CN1668733A - 利用jnk或mkk抑制剂调节细胞分化并治疗骨髓增生异常和脊髓发育不良综合症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供调节哺乳动物，特别是人的干细胞和祖细胞的分化以调节和控制这些细胞沿着特定的细胞和组织谱系分化和成熟的方法。本发明的方法涉及利用某些有机小分子调节干细胞群沿着特定的细胞和组织谱系的分化，特别是来源于产后胎盘的胚胎样干细胞或从例如脐血来源分离的干细胞。本发明也涉及对脊髓发育不良综合症或骨髓增生性综合症或其症状的治疗或预防，包括单独或组合，以及伴随或不伴随使用未调理的细胞或根据本发明的其他方面调理的细胞来施用JNK或MKK抑制剂。最后，本发明涉及这种分化干细胞在移植和其他医疗处理中的用途。

Description

利用JNK或MKK抑制剂调节细胞分化 并治疗骨髓增生异常和脊髓发育不良综合症的方法
本申请要求享受于2002年5月30日提交的美国临时申请号60/384,250和2002年12月19日提交的美国临时申请号60/434,833的权利，其每个在此全部引入作为参考。
1.引言
本发明涉及调节哺乳动物干细胞和祖细胞分化的方法，包括将干细胞或祖细胞暴露于抑制c-Jun N-末端激酶(JNK)或促分裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)活性的化合物。本发明的方法用于调节或控制哺乳动物，特别是人的干细胞沿着特定细胞和组织谱系的分化或成熟。本发明的方法涉及利用某些小的有机分子调节干细胞群沿着特定的细胞和组织谱系的分化，以及特别是来源于产后胎盘的胚胎样干细胞的分化或从来源例如脐带血分离的干细胞的分化。本发明也提供治疗或预防骨髓增生性疾病(“MPD”)或脊髓发育不良综合症(“MDS”)的方法，包括对需要其的患者单独或组合施用有效量的JNK抑制剂或MKK抑制剂。最后，本发明涉及这种分化的干细胞在移植和其他医学治疗中的用途。
2.发明背景
2.1.干细胞
人干细胞是全能或多能的前体细胞，能够产生多种成熟的人细胞谱系。该能力是用于细胞分化和为器官和组织发育所必需的特化的基础。
在这种干细胞移植中的最新成就已经为由于疾病而进行的骨髓切除、暴露于有毒的化学药品和/或辐射后恢复和/或补充骨髓提供新的临床工具。虽然不一定都可以，但可使用干细胞种群恢复许多组织，并且恢复生理和组织的功能。干细胞在组织工程、基因治疗递送和细胞治疗学中的应用也是突飞猛进的。
已经鉴定了许多不同类型的哺乳动物干细胞，包括胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、成人干细胞和其他定向的干细胞或祖细胞。然而控制或调节干细胞的分化仍然是困难的。大多数现有的调节干细胞分化的方法是粗糙且非调控性的，以致于干细胞可能分化成为细胞类型的混合物，而不是成为一种(或多种)所需要的细胞类型，或产生低产量的产物细胞。
人干细胞已经从多种来源获得。参见，例如，Caplan等人美国专利号5,486,359；Krbling等人，2002，“外周血干细胞受体中供体原点的肝细胞和上皮细胞(Hepatocytes and epithelial cells of donor origin inrecipients of peripheral-blood stem cells)”，N.Engl.J.Med.346(10)：738-46；Naughton等人，美国专利号5,962,325；以及Hu等人，WO00/73421。然而获得干细胞的现有方法的缺陷是，它们需要从供体收获骨髓或骨膜细胞，然后必须分离干细胞；其劳动强度很大；而干细胞的产量极低。这些参考文献没有公开利用JNK或MKK抑制剂或调节剂来调节干或祖细胞的分化。脐带血(脐血)是已知的造血祖代干细胞的备选来源。然而从脐带血获得干细胞的主要限制是经常不能获得足够体积的脐带血，而导致细胞数目不足以在移植后有效地恢复骨髓。
已经描述了用于自体内扩展细胞群的方法。参见，例如，Emerson等人，美国专利号6,326,198；Kraus等人，美国专利号6,338,942。利用小分子的调节和分化尚未公开。
已经确定许多生物分子调节干或祖细胞的分化。参见Rodgers等人，美国专利号6,335,195(造血和间充质干细胞的培养以及在存在血管紧张素原、血管紧张素I、血管紧张素II AII AT2类型2受体的激动剂时的生长对谱系特异的细胞增殖和分化的诱导)；Nadkarni等人，1984，肿瘤Tumor 70：503-505；Melchner等人，1985，血液Blood 66(6)：1469-1472；Slager等人，Dev.Genet，1993；14(3)：212-24，Ray等人，1997，生物化学杂志J.Biol.Chem.272(30)：18702-18708)；Damjanov等人，1993，Labor.Investig.68(2)：220-232；Yan等人，20，01，Devel.Biol.235：422-432；Hatzopoulos等人，1998，发育Development 125：1457-1468(类视黄醇，例如维生素A和视黄酸(RA)；类视黄醇在分化上的作用，然而，还有待于完全地理解以使得其可用作控制干细胞分化的可调节方式)。
叶酸类似物已经显示通过杀死某些干细胞群影响干细胞的分化(DeLoia等人，1998，人类生育Human Reproduction 13(4)：1063-1069)，并因此不是用于施用于患者的调节和增殖大量干细胞分化的有效工具。
例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11的细胞因子，以及例如促红细胞生成素、试剂盒配体、M-CSF和GM-CSF的蛋白质，也已经显示在造血谱系中直接分化干细胞成为特定的细胞类型(Dushnik-Levinson等人，1995，新生儿生物学Biol.Neonate 67：77-83)。然而这些方法不是很好理解并且对于控制干细胞分化的可调节方式来说仍然是太粗糙和不精确的。
2.2.c-JUN N-末端激酶(JNK)
Jun N-末端激酶(JNK)途径是通过将细胞暴露于环境应力或通过用促炎症性的细胞因子处理细胞而活化的。JNK途径的靶包括转录因子c-jun和ATF2(Whitmarsh和Davis，分子医学杂志J.Mol.Med.74：589-607，1996)。这些转录因子是碱性亮氨酸拉链(bZIP)组的成员，在许多基因的启动子中作为同型和异型的二聚复合物结合AP-1和AP-1类似位点(Karin等人，Curr.Opin.Cell Biol.9：240-246，1997)。JNK结合c-jun和ATF-2的N-末端区域并且在每个转录因子的活化结构域内磷酸化2个位点(Hibi等人，1993，基因发展Genes Dev.7：2135-2148；Mohit等人，1995，神经元Neuron 14：67-75)。已经确定3个JNK酶是独特基因的产物(Hibi等人，上述；Mohit等人，上述)。已经鉴定10种不同的JNK同工型，代表3个不同基因的替代拼接形式：JNK1、JNK2和JNK3。JNK1和2在人组织中普遍表达，而JNK3选择性地在脑、心脏和睾丸中表达(Dong等人，科学Science 270：1-4，1998)。JNK1和2广泛地在哺乳动物组织中表达，而JNK3几乎专门地在脑中表达。JNK信号的选择性是经JNK途径成分的特异相互作用并且利用选择性地结合信号级联多重成分的支架蛋白质而实现的。
JNKs通过Thr-183和Tyr-185上的双重磷酸化而活化。JNKK1(亦称MKK4)和JNKK2(MKK7)，2个MAPKK水平的酶，可在细胞中介导JNK活化(Lin等人，1995，科学Science 268：286-289；Toumier等人，1997，美国国家科学院院报Proc.Nat.Acad.Sci.USA 94：7337-7342)。JNKK2特异地磷酸化JNK，而JNKK1还可以磷酸化和活化p38。JNKK1和JNKK2都广泛地在哺乳动物组织中表达。JNKK1和JNKK2通过MAPKKK酶、MEKK1和2活化(Lange-Carter等人，1993，科学Science 260：315-319；Yan等人，1994，自然Nature 372：798-781)。MEKK1和MEKK2都广泛地在哺乳动物组织中表达。
已经在许多疾病背景中证明JNK途径的活化，为药物发现提供了导向该途径的基本原理。此外，分子遗传方法已经证实该途径在几种疾病中的发病作用。例如，由于免疫系统的过度活化而产生的自身免疫和炎症性疾病。活化免疫的细胞表达许多编码炎症性分子的基因，包括细胞因子、生长因子、细胞表面受体、细胞粘附分子和降解的酶。许多这些基因通过JNK途径，通过活化转录因子AP-1和ATF-2，包括TNFα、IL-2、E-选择蛋白和例如胶原酶-1的基质金属蛋白酶而调节(Manning A.M.和Mercurio F.，Exp.Opin Invest.Drugs 6：555-567，1997)。单核细胞、组织巨噬细胞和组织肥大细胞是产生TNFα的关键来源。JNK途径在细菌脂多糖-刺激的巨噬细胞和通过FceRII受体刺激的肥大细胞中调节TNFα的产生(Swantek J.L.，Cobb M.H.，Geppert T.D.分子细胞生物学Mol.Cell.Biol.17：6274-6282，1997；Ishizuka T.，Tereda N.，Gerwins P.，Hamelmann E.，Oshiba A.，FangerG.R.，Johnson G.L.，和Gelfland E.W.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 94：6358-6363，1997)。抑制JNK的活化有效地调节从这些细胞分泌TNFα。因此JNK途径调节该重要的促炎症性细胞因子的产生。基质金属蛋白酶(MMPs)促进风湿性关节炎中软骨和骨的侵蚀，并且在其他的自身免疫疾病中泛化组织的破坏。MMPs，包括MMP-3和MMP-9，胶原酶类型II和IV的可诱导表达，是通过JNK途径和AP-1的活化而调节的(Gum R.，Wang H.，Lengyel E.，Juarez J.，和Boyd D.致癌基因Oncogene 14：1481-1493，1997)。在用TNFα、IL-1或Fas配体活化的人风湿性滑膜细胞中JNK途径是活化的(Han Z.，Boyle D.L.，AupperleK.R.，Bennett B.，Manning A.M.，Firestein G.S.J.Pharm.Exp.Therap.291：1-7，1999；Okamoto K.，Fujisawa K.，Hasunuma T.，Kobata T.，Sumida T.，和Nishioka K.Arth & Rheum：919 26，1997)。抑制JNK的活化导致AP-1活化的降低和胶原酶-1的表达(Han等人，上述)。因此JNK途径在涉及风湿性关节炎的细胞中调节MMP的表达。
根据欧洲申请号EP 1 071 429 B1，JNK途径的改变可用于治疗糖尿病、胰岛素抗性；非胰岛素依赖的或类型II糖尿病；前糖尿病病症；多囊卵巢综合症(PCOS)；心血管疾病；冠状动脉病；高胰岛素血症；高脂血症；高血糖；肥胖症；减弱的葡萄糖耐受性(IGT)；胰岛素抗性的非IGT(NGT)；非诊断的葡萄糖耐受性；糖尿病并发症；脂肪肝；妊娠期糖尿病(GDM)；和高血压。国际申请公开号WO 02/085396说明通过调节JNK途径可治疗的病症包括胰岛素抗性；非胰岛素依赖型糖尿病；高血糖水平；升高的血清胰岛素；对静脉内给药的胰岛素的不敏感性；肥胖症；糖尿病；心脏病；中风；和癌症。然而这些参考文献没有表明调节JNK途径可用于调节干细胞的分化，或可用于治疗骨髓增殖性或骨髓发育不良的病症。
2.3.促分裂原活化的蛋白激酶(MKK)
促分裂原活化的蛋白激酶(MAPKs)是活化转录因子、翻译因子和应答多种细胞外信号的其他靶分子的保守信号转导途径的成员。MAPKs是通过在具有序列Thr--X--Tyr的双重磷酸化的基序，经促分裂原活化蛋白激酶激酶(MKKs)的磷酸化而活化的。在较高等的真核生物中，MAPK信号的生理学作用已经与例如增殖、肿瘤发生、发育和分化的细胞事件相关。因此，经这些途径调节信号转导的能力可导致研发治疗和预防性治疗与MAPK信号相关的人类疾病，例如炎症性的疾病，自身免疫疾病和癌症。在哺乳动物细胞中，已经描述了3个平行的MAPK途径。最好的鉴定的途径导致细胞外信号调节激酶(ERK)的活化。
已经鉴定了3个能够体外活化p38的MKKs。MKK3似乎特异于p38(即不活化JNK或ERK)，而MKK4活化p38和JNK(参见Derijard等人，1995，科学(Science)267：682-685)。第三个MKK，MEK6，似乎是p38磷酸化的更强和更特异的体内刺激物(参见美国专利系列号6,074,862)。这些蛋白质看来似乎在用于治疗与p38信号转导途径相关病症的治疗方法中具有用途。
2.4.骨髓增殖和骨髓发育不良的病症
骨髓增生异常(MPDs)通常是由造血干细胞的获得性克隆异常所引起的，并且包括真性红细胞增多症、骨髓纤维化、实质性血小板增多和慢性的骨髓白血病。C.A.Linker，血液(Blood)，现代内科诊断和治疗CURRENT MEDICAL DIAGNOSIS & TREATMENT，2002 535(第41版，2002)。骨髓发育不良病症(MDSs)是一组造血干细胞的获得性无性系病症，并且包括几种异型的综合症，包括有或没有翼型成高铁红细胞的难治性贫血；具有过量胚细胞的难治性贫血；以及慢性的骨髓单核细胞白血病。同上，在542。
骨髓增生疾病(MPDs)通常是由造血干细胞的获得性无性系异常所引起的，并且包括真性红细胞增多症、骨髓纤维化、实质性血小板增多和慢性的骨髓白血病。C.A.Liiiker，血液(Blood)，现代内科诊断和治疗CURRENT MEDICAL DIAGNOSIS & TREATMENT，2002535(第41版，2002)。与MPD相关的症状包括但不限于，头痛、眩晕、耳鸣、视觉模糊、疲劳、盗汗、低烧、全身性瘙痒、鼻出血、视力模糊、脾肿大、腹腔胀满、血栓、流血增加、贫血、脾梗塞、严重的骨疼痛、肝中造血、腹水、食道静脉曲张、肝功能衰竭、呼吸窘迫，以及阴茎异常勃起。
与MPD相关的异常包括但不限于，多潜能造血祖细胞的无性系扩展，伴随血液的一种或多种有形元件的过量产生(例如，升高的红细胞计数，升高的白细胞计数，和/或升高的血小板计数)，费城染色体或bcr-abl基因的存在，外周血涂片上的泪珠状红细胞畸形，白幼红细胞血像，巨大的异常血小板，具有网状或胶原纤维化的细胞过多的骨髓，包括但不限于TNF-α、IL-1、IL-2和IL-6的炎症性细胞因子的过度表达，包括但不限于iNOS(可诱导的一氧化氮合酶)和COX-2的炎症相关酶的过度表达，以及具有低百分数的前髓细胞和胚细胞的显著左偏移的骨髓系列。
骨髓发育不良病症(MDSs)是一组造血干细胞的获得性无性系病症，并且包括几种异型的综合症，包括有或没有翼型成高铁红细胞的难治性贫血；具有过量胚细胞的难治性贫血；以及慢性的单核细胞性白血病。C.A.Linker，血液Blood，现代内科诊断和治疗CURRENTMEDICAL DIAGNOSIS & TREATMENT，2002 535(第41版，2002)中。MDS的类型包括但不限于，难治性贫血(RA)，具有环状成高铁红细胞的RA(RARS)，具有过量胚细胞的RA(RAEB)，转化中的RAEB(RAEB-T)，白血病前期以及慢性的单核细胞性白血病(CMML)。
显然还保持对用于治疗或预防MPD或MDS的改进方法以及用于调节哺乳动物干细胞或祖细胞分化的方法的需要。
在本申请的第2节中引用任何文献并不是承认该参考文献相对于本申请是现有技术。
3.发明概述
本发明提供调节哺乳动物，特别是人的干细胞或祖细胞分化的方法。特别地，可使用本发明的方法调节和控制人干细胞沿着特定的细胞和组织谱系分化和成熟。本发明包括利用小分子作为调节分化的试剂。在一个实施方案中，小分子优选地不是多肽、肽、蛋白质、激素、细胞因子、寡核苷酸、核酸或其他大分子。在具体的实施方案中，小分子是在下列第4.3节中所公开的分子。
本发明的方法包括通过将该细胞与抑制c-Jun N-末端激酶(JNK)或促分裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)活性的抑制剂接触，而调节干细胞或祖细胞的分化和/或增殖。本发明的方法也包括调节干细胞或祖细胞分化成为特定的细胞谱系，包括但不限于间质的、造血的、产生脂肪的、生成肝组织的、神经原的、生成神经胶质的、形成软骨的、生成血管的、生肌的、形成软骨的，或成骨的谱系。在特别的实施方案中，本发明的方法包括调节干细胞分化成为造血谱系的细胞。在另一个实施方案中，本发明的方法涉及调节干细胞分化成为特定的造血谱系，特别为CD34+、CD133+和CD45+造血谱系的细胞。进一步地，本发明包括调节定向的细胞成为特定的细胞类型，例如间充质细胞、造血细胞、脂肪细胞、肝细胞、成神经细胞、成神经胶质细胞、软骨细胞、内皮细胞(EC)祖代、肌细胞、软骨细胞或成骨细胞。在具体的实施方案中，本发明包括调节定向的造血祖细胞成为红细胞、血小板或白细胞(白血球)，例如嗜中性白细胞、单核白细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞、B细胞、T细胞或浆细胞。
优选地，本发明的方法可用于特异地抑制不需要的红细胞或红细胞生成集落(BFU-E和CFU-E)的产生，同时增加形成白细胞和血小板的集落(CFU-GM)的产生并且增强总的集落形成单位(总的-CFU)的产生。因此不仅可以使用本发明的方法来调节干细胞的分化，而且还可用于刺激集落形成的速率，通过改善骨髓移入的速度和白细胞和/或血小板产生的恢复而提供有利于造血干细胞移植的显著益处。
可以根据本发明的方法使用任何哺乳动物的干细胞，包括但不限于，分离自脐带血、胎盘和其他来源的干细胞。干细胞可分离自任何哺乳动物种属，例如小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、猪、羊、牛、马、猴子等，更优选为人。干细胞可包括多潜能的细胞，即具有完全的分化多面性，能自我更新并可在组织内保持休眠或静止的细胞。干细胞也可包括多潜能细胞或定型的祖细胞。在一个优选的实施方案中，本发明利用的干细胞是有生存力的、休眠的、存在于足月胎盘内并且可以是在顺利分娩和胎盘排出、放血和灌流后回收的多潜能干细胞，其可导致回收多达10亿的有核细胞，产生5千万-1亿个多能和多潜能的干细胞。
本发明也包括用包括由本发明的方法制备的干细胞的组合物治疗需要治疗的患者的方法。这种患者包括但不限于，需要骨髓移植以治疗恶性疾病的患者(例如，患有急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性粒性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、脊髓发育不良综合症(“白血病前期”)、单体性7综合症、非Hodgkin′s淋巴瘤、成神经细胞瘤、脑肿瘤、多发性骨髓瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、肉瘤或其他实体瘤的患者)，需要骨髓移植以治疗非恶性疾病的患者(例如，患有血液学紊乱、先天性免疫缺陷、粘多糖沉积症、脂沉积症、骨质疏松症、Langerhan′s细胞组织细胞增多症、莱-纳二氏综合症或糖原贮存疾病的患者)，正在经受化疗或放射疗法的患者、准备经受化疗或放射疗法的患者以及先前经受化疗或放射疗法的患者。在某些实施方案中，患者在接受干细胞组合物前或与此同时接受免疫抑制剂治疗。
本发明进一步包括通过与JNK或MKK抑制剂组合共同施用未处理的干细胞或祖细胞，诱导所需要的干细胞原位分化来治疗需要治疗的患者的方法。
可与本发明联合使用的小分子化合物的实例包括但不限于，调节或优选抑制JNK或MKK的化合物。在一个实施方案中，JNK或MKK的抑制剂是能够直接抑制JNK或MKK活性的小的有机化合物。在另一个实施方案中，JNK或MKK的抑制剂调节JNK或MKK途径的另一个成分，因而抑制JNK或MKK活性。在另一个实施方案中，化合物不是多肽、肽、蛋白质、激素、细胞因子、寡核苷酸、核酸或其他大分子。优选地，化合物的分子量小于1000克/摩尔。这种化合物包括但不限于，氨基嘧啶、咪唑并吡啶、吡唑并吡啶、哌嗪、羟吲哚、吡嗪并羟吲哚、肾上腺素衍生物、氮茚、杂芳基、肟、吡唑、咪唑、磺酰肼衍生物、吲唑、苯胺基嘧啶、异噻唑并蒽酮、异噁唑并蒽酮、异吲哚并蒽酮、吡唑并蒽酮及其盐、溶剂化物、异构体、包合物、前体药物、水合物、多形体或衍生物。
在另一个实施方案中，本发明的代表性的JNK和MKK抑制化合物及其衍生物包括但不限于，下列结构(I)的化合物：
其中A、R1和R2如下定义(参见第4.3节)，包括其异构体、前体药物和药物学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物或多形体。
在另一个实施方案中，本发明的代表性的化合物及其衍生物包括但不限于下列结构(II)的化合物：
其中A、R1到R6如下定义(参见第4.3节)，并且包括其异构体、前体药物和药物学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物或多形体。
在一个实施方案中，本发明的代表性的化合物及其衍生物包括但不限于具有下列结构(III)的小分子：
Figure A0381726700191
其中R0如下定义(参见第4.3节)，该化合物是(i)未取代的，(ii)单取代的并具有第一取代基，或(iii)二取代的并具有第一取代基和第二取代基，其中第一和第二取代基如下所述，并且包括其异构体、盐、包合物、溶剂化物、水合物、前体药物、多形体和药物学上可接受的盐。
在本发明的一个特别的实施方案中，将包括但不限于胚胎样干细胞、祖细胞、多潜能细胞和多能细胞的产后灌流胎盘内源的细胞暴露于本发明的化合物并且诱导分化。可收集在胎盘中增殖的内源细胞，和/或从灌注液、培养基或从胎盘细胞本身回收生物活性分子。在另一个实施方案中，内源的细胞可从胎盘和培养基收集，并且在合适的条件下体外培养足够的一段时间以诱导分化而成为所需要的细胞类型或谱系。
在本发明的另一个实施方案中，干或祖细胞不是来源于产后灌流的胎盘，而是分离自其他来源，例如脐带血、骨髓、外周血或成人血液，将其暴露于本发明的化合物并诱导分化。在优选的实施方案中，分化是在合适的条件下在体外进行的，并且培养足够的一段时间以诱导分化成为所需要的谱系或细胞类型。本发明的化合物通过加入、原位产生或其他任何方式用于分化/培养的培养基，以容许干或祖细胞接触本发明的化合物。
总而言之，将培养在产后灌流胎盘中的内源或外源的干或祖细胞暴露于本发明的化合物可在胎盘中培养细胞的同时发生，或优选地，可在细胞已经回收并从胎盘移出后在体外发生。
本发明也包括移植预处理的干或祖细胞以治疗或预防疾病或病症。在一个实施方案中，疾病或病症是脊髓发育不良综合症(MDS)。在另一个实施方案中，疾病或病症是骨髓增生性疾病(MPD)。在另一个实施方案中，在移植前、移植期间和/或移植后也给需要移植的患者施用本发明的化合物。
本发明进一步包括由本发明的方法产生的祖细胞或特定细胞类型的用途。换言之，本发明包括由造血祖代细胞分化制备得到的白细胞的用途，无论是否利用本发明的化合物控制或调节所述祖代细胞的分化。
在其他的实施方案中，本发明包括通过对需要其的患者施用干细胞和本发明的小分子化合物而体内控制或调节干细胞。
在其他的实施方案中，本发明包括处理干细胞的方法，包括将干细胞与调节JNK或MKK活性的化合物接触足够的时间以影响所述的调节。在具体的实施方案中，所述的处理是在深低温保藏和解冻后进行的，以抵消深低温保藏和暴露于深低温保藏剂对干细胞的有害效应。在某些实施方案中，本发明提供在深低温保藏和解冻后处理干细胞的方法，以抵消暴露于深低温保藏剂(例如，DMSO)对干细胞增殖和迁移能力的有害效应。尽管本发明指向人细胞的分化，但本发明不包括克隆人类或其他哺乳动物。
本发明也提供用于治疗骨髓增生异常或脊髓发育不良综合症的方法，包括对需要其的患者施用有效量的JNK抑制剂或MKK抑制剂或两者皆是。在某些实施方案中，骨髓增生性疾病是原发性多血症；原发性血小板增多症；慢性粒性白血病；急性或慢性的粒细胞白血病；急性或慢性的单核细胞性白血病；骨髓纤维-红白血病；或原因不明的骨髓组织异生。
本发明也提供用于治疗或预防与骨髓增生性疾病相关的症状的方法，包括对需要其的患者施用有效量的JNK抑制剂或MKK抑制剂。在具体的实施方案中，异常是伴随血液的一种或多种有形元件过量产生的多潜能造血祖细胞的无性系扩展，费城染色体或bcr-abl基因的存在，外周血涂片上的泪珠状红细胞畸形，白幼红细胞血像，巨大的异常血小板，具有网状或胶原纤维化的细胞过多的骨髓或具有低百分数的前髓细胞和胚细胞的显著左偏移的骨髓系列。
本发明也提供用于治疗或预防脊髓发育不良综合症的方法，包括对需要其的患者施用有效量的JNK抑制剂或MKK抑制剂。在具体的实施方案中，脊髓发育不良综合症是难治性贫血、具有环状成高铁红细胞的难治性贫血、具有过量胚细胞的难治性贫血、具有转化中的过量胚细胞的难治性贫血、白血病前期或慢性的骨髓单核细胞白血病。本发明进一步提供用于治疗或预防脊髓发育不良综合症的症状的方法，包括对需要其的患者施用有效量的JNK抑制剂或MKK抑制剂。在具体的实施方案中，症状是贫血症、血小板减少症、嗜中性白细胞减少症、双血细胞减少症或全血细胞减少症。
3.1.定义
如在此所使用的，术语“患者”是指动物(例如，牛、马、羊、猪、鸡、火鸡、鹌鹑、猫、狗、小鼠、大鼠、兔或豚鼠)，优选为哺乳动物，例如非灵长类和灵长类(例如猴子和人)，最优选地为人。
“烷基”是指具有1-10个碳原子的饱和的直链或支链的非环烃。如上述所定义的，“低级烷基”是指具有1-4个碳原子的烷基。代表性的饱和直链烷基包括-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基和-正癸基；同时饱和的支链烷基包括-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2-甲基己基、3-甲基己基4-甲基己基、5-甲基己基、2，3-二甲基丁基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、2，3-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2，2-二甲基戊基、2，2-二甲基己基、3，3-二甲基戊基、3，3-二甲基己基、4，4-二甲基己基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、2-甲基-4-乙基戊基、2-甲基-2乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2-甲基-4-乙基己基、2，2-二乙基戊基、3，3-二乙基己基、2，2-二乙基己基、3，3-二乙基己基等。
“链烯基”或“亚烷基”是指具有2-10个碳原子并且包括至少一个碳-碳双键的直链或支链的非环烃。代表性的直链和支链的(C2-C10)链烯基包括-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-异丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2，3-二甲基-2-丁烯基、-1-己烯基、-2-己烯基、-3-己烯基、-1-庚烯基、-2-庚烯基、-3-庚烯基、-1-辛烯基、-2-辛烯基、-3-辛烯基、-1-壬烯基、-2-壬烯基、-3-壬烯基、-1-癸烯基、-2-癸烯基、-3-癸烯基等。链烯基可以是未取代或取代的。“环状亚烷基”是具有3-8个碳原子并且包括至少一个碳-碳双键的环，其中该环可具有1-3个杂原子。
“炔基”是指具有2-10个碳原子并且包括至少一个碳-碳三键的直链或支链的非环烃。代表性的直链和支链的-(C2-C10)炔基包括-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1丁炔基、-4-戊炔基、-1-己炔基、-2-己炔基、-5-己炔基、-1-庚炔基、-2-庚炔基、-6-庚炔基、-1-辛炔基、-2-辛炔基、-7-辛炔基、-1-壬炔基、-2-壬炔基、-8-壬炔基、、-1-癸炔基、-2-癸炔基、-9-癸炔基等。炔基可以是未取代或取代的。
术语“卤素”和“卤”是指氟、氯、溴或碘。
“卤代烷基”是指被一个或多个卤素原子取代的烷基，其中烷基是如上述所定义的。
“酮”是指羰基(即，C＝O)。
“酰基”是指-C(O)烷基，其中烷基如上述所定义，包括-C(O)CH3、-C(O)CH2CH3、-C(O)(CH2)2CH3、-C(O)(CH2)3CH3、-C(O)(CH2)4CH3、-C(O)(CH2)5CH3等。
“酰氧基”是指-OC(O)烷基，其中烷基如上述所定义，包括-OC(O)CH3、-OC(O)CH2CH3、-OC(O)(CH2)2CH3、-OC(O)(CH2)3CH3、-OC(O)(CH2)4CH3、-OC(O)(CH2)5CH3等。
“酯”或“烷氧基烷氧基”是指-C(O)O烷基，其中烷基如上述所定义，包括-C(O)OCH3、-C(O)OCH2CH3、-C(O)O(CH2)2CH3、-C(O)O(CH2)3CH3、-C(O)O(CH2)4CH3、-C(O)O(CH2)5CH3等。
“烷氧基”是指-O-(烷基)，其中烷基是上述定义的，包括-OCH3、-OCH2CH3、-O(CH2)2CH3、-O(CH2)3CH3、-O(CH2)4CH3、-O(CH2)5CH3等。
“低级烷氧基”是指-O-(低级烷基)，其中低级烷基是如上所描述的。
“烷氧羰基”是指-C(＝O)O-(烷基)，其中烷基是上述定义的，包括-C(＝O)O-CH3，-C(＝O)O-CH2CH3，-C(＝O)O-(CH2)2CH3，-C(＝O)O-(CH2)3CH3，-C(＝O)O-(CH2)4CH3，-C(＝O)O-(CH2)5CH3等。
“烷氧羰基烷基”是指-(烷基)-C(＝O)O-(烷基)，其中各个烷基是如上述独立定义的，包括-CH2-C(＝O)O-CH3，-CH2-C(＝O)O-CH2CH3，-CH2-C(＝O)O-(CH2)2CH3，-CH2-C(＝O)O-(CH2)3CH3，-CH2-C(＝O)O-(CH2)4CH3，-CH2-C(＝O)O-(CH2)5CH3等。
“烷氧基烷基”是指-(烷基)-O-(烷基)，其中各个烷基是如上述独立定义的烷基，包括-CH2OCH3，-CH2OCH2CH3，-(CH2)2OCH2CH3，-(CH2)2O(CH2)2CH3等。
“芳基”是指包含5-10个环原子的碳环芳基。代表性的实例包括但不限于苯基、甲苯基、蒽基、芴基、茚基、薁基、吡啶基和萘基，以及包括5，6，7，8-四氢化萘基的苯并稠合的碳环部分。碳环的芳基可以是未取代或取代的。在一个实施方案中，碳环的芳基是苯基。
“芳氧基”是指-O-芳基，其中芳基是如上述定义的。芳氧基可以是未取代或取代的。在一个实施方案中，芳氧基的芳基环是苯基。
“芳烷基”是指-(烷基)-(芳基)，其中烷基和芳基是如上述定义的，包括-(CH2)苯基，-(CH2)2苯基，-(CH2)3苯基，-CH(苯基)2，-CH(苯基)3，-(CH2)甲苯基，-(CH2)蒽基，-(CH2)芴基，-(CH2)茚基，-(CH2)薁基，-(CH2)吡啶基，-(CH2)萘基等。
“芳烷氧基”是指-O-(烷基)-(芳基)，其中烷基和芳基是上述定义的，包括-O-(CH2)2苯基，-O-(CH2)3苯基-O-CH(苯基)2，-O-CH(苯基)3，-O-(CH2)甲苯基，-O-(CH2)蒽基，-O-(CH2)芴基，-O-(CH2)茚基，-O-(CH2)薁基，-O-(CH2)吡啶基，-O-(CH2)萘基等。
“芳氧基烷基”是指-(烷基)-O-(芳基)，其中烷基和芳基是上述定义的，包括-CH2-O-(苯基)，-(CH2)2-O-苯基，(CH2)3-O-苯基，-(CH2)-O-甲苯基，-(CH2)-O-蒽基，-(CH2)-O-芴基，-(CH2)-O-茚基，-(CH2)-O-薁基，-(CH2)-O-吡啶基，-(CH2)-O-萘基等。
“环烷基”是指具有碳和氢原子并且没有碳-碳多重键的单环或多环的饱和环。环烷基的实例包括但不限于(C3-C7)环烷基，包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基，以及饱和环状的和双环的萜烯。环烷基可以是未取代或取代的。在一个实施方案中，环烷基是单环或二环的环。
“环烷氧基”是指-O-(环烷基)，其中环烷基是上述定义的，包括-O-环丙基，-O-环丁基，-O-环戊基，-O-环己基，-O-环庚基等。
“环烷基烷氧基”是指-O-(烷基)-(环烷基)，其中环烷基和烷基是上述定义的，包括-O-CH2-环丙基，-O-(CH2)2-环丙基，-O-(CH2)3-环丙基，-O-(CH2)4-环丙基，O-CH2-环丁基，O-CH2-环戊基，O-CH2-环己基，O-CH2-环庚基等。
“氨基烷氧基”是指-O-(烷基)-NH2，其中烷基是上述定义的，例如-O-CH2-NH2，-O-(CH2)2-NH2，-O-(CH2)3-NH2，-O-(CH2)4-NH2，-O-(CH2)5-NH2等。
“单烷基氨基”是指-NH(烷基)，其中烷基是上述定义的，例如-NHCH3，-NHCH2CH3，-NH(CH2)2CH3，-NH(CH2)3CH3，-NH(CH2)4CH3，-NH(CH2)5CH3等。
“二烷基氨基”指-N(烷基)(烷基)，其中各个烷基是如上述独立定义的烷基，包括-N(CH3)2，-N(CH2CH3)2，-N((CH2)2CH3)2，-N(CH3)CH2CH3)等。
“单烷基氨基烷氧基”指-O-(烷基)-NH(烷基)，其中各个烷基是如上述独立定义的烷基，包括-O-(CH2)-NHCH3，-O-(CH2)-NHCH2CH3，-O-(CH2)-NH(CH2)2CH3，-O-(CH2)-NH(CH2)3CH3，-O-(CH2)-NH(CH2)4CH3，-O-(CH2)-NH(CH2)5CH3，-O-(CH2)2-NHCH3等。
“二烷基氨基烷氧基”指-O-(烷基)-N(烷基)(烷基)，其中各个烷基是如上述独立定义的烷基，包括-O-(CH2)-N(CH3)2，-O-(CH2)-N(CH2CH3)2，-O-(CH2)-N((CH2)2CH3)2，-O-(CH2)-N(CH3)(CH2CH3)等。
“芳基氨基”指-NH(芳基)，其中芳基是上述定义的，包括-NH(苯基)，-NH(甲苯基)，-NH(蒽基)，-NH(芴基)，-NH(茚基)，-NH(薁基)，-NH(吡啶基)，-NH(萘基)等。
“芳烷基氨基”指-NH-(烷基)-(芳基)，其中烷基和芳基是上述定义的，包括-NH-(CH2)-(苯基)，-NH-CH2-(甲苯基)，-NH-CH2-(蒽基)，-NH-CH2-(芴基)，-NH-CH2-(茚基)，-NH-CH2-(薁基)，-NH-CH2-(吡啶基)，-NH-CH2-(萘基)，-NH-(CH2)2-(苯基)等。
“烷基氨基”指如上述所定义的单烷基氨基或二烷基氨基，例如-NH(烷基)，其中各个烷基独立地是如上述所定义的烷基，包括-NHCH3，-NHCH2CH3，-NH(CH2)2CH3，-NH(CH2)3CH3，-NH(CH2)4CH3，-NH(CH2)5CH3，和-N烷基)(烷基)，其中各个烷基独立地如上述所定义的烷基，包括-N(CH3)2，-N(CH2CH3)2，-N((CH2)2CH3)2，-N(CH3)(CH2CH3)等。
“环烷基氨基”指NH-(环烷基)，其中环烷基是如上述所定义的，包括-NH-环丙基，-NH-环丁基，-NH-环戊基，-NH-环己基，-NH-环庚基等。
“羧”和“羧基”指-COOH。
“环烷基烷基氨基”指-NH-(烷基)-(环烷基)，其中烷基和环烷基是上述定义的，包括-NH-CH2-环丙基，-NH-CH2-环丁基，-NH-CH2-环戊基，-NH-CH2-环己基，-NH-CH2-环庚基，-NH-(CH2)2-环丙基等。
“氨基烷基”指-(烷基)-NH2，其中烷基是上述定义的，包括CH2-NH2，-(CH2)2-NH2，-(CH2)3-NH2，-(CH2)4-NH2，-(CH2)5-NH2等。
“单烷基氨基烷基”指-(烷基)-NH(烷基)，其中各个烷基独立地是上述所定义的烷基，包括-CH2-NH-CH3，-CH2-NHCH2CH3，-CH2-NH(CH2)2CH3，-CH2-NH(CH2)3CH3，-CH2-NH(CH2)4CH3，-CH2-NH(CH2)5CH3，-(CH2)2-NH-CH3等。
“二烷基氨基烷基”指-(烷基)-N(烷基)(烷基)，其中各个烷基独立地是上述定义的烷基，包括-CH2-N(CH3)2，-CH2-N(CH2CH3)2，-CH2-N((CH2)2CH3)2，-CH2-N(CH3)(CH2CH3)，-(CH2)2-N(CH3)2等。
“杂芳基”指5-10元并具有至少1个选自氮、氧和硫的杂原子，以及包含至少1个碳原子，包括单和双环系统的芳族杂环的环。代表性的杂芳基是三唑基、四唑基、噁二唑基、吡啶基、呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、喹啉基、吡咯基、吲哚基、噁唑基、苯并噁唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、噌啉基、2，3-二氮杂萘基、喹唑啉基、嘧啶基、氧杂环丁烷基、氮杂基、哌嗪基、吗啉基、二噁烷基、硫杂环丁烷基和噁唑基。
“杂芳基烷基”指-(烷基)-(杂芳基)，其中烷基和杂芳基是上述定义的，包括-CH2-三唑基，-CH2-四唑基，-CH2-噁二唑基，-CH2-吡啶基，-CH2-呋喃基，-CH2-苯并呋喃基，-CH2-噻吩基，-CH2-苯并噻吩基，-CH2-喹啉基，-CH2-吡咯基，-CH2-吲哚基，-CH2-噁唑基，-CH2-苯并噁唑基，-CH2-咪唑基，-CH2-苯并咪唑基，-CH2-噻唑基，-CH2-苯并噻唑基，-CH2-异噁唑基，-CH2-吡唑基，-CH2-异噻唑基，-CH2-哒嗪基，-CH2-嘧啶基，-CH2-吡嗪基，-CH2-三嗪基，-CH2-噌啉基，-CH2-2，3-二氮杂萘基，-CH2-喹唑啉基，-CH2-嘧啶基，-CH2-氧杂环丁烷基，-CH2-氮杂基，-CH2-哌嗪基，-CH2-吗啉基，-CH2-二噁烷基，-CH2-硫杂环丁烷基，-CH2-噁唑基，-(CH2)2-三唑基等。
“杂环”指饱和、不饱和的5-7元单环的、或7-10元双环的杂环，其包含1-4个独立地选自氮、氧和硫的杂原子，并且其中氮和硫杂原子可任选地是氧化的，而氮杂原子可任选地是季铵化的，包括其中任何上述杂环与苯环稠合的双环。杂环可通过任何杂原子或碳原子连接。杂环包括如上所定义的杂芳基。代表性的杂环包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、乙内酰脲基、戊内酰胺基、氧杂环丙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基等。
“与苯基稠合的杂环”指在苯基环的2个相邻的碳原子处与苯环连接的杂环，其中杂环如上述定义。
“杂环烷基”指-(烷基)-(杂环)，其中烷基和杂环如上述定义，包括-CH2-吗啉基，-CH2-吡咯烷酮基，-CH2-吡咯烷基，-CH2-哌啶基，-CH2-乙内酰脲基，-CH2-戊内酰胺基，-CH2-环氧乙烷基，-CH2-氧杂环丁烷基，-CH2-四氢呋喃基，-CH2-四氢吡喃基，-CH2-四氢吡啶基，-CH2-四氢嘧啶基，-CH2-四氢噻吩基，-CH2-四氢噻喃基，-CH2-四氢嘧啶基，-CH2-四氢噻吩基，-CH2-四氢噻喃基等。
如在此所使用的术语“取代的”指上述任何基团(即，芳基、芳烷基、杂环和杂环烷基)，其中被取代部分的至少一个氢原子被取代基替换。在一个实施方案中，被取代基团的各个碳原子被不超过2个的取代基替换。在另一个实施方案中，被取代基团的各个碳原子被不超过1个的取代基替换。就酮取代基来说，2个氢原子被一个氧取代，后者通过双键与碳原子连接。取代基包括卤素、羟基、烷基、卤代烷基、单或二取代的氨基烷基、烷氧基烷基、芳基芳烷基、杂环、杂环烷基、-NRaRb、-NRaC(＝O)Rb、-NRaC(＝O)NRaRb、-NRaC(＝O)ORb-NRaSO2Rb、-ORa、-C(＝O)RaC(＝O)ORa-C(＝O)NRaRb、-OC(＝O)Ra、-OC(＝O)ORa、-OC(＝O)NRaRb-NRaSO2Rb，或化学式-Y-Z-Ra的基团，其中Y是亚烷基，或直接的键，Z是-O-，-S-，-N(Rb)-，-C(＝O)-，-C-(-＝O)O-，-OC(＝O)-，-N(Rb)C(＝O)-，-C(＝O)N(Rb)-或直接的键，其中Ra和Rb是相同或不同的，并且独立地为氢、氨基、烷基、卤代烷基、芳基、芳烷基、杂环、或杂环烷基，或其中Ra和Rb与氮原子结合在一起，从而结合形成杂环。
“卤代烷基”指具有一个或多个被卤素取代的氢原子的烷基，其中烷基如上述定义为，其中卤素如上述定义，包括-CF3，-CHF2，-CH2F，-CBr3，-CHBr2，-CH2Br，-CCl3，-CHCl2，-CH2Cl，-CI3，-CHI2，-CH2I，-CH2-CF3，-CH2-CHF2，CH2-CH2F，-CH2-CBr3，-CH2-CHBr2，-CH2-CH2Br，-CH2-CCl3，-CH2-CHCl2，-CH2-CH2Cl，-CH2-CI3，-CH2-CHI2，-CH2-CH2I等。
“羟基烷基”指具有一个或多个被羟基取代的氢原子的烷基，其中烷基如上述定义，包括-CH2OH，-CH2CH2OH，-(CH2)2CH2OH，-(CH2)3CH2OH，-(CH2)4CH2OH，-(CH2)5CH2OH，-CH(OH)-CH3，-CH2CH(OH)CH3等。
“羟基”指-OH。
“磺酰基”指-SO3H。
“磺酰烷基”指-SO2-(烷基)，其中烷基如上述定义，包括-SO2-CH3，-SO2-CH2CH3，-SO2-(CH2)2CH3，-SO2-(CH2)3CH3，-SO2-(CH2)4CH3，-SO2-CH2)5CH3等。
“亚磺酰烷基”指-SO-(烷基)，其中烷基如上述定义，包括-SO-CH3，-SO-CH2CH3，-SO-(CH2)2CH3，-SO-(CH2)3CH3，-SO-(CH2)4CH3，-SO-(CH2)5CH3等。
“磺酰氨基烷基”指-NHSO2-(烷基)，其中烷基如上述定义，包括-NHSO2-CH3，-NHSO2-CH2CH3，-NHSO2-(CH2)2CH3，-NHSO2-(CH2)3CH3，-NHSO2-(CH2)4CH3，-NHSO2-(CH2)5CH3等。
“硫代烷基”指-S-(烷基)，其中烷基如上述定义，包括-S-CH3，-SCH2CH3，-S-(CH2)2CH3，-S-(CH2)3CH3，-S-(CH2)4CH3，-S-(CH2)5CH3等。
当“有效量”用于与JNK抑制剂或MKK抑制剂相关时，它是JNK或MKK抑制剂用于治疗或预防MDS、MPD或用于调节干细胞或祖细胞分化的数量。
短语“JNK的调节”或“通过调节JNK”指产生由JNK1、JNK2，和JNK3基因表达的，通称为c-Jun N-末端激酶(JNK)和其所有同工型的蛋白质的可识别抑制或活化，优选为抑制(Hibi等人，1993，GenesDev.7：2135-2148；Mohit等人，1995，神经元Neuron14：67-78；Gupta等人，1996，EMBO J.15：2760-2770)。JNK的调节可在mRNA水平、蛋白质水平和激酶活性的水平实现。如此调节JNK活性的化合物在此归为“JNK调节剂”。
“JNK”指由JNK1、JNK2和JNK3基因表达的蛋白质和其所有同工型(Gupta等人，1996，EMBO J.15：2760-2770)，包括但不限于JNK1、JNK2和JNK3多肽(Hibi等人，1993，Genes Dev.7：2135-2148；Mohit等人，1995，神经元Neuron14：67-75)。
“JNK抑制剂”或“JNK的抑制剂”指能够在体外或体内可检测地抑制JNK活性的化合物。JNK抑制剂可以是药物学上可接受的盐、游离碱、溶剂化物、水合物、立体异构体、包合物或其前体药物的形式。这种抑制活性可通过本领域众所周知的分析或动物模型确定。在一个实施方案中，JNK抑制剂是结构(I)-(III)的化合物或其药物学上可接受的盐、游离碱、溶剂化物、水合物、立体异构体、包合物、多形体或前体药物(参见第4.3节)。抑制可能是直接或间接的；优选抑制是直接的。在某些实施方案中，JNK的抑制剂或JNK途径的另一个成分可抑制上游或下游。
“JNK途径”指对JNK活性具有直接或间接效应的任何生物分子。
短语“MKK的调节”或“通过调节MKK”指由MKK基因表达的，通称为促分裂原活化蛋白激酶-激酶(MKK)和其所有同工型的蛋白质的可识别的抑制或活化，优选为抑制。如此调节MKK活性的化合物在此归为“MKK调节剂”。
“MKK”指由MKK基因表达的蛋白质和其所有同工型。
“MKK抑制剂”或“MKK的抑制剂”指能够可检测地体外或体内抑制MKK活性的化合物。MKK抑制剂可以是药物学上可接受的盐、游离碱、溶剂化物、水合物、立体异构体、包合物或其前体药物的形式。这种抑制的活性可通过本领域众所周知的分析或动物模型确定。在一个实施方案中，MKK抑制剂是结构(I)-(III)的化合物或其药物学上可接受的盐、游离碱、溶剂化物、水合物、立体异构体、包合物、多形体或前体药物。抑制可能是直接或间接的；优选抑制是直接的。在某些实施方案中，MKK的抑制剂或JNK途径的另一个成分可抑制上游或下游。
“MKK途径”指对MKK活性具有直接或间接影响的任何生物分子。
“直接抑制”指JNK或MKK抑制剂直接地与JNK或MKK相互作用。
“间接抑制”指JNK或MKK抑制剂通过与除了JNK或MKK外的JNK或MKK途径的成分相互作用来阻断、减少或延迟JNK或MKK活性。
如在此所使用的，术语“生物反应器”指用于增殖细胞、产生或表达生物材料以及生长或培养细胞组织、细胞器、病毒、蛋白质、多核苷酸和微生物的来自体内的系统。
如在此所使用的，术语“胚胎干细胞”指来源于胚囊内细胞群的细胞(例如，4-5天的人胚胎)并且是多潜能的。
如在此所使用的，术语“胚胎样的干细胞”指不是来源于胚囊内细胞群的细胞。如在此所使用的，“胚胎样干细胞”也可称为“胎盘干细胞”。胚胎样干细胞优选是多潜能的。然而，可能从胎盘，包括胚胎样干细胞、多潜能细胞和定向祖细胞获得干细胞。根据本发明的方法，一旦已经对胎盘放血并且灌流足以除去残余细胞的时间后，可从分离的胎盘收集来源于胎盘的胚胎样干细胞。
如在此所使用的，当相对于胎盘使用术语“放血的”或“放血法”时，指以任何方式从胎盘除去和/或基本上排干所有的脐带血。
如在此所使用的，术语“灌流”或“灌流法”指灌注或使液体流过或通过器官或组织，优选地用足够的力或压力使液体通过器官或组织以除去任何残余的细胞，例如来自器官或组织的非附着细胞。如在此所使用的，术语“灌注液”指在使液体通过器官或组织后收集的液体。在优选的实施方案中，灌注液包含一种或多种抗凝剂。
如在此所使用的，术语“多能细胞”指能够生长为哺乳动物体的大约260种细胞类型的任何亚型的细胞。不同于多潜能的细胞，多能细胞不具有形成所有细胞类型的能力。
如在此所使用的，术语“祖细胞”指定向分化为细胞的特定类型或形成组织的特定类型的细胞。
如在此所使用的，术语“干细胞”指可不确定地再生以形成组织和器官的特化细胞的主要细胞。干细胞是在发育上多潜能或多能的细胞。干细胞可分裂产生2个子代干细胞，或1个子代干细胞和1个祖代(“转变的”)细胞，然后其增殖成为组织的成熟的完全成形的细胞。
如在此所使用的，术语“全能细胞”指能够形成完整胚胎的细胞(例如，胚囊)。
如在此所使用的，当术语“暴露”用于将细胞暴露于药物的范围或反之亦然时，它包括将细胞与药物接触或反之亦然。
如在此所使用的，术语“药物学上可接受的盐”指从药物学上可接受的无毒的酸或碱，包括无机酸和碱以及有机酸和碱制备的盐。用于本发明化合物的合适的药物学上可接受的碱添加盐包括但不限于，由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制成的金属盐或由赖氨酸、N，N′-二苄乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)和普鲁卡因制成的有机盐。合适的无毒的酸包括但不限于，无机和有机酸，例如乙酸、藻朊酸、邻氨基苯甲酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、亚乙基磺酸、甲酸、反丁烯二酸、糠酸、半乳糖醛酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、乙二醇酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、苯乙醇酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、双羟萘酸、泛酸、苯乙酸、磷酸、丙酸、水杨酸、硬脂酸、琥珀酸、磺胺酸、硫磺酸、酒石酸，和对甲苯磺酸。特异的无毒的酸包括盐酸、氢溴酸、磷酸、硫磺酸和甲磺酸。因而特异的盐的实例包括盐酸盐和甲磺酸盐。其他盐是本领域公知的，参见例如，REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，第十八版，Mack Publishing，Easton，宾夕法尼亚(1990)或REMINGTON：THE SCIENCE ANDPRACTICE OF PHARMACY，第19版，Mack Publishing，Easton，宾夕法尼亚(1995)。
如在此所使用的并且除非另有指明，术语“多形体”指JNK抑制剂的不同晶体排列。多形体可通过使用不同的作用条件和/或溶剂获得。特别地，多形体可通过在特别的溶剂中重结晶JNK抑制剂而制备。
如在此所使用的并且除非另有指明，术语“前体药物”指可水解、氧化，或其它在生物条件(体外或体内)下起作用以提供活性化合物的，特别为本发明化合物的衍生物。前体药物的实例包括但不限于，本发明化合物的衍生物和代谢物，包括可生物水解部分，例如可生物水解的酰胺、可生物水解的酯、可生物水解的氨基甲酸盐、可生物水解的碳酸盐、可生物水解的酰脲和可生物水解的磷酸盐类似物。优选地，具有羧基功能性基团的化合物的前体药物是羧酸的低级烷基酯。羧酸酯是通过酯化存在于分子上的任何羧酸部分而便利地形成的。前体药物一般可利用众所周知的方法制备，例如由Burger′s MedicinalChemistry and Drug Discovery第六版(Donald J.Abraham编辑，2001，Wiley)以及前体药物的设计和应用Design and Application ofProdrugs(H.Bundgaard编辑，1985，Harwood Academic PublishersGmfh)所描述的方法。
如在此所使用的并且除非另有指明，术语“旋光纯的”或“立体纯的”指化合物的一种立体异构体是基本上不含该化合物的其他立体异构体的。例如，具有一个手性中心的立体纯的化合物可能基本上不含该化合物的相反对映体。例如，具有2个手性中心的立体纯的化合物可能基本上不含该化合物的其他非对映异构体。一般立体纯的化合物包括大于大约80％重量的化合物的一种立体异构体，并且包含小于大约20％重量的该化合物的其他立体异构体，更优选地包含大于大约90％重量的该化合物的一种立体异构体，并且小于大约10％重量的该化合物的其他立体异构体，更优选地包含大于大约95％重量的该化合物的一种立体异构体，并且包含小于大约5％重量的该化合物的其他立体异构体，以及最优选地包含大于大约97％重量的该化合物的一种立体异构体，并且包含小于大约3％重量的该化合物的其他立体异构体。
4.发明详述
本发明包括调节干细胞或祖细胞的增殖和/或分化的方法，包括将细胞接触有效量的JNK或MKK抑制剂。在一个实施方案中，本发明涉及在适于干细胞或祖细胞分化的条件下，将干细胞或祖细胞接触有效量的JNK或MKK调节剂，从而产生控制干或祖细胞分化的可调节手段。在特定优选的实施方案中，调节剂是JNK或MKK抑制剂。在另一个特定的实施方案中，干细胞选自胚胎干细胞、胎盘干细胞、成人干细胞、脐血细胞、外周血细胞和骨髓细胞。在另一个具体的实施方案中，干细胞是人干细胞。在另一个具体的实施方案中，化合物是吲唑、苯胺基嘧啶、异噻唑并蒽酮、异噁唑并蒽酮、异吲哚并蒽酮或吡唑并蒽酮。在另一个具体的实施方案中，接触步骤是在体外进行的。在另一个具体的实施方案中，接触步骤是在体内进行的。在另一个具体的实施方案中，化合物的浓度为0.005μg/ml-5mg/ml。在另一个具体的实施方案中，化合物的浓度为1μg/ml-2mg/ml。
在其他的实施方案中，本发明的方法包括调节体内干或祖细胞的分化，包括将化合物递送给作为未调理的干细胞的受体的受试个体，然后对该受试个体直接施用化合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及控制干细胞或祖细胞分化的方法，包括将细胞暴露于有效量的JNK或MKK抑制剂。在另一个实施方案中，本发明涉及将干细胞或祖细胞暴露于JNK或MKK抑制剂，产生控制干或祖细胞分化成为祖细胞的特定群体或祖细胞分化成为特定细胞类型的可调节手段。
在另一个实施方案中，将干或祖细胞暴露于有效量的JNK或MKK抑制剂，导致造血细胞特定群体的可调节分化和扩展，包括CD34+和CD38+细胞。进一步地，将造血祖细胞暴露于有效量的JNK或MKK抑制剂导致特定的细胞类型的可调节分化和扩展。
本发明提供调节人干细胞分化的方法。特别地，本发明提供使用具有抑制JNK或MKK活性的有机小分子调节干细胞或祖细胞群体沿着特定的细胞和组织谱系分化的方法。
进一步地，本发明包括生产用于移植到哺乳动物中的造血细胞的方法，包括将造血祖细胞暴露于JNK或MKK抑制剂或拮抗剂，其中抑制剂或拮抗剂是小分子。
因此，在一个实施方案中，本发明提供生产造血细胞的方法，包括将哺乳动物干细胞细胞在适合于该干细胞分化的条件下接触抑制JNK或MKK活性的化合物，其中所述的分化导致造血细胞的产生。在具体的实施方案中，干细胞选自胚胎干细胞、胎盘干细胞、成人干细胞、脐血细胞、外周血细胞和骨髓细胞。在另一个具体的实施方案中，干细胞是人干细胞。在另一个具体的实施方案中，化合物是吲唑、苯胺基嘧啶、异噻唑并蒽酮、异噁唑并蒽酮、异吲哚并蒽酮或吡唑并蒽酮。在另一具体的实施方案中，接触步骤是体外进行的。在其他具体的实施方案中，化合物的浓度为0.005μg/ml-5mg/ml，或为1μg/ml-2mg/ml。在另一个具体的实施方案中，所述的造血细胞是造血祖细胞。
可与本发明联合使用的小分子化合物的实例包括但不限于，抑制JNK或MKK活性的化合物。在一个实施方案中，JNK或MKK的抑制剂是能够直接抑制JNK或MKK活性的小的有机化合物。在另一个实施方案中，JNK或MKK的抑制剂抑制JNK或MKK途径的另一个成分，因而抑制JNK或MKK活性。在一个实施方案中，化合物不是多肽、肽、蛋白质、激素、细胞因子、寡核苷酸、核酸或其他的大分子。优选地，化合物的分子量小于1000克/摩尔。这种化合物包括但不限于吲唑、苯胺基嘧啶、异噻唑并蒽酮、异噁唑并蒽酮、异吲哚并蒽酮、吡唑并蒽酮及其盐、溶剂化物、异构体、包合物、前体药物、水合物或衍生物。优选地，JNK或MKK的抑制剂是在第4.3节或下文公开的一种化合物，或其药物学上可接受的盐、游离碱、溶剂化物、水合物、立体异构体、包合物或前体药物。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括调节干细胞分化成为特定的细胞谱系，包括但不限于间质的、造血的、产生脂肪的、生成肝组织的、神经原的、生成神经胶质的、形成软骨的、生成血管的、生肌的、形成软骨的或成骨的谱系，包括将祖细胞或干细胞与本发明的化合物一起培养，优选在体外培养足够的一段时间以导致细胞分化成为所需要的细胞谱系的细胞。在具体的实施方案中，干或祖细胞分化成为造血谱系的细胞是受调节的。特别地，本发明的方法可用于调节血细胞群落世代以剂量应答的方式从CD34+、CD133+和CD45+造血祖细胞产生。
可根据本发明的方法使用任何哺乳动物的干细胞，包括但不限于分离自脐带血(“CB”细胞)、胎盘和其他来源的干细胞。干细胞可包括多潜能的细胞，即具有完全的分化多面性，自我更新并可在组织内保持体眠或静止的细胞。干细胞也可包括多能细胞或定型祖细胞。在一个优选的实施方案中，本发明利用的干细胞是有生存力的、休眠的、存在于足月胎盘内并且可以在顺利分娩和胎盘排出、放血和灌流后被回收的多潜能干细胞，其可导致回收多能和多潜能的干细胞。
在本发明一个特别的实施方案中，将内源于胎盘的细胞，包括但不限于，胚胎样干细胞、祖细胞、多潜能细胞和多能细胞，暴露于本发明的化合物并且同时在分离和灌流的胎盘中培养以诱导分化。可收集在产后灌流的胎盘中增殖的内源细胞，和/或从灌注液、培养基或胎盘细胞本身回收生物活性物质分子。备选地，外源细胞可在分娩后的胎盘中增殖。将外源细胞接触本发明的化合物并且在所需要的时间以与用于内源胎盘细胞所描述的相同方式从胎盘收集。同样地，分娩后胎盘所包含的，接触本发明化合物的细胞可能包括内源和外源细胞的嵌合体。
在本发明的另一个实施方案中，将来源于除了产后胎盘来源的干或祖细胞暴露于本发明的化合物，并且在2或3维的培养条件下体外培养以诱导分化。因此，本发明包括用于分化哺乳动物干细胞成为特定祖细胞的方法，包括在存在本发明的化合物时，在适于所需要分化的条件和/或培养基下分化干细胞。
进一步地，本发明包括用于调节或控制特定的祖细胞群分化成为特定细胞类型的方法，包括在适于所说的分化的条件下和存在本发明的一种或多种化合物时分化所述的祖细胞。备选地，可将干或祖细胞暴露于本发明的化合物并且随后利用合适的条件分化该细胞。适宜条件的实例包括补充有人血清和细胞培养物基质的培养基配方，例如补充有生长因子的MATRIGEL。
本发明包括在待治疗的患者中在体内调节干或祖细胞。因此，本发明的一种或多种JNK或MKK抑制性化合物可对患者单独或组合给药。在各种实施方案中，这种化合物可同时或顺序地与例如干或祖细胞组合施用，其中该干或祖细胞的分化已经利用一种或多种本发明的化合物进行调节；与处理的干或祖细胞和未处理的干或祖细胞组合施用；与脐血组合施用；与处理的干或祖细胞加上脐血组合施用。化合物和任何处理的或未处理的细胞可同时或分别地施用；在后者的情况中，可首先施用细胞或化合物。
在具体的实施方案中，本发明提供使用JNK或MKK抑制剂在造血祖代的预移植调理的前后过程中调节和控制造血作用的方法。
本发明也提供用于处理干或祖细胞的方法，包括将干或祖细胞与JNK或MKK调节剂接触足够的一段时间以进行干细胞或祖细胞分化的可检测调节。在具体的实施方案中，所述的JNK或MKK调节剂是JNK或MKK抑制剂。在具体的实施方案中，所述的接触可在收集干细胞或祖细胞后，或在干或祖细胞已经冷藏并解冻后立即进行。本发明也提供使用JNK或MKK调节剂，例如JNK或MKK抑制剂，在造血祖代自体内调理的前后过程中控制造血作用的方法。
本发明的方法包括体外调节干或祖细胞的分化，包括将干或祖细胞与化合物一起体外培养，然后将分化的细胞直接移植给受试个体。这种调节也可体内发生，例如，通过单独或与干或祖细胞联合来定位递送一种或多种本发明的化合物。
在移植方法的具体实施方案中，干细胞选自胚胎干细胞、胎盘干细胞、成人干细胞、脐血细胞、外周血细胞和骨髓细胞。在另一个具体的实施方案中，干细胞是人干细胞。在另一个具体的实施方案中，化合物是吲唑、苯胺基嘧啶、异噻唑并蒽酮、异噁唑并蒽酮、异吲哚并蒽酮或吡唑并蒽酮。在另一个具体的实施方案中，接触步骤是在体外进行的。在另一个具体的实施方案中，化合物的浓度为0.005μg/ml-5mg/ml。在另一个具体的实施方案中，化合物的浓度为1μg/ml-2mg/ml。
本发明也包括通过对需要其的患者施用干细胞或祖细胞和本发明的化合物来体内控制或调节干或祖细胞。本发明进一步包括移植已经用JNK或MKK抑制剂预先处理的干或祖细胞，其中进行所述的移植以治疗或预防疾病。在一个实施方案中，本发明提供移植哺乳动物干细胞或祖细胞给需要其的患者的方法，包括：(a)将干细胞或祖细胞接触抑制JNK活性的化合物，以产生处理的干细胞或祖细胞；以及(b)将处理的干细胞移植到所述的患者中。在具体的实施方案中，处理的细胞与未处理的细胞，例如未处理的干或祖细胞，例如胚胎干细胞、胎盘干细胞、成人干细胞、脐血细胞、成人血细胞、外周血细胞或骨髓细胞结合移植。在其他的实施方案中，在移植前、移植期间和/或移植后也对需要移植的患者施用本发明的化合物。在另一个实施方案中，本发明的方法包括将化合物施用给作为未调理的干细胞或祖细胞的受体的受试个体，以便引发对已经被移植的干细胞的调节作用。在此所公开的任何移植方法中，处理和/或未处理的细胞可以在移植前被冷藏并解冻。
在某些实施方案中，本发明包括骨髓移植，包括移植脐血(或从脐血获得的干细胞)、外周的(即，成人)血液(或从外周血获得的干细胞)，其中所述的脐血或干细胞已经用本发明的化合物预先处理。进一步地，本发明包括利用由造血祖细胞制备的，已经在存在本发明的化合物时分化的白细胞。例如，通过分化造血祖代细胞而产生的白细胞可被用于移植或可在移植前与脐血或脐血干细胞混合。
因此，本发明提供治疗需要白细胞的哺乳动物受试个体的方法，包括在适宜的条件下和存在抑制JNK或MKK活性的化合物时分化干细胞或祖细胞，其中所述的分化产生白细胞，以及对所述的哺乳动物受试个体施用治疗有效量的所述白细胞。在另一个实施方案中，本发明提供治疗需要白细胞的哺乳动物受试个体的方法，包括将本发明的一种或多种化合物与处理的或未处理的干或祖细胞组合给药。在具体的实施方案中，在体外对干细胞或祖细胞进行分化。在另一个具体的实施方案中，所述的分化在施用本发明的一种或多种化合物后，在所述的患者内体内发生。在另一个具体的实施方案中，干细胞或祖细胞是在产后灌流的胎盘中分化的。在另一个具体的实施方案中，将白细胞以基本上不含红细胞的细胞制剂形式施用给作为受体的哺乳动物受试个体。在另一个具体的实施方案中，将白细胞以包括脐血细胞的细胞制剂形式施用给作为受体的哺乳动物受试个体。在另一个具体的实施方案中，白细胞是与载体一起施用给作为受体的哺乳动物受试个体的。在另一个具体的实施方案中，白细胞是在静脉内施用的。在另一个具体的实施方案中，白细胞表达令人感兴趣的整合的遗传物质。在另一个具体的实施方案中，所述的哺乳动物受试个体是人。在另一个具体的实施方案中，所述的白细胞与一种或多种JNK或MKK调节剂，优选一种或多种JNK或MKK抑制剂联合施用。
在其他的实施方案中，本发明包括用包含已经在存在本发明的化合物时分化的干细胞的组合物来治疗需要骨髓移植的患者的方法。这种患者包括但不限于，需要骨髓移植来治疗恶性疾病的患者(例如，患有急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性粒性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、脊髓发育不良综合症(“白血病前期”)、单体性7综合症、非Hodgkin′s淋巴瘤、成神经细胞瘤、脑肿瘤、多发性骨髓瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、肉瘤或其他实体瘤的患者)，需要骨髓移植以治疗非恶性疾病的患者(例如，患有血液学紊乱、先天性免疫缺陷、粘多糖沉积症、脂沉积症、骨质疏松症、Langerhan′s细胞组织细胞增多症、莱-纳二氏综合症或糖原贮存疾病的患者)。
在其他的实施方案中，本发明包括将已经在存在本发明的化合物时分化的干细胞施用给经受化疗或放射疗法的患者或准备经受化疗或放射疗法的患者的方法。在某些实施方案中，患者在接受干细胞组合物前或同时接受免疫抑制剂治疗。这种免疫抑制剂治疗包括但不限于，施用一种或多种治疗剂或放射治疗。
本发明进一步包括在深低温保藏和解冻后调理干细胞，以抵消深低温保藏和暴露于深低温保藏剂对干细胞的有害效应的方法。在某些实施方案中，本发明提供在深低温保藏和解冻后调理干细胞的方法，以抵消暴露于深低温保藏剂(例如DMSO)对干细胞增殖和迁移能力的有害效应。
4.1.干细胞分化的调节
本发明提供调节人干细胞分化的方法。在某些实施方案中，本发明的方法包括体外调节干或祖细胞的分化，包括将干细胞与化合物体外培养，然后将分化的细胞直接移植给受试个体。在其他的实施方案中，本发明的方法包括体内调节干或祖细胞的分化，包括将化合物递送给作为未处理的干细胞的受体的受试个体，然后给该受试个体直接施用化合物。也可使用这些方法的组合。
可诱导通过本发明的方法获得的胚胎样干细胞分化成为特定的细胞谱系，包括但不限于间质的、造血的、产生脂肪的、生成肝组织的、神经原的、生成神经胶质的、形成软骨的、生成血管的、生肌的、形成软骨的，或成骨的谱系。在某些实施方案中，诱导根据本发明的方法获得的胚胎样干细胞分化以用于移植和先体外后体内的治疗方法。在某些实施方案中，诱导通过本发明的方法获得的胚胎样干细胞分化成为特定的细胞类型并且对其遗传工程化以提供治疗性的基因产物。在具体的实施方案中，将通过本发明的方法获得的胚胎样干细胞与化合物例如诱导该细胞分化的有机小分子体外培养，然后将分化的细胞直接移植给受试个体。在优选的实施方案中，用于控制或调节干细胞分化的化合物不是多肽、肽、蛋白质、激素、细胞因子、寡核苷酸或核酸。
可根据本发明使用的干细胞包括但不限于，脐血(CB)细胞、胎盘细胞、胚胎干(ES)细胞、胚胎样干细胞、滋养层干细胞、祖细胞、骨髓干细胞以及多能、多潜能的和全能的细胞。
特别地，本发明的方法包括调节除间充质干细胞之外的干细胞群分化成为特定的组织谱系。例如，可使用本发明的方法调节多能干细胞分化成为形成软骨的、生成血管的、生肌的和成骨的谱系细胞，可促进特定的肌骨胳的再生和修复、新血管发生，和例如心肌和骨骼肌的特定肌肉组织的再增殖，以及多种器官和组织，包括但不限于脑、脊髓、肝、肺、肾和胰腺的血管再形成。可使用本发明的方法调节多能干细胞分化成为产生脂肪的、形成软骨的、成骨的、神经原的或生成肝组织的谱系细胞。
可将用于调节分化的试剂引入产后灌流的胎盘以在胎盘中诱导培养细胞的分化。备选地，可使用试剂在已经收集细胞或从胎盘移出细胞后在体外调节分化。
本发明的方法包括调节祖代干细胞分化成为造血谱系的细胞，包括将祖代干细胞与化合物在体外培养足够的一段时间以导致这些细胞分化成为造血的谱系。特别地，可使用本发明的方法调节血细胞集落世代以剂量应答的方式从CD34+、CD133+和CD45+造血祖细胞的产生(关于剂量的论述，参见第4.8节)。
优选地，本发明的方法可用于特异地抑制不需要的红细胞或红细胞生成集落(BFU-E和CFU-E)的产生，同时增加白细胞和血小板形成集落(CFU-GM)的产生并且增强总的集落形成单位(总的-CFU)的产生。因此不仅可使用本发明的方法调节干细胞的分化，而且还可用于刺激集落形成的速率，通过改善骨髓移入的速度和白细胞和/或血小板产生的恢复而提供有利于造血干细胞移植的显著益处。
在其他的实施方案中，可使用本发明的方法调节例如神经元的前体细胞或神经胚细胞分化成为特定的神经元细胞类型，例如感觉神经元(例如，视网膜细胞、嗅细胞、感受力的神经元、感受化学的神经元等)，运动神经元、皮层神经元或中间神经元。在其他的实施方案中，可使用本发明的方法调节细胞类型的分化，细胞类型包括但不限于，胆碱能神经元、多巴胺能神经元、GABA-ergic神经元、胶质细胞(包括产生髓鞘质的少突神经胶质细胞)，以及室管膜细胞(其排列成脑的脑室系统)。在另一实施方案中，可使用本发明的方法作为调节器官成分的细胞的分化，细胞包括但不限于心脏的浦肯野细胞、肝的胆汁上皮细胞、胰腺的β-胰岛细胞、肾的皮层或髓细胞，以及眼睛的视网膜感光细胞。
评定根据本发明的方法获得的干细胞的分化状态可通过存在或缺少某些细胞表面标记而鉴定。本发明的胚胎样干细胞，例如可通过下列细胞表面标记辨别：OCT-4和ABC-p，或在不同哺乳动物种属中的其同等物。进一步地，本发明包括具有下列标记的胚胎样干细胞：CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、SH2、SH3、SH4、OCT-4和ABC-p，或缺乏下列细胞表面标记的胚胎样干细胞：CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4，或在不同哺乳动物种属中的其同等物。这种细胞表面标记的存在或缺少通常根据本领域公知的方法确定，例如通过流式细胞计数术，然后洗涤并用抗细胞表面标记的抗体染色。例如，为了确定CD34或CD38的存在，可在PBS中洗涤细胞，然后用抗CD34的藻红蛋白和抗CD38的异硫氰酸荧光素(Becton Dickinson，MountainView，CA)双染色。
在另一个实施方案中，分化的干细胞通过本领域通常已知的集落形成单位分析鉴定和表征，例如Mesen CultTM培养基(Stem CellTechnologies，公司，Vancouver British Columbia)。
确定干细胞已经分化成为特别的细胞类型，可通过本领域众所周知的方法实现，例如，利用例如流式细胞计数术或免疫细胞化学的技术测量形态学变化和细胞表面标记(例如，用组织特异的或细胞标记特异的抗体染色细胞)，通过利用光或共聚焦显微术检验细胞的形态学，或通过利用本领域公知的技术，例如PCR和基因-表达图谱测量基因表达的变化。
在某些实施方案中，分化的细胞可通过表征差异表达的基因(例如，将令人感兴趣的未分化祖细胞的多元基因表达水平与来源于该类型祖细胞的分化细胞的所述多元基因的表达水平相比较)而鉴定。例如，可使用核酸扩增方法，例如聚合酶链式反应(PCR)或基于转录的扩增方法(例如，体外转录(IVT))描绘不同细胞群中基因表达的图谱，例如通过利用多核苷酸微阵列。这种描绘差异基因表达的方法是本领域公知的。参见，例如Wieland等人，1990，美国国家科学院院报Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2720-2724；Lisitsyn等人，1993，科学Science 259：946-951；Lisitsyn等人，1995，酶学方法Meth.Enzymol.254：291-304；美国专利号5,436,142；美国专利号5,501,964；Lisitsyn等人，1994，自然遗传学Nature Genetics6：57-63；Hubank和Schatz，1994，核酸研究Nucleic Acids Res.22：5640-5648；Zeng等人，1994，核酸研究Nucleic Acids Research 22：4381-4385；美国专利号5,525,471；Linsley等人，2001年8月7日发表的，题目为“RNA扩增方法”的美国专利号6,271,002；Van Gelder等人，1998年2月10日发表的，题目为“利用启动子进行遗传操作的方法”的美国专利号5,716,785；Stoflet等人，1988，科学Science 239：491-494；Sarkar和Sommer，1989，科学Science 244：331-334；Mullis等人，美国专利号4,683,195；Malek等人，美国专利号5,130,238；Kacian和Fultz，美国专利号5,399,491；Burg等人，美国专利号5,437,990；van Gelder等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1663；Lockhart等人，1996，自然生物技术Nature Biotechnol.14：1675；Shannon，美国专利号6,132,997；Lindemann等人，2001年5月22日发表的，题目为“用于扣除杂交和差异分析的方法”的美国专利号6,235,503。
商业上可获得的试剂盒是可获得基因图谱的，例如，displayPROFILETM系列试剂盒(Qbiogene，Carlsbad，加利福尼亚)，其使用基于凝胶的方法来描绘基因表达图谱。该试剂盒利用限制性酶切片段差异显示-PCR(RFDD-PCR)以比较真核细胞中的基因表达模型。也可使用PCR-筛减试剂盒(Clontech)和PCR-选择差异筛选试剂盒(Clontech)，其容许在扣除文库中鉴定差异表达的克隆。在用PCR筛减试剂盒产生差异表达基因的库后，使用PCR选择的差异筛选试剂盒。该筛减文库与从测试和驱动群体直接合成的探针、从该筛减的cDNA制备的探针和由反向-筛减的cDNA(反向进行的第二筛减)制备的探针杂交。与测试探针但非驱动探针杂交的克隆是差异表达的；然而，非筛减的探针不是足够灵敏以检测稀有信息的。极大地富集筛减的探针以用于差异表达的cDNAs，但可能给出假阳性的结果。利用筛减和非筛减的探针，根据制造商的(Clontech)说明指导鉴定差异表达的基因。
4.2.干细胞群体
本发明提供调节人干细胞分化的方法。可在本发明的方法内使用任何哺乳动物的干细胞，包括但不限于，分离自脐带血(CB细胞)、外周血、成人血液，骨髓、胎盘、间充质干细胞和其他来源的干细胞。在非优选的实施方案中，干细胞是胚胎干细胞或已经从除了胎盘之外的来源分离的细胞。
间充质干细胞的来源包括骨髓、胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿和青少年的皮肤和血液。骨髓细胞可例如从髂嵴、股骨、胫骨、脊柱、肋骨或其他的骨髓间隔获得。
用于本发明方法的干细胞可包括多潜能的细胞，即具有完全的分化多面性，自我更新并可在组织内保持休眠或静止的细胞。干细胞也可包括多能细胞、定向祖细胞和成纤维样细胞。在一个优选的实施方案中，本发明利用的干细胞是有生存力的、休眠的、从足月放血的灌流的胎盘分离的多潜能干细胞。
干细胞群体可由通过商业服务，例如LifeBank USA(CedarKnolls，NJ)，ViaCord(Boston MA)，脐血登记处(San Bruno，CA)和Cryocell(Clearwater，FL)所获得的干细胞组成。干和/或祖细胞也可利用本领域已知的方法收集，例如血浆分离置换法或白细胞除去法。可以以相对未纯化的形式使用干细胞群，如在脐血中或在通过血浆分离置换法获得的外周血单核细胞群中，或是相对纯化的，即基本上从其他细胞类型纯化的。
干细胞群也可由根据2001年12月5日提交的，题目为“收集胎盘干细胞的方法”的共同悬而未决的美国申请系列号10/004,942，和2002年2月13日提交的，题目为“产后的哺乳动物胎盘，其用途和由此而来的胎盘干细胞”的美国申请系列号10/076,180所公开的方法来收集的胎盘干细胞组成，(其两者在此全部引入作为参考)。
在一个实施方案中，可使用来自脐血的干细胞。来自胎盘血液的第一收集物称为脐血，其主要地包含CD34+和CD38+造血祖细胞。在产后灌流的第一个24小时内，可从胎盘分离高浓度的CD34+CD38-造血祖细胞。在灌流的大约24小时后，可从伴随上述细胞的胎盘分离高浓度的CD34-CD38-细胞。本发明的分离的灌流的胎盘提供富集了CD34+CD38-干细胞和CD34-CD38+干细胞的大量干细胞的来源。已经被灌流24小时以上的分离的胎盘提供富集了CD34-CD38+干细胞的大量干细胞的来源。
用于本发明的优选细胞是来源于放血灌流胎盘的胚胎样干细胞，或来源于胚胎样胎盘干细胞的细胞。本发明的胚胎样干细胞可通过利用例如流式细胞计数术和免疫细胞化学的技术测量形态学变化和细胞表面标记，以及利用例如PCR的技术测量基因表达变化而鉴定。在本发明的一个实施方案中，这种胚胎样干细胞的特征为存在或缺少下列细胞表面标记：CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、SH2、SH3、SH4、OCT-4和ABC-p，或缺乏下列细胞表面标记：CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4，或在不同哺乳动物种属中的其同等物。在优选的实施方案中，这种胚胎样干细胞的特征为存在细胞表面标记OCT-4和ABC-p，或在不同哺乳动物种属中的其等同物。这种细胞表面标记的存在或缺少通常根据本领域公知的方法确定，例如通过流式细胞计数术，然后洗涤并用抗细胞表面标记的抗体染色。例如，为了确定CD34或CD38的存在，细胞可在PBS中洗涤，然后用抗CD34的藻红蛋白和抗CD38的异硫氰酸荧光素(Becton Dickinson，Mountain View，CA)双染色。
来源于胎盘的胚胎样干细胞具有胚胎干细胞的特征，但不是来源于胚胎。换言之，本发明包括利用分离自产后灌流胎盘的未分化干细胞的OCT-4+和ABC-p+细胞。这种细胞与人胚胎干细胞一样是可变的(例如多潜能的)。如上所述，许多不同的多潜能或多能干细胞可从灌流的胎盘，在不同的时间点分离，例如CD34+CD38+，CD34+CD38-，和CD34-CD38-造血细胞。根据本发明的方法，人胎盘是在产后作为胚胎样干细胞来源而使用的。
例如，在从子宫排出后，对胎盘尽快放血以预防或最小化细胞程序性死亡。随后，在放血后尽快灌流胎盘以除去存在于该器官中的血液、残余细胞、蛋白质、因子和任何其他物质。也可从胎盘除去物质碎片。灌流一般用合适的灌注液连续进行至少2至超过24小时。在几个另外的实施方案中，灌流胎盘至少4，6，8，10，12，14，16，18，20和22小时。换言之，本发明至少部分地是基于可通过放血和灌流足够数量的时间而活化产后胎盘的细胞这一发现的。因此，胎盘可轻易地用作富含胚胎样干细胞的充足来源，这些细胞可用于研究，包括药物开发、疾病的治疗和预防，特别为用于移植的外科手术或治疗，以及定型细胞、组织和细胞器的产生。参见2001年12月5日提交的，题目为“收集胎盘干细胞的方法”的共同悬而未决的美国申请系列号10/004,942，和2002年2月13日提交的，题目为“产后的哺乳动物胎盘、其用途和由此而来的胎盘干细胞”的美国申请系列号10/076,180，其两者在此全部引入作为参考。
胚胎样干细胞是从通过利用脐动脉和脐静脉的灌流技术排干的胎盘提取的。该胎盘优选地通过放血排干并且收集残余血液(例如，残余的脐带血液)。然后如此加工排干的胎盘，以建立来自体内的、天然的生物反应器环境，其中使在实体和血管外间隔内的固有胚胎样干细胞恢复。胚胎样干细胞移动到排干的、空的微循环中，其中根据本发明的方法收集它们，优选地通过灌流将其冲洗到收集管中。
4.3.例证性的JNK和/或MKK抑制剂
在一个实施方案中，JNK抑制剂或MKK抑制剂具有下列结构(I)：
Figure A0381726700441
其中：
A是直接的键，-(CH2)a-，-(CH2)bCH＝CH(CH2)c-，或-(CH2)bC≡C(CH2)c-；
R1是芳基、杂芳基或与苯基稠合的杂环，每个任选地用独立地选自R3的1-4个取代基取代；
R2是-R3，-R4，-(CH2)bC(＝O)R5，-(CH2)bC(＝O)OR5，-(CH2)bC(＝O)NR5R6，-(CH2)bC(＝O)NR5(CH2)cC(＝O)R6，-(CH2)bNR5C(＝O)R6，-(CH2)bNR5C(＝O)NR6R7，-(CH2)bNR5R6，-(CH2)bOR5，-(CH2)bSOdR5或-(CH2)bSO2NR5R6；
a是1，2，3，4，5或6；
b和c是相同或不同的，并且在每次出现时独立地选自0，1，2，3或4；
d在每次出现时是0，1或2；
R3在每次出现时独立地是卤素、羟基、羧基、烷基、烷氧基、卤代烷基、酰氧基、硫代烷基、亚磺酰烷基、磺酰烷基、羟烷基、芳基、芳烷基、杂环、杂环烷基、-C(＝O)OR8、-OC(＝O)R8、-C(＝O)NR8R9、-C(＝O)NR8OR9、-SO2NR8R9、-NR8SO2R9、-CN、-NO2、-NR8R9、-NR8C(＝O)R9、-NR8C(＝O)(CH2)bOR9、-NR8C(＝O)(CH2)bR9、NR8C(＝O)(CH2)bNR8R9、-O(CH2)bNR8R9或与苯基稠合的杂环；
R4是烷基、芳基、芳烷基、杂环或杂环烷基，每个任选地用独立地选自R3的1-4个取代基取代，或R4是卤素或羟基；
R5、R6和R7是相同或不同的，并且在每次出现时独立地为氢、烷基、芳基、芳烷基、杂环或杂环烷基，其中R5、R6和R7中的每一个任选地用独立地选自R3的1-4个取代基取代；以及
R8和R9是相同或不同的，并且在每次出现时独立地为氢、烷基、芳基、芳烷基、杂环、或杂环烷基；或R8和R9与跟它们键合的原子一起形成杂环，其中R8、R9以及一起形成杂环的R8和R9中的每一个任选地被独立地选自R3的1-4个取代基取代。
在一个实施方案中，-A-R1是苯基，任选地被独立地选自卤素、烷氧基、-NR8C(＝O)R9、-C(＝O)NR8R9和-O(CH2)bNR8R9的1-4个取代基取代，其中b是2或3，并且其中R8和R9如上述所定义。
在另一个实施方案中，R2是-R4、-(CH2)bC(＝O)R5、-(CH2)bC(＝O)OR5、-(CH2)bC(＝O)NR5R6、-(CH2)bC(＝O)NR5(CH2)cC(＝O)R6、-(CH2)bNR5C(＝O)R6、-(CH2)bNR5C(＝O)NR6R7、-(CH2)bNR5R6、-(CH2)bOR5、-(CH2)bSOdR5或-(CH2)bSO2NR5R6，并且b是0-4范围内的整数。
在另一个实施方案中，R2是-(CH2)bC(＝O)NR5R6、-(CH2)bNR5C(＝O)R6、3-三唑基或5-四唑基，其中b是0并且其中R8和R9是上述所定义的。
在另一个实施方案中，R2是3-三唑基或5-四唑基。
在另一个实施方案中：
(a)-A-R1是苯基，任选地用独立地选自卤素、烷氧基、-NR8C(＝O)R9、-C(＝O)NR8R9和-O(CH2)bNR8R9的1-4个取代基取代，其中b是2或3；以及
(b)R2是-(CH2)bC(＝O)NR5R6、-(CH2)bNR5C(＝O)R6、3-三唑基或5-四唑基，其中b是0，并且其中R8和R9如上述所定义。
在另一个实施方案中：
(a)-A-R1是苯基，任选地用独立地选自卤素、烷氧基、-NR8C(＝O)R9、-C(＝O)NR8R9和-O(CH2)bNR8R9的1-4个取代基取代，其中b是2或3；以及
(b)R2是3-三唑基或5-四唑基。
在另一个实施方案中，R2是R4，并且R4是3-三唑基，任选地在其5-位被下列基团取代：
(a)任选地被羟基、甲氨基、二甲氨基或1-吡咯烷基取代的C1-C4直链或支链的烷基；或
(b)2-吡咯烷基。
在另一个实施方案中，R2是R4，并且R4是3-三唑基，任选地在其5-位被下列基团取代：甲基、正丙基、异丙基、1-羟乙基、3-羟丙基、甲氨基甲基、二甲氨基甲基、1-(二甲氨基)乙基、1-吡咯烷基甲基或2-吡咯烷基。
在另一个实施方案中，当A是直接的键时结构(I)的化合物具有结构(IA)，或当A是-(CH2)a-时具有结构(IB)：
在其他的实施方案中，当A是-(CH2)bCH＝CH(CH2)c-时，结构(I)的化合物具有结构(IC)，并且当A是-(CH2)bC≡C(CH2)c-时结构(I)的化合物具有结构(ID)：
Figure A0381726700462
在本发明进一步的实施方案中，结构(I)的R1是芳基或取代的芳基，例如苯基或取代的苯基，如下列结构(IE)所代表的：
Figure A0381726700471
在另一个实施方案中，结构(I)的R2是-(CH2)bNR5(C＝O)R6。在该实施方案的一个方面，b＝0并且化合物具有下列结构(IF)：
结构(I)化合物的代表性的R2基团包括烷基(例如甲基和乙基)、卤素(例如氯和氟)、卤代烷基(例如三氟甲基)、羟基、烷氧基(例如甲氧基和乙氧基)、氨基、芳烷氧基(例如苄氧基)、单或双烷基胺(例如-NHCH3、-N(CH3)2和-NHCH2CH3)、-NHC(＝O)R6，其中R6是取代的或未取代的苯基或杂芳基(例如用羟基、羧基、氨基、酯、烷氧基、烷基、芳基、卤代烷基、卤素、-CONH2和-CONH烷基取代的苯基或杂芳基)、-NH(杂芳基烷基)(例如-NHCH2(3-吡啶基)、-NHCH2(4-吡啶基)、杂芳基(例如吡唑基、三唑基和四唑基)、-C(＝O)NHR6，其中R6是氢、烷基、或如上述所定义的(例如-C(＝O)NH2、-C(＝O)NHCH3、-C(＝O)NH(H-羧苯基)、-C(＝O)N(CH3)2)、芳基链烯基(例如苯乙烯基、3-硝基苯乙烯基、4-羧苯乙烯基)、杂芳基链烯基(例如2-吡啶乙烯基、4-吡啶乙烯基)。
结构(I)的化合物的代表性的R3基团包括卤素(例如氯和氟)，烷基(例如甲基、乙基和异丙基)、卤代烷基(例如三氟甲基)、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基、正丙氧基和异丁氧基)、氨基、单或双烷基氨基(例如二甲胺)、芳基(例如苯基)、羧基，硝基、氰基、亚磺酰烷基(例如甲亚磺酰基)、磺酰烷基(例如甲磺酰基)、磺酰氨基烷基(例如-NHSO2CH3)、-NR8C(＝O)(CH2)bOR9(例如NHC(＝O)CH2OCH3)、NHC(＝O)R9(例如-NHC(＝O)CH3、-NHC(＝O)CH2C6H5、-NHC(＝O)(2-呋喃基))和-O(CH2)bNR8R9(例如-O(CH2)2N(CH3)2)。
结构(I)的化合物可利用本领域技术人员公知的有机合成技术生产，以及通过在2002年2月7日公开的国际公开号WO 02/10137(特别是在实施例1-430，第35页，第1行到第396页第12行中)中所描述的方法生产，其在此全部引入作为参考。进一步地，化合物的具体实施例存在于该公开中。
结构(I)的JNK抑制剂或MKK抑制剂的例证性的实例是：
                  3-(4-氟苯基)-5-
            (1H[1，2，4]三唑-3-基)-1H-吲唑；
Figure A0381726700482
            3-[3-(2-哌啶-1-基-乙氧基)-苯基]
            -5-(1H-[1，2，4]三唑-3-基)-1H-吲唑；
Figure A0381726700491
               3-(4-氟苯基)-1H-吲唑-5-
             羧酸(3-吗啉-4-基-丙基)-酰胺；
Figure A0381726700492
            3-[3-(3-哌啶-1-基-丙酰氨基)-
              苯基]-1H-吲唑-5-甲酰胺；
Figure A0381726700493
          3-苯并[1，3]间二氧杂环戊烯-5-基
          -5-(2H-四唑-5-基)-1H-吲唑；
             3-(4-氟苯基)-5-(5-甲基-
          [1，3，4]噁二唑-2-基)-1H-吲唑；
        N-叔丁基-3-[5-(1H-[1，2，4]三唑-3-基)
              -1H-吲唑-3-基]-苯甲酰胺；
        3-[3-(2-吗啉-4-基-乙氧基)-苯基]
        -5-(1H-[1，2，4]三唑-3-基)-1H-吲唑；
Figure A0381726700504
        二甲基-(2-{4-[5-1H[1，2，4]三唑-3-基)
        -1H-吲唑-3-基-苯氧基}-乙基)-胺；
Figure A0381726700511
      5-[5-(1，1-二甲基-丙基)-1H[1，2，4]三唑
       -3-基]-3-(4-氟苯基)-1H-吲唑；
Figure A0381726700512
         3-(4-氟苯基)-5-(5-吡咯烷-1-基甲基
          -1H-[1，2，4]三唑-3-基)-1H-吲唑；
Figure A0381726700513
         3-(6-甲氧基-萘-2基)-5-(5-吡咯烷
      -1-甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-基)-1H-吲唑；
Figure A0381726700521
                      3-(4-氟苯基)-1H
                      -吲唑-5-甲酰胺；
及其药物学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，JNK抑制剂或MKK抑制剂具有下列结构(II)：
Figure A0381726700522
其中：
R1是任选地用1-4个独立地选自R7的取代基取代的芳基或杂芳基；
R2是氢；
R3是氢或低级烷基；
R4代表1-4个任选的取代基，其中每个取代基是相同或不同的并且独立地选自卤素、羟基、低级烷基和低级烷氧基；R5和R6是相同或不同的，并且独立地为-R8、-(CH2)aC(＝O)R9、-(CH2)aC(＝O)OR9、-(CH2)aC(＝O)NR9R10、-(CH2)aC(＝O)NR9(CH2)bC(＝O)R10、-(CH2)aNR9C(＝O)R10、-(CH2)aNR11C(＝O)NR9R10、-(CH2)aNR9R10、-(CH2)aOR9、-(CH2)aSOcR9或-(CH2)aSO2NR9R10；
或R5和R6与跟它们连接的氮原子在一起形成杂环或取代的杂环；
R7在每种情况中独立地为卤素、羟基、氰基、硝基、羧基、烷基、烷氧基、卤代烷基、酰氧基、硫代烷基、亚磺酰烷基、磺酰烷基、羟烷基、芳基、芳烷基、杂环、取代的杂环、杂环烷基、-C(＝O)OR8，-OC(＝O)R8，-C(＝O)NR8R9，-C(＝O)NR8OR9，-SOcR8，-SOcNR8R9，-NR8SOcR9，-NR8R9，-NR8C(＝O)R9，-NR8C(＝O)(CH2)bOR9，-NR8C(＝O)(CH2)bR9，-O(CH2)bNR8R9，或与苯基稠合的杂环；
R8、R9、R10和R11是相同或不同的，并且在每次出现时独立地为氢、烷基、芳基、芳烷基、杂环、杂环烷基；
或R8和R9与跟它们相连原子一起形成杂环；
a和b是相同或不同的并且在每次出现时独立地选自0，1，2，3或4；以及
c在每次出现时是0，1或2。
在一个实施方案中，R1是取代的或未取代的芳基或杂芳基。当R1被取代时，它被一个或多个下列定义的取代基取代。在一个实施方案中，当被取代时，R1是被卤素、-SO2R8或-SO2R8R9取代的。
在另一个实施方案中，R1是取代或未被取代的芳基，呋喃基，苯并呋喃基，苯硫基，苯并苯硫基，喹啉基，吡咯基，吲哚基，噁唑基，苯并噁唑基，咪唑基，苯并咪唑基，噻唑基，苯并噻唑基，异噁唑基，吡唑基，异噻唑基哒嗪基，嘧啶基，吡嗪基，三嗪基，噌啉基，2，3-二氮杂萘基或喹啉唑基。
在另一个实施方案中，R1是取代的或未被取代的芳基或杂芳基。当R1被取代时，它被一个或多个下列定义的取代基取代。在一个实施方案中，当被取代时，R1是被卤素、-SO2R8或-SO2R8R9取代的。
在另一个实施方案中，R1是取代的或未取代的芳基，优选为苯基。当R1是取代的芳基时，该取代基是下列所定义的。在一个实施方案中，当被取代时，R1是被卤素、-SO2R8或-SO2R8R9取代的。
在另一个实施方案中，R5和R6与跟它们相连的氮原子一起形成包含取代的或未被取代的氮的非芳族杂环，在一个实施方案中，形成哌嗪基、哌啶基或吗啉基。
当R5和R6与跟它们相连的氮原子一起形成取代的哌嗪基、哌啶基或吗啉基，哌嗪基、哌啶基或吗啉基被一个或多个下列定义的取代基取代。在一个实施方案中，当被取代时，该取代基是烷基，氨基，烷基氨基，烷氧基烷基，酰基，吡咯烷基或哌啶基。
在一个实施方案中，R3是氢并且R4不存在，以及JNK抑制剂或MKK抑制剂具有下列结构(IIA)：
Figure A0381726700541
及其药物学上可接受的盐。
在更具体的实施方案中，R1是任选地用R7取代的苯基，并且具有下列结构(IIIB)：
Figure A0381726700542
及其药物学上可接受的盐。
在进一步的实施方案中，R7是在相对于嘧啶的苯基的对位，如下列结构(IIC)所代表的：
及其药物学上可接受的盐。
结构(II)的JNK抑制剂或MKK抑制剂可利用本领域技术人员公知的有机合成技术生产，以及通过在2002年6月13日公开的，国际公开号WO 02/46170(特别是实施例1-27第23页，第5行到第183页第25行)中所描述的方法生产，其在此全部引入作为参考。进一步地，化合物的具体实施例存在于该公开物中。
结构(II)的JNK抑制剂或MKK抑制剂的例证性的实例是：
Figure A0381726700551
              4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶
               -2-基氨基]-苯甲酰胺；
              4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶-2-
            基氨基]-N，N-二甲基-苯甲酰胺；
Figure A0381726700561
        4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶-2-基氨基]
        -N-(3-哌啶-1-基-丙基)-苯甲酰胺；
Figure A0381726700562
           {4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶-2-
          基氨基]-苯基}-哌嗪-1-基-甲酮；
Figure A0381726700563
           1-(4-{4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶
       -2-基氨基]-苯甲酰基}-哌嗪-1-基)-乙酮；
Figure A0381726700571
         1-[4-(4-{4-[4(3-羟基-丙硫基)-苯基]
    -嘧啶-2-基氨基]-苯甲酰基)-哌嗪-1-基]-乙酮；
Figure A0381726700572
         {4-[4-(4-氯-苯基)-嘧啶-2-基氨基]
    -苯基}-(4-吡咯烷-1-基-哌啶-1-基)-甲酮；
及其药物学上可接受的盐。
在另一个实施方案中，JNK抑制剂或MKK抑制剂具有下列结构(III)：
Figure A0381726700573
其中R0是-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、NH或-CH2-；
结构(III)的化合物是：(i)未取代的，(ii)单取代的并且具有第一取代基，或(iii)二取代的并且具有第一取代基和第二取代基；
当存在时，第一或第二取代基是在3，4，5，7，8，9，9，或10的位置，其中当存在时，第一和第二取代基独立地是烷基、羟基、卤素、硝基、三氟甲基、磺酰基、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、芳烷基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧烷氧基、氨基烷氧基、单-烷基氨基烷氧基、二-烷基氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)代表的基团：
Figure A0381726700581
其中R3和R4结合在一起并且代表亚烷基或包含杂原子的环状亚烷基，或R3和R4独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳氧基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单-烷基氨基烷基或二-烷基氨基烷基；以及
R5是氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧羰基烷基、氨基、单-烷基氨基、二-烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷基氨基烷基或二烷基氨基烷基。
在另一个实施方案中，JNK抑制剂或MKK抑制剂具有下列结构(IIIA)：
Figure A0381726700591
               2H-二苯并[cd，g]吲哚-6-酮
                         (IIIA)
是：(i)未取代的，(ii)单取代的并且具有第一取代基，或(iii)二取代的并且具有第一取代基和第二取代基；
当存在时，第一或第二取代基是在3，4，5，7，8，9，或10的位置，
其中当存在时，第一和第二取代基独立地是烷基、羟基、卤素、硝基、三氟甲基，磺酰基、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、芳烷基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、氨基烷氧基、单-烷基氨基烷氧基、二-烷基氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)代表的基团：
Figure A0381726700592
其中R3和R4结合起来并且代表亚烷基或包含杂原子的环状亚烷基，或R3和R4独立地是氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、芳氧基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单烷基氨基烷基，或双烷基氨基烷基；以及
R5是氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧羰基烷基、氨基、单-烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷基氨基烷基，或二烷基氨基烷基。
一小类结构(IIIA)的化合物是其中第一或第二取代基存在于5，7或9位的化合物。在一个实施方案中，第一或第二取代基存在于5或7位。
第二小类结构(IIIA)的化合物是其中第一或第二取代基存在于5，7或9位的化合物。第一或第二取代基独立地是烷氧基，芳氧基，氨基烷基，单烷基氨基烷基，二烷基氨基烷基，或由结构(a)、(c)、(d)、(e)或(f)代表的基团；
R3和R4独立地是氢，烷基，环烷基，芳基，芳烷基或环烷基烷基；以及
R5是氢，烷基，环烷基，芳基，芳烷基或环烷基烷基。
在另一个实施方案中，JNK抑制剂或MKK抑制剂具有下列结构(IIIB)：
           2-氧代-2H-214-蒽并[9，1-cd]异噻唑-6-酮
                         (IIIB)
是(i)未取代的，(ii)单取代的并且具有第一取代基，或(ii)二取代的并且具有第一取代基和第二取代基；
当存在时，第一或第二取代基是在3，4，5，7，8，9或10位；
其中当存在时，第一和第二取代基独立地是烷基、羟基、卤素、硝基、三氟甲基，磺酰基、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、芳烷基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧烷氧基、氨基烷氧基、单-烷基氨基烷氧基、二烷基氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)代表的基团：
Figure A0381726700611
其中R3和R4结合在一起并且代表亚烷基或包含杂原子的环状亚烷基，或R3和R4独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳氧基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单-烷基氨基烷基，或二烷基氨基烷基；以及
R5是氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧羰基烷基、氨基、单-烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、芳烷基氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷基氨基烷基，或二烷基氨基烷基。
一小类结构(IIIB)的化合物是其中第一或第二取代基存在于5，7或9位的化合物。在一个实施方案中，第一或第二取代基存在于5或7位。
第二小类结构(IIIB)的化合物是其中第一或第二取代基独立地是烷氧基、芳氧基或由结构(a)、(c)、(d)、(e)或(f)代表的基团的化合物；
R3和R4独立地是氢，烷基，环烷基，芳基，芳烷基，或环烷基烷基；以及
R5是氢，烷基，环烷基，芳基，芳烷基或环烷基烷基。
在另一个实施方案中，JNK抑制剂或MKK抑制剂具有下列结构(IIIC)：
              2-氧杂-1-氮杂-醋蒽烯-6-酮
                        (IIIC)
是(i)单基取代的并且具有第一取代基，或(ii)二取代的并且具有第一取代基和第二取代基；
当存在时，第一或第二取代基是在3，4，5，7，8，9或10位；
其中当存在时，第一和第二取代基独立地是烷基、羟基、卤素、硝基、三氟甲基，磺酰基、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、芳烷基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、氨基烷氧基、单-烷基氨基烷氧基、二烷基氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)代表的基团：
其中R3和R4结合在一起并且代表亚烷基或包含杂原子的环状亚烷基或R3和R4独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳氧基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单-烷基氨基烷基，或二烷基氨基烷基；以及
R5是氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧羰基烷基、氨基、单-烷基氨基、二烷基氨基、芳氨基、芳烷基氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷基氨基烷基，或二烷基氨基烷基。
一小类结构(IIIC)的化合物是其中第一或第二取代基存在于5，7或9位的化合物。在一个实施方案中，第一或第二取代基存在于5或7位。
第二小类结构(IIIC)的化合物是其中第一或第二取代基独立地是烷氧基、芳氧基、氨基烷基、单烷基氨基烷基、双烷基氨基烷基或由结构(a)、(c)、(d)、(e)或(f)代表的基团的化合物；
R3和R4独立地是氢，烷基，环烷基，芳基，芳烷基或环烷基烷基；以及
R5是氢，烷基，环烷基，芳基，芳烷基或环烷基烷基。
在另一个实施方案中，JNK抑制剂或MKK抑制剂具有下列结构(IIID)：
          2，2-二氧代-2H-216-蒽并[9，1-cd]异噻唑-6-酮
                           (IIID)
是(i)单基取代的并且具有存在于5，7或9位的第一取代基，(ii)二取代的并且具有存在于5位的第一取代基和存在于7位的第二取代基，(iii)二取代的并且具有存在于5位的第一取代基和存在于9位的第二取代基，或iv)二取代的并且具有存在于7位的第一取代基和存在于9位的第二取代基；
其中当存在时，第一和第二取代基独立地是烷基、羟基、卤素、硝基、三氟甲基，磺酰基、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、芳烷基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧烷氧基、氨基烷氧基、单-烷基氨基烷氧基、二烷基氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)代表的基团：
Figure A0381726700641
其中R3和R4结合在一起并且代表亚烷基或包含杂原子的环状亚烷基或R3和R4独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳氧基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单-烷基氨基烷基，或二烷基氨基烷基；以及
R5是氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧羰基烷基、氨基、单-烷基氨基、二烷基氨基、芳氨基、芳烷基氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷基氨基烷基，或二烷基氨基烷基。
一小类结构(IIID)的化合物是其中第一或第二取代基存在于5或7位的化合物。
第二小类结构(IIID)的化合物是其中第一或第二取代基独立地是烷基，三氟甲基，磺酰基，羧基，烷氧羰基，烷氧基，芳基，芳氧基，芳烷氧基，芳烷基，环烷基烷氧基，环烷氧基，烷氧基烷基，烷氧烷氧基，氨基烷氧基，单-烷基氨基烷氧基，二烷基芳烷氧基或由结构(a)、(c)、(d)、(e)或(f)代表的基团的化合物。
另一小类结构(IIID)的化合物是其中第一和第二取代基独立地是烷氧基，芳氧基，或由结构(a)、(c)、(d)、(e)和(f)代表的基团的化合物；
R3和R4独立地是氢，烷基，环烷基，芳基，芳烷基或环烷基烷基；以及
R5是氢，烷基，环烷基，芳基，芳烷基，烷氧羰基或环烷基烷基。
在另一个实施方案中，JNK抑制剂或MKK抑制剂具有下列结构(IIIE)：
Figure A0381726700651
              蒽并[9，1-cd]异噻唑-6-酮
                         (IIIE)
是(i)单基取代的并且具有存在于5，7或9位的第一取代基，(ii)二取代的并且具有存在于5位的第一取代基和存在于9位的第二取代基，(iii)二取代的并且具有存在于7位的第一取代基和存在于9位的第二取代基，或(iv)二取代的并且具有存在于5位的第一取代基和存在于7位的第二取代基；
其中当存在时，第一和第二取代基独立地是烷基、羟基、卤素、硝基、三氟甲基，磺酰基、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、芳烷基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧烷氧基、氨基烷氧基、单-烷基氨基烷氧基、二烷基氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)代表的基团：
其中R3和R4结合起来并且代表亚烷基或包含杂原子的环状亚烷基，或R3和R4独立地是氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、芳氧基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单烷基氨基烷基，或双烷基氨基烷基；以及
R5是氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧羰基烷基、氨基、单-烷基氨基、二烷基氨基、芳氨基、芳烷基氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷基氨基烷基，或二烷基氨基烷基。
一小类结构(IIIE)的化合物是其中第一或第二取代基存在于5或7位的化合物。
第二小类结构(IIIE)的化合物是其中结构(IIIE)的化合物是二取代的并且至少一个取代基是由结构(d)或(f)代表的基团的化合物。
另一小类结构(IIIE)的化合物是其中化合物是单基取代的化合物。另外一小类化合物是其中化合物是在5或7位被结构(e)或(f)所代表的基团单基取代的化合物。
在另一个实施方案中，JNK抑制剂或MKK抑制剂具有下列结构(IIIF)：
                 2H-二苯并[cd，g]吲唑-6-酮
                             (IIIF)
是：(i)未取代的，(ii)单基取代的并且具有第一取代基，或(iii)二取代的并且具有第一取代基和第二取代基；
当存在时，第一或第二取代基是在3，4，5，7，8，9，9或10位；
其中当存在时，第一和第二取代基独立地是烷基、羟基、卤素、硝基、三氟甲基，磺酰基、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、芳烷基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧烷氧基、氨基烷氧基、单-烷基氨基烷氧基、二烷基氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)代表的基团：
其中R3和R4结合在一起并且代表亚烷基或包含杂原子的环状亚烷基或R3和R4独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳氧基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单-烷基氨基烷基，或二烷基氨基烷基；以及
R5是氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧羰基烷基、氨基、单-烷基氨基、二烷基氨基、芳氨基、芳烷基氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷基氨基烷基，或二烷基氨基烷基。
在一个实施方案中，结构(IIIF)的化合物或其药物学上可接受的盐是在3，4，5，7，8，9或10位未被取代的。
结构(III)的JNK抑制剂或MKK抑制剂可利用本领域技术人员公知的有机合成技术生产，以及通过在2001年2月22日公开的，国际公开号WO 01/12609(特别是实施例1-7第24页，第6行到第49页，第16行)，以及2002年8月29日公开的国际公开号WO 02/066450(特别是化合物AA-HG第59-108页)中所描述的方法生产，每个公开物都在此全部引入作为参考。进一步地，这些化合物的具体实施例存在于该公开物中。
结构(III)的JNK抑制剂或MKK抑制剂的例证性的实例是：
               2H-二苯并[cd，g]吲唑-6-酮；
                     7-氯-2H-二苯并
                    [cd，g]吲唑-6-酮；
               5-二甲氨基-2H-二苯并
                [cd，g]吲唑-6-酮；
               7-苄氧基-2H-二苯并
                [cd，g]吲唑-6-酮；
             N-(6-氧代-2，6-二氢-二苯并
              [cd，g]吲唑-5-基)-乙酰胺；
Figure A0381726700701
             5-(2-哌啶-1-基-乙胺基)-2H-
              二苯并[cd，g]吲唑-6-酮；
Figure A0381726700702
               5-氨基-蒽并[9，1-cd]
                    异噻唑-6-酮；
             N-(6-氧代-6H-蒽并[9，1-cd]
                异噻唑-5-基)-苯甲酰胺；
            7-二甲氨基-蒽并[9，1-cd]
                  异噻唑-6-酮；
                 2-氧杂-1-氮杂-
                  醋蒽烯-6-酮；
及其药物学上可接受的盐。
对本方法有用的其他JNK抑制剂或MKK抑制剂包括但不限于，在下列专利中所公开的内容，国际公开号WO 00/39101，(特别是第2页，第10行到第6页，第12行)；国际公开号WO 01/14375(特别是第2页，第4行到第4页，第4行)；国际公开号WO 00/56738(特别是第3页，第25行到第6页，第13行)；国际公开号WO 01/27089(特别是在第3页，第7行到第5页，第29行)；国际公开号WO 00/12468(特别是在第2页，第10行到第4页，第14行)；欧洲专利公开1 110 957(特别是在第19页，第52行到第21页，第9行)；国际公开号WO 00/75118(特别是在第8页，第10行到第11页，第26行)；国际公开号WO 01/1721(特别是在第8页，第10行到第10页，第7行)；国际公开号WO 00/64879(特别是在第9页，第1行到第106页，第2行)；国际公开号WO 01/23378(特别是在第90页，第1行到第91页，第11行)；国际公开号WO 02/16359(特别是在第163页，第1行到第164页，第25行)；美国专利号6,288,089(特别是在第22栏，第25行到第25栏，第35行)；美国专利号6,307,056(特别是在第63栏，第29行到第66栏，第12行)；国际公开号WO 00/35921(特别是在第23页，第5行到第26页，第14行)；国际公开号WO 01/91749(特别是在第29页，第1-22行)；国际公开号WO 01/56993(特别是在第43页到第45页)；以及国际公开号WO 01/58448(特别是在第39页)，其每个在此全部引入作为参考。
可在本发明的方法中使用包括包含有效量的JNK抑制剂或MKK抑制剂的本发明剂型的药物组合物。
4.4.干细胞的培养方法
在本发明的某些实施方案中，将干或祖细胞，包括但不限于胚胎干细胞、胚胎样干细胞、祖细胞、多潜能细胞、全能细胞、多能细胞、内源于产后灌流的胎盘的细胞、脐血细胞、来源于外周血或成人血液、或骨髓细胞的干或祖细胞暴露于本发明的化合物并且诱导分化。这些细胞可利用本领域公知的方法在体外增殖，或备选地可在产后灌流的胎盘中增殖。参见2003年2月13日发表的，题目为“产后哺乳动物胎盘、其用途以及由此而来的胎盘干细胞”的美国申请公开号US2003/0032179，其由此全部引入。
在某些实施方案中，内源于产后灌流胎盘的细胞可从胎盘和培养基收集，并且在合适的条件下在体外培养足够的一段时间以诱导分化为所需要的细胞类型或谱系。
在本发明的另一个实施方案中，干或祖细胞不是来源于产后灌流的胎盘，而是分离自其他来源，例如脐带血、骨髓、外周血或成人血液，将其暴露于本发明的化合物并诱导分化。在优选的实施方案中，分化是在合适的条件下在体外进行的，并且培养足够的时间以诱导分化成为所需要的谱系或细胞类型。本发明的化合物通过加入、原位产生或其他任何方式用于分化/培养基，以容许干或祖细胞接触本发明的化合物。
在另一个实施方案中，例如，通过施用促红细胞生成素、细胞因子、淋巴激活素、干扰素、集落刺激因子(CSFs)、干扰素、趋化因子、白细胞介素、重组的人造血生长因子包括配体、干细胞因子、血小板生成素(Tpo)、白细胞介素，以及粒性白细胞集落刺激因素(G-CSF)或其他生长因子来刺激培养的干细胞，例如在体外或在产后灌流胎盘中培养的干细胞在培养物中增殖。
在收集和/或分离培养的细胞后，它们可通过本领域通常已知的集落形成单位分析，例如Mesen CultTM培养基(Stem Cell Technologies，Inc.，Vancouver British Columbia)来鉴定和表征。
根据本发明，可应用获得干细胞的已知方法来产生可根据本发明的方法分化的干细胞群。Caplan等人(1996年1月23日发表的，题目为“人间充质干细胞”的美国专利号5,486,359，其在此全部引入作为参考)，公开了用于获得来源于骨髓，作为间充质细胞谱系的祖代的人间充质干细胞(hMSC)组合物的方法。均质的hMSC组合物是通过阳性选择不含与造血细胞或分化的间充质细胞相关的标记的，附着的骨髓或骨膜细胞而获得的。
Hu等人(2000年12月7日公开的，题目为“分离、深低温保藏人羊膜上皮细胞的方法及其治疗用途”的WO 00/73421，其在此全部引入作为参考)公开了用于从分娩胎盘收获人羊膜上皮细胞，以使得该细胞分离、培养、冷藏备用或诱导分化的方法。根据Hu等人，在产后立即收获胎盘，并例如通过解剖从绒毛膜分离羊膜。根据标准的细胞分离技术从羊膜分离羊膜上皮细胞。所公开的细胞可在各种培养基中培养，在培养物中扩展，被冷藏或诱导分化。
脐带血(脐血)是已知的造血祖代干细胞的备选来源。通常收获来自脐血的干细胞并且冷藏以用于造血再生，用于骨髓和其他相关移植的广泛使用的治疗性方法(参见，例如，Boyse等人，U.S.5,004,681，题目为“血液的胎儿和新生促红细胞生成素干和祖细胞的保存”，Boyse等人，1993年3月9日发表的，题目为“血液的胎儿和新生造血干和祖细胞的分离和保存，及治疗用途的方法”的美国专利号5,192,553，每个在此全部引入作为参考)。用于收集脐血的传统方法是基于利用针或插管，在重力的帮助下从胎盘排干脐血(即放血)(Boyse等人，1993年3月9日发表的美国专利号5,192,553；Boyse等人，1991年4月2日发表的美国专利号5,004,681；Anderson，1994年12月13日发表的，题目为“用于收集胎盘血的方法和设备”的美国专利号5,372,581；Hessel等人，1995年5月16日发表的，题目为“脐带夹、剪和血液收集设备和方法”的美国专利号5,415,665，其每个在此全部引入作为参考)。通常将针或插管置于脐静脉中，并且温和地按揉胎盘以帮助从胎盘排干脐血。
Krbling等人(2002，“外周血干细胞受体中供体起源的肝细胞和上皮细胞”，N.Engl.J.Med.346(10)：738-46，其在此全部引入作为参考)公开了可从外周血获取干细胞并且可作为能分化成为肝、胃肠道和皮肤细胞的干细胞来源。
Naughton等人(1999年10月5日发表的，题目为“三维基质的组织培养”的美国专利号5,962,325)公开了胎儿细胞，包括成纤维细胞样细胞和软骨细胞祖代，可从脐带或胎盘组织或脐带血获得。
4.4.1.干细胞体外培养
本发明的方法包括体外调节干细胞或祖细胞的分化，包括将细胞与化合物，例如本发明的小的有机分子一起在体外培养，诱导它们分化成为特定需要的细胞谱系的细胞，然后将分化的细胞直接移植给受试个体。在优选的实施方案中，诱导细胞分化成为造血细胞谱系。
用于体外培养干或祖细胞的方法是本领域中公知的，例如参见，Thomson等人，1998，科学Science 282：1145-47(胚胎干细胞)；Hirashima等人，1999，血液Blood 93(4)：1253-63，和Hatzopoulos等人，1998，发育Development 125：1457-1468(内皮细胞祖代)；Slager等人，1993，Dev.Genet.14(3)：212-24(神经元或肌肉祖代)；Genbachev等人，1995，Reprod.Toxicol.9(3)：245-55(细胞滋养层，即胎盘上皮细胞祖代)；Nadkarni等人1984，Tumori 70：503-505，Melchner等人，1985，血液Blood 66(6)：1469-1472，2000年5月18日公开的国际申请公开WO 00/27999，Himori等人，1984，Intl.J.Cell Cloning 2：254-262，和Douay等人，1995，骨髓移植Bone Marrow Transplantation 15：769-775(造血祖细胞)；Shamblott等人，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726-31(原生殖细胞)；Yan等人，2001，Devel.Biol.235：422-432(滋养层干细胞)。
在某些实施方案中，将令人感兴趣的培养的祖代细胞或干细胞体外暴露于浓度为0.1μg/ml，0.2μg/ml，0.3μg/ml，0.4μg/ml，0.5μg/ml，1μg/ml，5μg或10μg/ml的本发明的化合物。优选地将令人感兴趣的细胞暴露于浓度为在0.005μg/ml-5mg/ml之间，更优选在1.0μg/ml-2mg/ml之间的JNK或MKK抑制剂。
4.4.2.产后灌流胎盘中的干细胞培养
4.4.2.1.胎盘的预处理
根据本发明的方法，在产后胎盘排出之后不久回收人胎盘，在某些实施方案中，回收胎盘中的脐血。在某些实施方案中，胎盘受到常规的脐血回收处理。一般使用针或插管，借助于重力从胎盘排干脐血(即放血)(Boyse等人，1993年3月9日发表的美国专利号5,192,553；Boyse等人，1991年4月2日发表的美国专利号5,004,681；Anderson，1994年12月13日发表的美国专利号5,372,581；Hessel等人，1995年5月16日发表的，题目为“脐带夹、剪和血液收集设备和方法”的美国专利号5,415,665)。这种脐血回收物可以是商业上获得的，例如LifeBankUSA(Cedar Knolls，NJ)，ViaCord(Boston MA)，脐血登记处(SanBruno，CA)和Cryocell(Clearwater，FL)。脐血可在胎盘排出之后不久排干。
排干产后胎盘的脐血。胎盘可在无菌条件和在室温或5-25℃(摄氏度)储藏。在灌流胎盘以除去任何残余脐血前可将胎盘储藏超过48小时，并且优选储藏4-24小时。
优选地在胎盘排出后在无菌条件下回收胎盘，并且在5-25℃(摄氏度)的温度下保存在抗凝剂溶液中。合适的抗凝剂溶液是本领域公知的。例如，可使用肝素或杀鼠灵钠的溶液，例如肝素的溶液(1∶1000溶液中1％w/w)。优选地在收集胚胎样干细胞前将排干的胎盘储藏不超过36小时。用于灌流胎盘以除去残余细胞的溶液可以是与用于灌流和培养胎盘以回收干细胞相同的溶液。可收集任何灌注液并用作胚胎样干细胞的来源。
胎盘也可从经告知同意而从病人回收，并且在怀孕前、怀孕期间和怀孕后记录病人的完整医疗史，该病史与胎盘相关。这些医疗史可用于调整胎盘或由此收获或干细胞的后续用途。例如，因此可轻易地将人胎盘干细胞用于个人化针对所讨论的婴儿、父母、同胞或其他亲属的医药。实际上，人胎盘干细胞是比脐血更加多用途的。然而应该注意到本发明包括将由放血、灌流和/或培养的胎盘而产生的人胎盘干细胞加入到来自相同或不同的胎盘和脐带的脐血中。所得到的脐血将具有增加的人干细胞浓度/群体，并由此对移植更有用，例如用于骨髓移植。
4.4.2.2.胎盘的放血和残余细胞的去除
根据本发明的某些实施方案，包括但不限于胚胎样干细胞的干或祖细胞可从放血的胎盘回收，即在产后保持脐血的完全排干和/或受到常规的脐血回收处理。如上所述，胎盘可被放血和灌流，如在2001年12月5日提交的，题目为“收集胎盘干细胞的方法”的共同悬而未决的美国申请系列号10/004,942，和2002年2月13日提交的，题目为“产后的哺乳动物胎盘，其用途和由此而来的胎盘干细胞”的美国申请系列号10/076,180中所公开的，其两者都在此全部引入作为参考。
4.4.2.3.胎盘和干细胞在其中的培养
在放血和灌流胎盘足够的时间后，观察到胚胎样干细胞迁移进入放血和灌流的胎盘的微循环中，其中根据本发明的方法收集它们，优选地通过灌流冲洗到收集管中。灌流分离的胎盘不仅用来除去残余的脐血，而且给胎盘提供包括氧的合适养分。可用相似的溶液培养和灌流胎盘，使用该溶液除去残余的脐血细胞，优选地不加入抗凝剂。
在本发明的某些实施方案中，培养排干的、放血的胎盘作为生物反应器，即用于增殖细胞或产生生物材料的活体外系统，如在2001年12月5日提交的，题目为“收集胎盘干细胞的方法”的共同悬而未决的美国申请系列号10/004,942，和2002年2月13日提交的，题目为“产后的哺乳动物胎盘，其用途和由此而来的胎盘干细胞”的美国申请系列号10/076,180中所公开的，其两者都在此全部引入作为参考。通过周期性地或连续不断地除去被引入胎盘生物反应器的培养基或灌流液体的一部分而将胎盘生物反应器中产生的增殖细胞的数目或所产生的生物材料的水平维持在平衡增长的连续态，并且从该培养基或灌流液体回收增殖细胞或所产生的生物材料。以相同比率或相同的数量导入新鲜的培养基或灌流液体。
增殖细胞的数目和类型可通过利用标准的细胞检测技术，例如流式细胞计数术、细胞分拣、免疫细胞化学(例如，用组织特异的或细胞标记特异的抗体染色)、荧光活化的细胞分拣(FACS)、磁性活化的细胞分拣(MACS)，测量形态学变化和细胞表面标记，通过利用光或共聚焦显微术检验细胞的形态学，或通过利用本领域公知的技术，例如PCR和基因-表达图谱测量基因表达的变化而轻易地监测。关于监测细胞数目和种类以及用于细胞分离的方法，参见2001年12月5日提交的，题目为“收集胎盘干细胞的方法”的共同悬而未决的美国申请系列号10/004,942，和2002年2月13日提交的，题目为“产后的哺乳动物胎盘、其用途和由此而来的胎盘干细胞”的美国申请系列号10/076,180。
在优选的实施方案中，将欲用作生物反应器的胎盘放血并且在无菌条件下洗涤以除去任何附着的凝结物和非附着的细胞污染物。然后在无菌条件下培养或培植胎盘，如在2001年12月5日提交的，题目为“收集胎盘干细胞的方法”的共同悬而未决的美国申请系列号10/004,942，和2002年2月13日提交的，题目为“产后的哺乳动物胎盘、其用途和由此而来的胎盘干细胞”的美国申请系列号10/076,180中所公开的。
在某些实施方案中，在胎盘生物反应器中通过将养分、激素、维生素、生长因子或其任何组合引入灌流溶液而诱导胚胎样干细胞增殖。可将血清和其他生长因子加入灌流溶液或培养基。生长因子通常是蛋白质并且包括但不限于：细胞因子、淋巴激活素、干扰素、集落刺激因子(CSFs)、干扰素、趋化因子和白细胞介素。可使用的其他生长因子包括，重组的人造血生长因子，包括配体、干细胞发病诱因、血小板生成素(Tpo)、粒性白细胞集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子、碱性的成纤维细胞生长因子、胎盘衍生的生长因子和表皮生长因子。
被引入灌流溶液的生长因子可刺激未分化的胚胎样干细胞、定向的祖细胞或分化的细胞(例如分化的造血细胞)的增殖。生长因子可刺激产生生物材料和生物活性物质分子，包括但不限于免疫球蛋白、激素、酶或先前所描述的生长因子。应该周期性地“喂养”培养的胎盘，以除去消耗的培养基，减少释放的细胞，并且加入新鲜的培养基。培养的胎盘应该储藏在无菌条件下以减少污染的可能性，并且保持在间断和定期的加压下以产生保持养分定量供应给胎盘的细胞的条件。应该认识到为了效率和增加的能力，胎盘的灌流和培养可以都是自动化和计算机化的。
在另一个实施方案中，加工胎盘以除去所有的内源性增殖细胞，例如胚胎样干细胞，并且提供导入外来(即外源的)的细胞以及使其在灌流胎盘的环境中增殖。本发明预期许多种类的可在胎盘生物反应器中培养的干或祖细胞，包括但不限于胚胎样干细胞、间充质干细胞、基质细胞、内皮细胞、肝细胞、角质化细胞，以及用于特定细胞类型、组织或器官的干或祖细胞，包括但不限于神经元、髓鞘质、肌肉、血液、骨髓、皮肤、心脏、结缔组织、肺、肾、肝和胰腺(例如，郎格罕氏岛细胞)。
在本发明的某些实施方案中，将干或祖细胞在产后灌流的胎盘内培养或增殖，其中根据本发明的方法将它们暴露于调节该培养细胞分化的化合物。可使用的小分子化合物的实例包括但不限于抑制JNK或MKK活性的化合物。在一个实施方案中，该化合物不是如上所述的多肽、肽、蛋白质、激素、细胞因子、寡核苷酸或核酸。胎盘中胚层提供了理想的基质环境，包括为器官发生和组织再生所必需的丰富的小分子和生长因子、脂多糖和细胞外基质蛋白质。
在一个实施方案中，本发明提供利用分离灌流的胎盘作为生物反应器用于增殖外源细胞的方法。根据这些实施方案，本发明涉及包含不是来源于胎盘的细胞的分离的胎盘，其中将所述的细胞移入胎盘可刺激该胎盘产生胚胎样干细胞，或其中移入的细胞产生信号例如细胞因子和生长因子，其可刺激胎盘产生干细胞。可将最初不是从与该胎盘相关的婴儿的父母、同胞或其他血亲获得的胎盘的细胞移入该胎盘。
在另一个实施方案中，可将最初从不与该胎盘相关的婴儿或不与婴儿相关的个体获得的胎盘的细胞移入分离的胎盘。同样地，可将在胎盘中增殖和培养的细胞、组织、类器官和器官移植到与胎盘相关的婴儿、所述婴儿的父母、同胞或其他血亲中，或移植到不与该婴儿相关的个体中。
在本发明的一个实施方案中，胎盘可用任何特别的细胞类型填充并且作为用于细胞、组织或器官的活体外培养法的生物反应器。可收获这种细胞、组织或器官培养物用于移植和先体外后体内的治疗方法。在这些实施方案中，加工胎盘以除去所有的内源细胞，并且导入外来(即外源的)的细胞以及使其在灌流胎盘的环境中增殖。用于除去内源细胞的方法是本领域公知的。例如，用电磁、UV、X射线、γ-或β-射线照射灌流胎盘以消除所有剩余的存活的内源细胞。在一个实施方案中，可使用亚致死的暴露于例如500-1500CGγ的辐射来保存胎盘而消除不需要的细胞。关于国际上关于致死的对非致死的电离辐射(参见美国国防部的第5章“生物物理学和电离辐射的生物效应”)。然后将在辐射的胎盘生物反应器中增殖的令人感兴趣的外来细胞，例如通过血管灌流或直接的内实质性注射而导入。
在另一个实施方案中，可使用生物反应器来产生和增殖新的嵌合细胞、组织或器官。这种嵌合体可在生物反应器中利用胎盘细胞和一种或多种另外的细胞类型作为起始材料而产生。在不同细胞类型之间的相互作用，或“交流”可诱导与任何一个起始细胞类型不同的表达模型。在一个实施方案中，例如，自体同源的嵌合体是通过在具有来源于相同患者的另一个细胞类型的生物反应器中增殖患者的自体同源胎盘细胞而产生的。在另一个实施方案中，例如，异源的嵌合体可通过将患者的细胞，即血细胞加入具有异源胎盘细胞的生物反应器中而产生。在另一实施方案中，胎盘细胞可能来源于患者，而第二细胞类型来自第二患者。然后从任何一个起始细胞回收具有不同表型的和/或遗传特征的嵌合细胞。在具体的实施方案中，异源的细胞是相同的单倍体型，而嵌合的细胞被再导入到患者中。
在其他的实施方案中，可使用生物反应器以增强特定细胞类型的生长，无论从起源上该细胞类型是天然或合成的，或用于生产细胞类型特异的产物。例如，在一个实施方案中，可使用胎盘生物反应器刺激郎格罕氏岛细胞产生胰岛素。生物反应器可特别有利地用于生产治疗性的哺乳动物蛋白质，其治疗效能可取决于特有的翻译后修饰。因此，生物反应器可用于生产治疗性的蛋白质、抗体、生长因子、细胞因子和其他天然的或重组的治疗性分子，例如但不限于，促红细胞生成素、白细胞介素和干扰素。
在某些实施方案中，处理干细胞或祖细胞的特异群体用于在胎盘生物反应器内分化。在其他的实施方案中，诱导干细胞或祖细胞的特异群体用于在胎盘生物反应器内分化。这种干或祖细胞的特异群体包括但不限于胚胎样干细胞、胚胎干细胞、多潜能细胞、多能细胞、全能细胞和定向的祖细胞(例如，软骨细胞、肝细胞、造血细胞、胰腺实质细胞、神经胚细胞、肌肉祖细胞等)。在该实施方案中，可将本发明的化合物例如通过灌流引入胎盘生物反应器，并且根据本发明的方法进行使用以使其适应干细胞或祖细胞的分化。例如，在具体的实施方案中，在胎盘生物反应器内培养外源的CD34-干细胞或祖细胞，并且暴露于JNK或MKK抑制剂，其中从CD34-中分化CD34+细胞受到上调或增强。
在本发明的另一个实施方案中，使用胎盘作为用于增殖内源细胞(即，来源于胎盘的细胞)的生物反应器，包括但不限于多种种类的多潜能和/或全能胚胎样干细胞和淋巴细胞。在一个实施方案中，如在此所公开的，将胎盘用灌注溶液培养不同的时段。可转化胎盘起源的这种内源细胞来重组表达令人感兴趣的基因，表达突变体，和/或这种内源细胞可被工程化，利用“敲除”技术来删除基因位点。例如，可通过利用定向同源重组钝化或“敲除”靶基因或其启动子来使内源的靶基因缺失(例如，参见Smithies，等人，1985，自然Nature 317，230-234；Thomas和Capecchi，1987，细胞Cell 51，503-512；Thompson，等人，1989，细胞Cell 5，313-321；其每个在此全部引入作为参考)。例如，可使用有或没有选择性标记和/或阴性的选择性标记，两侧为与内源性靶基因(靶基因的编码区或调节区)同源的DNA的突变体无功能靶基因(或完全无关的DNA序列)，来转染在体内表达该靶基因的细胞。通过定向同源重组插入该DNA构建体导致该靶基因的失活。可使用这种方法除去、替代或改变细胞、组织、和/或器官中令人感兴趣的基因的表达。可使用该方法改变细胞、组织或器官的表型，然后可将其引入人受试个体中。
在其他的实施方案中，可将胎盘细胞导入分化的活体外或活体内的特定细胞类型中。例如，可将多潜能的胚胎样干细胞注入到损伤的器官中，并用于器官再生和体内创伤修复。这种创伤可能是由于下列病症和紊乱而引起的，包括但不限于，心肌梗死、抽搐病、多发性硬化、中风、低血压症、心跳骤停、局部缺血、炎症、与年龄相关的认知功能损失、辐射损伤、脑性麻痹、神经变性疾病、阿尔茨海默氏病、震颤性麻痹、Leigh疾病、获得性免疫缺陷综合症痴呆、记忆损失、肌萎缩性侧索硬化、缺血性肾病、脑或脊髓创伤、心肺旁路、青光眼、视网膜局部缺血或视网膜损伤。
可使用从胎盘分离的胚胎样干细胞，在具体的实施方案中，在自体同源的或异源的酶替代治疗中治疗特定的疾病或病症，包括但不限于，溶酶体贮存疾病，例如Tay-Sachs、Niemann-Pick、Fabry′s、Gaucher′s、Hunter′s和Hurler′s综合症，以及其他的神经节苷脂沉积症、粘多糖沉积症和糖原贮积病。
可使用移植处理的骨髓细胞来治疗恶性疾病(例如，患有急性淋巴细胞性白血病、急性髓性白血病、慢性粒性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、脊髓发育不良综合症(“白血病前期”)、单体性7综合症、非Hodgkin′s淋巴瘤、成神经细胞瘤、脑肿瘤、多发性骨髓瘤、睾丸生殖细胞肿瘤、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、神经胶质瘤、肉瘤或其他实体瘤的患者)，或非恶性疾病的患者(例如，血液学紊乱、先天性免疫缺陷、粘多糖沉积症、脂沉积症、骨质疏松症、Langerhan′s细胞组织细胞增多症、莱-纳二氏综合症或糖原贮存疾病)。
在其他的实施方案中，该细胞可用作自体同源的或异源的转基因载体，用于基因治疗矫正先天性代谢缺陷、肾上腺脑白质病变、囊性纤维化、糖原贮积病、甲状腺机能减退症、镰刀形红细胞贫血病、Pearson综合症、Pompe′s疾病、苯丙酮酸尿症(PKU)、卟啉症、槭糖尿病、高胱氨酸尿症、粘多糖沉积症、慢性肉芽肿病和酪氨酸血症和泰-萨二氏病或治疗癌症、肿瘤或其他病理学状况。
在其他的实施方案中，该细胞可用于自体同源的或异源的组织再生或置换治疗或方法，包括但不限于治疗角膜上皮细胞缺陷、软骨修复、脸部皮肤擦除术、粘膜膜层、鼓膜、肠内隔膜、神经学结构(例如，视网膜、基底膜中的听觉神经元、嗅上皮中的嗅觉神经元)、用于皮肤外伤性创伤的烧伤和创伤修复，或用于其他损害或患病器官或组织的重建。
4.5.干细胞的遗传工程
在另一个实施方案中，根据本发明的方法分化的干或祖细胞是在暴露于本发明的化合物前或后，利用例如病毒载体，例如腺病毒或反向病毒载体，或通过利用机械方式，例如脂质体或化学药品介导的DNA摄取而遗传工程化的。
可将包含转基因的载体通过本领域公知的方法引入令人感兴趣的细胞，这些方法例如为转染、转化、转导、电穿孔、感染、微量注射、细胞稠合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体、LIPOFECTINTM、溶酶体稠合、合成的阳离子脂类、利用基因枪或DNA载体运送，以使转基因传送到子代细胞，例如通过胚胎样干细胞的分裂而产生的子代胚胎样干细胞或祖细胞。至于用于哺乳动物细胞的转化或转染的多种技术，参见Keown等人，1990，酶学方法Methods Enzymol.185：527-37；Sambrook等人，2001，分子克隆，实验室指南，第三版，冷泉港实验室出版社，纽约。
优选地，利用任何技术导入转基因，只要它不对细胞的核膜或其他存在的细胞或遗传结构产生破坏作用。在某些实施方案中，通过微量注射将转基因插入核遗传物质中。细胞和细胞结构的微量注射通常是本领域已知并惯常进行的。
至于培养的哺乳动物细胞的稳定转染，例如胎盘中的细胞培养物，只有一小部分细胞可以将外来的DNA整合到它们的基因组中。整合的效率取决于所使用的载体和转染技术。为了鉴定和选择整合体，通常将编码可选择标记(例如，对抗生素的抗性)的基因随着令人感兴趣的基因序列一起导入宿主胚胎样干细胞。优选的可选择标记包括赋予抗药性，例如G418、潮霉素和氨甲蝶呤抗性的标记。用导入的核酸稳定转染的细胞可通过药物选择来鉴定(例如，具有整合的可选择标记基因的细胞将生存，同时其它的细胞死亡)。这些方法对在导入或移植重组细胞进入受试个体或患者前，涉及哺乳动物细胞(例如，在胚胎样干细胞中)中同源重组的方法是特别有用的。
许多选择系统可用来选择转化的宿主胚胎样细胞。特别地，载体可能包含某些可检测的或可选择的标记。其他的选择方法包括但不限于选择另一个标记，例如：单纯性疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，1977，细胞Cell 11：223)，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska和Szybalski，1962，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：2026)，和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等人，1980，细胞Cell 22：817)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。也可使用抗代谢物抗性作为选择下列基因的基础：dhfr，其赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等人，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：3567；O′Hare等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：1527)；gpt，其赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072)；neo，其赋予对氨基糖苷类G-418的抗性(Colberre-Garapin等人，1981，J.Mol.Biol.150：1)；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人，1984，基因Gene 30：147)。
转基因可整合进入令人感兴趣的细胞的基因组，优选通过随机整合。在其他的实施方案中转基因可通过直接的方法，例如通过直接的同源重组整合(即，在令人感兴趣的细胞的基因组中“敲入”或“敲除”令人感兴趣的基因)，Chappel，美国专利号5,272,071；和1991年5月16日公开的PCT公开号WO 91/06667；Capecchi等人，1995年11月7日发表的美国专利5,464,764；Capecchi等人，1997年5月6日发表的美国专利5,627,059；Capecchi等人，1996年1月30日发表的美国专利5,487,992)。
用于通过同源重组产生具有靶基因修饰的细胞的方法是本领域已知的。构建体可包括令人感兴趣的具有所需要的遗传修饰的基因的至少一部分，并且可包括与靶基因座同源的区域，即宿主基因组中靶基因的内源性拷贝。用于随机整合的DNA构建体与用于同源重组的构建体相比，不必包括与介导的重组体同源的区域。可将标记包括到用于进行正负选择转基因插入的靶构建体或随机构建体中。
为了产生同源重组细胞，例如同源重组的胚胎样干细胞、内源的胎盘细胞或胎盘中的外源细胞培养物，制备了同源重组载体，其中令人感兴趣的基因在与靶细胞基因组内源的基因序列的5′和3′末端的侧面，以容许同源重组发生在由载体携带的令人感兴趣的基因和靶细胞基因组中的内源基因之间。附加的侧面的核酸序列具有足够的长度以用于与靶细胞基因组中的内源基因的成功的同源重组。一般地，DNA侧面的几千个碱基(在5′和3′末端)被包括在载体中。用于构建同源重组载体的方法和来自重组干细胞的同源重组动物通常是本领域已知的(参见，例如，Thomas和Capecchi，1987，细胞Cell 51：503；Bradley，1991，Curr.Opin.Bio/Technol.2：823-29；以及PCT公开号WO 90/11354，WO 91/01140，和WO 93/04169。
在一个实施方案中，在根据本发明方法的胎盘中培养的外源细胞的基因组是经过同源重组或经过随机整合的基因寻靶的靶。
在具体的实施方案中，使用Bonadio等人的方法(1999年8月24日发表的，题目为用于将多基因转入骨细胞的方法和组合物的美国专利号5,942,496；和1995年8月24日公开的，题目为用于刺激骨细胞的方法和组合物的PCT WO 95/22611)将核酸导入令人感兴趣的细胞，例如培养在胎盘中的干细胞、祖细胞或外源细胞，例如骨祖细胞。
4.6.调理的干细胞用于分化的用途
可诱导本发明的干细胞分化供移植和先体外后体内的治疗方法之用。在一个实施方案中，干细胞群分化为特别的细胞类型并且遗传工程化以提供治疗性的基因产物。
本发明的化合物也在临床背景中具有用途，其中移植具有恢复骨髓白血球产生的基本目的，例如逆转导致疾病和/或临床骨髓切除的嗜中性白细胞减少症和白血球减少症。本发明的化合物也在优选其中抑制红细胞产生，而不抑制骨髓的情况中具有用途。
在某些实施方案中，将已经用本发明的化合物处理的干细胞伴随未处理的细胞，例如来自脐血或外周血的干细胞一起施用于需要其的患者。
干细胞，例如胚胎样干细胞，其分化已经根据本发明的方法受到调节，可被配制成可注射的(参见PCT WO 96/39101，在此全部引入作为参考)。在备选的实施方案中，其分化已经根据本发明的方法受到调节的细胞和组织，可利用多聚的或交联的水凝胶配制，如在美国专利号5,709,854；5,516,532；5,654,381中所描述的，其每个全部引入作为参考。
其分化已经根据本发明的方法受到调节的胚胎样干细胞，可用于多种治疗性方法，其中机体的组织或器官通过移入、移植或灌注所需要的细胞群，例如干细胞或祖细胞群而增加、修复或替代。胚胎样干细胞可用于替代或增加存活的组织，以导入新的或改变的组织，或连接生物组织或结构。胚胎样干细胞也可在治疗性的方法中被胚胎干细胞代替，其中一般使用胚胎干细胞。
在本发明的优选实施方案中，其分化已经根据本发明的方法得到调节的来自胎盘的胚胎样干细胞和其他干细胞，可用作自体同源的和异源的，包括匹配和错配的HLA类型的造血移植物。根据胚胎样干细胞作为异源造血的移植物的用途，可优选处理宿主以减少供体细胞的免疫排斥，例如如1998年9月1日发表的美国专利号5,800,539；和1998年9月15日发表的美国专利号5,806,529所描述的，其在此引入作为参考。
例如，其分化已经根据本发明的方法受到调节的胚胎样干细胞，可用于治疗性的移植方法，例如为了增加或替代肝、血液、淋巴系统、胰腺、肾、肺、神经系统、肌肉系统、骨、骨髓、胸腺、脾、粘膜组织、生殖腺或毛发的干或祖细胞。
胚胎样干细胞可用于在一般使用祖细胞的治疗或研究方法中代替祖细胞的具体种类(例如，软骨细胞、肝细胞、造血细胞、胰腺实质细胞、神经胚细胞、肌肉祖细胞等)。
本发明的胚胎样干细胞可用于软骨、腱或韧带的增加、修复或置换。例如，在某些实施方案中，修补物((例如，臀部修补物)用由本发明的胚胎样干细胞产生的置换的软骨组织构建物包覆。在其他的实施方案中，关节(例如，膝)用由胚胎样干细胞产生的软骨组织构建物重建。软骨组织构建物也可用于不同类型关节的重建性外科手术(至于方法，参见例如，Resnick，D.，和Niwayama，G.编辑，1988，骨和关节病症的诊断Diagnosis of Bone and Joint Disorders，第二版，W.B.Saunders Co.)。
本发明的胚胎样干细胞可用于修复由疾病导致的组织和器官的损伤。在这样的实施方案中，可对患者施用胚胎样干细胞以再生或恢复已经由于疾病而损伤的组织或器官，例如，在化疗或辐射后增强免疫系统，在心肌梗塞后修复心脏组织。
本发明的胚胎样干细胞可用于在骨髓移植中增加或替代骨髓细胞。目前人自体同源和异源的骨髓移植用于治疗例如白血病、淋巴瘤和其他危急生命的病症的疾病。然而这些方法的缺陷是必须移出大量的供体骨髓以保证有足够的细胞用于移入。
根据本发明的方法收集的胚胎样干细胞可提供根据本发明的方法分化的干细胞和祖细胞，因此减少对大量骨髓捐赠的需要。本发明的方法也包括获得小的骨髓捐赠，然后例如通过在输注或移植进入受体前，在胎盘中培养和扩展增加干细胞和祖细胞的数目。
可使用从胎盘分离的，与一种或多种本发明化合物接触的胚胎样干细胞，在具体的实施方案中，在自体同源的或异源的酶替代治疗中治疗特定的疾病或病症，包括但不限于，溶酶体贮存疾病，例如Tay-Sachs、Niemann-Pick、Fabry′s、Gaucher′s、Hunter′s和Hurler′s综合症，以及其他神经节苷脂沉积症、粘多糖沉积症和糖原贮积病。
在其他的实施方案中，可使用细胞作为自体同源的或异源的转基因载体，在基因治疗中矫正先天性代谢缺陷，例如肾上腺脑白质病变、囊性纤维化、糖原贮积病、甲状腺机能减退症、镰刀形红细胞贫血病、Pearson综合症、Pompe′s疾病、苯丙酮酸尿症(PKU)、和泰-萨二氏病、卟啉症、槭糖尿病、高胱氨酸尿症、粘多糖沉积症、慢性肉芽肿病和酪氨酸血症，或治疗癌症、肿瘤或其他病理学状况。
在其他的实施方案中，该细胞可用于自体同源的或异源的组织再生或置换治疗或方法，包括但不限于治疗角膜上皮细胞缺陷、软骨修复、脸部皮肤擦除术、粘膜膜层、鼓膜、肠内隔膜、神经学结构(例如，视网膜、基底膜中的听觉神经元、嗅上皮中的嗅觉神经元)、用于皮肤外伤性创伤的烧伤和创伤修复，头皮(毛发)移植，或用于其他损害或患病器官或组织的重建。
利用本发明方法获得的大量胚胎样干细胞和/或祖代可在某些实施方案中减少对大量骨髓捐赠的需要。每千克患者的重量必须注入大约1×108-2×108个骨髓单核细胞，用于骨髓移植中的移入(即，对于70kg供体大约70ml的骨髓)。为了获得70ml，在捐赠过程中需要增强的捐赠和显著的失血。在具体的实施方案中，来自少量骨髓捐赠的细胞(例如，7-10ml)可在输注进入受体前通过在胎盘生物反应器中增殖而扩大。
此外，少量干细胞和祖细胞在血流中正常循环。在另一个实施方案中，通过血浆分离置换法收集这种外源干细胞或外源祖细胞，在该方法中退回血液，有选择地除去一种或多种成分，而将血液的其余部分再注入供体。通过本发明的方法扩展经血浆分离置换法回收的外源细胞，从而消除对全部骨髓捐赠的需要。
在另一个实施方案中，根据本发明的方法扩展的造血祖细胞被用作除化疗外的辅助治疗。大多数用于导向和破坏癌细胞的化疗试剂通过杀死所有的增殖细胞，即经历细胞分裂的细胞而起作用。因为骨髓是体内最活跃增殖的一种组织，造血干细胞经常由于化疗试剂而受到损伤或破坏并因此减少或停止血细胞的生产。必须间歇地终止化疗以容许患者的造血系统在重新开始化疗前补足血细胞供给。这可能需要1个月或更多，用于原先休眠的干细胞增殖并使白细胞计数增加到可接受的水平，以便化疗可重新开始(当再次进行时，骨髓干细胞被破坏)。
然而，当血细胞在化疗治疗的间隔期再生时，癌症也有时间生长并且可能由于自然选择而对化疗药物变得更有抗力。因此，化疗进行越久以及化疗间隔的持续时间越短，成功杀死癌症的几率越大。为了缩短化疗治疗间隔的时间，可将根据本发明方法分化的胚胎样干细胞或祖细胞导入患者。这种治疗可减少患者显示低血细胞计数的时间，并且因此容许化学治疗的较早再开始。
在另一个实施方案中，人胎盘干细胞可用于治疗或预防遗传性疾病例如慢性肉芽肿病。
4.7.治疗或预防MPD或MDS的方法
本发明包括用于治疗或预防MPD的方法，包括对需要其的患者施用有效量的JNK或MKK抑制剂。MPD可以是初级的或次级的。本发明进一步包括用于治疗先前已经治疗过MPD，以及先前没有治疗过MPD的患者的方法。由于患有MPD的患者具有异型的临床表现和不同的临床结果，可能有必要根据患者预后划分病人的阶段和根据严重程度和阶段完善治疗方法。实际上，根据本发明的方法可治疗或可预防的MPD的类型包括但不限于，原发性多血症(PRV)；原发性血小板增多症(PT)；慢性粒性白血病(CML)；急性或慢性粒细胞白血病；急性或慢性单核细胞性白血病；骨髓纤维-红白血病；和原因不明的骨髓组织异生(AMM)。
本发明包括治疗或预防MPD或与MPD相关的一种或多种症状或异常的方法，包括对需要其的患者施用有效量的JNK或MKK抑制剂。这种抑制剂可以以下列第4.8节的任何一种形式施用给患者。特异地，可对患者单独施用抑制剂，可与药物组合物，包括干细胞、脐血细胞、祖细胞或脐血干或祖细胞组合施用抑制剂，其中这些细胞已经与JNK或MKK调节剂，例如JNK或MKK调节剂接触足够的时间以调节JNK或MKK活性，或调节干或祖细胞的分化或增殖。备选地，可将包括这种细胞的药物组合物在没有JNK或MKK调节化合物的情况下施用于患者。
本发明进一步包括用于治疗或预防MDS的方法，包括对需要其的患者施用有效量的JNK或MKK抑制剂。MDS可以是初级或次级的。本发明进一步包括治疗先前已经治疗过MDS，以及先前没有被治疗过MDS的患者。由于患有MDS的患者具有异型的临床表现和不同的临床结果，可能有必要根据其预后划分患者的阶段和根据严重程度和阶段完善治疗方法。根据本发明的方法可治疗或可预防的MDS类型包括但不限于，难治性贫血(RA)、具有环状成高铁红细胞的RA(RARS)、具有过量胚细胞的RA(RAEB)、转化中的RAEB(RAEB-T)、白血病前期和慢性的单核细胞性白血病(CMML)。
本发明包括治疗或预防MDS或与MDS相关的一种或多种症状或异常的方法，包括对需要其的患者施用有效量的JNK或MKK抑制剂。这种抑制剂可以以下列第4.8节的任何一种形式施用给患者。具体地，可对患者单独施用抑制剂，或可与药物组合物，包括脐血、脐血细胞、脐血干或祖细胞、干细胞或祖细胞组合施用抑制剂，其中这些细胞已经接触JNK或MKK调节剂，例如JNK或MKK调节剂足够的时间以调节JNK或MKK活性，或调节干或祖细胞的分化或增殖。包括这种细胞的药物组合物可备选地在没有JNK或MKK调节化合物的情况下施用于患者。
在一个实施方案中，本发明提供用于治疗或预防骨髓增生性疾病的方法，包括对需要其的患者施用有效量的JNK或MKK抑制剂。在具体的实施方案中，骨髓增生性疾病是原发性多血症；原发性血小板增多症；慢性粒性白血病；急性或慢性粒细胞白血病；急性或慢性单核细胞性白血病；骨髓纤维-红白血病；或原因不明的骨髓组织异生。本发明也提供用于治疗或预防与骨髓增生性疾病相关的症状或异常的方法，包括对需要这种治疗或预防的患者施用有效量的JNK或MKK抑制剂。在具体的实施方案中，所述的症状是头痛、眩晕、耳鸣、视觉模糊、疲劳、盗汗、低热、全身性瘙痒、鼻出血、视力障碍、脾肿大、腹部胀满、血栓症、流血增加、贫血、脾梗塞、严重的骨痛、肝中的造血作用、腹水、食道静脉曲张、肝功能衰竭、呼吸窘迫或阴茎异常勃起。在另一个具体的实施方案中，异常是伴随血液的一种或多种有形元件过量产生的多潜能造血祖细胞的无性系扩展，费城染色体或bcr-abl基因的存在，外周血涂片上的泪珠状红细胞畸形，白幼红细胞血像，巨大的异常血小板，具有网状或胶原纤维化的细胞过多的骨髓或具有低百分数的前髓细胞和胚细胞的显著左偏移骨髓系列。本发明进一步提供用于治疗或预防脊髓发育不良综合症的方法，包括对需要这种治疗或预防的患者施用有效量的JNK或MKK抑制剂。在具体的实施方案中，脊髓发育不良综合症是难治性贫血、具有环状成高铁红细胞的难治性贫血、具有过量胚细胞的难治性贫血、具有转化中的过量胚细胞的难治性贫血、白血病前期或慢性的单核细胞性白血病。本发明也提供用于治疗或预防脊髓发育不良综合症的症状的方法，包括对需要这种治疗或预防的患者施用有效量的JNK或MKK抑制剂。在具体的实施方案中，所述的症状是贫血、血小板减少症、嗜中性白细胞减少症、双血细胞减少症或全血细胞减少症。
4.8.药物组合物
可将对本方法有用的JNK或MKK抑制剂以药物组合物的形式施用于患者；在一个实施方案中，以单个的单位剂型施用。这种药物组合物和单位剂型包括有效量的JNK或MKK抑制剂和药物学上可接受的载体或媒介物。
本发明的单个单位剂型适合于口腔、粘膜(例如，鼻部、舌下、阴道、面颊或直肠的)，或肠胃外(例如，皮下、静脉内、快速浓注、肌内或动脉内)、透过真皮起作用的、眼内或透过皮肤的施用给患者。
单个单位剂型的实例包括但不限于：片剂；囊片；胶囊，例如柔软有弹性的胶囊；扁囊；锭剂；糖锭剂；分散物；栓剂；粉剂；气雾剂例如，鼻喷入或吸入器)；凝胶；适合于对患者口腔或粘膜给药的液体剂型，包括悬浮物(例如，含水或不含水的悬浮物、水包油乳化剂或油包水液体乳胶)、溶液和酏剂；适合于对患者肠胃外给药的液体剂型；以及可重新构成，以提供适合于对患者肠胃外给药的液体剂型的无菌固体(例如，晶体或非晶固体)。
剂型的组成、形状和类型可根据其用途而变化。例如，用于疾病的急性治疗的剂型可相对于用于同样疾病的慢性治疗的剂型包括较大量的JNK或MKK抑制剂。类似地，肠胃外剂型可相对于用于治疗相同疾病的口服形式包括较少量的JNK或MKK抑制剂。其中由本发明包括的具体剂型的这些及其他方式相互之间的差别对于本领域的技术人员来说是显而易见的。参见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences(第十八版，1990)。
在另一个实施方案中，本发明包括包含分离的脐血群体的药物组合物，其中该脐血群体已经用根据本发明的方法通过暴露于有效量的JNK或MKK抑制剂而分化的造血祖细胞扩大。
在另一个实施方案中，本发明包括包含未处理的造血祖细胞的药物组合物，其中该造血祖细胞根据本发明的方法与有效量的JNK或MKK抑制剂组合。
典型的药物组合物和剂型包括药物学上可接受的载体或媒介物。药物组合物和剂型可进一步包括药物学上可接受的赋形剂。合适的赋形剂是制药领域的技术人员公知的，并且在此提供合适赋形剂的非限制性的实施例。特定的赋形剂是否适合于掺入药物组合物或剂型取决于本领域已知的多种因素，包括但不限于，其中剂型将施用于患者的方式。例如，口服剂型，例如片剂可以包含不适合于在肠胃外剂型中使用的赋形剂。特定赋形剂的适用性也可能取决于剂型中具体的活化剂。例如，一些赋形剂，例如乳糖或受潮可能促进一些活化剂的分解。因此，本发明包括即使有，也是包含少量乳糖、其他的单或二糖的药物组合物和剂型。如在此所使用的，术语“无乳糖”指即使存在，乳糖的数量不足以基本上增加活化剂的降解速率。
本发明的无乳糖组合物可包括本领域已知的和例如在美国药典U.S.Pharmacopeia(USP)25-NF20(2002)中所列出的赋形剂。通常，无乳糖的组合物包括药物学上适合的和药物学上可接受数量的JNK或MKK抑制剂、粘合剂或填充剂，和润滑剂。在一个实施方案中，无乳糖剂型包括JNK或MKK抑制剂、微晶纤维素、预糊化淀粉和硬脂酸镁。
本发明的无水(包括小于大约5％重量的水)药物组合物和剂型可利用无水或包含低水分的试剂，以及低水分或低湿度的条件来制备。
可制备并储存无水的药物组合物以便维持其无水的特性。因此，可利用已知能防止暴露于水的物质来包装无水组合物以使得它们可被包括在合适的配方试剂盒中。合适的包装实例包括但不限于气密性的箔、塑性的单位剂量容器(例如，小瓶)、发泡包装以及胶条包装。
本发明进一步包括包含稳定剂，包括但不限于抗氧化剂，例如抗坏血酸、pH缓冲液或盐缓冲液的药物组合物和剂型。
4.8.1口服剂型
本发明的适合于口服的药物组合物可作为不连续的剂型存在，包括但不限于，片剂(例如，可嚼片)、囊片、胶囊和液体(例如，调味的糖浆)。这种剂型包含预先确定数量的JNK或MKK抑制剂，并且可通过本领域技术人员公知的方法制备。一般参见，Remington′sPharmaceutical Sciences，(第18版，1990)。
本发明的典型口服剂型是根据传统的药物混合技术通过将JNK或MKK抑制剂与药物学上可接受的载体或媒介物混合而常规制备的。赋形剂可根据所需要给药的制剂形式而采用多种形式。例如，适用于口服的液体或气雾剂剂型的赋形剂包括但不限于水、乙二醇、油剂、乙醇；调味剂、防腐剂和着色剂。适用于固体口服剂形式(例如，粉剂、片剂、胶囊剂和囊片)的赋形剂的实例包括但不限于淀粉、糖、微结晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。
由于其易于给药，片剂和胶囊代表最有利的口服剂量单位形式，而在这种情况下使用固体赋形剂。如果需要，片剂可通过标准的含水或非水的技术包覆。这种剂型可通过任何制药方法制备。通常，药物组合物和剂型是通过将JNK或MKK抑制剂与液体载体、精细粉碎的固体载体或两者都混合而制备的，然后如有必要，使产物成型为所需要的外形。
例如，片剂可通过压缩或模型来制备。压制的片剂可通过在合适的机器中，压缩自由流动形式的JNK或MKK抑制剂，例如粉末或颗粒，任选地与赋形剂混合而制备。模制片可通过在合适的机器中塑模润湿的粉末化合物与惰性液体稀释剂的混合物而制备。
可用于本发明口服剂型的赋形剂的实例包括但不限于粘合剂、填充剂、崩解剂和润滑剂。适用于药物组合物和剂型的粘合剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其他淀粉、白明胶、天然和合成的胶体，例如阿拉伯胶、海藻酸钠、藻酸、其他藻酸盐、粉碎的黄芪胶、瓜耳豆胶、纤维素及其衍生物(例如，乙基纤维素、醋酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预糊化淀粉、羟丙基甲基纤维素(例如，Nos.2208，2906，2910)、微晶纤维素及其混合物。
微晶纤维素的合适形式包括但不限于，作为AVICEL-PH-101、AVICEL-PH-103、AVICELRC-581、AVICEL-PH-105出售的物质及其混合物(可以从FMC公司，American Viscose Division，AvicelSales，Marcus Hook，PA获得)。特异的粘合剂是作为AVICELRC-581出售的微晶纤维素和羧甲基纤维素钠的混合物。合适的无水或低水分赋形剂或添加剂包括AVICEL-PH-103和淀粉1500LM。
适用于在此所公开的药物组合物和剂型的填充剂的实例包括但不限于，滑石粉、碳酸钙(例如，颗粒或粉末)、微晶纤维素、粉末纤维素、葡萄糖结合剂、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨糖醇、淀粉、预糊化淀粉及其混合物。本发明的药物组合物中的粘合剂或填充剂一般以占药物组合物或剂型的大约50-99的重量百分数存在。
崩解剂可用于本发明的组合物中以提供暴露于水相环境时崩解的片剂。包含太多崩解剂的片剂可能在储藏中崩解，而包含太少崩解剂的片剂可能不能以所需要的比率或在需要的情况下崩解。因此，应该使用既不是太多也不是太少的，不会不利地改变活化剂的释放的足够数量的崩解剂来形成本发明的固体口服剂型。所使用的崩解剂的数量根据配方的种类而变化，并且对于本领域的技术人员是可轻易辨别的。药物组合物可以包含大约0.5-15重量百分数的崩解剂，在一个实施方案中，包含大约1-5重量百分数的崩解剂。
可用于本发明的药物组合物和剂型的崩解剂包括但不限于，琼脂、藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲纤维素钠、聚乙烯聚吡咯烷酮、离子交换树脂钾、淀粉羟基乙酸钠、马铃薯或木薯淀粉、其他淀粉、预糊化淀粉、其他淀粉、粘土、其他藻胶、其他纤维素、胶体及其混合物。
可用于本发明的药物组合物和剂型的润滑剂包括但不限于，硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻质矿物油、甘油、山梨糖醇、甘露醇、聚乙二醇、其他的乙二醇、硬脂酸、十二烷基硫酸钠、滑石粉、氢化植物油(例如，花生油、棉籽油、向日葵油芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂及其混合物。另外的润滑剂包括例如，硅石硅胶(AEROSIL 200，由W.R.Grace Co.，Baltimore，MD制造)，合成硅的凝结气雾剂(由Degussa Co.，Plano TX销售)，CAB-O-SIL(火成的二氧化硅产品，由Cabot Co.，Boston，MA出售)，及其混合物。如果完全使用，一般润滑剂以小于药物组合物或剂型的大约1的重量百分数数量，混合入其中而使用，
本发明的固体口服剂型可以包括JNK或MKK抑制剂、无水乳糖、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硬脂酸、胶态的无水氧化硅和明胶。
4.8.2延迟释放的剂型
JNK或MKK抑制剂可经本领域技术人员公知的控制-释放的方式或经递送设备而施用。实例包括但不限于，在美国专利号：3,845,770；3,916,899；3,536,809；3,598,123；和4,008,719；5,674,533；5,059,595；5,591,767；5,120,548；5,073,543；5,639,476；5,354,556和5,733,566中所描述的，其每个在此引入作为参考。可使用剂型来提供一种或多种JNK或MKK抑制剂的缓慢或控制的释放，例如利用氢丙基甲基纤维素、其他的聚合物基质、凝胶剂、渗透膜、渗透系统、多层涂层、微粒、脂质体、微球体，或其组合，以提供所需要的不同比例的释放分布。本领域技术人员已知的合适的控制释放剂型，包括在此所描述的剂型，可轻易地被选择出来而与JNK或MKK抑制剂一起使用。因此，本发明包括适用于口服的单个单位剂型，例如但不限于，适合于控制释放的片剂、胶囊剂、软胶囊和囊片。控制释放的药物组合物可以与其非控制的对应物具有共同的改善药物疗法的目的。
控制释放剂型的优点包括扩大药物的活性，减少剂量频率以及增加患者的适应性。此外，控制释放的剂型可用于影响开始作用的时间或其他特性，例如药物的血液水平，并且可因此影响副(例如，不利)作用的发生。
控制释放剂型可被设计成最初释放一定量的迅速产生所需要的治疗作用的JNK或MKK抑制剂，并且逐渐和连续地释放其他数量的JNK或MKK抑制剂以维持治疗或预防作用的水平达到一段持续的时间。为了维持体内JNK或MKK抑制剂的恒定水平，JNK或MKK抑制剂应该以能替代被代谢和从机体排出的JNK或MKK抑制剂的数值的速度从剂型中释放。JNK或MKK抑制剂的控制释放可受到各种情况的刺激，包括但不限于pH、温度、酶、水或其他的生理条件或化合物。
4.8.3肠胃外的剂型
肠胃外的剂型可经各种途径施用于患者，包括但不限于皮下的、静脉内的(包括快速浓注)、肌内的、眼内的和动脉内的。由于其施用一般绕过患者对污染物的天然防御，肠胃外的剂型可以是无菌的或在施用于患者前能够进行灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于，准备用于注射的溶液、准备溶解或悬浮在药物学上可接受的用于注射的媒介物中的干燥产品、准备用于注射的悬浮液以及乳剂。
可用于提供本发明的肠胃外剂型的合适的媒介物是本领域技术人员公知的。实例包括但不限于：注射用水USP；含水媒介物，例如但不限于氯化钠注射液、Ringer′s注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液，以及Ringer′s乳酸盐注射液；易混溶于水的媒介物，例如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；以及无水的媒介物，例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
增加JNK或MKK抑制剂可溶性的化合物也可被掺入本发明的肠胃外剂型。例如可使用环糊精及其衍生物。参见，例如美国专利号5,134,127，其在此引入作为参考。
4.8.4局部和粘膜的剂型
本发明的局部和粘膜剂型包括但不限于，喷雾剂、气雾剂、溶液、乳剂、混悬液，或其他本领域技术人员已知的形式。参见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences(第18版，1990)；和药物剂型导言Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms(第4版，1985)。适用于在口腔内治疗粘膜组织的剂型可以作为漱口药或作为口服凝胶配制。
本发明所包括的合适的赋形剂(例如，载体和稀释剂)及其他可用于提供局部和粘膜剂型的物质是药物领域技术人员公知的，并且可取决于给定的药物组合物或剂型所要应用的特定组织。一般的赋形剂包括但不限于水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁烷-1，3-二醇、豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油及其混合物，以形成无毒的和药物学上可接受的溶液、乳剂或凝胶剂。如果需要，也可向药物组合物和剂型是加入补湿剂或湿润剂。这种附加试剂的实例是本领域众所周知的。参见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences(第18版，1990)。
也可调节药物组合物或剂型的pH以改善一种或多种活化剂的递送。类似地，可调节溶剂载体的极性、其离子强度或渗透性以改善递送。也可向药物组合物或剂型加入化合物例如硬脂酸盐以改变JNK或MKK抑制剂的亲水性或亲油性以便改善递送。关于这一点，硬脂酸盐可作为用于剂型的脂类媒介物，作为乳化剂或表面活性剂，以及作为加强递送或增加穿透力的试剂。JNK或MKK抑制剂的盐、水合物或溶剂化物可进一步用于调节所得到的组合物的特性。
在本发明的一个实施方案中，JNK或MKK抑制剂通过肠胃外的、静脉内的、皮下的、皮内的、眼内、局部的、粘膜的或口服途径施用，并且是大约0.1mg-大约2500mg，大约1mg-大约2000mg，或10mg-大约1500mg，或50mg-大约1000mg，或100mg-大约750mg，或250mg-大约500mg数量的单个或分多次的有效每日剂量。
在一个实施方案中，对患者施用JNK或MKK抑制剂作为循环治疗的一部分。循环治疗包括对指定的时段施药，然后对另一个指定的时段施药并且重复该顺序的给药。循环治疗可减少对一种或多种治疗的抗性的发展，避免或减少治疗的副作用，和/或改善治疗的效能。
在一个实施方案中，对JNK或MKK抑制剂进行大约16周的循环给药，大约每天一次或两次。一个给药循环可包括JNK抑制剂的给药和至少一(1)或三(3)周的不给药。循环的数目可从大约1变化到大约12个循环，更一般地为大约2至大约10个循环，更一般地为大约2至大约8个循环。
本发明的化合物优选在用于人之前，在体外和体内分析所需要的治疗或预防活性。例如，可使用体外分析来确定给药本发明的特异化合物或本发明化合物的组合是否是优选的。本发明的化合物和组合物也可利用动物模型系统来证明是有效和安全的。其他方法是技术人员已知的并且是在本发明的范围内。
本发明也提供包括药物学上可接受的载体和干细胞和/或祖细胞的药物组合物，其中所述的细胞已经与JNK或MKK调节剂，优选JNK或MKK抑制剂接触一段时间以有效地提供所述的JNK或MKK活性的调节或抑制。在一个实施方案中，药物组合物可包括已经接触了JNK或MKK抑制剂的干或祖细胞的单个群体，或多个这种群体，并且可能包括全部或部分或完全不是从该组合物的最终受体的人所形成的这种群体。在另一个实施方案中，药物组合物可包括用JNK或MKK抑制剂接触或处理的干细胞和/或祖细胞以及未处理的细胞。在另一个实施方案中，药物组合物可包括处理的干细胞和/或祖细胞以及与其组合的外周血或脐血。在该实施方案中，外周血或脐血可以是未处理的，或可能是单独处理或与干和/或祖细胞一起处理的。上述任何药物组合物可另外包括一种或多种JNK或MKK调节剂，例如一种或多种JNK或MKK抑制剂。
因此，在一个实施方案中，本发明提供包括哺乳动物干细胞和药物学上可接受的载体的药物组合物，其中所述的干细胞已经与抑制JNK或MKK活性的化合物接触一段时间，足够产生对所述的JNK或MKK活性的调节。在另一个实施方案中，本发明提供包括哺乳动物祖细胞和药物学上可接受的载体的药物组合物，其中所述的祖细胞已经与抑制JNK或MKK活性的化合物接触一段时间，足够产生对所述的JNK或MKK活性的调节。在另一个实施方案中，本发明提供包括哺乳动物干细胞或祖细胞和药物学上可接受的载体的药物组合物，其中所述的干细胞或祖细胞已经与抑制JNK或MKK活性的化合物接触一段时间，足够引起对所述的干细胞或祖细胞的分化或增殖的调节。
在具体的实施方案中，对于上述包含干细胞的药物组合物，本发明提供的干细胞选自胚胎干细胞、成人细胞、脐血细胞、胎盘干细胞或外周血干细胞。在上述任何方法的另一个具体的实施方案中，化合物是酰亚胺或酰胺。在上述任何方法的另一个具体实施方案中，接触步骤在细胞培养物中进行。在另一个具体的实施方案中，化合物的浓度是大约0.005μg/ml-大约5mg/ml。另一个具体的实施方案中，化合物的浓度是大约1μg/ml-大约2mg/ml。在另一个具体的实施方案中，干细胞是人干细胞。在包含祖细胞的药物组合物的另一个具体实施方案中，所述的祖细胞是人祖细胞。在另一个具体的实施方案中，祖细胞是造血祖细胞。在上述方法的另一个具体实施方案中，所述的分化是分化成为造血细胞。在更具体的实施方案中，造血细胞是CD34+或CD38+。在另一个更具体的实施方案中，造血细胞是CD11b+。
本发明也提供包括在药物学上可接受的载体中的分离脐血细胞和白细胞的分离群体的药物组合物，其中白细胞是通过下列方法产生的，该方法包括在适宜条件下和存在抑制JNK活性或MKK活性的化合物时分化干细胞，并且因此分离分化的白细胞。在另一个实施方案中，本发明提供包括在药物学上可接受的载体中的分离脐血细胞和白细胞的分离群体的药物组合物，其中白细胞是通过下列方法产生的，该方法包括在适宜条件下和存在抑制祖细胞JNK活性或MKK活性的化合物时分化祖细胞，并且因此分离分化的白细胞。在具体的实施方案中，所述的分化是在细胞培养物中进行的。在另一个具体的实施方案中，化合物的浓度为0.005μg/ml-5mg/ml。在另一个具体的实施方案中，化合物的浓度为1μg/ml-2mg/ml。在另一个具体的实施方案中，干细胞是人干细胞。在另一个具体的实施方案中，祖细胞是造血祖细胞。本发明进一步提供分化的细胞的制剂，如果合适的话，其可以包括在上述的药物组合物内，或可能用于不同的目的。这种制剂可包括干细胞或祖细胞，优选人的干细胞或祖细胞，其已经与一种或多种JNK或MKK调节化合物接触一段时间，足够在所述的细胞内可检测地调节，优选可检测地抑制JNK或MKK活性，或接触一段时间，足够调节所述干或祖细胞的增殖或分化。在优选的实施方案中，将所述的干或祖细胞与一种或多种JNK或MKK调节剂，优选JNK或MKK抑制剂接触一段时间，足够分化所述的干细胞或祖细胞成为终末分化的细胞。在制剂的变化中，制剂包括已经与JNK或MKK调节剂接触足够时间，以分化干细胞成为一种或多种细胞谱系的祖细胞的干细胞。
5.实施例
5.1.实施例1：JNK或MKK抑制剂对CD34+祖细胞分化的影响
利用下列分析确定JNK或MKK抑制剂对CD34+(造血祖代)细胞分化和集落形成单位(CFU)产生的影响。显著地，该分析表明JNK或MKK抑制剂能够特异地抑制红细胞生成集落(BFU-E和CFU-E)的产生，同时增加形成的白细胞和血小板集落(CFU-GM)的产生并且增强总的集落形成单位(总的-CFU)的产生。因此本发明的方法可用于调节干细胞的分化，并且还可用于刺激集落形成的比率，通过改善骨髓移入的速度和白细胞和/或血小板产生的恢复而提供有利于造血干细胞移植的显著益处。
将脐带血CD34+造血祖细胞以每孔1000个细胞的密度接种在含有补充有20％胎牛血清和细胞因子(IL-3，G-CSF和试剂盒-配体(R&D系统，公司)的IMDM的96孔培养碟中。将细胞暴露于浓度在0.001μg/ml-5mg/ml之间的JNK或MKK抑制剂，或DMSO(对照化合物)，并且容许培养6白天。将脐带血CD34+细胞以1000个细胞/每孔的密度接种在含有补充有20％胎牛血清和细胞因子(IL-3，G-CSF和试剂盒-配体(KL)(R&D系统，公司))的IMDM的96孔培养碟中。培养后，染色细胞并且用激发荧光细胞分离器(FACS)分拣。收获400μl的染色细胞并且用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1％胎牛血清稀释到1.0ml。计数细胞以确定对干细胞分化调节的影响。
这些结果表明本发明的化合物在造血祖代干细胞谱系定向的调节中是有效的。因此，该化合物可用于特异地抑制红细胞或红细胞生成集落(BFU-E和CFU-E)的产生，同时增加形成白细胞和血小板的集落(CFU-GM)的产生并且增强总的集落形成单位的产生。因此本发明的方法可用于调节干细胞的分化，并且还可用于刺激特定的集落形成的速率，通过改善骨髓移入的速度和通过起始干细胞定向于所需要的可移入谱系恢复白细胞和/或血小板的生产而提供有利于造血干细胞移植的显著益处。
5.2.实施例2：JNK或MKK抑制剂对人脐带血CD34+细胞的增殖和分化的影响
在下面的实施例中，研究了JNK或MKK抑制剂对脐带血(CB)单核细胞增殖和分化成为CD34+(造血祖代)细胞的影响。脐带血单核细胞是包括一小群造血祖代(CD34+)细胞的混合的细胞群体。一小组该小的CD34+细胞群体包括CD34+CD38+细胞的群体(大约总的CB单核细胞的1％)和甚至更小的CD34+CD38-细胞的群体(小于总的CB单核细胞的1％)。显著地，结果可以表明与正负对照相比，CD34+细胞上调了(增加分化)，并且抑制或减慢了造血干细胞或祖细胞的分化。
材料和方法：CB CD34+细胞起始于补充有细胞因子(IL3，G-CSF和Kit-配体)(R&D系统，公司)的20％FCS IMDM(胎牛血清/Iscove′s改进的Dulbecco′s培养基)24-孔平板中的4×104细胞/ml。JNK或MKK以各种浓度将抑制剂包括到培养物中。使用相同体积的DMSO作为对照。也使用没有任何化合物的阴性对照。在湿润的恒温箱中于37℃和5％的CO2培养细胞7天。然后从每个孔收获细胞。通过在CELL-DYN1700(Abbott Diagnostics)中计数确定来自每个孔的总的细胞数目，并且通过FACS(荧光激活细胞分类)染色法对CXCR4，CD45，CD34，CD38，CD11b和Gly-A的表达进行分析。
5.3.实施例3：JNK或MKK抑制剂对人脐带血单核细胞的影响
通过标准的Ficoll分离方法对利用标准方法已经冷藏并解冻的脐带血MNCs进行分离，并且一式三份地在具有细胞因子(各自为IL6，KL和G-CSF 10ng/ml)的20％FCS-IMDM中以0.5×106细胞/ml在24孔平板中培养。实验组是无(只有细胞因子)、DMSO(1.7μL)和在DMSO中变化浓度的JNK或MKK抑制剂。培养1周后收获培养的细胞并通过FACS染色法分析。
5.4.实施例4：JNK或MKK抑制剂对单核细胞生产的影响
将纯化的人脐带血CD34+细胞(大于90％的CD34+)在补充有细胞因子(IL3，IL6，G-CSF，KL和Epo)的20％ FCS IMDM培养基中以4×104细胞/ml，在湿润的5％ CO2恒温箱中培养14天。实验组由其中(i)没有加入DMSO或化学化合物(“无”)，(ii)只有DMSO，和(iii)溶于DMSO的JNK或MKK抑制剂的一组组成。收获细胞等分，并且通过用CD34-PE轭合的单克隆抗体和CD14-FITC轭合的单克隆抗体染色来确定CD34和CD14的表达。
5.5.实施例5：JNK或MKK抑制剂对来自脐带血和胎盘的移植的有核细胞的影响
该实验表明JNK或MKK抑制剂预处理增加了移植的胎盘有核细胞(PLNC)、脐带血有核细胞(UCBNC)和骨髓细胞(BMNC)的存活力。
胎盘有核细胞(PLNC)、脐带血有核细胞(UCBNC)和骨髓细胞(BMNC)是从人供体获得的。PLNC和UCBNC是利用上述第4.1和4.2节所描述的方法从胎盘和脐带获得的。
在补充有含10μg/ml的JNK或MKK抑制剂的2％人CB血清的DMEM中培养细胞24小时而预处理细胞。然后洗涤细胞，重悬在自体同源的血浆中并且静脉内施用于成年SJL/L小鼠受体(Jackson实验室)，该小鼠已经根据标准方法通过致死照射(900cGy)而产生了骨髓切除。这种照射比通过50天照射后90％的致死更好(Ende等人，2001，生命科学Life Sci.69(13)：1531-1539；Chen和Ende，2000，医学杂志J.Med.31：21-30；Ende等人，2000，生命科学Life Sci.67(1)：53-9；Ende和Chen，2000，Am.J.Clin.Pathol.114：89)。
5.6.实施例6：诱导分化成为特定细胞类型
通过暴露于生长因子来诱导脐带血细胞和/或胚胎样干细胞分化成为特定的细胞类型。用于引发诱导的生长因子包括但不限于：GM-CSF、IL-4、Flt3L、CD40L、IFN-α、TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6、视黄酸、碱性的成纤维细胞生长因子、TGF-β-1、TGF-β-3、肝细胞生长因子、表皮生长因子、促心跳激素-1、血管紧张素原、血管紧张素I(AI)、血管紧张素II(AII)、All AT2类型2受体激动剂或其类似物或片段。
5.6.1.诱导分化成为神经元
本实施例描述诱导脐带血细胞和/或胚胎样干细胞分化成为神经元。使用下列方法诱导神经元的分化：
1.让胎盘干细胞在由DMEM/20％FBS和1mM β-巯基乙醇组成的预诱导的培养基中生长24hr。
2.除去预诱导的培养基并且用PBS洗涤细胞。
3.加入由DMEM和1-10mMβ-巯基乙醇组成的神经元诱导培养基。备选地，可使用由DMEM/2％DMSO/200μM丁基化的羟基苯甲醚组成的诱导培养基来增强神经元的分化效率。
4.在某些实施方案中，形态学和分子的变化可早在暴露于无血清培养基和β-巯基乙醇后60分钟时发生(Woodbury等人，J.Neurosci.Res.，61：364-370)。可使用RT/PCR评估例如神经生长因子受体和神经丝重链基因的表达。
5.6.2.诱导分化成为脂肪细胞
本实施例描述了诱导脐带血细胞和/或胚胎样干细胞分化成为脂肪细胞。使用下列方法诱导产生脂肪的分化：
1.让胎盘干细胞在MSCGM(Bio Whittaker)或补充有15％脐带血血清的DMEM中生长。
2.使用3个循环的诱导/维持。各个循环由用脂肪形成诱导培养基(Bio Whittaker)喂养胎盘干细胞并且培养该细胞3天(在37℃，5％CO2)，然后在脂肪形成维持培养基中(Bio Whittaker)培养1-3天组成。所使用的诱导培养基包含1μM地塞米松、0.2mM吲哚美辛、0.01mg/ml胰岛素、0.5mM IBMX、高DMEM葡萄糖、FBS和抗生素。
3.在3个完全的诱导/维持循环后，另外在脂肪形成维持培养基中培养细胞7天，每隔2-3天替换培养基。
4.可通过多重胞质内的脂类囊泡的发育而评估脂肪形成，该脂类囊泡可利用亲脂性的染色油红O轻易地观察到。使用RT/PCR分析检验结合脂肪酶和脂肪酸的蛋白基因的表达。
5.6.3.诱导分化成为软骨细胞
本实施例描述了诱导脐带血细胞和/或胚胎样干细胞分化成为软骨细胞。使用下列方法诱导形成软骨的分化：
1.让胎盘干细胞在MSCGM(Bio Whittaker)或补充有15％脐带血血清的DMEM中维持。
2.将胎盘干细胞等分到无菌的聚丙烯试管中。离心细胞(150×g，5分钟)，并且在不完全的软骨形成培养基(Bio Whittaker)中洗涤两次。
3.在最后的洗涤后，在包含0.01μg/ml TGF-β-3的完全的软骨形成培养基(Bio Whittaker)中重悬细胞到浓度为5×10(5)细胞/ml。
4.将等分0.5ml的细胞加入到15ml的聚丙烯培养试管中。在150×g沉淀细胞5分钟。将沉淀的颗粒细胞完整地保留在培养基中。
5.将松开盖的试管在37℃，5％CO2培养24小时。
6.每隔2-3天用新鲜制备的完全软骨形成培养基培养细胞沉淀颗粒。
7.利用低速涡旋通过每日搅动将沉淀颗粒保持悬浮在培养基中。
8.培养14-28天后，收获形成软骨的细胞的沉淀颗粒。
9.软骨形成可通过例如，观察嗜酸性基质的产生，评估细胞形态，和/或用于检验胶原2和胶原9基因表达的RT/PCR而鉴定。
5.6.4.诱导分化成为骨细胞
本实施例描述了诱导脐带血细胞和/或胚胎样干细胞分化成为骨细胞。使用下列方法诱导成骨的分化：
1.将胎盘干细胞的附着培养物在MSCGM(Bio Whittaker)或补充有15％脐带血血清的DMEM中培养。
2.在组织培养瓶中静置培养24小时。
3.成骨的分化通过用包含0.1μM地塞米松、0.05mM抗坏血酸-2磷酸盐、10mMβ磷酸甘油的成骨诱导培养基(Bio Whittaker)替换MSCGM而诱导。
4.每隔3-4天用成骨的诱导培养基喂养细胞2-3周。
5.利用钙-特异的染色和用于碱性磷酸酶和骨桥蛋白基因表达的RT/PCR分析分化。
5.6.5.诱导分化成为肝细胞
本实施例描述了诱导脐带血细胞和/或胚胎样干细胞分化成为肝细胞。使用下列方法诱导生成肝组织的分化：
1.将胎盘干细胞在补充有20ng/ml肝细胞生长因子；和100ng/ml表皮生长因子的DMEM/20％CBS中培养。可在FBS的替代中使用敲除血清的替换。
2.向诱导培养瓶加入IL-650ng/ml。
5.6.6.诱导分化成为胰腺细胞
本实施例描述了诱导脐带血细胞和/或胚胎样干细胞分化成为胰腺细胞。使用下列方法诱导胰腺的分化：
1.将胎盘干细胞在补充有碱性的10ng/ml成纤维细胞生长因子；和2ng/ml转化生长因子β-1的DMEM/20％CBS中培养。可在CBS的替代中使用敲除血清的替换。
2.向培养基加入来自干蛋白-阳性的神经元细胞培养物的条件培养基到浓度为50/50。
3.培养细胞14-28天，每3-4天重新喂养。
4.通过分析胰岛素蛋白质或通过RT/PCR分析胰岛素基因表达而鉴定分化。
5.6.7.诱导分化成为心脏细胞
本实施例描述了诱导脐带血细胞和/或胚胎样干细胞分化成为心脏细胞。使用下列方法诱导生肌的分化：
1.将胎盘干细胞在补充有1μM视黄酸；10ng/ml碱性的成纤维细胞生长因子；和2ng/ml转化生长因子β-1；和100ng/ml表皮生长因子的DMEM/20％CBS中培养。可在CBS的替代中使用敲除血清的替换。
2.备选地，将胎盘干细胞在补充有50ng/ml促心跳激素-1的DMEM/20％CBS中培养24小时。
3.备选地，将胎盘干细胞在无蛋白质的培养基中维持5-7天，然后用人心肌提取物(逐步增加的剂量分析)刺激。心肌提取物是通过在补充有1％脐带血血清的1％HEPES缓冲液中均质化1gm人心肌而产生的。培养悬浮物60分钟，然后离心并收集上清液。
4.培养细胞10-14天，每3-4天重新喂养。
5.利用心动蛋白RT/PCR基因表达分析来评估分化。
5.6.8.分化前和/或之后的脐带血细胞和/或胚胎样干细胞的鉴定
将胚胎样干细胞、脐带血细胞和/或用胚胎样干细胞穿刺的脐带血细胞群在分化前和/或之后，通过利用技术例如流式细胞计数术和免疫细胞化学技术测量形态学和细胞表面标记的变化，并且利用技术例如PCR测量基因表达的变化而进行鉴定。已经暴露于生长因子和/或已经分化的细胞特征为具有下列细胞表面标记：CD10，CD29，CD44，CD54，CD90，SH2，SH3，SH4，OCT-4和ABC-p，或缺乏下列细胞表面标记：CD34，CD38，CD45，SSEA3和SSEA4，或在不同哺乳动物种属中的其同等物。优选地，胚胎样干细胞在分化前的特征为存在细胞表面标记OCT-4或ABC-p，并缺乏细胞表面标记CD34和CD38。具有这些标记的干细胞与人胚胎干细胞一样是可变的(例如多潜能的)。脐带血细胞是在分化前通过存在细胞表面标记CD34和CD38而被鉴定的。来源于胚胎样干细胞、脐带血细胞和/或用胚胎样干细胞穿刺的脐带血细胞群分化的细胞优选地不表达这些标记。
本发明不受限于在此所描述的具体实施方案的范围内。实际上，除在此所描述的实施方案外，根据上述描述对本发明进行各种改变对于本领域的技术人员来说是显而易见的。这种改变是属于所附的权利要求的范围内的。
在此引用的所有参考文献在此全部引入作为参考，为了所有的目的达到相同的程度，正如各个单独的出版物、专利、专利申请具体并且分别地指明为了所有目的全部引入作为参考。
对任何出版物的引用是在提交日期之前的其所公开的内容，而不应认为是承认本发明借助于在前发明的提前公开而不被授权。

Claims (58)

1.调节哺乳动物干细胞分化的方法，包括在适合于所述干细胞分化的条件下，将该干细胞与调节JNK或MKK活性的化合物接触。
2.权利要求1的方法，其中该化合物抑制JNK或MKK的活性。
3.调理哺乳动物干细胞的方法，包括将该干细胞与调节JNK或MKK活性的化合物接触。
4.权利要求3的方法，其中所述的化合物抑制JNK或MKK的活性。
5.权利要求3的方法，其中哺乳动物干细胞或祖细胞被冷藏并在所述的调理前被解冻。
6.将哺乳动物干细胞或祖细胞移植到需要其的患者中的方法，包括：
(a)将该干细胞或祖细胞与抑制JNK活性的化合物接触，以产生处理的干细胞或祖细胞；以及
(b)将该处理的干细胞移植到所述的患者中。
7.权利要求6的方法，其中步骤(b)包括将所述的处理的干细胞与未处理的细胞一起施用。
8.权利要求7的方法，其中未处理的细胞选自胚胎干细胞、胎盘干细胞、成人干细胞、脐带血细胞、骨髓细胞和外周血细胞。
9.权利要求7的方法，其中在所述的接触前哺乳动物干细胞已经被冷藏并解冻。
10.产生造血细胞的方法，包括将哺乳动物干细胞在适合于该干细胞分化的条件下，与抑制JNK或MKK活性的化合物接触，其中所述的分化导致造血细胞的产生。
11.权利要求1、3、6或10的方法，其中所述的干细胞选自胚胎干细胞、胎盘干细胞、成人干细胞、脐带血细胞、外周血细胞和骨髓细胞。
12.权利要求1、3、6或10的方法，其中所述的干细胞是人的干细胞。
13.权利要求1、3、6或10的方法，其中所述的化合物是吲唑、苯胺基嘧啶、异噻唑并蒽酮、异噁唑并蒽酮、异吲哚并蒽酮或吡唑并蒽酮。
14.权利要求1、3、6或10的方法，其中所述的接触步骤是体外进行的。
15.权利要求1、3、6或10的方法，其中所述的化合物的浓度为0.005μg/ml至5mg/ml。
16.权利要求15的方法，其中所述的化合物的浓度为1μg/ml至2mg/ml。
17.权利要求10的方法，其中所述的造血细胞是造血祖细胞。
18.包括哺乳动物干细胞和药物学上可接受的载体的药物组合物，其中所述的干细胞已经与抑制JNK或MKK活性的化合物接触足够的一段时间以产生对所述干细胞分化或增殖的调节。
19.包括哺乳动物祖细胞和药物学上可接受的载体的药物组合物，其中所述的干细胞已经与抑制JNK或MKK活性的化合物接触足够的一段时间以产生对所述祖细胞分化或增殖的调节。
20.权利要求18的药物组合物，其中所述的干细胞选自胚胎干细胞、成人细胞、脐带血细胞、胎盘干细胞或外周血干细胞。
21.权利要求18或19的药物组合物，其中所述的化合物是酰亚胺或酰胺。
22.权利要求18或19的药物组合物，其中所述的接触步骤是在细胞培养物中进行的。
23.权利要求18或19的药物组合物，其中所述的化合物的浓度是大约0.005μg/ml至大约5mg/ml。
24.权利要求18或19的药物组合物，其中所述的化合物的浓度是大约1μg/ml至大约2mg/ml。
25.权利要求18的药物组合物，其中所述的干细胞是人干细胞。
26.权利要求19的药物组合物，其中所述的祖细胞是人的祖细胞。
27.权利要求19的药物组合物，其中所述的祖细胞是造血祖细胞。
28.权利要求18或19的药物组合物，其中所述的分化是分化为造血细胞。
29.权利要求28的药物组合物，其中所述的造血细胞是CD34+或CD38+。
30.权利要求28的药物组合物，其中所述的造血细胞是CD11b+。
31.在药物学上可接受的载体中包含分离的脐带血细胞和分离的白细胞群的药物组合物，其中白细胞是通过包括在适宜条件下分化干细胞并且在存在抑制JNK活性或MKK活性的化合物时，分离由此分化的白细胞的方法而产生的。
32.包括分离的脐带血细胞和分离的白细胞群的药物组合物，其中白细胞是通过包括在适宜条件下分化干细胞并且在存在抑制JNK活性或MKK活性的化合物时，分离由此分化的白细胞的方法而产生的。
33.权利要求31或32的药物组合物，其中所述的分化是在细胞培养物中进行的。
34.权利要求31或32的药物组合物，其中所述的化合物的浓度为0.005μg/ml至5mg/ml。
35.权利要求31或32的药物组合物，其中所述的化合物的浓度为1μg/ml至2mg/ml。
36.权利要求31的药物组合物，其中所述的干细胞是人干细胞。
37.权利要求32的药物组合物，其中所述的祖细胞是造血祖细胞。
38.治疗需要白细胞的哺乳动物受试个体的方法，包括在适宜的条件下和在存在抑制JNK或MKK活性的化合物时分化于细胞或祖细胞，其中所述的分化产生白细胞，并且对所述的哺乳动物受试个体施用治疗有效量的所述白细胞。
39.权利要求38的方法，其中所述的干细胞或祖细胞是在体外分化的。
40.权利要求38的方法，其中所述的干细胞或祖细胞是在产后灌流的胎盘中分化的。
41.权利要求38的方法，其中以基本上不含红细胞的细胞制品的形式将白细胞施用给作为受体的哺乳动物受试个体。
42.权利要求38的方法，其中以包含脐带血细胞的细胞制品的形式将白细胞施用给作为受体的哺乳动物受试个体。
43.权利要求38的方法，其中将白细胞与载体一起施用给作为受体的哺乳动物受试个体。
44.权利要求38的方法，其中白细胞是以静脉内方式给药的。
45.权利要求38的方法，其中白细胞表达令人感兴趣的整合的遗传物质。
46.权利要求38的方法，其中所述的哺乳动物受试个体是人。
47.将骨髓移植到需要骨髓的患者中的方法，包括将脐带血、从脐带血获得的干细胞、外周血或从外周血获得的干细胞移植给所述的患者，其中所述的脐带血、从脐带血获得的干细胞、外周血或干细胞已经与JNK或MKK的活性抑制剂接触足够的一段时间以产生对所述干细胞的分化或增殖的调节。
48.权利要求1、3、6、10、38或47中任意一项的方法，其中JNK抑制剂或MKK抑制剂是下列结构(I)的化合物：
其中：
A是直接的键、-(CH2)a-、-(CH2)bCH＝CH(CH2)c-或-(CH2)bC≡C(CH2)c-；
R1是芳基、杂芳基或与苯基稠合的杂环，每个任选地被独立地选自R3的1-4个取代基取代；
R2是-R3，-R4，-(CH2)bC(＝O)R5，-(CH2)bC(＝O)OR5，-(CH2)bC(＝O)NR5R6，-(CH2)bC(＝O)NR5(CH2)cC(＝O)R6，-(CH2)bNR5C(＝O)R6，-(CH2)bNR5C(＝O)NR6R7，-(CH2)bNR5R6，-(CH2)bOR5，-(CH2)bSOdR5或-(CH2)bSO2NR5R6；a是1，2，3，4，5或6；
b和c是相同或不同的，并且在每次再现时独立地选自0，1，2，3或4；
d在每次出现时是0，1或2；
R3在每次出现时独立地为卤素、羟基、羧基、烷基、烷氧基、卤代烷基、酰氧基、硫代烷基、亚磺酰烷基、磺酰烷基、羟烷基、芳基、芳烷基、杂环、杂环烷基、-C(＝O)OR8、-OC(＝O)R8、-C(＝O)NR8R9、-C(＝O)NR8OR9、-SO2NR8R9、-NR8SO2R9、-CN、-NO2、-NR8R9、-NR8C(＝O)R9、-NR8C(＝O)(CH2)bOR9、-NR8C(＝O)(CH2)bR9、NR8C(＝O)(CH2)bNR8R9、-O(CH2)bNR8R9或与苯基稠合的杂环；
R4是烷基、芳基、芳烷基、杂环或杂环烷基，每个任选地被独立地选自R3的1-4个取代基取代，或R4是卤素或羟基；
R5、R6和R7是相同或不同的，并且在每次出现时独立地为氢、烷基、芳基、芳烷基、杂环或杂环烷基，其中R5、R6和R7中的每一个任选地被独立地选自R3的1-4个取代基取代；以及
R8和R9是相同或不同的，并且在每次出现时独立地为氢、烷基、芳基、芳烷基、杂环或杂环烷基，或R8和R9与跟它们键合的一起形成杂环，其中R8、R9以及结合在一起形成杂环的R8和R9中的每一个任选地被1-4个独立地选自R3的取代基取代。
49.权利要求1、3、6、10、38或47中任何一项的方法，其中JNK抑制剂或MKK抑制剂是下列结构(II)的化合物：
其中：
R1是任选地被1-4个独立地选自R7的取代基取代的芳基或杂芳基；
R2是氢；
R3是氢或低级烷基；
R4代表1-4个任选的取代基，其中每个取代基是相同或不同的，并且独立地选自卤素、羟基、低级烷基和低级烷氧基；
R5和R6是相同或不同的，并且独立地为-R8、-(CH2)aC(＝O)R9、-(CH2)aC(＝O)OR9、-(CH2)aC(＝O)NR9R10、-(CH2)aC(＝O)NR9(CH2)bC(＝O)R10、-(CH2)aNR9C(＝O)R10、-(CH2)aNR11C(＝O)NR9R10、-(CH2)aNR9R10、-(CH2)aOR9、-(CH2)aSOcR9或-(CH2)aSO2NR9R10；或R5和R6与跟它们相连的氮原子一起形成杂环或取代的杂环；
R7在每次出现时独立地为卤素、羟基、氰基、硝基、羧基、烷基、烷氧基、卤代烷基、酰氧基、硫代烷基、亚磺酰烷基、磺酰烷基、羟烷基、芳基、芳烷基、杂环、取代的杂环、杂环烷基、-C(＝O)OR8、-OC(＝O)R8、-C(＝O)NR8R9、-C(＝O)NR8OR9、-SOcR8、-SOcNR8R9、-NR8SOcR9、-NR8R9、-NR8C(＝O)R9、-NR8C(＝O)(CH2)bOR9、-NR8C(＝O)(CH2)bR9、-O(CH2)bNR8R9或与苯基稠合的杂环；
R8、R9、R10和R11是相同或不同的，并且在每次出现时独立地为氢、烷基、芳基、芳烷基、杂环、杂环烷基；
或R8和R9与跟它们相连的原子一起形成杂环；
a和b是相同或不同的，并且在每次出现时独立地选自0、1、2、3或4；以及
c在每次出现时是0、1或2。
50.权利要求1、3、6、38或47中任何一项的方法，其中JNK抑制剂或MKK抑制剂是下列结构(III)的化合物：
其中R0是-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、NH或-CH2-；
结构(III)的化合物是：(i)未取代的，(ii)单取代的并且具有第一取代基，或(iii)二取代的并且具有第一取代基和第二取代基；
当存在时，第一或第二取代基是在3、4、5、7、8、9或10的位置，其中当存在时，第一和第二取代基独立地是烷基、羟基、卤素、硝基、三氟甲基，磺酰基、羧基、烷氧羰基、烷氧基、芳基、芳氧基、芳烷氧基、芳烷基、环烷基烷氧基、环烷氧基、烷氧基烷基、烷氧基烷氧基、氨基烷氧基、单-烷基氨基烷氧基、二烷基氨基烷氧基，或由结构(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)代表的基团：
其中R3和R4结合在一起并且代表亚烷基或包含杂原子的环状亚烷基，或R3和R4独立地为氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、芳氧基烷基、烷氧基烷基、氨基烷基、单-烷基氨基烷基，或二烷基氨基烷基；以及
R5是氢、烷基、环烷基、芳基、芳烷基、环烷基烷基、烷氧基、烷氧基烷基、烷氧羰基烷基、氨基、单-烷基氨基、二烷基氨基、芳氨基、芳烷基氨基、环烷基氨基、环烷基烷基氨基、氨基烷基、单-烷基氨基烷基，或二烷基氨基烷基。
51.治疗或预防骨髓增生性疾病的方法，包括给需要这种治疗或预防的患者施用有效量的JNK抑制剂或MKK抑制剂。
52.权利要求51的方法，其中所述的骨髓增生性疾病是真性红细胞增多症；原发性血小板增多症；慢性粒性白血病；急性或慢性的粒细胞性白血病；急性或慢性的单核细胞性白血病；骨髓纤维-红白血病；或原因不明的骨髓组织异生。
53.用于治疗或预防骨髓增生性疾病的症状或与其相关的异常的方法，包括对需要这种治疗或预防的患者施用有效量的JNK抑制剂或MKK抑制剂。
54.权利要求53的方法，其中所述的异常是多潜能造血祖细胞的无性系扩展，伴随着血液的一种或多种有形元件的过量生产，费城染色体或bcr-abl基因的存在，外周血涂片上的泪珠状红细胞畸形，白幼红细胞血像，巨大的异常血小板，具有网状或胶原纤维化的细胞过多的骨髓或具有低百分数的前髓细胞和胚细胞的显著左偏移的骨髓系列。
55.用于治疗或预防脊髓发育不良综合症的方法，包括对需要这种治疗或预防的患者施用有效量的JNK抑制剂或MKK抑制剂。
56.权利要求55的方法，其中所述的脊髓发育不良综合症是难治性贫血、具有环状成高铁红细胞的难治性贫血、具有过量胚细胞的难治性贫血、具有过量的转化中的胚细胞的难治性贫血、白血病前期或慢性的单核细胞性白血病。
57.用于治疗或预防脊髓发育不良综合症的症状的方法，包括对需要这种治疗或预防的患者施用有效量的JNK抑制剂或MKK抑制剂。
58.权利要求57的方法，其中所述的症状是贫血症、血小板减少症、嗜中性白细胞减少症、双血细胞减少症或全血细胞减少症。
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