KR20080026198A - 태반 유도된 콜라겐 바이오패브릭을 사용한 고막의 복원 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콜라겐 바이오패브릭을 사용한, 흔히 고실성형술 또는 고막성형술로서 지칭되는, 고막 천공과 같은 고막 변형의 복원 방법을 제공한다. 콜라겐 바이오패브릭은 적층되는 것이 바람직하다. 본 발명은 고막의 복원을 위해, 콜라겐 바이오패브릭의 하나 이상의 조각들, 예를 들어 적층된 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 키트를 추가로 제공한다.

콜라겐 바이오패브릭, 고막 변형의 복원 방법

Description

태반 유도된 콜라겐 바이오패브릭을 사용한 고막의 복원{REPAIR OF TYMPANIC MEMBRANE USING PLACENTA DERIVED COLLAGEN BIOFABRIC}

본 출원은, 그의 전문이 본원에 참조로써 편입되는 2005년 6월 30일에 출원된 U.S. 가출원 제60/696,197호의 효용을 청구한다.

1. 본 발명의 분야

본 발명은 콜라겐 바이오패브릭(collagen biofabric)을 사용하는, 흔히 고실성형술(tympanoplasty) 또는 고막성형술(myringoplasty)로서 지칭되는 고막의 복원에 관한 것이다.

2. 본 발명의 배경기술

음파를 수신하는 중이(middle ear)의 제1 구성체는, 귀청이라고도 불리는 고막이다. 고막을 두드리는 소리는 일련의 소골들 (추골, 침골 및 등골)을 통해 음파가 감지 및 처리되는 달팽이관으로 전송된다. 고막 자체는 살아있는 조직이다.

천공과 같은 고막 변형은 소리의 전송 및 지각에 간섭한다. 천공은 통상 외상 또는 감염에 의해 초래된다. 천공된 귀청의 외상적 요인들의 예는 귀에 대한 손의 개방 타격(즉, 귀 복싱); 두개골 골절; 갑작스런 폭발; 귀길(ear canal)로 너무 깊숙이 밀어 넣어진 보비 핀(bobby pin) 또는 면봉과 같은 물체들; 귀길로 침입 하는 산 또는 용접으로부터의 고온 쇠녹, 및 기타 외상들을 포함한다. 중이 감염은 천공을 일으키는 귀청의 자발적 파열(인열(tear))을 초래할 수 있다. 천공을 갖는 중이염이라 불리는 이러한 상황에서, 귀로부터의 감염 또는 출혈 배액이 있을 수 있다. 고막 내의 구멍은 또한 고실절개술 또는 고막절개술과 같은 수술 절차로 인해 초래될 수도 있다. 사전 배치된 압력 평형관이 떨어지거나 의사에 의해 제거된 후, 귀청에 작은 구멍이 남을 수도 있다.

그러나, 고막 변형에 대한 원인이 무엇이든지 간에, 막의 복원이 소망된다. 고막 천공의 복원은, 일반적으로 고실성형술 또는 고막성형술로서 공지된 절차로 달성된다. 이 둘은 유사하지만; 고막 자체의 복원 이외에도, 고실성형술은 부가적으로 중이열(cleft), 예컨대 만성 감염, 진주종, 또는 이소골 연쇄 문제들의 병리 또는 병리들의 치료를 함축한다. 전형적으로, 고실성형술 또는 고막성형술에서, 고막의 구멍은 이식편을 사용함으로써 복원된다. 전형적인 이식편 재료들은, 지금까지, 천연 재료들, 예컨대 측두(側頭) 근막, 이주성(tragal) 연골막, 피부, 골막(periosteum), 치밀하지 않은 중첩 조직, 지방, 정맥 조직, 인간 양막(amniotic membrane), 및 동종 경질막; 및 비-천연 재료들, 예컨대 실라스틱(silastic), 종이 및 테플론 시트를 포함한다. 고막의 복원 이외에, 고실성형술의 한 주요 목적은 공기를 함유하는 중이 공간의 창출이다. 이러한 목적으로 인하여, 고막의 복원에 사용되는 상기 재료는 점착물 형성 또는 감염 촉진에 대해 저항성이거나 낮은 성향을 나타내는 것이 중요하다.

일반적으로, 천공된 고막은 하기와 같이 치료된다. 현미경으로 작업하여, 성장을 자극하도록 가장자리들을 새롭게 하기 위해, 귀청의 가장자리의 죽은 조직을 제거처리하고, 이어서 폐쇄 재료, 일반적으로 얇은 패치 또는 이식편을, 고막의 온전한 부분과 중첩되도록 귀청 천공 위에 배치한다. 통상, 상기 패치는 담배 종이의 작은 부분이며, 이는 천공을 채우는 상피 세포들의 내성장에 대한 스텐트(stent)를 제공하는 것으로 여겨진다. 대체로, 고막의 봉합 후, 청력 개선이 주목된다. 천공이 완전히 봉합되기 전에 수 회의 패치 적용이(3회 또는 4회까지) 요구될 수도 있다. 종이 패치가 귀청 내 구멍의 신속하거나 적절한 봉합을 제공하지 않는 경우, 또는 종이 패치 적용을 사용한 시도가 성공적이지 않은 경우, 수술, 예를 들어, 고막성형술 또는 고실성형술이 고려된다. 하지만, 모든 이비인후과 의사들이, 비교적 높은 실패율을 들어, 천공된 고막에의 종이 패치의 배치가 적절한 치료라는 점에 동의하는 것은 아니다.

3. 본 발명의 개요

본 발명은 고막의 복원 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 고막 상해 또는 변형의 복원 방법 및 조성물을 제공한다. 한 구현예에서, 본 발명은 고막을 콜라겐 바이오패브릭과 접촉시키는 것을 포함하는, 천공된 고막의 복원 방법을 제공한다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 접촉은 천공을 폐쇄하기에 충분하다. 더욱 특정의 구현예에서, 상기 천공은 중심성 천공이다. 또 다른 더욱 특정의 구현예에서, 상기 천공은 변연성 천공이다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 천공은 천공 발생 2개월 이내에 자발적으로 치유되지 않는다. 특정 구현예에서, 콜라겐 바이오패브릭을 구성하는 단백질들은 실질적으로 그들의 천연 입체구조들을 보유하며, 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭은 프로테아제-처리되지 않는다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭의 단백질은 교차 결합되지 않으며, 예를 들어, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 고정되지 않는다. 또 다른 특정 구현예에서, 콜라겐 바이오패브릭은 실질적으로 상기 접촉 전에 건조되며, 즉, 약 20 중량％ 이하의 물을 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 단일층이다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 2 이상의 층들의 적층체이다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 상기 접촉 전에 트리밍(trimming) 처리된다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 트리밍 전에 약 2×2㎝이다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 트리밍 전에 약 3×3㎝이다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 트리밍 전에 약 2×3㎝이다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 고막과의 접촉 전에 수화된다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 건조 상태에서 약 2 마이크로미터 내지 약 150 마이크로미터의 두께이다. 더욱 특정의 구현예에서, 상기 바이오패브릭은 건조 상태에서 약 10 내지 약 50㎛의 두께이다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 바이오패브릭은 건조 상태에서 약 40 내지 약 50㎛의 두께이다. 더욱 특정의 구현예에서, 건조 상태에서 약 2 마이크로미터 내지 약 150 마이크로미터의 두께인 콜라겐 바이오패브릭은 2 이상의 층들의 적층체이다. 상기 구현예들에서, 범위는 평균 두께를 나타내며, 두께에 대한 절대적 제한은 아니다. 또 다른 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 어플리케이터(applicator)의 사용을 통해 고막과 접촉된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 멸균의 이중 필 파우치(peel pouch) 내에 1 이상의 시트들의 콜라겐 바이오패브릭을 제공한다.

3.1 정의들

본원에서 사용된, "콜라겐 바이오패브릭"은 일반적으로 필름 또는 시트로서 이용될 수 있는 콜라겐-함유, 태반-유도된 양막 또는 융모막(chorionic membrane) 재료를 의미한다. 바람직한 콜라겐 바이오패브릭은 그의 전문이 본원에 편입되는, 하리리(Hariri)의 U.S. 출원 공보 U.S. 2004/0048796에 기재된 진공-건조된 비-고정의 비-프로테아제-처리된 양막 재료이며, 이는 상기 문헌 및 본원에 기재된 방법들에 의해 제조된다(실시예 1, 2 참조). 상기 콜라겐 바이오패브릭은 양막체(amnion)로부터 제조되는 것이 바람직하지만, 융모막체(chorion)로부터, 또는 양막체 및 융모막체 모두로부터 제조될 수 있다.

본원에서 사용된, 용어 "생체활성 화합물"은 시험관 내 또는 생체 내의 1종 이상의 생물학적 시스템들에 측정가능한 효과를 일으키는 임의의 화합물 또는 분자를 의미한다.

4. 본 발명의 상세한 설명

본 발명은, 본원에서 콜라겐 바이오패브릭으로서 지칭되는 콜라겐성 양막 및/또는 융모막 재료를 사용한, 고막 변형의 복원, 및 더욱 구체적으로 고실성형술 또는 고막성형술의 수행 방법들을 제공한다.

4.1 콜라겐 바이오패브릭을 사용한 고막의 복원

본 발명은 콜라겐 바이오패브릭을 사용한 고막의 복원 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 복원될 고막은 변형을 갖는다. 상기 변형은, 예를 들어, 질병 또는 감염의 결과로서 천연-발생할 수 있거나, 상해일 수 있다. 다양한 구현예들에서, 상기 변형은, 예를 들어, 천공, 예컨대, 급성 천공 또는 만성 천공(예를 들어, 2개월이 넘게 지속되는 천공), 고막 내 콜라겐의 부분적 또는 전체적 손실, 정상 고막 강직도의 부분적 또는 전체적 손실, 무기폐성 고막(즉, 막을 강직화하는 천연 콜라겐성 층이 부분적으로 또는 전체적으로 소실된 고막), 중이의 종양 병발 또는 진주종 관련 변형, 고막의 질병, 예컨대 다이머릭 드럼(dimeric drum), 함몰, 함몰낭(즉, 중이강(middle ear cavity) 내의 압력 손실로 인한, 중이강으로의 고막의 함몰의 결과로 귀청에 형성된 주머니), 또는 고실경화증 등일 수 있다.

고막 변형의 복원은, 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭과 접촉되지 않은 고막과 비교시, 고막 변형의 치유에 충분한 시간 동안, 고막 변형의 하나 이상의 측면들의 측정가능한 개선에 충분한 시간 동안 또는 고막 변형의 하나 이상의 측면들의 악화를 경감시키는데 충분한 시간 동안, 고막을 콜라겐 바이오패브릭과 접촉시키는 것을 수반할 수 있다.

본원에서 사용된, "고막 변형의 측면들"은 객관적으로 측정가능한 기준, 예컨대 고막의 소리 전송 능력, 데시벨(decibel)에서의 청력 손실, 고막 또는 주위 조직의 외관, 고막 내의 천공 내부 또는 주변으로의 상피 조직의 내성장 등, 또는 주관적 기준, 예컨대 개선된 청력의 감지, 불쾌함 또는 진통의 경감 등을 포함한다.

한 구현예에서, 변형은 천공이다. 그러한 천공은, 예를 들어, 우연적으로, 외상에 의해, 감염에 의해 초래될 수 있거나, 고의적으로 초래된, 예를 들어, 고막을 지나서 중이 내에서 및 이도(auditory canal) 바깥에서 액체의 배수를 허용하는 하나 이상의 관들의 삽입에 의해 초래되는 천공(예를 들어, 고막절개술 관 설치를 허용하는 천공(들), 또는 질병이 있거나 손상된 조직의 수술적 제거에 의해 초래된 천공)일 수 있다. 천공은 급성일 수 있거나, 또는 천공은 2개월 이상 존재해 온 만성일 수 있다.

고막 복원의 한 구현예에서, 콜라겐 바이오패브릭이 부분적으로 또는 전체적으로 천공을 폐쇄하도록, 천공을 갖는 고막을 콜라겐 바이오패브릭과 접촉시킨다. 폐쇄되는 천공은 중심성 천공, 즉, 고막의 변연(즉, 이도 내에 존재하는 주변부)이 연루되지 않는 임의 크기의 천공, 또는 변연성 천공(즉, 고막의 변연 상에 접촉하거나, 이와 대규모로 연루된 천공)일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 오직 고막만이 천공되며, 이외의 다른 귀 구조는 천공되거나 손상되지 않는다. 또 다른 구현예에서, 천공의 폐쇄는 외이, 중이 또는 내이에 관여하는 적어도 하나의 기타 수술 절차에 부가적이다. 또 다른 구현예에서, 고막의 복원은 고실성형술이다. 또 다른 구현예에서, 고막의 복원은 고막성형술이다.

고막 천공 봉합의 혜택은 샤워, 목욕 또는 수영을 하는 동안 귀에 물이 들어가는 것(이는 귀 감염을 초래할 수 있다)을 방지, 개선된 청력, 및 감소된 이명을 포함한다. 이는 또한 만성 감염 및 귀 구조의 파괴를 일으킬 수 있는 진주종의 발생(중이 내의 피부 낭종)을 예방할 수도 있다.

고실성형술 및 고막성형술은 일반적으로 외래 절차이다. 이비인후과 의사는 이도를 통해(이도-경유 접근), 또는 고막이 노출되도록 귀를 앞으로 접는 것이 후행되는 뒤-귓바퀴 절개(뒤-귓바퀴 접근)를 통해, 고막 천공의 복원에 접근할 수 있다.

임의의 천공 교정을 시도하기 전에, 청력 검사가 일반적으로 수행되며, 환자는 유스타키오관(Eustachian tube) 기능의 부분적 또는 완전 손실이 고막 천자(puncture)를 악화시키고, 고막에 대한 이식편의 부착에 간섭할 수 있기 때문에, 유스타키오관 기능에 대해 평가된다. 천공된 고막의 복원은 일반적으로 폐쇄 재료를 막에 위치시키는 것을 포함한다. 환자는 합병증들, 예컨대 천공을 통한 그리고 중이 공간으로의 편평상피의 확장에 대해 평가된다. 이러한 예들에서, 고실성형술 또는 고막성형술은, 가능한 경우, 합병증의 치료를 수반하는 것이 바람직하다.

본 발명은 첫 번째 또는 후속적 치료 요법으로서 콜라겐 바이오패브릭을 사용한 고막의 복원을 포함한다. 즉, 콜라겐 바이오패브릭은, 기타의 치료상 조치들을 시도하기 전에, 천공과 같은 고막 변형을 복원하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 콜라겐 바이오패브릭을 사용한 고막의 복원은 1종 이상의 기타 치료상 조치들의 시도 및 실패 후 수행될 수도 있다.

한 구현예에서, 콜라겐 바이오패브릭을 사용한 고막의 복원은 이식편 및/또는 주위 귀길에 항-감염제를 적용하는 것을 부가적으로 포함할 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명은 고막을 콜라겐 바이오패브릭 및 항-감염제와 접촉시키는 것을 포함하는 고막의 복원 방법을 제공한다. 항-감염제는 고막과 콜라겐 바이오패브릭의 접촉 이전에, 이와 동시에 또는 이에 후속적으로 접촉될 수 있다. 항-감염제는 콜라겐 바이오패브릭으로 부터 분리되어, 또는 이의 일체적 부분으로서 존재할 수 있다. 예를 들어, 항-감염제는 콜라겐 바이오패브릭의 표면에 존재할 수 있거나, 또는 콜라겐 바이오패브릭에 함침(impregnation)될 수 있다. 특정 예에서, 항-감염제는 항생제, 정균제, 항바이러스 화합물, 정(靜)바이러스제, 항진균 화합물, 정진균제, 또는 항균 화합물이다. 특정 구현예에서, 항-감염제는 이온성 은이다. 더욱 특정의 구현예에서, 이온성 은은 하이드로겔(hydrogel) 내에 함유된다. 이온성 은 하이드로겔은 바람직한 항-감염제이고, 이는 상기가 어떠한 공지의 박테리아 내성도 갖지 않는, 광범위한 스펙트럼이며; 그의 적용 및 제거시 진통이 없고, 상기 하이드로겔이 자가용해 죽은조직제거를 지원하기 때문이다. 바람직한 구현예에서, 콜라겐 바이오패브릭은 고막에의 적용 전에 은 이온들로 함침된다. 또 다른 구현예에서, 콜라겐 바이오패브릭은 고막에의 바이오패브릭 적용 후에, 예를 들어 귀 점적액의 적용에 의해 은 이온들로 함침된다.

본 발명은 고막을 콜라겐 바이오패브릭 및 복수의 줄기 또는 전구 세포들과 접촉시키는 것을 포함하는 고막의 복원 방법을 추가로 제공한다. 바람직한 줄기 세포들은, 예를 들어, 그들 각각은 전문이 본원에 편입된, 미합중국 출원 공보 제US 2003/0032179호 및 제US 2003/0180269호에 개시된 중간엽 줄기 세포들 및 태반-유도된 줄기 세포들을 포함한다. 한 구현예에서, 콜라겐 바이오패브릭은 고막이 콜라겐 바이오패브릭과 접촉되기 전에 줄기 또는 전구 세포들과 접촉될 수 있다. 예를 들어, 줄기 또는 전구 세포들을 콜라겐 바이오패브릭의 표면상에, 또는 그의 내부에, 배치하고, 줄기 또는 전구 세포들에 콜라겐 바이오패브릭에 부착하기에 충분한 시간을 허용함으로써, 콜라겐 바이오패브릭을 고막에의 적용 전에 제조할 수 있다. 상기 줄기 또는 전구 세포들은, 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭의 표면상에, 또는 그의 내부에, 콜라겐 바이오패브릭의 고막 상에의 적용 전에, 적어도, 30 분, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 또는 24 시간, 또는 그 이하 동안 배치될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 줄기 또는 전구 세포들과 콜라겐 바이오패브릭의 고막에의 적용 후에 접촉될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 고막을 복수의 줄기 또는 전구 세포들과 접촉시키고, 고막을 콜라겐 바이오패브릭과 접촉시켜 콜라겐 바이오패브릭이 고막 및 줄기 또는 전구 세포들을 덮는 것을 포함하는, 고막의 치료 방법을 제공한다.

고막 상에, 또는 콜라겐 바이오패브릭의 표면 상에 배치된 줄기 또는 전구 세포들의 수는, 임의의 구현예에서 가변적일 수 있지만, 적어도 1×10⁶, 3×10⁶, 1×10⁷, 3×10⁷, 1×10⁸, 3×10⁸, 1×10⁹, 3×10⁹, 1×10¹⁰, 3×10¹⁰, 1×10¹¹, 3×10¹¹, 또는 1×10¹²일 수 있거나; 1×10⁶, 3×10⁶, 1×10⁷, 3×10⁷, 1×10⁸, 3×10⁸, 1×10⁹, 3×10⁹, 1×10¹⁰, 3×10¹⁰, 1×10¹¹, 3×10¹¹, 또는 1×10¹² 줄기 또는 전구 세포들 이하일 수 있다. 따라서, 특정 구현예들에서, 본 발명은 상기 고막을, 어느 순서로든, (a) 콜라겐 바이오패브릭, 및 (b) 1×10⁶, 3×10⁶, 1×10⁷, 3×10⁷, 1×10⁸, 3×10⁸, 1×10⁹, 3×10⁹, 1×10¹⁰, 3×10¹⁰, 1×10¹¹, 3×10¹¹, 또는 1×10¹²; 줄기 또는 전구 세포들을 포함하는 복수의 줄기 또는 전구 세포들과 접촉시키는 것을 포함하는 고막의 복원 방법을 제공한다. 기타 특정 구현예들에서, 본 발명은 고막을, 어느 순서로든, (a) 콜라겐 바이오패브릭, 및 (b) 1×10⁶, 3×10⁶, 1×10⁷, 3×10⁷, 1×10⁸, 3×10⁸, 1×10⁹, 3×10⁹, 1×10¹⁰, 3×10¹⁰, 1×10¹¹, 3×10¹¹, 또는 1×10¹²; 이하의 줄기 또는 전구 세포들을 포함하는 복수의 줄기 또는 전구 세포들과 접촉시키는 것을 포함하는, 고막의 치료 방법을 제공한다. 더욱 특정의 구현예에서, 상기 복수의 줄기 세포들은 2종 이상의 상이한 줄기 또는 전구 세포 유형들을 포함한다.

본 발명은 고막 변형을 복원하기 위한 콜라겐 바이오패브릭의 사용이 고막의 유일한 치료일 수 있거나, 고막의 치료 또는 복원의 절차에 있어 또 다른 요법들 또는 치료에 부가하여 동시적으로 사용될 수 있음을 추가로 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 고막을 콜라겐 바이오패브릭과 접촉시키고, 이어서 고막과 콜라겐 바이오패브릭을 접촉시키는 것을 포함하지 않는 추가적 치료 요법을 사용하여 고막을 치료하는 것을 포함하는, 고막의 복원을 제공하며, 여기서 사용된 상기의 접촉 및 추가적 치료 요법은, 개별적으로 또는 함께, 콜라겐 바이오패브릭과 접촉되지 않은 고막과 비교시, 고막 변형의 적어도 한 측면에 있어 측정가능한 개선, 이의 유지, 또는 이의 악화의 경감을 결과로 한다.

본 발명은 고막의 복원과 함께 귀 상태의 복원을 위한 콜라겐 바이오패브릭의 사용을 제공한다. 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭은 이도 및 중이 챔버(chamber)를 포함하는 외이 또는 중이 구조들을 재건 또는 복원하는데 사용될 수 있다. 콜라겐 바이오패브릭은, 예를 들어, 특히 고실성형술에 부가하여 유양돌기 재건이 지적되는 경우, 유돌강(mastoid cavity)의 복원 또는 라이닝(lining)에 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 유돌강이 노출된 뼈, 즉 어떠한 피복 상피 세포층도 갖지 않는 뼈를 포함하는 경우, 유돌강을 라이닝하는데 사용될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 콜라겐 바이오패브릭은 단독으로 또는 고실성형술 또는 고막성형술과 접목되어, 등골 수술에서의 타원 창 이식편으로서 사용될 수 있다.

4.2 콜라겐 바이오패브릭

4.2.1 상세한 설명

고막의 복원에 사용되는 콜라겐 바이오패브릭은 임의의 포유 동물, 예를 들어, 말, 소, 돼지 또는 원숭이 공급원의 양막으로부터 유도될 수 있지만, 사람 태반으로부터 유도되는 것이 가장 바람직하다. 바람직한 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 실질적으로 건조하며, 즉, 20 중량％ 이하의 물이 존재한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 양막의 천연적 삼차 및 사차 구조를 보유하며, 즉, 프로테아제-처리되지 않았다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 콜라겐 바이오패브릭은 인공적으로 교차결합된, 예를 들어, 화학적으로 교차결합된 콜라겐 및 기타 구조 단백질들을 전혀 함유하지 않으며, 즉, 바람직한 콜라겐 바이오패브릭은 고정되지 않는다. 바람직한 콜라겐 바이오패브릭은, 그의 전문이 본원에 편입되는 하리리에 의한 U.S. 출원 공보 U.S.2004/0048796에 기재된, 건조의, 비-고정의, 프로테아제-처리되지 않은 양막 재료이며, 이는 상기 문헌 및 본원에 기재된 방법들에 의해 제조된다(실시예 1, 2 참조). 하지만, 본 발명의 방법들은 임의의 절차에 의해 제조된 임의의 태반-유도된 콜라겐 재료를 이용할 수 있다.

바람직한 구현예에서, 고막의 치료 또는 복원에 사용되는 콜라겐 바이오패브릭은 반투명이다. 기타 구현예들에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 불투명이거나, 착색 또는 염색되거나, 예를 들어, 의학적으로-허용가능한 염색 또는 착색제를 사용하여 영구적으로 착색 또는 염색되고; 상기 작용제는 콜라겐 바이오패브릭 상에 흡착될 수 있거나, 또는 상기 콜라겐 바이오패브릭은 상기 작용제로 함침되거나 코팅될 수 있다. 상기 구현예에서, 임의의 공지의 무독성, 무-자극 착색제 또는 염료가 사용될 수 있다.

상기 콜라겐 바이오패브릭이 실질적으로 건조한 경우, 이는 약 0.1 g/㎠ 내지 약 0.6 g/㎠이다. 특정 구현예에서, 콜라겐 바이오패브릭의 단일층은 적어도 2㎛의 두께이다. 또 다른 특정 구현예에서, 고막의 복원에 사용되는 콜라겐 바이오패브릭의 단일층은 대략 10-40㎛의 두께이지만, 건조 상태에서 대략 2-150, 2-100㎛, 5-75㎛ 또는 7-60㎛의 두께일 수 있다.

한 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 주로 콜라겐(유형 I, III 및 Ⅳ; 바이오패브릭의 매트릭스의 약 90％), 피브린, 피브로넥틴, 엘라스틴으로 구성되며, 글리코사미노글리칸류 및/또는 프로테오글리칸류를 추가로 포함할 수 있다. 특정 구현예들에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 비-구조적 구성성분들, 예컨대, 예를 들어, 1종 이상의 성장 인자들, 예를 들어, 혈소판-유도된 성장 인자들(PDGF), 혈관-내피 성장 인자(VEGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF) 및 전환 성장 인자-β1을 포함할 수 있다. 콜라겐 바이오패브릭의 조성은 섬유모세포들 및 대식세포들의 이동, 및 따라서 상처 치유의 촉진을 조장하는데 적합한 것이 이상적일 수 있다.

상기 콜라겐 바이오패브릭은, 예를 들어, 단일-층 시트 또는 비-적층 막과 같은 단일-층 형식으로 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 이중-층 또는 다중-층 형식으로 사용될 수 있고, 예를 들어, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 적층될 수 있다. 적층은 치유 과정 동안 보다 큰 강직도 및 내구성을 제공할 수 있다. 상기 콜라겐 바이오패브릭은, 예를 들어, 하기된 바와 같이 적층될 수 있다(단락 4.2.7 참조).

상기 콜라겐 바이오패브릭은 비-태반 공급원으로 부터의 콜라겐을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 1 이상의 층의 콜라겐 바이오패브릭은, 정제된 추출 콜라겐으로 코팅 또는 함침되거나, 이들과 적층될 수 있다. 상기 콜라겐은, 예를 들어, 상업적 공급원들로부터 구해질 수 있거나, 공지의 방법들, 예컨대 그의 개시가 본원에 참조로써 편입된 U.S. 특허 제4,420,339, 5,814,328, 및 5,436,135호에 개시된 방법들에 따라 제조될 수 있다.

고막의 복원에 사용되는 콜라겐 바이오패브릭은 그로부터 콜라겐 바이오패브릭이 유도되는 태반 재료에 존재하지 않는 1종 이상의 화합물들 또는 물질들을 포함할 수 있다. 상기 콜라겐 바이오패브릭은 그로부터 콜라겐 바이오패브릭이 유도되는 태반 재료에 정상적으로 존재하는 1종 이상의 화합물들 또는 물질들의 비-천연-발생적 양을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 하기 단락 4.2.2에 열거된 것들과 같은 생체활성 화합물로 함침될 수 있다. 그러한 생체활성 화합물들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 유기 저분자들(예를 들어, 약물들), 항생제들(예컨대 클린다마이신, 미노사이클린, 독시사이클린, 젠타마이신), 호르몬들, 성장 인자들, 항-종양제들, 항-진균제들, 항-바이러스제들, 진통 투약들, 항-히스타민류, 항-염증제들, 이에 한정되는 것은 아니나 은을 포함하는 항-감염제들(예컨대 이에 한정되는 것은 아니나, 은 니트레이트 및 은 술파디아진을 포함하는 은 염들), 원소 은, 항생제들, 살균 효소들(예컨대 리소자임), 상처 치유제들(예컨대 이에 한정되는 것은 아니나, PDGF, TGF를 포함하는 사이토카인류; 티모신), 상처 치유제인 히알루론산, 상처 봉함제들(예컨대 트롬빈을 갖거나 갖지 않는 피브린), 세포 유인물질 및 스캐폴딩(scaffolding) 시약들(예컨대 첨가된 피브로넥틴) 등을 포함한다. 특정 예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 적어도 1종의 성장 인자, 예를 들어, 섬유모세포 성장 인자, 상피 성장 인자, 등으로 함침될 수 있다. 상기 바이오패브릭은 또한 유기 저분자들, 예컨대 특별한 생화학 과정들의 특이 억제제들, 예를 들어, 막 수용체 억제제들, 키나아제 억제제들, 성장 억제제들, 항암 약물들, 항생제들, 등으로 함침될 수도 있다. 생체활성 화합물로 콜라겐 바이오패브릭을 함침시키는 것은, 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭을 목적하는 농도의 생체활성 화합물의 용액에, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 상기 용액을 흡수하여 평형을 이루도록 하기에 충분한 시간동안 침지시킴으로써, 달성될 수도 있다.

기타 구현예들에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 하이드로겔과 조합되어 복합재를 형성할 수도 있다. 당업자에게 공지된 임의의 하이드로겔 조성물이 본 발명 내에 포함되며, 예를 들어, 하기 리뷰들에 개시된 임의의 하이드로겔 조성물들: Graham, 1998, Med. Device Technol. 9(1): 18-22; Peppas et al, 2000, Eur. J. Pharm. Biopharm. 50(1): 27-46; Nguyen et al, 2002, Biomaterials, 23(22): 4307-14; Henincl et al, 2002, Adv. DrugDeliv. Rev 54(1): 13-36; Skelhorne et al, 2002, Med. Device. Technol. 13(9): 19-23; Schmedlen et al, 2002, Biomaterials 23: 4325-32;이고, 이들 모두는 그의 전문이 본원에 참조로써 편입된다. 특정 구현예에서, 상기 하이드로겔 조성물은 콜라겐 바이오패브릭에 적용되고, 즉, 콜라겐 바이오패브릭의 표면 상에 배치된다. 상기 하이드로겔 조성물은 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭 상에 분무될 수 있거나 콜라겐 바이오패브릭의 표면 상에 코팅될 수 있고, 또는 상기 바이오패브릭이 하이드로겔 조성물로 침윤, 목욕 또는 포화될 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 하이드로겔은 2 이상의 층들의 콜라겐 바이오패브릭 사이에 샌드위치된다. 보다 더욱 특정의 구현예에서, 상기 하이드로겔은 2층의 콜라겐 바이오패브릭 사이에 샌드위치되고, 여기서 2층의 바이오패브릭의 가장자리는, 실질적으로 또는 완전히 하이드로겔을 함유하도록 밀봉된다.

본 발명의 방법들 및 조성물들에 유용한 하이드로겔은, 이에 한정되는 것은 아니지만 폴리비닐알콜(PVA), 폴리히드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 히알루론산, 알기네이트, 콜라겐, 젤라틴, 덱스트란 또는 이들의 유도체들 및 유사체들을 포함하는, 당업계에 공지된 임의의 수-상호작용성, 또는 수용성 고분자로부터 제조될 수 있다.

일부 구현예들에서, 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭은 1종 이상의 생체활성 화합물들을 포함하고, 하이드로겔과 조합된다. 예를 들어, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 하이드로겔과 조합되기 전에, 1종 이상의 생체활성 화합물들로 함침될 수 있다. 기타 구현예들에서, 상기 하이드로겔 조성물은, 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭과 조합되기 전 또는 후에, 1종 이상의 생체활성 화합물들로 추가 함침되고, 예를 들어 생체활성 화합물들은 하기 단락 4.2.2에 기재된다.

4.2.2 생체활성 화합물들

본 발명의 방법들에 사용되는 콜라겐 바이오패브릭은 1종 이상의 생체활성 또는 의약 화합물들, 예컨대 유기 저분자들 (예를 들어, 약물들), 항생제들, 항바이러스제들, 항균제들, 항염증제들, 항증식제들, 사이토카인류, 효소 또는 단백질 억제제들, 항히스타민류 등을 포함할 수 있다(예를 들어, 이들로 함침되거나 코팅될 수 있다). 다양한 구현예들에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 항생제들(예컨대 클린다마이신, 미노사이클린, 독시사이클린, 젠타마이신), 호르몬들, 성장 인자들, 항-종양제들, 항-진균제들, 항-바이러스제들, 진통 투약들(자일로카인(Xylocaine)^®, 리도카인, 프로카인, 노보카인 등을 포함), 항히스타민류(예를 들어, 디페닐히드라민, 베나드릴(Benadryl)^® 등), 항-염증제들, 이에 한정되는 것은 아니나 은을 포함하는 항-감염제들(예컨대 이에 한정되는 것은 아니나, 은 니트레이트 및 은 술파디아진을 포함하는 은 염들), 원소 은, 항생제들, 살균 효소들(예컨대 리소좀), 상처 치유제들(예컨대 이에 한정되는 것은 아니나, PDGF(예를 들어, 리그라넥스(Regranex)^®), TGF를 포함하는 사이토카인류; 티모신), 상처 치유제인 히알루론산, 상처 봉함제들(예컨대 트롬빈을 갖거나 갖지 않는 피브린), 세포 유인물질 및 스캐폴딩 시약들(예컨대 피브로넥틴) 등, 또는 임의의 상기의, 또는 임의의 상기 및 열거되지 않은 기타 화합물들의 조합물들로 코팅되거나 함침될 수 있다. 그러한 함침 또는 코팅은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 달성될 수 있고, 콜라겐 바이오패브릭의 부분 또는 전체가 코팅되거나 함침될 수 있다.

콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재들은, 제한 없이, 개별적으로 또는 임의의 조합으로 본원에 열거된 임의의 화합물들을 포함할 수 있다. 본원에 열거된 임의의 생물학적으로 활성인 화합물들, 및 공막 또는 눈의 맥락에 있어 유용한 기타의 것들이 즉각적 방출 또는 연장된 방출을 위한 공지의 방법들에 의해 제형될 수 있다. 부가적으로, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 2종 이상의 생물학적으로 활성인 화합물들을 상이한 방식들로 포함할 수 있고; 예를 들어, 상기 바이오패브릭은 1종의 생물학적으로 활성인 화합물로 함침되고 다른 1종으로 코팅될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 연장된 방출을 위해 제형된 제 1의 생물학적으로 활성인 화합물, 및 즉각적 방출을 위해 제형된 제 2의 생물학적으로 활성인 화합물을 포함한다

천공된 고막을 포함하는 고막의 치유를 포함하는 상처 치유는, 적당한 영양, 특히 철, 아연, 비타민 C, 아르기닌 등의 존재를 필요로 한다. 따라서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 상처 치유에 필요한 1종 이상의 영양소들의 생리적으로-이용가능한 형태로 함침되거나 코팅될 수 있다. 바람직하게는, 상기 영양소는 연장된 방출을 위해 제형된다.

콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재는 항생제를 포함할 수 있다. 특정 구현예들에서, 상기 항생제는 마크롤라이드(예를 들어, 토브라마이신(토비(Tobi)^®)), 세팔로스포린(예를 들어, 세팔렉신(케플렉스(Keflex)^®)), 세프라딘(벨로세프(Velosef)^®)), 세푸록심(세프틴(Ceftin)^®, 세프프로질(세프질(Cefzil)^®), 세파클로어(세클로어(Ceclor)^®), 세픽심(슈프락스(Suprax)^® 또는 세파드록실(듀리세프(Duricef)^®), 클라리트로마이신(예를 들어, 클라리트로마이신(비악신(Biaxin))), 에리트로마이신(예를 들어, 에리트로마이신(이마이신(EMycin)^®)), 페니실린(예를 들어, 페니실린 V(브이-실린케이(V-CillinK)^® 또는 펜 비이크(Pen VeeK)^®)) 또는 퀴놀론(예를 들어, 오플록사신(플록신^®), 시프로플록사신(시프로(Cipro)^®) 오르노플록사신(노록신(Noroxin)^®)), 아미노글리코시드 항생제들(예를 들어, 아프라마이신, 아르베카신, 밤베르마이신류, 부티로신, 디베카신, 네오마이신, 네오마이신, 운데실레네이트, 네틸미신, 파로모마이신, 리보스타마이신, 시소미신, 및 스펙티노마이신), 암페니콜 항생제들(예를 들어, 아지담페니콜, 클로르암페니콜, 플로르페시놀, 및 티암페니콜), 안사마이신 항생제들(예를 들어, 리파미드 및 리팜핀), 카르바세펨류(예를 들어, 로라카르베프), 카르바페넴류(예를 들어, 비아페넴 및 이미페넴), 세팔로스포린류(예를 들어, 세파클로어, 세파드록실, 세팜안돌, 세파트리진, 세파제돈, 세포조프란, 세프피미졸, 세프피라미드, 및 세프피롬), 세파마이신류(예를 들어, 세프부페라존, 세피네타졸, 및 세프미녹스), 모노박탐류(예를 들어, 아즈트레오남, 카루모남, 및 티게모남), 옥사세펨류(예를 들어, 플로목제프, 및 목살락탐), 페니실린류(예를 들어, 암디노실린, 암디노실린 피복실, 암옥시실린, 바캄피실린, 벤질페니실린산, 벤질페니실린 나트륨, 에피실린, 페베니실린, 플록사실린, 페남실린, 페네타메이트 히드리요오다이드, 페니실린 o-베네타민, 페니실린 O, 페니실린 V, 페니실린 V 벤자틴, 페니실린 V 히드라바민, 페니메피사이클린, 및 페니히실린 칼륨), 린코사미드류(예를 들어, 클린다마이신, 및 린코마이신), 마크롤라이드류(예를 들어, 아지트로마이신, 카르보마이신, 클라리토마이신, 디리트로마이신, 에리트로마이신, 및 에리트로마이신 아시스트레이트), 암포마이신, 박시트라신, 카프레오마이신, 콜리스틴, 엔듀라시딘, 엔비오마이신, 테트라사이클린류(예를 들어, 애피사이클린, 클로르테트라사이클린, 클로모사이클린, 및 데메클로사이클린), 2,4-디아미노피리미딘류(예를 들어, 브로디모프림), 니트로푸란류(예를 들어, 푸랄타돈, 및 푸라졸륨 클로리드), 퀴놀론류 및 이들의 유사체들(예를 들어, 시녹사신, 시프로플록사신, 클리나플록사신, 플루메퀸, 및 그레파글록사신), 술폰아미드류(예를 들어, 아세틸 술파메톡시피라진, 벤질술파미드, 노프릴술파미드, 프탈릴술파세타미드, 술파크리소이딘 및 술파사이틴), 술폰류(예를 들어, 디아티모술폰, 글루코술폰 나트륨, 및 솔라술폰), 사이클로세린, 뮤피로신 및 튜베린이다.

특정 구현예들에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 항진균제로 코팅 또는 함침될 수 있다. 적절한 항진균제들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 암포테리신 B, 이트라코나졸, 케노코나졸, 플루코나졸, 인트라테칼, 플루사이토신, 미코나졸, 부토코나졸, 클로트리마졸, 나이스타틴, 테르코나졸, 티오코나졸, 시클로피록스, 에코나졸, 할로프로그린, 나프티핀, 테르비나핀, 운데실레네이트, 및 그리세오풀딘을 포함한다.

특정 기타 구현예들에서, 콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재는, 항-염증제로 코팅 또는 함침된다. 유용한 항염증제들은 이들에 한정되는 것은 아니지만, 비-스테로이드성 항-염증 약물들, 예컨대 살리실산, 아세틸살리실산, 메틸 살리실레이트, 디플루니살, 살살레이트, 올살라진, 술파살라진, 아세트아미노펜, 인도메타신, 술린닥, 에토돌락, 메페남산, 메클로페나메이트 나트륨, 톨메틴, 케토롤락, 디클로페낙, 이부프로펜, 나프록센, 나프록센 나트륨, 페노프로펜, 케토프로펜, 플루빈프로펜, 옥사프로진, 피록시캄, 멜록시캄, 암피록시캄, 드록시캄, 피복시캄, 테녹시캄, 나부메톰, 페닐부타존, 옥시펜부타존, 안티피린, 아미노피린, 아파존 및 니메술리드; 이들에 한정되는 것은 아니지만, 질류톤, 아우로티오글루코스, 금 나트륨 티오말레이트 및 아우라노핀을 포함하는 류코트리엔 길항제들; 및 이들에 한정되는 것은 아니지만, 메토트렉세이트, 콜키신, 알로퓨리놀, 프로베네시드, 술핀피라존 및 벤즈브로마론을 포함하는 기타 항-염증제들을 포함한다.

특정 구현예들에서, 콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재는, 항바이러스제로 코팅 또는 함침된다. 유용한 항바이러스제들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 뉴클레오사이드 유사체들, 예컨대 지도부딘, 아시클로버, 갱사이클로버, 비다라빈, 이독수리딘, 트리플루리딘, 및 리바비린, 및 포스카르넷, 아만타딘, 리만타딘, 사퀴네이버, 인디네이버, 리토네이버, 및 알파-인터페론류를 포함한다.

콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재는 또한 사이토카인 수용체 조정자(modulator)로 코팅 또는 함침될 수 있다. 사이토카인 수용체 조정자들의 예들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 가용성 사이토카인 수용체류(예를 들어, TNF-α 수용체 또는 이의 분절의 세포외 영역, IL-10 수용체 또는 이의 분절의 세포외 영역 , IL-6 수용체 또는 이의 분절의 세포외 영역), 사이토카인류 또는 이의 분절들(예를 들어, 인터류킨 (IL)-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-15, TNF-α, TNF-β, 인터페론 (IFN)-α, IFN-β, IFN-γ, 및 GM-CSF), 항-사이토카인 수용체 항체들(예를 들어, 항-IFN 수용체 항체들, 항-IL-2 수용체 항체들(예를 들어, 제나팍스(Zenapax)(프로테인 디자인 랩스(Protein Design Labs))), 항-IL-4 수용체 항체들, 항-IL-6 수용체 항체들, 항-IL-10 수용체 항체들, 및 항-IL-12 수용체 항체들), 항-사이토카인 항체들(예를 들어, 항-IFN 항체들, 항-TNF-α 항체들, 항-IL-10 항체들, 항-IL-6 항체들, 항-IL-8 항체들(예를 들어, ABX-IL-8(아브제닉스(Abgenix))), 및 항-IL-12 항체들)을 포함한다. 특정 구현예에서, 사이토카인 수용체 조정자는 IL-4, IL-10, 또는 이의 분절이다. 또 다른 구현예에서, 사이토카인 수용체 조정자는 항-IL-1 항체, 항-IL-6 항체, 항-IL-12 수용체 항체, 또는 항-TNF-α 항체이다. 또 다른 구현예에서, 사이토카인 수용체 조정자는 TNF-α 수용체 또는 이의 분절의 세포외 영역이다. 특정 구현예들에서, 사이토카인 수용체 조정자는 TNF-α 길항제가 아니다.

바람직한 구현예에서, 면역조정제들로서 이용되는 단백질류, 폴리펩타이드류 또는 펩타이드류(항체들을 포함함)은 상기 단백질류, 폴리펩타이드류 또는 펩타이드류에 대한 면역 반응의 가능성을 감소시키도록, 단백질류, 폴리펩타이드류 또는 펩타이드류의 수용자와 동일한 종들로부터 유도된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 대상체가 인간인 경우, 면역조정제들로서 이용되는 단백질류, 폴리펩타이드류, 또는 펩타이드류는 인간의 또는 인체적응된 것이다.

콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재는 또는 사이토카인으로 코팅 또는 함침될 수도 있다. 사이토카인류의 예는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 집락 자극 인자 1(CSF-1), 인터류킨-2(IL-2), 인터류킨-3(IL-3), 인터류킨-4(IL-4), 인터류킨-5(IL-5), 인터류킨-6(IL-6), 인터류킨-7(IL-7), 인터류킨-9(IL-9), 인터류킨-10(IL-10), 인터류킨-12(IL-12), 인터류킨 15(IL-15), 인터류킨 18(IL-18), 인슐린형 성장 인자 1(IGF-1), 혈소판 유도된 성장 인자(PDGF), 에리트로포이에틴(Epo), 표피 성장 인자(EGF), 섬유모세포 성장 인자(FGF)(염기성 또는 산성), 과립구 대식세포 자극 인자(GM-CSF), 과립구 집락 자극 인자(G-CSF), 헤파린 결합 표피 성장 인자(HEGF), 대식세포 집락 자극 인자(M-CSF), 프로락틴, 및 인터페론(IFN), 예를 들어, IFN-알파, 및 IFN-감마), 전환 성장 인자 알파(TGF-α), TGFβ1, TGFβ2, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 간세포 성장 인자(HGF) 등을 포함한다.

콜라겐 바이오패브릭은 또한 호르몬으로 코팅 또는 함침될 수 있다. 호르몬들의 예는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LHRH), 성장 호르몬(GH), 성장 호르몬 방출 호르몬, ACTH, 소마토스타틴, 소마토트로핀, 소마토메딘, 부갑상샘 호르몬, 시상하부 방출 인자들, 인슐린, 글루카곤, 엔케팔린류, 바소프레신, 칼시토닌, 헤파린, 저분자량 헤파린류, 헤파리노이드류, 합성 및 천연 아편유사물질들, 인슐린 갑상샘 자극 호르몬들, 및 엔돌핀류를 포함한다. β-인터페론류의 예는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 인터페론 β1-a 및 인터페론 β1-b를 포함한다.

콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재는 알킬화제로 코팅 또는 함침될 수 있다. 알킬화제들의 예는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 질소 머스타드, 에틸렌이민류, 메틸멜라민류, 알킬 술포네이트류, 니트로소우레아류, 트리아젠류, 메클로르에타민, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란, 클로람뷰실, 헥사메틸멜라인, 티오테파, 부술판, 카르무스틴, 스트렙토조신, 다카바진 및 테모졸로미드를 포함한다.

콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재는 또한, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 시클로포스파미드, 시클로스포린 A, 마크롤라이드 항생제들(예를 들어, FK506(타크롤리무스)), 메틸프레드니솔론(MP), 코르티코스테로이드류, 스테로이드류, 마이코페놀레이트 모페틸, 라파마이신(시롤리무스), 미조리빈, 데옥시스페르구알린, 브레퀴나르, 말로노니트릴로아미드류(예를 들어, 레플루나미드), T 세포 수용체 조정자들, 및 사이토카인 수용체 조정자들, 펩타이드 모방체들, 및 항체들(예를 들어, 인간의, 인체적응된, 키메라, 단클론성, 다클론성, Fvs, ScFvs, Fab 또는 F(ab)₂ 분절들 또는 에피토프 결합 분절들), 핵산 분자들(예를 들어, 안티센스(antisense) 핵산 분자들 및 삼중 나선들), 소분자들, 유기 화합물들, 및 무기 화합물들을 포함하는 면역조정제로 코팅 또는 함침될 수도 있다. 특히, 면역조정제들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 메토트렉세이트, 레플루노미드, 시클로포스파미드, 사이톡산, 이뮤란, 시클로스포린 A, 미노사이클린, 아자티오프린, 항생제들(예를 들어, FK506(타크롤리무스)), 메틸프레드니솔론(MP), 코르티코스테로이드류, 스테로이드류, 마이코페놀레이트 모페틸, 라파마이신(시롤리무스), 미조리빈, 데옥시스페르구알린, 브레퀴나르, 말로노니트릴로아미드류(예를 들어, 레플루나미드), T 세포 수용체 조정자들, 및 사이토카인 수용체 조정자들을 포함한다. T 세포 수용체 조정자들의 예는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 항-T 세포 수용체 항체들(예를 들어, 항-CD4 항체들(예를 들어, cM-T412(베링거(Boeringer)), IDEC-CE9.Is(IDEC 및 SKB), mAB 4162W94, 오르토클론(Orthoclone) 및 OKTcdr4a(얀센-실락(Janssen-Cilag))), 항-CD3 항체들(예를 들어, 누비온(Nuvion)(프로덕트 디자인 랩스(Product Design Labs)), OKT3(존슨 앤 존슨(Johnson & Johnson)), 또는 리투잔(Rituxan)(IDEC)), 항-CD5 항체들(예를 들어, 항-CD5 리신-연결된 면역접합체), 항-CD7 항체들(예를 들어, CHH-380(노바르티스(Novartis))), 항-CD8 항체들, 항-CD40 리간드 단클론성 항체들(예를 들어, IDEC-131(IDEC)), 항-CD52 항체들(예를 들어, CAMPATH 1H(아일렉스(Ilex))), 항-CD2 항체들, 항-CD1 1a 항체들(예를 들어, 자넬림(Xanelim)(제넨테크(Genentech))), 및 항-B7 항체들(예를 들어, IDEC-114)(IDEC))) 및 CTLA4-면역글로뷸린을 포함한다. 특정 구현예에서, T 세포 수용체 조정자는 CD2 길항제이다. 기타 구현예들에서, T 세포 수용체 조정자는 CD2 길항제가 아니다. 또 다른 특정 구현예에서, T 세포 수용체 조정자는 CD2 결합 분자, 바람직하게는 MEDI-507이다. 기타 구현예들에서, T 세포 수용체 조정자는 CD2 결합 분자가 아니다.

콜라겐 바이오패브릭, 또는 콜라겐 바이오패브릭을 포함하는 복합재는 또한 IMiDs^®로 공지된 면역조정 화합물들의 계열로 코팅 또는 함침될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 특별히 지시되지 않는 한, 용어 "IMiD^®" 및 "IMiDs^®"(셀진 코포레이션(Celgene Corporation))은 TNF-α, LPS 유도된 단핵구 IL1β 및 IL12를 현저히 억제하고, IL6 생성을 부분적으로 억제하는 유기 저분자들을 포함한다. 특이 면역조정 화합물들이 하기에 논의된다.

상기 면역조정 화합물들의 특정 예는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, U.S. 특허 제5,929,117호에 개시된 것들과 같은, 치환된 스티렌류의 시아노 및 카르복시 유도체들; 특허 제5,874,448 및 5,955,476호에 기재된 것들과 같은, 1-옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3-일)이소인돌린류 및 1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3-일)이소인돌린류; U.S. 특허 제 5,798,368호에 기재된 테트라 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-옥소이소인돌린류; 이들에 한정되는 것은 아니지만, U.S. 특허 제5,635,517, 6,476,052, 6,555,554, 및 6,403,613호에 개시된 것들을 포함하는, 1-옥소 및 1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린류(예를 들어, 탈리도미드의 4-메틸 유도체들); U.S. 특허 제6,380,239호에 기재된, 인돌린 고리의 4- 또는 5-위치에서 치환된 1-옥소 및 1,3-디옥소이소인돌린류(예를 들어, 4-(4-아미노-1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-4-카르바모일부타논산); U.S. 특허 제6,458,810호에 기재된, 2-위치에서 2,6-디옥소-3-히드록시피페리딘-5-일로 치환된 이소인돌린-1-온 및 이소인돌린-1,3-디온(예를 들어, 2-(2,6-디옥소-3-히드록시-5-플루오로피페리딘-5-일)-4-아미노이소인돌린-1-온); U.S. 특허 제5,698,579 및 5,877,200호에 개시된 비-폴리펩타이드 시클릭 아미드류의 계열; 아미노탈리도미드, 및 아미노탈리도미드의 유사체들, 가수분해 생성물들, 대사물들, 유도체들 및 전구체들, 및 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일) 프탈리미드류 및 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-옥소이소인돌류, 예컨대 U.S. 특허 제6,281,230 및 6,316,471호에 기재된 것들; 및 2001년 10월 5일에 출원된 U.S. 특허 출원 제09/972,487호, 2001년 12월 21에 출원된 U.S. 특허 출원 제10/032,286호, 및 국제 출원 번호 PCT/US01/50401(국제 공개 번호 WO 02/059106)에 기재된 것들과 같은 이소인돌-이미드 화합물들을 포함한다. 본원에 규명된 각각의 특허들 및 특허 출원들의 전문이 본원에 참조로서 편입된다. 면역조정 화합물들은 탈리도미드를 포함하지 않는다.

기타 특정 면역조정 화합물들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 본원에 참조로써 편입되는 U.S. 특허 제5,635,517호에 기재되는 바와 같이, 벤조 고리에서 아미노로 치환된 1-옥소- 및 1,3 디옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린류를 포함한다. 상기 화합물들은 하기 화학식 I을 갖는다.

식 중, X 및 Y 중 하나는 C=O이고, X 및 Y 중 나머지 하나는 C=O 또는 CH₂이고, R²는 수소 또는 저급 알킬, 특히 메틸이다.

특정 면역조정 화합물들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 하기를 포함한다:

1-옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-아미노이소인돌린;

1-옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-5-아미노이소인돌린;

1-옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-6-아미노이소인돌린;

1-옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-7-아미노이소인돌린;

1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-아미노이소인돌린; 및

1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-5-아미노이소인돌린.

기타 특정 면역조정 화합물들은 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)프탈리미드류 및 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-옥소이소인돌류의 계열에 속하 며, 예컨대 그의 각각이 본원에 참조로써 편입되는 U.S. 특허 제6,281,230; 6,316,471; 6,335,349; 및 6,476,052호, 및 국제 특허 출원 번호 PCT/US97/13375(국제 공개 번호 WO 98/03502)에 기재된 것들과 같다. 대표적 화합물들은 하기 화학식을 갖는다:

식 중,

X 및 Y 중 하나는 C=O이고, X 및 Y 중 나머지 하나는 C=O 또는 CH₂이고;

(i) 각각의 R¹, R², R³ 및 R⁴는 서로 독립적으로 할로, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 또는 탄소수 1 내지 4의 알콕시이거나 (ii) R¹, R², R³ 및 R⁴ 중 하나는 -NHR⁵이고 나머지의 R¹, R², R³ 및 R⁴는 수소이며;

R⁵는 수소 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬이고;

R⁶는 수소, 탄소수 1 내지 8의 알킬, 벤질, 또는 할로이며; 단, X 및 Y가 C=O 이고, (i) 각각의 R¹, R², R³ 및 R⁴는 플루오로이거나 (ii) R¹, R², R³ 또는 R⁴ 중 하나가 아미노인 경우, R⁶는 수소 이외의 것이다.

이러한 계열의 대표적인 화합물들은 하기 화학식들과 같다:

식 중, R¹은 수소 또는 메틸이다.

별도의 구현예에서, 본 발명은 이들 화합물들의 거울상이성질체적으로 순수한 형태들(예를 들어, 광학적으로 순수한 (R) 또는 (S) 거울상이성질체들)의 사용을 포함한다.

또한 기타 특정 면역조정 화합물들은 그의 각각이 본원에 참조로써 편입되는 U.S. 특허 출원 공보 제US 2003/0096841 및 US 2003/0045552호, 및 국제 출원 번호 PCT/US01/50401(국제 공개 번호 WO 02/059106)에 개시된, 이소인돌-이미드류의 계열에 속한다. 대표적 화합물들은 하기 화학식 II의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염들, 수화물들, 용매화물들, 포접 화합물들(clathrate), 거울상이성질체들, 부분입체이성질체들, 라세미체들, 및 입체이성질체들의 혼합물들이다.

식 중,

X 및 Y 중 하나는 C=O이고, 다른 하나는 CH₂ 또는 C=O이고;

R¹은 H, (C₁-C₈)알킬, (C₃-C₇)시클로알킬, (C₂-C₈)알케닐, (C₂-C₈)알키닐, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로시클로알킬, (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴, C(O)R³, C(S)R³, C(O)OR⁴, (C₁-C₈)알킬-N(R⁶)₂, (C₁-C₈)알킬-OR⁵, (C₁-C₈)알킬-C(O)OR⁵, C(O)NHR³, C(S)NHR³, C(O)NR³R^3', C(S)NR³R^3' 또는 (C₁-C₈)알킬-O(CO)R⁵이고;

R²는 H, F, 벤질, (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알케닐, 또는 (C₂-C₈)알키닐이고;

R³ 및 R^3'는 독립적으로 (C₁-C₈)알킬, (C₃-C₇)시클로알킬, (C₂-C₈)알케닐, (C₂-C₈)알키닐, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로시클로알킬, (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴, (C₀-C₈)알킬-N(R⁶)₂, (C₁-C₈)알킬-OR⁵, (C₁-C₈)알킬-C(O)OR⁵, (C₁-C₈)알킬- O(CO)R⁵, 또는 C(O)OR⁵이고;

R⁴는 (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알케닐, (C₂-C₈)알키닐, (C₁-C₄)알킬-OR⁵, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로시클로알킬, 또는 (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴이고;

R⁵는(C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알케닐, (C₂-C₈)알키닐, 벤질, 아릴, 또는 (C₂-C₅)헤테로아릴이고;

R⁶의 각각의 존재는 독립적으로 H, (C₁-C₈)알킬, (C₂-C₈)알케닐, (C₂-C₈)알키닐, 벤질, 아릴, (C₂-C₅)헤테로아릴, 또는 (C₀-C₈)알킬-C(O)O-R⁵이거나 R⁶ 기들은 연결되어 헤테로시클로알킬 기를 형성할 수 있고;

n은 0 또는 1이고;

*는 키랄-탄소 중심을 나타낸다.

화학식 II의 특정 화합물들에서, n이 0인 경우, R¹은 (C₃-C₇)시클로알킬, (C₂-C₈)알케닐, (C₂-C₈)알키닐, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로시클로알킬, (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴, C(O)R³, C(O)OR⁴, (C₁-C₈)알킬-N(R⁶)₂, (C₁-C₈)알킬-OR⁵, (C₁-C₈)알킬- C(O)OR⁵, C(S)NHR³ 또는 (C₁-C₈)알킬-O(CO)R⁵이고;

R²는 H 또는 (C₁-C₈)알킬이고;

R³는 (C₁-C₈)알킬, (C₃-C₇)시클로알킬, (C₂-C₈)알케닐, (C₂-C₈)알키닐, 벤질, 아릴, (C₀-C₄)알킬-(C₁-C₆)헤테로시클로알킬, (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴, (C₅-C₈)알킬-N(R⁶)₂; (C₀-C₈)알킬-NH-C(O)O-R⁵; (C₁-C₈)알킬-OR⁵, (C₁-C₈)알킬-C(O)OR⁵, (C₁-C₈)알킬-O(CO)R⁵, 또는 C(O)OR⁵이고; 기타 변수들은 동일한 정의들을 갖는다.

화학식 II의 기타 특정 화합물들에서, R²는 H 또는 (C₁-C₄)알킬이다.

화학식 II의 기타 특정 화합물들에서, R¹은 (C₁-C₈)알킬 또는 벤질이다.

화학식 II의 기타 특정 화합물들에서, R¹은 H, (C₁-C₈)알킬, 벤질, CH₂OCH₃, CH₂CH₂OCH₃ 또는

이다.

화학식 II의 화합물들의 또 다른 구현예에서, R¹은

이고,

여기서, Q는 O 또는 S이며, R⁷의 각각의 존재는 독립적으로 H, (C₁_C₈)알킬, (C₃_C₇)시클로알킬, (C₂_C₈)알케닐, (C₂_C₈)알키닐, 벤질, 아릴, 할로겐, (C₀_C₄)알킬 -(C₁_C₆)헤테로시클로알킬, (C₀_C₄)알킬-(C₂_C₅)헤테로아릴, (C₀_C₈)알킬-N(R⁶)₂, (C₁_C₈)알킬-OR⁵, (C₁_C₈)알킬-C(O)OR⁵, (C₁_C₈)알킬-O(CO)R⁵ 또는 C(O)OR⁵이거나, R⁷ 의 인접하는 존재들은 함께 취해져 바이시클릭 알킬 또는 아릴 고리를 형성할 수 있다.

화학식 II의 기타 특정 화합물들에서, R¹은 C(O)R³이다.

화학식 II의 기타 특정 화합물들에서, R³은 (C₀-C₄)알킬-(C₂-C₅)헤테로아릴, (C_1-C₈)알킬, 아릴, 또는 (C₀-C₄)알킬-OR⁵이다.

화학식 II의 기타 특정 화합물들에서, 헤테로아릴은 피리딜, 푸릴, 또는 티에닐이다.

화학식 II의 기타 특정 화합물들에서, R¹은 C(O)OR⁴이다.

화학식 II의 기타 특정 화합물들에서, C(O)NHC(O)의 H는 (C₁-C₄)알킬, 아릴, 또는 벤질로 대체될 수 있다.

상기 계열의 화합물들의 추가적 예들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만: [2-(2,6-디옥소-피페리딘-3-일)-1,3-디옥소-2,3-디히드로-1H-이소인돌-4-일메틸]-아미드; (2-(2,6-디옥소-피페리딘-3-일)-1,3-디옥소-2,3-디히드로-1H-이소인돌-4-일메틸)-카르밤산 t-부틸 에스테르; 4-(아미노메틸)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))- 이소인돌린-1,3-디온; N-(2-(2,6-디옥소-피페리딘-3-일)-1,3-디옥소-2,3-디히드로- 1H-이소인돌-4-일메틸)-아세타미드; N-{(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜)-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)메틸}시클로프로필-카르복사미드; 2-클로로-N-{(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)메틸}아세타미드; N-(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)-3-피리딜카르복사미드; 3-{1-옥소-4-(벤질아미노)이소인돌린-2-일}피페리딘-2,6-디온; 2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-4-(벤질아미노)이소인돌린-1,3-디온; N-{(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)메틸}프로판아미드; N-{(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)메틸}-3-피리딜카르복사미드; N-{(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)메틸}헵탄아미드; N-{(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)메틸}-2-푸릴카르복사미드; {N-(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)카르바모일}메틸 아세테이트; N-(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))- 1,3-디옥소이소인돌린-4-일)펜탄아미드; N-(2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥소이소인돌린-4-일)-2-티에닐카르복사미드; N-{[2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥소이소인돌린-4-일]메틸}(부틸아미노)카르복사미드; N-{[2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥소이소인돌린-4-일]메틸}(옥틸아미노)카르복사미드; 및 N-{[2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-1,3-디옥소이소인돌린-4-일]메틸}(벤질아미노)카르복사미드를 포함한다.

또한 기타 특정 면역조정 화합물들은 이들의 각각이 본원에 참조로써 편입된 U.S. 특허 출원 공보 제US 2002/0045643호, 국제 공개 번호 WO 98/54170, 및 미합 중국 특허 제6,395,754호에 개시된, 이소인돌-이미드류의 계열에 속한다. 대표적 화합물들은 하기 화학식 III의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염들, 수화물들, 용매화물들, 포접 화합물들, 거울상이성질체들, 부분입체이성질체들, 라세미체들, 및 입체이성질체들의 혼합물들이다.

식 중,

X 및 Y 중 하나는 C=O이고, 다른 하나는 CH₂ 또는 C=O이며;

R은 H 또는 CH₂OCOR'이고;

(i) 각각의 R¹, R², R³ 또는 R⁴는 서로 독립적으로 할로, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 또는 탄소수 1 내지 4의 알콕시이거나 (ii) R¹, R², R³ 또는 R⁴ 중 하나는 니트로 또는 -NHR⁵이고, 나머지 R¹, R², R³ 또는 R⁴는 수소이며;

R⁵은 수소 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬이고;

R⁶는 수소, 탄소수 1 내지 8의 알킬, 벤조, 클로로, 또는 플루오로이며;

R'는 R⁷-CHR¹⁰-N(R⁸R⁹)이고;

R⁷은 m-페닐렌 또는 p-페닐렌 또는 -(C_nH_2n)- (식 중, n은 0 내지 4의 값임)이며;

서로에 대해 독립적으로 취해지는 각각의 R⁸ 및 R⁹은 수소 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬이거나, 함께 취해져 R⁸ 및 R⁹ 는 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌, 또는 -CH₂CH₂X₁CH₂CH₂- (식 중, X₁은 -O-, -S-, 또는 -NH-임)이고;

R¹⁰은 수소, 탄소수 8까지의 알킬 또는 페닐이며;

*는 키랄-탄소 중심을 나타낸다.

기타 대표적 화합물들은 하기 화학식의 화합물이다:

식 중,

X 및 Y 중 하나는 C=O이고, X 및 Y 중 나머지 하나는 C=O 또는 CH₂이고;

(i) 각각의 R¹, R², R³ 또는 R⁴는 서로 독립적으로 할로, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 또는 탄소수 1 내지 4의 알콕시이거나 (ii) R¹, R², R³ 및 R⁴ 중 하나는 -NHR⁵이고 나머지의 R¹, R², R³ 및 R⁴는 수소이며;

R⁵는 수소 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬이고;

R⁶는 수소, 탄소수 1 내지 8의 알킬, 벤조, 클로로, 또는 플루오로이며;

R⁷은 m-페닐렌 또는 p-페닐렌 또는 -(C_nH_2n)- (식 중, n은 0 내지 4의 값임)이며;

서로에 대해 독립적으로 취해지는 각각의 R⁸ 및 R⁹는 수소 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬이거나, 함께 취해져 R⁸ 및 R⁹ 는 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌, 또는 -CH₂CH₂X¹CH₂CH₂- (식 중, X¹은 -O-, -S-, 또는 -NH-임)이고;

R¹⁰은 수소, 탄소수 8까지의 알킬 또는 페닐이다.

기타 대표적 화합물들은 하기 화학식의 화합물이다:

식 중,

X 및 Y 중 하나는 C=O이고, X 및 Y 중 나머지 하나는 C=O 또는 CH₂이고;

각각의 R¹, R², R³ 및 R⁴는 서로 독립적으로 할로, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 또는 탄소수 1 내지 4의 알콕시이거나 (ii) R¹, R², R³ 및 R⁴ 중 하나는 니트로 또 는 보호된 아미노이고, 나머지의 R¹, R², R³ 및 R⁴는 수소이며;

R⁶은 수소, 탄소수 1 내지 8의 알킬, 벤조, 클로로, 또는 플루오로이다.

기타 대표적 화합물들은 하기 화학식의 화합물이다:

식 중,

X 및 Y 중 하나는 C=O이고, X 및 Y 중 나머지 하나는 C=O 또는 CH₂이고;

(i) 각각의 R¹, R², R³ 및 R⁴는 서로 독립적으로 할로, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 또는 탄소수 1 내지 4의 알콕시이거나 (ii) R¹, R², R³ 및 R⁴ 중 하나는 -NHR⁵이고 나머지의 R¹, R², R³ 및 R⁴는 수소이며;

R⁵는 수소, 탄소수 1 내지 8의 알킬, 또는 CO-R⁷-CH(R¹⁰)NR⁸R⁹ (식 중, 각각의 R⁷, R⁸, R⁹, 및 R¹⁰ 은 본원에 정의된 바와 같음)이고;

R⁶은 탄소수 1 내지 8의 알킬, 벤조, 클로로, 또는 플루오로이다.

상기 화합물들의 특정 예들은 하기 화학식의 화합물이다:

식 중,

X 및 Y 중 하나는 C=O이고, X 및 Y 중 나머지 하나는 C=O 또는 CH₂이고;

R⁶은 수소, 탄소수 1 내지 8의 알킬, 벤질, 클로로, 또는 플루오로이며;

R⁷은 m-페닐렌, p-페닐렌 또는 -(C_nH_2n)- (식 중, n은 0 내지 4의 값임)이고;

서로에 대해 독립적으로 취해지는 각각의 R⁸ 및 R⁹는 수소 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬이거나, 함께 취해져 R⁸ 및 R⁹ 는 테트라메틸렌, 펜타메틸렌, 헥사메틸렌, 또는 -CH₂CH₂X¹CH₂CH₂- (식 중, X¹은 -O-, -S-, 또는 -NH-임)이고;

R¹⁰은 수소, 탄소수 1 내지 8의 알킬, 또는 페닐이다.

바람직한 면역조정 화합물들은 4-(아미노)-2-(2,6-디옥소(3-피페리딜))-이소인돌린-1,3-디온 및 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디히드로-이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온이다. 상기 화합물들은 표준의 합성 방법들을 통해 수득될 수 있다(본원에 참조로써 편입되는, 예를 들어, 미합중국 특허 제5,635,517호 참조). 상기 화합물들은 셀진 코포레이션, 워렌, NJ로부터 입수가능하다. 4-(아미노)-2-(2,6-디 옥소(3-피페리딜))-이소인돌린-1,3-디온은 하기 화학 구조를 갖는다:

화합물 3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디히드로-이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온은 하기 화학 구조를 갖는다:

또 다른 구현예에서, 특정 면역조정 화합물들은, 양 모두가 본원에 참조로써 편입되는 2003년 9월 4일에 제출된 U.S. 가출원 제60/499,723호, 및 2004년 9월 3일에 출원된 U.S. 비-가출원 제10/934,863호에 개시된, 형태 A, B, C, D, E, F, G 및 H와 같은 3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디히드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 다형(polymorphic) 형태들을 포함한다. 예를 들어, 3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디히드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 형태 A는 비-수성 용매 시스템으로부터 수득될 수 있는 비-용매화, 결정성 재료이다. 형태 A는 대략 8, 14.5, 16, 17.5, 20.5, 24 및 26도 2θ에서 유의미한 피크들을 포함하는 X-선 분말 회절 패턴을 가지고, 최대 약 270℃의 시차 주사 열계량법 융점을 갖는다. 형태 A는 약한- 또는 비-흡습성이며, 3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디히드로-이소인돌-2-일)-피페리딘-2,6-디온의 지금까지 발견된 가장 열역학적으로 안정한 무수성 다형체로 나타난다.

3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디히드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 형태 B는, 이들에 한정되는 것은 아니지만 헥산, 톨루엔, 및 물을 포함하는 다양한 용매 시스템들로부터 수득될 수 있는 반(半)수화, 결정성 재료이다. 형태 B는 대략 16, 18, 22 및 27도 2θ에서 유의미한 피크들을 포함하는 X-선 분말 회절 패턴을 가지고, DSC 곡선으로부터 약 146 및 268℃의 흡열을 가지며, 이는 가열 현미경(hot stage microscopy) 실험들을 통해 규명된 탈수 및 용융이다. 상호전환 연구는 형태 B가 수성 용매 시스템에서 형태 E로 전환되고, 아세톤 및 기타 무수성 시스템에서 기타 형태들로 전환됨을 나타낸다.

3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디히드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 형태 C는, 이들에 한정되는 것은 아니지만 아세톤과 같은 용매들로부터 수득될 수 있는 반(半)용매화 결정성 재료이다. 형태 C는 대략 15.5 및 25도 2θ에서 유의미한 피크들을 포함하는 X-선 분말 회절 패턴을 가지고, 최대 약 269℃의 시차 주사 열계량법 융점을 갖는다. 형태 C는 약 85％ RH 미만에서 흡습성이 아니지만, 보다 높은 상대 습도에서 형태 B로 전환될 수 있다.

3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디히드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 형태 D는 아세토니트릴 및 물의 혼합물로부터 제조된 결정성, 용매화 다형체이다. 형태 D는 대략 27 및 28도 2θ에서 유의미한 피크들을 포함하는 X-선 분말 회절 패턴을 가지고, 최대 약 270℃의 시차 주사 열계량법 융점을 갖는다. 형태 D는 약한- 또는 비-흡습성이지만, 보다 높은 상대 습도에서 강제되는 경우, 보통 형태 B로 전환될 것이다.

3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디히드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 형태 E는 3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디히드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 수중 슬러리화 및 약 9:1 아세톤:물 비율을 갖는 용매 시스템에서의 3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디히드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 느린 증발에 의해 수득될 수 있는 2수화된, 결정성 재료이다. 형태 E는 대략 20, 24.5 및 29도 2θ에서 유의미한 피크들을 포함하는 X-선 분말 회절 패턴을 가지고, 최대 약 269℃의 시차 주사 열계량법 융점을 갖는다. 형태 E는 아세톤 용매 시스템에서 형태 C로 그리고 THF 용매 시스템에서 형태 G로 전화될 수 있다. 수성 용매 시스템들에서, 형태 E가 가장 안정한 형태인 것으로 나타난다. 형태 E에 대해 수행된 탈용매화 실험들은, 약 125℃에서 약 5분 동안 가열시, 형태 E가 형태 B로 전환될 수 있음을 나타낸다. 175℃에서 약 5분 동안 가열시, 형태 B는 형태 F로 전환될 수 있다.

3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디히드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 형태 F는 형태 E의 탈수로부터 수득될 수 있는 비-용매화, 결정성 재료이다. 형태 F는 대략 19, 19.5 및 25도 2θ에서 유의미한 피크들을 포함하는 X-선 분말 회절 패턴을 가지고, 최대 약 269℃의 시차 주사 열계량법 융점을 갖는다.

3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디히드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 형태 G는 이들에 한정되는 것은 아니지만, 테트라히드로푸란(THF)과 같은 용매 중에서 형태 B 및 E를 슬러리화함으로써 수득될 수 있는 비-용매화, 결정성 재료이다. 형태 G는 대략 21, 23 및 24.5도 2θ에서 유의미한 피크들을 포함하는 X-선 분말 회절 패턴을 가지고, 최대 약 267℃의 시차 주사 열계량법 융점을 갖는다.

3-(4-아미노-1-옥소-1,3 디히드로-이소인돌-2-일)-피페리덴-2,6-디온의 형태 H는, 0％ 상대 습도에 형태 E를 노출시킴으로써 수득될 수 있는 부분적으로 수화된(약 0.25 몰) 결정성 재료이다. 형태 H는 대략 15, 26 및 31도 2θ에서 유의미한 피크들을 포함하는 X-선 분말 회절 패턴을 가지고, 최대 약 269℃의 시차 주사 열계량법 융점을 갖는다.

기타 특정 면역조정 화합물들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 1-옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3일)이소인돌린류 및 1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소-3-플루오로피페리딘-3-일)이소인돌린류, 예컨대 이들의 각각이 본원에 참조로써 편입된 U.S. 특허 제5,874,448 및 5,955,476호에 기재된 것들을 포함한다. 대표적 화합물들은 하기 화학식의 화합물이다:

식 중, Y는 산소 또는 H₂이고,

각각의 R¹, R², R³ 및 R⁴는 서로 독립적으로 수소, 할로, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 탄소수 1 내지 4의 알콕시, 또는 아미노이다.

기타 특정 면역조정 화합물들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 본원에 참조로써 편입되는 U.S. 특허 제5,798,368호에 기재된, 테트라 치환된 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-1-옥소이소인돌린류를 포함한다. 대표적 화합물들은 하기 화학식의 화합물이다:

식 중, 각각의 R¹, R², R³ 및 R⁴는 서로 독립적으로 할로, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 또는 탄소수 1 내지 4의 알콕시이다.

기타 특정 면역조정 화합물들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 본원에 참조로써 편입되는 U.S. 특허 제6,403,613호에 개시된 1-옥소 및 1,3-디옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌린류를 포함한다. 대표적 화합물들은 하기 화학식의 화합물이다:

식 중,

Y는 산소 또는 H₂이고,

R¹ 및 R² 중 첫 번째는 할로, 알킬, 알콕시, 알킬아미노, 디알킬아미노, 시아노, 또는 카르바모일이고, R¹ 및 R² 중 두 번째는, 첫 번째의 것과는 독립적으로 수소, 할로, 알킬, 알콕시, 알킬아미노, 디알킬아미노, 시아노, 또는 카르바모일이며,

R³는 수소, 알킬, 또는 벤질이다.

상기 화합물들의 특정 예들은 하기 화학식의 화합물이다:

식 중, R¹ 및 R² 중 첫 번째는 할로, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 탄소수 1 내지 4의 알콕시, 각각의 알킬이 탄소수 1 내지 4인 디알킬아미노, 시아노, 또는 카르바모일이고,

R¹ 및 R² 중 두 번째는, 첫 번째의 것과는 독립적으로 수소, 할로, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 탄소수 1 내지 4의 알콕시, 알킬이 탄소수 1 내지 4인 알킬아미노, 각각의 알킬이 탄소수 1 내지 4인 디알킬아미노, 시아노, 또는 카르바모일이며,

R³는 수소, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 또는 벤질이다. 특정 예들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 1-옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-메틸이소인돌린을 포함한다.

기타 대표적 화합물들은 하기 화학식의 화합물이다:

식 중, R¹ 및 R² 중 첫 번째는 할로, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 탄소수 1 내지 4의 알콕시, 각각의 알킬이 탄소수 1 내지 4인 디알킬아미노, 시아노, 또는 카 르바모일이고,

R¹ 및 R² 중 두 번째는, 첫 번째의 것과는 독립적으로 수소, 할로, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 탄소수 1 내지 4의 알콕시, 알킬이 탄소수 1 내지 4인 알킬아미노, 각각의 알킬이 탄소수 1 내지 4인 디알킬아미노, 시아노, 또는 카르바모일이며,

R³는 수소, 탄소수 1 내지 4의 알킬, 또는 벤질이다.

특정 예들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 1-옥소-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-4-메틸이소인돌린을 포함한다.

기타 특정 면역조정 화합물들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 본원에 참조로써 편입되는 2004년 7월 28일에 제출된 U.S. 특허 제6,380,239호 및 공동계류 U.S. 출원 제10/900,270호에 기술된, 인돌린 고리의 4- 또는 5-위치에서 치환된 1-옥소 및 1,3-디옥소이소인돌린류를 포함한다. 대표적 화합물들은 하기 화학식의 화합물 및 이의 염들이다:

식 중, C* 표시된 탄소 원자는 키랄성의 중심을 구축하고(n이 영이 아니고, R¹이 R²와 동일하지 않은 경우); X¹ 및 X² 중 하나는 아미노, 니트로, 탄소수 1 내지 6의 알킬, 또는 NH-Z이고, X¹ 또는 X² 중 나머지 하나는 수소이고; 각각의 R¹ 및 R² 는 서로 독립적으로 히드록시 또는 NH-Z이고; R³는 수소, 탄소수 1 내지 6의 알킬, 할로, 또는 할로알킬이고; Z는 수소, 아릴, 탄소수 1 내지 6의 알킬, 포르밀, 또는 탄소수 1 내지 6의 아실이고; n은 0, 1 또는 2의 값을 가지며; 단, X¹이 아미노이고, n이 1 또는 2이면, R¹ 및 R² 는 모두 히드록시가 아니다.

추가의 대표적 화합물들은 하기 화학식의 화합물이다:

식 중, n이 영이 아니고 R¹이 R²가 아닌 경우, C* 표시된 탄소 원자는 키랄성의 중심을 구축하고; X¹ 및 X² 중 하나는 아미노, 니트로, 탄소수 1 내지 6의 알킬, 또는 NH-Z이고, X¹ 또는 X² 중 나머지 하나는 수소이고; 각각의 R¹ 및 R²는 서로 독립적으로 히드록시 또는 NH-Z이고; R³는 탄소수 1 내지 6의 알킬, 할로, 또는 수소이고; Z는 수소, 아릴 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬 또는 아실이고; n은 0, 1 또는 2의 값을 갖는다.

특정 예들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 각각 하기 구조들을 갖는 2-(4-아미노-1-옥소-1,3-디히드로-이소인돌-2-일)-4-카르바모일-부티르산 및 4-(4-아미노-1-옥소-1,3-디히드로-이소인돌-2-일)-4-카르바모일-부티르산, 및 이의 약제학적으로 허용가능한 염들, 용매화물들, 전구약물들, 및 입체이성질체들이다:

기타 대표적 화합물들은 하기 화학식의 화합물 및 이의 염들이다:

식 중, n이 영이 아니고 R¹이 R²가 아닌 경우, C* 표시된 탄소 원자는 키랄성의 중심을 구축하고; X¹ 및 X² 중 하나는 아미노, 니트로, 탄소수 1 내지 6의 알킬, 또는 NH-Z이고, X¹ 또는 X² 중 나머지 하나는 수소이고; 각각의 R¹ 및 R²는 서로 독립적으로 히드록시 또는 NH-Z이고; R³은 탄소수 1 내지 6의 알킬, 할로, 또는 수소이고; Z는 수소, 아릴, 또는 탄소수 1 내지 6의 알킬 또는 아실이고; n은 0, 1 또는 2의 값을 갖는다.

특정 예들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 각각 하기 구조들을 갖는 4-카르바모일-4-{4-[(푸란-2-일-메틸)-아미노]-1,3-디옥소-1,3-디히드로-이소인돌-2-일}-부티르산, 4-카르바모일-2-{4-[(푸란-2-일-메틸)-아미노]-1,3-디옥소-1,3-디히드로-이소인돌-2-일}-부티르산, 2-{4-[(푸란-2-일-메틸)-아미노]-1,3-디옥소-1,3-디히드로-이소인돌-2-일}-4-페닐카르바모일-부티르산, 및 2-{4-[(푸란-2-일-메틸)-아미노]-1,3-디옥소-1,3-디히드로-이소인돌-2-일}-펜탄디온산, 및 이들의 약제학적 으로 허용가능한 염들, 용매화물, 전구약물들, 및 입체이성질체들을 포함한다:

기타 상기 화합물들의 특정 예들은 하기 화학식의 화합물이다:

식 중, X¹ 및 X² 중 하나는 니트로, 또는 NH-Z이고, X¹ 또는 X² 중 나머지 하나는 수소이고;

각각의 R¹ 및 R²는 서로 독립적으로 히드록시 또는 NH-Z이고;

R³은 탄소수 1 내지 6의 알킬, 할로, 또는 수소이고;

Z는 수소, 페닐, 탄소수 1 내지 6의 아실,또는 탄소수 1 내지 6의 알킬이고;

n은 0, 1 또는 2의 값을 가지고;

단, X¹ 및 X² 중 하나가 니트로이고, n이 1 또는 2인 경우, R¹ 및 R²는 히드록시 이외의 것이고;

-COR² 및 -(CH₂)_nCOR¹이 상이하면, C* 표시된 탄소 원자는 키랄성의 중심을 구축한다. 기타 대표적 화합물들은 하기 화학식의 화합물이다:

식 중, X¹ 및 X² 중 하나는 탄소수 1 내지 6의 알킬이고;

각각의 R¹ 및 R²는 서로 독립적으로 히드록시 또는 NH-Z이고;

R³은 탄소수 1 내지 6의 알킬, 할로, 또는 수소이고;

Z는 수소, 페닐, 탄소수 1 내지 6의 아실,또는 탄소수 1 내지 6의 알킬이고;

n은 0, 1 또는 2의 값을 가지고;

-COR² 및 -(CH₂)_nCOR¹이 상이하면, C* 표시된 탄소 원자는 키랄성의 중심을 구축한다.

또한 기타 특정 면역조정 화합물들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 본원에 참조로써 편입되는 U.S. 특허 제6,458,810호에 기술된, 2-위치에 2,6-디옥소-3-히드록시피페리딘-5-일로 치환된 이소인돌린-1-온 및 이소인돌린-1,3-디온이다. 대표적 화합물들은 하기 화학식의 화합물이다:

식 중,

C* 표시된 탄소 원자들은 키랄성의 중심들을 구축하고;

X는 -C(O)- 또는 -CH₂-이고;

R¹은 탄소수 1 내지 8의 알킬 또는 -NHR³이고;

R²는 수소, 탄소수 1 내지 8의 알킬, 또는 할로겐이고;

R³은 수소, 비치환되거나 또는 탄소수 1 내지 8의 알콕시, 할로, 아미노, 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬아미노로 치환된 탄소수 1 내지 8의 알킬, 탄소수 3 내지 18의 시클로알킬, 비치환되거나 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬, 탄소수 1 내지 8의 알콕시, 할로, 아미노, 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬아미노로 치환된 페닐, 비치환되거나 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬, 탄소수 1 내지 8의 알콕시, 할로, 아미노, 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬아미노로 치환된 벤질, 또는 -COR⁴이고, 여기서 R⁴는 수소, 비치환되거나 또는 탄소수 1 내지 8의 알콕시, 할로, 아미노, 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬아미노로 치환된 탄소수 1 내지 8의 알킬, 탄소수 3 내지 18의 시클로알킬, 비치환되거나 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬, 탄소수 1 내지 8의 알콕시, 할로, 아미노, 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬아미노로 치환된 페닐, 또는 비치환되거나 또는 탄소수 1 내지 8의 알킬, 탄소수 1 내지 8의 알콕시, 할로, 아미노, 또는 탄소수 1 내지 4의 알킬아미노로 치환된 벤질이다.

본원에 개시된 면역조정 화합물들은 상업적으로 구매가능하거나 본원에 개시된 특허들 또는 특허 공보들에 기재된 방법들에 따라 제조될 수 있다. 또한, 광학적으로 순수한 화합물들은 공지의 분할제들 또는 키랄 칼럼들 및 기타 표준 합성 유기 화학 기술들을 사용하여, 비대칭적으로 합성되거나 분할될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이 특별히 지시되지 않는 한, 용어"약제학적으로 허용가능한 염"은 상기 용어가 지칭하는 화합물의 무독성 산 및 염기 첨가 염들을 포함한다. 허용가능한 무독성 산 첨가 염들은 당업계에 공지된 유기 및 무기 산들 또는 염기들로부터 유도된 것들을 포함하며, 예를 들어, 염화수소산, 브롬화수소산, 인산, 황산, 메탄술폰산, 아세트산, 타르타르산, 락트산, 숙신산, 시트르산, 말산, 말레산, 소르빈산, 아코니틴산, 살리실산, 프탈산, 엠볼산, 에난틴산, 등을 포함한다.

본질상 산성인 화합물들은 다양한 약제학적으로 허용가능한 염기들과 염을 형성할 수 있다. 상기 산성 화합물들의 약제학적으로 허용가능한 염기 첨가 염들의 제조에 사용될 수 있는 염기들은, 무독성 염기 첨가 염들, 즉, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 알칼리 금속 또는 알칼리토금속 염들 및 특히 칼슘, 마그네슘, 나트륨 또는 칼륨 염들과 같은 약리학적으로 허용가능한 양이온들을 함유하는 염들을 형성하는 것들이다. 적합한 유기 염기들은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, N,N-디벤질에틸렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메글루마인(N-메틸글루카민), 라이신, 및 프로카인을 포함한다.

본원에서 사용되며, 특별히 명시되지 않는 한, 용어 "용매화물"은 비-공유 분자간 힘에 의해 결합되는 용매의 화학량적 또는 비-화학량적 양을 추가로 포함하는, 본 발명의 화합물 또는 이의 염을 의미한다. 용매가 물인 경우, 용매화물은 수화물이다.

본원에서 사용되는 바와 같이 특별히 지시되지 않는 한, 용어 "전구약물"은 가수분해, 산화, 또는 그렇지 않으면 생물학적 조건들(시험관 내 또한 생체 내) 하에 반응하여 화합물을 제공할 수 있는, 화합물의 유도체를 의미한다. 전구약물들의 예는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 생(生)-가수분해성 부분들, 예컨대 생체가수분해성 아미드류, 생체가수분해성 에스테르류, 생체가수분해성 카바메이트류, 생체가수분해성 카보네이트류, 생체가수분해성 우레이드류, 및 생체가수분해성 포스페이트 유사체들을 포함하는 본 발명의 면역조정 화합물들의 유도체들이다. 전구약물들의 기타 예들은 -NO, -NO₂, -ONO, 또는 -ONO₂ 부분들을 포함하는 본 발명의 면역조정 화합물들의 유도체들을 포함한다. 전구약물들은, [1 Burger's Medicinal Chemistry and Drug Discovery, 172-178, 949-982 (Manfred E. Wolff ed., 5th ed. 1995)], 및 [Design of Prodrugs (H. Bundgaard ed., Elselvier, New York 1985)]에 기재된 것들과 같은 널리 공지된 방법들을 사용하여 통상 제조될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같이 특별히 지시되지 않는 한, 용어 "생체가수분해성 아미드," "생체가수분해성 에스테르," "생체가수분해성 카바메이트," "생체가수분해성 카보네이트," "생체가수분해성 우레이드," "생체가수분해성 포스페이트"는, 1) 화합물의 생물학적 활성과 간섭하지는 않지만, 상기 화합물에 섭취, 작용 기간, 또는 작용의 개시와 같은, 생체 내에서 유리한 물성들을 부여할 수 있거나; 또는 2) 생물학적으로 불활성이지만,생체 내에서 생물학적으로 활성인 화합물로 전환되는, 화합물의, 개별적인, 아미드, 에스테르, 카바메이트, 카보네이트, 우레이드, 또는 포스페이트를 의미한다. 생체가수분해성 에스테르류의 예는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 저급 알킬 에스테르류, 저급 아실옥시알킬 에스테르류(예컨대 아세톡실메틸, 아세톡시에틸, 아미노카르보닐옥시메틸, 피발로일옥시메틸, 및 피발로일옥시에틸 에스테르류), 락토닐 에스테르류(예컨대 프탈리딜 및 티오프탈리딜 에스테르류), 저급 알콕시아실옥시알킬 에스테르류(예컨대 메톡시카르보닐-옥시메틸, 에톡시카르보닐옥시에틸 및 이소프로폭시카르보닐옥시에틸 에스테르류), 알콕시알킬 에스테르류, 콜린 에스테르류, 및 아실아미노 알킬 에스테르류(예컨대 아세트아미도메틸 에스테르류)를 포함한다. 생체가수분해성 아미드류의 예는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 저급 알킬 아미드류, α-아미노산 아미드류, 알콕시아실 아미드류, 및 알킬아미노알킬카르보닐 아미드류를 포함한다. 생체가수분해성 카바메이트류의 예는, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 저급 알킬아민류, 치환 에틸렌디아민류, 아미노산류, 히드록시알킬아민류, 헤테로시클릭 및 헤테로방향족 아민류, 및 폴리에테르 아민류를 포함한다.

본원에서 사용된, 특별히 명시되지 않는 한, 용어 "입체이성질체"는 모든 거울상이성질체적으로/입체이성질체적으로 순수한 및 거울상이성질체적으로/입체이성질체적으로 풍부한 본 발명의 화합물들을 포괄한다.

본원에서 사용된, 달리 지시되지 않는 한, 용어 "입체이성질체적으로 순수한" 또는 "거울상이성질체적으로 순수한"은 화합물이 한 가지 입체이성질체를 포함하고, 그의 대응 입체이성질체 또는 거울상이성질체를 실질적으로 전혀 함유하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 화합물이 80％, 90％, 또는 95％ 또는 그 이상의 한 가지 입체이성질체 및 20％, 10％, 또는 5％ 또는 그 이하의 대응 입체이성질체를 함유하는 경우, 화합물은 입체이성질체적으로 또는 거울상이성질체적으로 순수이다. 특정 경우들에서, 본 발명의 화합물은, 상기 화합물이 특별한 키랄 중심에 대해 약 80％ ee(거울상이성질체 초과량) 또는 그 이상, 바람직하게는, 90％ ee 또는 그 이상, 더욱 바람직하게는 특별한 키랄 중심에 대해 95％ ee인 경우, 키랄 중심에 대해 광학적으로 활성 또는 입체이성질체적으로/거울상이성질체적으로 순수(즉, 실질적으로 R-형 또는 실질적으로 S-형)인 것으로 간주된다.

본원에서 사용된, 달리 지시되지 않는 한, 용어 "입체이성질체적으로 풍부한" 또는 "거울상이성질체적으로 풍부한"은 본 발명의 화합물의 라세미체 혼합물들 및 기타 입체이성질체들의 혼합물들을 포함한다(예를 들어, R/S=30/70, 35/65, 40/60, 45/55, 55/45, 60/40, 65/35 및 70/30). 본 발명의 다양한 면역조정 화합물들은 하나 이상의 키랄 중심을 가지며, 거울상이성질체들의 라세미체 혼합물들 또는 부분입체이성질체들의 혼합물들로서 존재할 수 있다. 본 발명은 상기 화합물들의 입체이성질체적으로 순수한 형태들의 사용, 및 상기 형태들의 혼합물의 사용을 포함한다. 예를 들어, 동일하거나 상이한 양의 본 발명의 특별한 면역조정 화합물들의 거울상이성질체들을 포함하는 혼합물들이 본 발명의 방법들 및 조성물들 에 사용될 수 있다. 이들 이성체들은 키랄 칼럼들 또는 키랄 분할제들과 같은 표준 기술들을 사용하여 비대칭적으로 합성되거나 분할될 수 있다. 예를 들어, [Jacques, J., et al, Enantiomers , Racemates and Resolutions (Wiley-Interscience, New York, 1981)]; [Wilen, S. H., et al, Tetrahedron 33:2725 (1977)]; [Eliel, E. L., Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962)]; 및 [Wilen, S. H., Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN, 1972)] 참조하라.

만약 묘사된 구조 및 그 구조에 주어진 명칭 사이에 불일치가 존재하는 경우, 묘사된 구조에 더욱 비중을 둔다는 점을 주목해야 한다. 또한, 구조의 입체화학 또는 구조의 일부분이, 예를 들어, 굵은 또는 점선들로 표시되지 않는 경우, 구조 또는 구조의 일부분은 그의 모든 입체이성질체들을 포함하는 것으로서 해석되어야 한다.

콜라겐 바이오패브릭을 코팅 또는 함침하는 생체활성 화합물의 양은 가변적일 수 있고, 바람직하게는 전달되는 특별한 생체활성 화합물 및 소망되는 효과에 의존할 것이다. 예를 들어, 상기 생체활성 화합물이 항염증제인 경우, 콜라겐 바이오패브릭 상에 또는 이에 함유되는 항-염증제의 양은 고막, 및/또는 고막 주위부에 있어, 1종 이상의 증상들 또는 염증의 표지를 측정가능한 정도로 감소시키기에 충분한 양이다.

다양한 구현예들에서, 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭은, 적어도 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 100, 1250, 1500, 2000, 2500, 300, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000 또는 적어도 1000000 나노그램의 생체활성 화합물로 코팅되거나 함침될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭은, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 100, 1250, 1500, 2000, 2500, 300, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000, 100000, 200000, 300000, 400000, 500000, 600000, 700000, 800000, 900000 또는 적어도 1000000 이하 나노그램의 생체활성 화합물로 코팅되거나 함침될 수 있다.

4.2.3 콜라겐 바이오패브릭의 입체구조

콜라겐 바이오패브릭은 본 발명의 방법들에 있어 그들의 사용을 용이하게 하는 임의의 모양 또는 입체구조로 형성될 수 있다. 예를 들어, 상기 콜라겐 바이오패브릭은, 특히 고실성형술 또는 고막성형술의 맥락에서, 고막 천공의 폐쇄를 용이 하게 할 임의의 모양 또는 입체구조로 형성될 수 있다. 예를 들어, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 이비인후과 의사, 또는 기타의 최종 사용자들이, 특별한 고막의 복원을 위해 적절하게 측정된 조각을 사용하거나 절단해낼 수 있도록, 다양한 크기들로 제공될 수 있다. 상기 콜라겐 바이오패브릭은, 예를 들어, 정사각형, 직사각형, 원형 또는 타원 모양 조각들로 제공될 수 있거나, 고막의 모양에 일반적으로 합치하도록 절단될 수 있다. 상기 방법의 다양한 구현예들에서, 고막의 복원에 사용되는 콜라겐 바이오패브릭 조각들은 대략 1×1㎝, 1.5×1.5㎝, 2×2㎝, 2.5×2.5㎝, 3×3㎝, 3.5×3.5㎝, 4×4㎝, 4.5×4.5㎝, 5×5㎝, 1×1.5㎝, 1×2㎝, 1×2.5㎝, 1×3㎝, 1×3.5㎝, 1×4㎝, 1×4.5㎝, 1×5㎝, 1.5×2㎝, 1.5×2.5㎝, 1.5×3㎝, 1.5×3.5㎝, 1.5×4㎝, 1.5×4.5㎝, 2×2.5㎝, 2×3㎝, 2×3.5㎝, 2×4㎝, 2×4.5㎝, 2×5㎝, 2.5×3㎝, 2.5×3.5㎝, 2.5×4㎝, 2.5×4.5㎝, 2.5×5㎝, 3×3.5㎝, 3×4㎝, 3×4.5㎝, 3×5㎝, 3.5×4㎝, 3.5×4.5㎝, 3.5×5㎝, 4×4.5㎝, 4×5㎝, 또는 4.5×5㎝ 크기로 측정되는 조각들로서 제공될 수 있거나, 1×1㎝, 1.5×1.5㎝, 2×2㎝, 2.5×2.5㎝, 3×3㎝, 3.5×3.5㎝, 4×4㎝, 4.5×4.5㎝, 5×5㎝, 1×1.5㎝, 1×2㎝, 1×2.5㎝, 1×3㎝, 1×3.5㎝, 1×4㎝, 1×4.5㎝, 1×5㎝, 1.5×2㎝, 1.5×2.5㎝, 1.5×3㎝, 1.5×3.5㎝, 1.5×4㎝, 1.5×4.5㎝, 2×2.5㎝, 2×3㎝, 2×3.5㎝, 2×4㎝, 2×4.5㎝, 2×5㎝, 2.5×3㎝, 2.5×3.5㎝, 2.5×4㎝, 2.5×4.5㎝, 2.5×5㎝, 3×3.5㎝, 3×4㎝, 3×4.5㎝, 3×5㎝, 3.5×4㎝, 3.5×4.5㎝, 3.5×5㎝, 4×4.5㎝, 4×5㎝, 또는 4.5×5㎝보다 작지 않거나 크지 않을 수 있지만, 상기 바이오패브릭은 다른 치수들로도 절단될 수 있다. 2×2㎝, 3×3㎝, 3×2㎝, 1 ×2㎝, 1×1㎝ 또는 4×4㎝인 콜라겐 바이오패브릭의 조각들이 특히 바람직하다. 추가로, 상기 바이오패브릭은 최종 사용자가 그로부터 2 이상의 조각들을 절단해낼 수 있는 시트로서 제공될 수 있거나, 롤(roll) 또는 스트립(strip)으로서 제공될 수 있다.

본 발명의 치료 방법에 유용한 콜라겐 바이오패브릭은 건조 상태로, 또는 적합한 생리적으로-적합성인, 의학적으로-유용한 액체, 예컨대 생리 식염수에 미리 적셔진 상태로, 최종 사용자에게 제공될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 용액은 상기 단락 4.2.2에 기재된 1종 이상의 생체활성 화합물들을 제한 없이 포함한다. 바람직하게는, 상기 생체활성 화합물은, 콜라겐 바이오패브릭이 고막과 접촉하는 시간 동안, 일부 지점에서 대다수의 생체활성 화합물이 고막과 접촉하도록, 콜라겐 바이오패브릭 상에 또는 내부에 배치된다.

4.2.4 콜라겐 바이오패브릭의 제조 방법

양막으로부터 제조된 콜라겐 바이오패브릭은 막의 구성성분들-주로 콜라겐, 엘라스틴, 라미닌, 및 피브로넥틴의 생화학적 및 구조적 특성들을 보존하는 임의의 수단들에 의해 제조될 수 있다. 바람직한 재료는, 그의 전문이 본원에 편입되는, 하리리에 의한 미합중국 출원 공보 제U.S. 2004/0048796 A1호 "콜라겐 바이오패브릭 및 이의 제조 방법 및 용도{Collagen Biofabric and Methods of Preparation and Use Therefor}"에 기술되고 상기에 개시된 방법들에 따라 제조되는 콜라겐 바이오패브릭이다.

바람직하게는, 고막의 복원에 사용되는 콜라겐 바이오패브릭은, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 인간이 아닌 포유 동물의 양막으로부터 제조될 수도 있지만, 인간 대상체들에의 사용을 위해 사람 태반으로부터 유래한다. 콜라겐 바이오패브릭이 인간이 아닌 동물의 고막의 치료에 사용되는 경우, 사용되는 콜라겐 바이오패브릭은 상기 동물의 종들로부터의 태반에서 유도되는 것이 바람직하다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법들에 사용되는 태반은 신생아의 분만 후 가능한 한 즉시 취해지는 것이 바람직하다. 상기 태반은 즉시 사용될 수 있거나, 임의의 추가적 처리 전에 분만시로부터 2-5일 동안 저장될 수 있다. 태반은 전형적으로 방혈되며, 즉 출산 후 잔류하는 탯줄 혈을 유출시킨다. 바람직하게는, 임신부는 당업자들에게 공지된 표준 기술들을 사용하여, 이들에 제한되는 것은 아니지만, HIV, HBV, HCV, HTLV, 매독, CMV, 및 태반 조직을 오염시키는 것으로 알려진 기타 바이러스성 병원체들을 포함하는 전염병들에 대해, 출산 전에 스크리닝된다.

본 발명의 콜라겐 바이오패브릭 제조의 한 예시적 방법은 하기 단계들을 포함한다:

단계 Ⅰ. 탯줄을 태반 원반으로부터 분리하고; 선택적으로, 양막을 융모막으로부터 분리한다. 바람직한 구현예에서, 상기 양막은, 태반 막을 절단하기 전에 융모막으로부터 분리된다. 융모막 및 태반 원반으로부터의 양막의 분리 후, 탯줄 잘린끝(stump)을, 예를 들어, 가위를 사용하여 절단하고, 태반 원반으로부터 떼어낸다. 상기 양막은 이어서 멸균의, 바람직하게는 완충된, 생리 식염수, 예컨대 0.9％ 멸균 NaCl 용액에 저장될 수 있다. 바람직하게는, 상기 양막은 적어도 2℃ 의 온도에서, 냉장 저장된다.

단계 II. 상기 양막은 실질적으로 탈세포화되고; 즉, 실질적으로 모든 세포 물질 및 세포 조직파편 (예를 들어, 모든 가시적 세포 물질 및 세포 조직파편)이 제거된다. 당업자에게 알려진 임의의 탈세포화 처리과정이 사용될 수 있지만, 일반적으로 본 발명의 양막을 탈세포화하는데 사용되는 처리과정은 바이오패브릭을 구성하는 단백질류의 본질적 입체구조를 붕괴하지 않는다. 양막의 "실질적인 탈세포화"는 바람직하게는 적어도 90％의 세포들을 제거하고, 더욱 바람직하게는 적어도 95％의 세포들을 제거하고, 가장 바람직하게는 적어도 99％의 세포들(예를 들어, 섬유모세포들, 양막세포(amniocyte)들 및 융모막세포(chorionocyte)들)을 제거한다. 본 발명의 방법들에 따라 탈세포화된 양막들은 건조 상태에서 약 2 내지 약 150㎛의 두께에서 변화하며 균일하게 얇고, 평활하며(촉감에 의해 결정됨), 반투명이다. 탈세포화는, 멸균 용액을 사용한 헹굼과 조합하여, 예를 들어, 멸균 세포 스크래퍼(scraper)를 사용한 물리적 스크래핑을 포함할 수 있다. 이용되는 탈세포화 기술은 바람직하게는 양막의 해부학의 총체적 붕괴를 초래하거나 양막의 생물역학적 물성들을 변경시키지 않는다. 바람직하게는, 양막의 탈세포화는 세제-함유 용액, 예컨대 비이온성 세제들, 트리톤(Triton) X-100, 음이온성 세제들, 나트륨 도데실 술페이트의 사용을 포함하고, 임의의 순한 음이온성 세제, 즉, 6 내지 8의 pH를 갖는 저-발포성 비-부식성 세제가 상기 양막을 탈세포화하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 0.01-10％ 데옥시콜린산 나트륨 염 일수화물이 양막의 탈세포화에 사용된다. 효소 용액, 예컨대 트립신-함유 완충액을 사용한 탈세포화가 또 한 사용될 수 있다.

바이오패브릭의 제조에 있어 프로테아제 활성을 제한하는 것이 매우 바람직하다. 금속 이온 킬레이터들, 예를 들어 1,10-페난트롤린 및 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)과 같은 용해, 헹굼 및 저장 용액들에 대한 첨가제들은, 다수의 단백분해성 효소들에 불리한 환경을 창출한다. 콜라겐분해효소와 같은 프로테아제에 준-최적(sub-optimal) 조건들을 제공함으로써, 콜라겐과 같은 양막 구성성분들을 세포 용해 단계 동안의 분해로부터 보호하는 것을 돕는다. 프로테아제에 대한 준-최적 조건은 용액 내에 존재하는 칼슘 및 아연 이온들의 양을 제거 또는 제한하는 저삼투압 용해 용액을 제형함으로써 달성될 수 있다. 다수의 프로테아제들은 칼슘 및 아연 이온들의 존재 하에 활성이며 칼슘 및 아연 이온이 없는 환경에서는 그들의 활성의 상당부분을 잃는다. 바람직하게는, 저삼투압 용해 용액은, 상기 용액이 역의 단백분해성 분해로부터 그 밑에 존재하는 양막을 보호하면서 천연 세포들을 최적으로 용해하도록, pH의 조건, 칼슘 및 아연 이온들의 감소된 존재가능성, 금속 이온 킬레이터들의 존재 및 콜라겐분해효소에 특이적인 단백분해성 억제제들의 사용을 선택함으로써 제조될 것이다. 예를 들어, 저삼투압 용해 용액은, pH 5.5 내지 8, 바람직하게는 pH 7 내지 8이고, 칼슘 및 아연 이온들이 존재하지 않으며, EDTA와 같은 금속 이온 킬레이터를 포함하는 물의 완충된 용액을 포함할 수 있다. 부가적으로, 저삼투압 용해 용액으로 양막을 처리하는 동안 온도 및 시간 파라미터들의 제어는 또한 프로테아제의 활성을 제한하기 위해 이용될 수 있다.

양막의 탈세포화 처리는 또한 새로운 면역 부위들의 생성을 제한하는 것이 바람직하다. 콜라겐의 효소적 분해는 상승된 면역원성을 초래하는 것으로 여겨지기 때문에, 본 발명은, 양막의 조성물들의 단백분해를 최소화하여 그 밑에 존재하는 양막의 구조를 보존하는, 세포 대사, 단백질 생산 및 세포 분할을 억제하는데 효과적인, 효소들, 예를 들어, 뉴클레아제들로 양막을 처리하는 것을 포함한다. 본 발명의 방법들에 따라 사용될 수 있는 뉴클레아제들의 예는 엑소뉴클레아제들 및 엔도뉴클레아제 모두를 포함하는 천연 세포 DNA 및 RNA의 소화에 효과적인 것들이다. 본 발명의 방법들에 따라 사용될 수 있는 뉴클레아제의 비-제한적인 예는 세포 활성을 억제하는 엑소뉴클레아제들, 예를 들어, DNase I(시그마 케미칼 컴퍼니, 세인트 루이스, 미주리(SIGMA Chemical Company, St. Louis, Mo.)) 및 RNase A(시그마 케미칼 컴퍼니, 세인트 루이스, 미주리) 및 세포 활성을 억제하는 엔도뉴클레아제들, 예를 들어, EcoRI(시그마 케미칼 컴퍼니, 세인트 루이스, 미주리) 및 HindIll(시그마 케미칼 컴퍼니, 세인트 루이스, 미주리)를 포함한다. 선택된 뉴클레아제들은 뉴클레아제의 활성에 최적인 이온들, 예를 들어, 마그네슘, 칼슘을 함유하는 생리적 완충 용액에 적용되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 완충된 용액의 이온 농도, 처리 온도 및 처리의 길이는 소망하는 수준의 뉴클레아제 활성을 보장하는 통상적 실험에 의해 당업자들에 의해 선택된다. 완충액은 세포 내부에 대한 뉴클레아제들의 접근을 촉진하도록 저삼투압인 것이 바람직하다.

단계 I 및 II의 또 다른 구현예에서, 초기 처리 후 식염수에서 상기 태반을 짧게 헹구어, 태반 표면으로부터의 혈액을 제거한다. 이어서, 태반 원반을 약 0.1％ 내지 약 10％, 그리고, 특정 구현예에서, 약 0.1％ 내지 약 2.0％의 농도의 차 가운 데옥시콜린산 용액에 침지시킨다. 이어서 상기 태반을 약 1℃ 내지 약 8℃ 사이에서, 약 5일 내지 약 6개월 동안 항온처리한다. 특정 구현예들에서, 상기 태반 원반은, 예를 들어, 약 5 내지 약 15일; 약 5 내지 약 30일, 약 5 내지 약 60일 동안, 또는 약 1년 동안까지 침지된다. 전형적으로, 상기 데옥시콜린산 용액은 항온처리 동안 매 2일 내지 5일 마다 교체된다. 또 다른 특정 구현예에서, 상기 태반 원반은 0℃ 내지 약 8℃의 온도에서 약 5일 내지 약 15일 동안 약 1％ 농도의 데옥시콜린산 용액에 침지된다. 상기 항온처리는 두 가지 목적들을 수행한다. 첫째로, 이는 태반 재료 및 혈액에 대해 혈청학적 검사들이 수행되는 시간을 허용하여, 혈청학적 기준에 부합되지 못하는 태반들을 추가로 처리하지 않도록 한다. 둘째로, 보다 장기의 항온처리는 상피 세포 및 섬유모세포의 제거를 개선하여, 물리적 스크래핑에 의한 양막체의 탈세포화에 소모되는 시간의 양을 현저히 감소시킨다. 전형적으로, 상기 스크래핑 시간은, 예를 들어, 약 40분 내지 약 20분에서 감소된다. 상기 양막은 이어서 하기된 바와 같이 건조된다.

단계 I 및 II의 한 구현예에서, 따라서, 상기된 바와 같이 상기 양막은 융모막체로부터 분리되고, 상기 양막체는 짧게 헹굼처리된다. 상기 양막체는 이어서 10일 동안 4℃의 1％ 데옥시콜린산에서 항온처리되고, 항온처리 5일째 데옥시콜린산 용액을 교체한다. 혈청학적 검사 결과들이 평가되어, 상기 양막체는 결과에 대한 부분으로 허용되거나 거절된다. 일단 항온처리가 완결되면, 상기 양막체에 여전히 붙어있는 상피 세포들 및 섬유모세포들을 스크래핑으로 제거한다. 하기된 바와 같이 양막체를 헹굼처리하고, 이어서 건조한다.

단계 III. 탈세포화 후, 세제 및, 사용되는 경우, 탈세포화에 사용되는 효소들의 제거를 보장하기 위해 상기 양막을 세척한다. 상기 처리과정은 또한 세포 조직파편을 포함할 수 있는 세포 조직파편을 제거한다. 상기 세척 용액은 탈이온수 또는 수성 저삼투압 완충액일 수 있다. 바람직하게는, 탈세포화를 돕기 위해, 상기 양막은 예를 들어 흔들리는 플랫폼(platform)상의 세제 내에서 서서히 15-120분 동안 교반된다. 상기 양막은, 세제 탈세포화 후, 다시 상기된 바와 같이 물리적으로 탈세포화될 수 있고; 양막의 온전성이 유지되는 한, 어떠한 가시적 세포 물질 및 세포 조직파편도 남아있지 않을 때까지 물리적 및 세제 탈세포화 단계들이 필요에 따라 반복될 수 있다.

특정 구현예들에서, 상기 양막은 탈세포화 및 세척 단계 후 즉시(즉, 30분 이내로) 건조된다. 대안적으로, 추가적 처리가 즉시 실행되지 않는 경우, 상기 양막은 냉장, 예를 들어, 약 1℃ 내지 약 20℃, 바람직하게는 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서, 건조 전 28일 동안까지 저장될 수 있다. 상기 탈세포화된 양막이 3일 초과 28일 미만 동안 저장되는 경우, 양막을 덮는 멸균 용액은 주기적으로, 예를 들어 매 1일 내지 3일 마다 교환되는 것이 바람직하다.

특정 구현예들에서, 상기 양막이 세척 후 냉장되지 않는 경우, 제조 단계 Ⅳ로 진행하기 전에 상기 양막을 적어도 3회 세척한다. 기타 구현예에서, 상기 양막이 냉장되고 상기 멸균 용액이 1회 교체되었을 때, 제조 단계 Ⅳ로 진행하기 전에 상기 양막을 적어도 2회 세척한다. 또한 기타의 구현예들에서, 상기 양막이 냉장되고 상기 멸균 용액이 2회 이상 교체되었을 때, 제조 단계 Ⅳ로 진행하기 전에 상 기 양막을 적어도 1회 세척한다.

단계 Ⅳ로 진행 전에, 모든 검사들이 음성임을 확실히 하도록, 모든 세균학적 및 혈청학적 검사가 평가되는 것이 바람직하다.

단계 Ⅳ. 콜라겐 바이오패브릭 제조 방법의 본 구현예에 있어 최종 단계는 본 발명의 탈세포화된 양막을 건조하여 콜라겐 바이오패브릭을 제조하는 것을 포함한다. 콜라겐의 편평한 건조 시트를 생산하는 임의의 양막 건조 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 양막은 진공 건조된다.

특정 구현예에서, 본 발명의 탈세포화된 양막 건조의 예시적인 방법은 하기 단계들을 포함한다:

건조를 위한 탈세포화된 양막의 어셈블리. 탈세포화된 양막을 멸균 용액으로부터 제거하고, 과량의 유체를 서서히 짜낸다. 이어서, 탈세포화된 양막을, 태아 측이 아래쪽 위치를 향하도록 하여, 예를 들어 트레이 상에서, 편평할 때까지 서서히 스트레칭한다. 이어서, 탈세포화된 양막을 태아 측이 위쪽을 향하도록 뒤집어서, 건조 프레임, 바람직하게는 플라스틱 메쉬 건조 프레임(예를 들어, 퀵 카운트(Quick Count)^® 플라스틱 캔버스, 유니엑, 인코퍼레이티드, 와나키, 위스콘신(Plastic Canvas, Uniek, Inc., Waunakee, WI))에 위치시킨다. 기타 구현예들에서, 상기 건조 프레임은 이에 한정되는 것은 아니지만 스테인레스 스틸 메쉬를 포함하는 임의의 고압증기멸균가능한(autoclavable) 재료일 수 있다. 가장 바람직한 구현예에서, 약 0.5㎝의 양막이 건조 프레임의 가장자리와 중첩된다. 특정 구현예 들에서, 건조 프레임을 지나 연장하는 중첩 양막은, 예를 들어 클램프(clamp) 또는 지혈기를 사용하여, 프레임의 상부에 대해 감싸진다. 일단 양막이 건조 프레임 상에 위치되면, 멸균 거즈(gauze)를 열 건조기(또는 겔-건조기)(예를 들어, 모델명 583, 바이오-라드 라보래토리즈(Bio-Rad Laboratories), 200 알프레드 노벨 드라이드(Alfred Nobel Drive), 허큘리스(Hercules), CA 94547)의 건조 플랫폼에 위치시켜, 플라스틱 메쉬 건조 프레임 상에 놓인 양막보다 약간 더 넓은 부위가 커버되도록 한다. 바람직하게는, 거즈 층의 총 두께는 한번 접힌 4×4 거즈의 두께를 초과하지 않는다. 시트형 재료를 건조하는데 적합한 임의의 열 건조 기기가 사용될 수 있다. 바람직하게는 0.1 - 1.0㎝, 더욱 바람직하게는 0.5-1.0㎝ 사이에서 플라스틱 프레임의 가장자리가 거즈 가장자리를 지나 연장하도록, 건조 플랫폼 상의 거즈의 상부에 건조 프레임을 위치시킨다. 가장 바람직한 구현예에서, 양막을 갖는 상기 건조 프레임은 양막의 태아 측이 위쪽을 향하도록 멸균 거즈의 위에 배치된다. 일부 구현예들에서, 또 다른 플라스틱 프레임 메쉬를 양막의 위에 위치시킨다. 메쉬 프레임 및 그 안에 건조된 막의 도면을 도 4에 나타낸다. 또 다른 구현예들에서, 얇은 플라스틱의 시트(예를 들어, SW 182, 투명 PVC, 에이이피 인더스트리즈 인코퍼레이티드(AEP Industries Inc.), South Hackensack, NJ 07606) 또는 생체적합성 실리콘이 상기 시트가 모든 가장자리들을 여유있게 지나 연장하도록, 막으로 덮인 메쉬의 위에 배치된다. 상기 구현예에서, 제 2의 메쉬 프레임은 필요하지 않다.

한 대안적 구현예에서, 선택적으로, 1종의 타이벡(Tyvek)^®의 시트를 막의 상부에 가지면서(플라스틱 필름의 배치 전에), 상기 양막을 타이벡^® 재료의 1종 이상의 멸균 시트들(예를 들어, 의료적 포장용의 타이벡^®의 시트, 듀퐁(Dupont) 타이벡^®, P.O. Box 80705, 윌밍턴(Wilmington), DE 19880-0705)에 배치한다. 본 대안적인 처리과정은, 예를 들어, 세포들의 팽창에 대한 매트릭스로서의 사용과 같은 특정 적용들에 대해 유리할 수 있는, 바이오패브릭의 더욱 평활한 모형(즉, 재료의 축을 따라 또는 이와 수직으로 차별적인 섬유 압축 영역들의 패턴 없이)을 제공할 것이다,

양막의 건조. 한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 양막의 진공 하에서의 열 건조를 포함한다. 상기 진공 건조는 약 0℃ 내지 약 60℃의 임의의 온도에서 수행될 수 있지만, 상기 양막은 바람직하게는 약 35℃ 내지 약 50℃사이에서, 가장 바람직하게는 약 50℃에서 건조된다. 콜라겐의 일부 분해는 50℃ 초과의 온도에서 예기된다는 점을 숙지해야 한다. 건조 온도는 연장된 탐침을 갖는 눈금 디지털 온도계를 사용하여 설정 및 확인되는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 진공압을 약 -22 인치의 Hg로 설정한다. 예를 들어 수분 측정기로 측정시, 양막의 콜라겐 매트릭스가 3-12％ 미만의 수분을 함유할 때까지 건조 단계를 계속한다. 이의 수행을 위해, 상기 양막은 예를 들어, 대략 60분 동안 열-진공 건조되어, 탈수된 양막이 달성될 수 있다. 일부 구현예들에서, 상기 양막을 약 30분 내지 2 시간, 바람직하 게는 약 60분 동안 건조한다. 작용의 어떠한 이론 또는 메카니즘에 얽매이고자 하는 것은 아니지만, 진공압과 병합된 저열 설정은 콜라겐의 변성 없이 탈수 상태를 달성하는 것을 가능케 하는 것으로 여겨진다.

본 발명에 따른 건조 처리과정의 완수 후, 상기 양막을 진공 펌프를 실행시키면서 대략 2분 동안 식힌다.

양막의 포장 및 저장. 일단 양막이 건조되면, 상기 막을 건조 프레임으로부터 서서히 들어올린다. 막의 "들어올림"은 하기 단계들을 포함할 수 있다: 펌프가 여전히 실행되는 동안, 양막을 아래로 잡아주면서 상기 플라스틱 필름을 모서리에서 시작하여 양막으로부터 서서히 제거하는 단계; 양막을 갖는 프레임을 건조 플랫폼에서 들어올려 양막 측이 위쪽을 향하도록 하여 절단대 상에 배치하는 단계; 프레임의 가장자리로부터 1-2㎜를 가장자리를 따라 절단하는 절개가 이루어지는 단계; 및 이어서 양막을 프레임으로부터 벗겨내는 단계. 바람직하게는, 상기 단계에서 멸균 장갑을 착용하고 양막을 취급한다.

상기 양막을 멸균 용기, 예를 들어, 필 파우치에 위치시키고, 밀봉한다. 본 발명의 방법에 따라 제조되는 바이오패브릭은 상기된 시간의 연장된 기간 동안 실온에서 저장될 수 있다. 대안적인 구현예들에서, 본 발명은, 융모막, 또는 융모막 및 양막 모두를 포함하는 콜라겐 바이오패브릭 제조 방법을 제공한다. 상기된 방법들은 융모막, 또는 융모막 및 양막 모두를 포함하는 바이오패브릭의 제조 방법에 적용가능하다. 한 구현예에서, 본 발명은 양막 및 융모막을 포함하는 태반을 제공하고; 양막을 융모막으로부터 분리하고; 융모막을 탈세포화함으로써 제조된 콜라겐 바이오패브릭의 사용을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 탈세포화된 융모막을 세척 및 건조하는 것을 추가로 수반한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 양막 및 융모막을 포함하는 태반을 제공하고; 양막 및 융모막을 탈세포화함으로써 제조된 콜라겐 바이오패브릭의 사용을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 탈세포화된 양막 및 융모막을 세척 및 건조하는 것을 추가로 수반한다.

4.2.5 콜라겐 바이오패브릭의 저장 및 취급

탈수된 콜라겐 바이오패브릭은, 사용 전에 실온에서(예를 들어, 25℃), 예를 들어, 탈수된 시트들로서 저장될 수 있다. 특정 구현예들에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 적어도 10℃, 적어도 15℃, 적어도 20℃, 적어도 25℃, 또는 적어도 29℃의 온도에서 저장될 수 있다. 바람직하게는, 탈수된 형태의 콜라겐 바이오패브릭은 냉장되지 않는다. 일부 구현예들에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 약 2℃ 내지 약 8℃의 온도에서 냉장될 수 있다. 본 발명의 방법들에 따라 제조된 바이오패브릭은, 콜라겐 바이오패브릭의 생화학적 또는 생물물리학적 물성들의 임의의 변경 없이, 생화학적 또는 구조적 온전성의 어떠한 변경도 가지지 않으면서(예를 들어, 분해가 일어나지 않음), 임의의 규정된 온도들에서, 12개월 이상 동안 저장될 수 있다. 상기 바이오패브릭은, 콜라겐 바이오패브릭의 생화학적 또는 생물물리학적 물성들의 임의의 변경 없이, 생화학적 또는 구조적 온전성의 어떠한 변경도 가지지 않으면서(예를 들어, 분해가 일어나지 않음), 수년 동안 저장될 수 있다. 상기 바이오패브릭은 장기적 저장에 적합한 임의의 용기에 저장될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭은 멸균 이중 필 파우치 패키지에 저장된 다.

상기 콜라겐 바이오패브릭은 사용 전에 수화될 수 있다. 상기 콜라겐 바이오패브릭은, 예를 들어, 멸균의 생리적 완충액을 사용하여 재수화될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 멸균의 생리 식염수는 0.9％ NaCl 용액이다. 일부 구현예들에서, 상기 멸균 생리 식염수는 완충된다. 특정 구현예들에서, 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭의 수화는 적어도 2분, 적어도 5분, 적어도 10분, 적어도 15분, 또는 적어도 20분을 필요로 한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭의 수화는 5분 이내로 완결된다. 또한 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭의 수화는 10분 이내로 완결된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 콜라겐 바이오패브릭의 수화는 10분이 넘게 걸리지 않는다. 일단 수화되면, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 예를 들어, 매 3일 마다 용액을 교환하면서, 용액에서, 예를 들어, 멸균 0.9％ NaCl 용액에서, 6개월까지 동안 유지될 수 있다.

4.2.6 멸균화

바이오패브릭의 멸균화는 임의의 의학적으로-적절한 수단들, 바람직하게는 양막 단백질류의 삼차 및 사차 구조를 유의미하게 변경하지 않는 수단들에 의해 달성될 수 있다. 멸균화는, 예를 들어, 가스, 예를 들어, 에틸렌 디옥시드를 사용하여 달성될 수 있다. 멸균화는 방사선, 예를 들어, 감마 방사선을 사용하여 달성될 수 있고, 바람직하게는 당업자에게 공지된 방법들, 예를 들어, [Gorham, D. Byrom(ed.), 1991, Biomaterials, Stockton Press, New York, 55-122]을 사용하여 전자 빔(beam) 조사에 의해 수행된다. 적어도 99.9％의 세균 또는 기타의 잠재적 으로 오염성인 유기체들을 박멸하기에 충분한 임의의 분량의 방사선이 본 발명의 범주 내에 속한다. 바람직한 구현예에서, 적어도 18-25kGy의 분량이 바이오패브릭의 최종적 멸균화를 달성하는데 사용된다.

4.2.7 적층체들

상기 콜라겐 바이오패브릭은 치유 과정 동안(전형적으로 약 3개월) 보다 큰 강직도 및 내구성을 제공하도록 적층될 수 있다. 상기 콜라겐 바이오패브릭은 하기와 같이 적층될 수 있다.

콜라겐 바이오패브릭은, 2 이상의 층의 콜라겐 바이오패브릭을 하나를 다른 하나의 위에 쌓고, 밀봉 또는 건조함으로써 보통 적층된다. 상기 콜라겐 바이오패브릭은 건조 적층 되거나 또는 재수화 후 적층될 수 있다. 대안적으로, 예를 들어, 양막의 2 이상의 층들이, 예를 들어, 세포 스크래핑 단계(하기 실시예 참조)를 통한 세포 제거 후 초기 건조 전에 적층될 수 있다. 초기 건조 전에 적층된다면, 2 이상의 콜라겐 바이오패브릭 층들은 하나가 다른 하나의 위에 쌓이고, 이어서 예를 들어, 냉동-건조 과정을 사용함으로써 또는 진공을 사용하거나 사용하지 않으면서 중간 열 하에 건조함으로써 건조된다. 적용되는 열은 콜라겐 바이오패브릭의 단백질 구성성분들, 특히 콜라겐의 쇠퇴 또는 해체를 초래할 정도로 강하지 않은 것이 바람직하다. 전형적으로, 적용되는 열은 약 70℃ 이하, 바람직하게는 약 60℃ 이하, 그리고, 더욱 바람직하게는, 대략 50℃이다. 적층 시간은, 예를 들어, 적층되는 층들의 수에 따라 가변적이지만, 고막 복원에 사용되는 콜라겐 바이오패브릭의 크기 조각들에 대해 50℃에서 보통 1-2 시간 걸린다. 바람직하게는, 상기 콜라겐 바이오패브릭 적층체는 2-6 층들의 콜라겐 바이오패브릭을 포함한다. 한 바람직한 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭 적층체는 2개의 층들을 가지며 대략 50 마이크로미터의 두께이다. 또 다른 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭 적층체는 2개의 층들을 가지며, 약 20-60㎛의 두께를 갖는다. 바람직하게는, 각각의 층들은 동일한 콜라겐 바이오패브릭 로트(lot), 즉, 동일한 태반으로부터의 것이다.

상기 콜라겐 바이오패브릭은 또한, 예를 들어 2 이상의 층들의 콜라겐 바이오패브릭 또는 양막 사이에 적용되는 접착제를 사용하여 적층될 수도 있다. 그러한 접착제는 바람직하게는 의학적 적용들에 적합하고, 예를 들어, 천연의 생물학적 접착제, 예를 들어 피브린 글루, 합성 접착제, 또는 이들의 조합물들을 포함할 수 있다. 상기 접착제는 적층 과정 동안 전구체들로부터 추가적 화학적 전환될 수도 있다.

4.2.8 줄기 세포들

본원에 기술된, 고막 복원 방법들, 및 상기 치료 방법들에 사용되는 콜라겐 바이오패브릭은 또한 줄기 또는 전구 세포들을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 치료 방법은 고막 재성장을 장려하는 줄기 또는 전구 세포들의 사용을 포함한다. 바람직하게는, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 중간엽 또는 중간엽-형 줄기 세포들, 예를 들어, U.S. 특허 제5,486,359, 6,261,549 및 6,387,367호에 기술된 것들, 또는 태반-유도된 줄기 세포들, 예컨대 U.S. 출원 공보 제2002/0123141, 2003/0032179 및 2003/0180269호에 기술된 것들을 포함한다. 하지만, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 임의의 조직원(tissue source)으로부터의 줄기 또는 전구 세포들, 바람직하게는 포유류의 줄기 또는 전구 세포들을 포함할 수 있다. 콜라겐 바이오패브릭은 태아의 줄기 세포들 또는 태아의 생식 세포들을 포함할 수 있다.

콜라겐 바이오패브릭 및 줄기 또는 전구 세포들의 조합은 콜라겐 바이오패브릭을 고막에 적용하기 전에 또는 적용하는 동안 수행될 수 있다. 예를 들어, 콜라겐 바이오패브릭의 시트 또는 조각은, 줄기 또는 전구 세포들의 용액을 콜라겐 바이오패브릭의 표면상에 배치하고, 줄기 또는 전구 세포들에 대해 콜라겐 바이오패브릭에 부착하기에 충분한 시간을 허용함으로써, 고막 상에의 적용 직전에 제조될 수 있다. 상기 줄기 또는 전구 세포들은, 대안적으로, 콜라겐 바이오패브릭의 고막상에의 적용 전에, 콜라겐 바이오패브릭의 표면상에, 약 30분, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 10, 12, 24 또는 그 이상의 시간 동안 배치될 수 있다. 콜라겐 바이오패브릭의 표면상에 배치된 줄기 또는 전구 세포들의 수는 가변적일 수 있지만, 적어도 1×10⁶, 3×10⁶, 1×10⁷, 3×10⁷, 1×10⁸, 3×10⁸, 1×10⁹, 3×10⁹, 1×10¹⁰, 3×10¹⁰, 1×10¹¹, 3×10¹¹, 또는 1×10¹²일 수 있거나; 1×10⁶, 3×10⁶, 1×10⁷, 3×10⁷, 1×10⁸, 3×10⁸, 1×10⁹, 3×10⁹, 1×10¹⁰, 3×10¹⁰, 1×10¹¹, 3×10¹¹, 또는 1×10¹² 줄기 또는 전구 세포들 이하일 수 있다. 대안적으로, 또 다른 구현예에서, 상기 지시된 수의 줄기 또는 전구 세포들은, 콜라겐 바이오패브릭이 고막에 적용된 후 콜라겐 바이오패브릭의 표면상에 배치될 수 있다. 또 다른 구현 예에서, 상기 줄기 세포들은 상기 지시된 임의의 양으로 고막에 직접 적용되고, 상기 고막은 콜라겐 바이오패브릭으로 커버된다. 더욱 특정의 구현예에서, 줄기 세포들은 생리적으로-허용가능한 액체, 예컨대 생리 식염수로 적용되거나, 줄기 또는 전구 세포들이 유지 및 그를 통해 이동할 수 있는 생리적으로-허용가능한 겔, 예컨대 하이드로겔에 포매된다. 줄기 세포들은, 고막과의 접촉 전 또는 후에, 1종 이상의 분화-조정제, 예를 들어, U.S. 출원 공보 제2003/0235909, 2004/0028660호, 또는 국제 출원 공보 번호 WO 03/087333에 기술된 분화-조정제들과 접촉될 수 있다. 줄기 세포들을, 예를 들어, 표피, 중배엽, 및 기타 세포 유형들로 분화시키는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, U.S. 출원 공보 제2004/0028660호에 기술된다.

4.3 키트( kit )

본 발명의 고막 복원 방법에 유용한 콜라겐 바이오패브릭은 고막 복원의 촉진을 위한 키트의 부분으로서 포장재(wrapping) 또는 용기에 제공될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 멸균의 이중 필 패키지로서 제공된다. 더욱 특정의 구현예에서, 상기 콜라겐 바이오패브릭은 약 6×8㎝이다. 상기 키트는 하나 이상의 조각들의 콜라겐 바이오패브릭 및 고막의 복원을 촉진하는 임의의 기타 의학적 장치, 일회용품 또는 약물을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 키트 내의 콜라겐 바이오패브릭의 각각의 조각은 나머지의 키트 내용물들과 분리되어 멸균 용기 또는 포장재 내의 단일 시트 또는 패치로서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 상기 키트는, 별도로 포장 또는 용기 보존된, 2 이상의 조각들의 콜라겐 바이오패 브릭을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 키트는 콜라겐 바이오패브릭에 대한 지지체를 포함한다. 특정 구현예들에서, 상기 지지체는 천연 또는 합성 재료일 수 있다. 기타 특정 구현예들에서, 상기 지지체는 플라스틱 필름, 플라스틱 시트, 또는 신축성 플라스틱 랩(wrap)이다. 또 다른 구현예에서, 상기 키트는 1종 이상의 일회용품들을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 일회용품들은 붕대, 고막 주위 피부의 멸균을 위한 수단, 탈지면, 장갑, 또는 멸균 시트이다. 또 다른 구현예에서, 상기 키트는 항생제 연고, 크림, 또는 스프레이를 포함한다. 또 다른 구현예에서, 상기 키트는 콜라겐 바이오패브릭의 조각 및 1종 이상의 상처 치유제들을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 상처 치유제는 PDGF, TGF3, 히알루론산, 피브린, 또는 피브로넥틴이다.

5. 실시예들

5.1 실시예 1: 콜라겐 바이오패브릭의 제조 방법

재료들

하기 재료들을 콜라겐 바이오패브릭의 제조에 사용했다.

재료들/장비

분만 기록 사본

재료/가족 건강력/치료숙지 동의서(Informed Consent) 사본

공급원 바코드 레이블(Bar Code Label)(공여자(donor) ID 번호)

수집 #(들어오는 재료에 대해 순차적인 수가 배정된다)

조직 처리 기록(문서 ID # ANT-19F); 각 로트 번호 처리의 상세한 기록이 유지된다

사람 태반(처리 시작 시 48시간 보다 오래되지 않음)

멸균의 수술용 클램프들/지혈기들

멸균된 가위

멸균의 수술용 칼(scalpel)

멸균 스테리-와이프(Steri-Wipe)

멸균 세포 스크래퍼(날진 엔유엔씨 인터네셔날(Nalgene NUNC Int.) R0896)

멸균 거즈(비-멸균 PSS 4416, 멸균됨)

멸균의 헹굼 스테인레스 스틸 트레이

소독된 처리 스테인레스 스틸 트레이

소독된 플라스틱 빈(Bin)

멸균 0.9％ NaCl 용액(박스터(Baxter) 2F7124)

멸균수(밀리 큐 플러스(Milli Q plus) 09195 또는 박스터 2F7113)

멸균 검사물 용기(VWR 15704-014)

개인용 보호 장비(멸균 및 비-멸균 장갑 포함)

보증된 청정실(Clean Room)

미리 제조된 탈세포화 용액(D-세포); 0.01-1％ 데옥시콜린산 나트륨 일수화물

소독된 빈

흔들리는 플랫폼(VWR 모델명 100)

타이머(VWR 21376890)

소독된 플라스틱 프레임 메쉬

PVC 랩 필름

진공 펌프(슈코-백(Schuco-Vac) 5711-130)

겔 건조기(즉, 열 건조기; 바이오라드 모델 583)

소독된 스테인레스 스틸 절단대

포장용 파우치

멸균 스테인레스 스틸 자(제너럴 툴즈(General Tools) MFG. Co 1201)

추적가능형 디지탈 온도계(모델명 61161-364, 콘트롤 컴퍼니(Control Company))

아쿠-실 자동 밀봉기(Accu-Seal Automatic Sealer) (아쿠-실, 모델명 630-1B6)

임신부는, HIV, HBV, HCV, HTLV, 매독, CMV 및 수집되는 태반 조직을 오염시킬 수 있는 기타 바이러스성 및 세균성 병원체들과 같은 전염병들에 대해 출산시 스크리닝되었다. 상기 언급된 병원체들에 대해 음성 또는 비-반응성으로 검사된 모체의 것인 공여자에서 수집된 조직들만이 상기 콜라겐 바이오패브릭을 제조하는데 사용되었다.

정상적이 출산 후, 태반, 탯줄 및 탯줄 혈액은 수축하는 자궁으로부터 자발 적으로 방출되었다. 상기 태반, 탯줄, 및 탯줄 혈액은 출산 후 수집되었다. 상기 재료들은 실험실로 수송되어, 처리 적어도 1시간 전에 시동된, HEPA 여과 시스템을 갖는 청정실 내의 무균 조건들 하에서 처리되었다. 상기 제품들을 취급하는 동안 장갑(멸균 또는 비-멸균, 적합한 대로)을 항상 착용했다. 양막체/융모막체의 모든 미사용(폐기) 분절체들 및 조직 처리 동안 생성된 오염 액체들은 실행가능한 한 빨리 폐기처분되었다.

단계 Ⅰ.

멸균 스테리-랩(Steri-Wrap) 시트를 사용하여 멸균 범위를 설정하고, 하기 처리용 기구들 및 부속품들을 그 위에 위치시켰다.

멸균 트레이 팩

멸균 세포 스크래퍼

멸균된 수술용 칼

소독된 처리 트레이

멸균 팩(pack) ID #을 처리 기록에 기록했다.

상기 태반을 수송 용기로부터 제거하여 소독된 스테인레스 스틸 트레이 상에 위치시켰다. 수술용 클램프 및 가위를 사용하여, 상기 탯줄을 태반 원반으로부터 대략 2 인치 절단했다. 이후의 처리를 위해 상기 탯줄을 별도의 멸균 용기에 넣어두었다. 상기 용기를 조직 ID 바코드로 표지하고; 존재하는 상기 재료 및 저장 용액(들)(예를 들어, 매질의 유형)을 밝혀두었다. 일부 경우들에서, 기타 프로젝트에 요구되지 않는다면, 상기 탯줄을 폐기하였다.

태반 막의 가장자리로부터 시작하여, 손가락을 이용한 무딘 절제를 사용하여 상기 양막체를 융모막체로부터 분리했다. 이는 막을 절단하기 전에 수행되었다.

융모막체 및 태반 원반의 전체 표면으로부터 상기 양막체를 분리한 후, 가위를 사용하여 양막을 탯줄 잘린끝 주변에서 절단하여 태반 원반으로부터 떼어냈다. 일부 예들에서, 조직을 인열시키지 않고는 양막체 및 융모막체의 분리가 가능하지 않다면, 상기 양막체 및 융모막체를 하나의 조각으로서 태반 원반으로부터 절단한 후, 벗겨내어 분리시킨다.

상기 융모막체를 기타 프로젝트들에 이용되는 별도의 검사물 용기에 넣어두었다. 상기 용기를 조직 ID 바코드로 표지하고; 존재하는 상기 재료 및 저장 용액(들)(예를 들어, 매질의 유형)을 밝혀두어, 이니셜 표기하고 날짜를 적어두었다.

임의 조각의 양막체가 여전히 태반 원반에 부착되었다면, 이는 원반으로부터 박리되어, 가위를 사용하여 탯줄 주변에서 절단된다. 상기 태반을 기타 프로젝트에 이용되는 수송 용기에 다시 위치시켰다.

적합한 자료는 조직 처리 기록에 기록되었다.

상기 양막은 멸균의 0.9％ NaCl 용액을 갖는 트레이에 유지되었다. 바람직하게는, 상기 양막을, 과정의 다음 단계 이전에, 분만시로부터 최대 72 시간 동안 냉장 저장한다.

단계 II.

상기 양막을 한 번에 한 조각씩 검사물 용기로부터 제거하여, 소독된 스테인레스 스틸 트레이 상에 위치시켰다. 기타 조각들은, 이들이 세정될 준비가 될 때 까지, 멸균수로 채워진 별도의 멸균 스테인레스 스틸 트레이에 위치되었다. 처리 트레이로부터 양막체의 여분 조각들을 제거하고, 멸균수로 채워진 별도의 헹굼 스테인레스 스틸 트레이에 위치시켰다.

모체 또는 태아의 혈액 유체들/재료들로 심하게 오염된 경우, 필요에 따라 멸균수를 교체하면서 양막을 헹구었다.

양막은, 모체 측이 위쪽을 향하도록 처리 트레이 상에 위치되었다. 멸균의 세포 스크래퍼를 사용하여, 양막체의 모체 측으로부터 가능한 한 많은 가시적 오염 및 세포 물질을 조심스럽게 제거했다.(주: 막의 인열을 방지하기 위해 본 단계에 최소 압력이 적용되어야 한다). 세포 및 세포 조직파편의 제거를 돕는데 멸균수가 사용되었다. 상기 양막을 별도의 멸균 스테인레스 스틸 헹굼 트레이에서 멸균수를 사용하여 추가로 헹구었다.

상기 양막을 태아 측이 위쪽을 향하도록 뒤집고, 처리 트레이 상에 다시 위치시키고 멸균수로 헹구었다. 가시적 세포 물질 및 조직파편을 세포 스크래퍼를 사용하여 서서히 제거했다(주: 막의 인열을 방지하기 위해 본 단계에 최소 압력이 적용되어야 한다). 세포 및 세포 조직파편의 제거를 돕는데 멸균수가 사용되었다.

세정 라운드(round) 사이에 별도의 멸균 헹굼 트레이에서, 상기 양막을 멸균수로 헹구었다. 상기 조직은, 막의 양측으로부터 가시적 세포 물질 및 조직파편이 전부 제거되지 않는다면, 대부분을 제거하는데 필요한 한 많은 횟수로(세정 라운드), 세정된다.

각각의 세정 라운드 후, 처리 트레이를 멸균수로 헹구었다.

모든 기타 양막체 조각들을 동일한 방식으로 처리하고 동일한 용기에 위치시켰다. 조직 ID 바코드를 첨부하고; 존재하는 상기 재료 및 저장 용액(들)(예를 들어, 매질의 유형)을 밝혀두고, 이니셜 표기하고 날짜를 부가했다.

적합한 정보 및 날짜를 조직 처리 기록에 기록했다.

단계 III.

양막을 헹굼 트레이로부터(또는 저장 용기로부터) 제거하고, 과량의 유체를 손가락을 사용하여 서서히 짜내고, 상기 막을 멸균 검사물 용기에 위치시켰다. 양막이 확실히 커버되도록 상기 용기를 D-세포 용액으로 150㎖ 표식까지 채우고, 용기를 밀폐했다.

상기 용기를 흔들리는 플랫폼 상의 빈에 위치시켰다. 흔들리는 플랫폼을 작동시키고, 상기 막을 D-세포 용액 내에서 최소 15분 동안 그리고 최대 120분 동안 셋팅 #6에서 교반했다.

단계 Ⅰ에서와 동일한 방식으로 새로운 멸균 기구들 및 소독된 트레이를 사용하여 새로운 멸균 범위가 설정되었다. 멸균 팩 ID #를 처리 기록에 기록했다.

교반 완료 후, 흔들리는 플랫폼을 끄고 막을 용기로부터 제거했다. 상기 막을 새로운 멸균 스테인레스 스틸 처리 트레이에 위치시켰다. 트레이의 저부를 커버하도록 멸균 0.9％ NaCl 용액을 첨가했다.

새로운 멸균 세포 스크래퍼를 사용하여, 잔류 D-세포 및 세포 물질(존재하는 경우)을 조직의 양쪽 측면들로부터 제거했다. 본 단계는, 양측 상의 전체 표면으로부터 가능한 한 많은 가시적 잔류 세포 물질을 제거하도록 필요한 만큼 많은 횟 수로, 반복되었다. 상기 막을 세정 라운드들 사이에 별도의 헹굼 트레이 내의 멸균 0.9％ NaCl 용액을 사용하여 헹구었다. 멸균 0.9％ NaCl 용액은 헹굼 트레이에서 헹굼 라운드 사이에 교환되었다.

최후 세정 라운드 완수 후, 상기 막을 멸균 0.9％ NaCl 용액으로 헹구고, 멸균 0.9％ NaCl 용액으로 채워진 새로운 멸균 검사물 용기에 위치시켰다.

잔존하는 모든 양막의 조각들을 정확히 동일한 방식으로 처리했다.

모든 양막 조각들이 처리되어 멸균 0.9％ NaCl 용액을 갖는 용기에 있는 경우, 상기 용기를 흔들리는 플랫폼 상의 빈에 위치시켜, 셋팅 #6에서 최소 5분 동안 교반했다. 교반 완료 후, 상기 막을 검사물 용기로부터 제거하고, 용기 내의 멸균 0.9％ NaCl 용액을 교체하고, 상기 막을 검사물 용기에 다시 위치시켰다.

상기 검사물 용기를 조직 ID 바코드 및 검역 레이블로 표지했다. 존재하는 상기 재료 및 저장 용액(들)(예를 들어, 매질의 유형)을 밝혀두고, 이니셜 표기하고 날짜를 적어두었다. 상기 검사물 용기를 청결한 지퍼-록(zip-lock) 백에 위치시켜 냉장고에 넣었다(2-8℃).

모든 적합한 자료는 조직 처리 기록에 기록되었다.

혈청학 결과들이 입수가능해지면, 적합한 레이블(혈청학 음성 또는 연구 사용을 위해서만)을 검역 레이블의 위에 배치하고, 상기 용기들을 검역된 것들과 격리시켰다.

단계 Ⅳ.

단계 Ⅳ로의 진행 전에, 상기 조직 상태 리뷰를 검토하여 모든 적용가능한 검사 결과들이 음성임을 확실히 한다.

멸균 범위를 멸균 스테리-랩 시트를 사용하여 설정하고, 모든 멸균 및 소독된 기구들 및 부속품들을 단계 II 및 III에서와 동일한 방식으로 설정했다.

상기 막을 냉장고에서 제거하여 새로운 멸균 스테인레스 스틸 처리 트레이에 위치시켰다. 트레이의 저부를 커버하도록 멸균 0.9％ NaCl 용액을 첨가했다.

모든 가시적 세포 물질 및 조직파편(존재하는 경우)을 새로운 멸균 세포 스크래퍼를 사용하여 서서히 제거했다(주: 막의 인열을 방지하기 위해 본 단계에 최소 압력이 적용되어야 한다). 세포들 및 조직파편의 제거를 돕는데 멸균 0.9％ NaCl 용액이 사용되었다.

상기 막을 멸균 0.9％ NaCl 용액으로 채워진 별도의 멸균 스테인레스 스틸 헹굼 트레이에서 헹구었다. 0.9％ NaCl 용액을 세정 라운드 사이에 교체했다. 상기 막을 새로운 멸균 검사물 용기에 위치시키고, 상기 용기를 신선한 멸균 0.9％ NaCl 용액으로 채우고, 이어서 셋팅 #6에서 최소 5분 동안의 교반을 위해 흔들리는 플랫폼상에 위치시켰다.

이전 단계를 3회 반복하고, 멸균 0.9％ NaCl 용액을 각 교반 사이에 교체했다. 적합한 자료를 조직 처리 기록에 기록했다.

상기 막을 한 번에 한 조각씩 검사물 용기로부터 제거하고, 과량의 유체를 손가락을 사용하여 서서히 짜내고, 막을 멸균 처리 트레이 상에 위치시켰다. 상기 막을, 태아 측이 아래쪽을 향하도록 보장하면서, 편평해질 때까지 서서히 스트레칭한다.

소독된 플라스틱 시트를 멸균 가위로 절단함으로써 프레임을 제조했다. 프레임의 크기는 막 분절체 보다 각 방향에서 대략 0.5㎝ 더 작아야 한다. 상기 프레임은 멸균 0.9％ NaCl 용액으로 채워진 헹굼 트레이에서 헹구어졌다.

상기 프레임을 약간 늘어난 막 표면상에 위치시키고, 그 위에서 서서히 압착했다. 플라스틱 프레임의 평활한 측면이 조직을 향하는 것이 필수적이다.

수술용 칼을 사용하여, 상기 막을 프레임 주위에서, 프레임 가장자리들을 지나 대략 0.5㎝ 연장하도록 절단했다. 남은 막은 검사물 용기에 다시 넣었다.

상기 프레임을 지나 연장된 막 가장자리들은 클램프 또는 겸자(tweezers)를 사용하여 프레임의 가장자리에 감싸지고, 동일한 트레이 상의 한쪽에 놓여진다.

막의 다음 조각을 동일한 방식으로 처리했다. 건조되는 총 면적이 열 건조기 당 300㎠를 초과하지 않는 것이 중요하다. 막의 조각을 ‘프레이밍 아웃(framing out)'하는 동안, 프레임화되지 않은 조각들은 용기 내의 멸균 0.9％ NaCl 용액에 남아있어야 한다.

건조기의 건조 온도는 연장된 탐침을 갖는 눈금 디지털 온도계를 사용하여 설정 및 확인된다. 건조 온도는 50℃로 설정되었다. 상기 자료를 조직 처리 기록에 기록했다.

진공 펌프를 작동시켰다.

열 건조기의 건조 플랫폼상에 멸균 거즈를 위치시켜, 프레임화된 막의 면적 보다 약간 더 큰 면적을 덮었다. 거즈 층의 총 두께가 한번 접힌 4×4 거즈의 두께를 초과하지 않도록 보장하는 것이 중요하다.

플라스틱 프레임 메쉬의 한 시트를 거즈의 위에 위치시켰다. 상기 플라스틱 메쉬의 가장자리는 거즈 가장자리를 지나 대략 0.5 - 1.0㎝ 연장되어야 한다.

프레임화된 막을 서서히 들어올려, 막 측이 위쪽을 향하도록 플라스틱 메쉬의 상부의 열 건조기 플랫폼 상에 위치시켰다. 최대량의 막이(300㎠을 초과하지 않음) 열 건조기 플랫폼에 존재할 때까지 이를 반복했다(주: 양막체의 태아 측이 위를 향함).

PVC 랩 필름의 조각을 열 건조기의 전체 건조 플랫폼에 더하여 초과 1 피트(foot)를 커버하기에 충분한 크기로 절단해 낸다.

진공 펌프를 실행시키면서, 양측 모두의 건조 플랫폼 가장자리를 지나 연장되는 ½ 피트를 남기면서, 플라스틱 필름으로 열 건조기의 전체 건조 플랫폼을 서서히 커버했다. 막 및 프레임 시트에 대해 필름을 팽팽히 잡아당기고(즉, 이는 진공에 의해 "흡인"됨), 조직 부위에 대해 어떠한 공기 누출 및 어떠한 주름도 존재하지 않도록 주의를 기울였다. 이어서, 뚜껑을 닫았다.

진공 펌프를 대략 -22인치 Hg의 진공으로 설정했다. 상기 펌프 게이지는 건조 사이클의 2-3분 후 기록되었다. 막을 대략 60분 동안 열 진공 건조했다. 건조 과정 진입 대략 15-30분에서, 열 건조기 내의 상기 멸균 거즈를 새로운 것으로 대체했다. 거즈 층의 총 두께는 한번 접힌 4×4 거즈의 두께를 초과하지 않아야 한다.

교환 후, 막 및 프레임 시트에 대해 상기 플라스틱 필름을 팽팽히 잡아당기고, 막 부위에 대해 어떠한 공기 누출 및 어떠한 주름도 존재하지 않도록 주의를 기울였다.

펌프 압력 모노미터(monometer)를 검토함으로써, 진공 밀봉재의 온전성을 주기적으로 체크했다. 건조 과정 완료 후, 상기 열 건조기를 개방하고, 펌프를 실행시키면서 대략 2분 동안 막을 식혔다.

멸균 스테리-랩 및 그 밑의 소독된 스테인레스 스틸 절단대를 사용하여, 새로운 멸균 범위를 설정했다. 이 시점에서, 멸균 장갑을 사용했다. 펌프가 여전히 실행되는 동안, 장갑을 착용한 손으로 상기 막 시트를 아래로 잡아주면서, 상기 플라스틱 필름을 모서리에서 시작하여 막 시트로부터 서서히 제거했다. 상기 프레임은 상기 막과 함께 건조 플랫폼으로부터 서서히 들어올려지고, 상기 막 측이 위쪽을 향하도록 소독된 스테인레스 스틸 절단대 위의 멸균 범위 상에 위치되었다. 수술용 칼을 사용하여, 프레임의 가장자리로부터 가장자리 1-2㎜를 따라 절개하는 것을 통해, 상기 막 시트를 절단했다. 장갑을 착용한(멸균 장갑) 손으로 막을 적소에 잡아주었다. 천천히 벗겨냄으로써, 상기 막 시트를 프레임으로부터 서서히 들어올리고, 절단대 상의 멸균 범위 상에 위치시켰다.

수술용 칼 또는 예리한 가위를 사용하여, 막 시트를 규정된 크기의 분절체들로 절단했다. 모든 조각들을 절단하고, 포장 전에 멸균 범위 위에 고정시켰다. 단일 조각의 막을, 한 손(멸균됨)을 사용하여, 내부 필 파우치 패키지의 안에 위치시키는 한편, 다른 한 손(비-멸균됨)으로 파우치를 잡아준다. "멸균된" 손으로 파우치들을 건드리지 않도록 주의를 기울였다. 모든 조각들을 내부 파우치의 안에 넣으면, 이들을 밀봉했다. 파우치의 외부 상의 지정된 부위에, 적합한 정보(예를 들어, 파트#, 로트#, 등)를 갖는 레이블을 부착했다. 막의 모든 조각들을 동일한 방식으로 처리했다. 표지되고 밀봉된 필 파우치 패키지들을, 멸균화 시설 또는 배급자에게 선적할 준비가 될 때까지, 저장용 방수 지퍼-록 백에 넣어 두었다.

5.2 실시예 2: 콜라겐 바이오패브릭 제조의 대안적 방법

실시예 1의 단계 Ⅰ에 기재된 바와 같이 상기 실시예의 재료들을 사용하여, 태반을 실질적으로 제조했다. 임신부는, HIV, HBV, HCV, HTLV, 매독, CMV 및 수집되는 태반 조직을 오염시킬 수 있는 기타 바이러스성 및 세균성 병원체들과 같은 전염병들에 대해 출산시 스크리닝되었다. 상기 언급된 병원체들에 대해 음성 또는 비-반응성으로 검사된 모체의 것인 공여자에서 수집된 조직들만이 상기 콜라겐 바이오패브릭을 제조하는데 사용되었다.

스테리-랩 시트를 사용하여 멸균 범위를 설정하고, 하기 처리용 기구들 및 부속품들을 그 위에 위치시켰다: 멸균 트레이 팩; 헹굼 트레이, 스테인레스 스틸 컵, 클램프/지혈기들, 겸자, 가위, 거즈.

상기 태반을 수송 용기로부터 제거하고, 소독된 스테인레스 스틸 트레이 위에 위치시켰다. 수술용 클램프 및 가위를 사용하여, 상기 탯줄을 태반 원반으로부터 대략 2 인치 절단했다.

태반 막의 가장자리로부터 시작하여, 손가락을 이용한 무딘 절제를 사용하여 상기 양막체를 융모막체로부터 분리한다. 이는 막을 절단하기 전에 수행되었다. 융모막체 및 태반 원반의 전체 표면으로부터 상기 양막체를 분리한 후, 가위를 사용하여 양막을 탯줄 잘린끝 주변에서 절단하여 태반 원반으로부터 떼어낸다. 일부 예들에서, 조직을 인열시키지 않고는 양막체 및 융모막체의 분리가 가능하지 않다면, 상기 양막체 및 융모막체를 하나의 조각으로서 태반 원반으로부터 절단한 후, 벗겨내어 분리시킨다.

적절한 자료는 조직 처리 기록에 기록된다.

혈액 및 태아 유체 또는 재료들을 제거하기 위해, 멸균 0.9％ NaCl 용액으로 상기 양막을 헹군다. 생리 식염수는 헹굼 동안 필요에 따라 교체된다.

이어서, 양막체를 검사물 용기 내의 0.9％ 식염수, 1.0％ 데옥시콜린산 용액에 위치시키고, 매 3일 내지 5일 마다 용액을 교체하면서, 2 내지 8℃에서 15일까지 냉장한다. 항온처리 도중 또는 이의 끝에, 상기 제시된 혈청학적 검사들이 평가되었다. 상기 검사들이 1종 이상의 병원체들로의 오염을 지시한다면, 상기 양막체를 거절하고 더 이상 처리하지 않는다. 하지만, CMV-양성 공여자로부터 유도된 것으로서 지시된 조직은 바이오패브릭의 제조에 여전히 적합하다.

일단 항온처리가 완료되면, 상기 양막체를 검사물 용기로부터 제거하고, 멸균 트레이에 위치시키고, 0.9％ NaCl 용액으로 3회 헹구어 조직으로부터의 데옥시콜린산을 감소시킨다. 모체 측이 위로 향하도록 양막체를 위치시키면서, 세포 스크래퍼를 사용하여 양막체를 서서히 스크래핑하여 가능한 한 많은 세포 물질을 제거한다. 세포 및 세포 조직파편의 제거를 돕기 위한 필요에 따라 추가적인 식염수를 첨가한다. 상기 단계를 양막체의 태아 측에 대해 반복한다. 스크래핑 후 헹굼을 실행했고, 세포 및 세포 물질을 제거하는데 필요한 한 많은 횟수가 양측에 대해 반복된다. 셋팅 #6에서 5 내지 120분 동안 흔들리는 플랫폼상의 별도의 용기에, 0.9％ 생리 식염수 중 양막체를 위치시킴으로써 스크래핑된 양막체를 헹군다. 생리 식염수를 교체하고, 진탕 헹굼을 반복한다.

헹굼 완료 후, 상기 양막체를 냉장고 내의 지퍼-록 백에서 선택적으로 저장한다.

이어서, 스크래핑된 양막체를 태아 측이 아래를 향하도록 멸균 처리 트레이 상에 위치시킨다. 상기 양막체를 손으로 부드럽게 마사지하여 과량의 액체를 제거하고, 막을 편평화시킨다. 그의 치수들이 편평한 양막체 보다 각 방향으로 대략 0.5㎝ 작도록, 멸균 플라스틱 시트를 절단한다. 상기 플라스틱 시트를 NaCl 용액에서 짧게 헹군다. 상기 플라스틱 시트를, 커버되지 않은 양막체의 변연을 남기면서, 평활한 쪽이 아래로 향하도록 편평한 양막체 상에 위치시킨다. 시트 가장자리를 지나 연장하는 대략 0.5㎝를 남기면서, 상기 양막체를 트리밍하는데 수술용 칼을 사용한다. 이들 연장하는 양막체 가장자리들은 플라스틱 시트에 대해 뒤로 감싸진다. 건조되는 전체 조직 부위는, 표준 진공 열 건조기에 대해 300㎠를 초과하지 않는다.

멸균 거즈의 시트를 진공 열 건조기에 위치시킨다. 거즈의 가장자리를 지나 대략 0.5-10.0㎝가 연장하도록, 얇은 플라스틱 메쉬를 거즈 상에 배치한다. 이어서, 양막체 및 플라스틱 시트를 조직 측이 위를 향하도록 메쉬 상부의 진공 열 건조기 내에 위치시키고, 상기 양막체를 PVC 랩 필름의 시트로 커버한다. 건조기를 50℃로 설정하고, 50℃±1℃의 유지를 보장하도록 온도를 주기적으로 검토한다. 이어서, 진공 펌프를 작동시키고 대략 -22 인치의 Hg 진공으로 설정한다. 건조를 60분 동안 진행시킨다.

건조된 양막체를 이어서 밀봉된 플라스틱 용기에 이후의 사용을 위해 저장한다.

5.3 실시예 3: 콜라겐 바이오패브릭을 사용한 고막성형술

환자는 청력 손실, 및 공기 전도 보다 큰 골 전도를 보인다. 고막을 육안 진찰하여, 이도 안으로 너무 깊숙이 밀어 넣어진 면봉으로 인해 초래된, 막 면적의 약 40%를 차지하는 변연성 구멍을 포착했다. 고막의 면적을 추정하고, 바이오패브릭의 2×2㎝ 정사각형으로부터, 고막의 개략적인 모양으로 콜라겐 바이오패브릭 적층체의 조각을 트리밍했다. 상기 콜라겐 바이오패브릭 적층체는 동일한 로트, 즉 동일한 기원의 태반으로부터의 5층의 콜라겐 바이오패브릭을 포함한다. 트리밍된 콜라겐 바이오패브릭 적층체를, 이도를 통해, 새로이 죽은조직제거처리되어 잠재적으로 삼출성인(oozing) 천공의 부위 위로 고막에 대하여 위치시키고, 서서히 위치로 압착시킨다. 삼출물의 점착성은 막에 대한 생체재료 부착성에 기여한다. 일시적으로 겔폼(gelfoam)으로 귀를 충전하여, 콜라겐 바이오패브릭 적층체를 고막에 대해 고정시킨다.

5.4 실시예 4: 콜라겐 바이오패브릭을 사용한 고막성형술

환자는 청력 손실, 및 공기 전도 보다 큰 골 전도를 보인다. 고막을 육안 진찰하여, 사전 감염으로 인해 초래된, 막 면적의 약 40%를 차지하는 변연성 구멍을 포착했다. 뒤-귓바퀴 절개는 뒤-귓바퀴 주름의 대략 1㎝ 뒤에서 이루어진다. T-모양 절개는 유양돌기에 위에 놓인 골막에서 이루어진다. 상기 골막을 들어올려 귀길로 전방 이동시켰다. 이도 피부 및 골막을 덕빌 엘리베이터(duckbill elevator) 또는 둥근형 칼을 사용하여 들어올린다. 자가-지지 견인기를 위치시켜 이도 피부 및 귀를 앞으로 견인시킨다. 이도 절개는 측면적으로 기반을 둔 이도 피부판 또는 혈관 띠를 형성하도록 고안된다. 우선 수평적 절개가, 12시 내지 8시 위치에서(오른쪽 귀) 고리에 대해 측면으로 대략 2 내지 5㎜ 절단된다. 그 다음 수직적 절개가 이루어진다. 천공에 도달할 때까지, 판을 전방으로 들어올린다. 이어서, 유스타키오관 및 중이를 겔폼으로 충전한다. 콜라겐 바이오패브릭 적층체를 이어서 천공에 필요한 적당한 크기로 형상화시킨다. 이를 이어서 전방 고막 잔유물 하의 그리고 후방 이도 벽 상의 위치에 배치시킨다. 상기 고리를 이어서 후방적으로 재위치시키고, 혈관 띠를 조심스럽게 그의 해부학적 위치로 이동시킨다. 겔폼을 드럼 잔유물, 이식편, 및 혈관 띠 위에 배치하고, 외이도를 항생제 연고로 채운다. 뒤-귓바퀴 절개를 흡수성 봉합사를 사용하여 피하 봉합하고, 유양 돌기 드레싱(dressing)을 적용하여 약한 압력 및 보호를 제공한다.

5.5 실시예 5: 콜라겐 바이오패브릭 적층체

상기된 방법들에 의해 제조된 콜라겐 바이오패브릭을 하기와 같이 적층했다. 건조된 콜라겐 바이오패브릭을, 일부 예들에서, 1시간 10분 내지 1시간 30분 동안 멸균의 0.9％ NaCl 용액에서 재수화시켰다. 건조된 콜라겐 바이오패브릭을 상기(실시예 1)에 개괄된 전체 절차에 의해 제조한 후, 적층하고; 습윤된 콜라겐 바이오패브릭을 단계 III까지 제조한 후, 적층시켰다. 탑재 후, 프레임을 절단하고, 태아 측을 아래로 향하도록 배치함으로써 재수화된 조직을 탑재하고, 조직의 위에 탑재할 프레임을 배치하고, 조직을 절단하여, 프레임 주변에 약 1㎝ 가장자리를 남긴다. 1㎝ 가장자리를 세포 스크래퍼를 사용하여 프레임의 가장자리 위로 접었다. 상기 단계들은 습윤된 콜라겐 바이오패브릭의 추가적인 조각들을 첨가하기 위해 반복되었다. 적층된 바이오패브릭은 이어서 겔 건조기에 배치되고 실질적인 건조도(<20 중량％ 수분 함량)까지 건조되었다. 적층체들을 이어서 2×6㎝ 샘플들로 절단했다.

적층된 콜라겐 바이오패브릭의 별도의 로트들을 하기와 같이 평가했다. 건조(DT) 및 습윤(WT) 적층된 콜라겐 바이오패브릭의 치수는, 표 1에 보여지는 바와 같이, 2, 3, 5 또는 8 층들을 함유하는 적층체들에 대해 측정되었다.

	두께(μm)	길이(㎜)	넓이(㎜)	중량(mg)
DT2	29±12	20.0±0.3	5.2±0.1	0.87±0.02
DT3	32±2	20.5±0.1	5.2±0.2	1.26±0.11
WT2	20±15	20.2±0.2	5.0±0.3	0.93±0.17
WT3	15±5	19.6±0.1	5.1±0.3	0.9±0.04
WT5	31±5	19.8±0.4	5.3±0.1	2.06±0.2
WT8	115±26	20.3±0.2	5.1±0.4	4.92±0.56

검사물들은, 실온의 건조 조건 하에 보관되는 경우, 적층 후 최초 2일에 걸쳐 어떠한 층간분리의 징후도 보이지 않았다. 적층된 콜라겐 바이오패브릭은 또한 교반된 0.9％ 식염수 중, 실온에서 10일 동안 보관시 어떠한 층간분리의 징후도 보이지 않았다.

더욱 큰 적층된 콜라겐 바이오패브릭 검사물들이 적층체 내구성 및 층간분리에 대한 저항성에 대해 검사되었다. 상기 열거된 목록으로부터의 1×2㎝ 검사물들(즉, DT2, DT3, WT2, WT3, WT5 및 WT8)을 5㎖ 포스페이트 완충된 식염수의 페트리 접시에 위치시켰다. 상기 검사물을 95 RPM에서 대략 24 시간 동안 오비탈 진탕기 상에 놓아두었다. 진탕 동안 또는 그후 간단한 취급 동안, 검사물의 어떠한 층간분리도 관찰되지 않았다.

균등:

본 발명은 본원에 기재된 특정 구현예들에 의해 범주가 제한되지 않는다. 사실상, 기재된 것들에 부가하여 본 발명의 다양한 수정들이 상기의 기술 및 첨부 도면들로부터 당업자들에게 명백해질 것이다. 그러한 수정들은 첨부된 청구항들의 범주 내에 속하게 된다.

다양한 공보들, 특허들 및 특허 출원들이 본원에 인용되며, 그의 개시는 그의 전체로 참조로써 편입된다.

Claims (20)

1. 고막을 콜라겐 바이오패브릭(collagen biofabric)과 접촉시키는 것을 포함하는, 변형을 갖는 고막의 복원 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 변형이 천공인 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 변형이 무기폐성 고막, 진주종 관련 변형, 함몰낭 또는 고실경화증에 기인한 변형인 방법.
4. 제2항에 있어서, 상기 천공이 외상에 의해 초래되는 것인 방법.
5. 제2항에 있어서, 상기 천공이 수술 절차의 부분으로서 초래되는 것인 방법.
6. 제2항에 있어서, 상기 접촉이 천공을 폐쇄하기에 충분한 것인 방법.
7. 제2항에 있어서, 상기 천공이 천공 발생 2개월 이내에 자발적으로 치유되지 않는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 단일층의 양막(amniotic membrane)인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 2 이상의 층들의 양막의 적층체인 방법.
10. 제11항에 있어서, 상기 적층체가 2층을 가지며, 두께가 약 20 내지 약 60㎛인 방법.
11. 제12항에 있어서, 상기 적층체의 두께가 약 50㎛인 방법.
12. 제2항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 고막과 접촉시 약 20 중량％ 미만의 물을 포함하는 것인 방법.
13. 제2항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 고막과의 접촉 전에 수화되는 것인 방법.
14. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭의 두께가 약 2㎛ 내지 약 150㎛인 방법.
15. 제20항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭의 두께가 약 1㎛ 내지 약 40㎛ 인 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 콜라겐 바이오패브릭이 이중 필 파우치(peel pouch)에 제공되는 것인 방법.
17. 2층 이상을 갖는 적층체인 콜라겐 바이오패브릭.
18. 제23항에 있어서, 2층의 적층체이고, 약 20 내지 약 60㎛의 평균 두께를 갖는 콜라겐 바이오패브릭.
19. 제24항에 있어서, 약 50㎛의 평균 두께를 갖는 콜라겐 바이오패브릭.
20. 제23항에 있어서, 치수 약 3×3㎝ 이하의 콜라겐 바이오패브릭.