV 세포주인 B95.8의 상청액과 사이클로스포린 A와 함께 2주일 동안 배양하여 얻었다. 이 LCL은 9 가지의 EBV 항원을 발현하였다. 증식하여 확장하는 이 LCL 세포주는 10% 소 태아 혈청이 보강된 RPMI 1640 속에서 유지하였다. 이 회귀 분석은 CD4⁺와 CD8⁺ T 세포를 자가(autologous) LCL과 T 세포:LCL=10:1의 비율로 섞어 줌으로써 이루어졌다. 이 분석은 5% 사람 혼주혈청(R5)이 보강된 RPMI 1640 200 μL가 담긴 96 웰 플레이트에서 이루어졌다. 이 플레이트에 태반 줄기세포를 T 세포:LCL:PSC=10:1:2로 첨가하였다. 이 분석은 6, 10일 또는 17일에 걸쳐 이루어졌다.

CFSE 염색 T 세포를 이용하여 6일 회귀 분석을 수행하였다. 65450 태반으로부터 얻은 태반 줄기세포는 T 세포 증식을 회귀 분석에서 약 65% 내지 97%로 억제하였는데, 이러한 결과는 MLR에서 이들 태반 줄기세포(PSC)가 이룬 결과와 상응한다(도 12). 역시 65450 태반으로부터 얻은 UC와 AC 세포주도 T 세포 증식을 현저하게 억제하였지만, 65450 AM PSC는 증식을 억제하지 않았다.

별도 실험에서는 자연세포독성 세포가 MLR과 회귀 분석에서 마찬가지로 억제된다는 것이 밝혀졌다. NK 세포의 억제 효과는 해당 MLR 또는 회귀 분석이 50 단위/mL의 IL-2를 함유하여 이루어졌을 때 약 45%(수치 범위는 약 40%에서 약 65%, SEM 5%)였다.

태반 줄기세포는 면역원성이 아니다 어떠한 태반 기증자 또는 태반 해부 자리에서 유래한 태반 줄기세포더라도 배경(background) T 세포 증식의 5%보다 더 많은 T 세포 증식이 관측된 것은 없었다.

세포-세포 접촉의 필요성 상기 회귀 분석에서 세포독성 효과와 MLR의 동종이형 인식(allo-recognition)은 모두 표적과 작동 세포 사이의 T 세포 수용체-MHC 상호작용에 의존하였다. 태반 줄기세포 매개 억제에 있어서 세포-세포 접촉의 필요성은 트랜스웰(transwell) 삽입막 분석으로 평가하였다. 이 분석에서는 T 세포와 태반 줄기세포가 막으로 서로 분리된 채로 MLR을 수행하였다. 도 13에서 볼 수 있듯이, MLR에 쓰인 태반 줄기세포의 수가 더 많을수록 억제 감소가 더 커지는데, 이는 태반 줄기세포(UC)가 T 세포 증식을 억제하기 위하여, 특히 고밀도에서는, T 세포와 상당한 정도의 접촉을 요한다는 것을 가리킨다.

별도의 실험에서는 태반 줄기세포의 T 세포 면역 억제에서 한 수용성 인자가 적어도 부분적으로는 연루되어 있는 것으로 보인다는 점을 확인하였다. 이 태반 줄기세포가 매개 면역 억제가 세포-세포 접촉에 의존하는지를 밝히기 위하여, 바닥의 틈을 통하여 수용성 인자만이 다닐 수 있는 삽입막이 설치된 웰에 태반 줄기세포를 놓은 트랜스웰 분석을 수행하였다. 웰 바닥에는 상기 태반 줄기세포로부터 분리된 채 MLR 또는 T 세포가 단독으로 존재하였다. 관측된 효과가 태반 줄기세포의 상대적 투여량에 의존하는지를 밝히기 위하여 이들 줄기세포를 T 세포와 가지상 세포에 대하여 서로 다른 상대적 비율로 첨가하였다. 탯줄 줄기세포를 MLR에서 분리하였을 때, 억제 효과는 부분적으로 사라졌다. 태반 줄기세포를 도 4에서 쓰인 것과 유사한 밀도로 사용하였을 때, MLR 억제는 CD4⁺ T 세포에서 75%, CD8⁺ T 세포에서 85%(도 7과 도 8)가 줄어들었다. 억제 효과는 태반 줄기세포 투여량의 4분의 1만이 사용되었을 때(UC OP 25)도 아직 66%를 유지하였고, 12,5000 UC 태반 줄기세포를 가하자 배경(background) 수준으로 감소하였다. 삽입막을 이용하여 분리했을 때 억제도의 변화는 관측되지 않았다(도 7). 25,000 개의 태반 줄기세포에서는 여전히 활발한 억제 효과에도 불구하고, 삽입막 도입에 따른 가장 적은 상대적 억제도 감소가 관측되었다(도 8).

5. 실시예 5 : 태반 줄기세포 면역 억제의 접촉 의존성은 골수 유래 중간엽 줄기세포와 다르다

면역 조절의 접촉 의존성 정도를 밝히는 실험에서, 탯줄 줄기세포는 면역 조절에서 골수 유래 줄기세포와 비교했을 때 확연히 다른 세포-세포 접촉 요건을 나타내었다. 무엇보다 태반 줄기세포는 면역 조절을 위하여 세포-세포 접촉에 더 의존하였는데, 태반 또는 중간엽 줄기세포의 수가 많을 수록 특히 그러하였다.

골수 유래 줄기세포(BMSC)와 탯줄 줄기세포(UC)는 백혈구 혼합 배양 반응 분석(Mixed leukocyte reaction assay, MLR) 상의 부착세포 대 T 세포 비율에 따라 서로 다른 세포-세포 접촉 요건을 가진다. 태반 줄기세포가 T 세포와 가지상 세포(DC)로부터 분리된 MLR 실험인 트랜스웰 실험에서 면역 억제는 상기 두 종류의 부착세포에 따라 달라졌다. 도 15는 개방형 웰(open well)과 트랜스웰 실험 결과를 나란히 보여준다. 대략 100,000 또는 75,000 개의 UC 또는 BMSC를 개방형 웰 실험에 사용하였을 때 유사한 정도의 억제 효과가 관측되었다. 그러나 트랜스웰 실험에서는 UC가 BMSC보다 MLR을 덜 억제하는데, 이는 태반 줄기세포/T 세포 비율이 이처럼 높을 때 접촉 의존성도 커진다는 것을 의미한다. 태반 줄기세포 대 T 세포 비율을 낮추었을 때, 태반 줄기세포는 세포 별 억제력은 더 높았다.

이러한 억제도 데이터로부터 접촉 의존성 정도를 계산하였다. 도 16은 UC와 BMSC MLR의 접촉 의존성을 나타낸다. 골수 유래 세포는 높은 BMSC/T 세포 비율에서 UC의 경우보다 접촉 의존성이 낮다. 다른 말로 하면, UC 태반 줄기세포와 BMSC는 중요한 메커니즘 파라미터인 세포-세포 접촉 의존성에 관한 거동을 달리한다.

조절 T 세포(Treg)는 BMSC 매개 T 세포 억제에 필요하다. Aggarwal과 Pittenger의 "Human Mesenchymal Stem Cells Modulate Allogeneic Immune Cell Responses," Blood 105(4): 1815-1822 (2004)를 참조하라. 건강한 기증자의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 CD4⁺CD25⁺ T 조절 세포를 고갈시킨 다음 자가 EBV 전환세포를 이용하여 회귀 분석을 하였다. 몇몇 조건에서는 UC를 부가하였다. 도 17에서 볼 수 있는 바와 같이, 회귀 분석상의 태반 줄기세포 매개 T 세포 반응 억제는 T 조절 세포의 존부와 관계없이 차이가 없었다. 따라서 T 조절 세포는 BMSC 매개 T 세포 억제에 필요한 것으로 보고되었지만, 태반 줄기세포 매개 면역 억제에 있어서 T 조절 세포는 어떠한 구실을 하지는 않는다.

태반 줄기세포에 의하여 억제된 MLR로부터 T 세포를 덜어낸 다음, 가지상 세포를 새로 부가하는 MLR 실험을 하였다. 이 T 세포는 CFSE로 염색하였는데, 증식 과정에서 딸세포들로 고루 배분된다. CFSE^Hi 세포는 증식하지 못한 T 세포(예를 들어 도 17 패널의 가장 왼쪽 피크)이다. 이 세포군은 염색한 T 세포를 FACS Aria로 세포 분류하여 얻었다. 이들 세포를 새 가지상 세포와 함께 두번째 MLR에서 사용하였다. 도 18에서 볼 수 있는 바와 같이, 계속적인 억제 효과는 관측되지 않았는데, 이전에 억제되었던 세포는 가지상 세포에 대항하여 잘 증식하였다. CFSE^Lo 세포(즉 딸세포) 때문에 이러한 억제가 이루어졌을 가능성은 적은데, 이는 이들 세포 자신이 뒤이어 증식하였기 때문이다. CFSE^Hi 세포군은 이 기증 가지상 세포에 대하여 증식하지 않았을 비 동종이형 특이 세포(non-allo-specific cell)와 태반 줄기세포에 의하여 억제되는 T 세포로 이루어졌다. 태반 줄기세포를 들어내자, 억제되었던 세포들이 증식하였다.

상청액 10%를 BMSC MLR 상청액으로 갈아주었을 때 BMSC는 MLR을 억제한다. 이와 정반대로, 태반 줄기세포를 함유하는 MLR 상청액으로 상청액을 갈아주었을 때에는, 심지어 배지의 75%를 갈아주더라도 T 세포 증식에 변화가 없었다(도 19).

가지상 세포 또는 휴식 T 세포(resting T cell)를 태반 줄기세포와 MLR 시작 전에 서로 다른 시간 동안 배양하면 이들 세포가 영향을 받을 수 있다. 이러한 점은 태반 줄기세포 또는 BMSC를 T 세포(도 20A) 또는 가지상세포(DC, 도 20B)와 시간을 달리하여 분석 시작 전에 배양함으로써 시험하였다. T 세포와 태반 줄기세포를 사전 배양하면 억제성 표현형을 그다지 변화시키지 못한다(도 20A). 그러나 BMSC T 세포 억제는 DC/PDAC 사전 배양 기잔에 따라 달라진다. 도 20B에 나타난 것처럼, BMSC에 의한 억제는 T 세포 하루 뒤에 가지상 세포를 부가하였을 때 가장 강하다. 그러나 가지상 세포를 T 세포와 같은 시간에 부가하면 훨씬 더 낮은 억제력을 보인다. 이틀간 사전 배양하면, 억제도는 DC를 T 세포 하루 뒤(+1 일)에 부가한 경우에 근접한다. 태반 줄기세포 매개 억제에서는 비슷한 경향을 볼 수 없었다.

6. 실시예 6 : MLR과 회귀 분석에서의 태반 줄기세포와 탯줄 줄기세포의 사이토킨 특성

양막-융모막판(AC) 유래의 탯줄 줄기세포(UC)와 태반 줄기세포는 MLR 배지 속으로 몇몇 사이토킨을 분비하는 것을 확인되었다.

몇몇 분석에서는 사이토킨 어레이를 이용하여 상청액 속 사이토킨과 케모킨의 농도를 측정하였다. 몇몇 인자는 상청액 속으로 분비되는 것으로 밝혀졌는데, MLR과 회귀 분석에 가장 연관성이 있는 것은 포식세포 염증성 단백질인 MIP-1α와 MIP-1β였다. 이들은 모두 T 세포를 유인하는 화학주성 물질로서, 사람 면역 결핍 바이러스(HIV) 감염에 반응하여 CD8⁺ T 세포가 분비한다. MLR로 분석하였을 때, 이들 화학주성 물질의 분비는 태반 줄기세포와 MSC의 MLR 억제와 역방향의 상관 관계(도 14)가 있다. 태반 줄기세포나 MSC는 MIP-1α와 MIP-1β를 분비하지 않았다.

다른 연구에서는 MCP-1과 IL-6의 분비 사이에 상관 관계를 발견하였는데, 이들은 모두 중요한 면역 조절자이다(도 9와 도 10. 도 4와 비교하라). 태반 줄기세포 단독으로는 IL-6이나 MCP-1을 분비하지 않았지만, MLR과 T 세포 증식을 회귀 분석에서 억제하는 UC와 AC 세포주는 MCP-1과 IL-6을 분비한다(도 9와 도 10). 비록 IL-6은 대개 염증 유발성(pro-inflammatory) 작용을 하지만(예를 들어 Kishimoto 외, Annu. Rev. Immunol. 23:1-21 (2005)을 보라), Il-6은 마우스에서 간 손상시 보호 작용을 하는 등의 다른 기능도 가지고 있다(예를 들어 Klein 외, J. Clin . Inves. 15:860~869 (2005)을 보라).

별도의 실험에서는 MLR 또는 회귀 분석에 쓰인 AC에 대하여 사이토킨 분비를 분석하였다. 사이토킨은 6일째 줄기세포 배양물, 줄기세포 MLR 또는 줄기세포 회귀 분석물에 대하여 Luminex 시스템을 이용하여 측정하였다. MLR은 줄기세포, 가지상 세포(DC)와 T 세포를 2:1:10의 비율로 포함하였다. 엡스타인 바 바이러스 회귀 분석은 줄기세포, EBV 종양 세포(Ts)와 T 세포를 Ts:줄기세포:T 세포=2:1:10의 비율로 포함하였다.

줄기세포 단독 배양, MLR과 회귀 분석에서 IL-6(11 ng/mL)와 IL-8(16 ng/mL)의 농도는 일정하게 유지되는 것으로 드러났다. MCP-1의 농도는 줄기세포 단독 배양과 비억제성 대조군 부착세포 MLR과 회귀 분석에서 약 2 ng/mL이었지만 억제 줄기세포 MLR과 줄기세포 회귀 분석에서는 약 10 ng/mL로 증가하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 수치는 MCP-1에 대하여 기록된 혈청 농도 범위 안에 포함된다.

인터루킨-2(IL-2)는 T 세포 생존 인자이자 CD4⁺CD25⁺ T 조절 세포의 절대 인자(obligate factor)이다. 이 T 세포 부분집합은 AC 줄기세포에 의한 T 세포 억제에는 필요하지 않지만, AC 줄기세포에 의한 MLR 억제에서는 IL-2 농도가 꾸준하게 감소한다. AC 줄기세포가 부재한 상태의 MLR 상청액은 약 35 pg/mL의 IL-2를 포함한데 반하여, AC 줄기세포를 함유한 MLR은 IL-2를 440 pg/mL까지 함유하였다.

이러한 IL-2 농도는 억제도와 상관 관계가 있었다. 예를 들어 85% 억제도를 나타낸 CD4⁺ T 세포 MLR에서는 IL-2를 330 pg/mL 함유하였고, AC 줄기세포를 이용하여 85% 억제도를 나타낸 CD8⁺ T 세포 MLR에서는 IL-2를 66 pg/mL 함유하였다. 이러한 결과는 전통적으로 면역 반응의 자극제로 알려진 IL-2와 MCP-1이 면역 억제에서도 역할을 맡을 수도 있다는 것을 가리킨다.

균등물

본 발명은 본 명세서에서 기술한 특정 실시 태양의 범위 내로 한정되지 아니한다. 실제로 당업자에게는 앞선 기재와 첨부 도면의 내용으로부터 전술한 것 이외에 본 발명의 다양한 변형이 있을 수 있다는 점은 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부하는 청구범위 내에 포함되는 것이다.

본 명세서에서 인용하는 많은 간행물, 특허와 특허 출원은 그 전문에서 개시하는 바를 참고 문헌으로 삼고 있다.

Claims (58)

1. 복수의 태반 줄기세포가 검출 가능한 수준으로 면역 반응을 억제하는데 충분한 시간 동안 상기 태반 줄기세포를 복수의 면역 세포와 접촉시키는 단계를 포함하되,

   상기 태반 줄기세포는 림프구 혼합 배양 반응 분석법(mixed lymphocyte reaction assay, MLR)에서 T 세포 증식을 검출가능한 정도로 억제하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
2. 제1항에 있어서,

   상기 복수의 태반 줄기세포는

   CD200과 HLA-G를 발현하고,

   CD73, CD105와 CD200을 발현하고,

   CD200과 OCT-4를 발현하고,

   CD73, CD105와 HLA-G를 발현하고,

   CD73과 CD105를 발현하면서 배아 유사체(embryoid-like body)의 형성이 가능한 조건하에서 상기 복수의 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체의 형성 촉진 및/또는

   OCT-4를 발현하면서 배아 유사체의 형성이 가능한 조건하에서 상기 복수의 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체의 형성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
3. 제1항에 있어서,

   상기 복수의 면역 세포는 T 세포 또는 자연세포독성(NK) 세포인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
4. 제3항에 있어서,

   상기 T 세포는 CD4⁺ 세포인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
5. 제3항에 있어서,

   상기 T 세포는 CD8⁺ 세포인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
6. 제1항에 있어서,

   상기 접촉은 시험관내에서 일어나는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
7. 제1항에 있어서,

   상기 접촉은 생체내에서 일어나는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
8. 제7항에 있어서,

   상기 접촉은 포유류 대상(subject) 속에서 일어나는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
9. 제8항에 있어서,

   상기 포유류 대상은 사람인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
10. 제7항에 있어서,

    상기 접촉은 상기 태반 세포를 정맥 투여하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
11. 제7항에 있어서,

    상기 접촉은 상기 태반 세포를 근육 투여하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
12. 제7항에 있어서,

    상기 접촉은 상기 태반 세포를 상기 대상의 장기에 투여하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
13. 제12항에 있어서,

    상기 장기는 이자인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
14. 제8항에 있어서,

    상기 대상에게 항-포식세포 염증성 단백질-1α 항체(anti-macrophage inflammator protein 1α, anti-MIP-1α) 또는 항포식세포 염증성 단백질-1β(anti-MIP-1β) 항체를 투여하는 단계를 더 포함하되, 상기 항체는 상기 대상에서 MIP-1α 또는 MIP-1β 혈중 농도를 측정가능한 정도로 감소시키기에 충분한 양으로 투여하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
15. 제1항에 있어서,

    상기 면역 반응은 이식 대 숙주(graft-versus-host) 질환인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
16. 제15항에 있어서,

    상기 면역 반응은 자가 면역 질환인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
17. 제16항에 있어서,

    상기 자가 면역 질환은 당뇨병, 전신 홍반 루프스(lupus erythematosus), 류 마티스성 관절염 또는 다발성 경화증인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
18. 제1항에 있어서,

    상기 복수의 면역 세포를 또한 비태반 세포에 접촉시키는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
19. 제18항에 있어서,

    상기 비태반 세포는 CD34⁺ 세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
20. 제19항에 있어서,

    상기 CD34⁺ 세포는 말초 혈액 조혈 전구세포(hematopoietic progenitor cell), 제대혈 조혈 전구세포 또는 태반 혈액 조혈 전구세포인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
21. 제18항에 있어서,

    상기 비태반 세포는 중간엽 줄기세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
22. 제21항에 있어서,

    상기 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
23. 제18항에 있어서,

    상기 비태반 세포는 동종 이식편(allograft) 속에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
24. 제1항에 있어서,

    상기 복수의 태반 줄기세포는 1×10⁵ 개의 태반 줄기세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
25. 제1항에 있어서,

    상기 복수의 태반 줄기세포는 1×10⁶ 개의 태반 줄기세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
26. 제1항에 있어서,

    상기 복수의 태반 줄기세포는 1×10⁷ 개의 태반 줄기세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
27. 제1항에 있어서,

    상기 복수의 태반 줄기세포는 1×10⁸ 개의 태반 줄기세포를 함유하는 것을 특징으로 하는 면역 반응의 억제 방법.
28. (a) 림프구 혼합 배양 반응(MLR) 분석으로 복수의 태반 세포를 분석하는 단계 및

    (b) 상기 복수의 태반 줄기세포가 MLR에서 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 측정 가능한 수준으로 억제하는 경우 상기 복수의 태반 줄기세포를 선택하는 단계를 포함하되,

    상기 태반 줄기세포는 (i) 기질(substrate)에 부착하며,

    (ii) CD200과 HLA-G를 발현하거나

    CD73, CD105와 CD200을 발현하거나

    CD200과 OCT-4를 발현하거나

    CD73, CD105와 HLA-G를 발현하거나

    CD73과 CD105를 발현하면서, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서는 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군(cell population)을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체(embryoid-like body)가 형성되는 것을 촉진하거나,

    OCT-4를 발현하면서, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서는 상기 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하는 것을 특징으로 하는 태반 세포군의 선별 방법.
29. (a) 기질에 부착하면서 (b) CD200과 HLA-G를 발현하고 (c) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 복수의 세포 속에서 선별하는 단계 및

    상기 태반 줄기세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 선별 방법.
30. (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73, CD105와 CD200을 발현하고 (c) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 복수의 세포 속에서 선별하는 단계 및

    상기 태반 줄기세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 제조 방법.
31. (a) 기질에 부착하면서 (b) CD200과 OCT-4를 발현하고 (c) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 복수의 세포 속에서 선별하는 단계 및

    상기 태반 줄기세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 제조 방법.
32. (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73과 CD105를 발현하고 (c) 배아유사체 형성이 가능한 조건하에서 배양되었을 때 배아유사체를 형성하며 (d) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 복수의 세포 속에서 선별하는 단계 및

    상기 태반 줄기세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 제조 방법.
33. (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73, CD105와 HLA-G를 발현하고 (c) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 복수의 세포 속에서 선별하는 단계 및

    상기 태반 줄기세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 제조 방법.
34. (a) 기질에 부착하면서 (b) OCT-4를 발현하고 (c) 배아유사체 형성이 가능한 조건하에서 배양되었을 때 배아유사체를 형성하며 (d) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 태반 줄기세포를 복수의 세포 속에서 선별하는 단계 및

    상기 태반 줄기세포를 다른 세포들로부터 분리하여 세포군을 형성하는 단계를 포함하는 세포군의 제조 방법.
35. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 T 세포와 상기 태반 줄기세포는 림프구 혼합 배양 반응 속에서 약 5:1의 비율로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 태반 줄기세포는 양막 또는 양막과 융모막에서 유래한 것을 특징으로 하는 방법.
37. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 태반 줄기세포는 상기 림프구 혼합 배양 반응(MLR)에서 상기 태반 줄기세포가 부재한 경우와 비교하였을 때 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석 기준 으로 적어도 50%까지 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
38. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 태반 줄기세포는 상기 림프구 혼합 배양 반응(MLR)에서 상기 태반 줄기세포가 부재한 경우와 비교하였을 때 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석 기준으로 적어도 75%까지 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
39. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 태반 줄기세포는 상기 림프구 혼합 배양 반응(MLR)에서 상기 태반 줄기세포가 부재한 경우와 비교하였을 때 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석 기준으로 적어도 90%까지 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
40. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 태반 줄기세포는 상기 림프구 혼합 배양 반응(MLR)에서 상기 태반 줄기세포가 부재한 경우와 비교하였을 때 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 MLR 분석 기준으로 적어도 95%까지 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
41. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 태반 줄기세포는 자연세포독성(natural killer, NK) 세포의 활성을 측 정 가능한 정도로 더 억제하는 것을 특징으로 하는 방법.
42. 제28항 내지 제34항 중 어느 한 항의 방법에 따라 제조된 분리된 태반 줄기세포군.
43. 태반 줄기세포군으로서, 상기 줄기세포군의 태반 줄기세포는

    (a) 기질에 부착하며,

    (b) CD200과 HLA-G를 발현하거나

    CD73, CD105와 CD200을 발현하거나

    CD200과 OCT-4를 발현하거나

    CD73, CD105와 HLA-G를 발현하거나

    CD73과 CD105를 발현하면서, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서는 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나,

    OCT-4를 발현하면서, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서는 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하고,

    (c) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 림프구 혼합 배양 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 것이 확인된 줄기세포인 것을 특징으로 하는 분리된 태반 줄 기세포군.
44. (a) 기질에 부착하면서 (b) CD200과 HLA-G를 발현하고 (c) 림프구 혼합 배양 분석법에서 측정 가능한 수준으로 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 억제하는 것이 확인된 태반 줄기세포를 포함하는 분리된 세포군.
45. (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73, CD105와 CD200을 발현하고 (c) 림프구 혼합 배양 분석법에서 측정 가능한 수준으로 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 억제하는 것이 확인된 태반 줄기세포를 포함하는 분리된 세포군.
46. (a) 기질에 부착하면서 (b) CD200과 OCT-4를 발현하고 (c) 림프구 혼합 배양 분석법에서 측정 가능한 수준으로 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 억제하는 것이 확인된 태반 줄기세포를 포함하는 분리된 세포군.
47. (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73과 CD105를 발현하고 (c) 배아유사체 형성이 가능한 조건하에서 배양되었을 때 배아유사체를 형성하며 (d) 림프구 혼합 배양 분석법에서 측정 가능한 수준으로 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 억제하는 것이 확인된 태반 줄기세포를 포함하는 분리된 세포군.
48. (a) 기질에 부착하면서 (b) CD73, CD105와 HLA-G를 발현하고 (c) 림프구 혼합 배양 분석법으로 측정 가능한 수준에서 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 억제하는 것으로 확인된 태반 줄기세포를 포함하는 분리된 세포군.
49. (a) 기질에 부착하면서 (b) OCT-4를 발현하고 (c) 배아유사체 형성이 가능한 조건하에서 배양되었을 때 배아유사체를 형성하며 (d) 림프구 혼합 배양 분석법으로 측정 가능한 수준에서 CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 억제하는 것으로 확인된 태반 줄기세포를 포함하는 분리된 세포군.
50. 제43항 내지 제49항 중 어느 한 항에 따른 세포군의 배양에서 얻은 상청액을 함유하는 조성물.
51. 태반 줄기세포의 배양에서 얻은 배양 배지를 함유하는 조성물로서,

    상기 태반 줄기세포는

    (a) 기질에 부착하며,

    (b) CD200과 HLA-G를 발현하거나

    CD73, CD105와 CD200을 발현하거나

    CD200과 OCT-4를 발현하거나

    CD73, CD105와 HLA-G를 발현하거나

    CD73과 CD105를 발현하면서, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서는 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하거나,

    OCT-4를 발현하면서, 배아유사체의 형성이 가능한 조건하에서는 상기 태반 줄기세포를 함유하는 태반 세포군을 배양하였을 때, 상기 세포군 속에서 하나 이상의 배아유사체가 형성되는 것을 촉진하고,

    (c) CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포 증식을 림프구 혼합 배양 분석법에서 측정 가능한 수준으로 억제하는 것이 확인된 줄기세포이며,

    상기 태반 줄기세포의 배양은 상기 배지 속에서 24시간 또는 그 이상 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
52. 제51항에 있어서,

    복수의 상기 태반 줄기세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
53. 제51항에 있어서,

    복수의 비태반 세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
54. 제53항에 있어서,

    상기 비태반 세포는 CD34⁺ 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
55. 제54항에 있어서,

    상기 CD34⁺ 세포는 말초 혈액 조혈 전구세포, 제대혈 조혈 전구세포 또는 태반 혈액 조혈 전구세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
56. 제53항에 있어서,

    상기 비태반 세포는 중간엽 줄기세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
57. 제56항에 있어서,

    상기 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
58. 제51항에 있어서,

    항MIP-1α 또는 항MIP-1β 항체를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.

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