CN1426466A - 遗传沉默 - Google Patents

Abstract

总的来说，本发明涉及诱导，促进或者易化动物细胞或包含所述动物细胞的细胞组表型改变的方法。表型表达的调节可通过遗传操作方便地进行，如通过减少转录物翻译成蛋白产物等方法。诱导，促进或易化可表达的遗传序列沉默的能力提供了一种在例如，医药，兽医和动物饲养业中调节表型的方法。本发明所包含的可表达的遗传序列不仅包括正常存在于特定动物细胞中的基因(即固有基因)还包括通过重组方法或由病原媒介物如病毒转染而导入的基因。

Description

遗传沉默

发明领域

总的来说本发明涉及诱导，促进或者易化动物细胞或包含所述动物细胞的细胞组表型改变的方法。表型表达的调节可通过遗传操作方便地进行，如通过减少转录物翻译成蛋白产物等方法。诱导，促进或易化可表达的遗传序列沉默的能力提供了一种在例如，医药，兽医和动物饲养业中调节表型的方法。本发明所包含的可表达的遗传序列不仅包括正常存在于特定动物细胞中的基因(即固有基因)还包括通过重组方法或由病原媒介物如病毒转染而导入的基因。

背景技术

本说明书中的任何现有技术的引用不是，也不应被视为是承认或任何形式的暗示这一现有技术构成在澳大利亚或任何其它国家公知常识的一部分。

本说明书中有关出版物的详细文献资料按作者索引列于说明书的末尾。

日益成熟的重组DNA技术极大地促进了医药和兽医工业的研究和发展。重组DNA技术的一个重要的方面是通过调节遗传物质的表达改变基因型的方法的开发。许多所需的表型特征均可以通过选择性的基因表达失活来获得。基因失活，即基因表达失活，可以顺式和反式形式出现。对于顺式失活，仅靶基因失活而其它分布于基因组中的类似基因不受影响。而与此相反对于反式失活，一个或多个分布于基因组中与特定的靶序列具有同源性的基因也失活。在文章中经常用到“基因沉默”这一术语。但一般这样用时并不注重所述的基因沉默是以顺式还是反式起作用。由于顺式失活不如反式失活有用，因此这与基因沉默技术的商业利用相关。例如，用促进顺式失活的技术成功靶定内源基因(如植物基因)或外源基因(如病原体的基因)的可能性较小。而且，在用标记基因监测基因失活的情况下，时常不能区分顺式和反式失活事件。因此在文献中有关基因失活的精确分子机制存在混乱(Garrick等，1998；Pal-Bahdra等，1997；Bahramian和Zarbl，1999)。

现有的文献中对有关基因失活或基因沉默的机制相当混乱。例如，术语“反义”用于描述将设计为表达反义RNAs的遗传构建体引入细胞以降低特定RNA表达的情况。这种策略在实验和实际应用中被广泛使用。反义RNA的功能机制一般认为包括在内源有义RNAs和抑制翻译的反义RNA之间形成双螺旋。但没有明确的证据说明这一机制可以存在于所有高等真核生物系统中。

术语“基因沉默”常用于表示在真核生物细胞中转基因表达失活。尽管一般认为上述情况是由转录失活造成的，但在记载有关这一情况的机制的文献中存在相当多的混乱。既然基因自身的表达失活即没有其它基因的反式失活作用，不清楚这一特定的机制是否有什么实际的功用。

在植物中，术语“共抑制”用于确切描述转基因稳定地导入基因组并表达为有义RNA的情况。令人惊讶的是，这种转基因序列的表达导致同源基因的失活，即一种基因表达的序列特异性的反式失活(Napoli等，1990；van der Krol等，1990)。出现这种情况的细胞的分子表型在植物系统中已有详细描述：基因转录为前体RNA但并不被翻译。另一个描述共抑制的术语是转录后基因失活。人们认为mRNA序列的消失是序列特异的RNA降解系统失活的结果(lindbo等，1993；Waterhouse等，1999)。在有关术语“共抑制”的动物文献中存在相当的混乱(Bingham，1997)。

在作出本发明的工作中，发明人应用遗传操作技术将基因沉默引入动物细胞。所述的遗传操作技术包括转录后失活作用的诱导。本发明人由此提供一种在动物细胞中进行共抑制的方法。所述的在动物细胞中共抑制的诱导允许在动物多种表型范围内进行操作。

发明简述

在本说明书中，除非是上下文需要，用语“包含”或该用语的变形“包括”或“含”应理解为指包含所阐述的元素或整体或元素或整体构成的组，但不排除其他元素或整体或元素或整体所构成的组。

核苷酸序列和氨基酸序列通过序列标识号(SEQ ID NO：)表示。所述的SEQ ID Nos数字相当于序列标识<400>1，<400>2等。在权利要求后附有序列表。

本发明的一个方面是提供含与脊椎动物细胞基因组中内源靶核苷酸序列基本同一的核苷酸序列的遗传构建体，其中，一旦将所述的遗传构建体导入所述的动物细胞，含所述内源核苷酸序列的基因转录形成的RNA转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力。

本发明的另一方面提供一种遗传构建体，其包含：

(i)一种与脊椎动物细胞基因组中靶内源核苷酸序列基本同一的核苷酸序列；

(ii)与(i)中所定义的靶内源核苷酸序列基本互补的单一核酸序列；

(iii)分隔上述(i)和(ii)中核苷酸序列的内含子核苷酸序列；

其中，一旦当将所述的构建体引入所述动物细胞，由包含所述内源靶核苷酸序列的基因转录出的RNA转录本表现出改变了的转录能力。

本发明的又一方面提供一种遗传构建体，其包括：

(i)与在脊椎动物细胞基因组中的靶内源核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列；

(ii)与(i)中所定义的靶内源核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列；

(iii)分隔上述(i)和(ii)中核苷酸序列的内含子核苷酸序列；

其中，一旦将所述的构建体引入所述的动物细胞，由含有所述的内源靶核苷酸序列的基因转录形成的RNA转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力，且含有所述内源靶序列的基因的转录水平基本上没有下降和/或由含有所述核苷酸内源靶序列的基因转录的总RNA水平基本上没有下降。

本发明的另一方面提供经遗传修饰的脊椎动物细胞，其特征在于所述的细胞：

(i)含有引入所述细胞或其亲代细胞的靶内源核苷酸序列的有意拷贝；

(ii)与未经遗传修饰的同一所述细胞相比基本上没有由含有所述内源靶核苷酸序列的基因编码的蛋白产物；和

(iii)相对于未经遗传修饰的同一所述细胞，稳定状态的总RNA水平基本上没有下降。

本发明的另一方面提供一种改变脊椎动物细胞表型的方法，其中所述的表型是由内源基因的表达所赋予或者所促进的，所述的方法包括将一种遗传构建体引入所述的细胞或所述细胞的亲本细胞，其中所述的遗传构建体含有与包含上述内源基因或其部分的核苷酸序列基本同一的核苷酸序列，且与未导入上述遗传构建体的细胞相比转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力。

本发明的再一方面提供一种经遗传修饰含有与所述鼠科动物细胞基因组中的靶内源核酸序列基本同一的核苷酸序列的鼠科动物，其中由含有所述内源靶核苷酸序列的基因转录的RNA转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力。

本发明的又一方面涉及含有与脊椎动物细胞基因组中靶内源核苷酸序列基本同一的核苷酸序列的遗传构建体在动物细胞产生中的应用，其中由含有所述内源靶核苷酸序列的基因转录形成的RNA转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力。

本发明的又一方面涉及脊椎动物中的遗传治疗的方法，该方法包括向所述的动物细胞中引入含有与所述动物细胞基因组中靶内源核苷酸序列基本同一的核苷酸序列的核苷酸序列，使得在引入了所述的核苷酸序列后，由含有所述内源靶核苷酸序列的基因转录形成的RNA转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力。

附图说明

图1是质粒pEGFP-Nl的示意图。详细情况参见实施例1。

图2是质粒pCMV.cass的示意图。详细情况参见实施例11。

图3是质粒pCMV.BGI2.cass的示意图。详细情况参见实施例11。

图4是质粒pCMV.GFP.BGI2.PFG的示意图。详细情况参见实施例12。

图5是质粒pCMV.EGFP的示意图。详细情况参见实施例12。

图6是质粒pCMV^pur.BGI2.cass的示意图。详细情况参见实施例12。

图7是质粒pCMV^pur.GFP.BGI2.PFG的示意图。详细情况参见实施例12。

图8是推定的转基因细胞系的Southern印迹分析的例子，所述转基因细胞系在这个例子中是已由构建体pCMV.EGFP转化的猪肾细胞(PK)。由PK-1细胞和转化细胞系分离的基因组DNA经限制性内切酶BamHI消化，然后被³²P-dCTP标记的EGFP DNA片段探测。泳道A是分子量标记，其中每一片段的大小用千碱基对(kb)表示；泳道B是亲本细胞系PK-1。泳道C是A4，表达EGFP的转基因PK-1细胞系；泳道D是C9，非表达的转基因PK-1细胞系。

图9是在普通光下和设计为检测GFP的荧光条件下观察到的由pCMV.EGFP转化的PK-1细胞系的显微图。A：在普通光下的PK EGFP2.11细胞；B：在荧光条件下的PK EGFP 2.11 细胞；C：普通光下的PK EGFP 2.18细胞；D：荧光条件下的PK EGFP 2.18细胞。

图10是质粒pCMV.BEV2.BGI 2.2VEB的示意图。详细情况参见实施例13。

图11是质粒pCMV.BEV.EGFP.VEB的示意图。详细情况参见实施例13。

图12是CRIB-1细胞和CRIB-1转化系[CRIB-1BGI2#19(tol)]在用BEV转染前和同一滴度的BEV转染后48hr的显微图。A：BEV转染前的CRIB-1细胞；B：BEV转染后48hr的CRIB-1细胞；C：BEV转染前的CRIB-1 BGI2#19(tol)细胞；D：BEV转染后48hr的CRIB-1 BGI2#19(tol)。详细情况参见实施例13。

图13是质粒pCMV.TYR.BGI2.RYT的示意图。详细情况参见实施例14。

图14是质粒pCMV.TYR的示意图。详细情况参见实施例14。

图15是质粒pCMV.TYR.TYR的示意图。详细情况参见实施例14。

图16是用pCMV.TYR.BGI2.RYT转化的B16细胞和B16细胞的着色水平。细胞系是，从左至右：B16，B16 2.1.6，B162.1.11，B16 3.1.4，B163.1.15，B164.12.2和B164.12.3。详细情况参见实施例14。

图17是质粒pCMV.GALT.BGI2.TLAG的示意图。详细情况参见实施例16。

图18是质粒pCMV.MTK.BGI2.KTM的示意图。详细情况参见实施例17。

图19是质粒HER2.BGI2.2REH的示意图。详细情况参见实施例18。

图20是用pCMV.HER2.BGI2.2REH转化的MDA-MB-468细胞和MDA-MB468细胞的染色HER-2的免疫荧光显微图。A：MDA-MB-468细胞；B：仅由二抗染色的MDA-MB-468细胞；C：对HER-2着色的MDA-MB-468 1.4细胞；D：对HER-2着色的MDA-MB-468 1.10细胞。详细情况参见实施例18。

图21是在(A)MDA-MB-468细胞；(B)MDA-MB-468 1.4细胞；(C)MDA-MB-468 1.10细胞中HER-2表达的FACS分析。详细情况参见实施例18。

图22是质粒pCMV.BRN2.BGI2.2NRB的示意图。详细情况参见实施例19。

图23是质粒pCMV.YBl.BGI2.1BY的示意图。详细情况参见实施例20。

图24是质粒pCMV.YBl.p53.BGI2.35p.1BY的示意图。详细情况参见实施例20。

图25是在用YB-1-相关基因构建体和寡核苷酸转染后活细胞计数的矩形图。锥虫蓝染色后用血细胞计数器对一式四份样品进行活细胞计数。柱高表示两次独立转染实验的平均细胞计数，垂线标志表示标准偏差。(A)用基因构建体：(i)对照：pCMV.EGFP；(ii)pCMV.YB1.BGI2.1BY；(iii)pCMV.Ybl.p53.BGI2.35p.1BY转染72hr后的活B10.2细胞计数。所用的所有材料和方法如实施例20所述。(B)用基因构建体：(i)对照：pCMV.EGFP；(ii)pCMV.YBl.BGI 2.1 BY；(iii)pCMV.YBl.p53.BGI2.35p.1BY转染后72hr活Pam 212细胞计数。所用的所有材料和方法如实施例20所述。(C)用寡核苷酸：(i)对照：仅Lipofectin(商标)；(ii)对照：非特异的寡核苷酸；(iii)假(decoy)Y-框寡核苷酸转染后18hr活B10.2细胞计数。所用的所有材料和方法如实施例20所述。(D)用寡核苷酸：(i)对照：仅Lipofectin(商标)；(ii)对照：非特异的寡核苷酸；(iii)假(decoy)Y-框寡核苷酸转染后18hr活Pam 212细胞计数。所用的所有材料和方法如实施例20所述。

优选实施方案的详细描述

本发明部分取决于应用与脊椎动物细胞中内源核苷酸序列相关的有义核酸序列下调含有所述内源核苷酸序列的基因的表达。所述的内源核苷酸序列可以包含全部或部分基因，且可以是或不是所述细胞所固有的。非固有基因包括通过例如病毒感染或重组DNA技术导入动物细胞的基因。固有基因可以包括被视为天然存在于所述动物细胞中的基因。所述的靶内源基因的下调包括向特定的细胞或其亲代细胞中引入有义核苷酸序列。

据此，本发明的一方面提供含有与脊椎动物细胞基因组中靶内源核苷酸序列基本同一的核苷酸序列的遗传构建体，其中当向所述的动物细胞中引入所述的遗传构建体后，由含有所述内源靶核苷酸序列的基因转录形成的RNA转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力。

提及“改变了的......能力”优选包括相对于未经遗传修饰的细胞翻译水平下降，如约10％到约100％，更优选约20％到约90％。在一尤其优选的实施方案中，所述的相应于靶内源序列的基因基本上不翻译成蛋白产物。适宜地，改变了的翻译能力可由任何表型改变所确定，其中所述的表型在未经遗传修饰的细胞中由上述内源基因的表达所促进。

优选地，所述脊椎动物细胞来自哺乳动物，鸟类，鱼或爬行动物。优选地，所述脊椎动物细胞来自哺乳动物。哺乳动物细胞可以是人，灵长类，家畜动物(如绵羊，母牛，山羊，猪，驴，马)，实验动物(如大鼠，小鼠，兔，豚鼠，仓鼠)，陪伴动物(如狗，猫)或捕获的野生动物。特别优选的哺乳动物细胞来自人和鼠科动物。

所述的脊椎动物细胞基因组中的核苷酸序列是指“基因组”核苷酸序列，优选相应于编码为所述动物细胞，动物细胞组和/或含有所述细胞的动物带来特定表型的产物的基因。如上所述，上述内源基因可以是动物细胞所固有的，也可以是来自外源，如病毒，胞内寄生虫或通过重组或其他物理方法导入的。因此所用到的“基因组”或“基因组的”不仅包括染色体遗传物质还包括染色体外如来自非整合的病毒的遗传物质。所用到的“基本上同一的”核苷酸序列也包含在术语基本同源和基本相似中。

此处所用到的“基因”应以其最广泛的内涵来理解，其包括：(i)由转录和/或翻译调控序列和/或编码区和/或非翻译序列(即，内含子，5’-和3’-非翻译序列)组成的标准的基因组基因；(ii)相应于编码区(即外显子)的mRNA或cDNA，可选择地包含与其相连接的5’-和3’-非翻译序列；或(iii)在体外扩增产生的DNA片段或其他重组核酸分子，包含全部或部分编码区和/或与其相连的5’-和3’-非翻译序列。

所述的在动物细胞基因组中的基因也指靶基因或靶序列，且可以如上所述天然存在于基因组中或可以通过重组技术或其他方式，如病毒感染引入。所用术语“基因”并不解释为将所述靶序列限定为任何特定的结构，大小或组分。

所述的靶序列或基因是任何能表达以形成mRNA和/或蛋白产物的核苷酸序列。所用术语“表达为”以及相关术语“表达”包括转录和/或翻译步骤之一或全部。

在一个优选的实施方案中，所述的在遗传构建体中的核苷酸序列进一步包含与靶内源核苷酸序列互补的核苷酸序列。

因此，本发明的另一方面提供一种遗传构建体，其包括：

(i)与在脊椎动物细胞基因组中靶内源核苷酸序列基本同一的核苷酸序列；

(ii)与(i)中所定义的靶内源核苷酸序列基本上互补的单一核苷酸序列；

(iii)将(i)和(ii)中所述的核苷酸序列分隔开的内含子核苷酸序列；

其中当将所述的构建体引入所述动物细胞后，由含有所述内源靶核苷酸序列的基因转录形成的RNA转录本表现出改变了的转录能力。

优选地，所述的同一和互补序列由内含子序列相分隔。合适的内含子序列的例子包括但不限于来自编码β-珠蛋白的基因的内含子，如人β-珠蛋白内含子2的全部或部分。

蛋白产物丧失可方便地通过表型特性的改变(如丧失)或基因型特性的变化观察到。

靶基因可以编码结构蛋白或调节蛋白。“调节蛋白”包括转录因子，热激蛋白或DNA/RNA复制，转录和/或翻译中所涉及的蛋白。所述的靶基因可以存在于已整合到动物基因中的病毒基因组中或作为染色体外元件存在。例如靶基因可以是在HIV基因组中的基因。在这种情况下，所述的遗传构建体对灭活哺乳动物细胞中的HIV基因的翻译是有用的。

当靶基因是病毒基因时，特别优选该病毒基因编码对所述病毒的复制和繁殖至关重要的功能，例如尤其是但不限于DNA聚合酶或RNA聚合酶基因或病毒外壳蛋白基因等。在一个特别优选的实施方案中所述的靶基因包含尤其是来自单链(+)RNA病毒如牛肠道病毒(BEV)，新培斯甲病毒(Sinbis alphavirus)或慢病毒，如但不限于免疫缺陷病毒(如HIV-1)的RNA聚合酶基因，或者，来自双链DNA病毒如牛疱疹病毒或单纯疱疹病毒I(HSVI)的DNA聚合酶基因。

在一个特别优选的实施方案中，所述的转后灭活优选通过涉及反式丧失的机制达到。

本发明的遗传构建体一般但并不仅仅包括合成基因。“合成基因”包含一种核苷酸序列，当该核苷酸序列在动物细胞内表达时其下调所述动物细胞的内源的同源基因或存在于其中的整合的病毒基因的表达。

本发明的合成基因可以通过标准的重组技术由天然存在的基因衍生而来，仅需要的条件是：合成基因在核苷酸水平上至少与其表达将被修饰的靶基因的一部分基本同一或类似。“基本上同一”是指合成基因的结构基因序列与靶基因中连续的30个或更多的核苷酸至少约80-90％同一，优选与靶基因中连续的30个或更多的核苷酸至少约90-95％同一，更优选与靶基因中连续的30个或更多的核苷酸至少约95-99％同一，或与靶基因中连续的30个或更多的核苷酸绝对同一。或者，所述基因能够与靶基因序列在低严谨，优选中度严谨或更优选高度严谨条件下杂交。

此处所涉及的低严谨条件包括和涵盖用于杂交的从至少约0到至少约15％v/v甲酰胺及从至少约1M到至少约2M的盐，并在至少约1M到至少约2M盐条件下洗膜。一般来说，低严谨条件从约25-30℃到约42℃。所述的温度可以改变，高温可以用于替换甲酰胺和/或给出替代严谨条件。替代的严谨条件可以在需要时使用，如中等严谨条件，其包括用于杂交的从至少约16％v/v到至少约30％v/v甲酰胺及从至少约0.5M到至少约0.9M的盐，并在至少约0.5M到至少约0.9M盐条件下洗膜；或度严谨条件，其包括用于杂交的从至少约31％v/v到至少约50％v/v甲酰胺及从至少约0.01M到至少约0.15M的盐，并在至少约0.01M到至少约0.15M盐条件下洗膜。一般洗膜在Tm＝69.3+0.41(G+C)％条件下进行(Marmur和Doty，1962)。但是双螺旋DNA的Tm随每增加1％的错配碱基数而下降1℃(Bonner and Laskey，1974)。在这些杂交条件下甲酰胺是可选择的。因此特定的优选严谨水平定义如下：低严谨条件是6×SSC缓冲液，0.1％w/v SDS在25-42℃下；中度严谨条件是2×SSC缓冲液，0.1％w/v SDS在20℃到65℃的范围内；高度严谨条件是0.1×SSC缓冲液，0.1％w/v SDS在至少65℃下进行。

一般而言，本发明的合成基因可以经诱变产生单或多个核苷酸替代，缺失和/或添加但并不影响其修饰靶基因表达的能力。本发明的合成基因的核苷酸插入衍生物包括5’和3’末端的融合及单个或多个核苷酸的序列内插入。尽管适当筛选所得产物随机插入也是可能的，但插入的核苷酸变异体是那些在核苷酸序列内的预定位置引入了一个或多个核苷酸的序列。缺失变异体以从所述序列中去除一个或多个核苷酸为特征。替代核苷酸变异体是指在序列中至少去除一个核苷酸并用不同的核苷酸插入到该位置。这样的替代可以是“沉默”的，因为所述的替代并没有改变该位置的密码子所定义的氨基酸。另外，替代也可以设计为将一个氨基酸用与之行为相似或有相似电荷，极性，或疏水性的氨基酸替代。

据此，本发明延及上述合成基因的同系物，类似物和衍生物。

为此，在上文中所定义的基因或核苷酸序列的“同系物”应指分离的核酸分子，尽管该核酸分子内部存在一个或多个核苷酸的替代，插入，缺失或重排但其与本发明的核酸分子或其互补的序列基本上相同。

在上文中所定义的基因或核苷酸序列的“类似物”应指分离的核酸分子，尽管该核酸分子内部存在通常情况下不存在于该分离的核酸分子中的非核苷酸组分，例如碳水化合物，放射性化学物质(包括放射性核苷酸)，报告分子例如但不限于DIG，碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶等但其与本发明的核酸分子或其互补的序列基本上相同。

在上文中所定义的基因或核苷酸序列的“衍生物”应指任何与所述序列或其一部分具有显著的序列相似性的分离的核酸分子。

因此，所述合成基因的结构基因组分可以包含与存在于动物细胞中的内源靶基因，外源靶基因或病毒靶基因中30个连续的核苷酸具有至少80％的同一性或同源性的核苷酸序列或其同源物，类似物，衍生物或它们的互补序列。

本发明所述的遗传构建体一般但并不仅仅包含可操作地与启动子序列相连接的核苷酸序列，如合成基因的形式。所述遗传构建体中的其它组分包括但不限于调节区域，转录起始或修饰位点和一个或多个编码报告分子的基因。可以包含于所述遗传构建体中的其他组分还可以包括病毒组分如病毒DNA聚合酶和/或RNA聚合酶。非病毒组分包括RNA-依赖的RNA聚合酶。所述的合成基因的结构部分可以包含或不包含翻译起始位点或5’-和3’-非翻译区域，及可以编码或不编码由相应的内源哺乳动物基因产生的全长的蛋白。

本发明的另一方面提供一种包含基本上与哺乳动物细胞基因组中的核苷酸序列同源的并可操作地与启动子相连接的核苷酸序列的遗传构建体，该遗传构建体可选择地进一步包含一个或多个调节序列和/或编码报告分子的基因序列，其中当上述的遗传构建体引入动物细胞后，与所述遗传构建体上的核苷酸序列同源的内源核苷酸序列的表达通过包含转录后调制的过程被抑制，减弱或下调。

此处所用到的“启动子”应视为指其最广泛的含义，其包括典型基因组基因的转录调控序列，如在真核细胞中精确转录起始所需的TATA框，带有或不带有CCAAT框和附加调节元件(即上游激活序列，增强子和沉默子)。

启动子通常但不是必须位于其所调节的本发明合成基因中结构基因组分的上游或5’端。而且包括启动子在内的调节元件通常位于距所述结构基因转录起始位点2kb的范围内。

在本发明的上下文中，术语“启动子”也用于描述导致，激活或增强哺乳动物细胞中分离的核酸分子表达的合成或融合分子或其衍生物。也可能需要另一个或相同的启动子在植物，动物，昆虫，真菌，酵母或细菌细胞中行使功能。优选的启动子可以包含一个或多个特异调控元件的附加拷贝以进一步增强结构基因的表达，其反过来调节和/或改变所述基因的时空表达。例如，可使所述结构基因表达具有可诱导性的调节元件可置于驱动核酸分子表达的异源启动子序列的附近。

将结构基因置于启动子的调控下是指安排所述分子的位置使其表达受启动子序列的控制。

启动子一般置于其所控制的基因的5’(上游)。在异源启动子/结构基因组合的结构中，一般优选启动子到转录起始位点的距离与在天然状态下该启动子与其所调节的基因，即取得该启动子的基因的距离相似。本领域中已知在不损害所述启动子功能的前提下上述距离的一些变化也是可以适应的。类似地，优选地依照其天然状态下，即取得该调节元件的基因中的设置确定相对于异源基因的调节序列元件的位置。同样，本领域中已知这样的距离可以有变化。

所述的启动子可以组成型地调节所述结构基因组分的表达，或根据发生表达的有关细胞，组织或器官的不同或出现上述表达的发育阶段的不同，或对刺激的反应如生理压力，调节蛋白，激素，病原体或金属离子等的不同而有所不同。

优选地，所述启动子可以调节哺乳动物细胞中核酸分子的表达，至少是在靶基因在其中表达的期间，更优选还在所述细胞中所述靶基因可检测的表达将将开始之前。所述的启动子可以是组成型的，诱导型的或发育调节型的。

在本文中，术语“可操作地连接”或“可操作地在......控制下”或类似的表达应视为是指在细胞中所述结构基因的表达在与其空间上相连的启动子的控制之下。

本发明的遗传构建体还可以包括多个核苷酸序列，每个核苷酸序列均可任选地与一个或多个启动子相连，每个核苷酸序列均指向动物细胞中的靶基因。

多核苷酸序列(multiple nucleotide sequence)可以包括两个或多个同一核苷酸序列的串联重复的串联体，或者两个或多个非同一核苷酸序列的串联阵列或串联体，唯一的要求就是所包含的每一个核苷酸序列需与靶基因序列或其互补序列基本上同一。在这一方面，本领域的技术人员可知在其包含由基因组靶基因衍生的外显子序列串联阵列或串联体的情况下，cDNA分子也可以视为本发明上下文中的多结构基因序列。因此，cDNA分子和外显子序列和/或内含子序列和/或5’-非翻译和/或3’-非翻译序列的任何串联阵列、串联重复或串联体显然包含于本发明的这一实施方案中。

优选地，所述的多核苷酸序列包含至少2-8个单个的结构基因序列，更优选至少约2-6个单个的结构基因序列，更优选至少约2-4个单个的结构基因序列。

可以包含在本发明的合成基因中的结构基因序列的理想数目根据每一个结构基因的长度，它们的方向和彼此之间的同一性程度可以有相当的变化。例如，本领域的技术人员已知回文核苷酸序列在体内固有的不稳定性和构建包含倒转重复核苷酸序列的长合成基因的困难，因为上述序列有形成发夹环的倾向并且在体内可发生重组。

尽管存在上述的困难但可以包含在本发明的合成基因中的结构基因序列的理想数目仍可根据本领域技术人员的经验，在无需过量实验的情况下通过标准方法而确定，如用重组酶缺陷的细胞系构建本发明的合成基因，减少重复序列的数目以排除或使重组事件最小化，维持多结构基因序列的长度到可接受的程度，优选不多于5-10kb，更优选不多于2-5kb，更优选不多于0.5-2.0kb的长度。

在一个实施方案中，包括含有义核苷酸序列的合成基因的遗传构建体的作用是在基本上不降低靶基因转录水平的情况下减少转录本翻译成蛋白产物。或者或另外，所述的包含合成基因的遗传构建体基本上不导致总的RNA稳定水平的下降。

因此本发明的一个特定实施方案提供一种遗传构建体，其包含：

(i)与脊椎动物基因组中的靶内源核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列；

(ii)与(i)中所定义的靶内源核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列；

(iii)分隔(i)和(ii)中所述核苷酸序列的内含子序列；

其中，当将所述的构建体导入动物细胞后，由含有所述内源靶核苷酸序列的基因转录形成的RNA转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力，并且含有所述内源靶序列的基因的转录水平基本上没有降低和/或由含有所述内源靶核苷酸序列的基因所转录的总RNA水平基本上没有下降。

优选地，所述的动物细胞是哺乳动物细胞，如但并不限于人或鼠科动物细胞。

本发明进一步延及经过遗传修饰的脊椎动物细胞，所述细胞的特征在于：

(i)包含导入所述细胞或其亲本细胞的靶内源核苷酸序列的有义拷贝；和

(ii)与未经遗传修饰的相同细胞相比，基本上没有由包含所述内源靶核苷酸序列的基因编码的蛋白产物。

这一实施方案中的脊椎动物细胞优选来自哺乳动物，鸟类，鱼类或爬行动物。更优选地，所述的动物细胞来源于哺乳动物如人，灵长类，家畜或实验动物。特别优选所述的动物细胞来源于人和鼠科动物。

所述的包含上述靶内源核苷酸序列有义拷贝的核苷酸序列可以进一步包含互补于所述靶序列的核苷酸序列。优选地，所述的同一且互补的序列由内含子序列，如来自编码β-珠蛋白的基因的内含子(例如人β-珠蛋白内含子2)所分隔。

而且在一个实施方案中，导入含有所述靶序列有义拷贝的核苷酸序列的结果没有使稳定状态的总RNA的水平降低。

由此，本发明提供经遗传修饰的脊椎动物细胞，该细胞的特征在于：

(i)包含导入所述细胞或其亲本细胞的靶内源核苷酸序列的有义拷贝；

(ii)与未经遗传修饰的相同细胞相比，基本上没有由包含所述内源靶核苷酸序列的基因编码的蛋白产物；和

(iii)与未经遗传修饰的相同细胞相比，稳定状态的总RNA的水平基本上没有降低。

本发明进一步涉及转基因的包括遗传修饰的表现以转录后调节的基因序列为特征的经修饰表型的动物细胞和细胞系。

据此，本发明的另一方面涉及分离形式的或在体外培养条件下维持的动物细胞或含有所述细胞的动物，其中所述的细胞或动物宿主与经遗传操作前的细胞或动物相比表现至少一种改变了的表型，所述的遗传操作包含向所述的动物细胞中导入含与所述动物细胞基因组中的靶核苷酸序列基本同源的核苷酸序列的遗传构建体，并且其中所述的靶核苷酸序列的表达在转录后水平被调节。

优选地，所述的遗传构建体上的核苷酸序列可操作地与启动子相连接。

可选择地，所述的遗传构建体可以包含两个或更多的核苷酸序列，每一核苷酸序列可操作地与一个或更多的启动子相连接，且每一核苷酸序列与内源哺乳动物核苷酸序列具有同源性。

本发明还涉及经遗传修饰的动物，如哺乳动物，其包含具有如下特征的一个或更多个细胞，这些细胞中内源基因基本上转录了但并不翻译进而导致与经遗传操作前的动物或动物细胞相比出现了经修饰的表型。

本发明的又一方面提供一种经遗传修饰的含有与鼠科动物细胞基因组中的靶内源核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列的鼠科动物，其中由含有所述内源靶核苷酸序列的基因转录形成的RNA转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力。

优选的鼠科动物是小鼠且在作为实验动物模型以检验治疗方法或筛选治疗试剂中尤其有用。

在优选的实施方案中，所述的经遗传修饰的鼠科动物进一步包括与靶内源序列互补的序列。一般所述的同一和互补序列可由如上所述的内含子序列所分隔。

本发明进一步涉及改变脊椎动物细胞表型的方法，其中所述的表型是由内源基因的表达所赋予或促进的，该方法包括向所述的细胞或其亲本细胞中导入遗传构建体，其中所述的遗传构建体包括与含有所述内源基因或其部分序列的核苷酸序列基本上同源的核苷酸序列，与未经导入所述遗传构建体的细胞相比，转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力。

此处所涉及同源性包括基本上的同源性，尤其是实质性的核苷酸相似性，更优选核苷酸同一性。

此处所用的术语“相似性”包括相比较的序列间在核苷酸水平上的精确同一。当在核苷酸水平上存在非同一，“相似性”包括序列间的不同，其产生在结构，功能，生化和/或构象水平上相关的不同氨基酸。在一个特别优选的实施方案中，所述的核苷酸序列对比是在同一性水平而非相似性水平上进行的。

用于表示两个或更多个多核苷酸之间序列关系的术语包括“参比序列”，“对比窗”，“序列相似性”，“序列同一性”，“序列相似性百分数”，“序列同一性百分数”“基本相似”和“基本同一性”。“参比序列”是长至少12个但常是15到18个经常是至少25个或更多，如30个单体单元(包括端点)的核苷酸。由于两个多核苷酸每一个可以含有(1)在两个多核苷酸序列间相似的序列(即全部多核苷酸序列的一部分)和(2)在两多核苷酸之间有差异的序列，两个(或更多)多核苷酸之间的序列比较可通过比较“对比窗”中的两个多核苷酸序列进行以鉴定和比较局部区域的序列相似。“对比窗”是指与参比序列相比的典型为12个连续残基的概念片段。为进行理想的对比，与参比序列(其不包含添加或缺失)相比所述的对比窗可以包含约20％或更少的添加或缺失(即gap)。为对齐对比窗进行的最佳对比可以通过计算机程序化的算法(GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，见the WisconsinGenetics Software Package Release 7.0，Genetics ComputerGroup，575 Science Drive Madison，WI，USA)或目测进行，所述的最佳对比(即产生对比窗内最高百分同源性)可有所选择的任何方法产生。参见例如Altschul等(1997)所公开的BLAST系列的程序。有关序列分析的详细讨论可参见Ausubel等(1998)中的Unit 19.3。

所用的术语“序列相似性”和“序列同一性”指在通过对比窗比较中基于核苷酸对核苷酸的序列同一或功能或结构相似性程度。因此“百分序列同一性”例如是通过下述方式计算出来的：由对比窗比较两个理想对比的序列，确定在两序列中均出现同一的核酸碱基(如A，T，C，G，I)的位置的数目以获得匹配位置的数目，用对比窗中总的位置数(即窗的大小)除匹配的位置数，所得结果乘以100以获得序列同一性百分数。为本发明的目的，“序列同一性”可以理解为是由计算机程序DNASIS(Version 2.5 for windows；购自Hitachi  Softwareengineering Co.，Ltd.，South San Francisco，California，USA)用该软件所附带的参考手册中的标准默认值计算出的“匹配百分数”。类似的注解也使用于序列相似性。

本发明进一步涉及含有与脊椎动物细胞基因组中靶内源核苷酸序列基本同一的核苷酸序列的遗传构建体在产生动物细胞中的应用，在上述的动物细胞中由含有所述内源靶核苷酸序列的基因转录形成的RNA转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力。

优选地，所述脊椎动物细胞如上述定义，最优选的是人和鼠科动物。

所述的构建体可以进一步包括与所述的靶内源核苷酸序列互补的核苷酸序列，且与所述靶内源核酸序列同一或互补的核苷酸序列可由上述的内含子序列所分隔。

在一个实施方案中，含有内源靶序列的基因的转录水平没有下降和/或稳定状态的总RNA的水平基本上没有下降。

本发明的再一方面涉及在脊椎动物中进行遗传治疗的方法，所述的方法包括向所述动物细胞中引入含有与所述动物细胞基因组中的靶内源核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列，以使得在引入所述的核苷酸序列后，由含有所述内源靶核苷酸序列的基因转录形成的RNA转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力。

此处所涉及的“遗传治疗”包括基因治疗。包含在本发明范围内的遗传治疗进一步包括体细胞基因治疗，其是通过分离细胞，经遗传修饰后再放回个体中进行的。

优选地，所述的动物是人。

本发明通过下述非限定性的实施例进行详细描述。

                      实施例1

                    组织培养操作

为产生表达GFP的细胞系，用设计为表达GFP的构建体转化PK-1细胞(来自猪肾上皮细胞)，所述构建体即pEGFP-N1(ClontechCatalogue No.：6085-1；参见图1)。

PK-1细胞用添加10％v/v胎牛血清(FBS；TRACE Biosciences或Life Technologies)的Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基(DMEM；Life Technologies)培养生长成为粘附单层细胞。细胞一直在37℃下空气中含5％v/v CO₂的培养箱中生长。依实验要求细胞可在多种组织培养容器中生长。所用的容器：96-孔组织培养板(容器包括96个相分离的组织培养孔，每孔直径约为0.7cm；Costar)；48-孔组织培养板(容器包括48个相分离的组织培养孔，每孔直径约为1.2cm；Costar)；6-孔组织培养板(容器包括6个相分离的组织培养孔，每孔直径约为3.8cm；Nunc)；或大的T25和T75培养瓶(Nunc)。对于用pEGFP-N1转化的细胞，DMEM，10％(v/v)FBS培养基进一步添加了遗传霉素(Life Technologies)；对于初步筛选转化细胞，使用1.5mg/l遗传霉素。对转化细胞的常规培养可使用1.0mg/l的遗传霉素。

所有的情况下均每隔48-72hr(小时)更换培养基。这是通过下述方式进行的：去除已用过的培养基，通过添加磷酸盐缓冲液(1×PBS；Sigma)并轻轻晃动培养容器以洗涤组织培养容器中的单层细胞，去除所述的1×PBS缓冲液，添加新鲜的培养基。在这些操作中所用的1×PBS的体积为针对96-孔，48-孔，6-孔，T25和T75培养瓶分别为100μl，400μl，1ml，2ml和5ml。组织培养的培养基的体积典型地，对96-孔组织培养板为200μl，对48-孔组织培养板为0.4ml，对6-孔组织培养板为4ml，对T25和T75培养瓶分别为11ml和40ml。

在这些实验过程中，经常需要更换培养容器。为此，用1×PBS洗单细胞层两次，然后用胰蛋白酶-EDTA(Life Technologies)在37℃下处理5min。在这些条件下细胞失去粘着性，能够通过研磨(trituration)重悬，并转移到可阻止胰蛋白酶-EDTA作用的DMEM，10％v/v FBS中。洗涤用1×PBS的体积和用于上述操作的胰蛋白酶-EDTA针对96-孔，48-孔，6-孔，T25和T75培养瓶典型地分别为100μl，400μl，1ml，2ml和5ml。

另外，有时需要给重悬细胞计数，特别是当生物克隆转化的细胞系时。为此，细胞重悬于适当体积的DMEM，10％v/v FBS中，将典型的100μl的小份转移到血细胞计数器(Hawksley)，并通过显微镜进行细胞计数。冷冻细胞的方法

在这些实验中，时常需要贮存PK-1细胞系以备后面使用。为此，用1×PBS洗单层细胞两次，然后用胰蛋白酶-EDTA在37℃下处理5min。所述的PK-1通过研磨重悬并转移到由DMEM，20％v/v FBS和10％v/v二甲基亚砜(Sigma)组成的贮存培养基中。所述的PK-1细胞的浓度通过血细胞计数器确定并进一步稀释到10⁵细胞ml。将小份的PK-1细胞转移到1.5ml的cryotubes(Nunc)中。所述的PK-1细胞管置于含2-丙醇(BDH)的Cryo 1℃冷冻容器中(Nalgene)并缓慢冷却至-70℃。将上述PK-1细胞管于-70℃贮存。可通过在冰上使所述细胞升温到0℃使贮存的PK-1细胞复苏。将所述的细胞转移到含DMEM和20％v/v FBS的T25培养瓶中，并在37℃条件下含有5％v/vCO₂的空气中培养。培养基成分列表

(a)Dulbecco’s修饰的Eagle培养基(DMEM)

两个所使用的DMEM可商购配方，均由Life Technologies获得。第一个是液体配方(Cat.no.11995)，第二个是粉末配方，其依照制造商提供的方法配置(Cat.no.23700)。两配方均在这些实验中使用，除了微小的修改外可将它们视为等同物。所述的液体配方(11995)是：

D-葡萄糖                  4,500mg/l

酚红                      15mg/l

丙酮酸钠                  110mg/l

L-精氨酸.HCl              84mg/l

L-胱氨酸.2HCl             63mg/l

L-谷氨酰胺                584mg/l

甘氨酸                    30mg/l

L-组氨酸HCl.H₂O          42mg/l

L-异亮氨酸                105mg/l

L-亮氨酸                  105mg/l

L-赖氨酸.HCl              146mg/l

L-甲硫氨酸                30mg/l

L-苯丙氨酸                66mg/l

L-丝氨酸                  42mg/l

L-苏氨酸                  95mg/l

L-色氨酸                  16mg/l

L-酪氨酸.2Na.2H₂O        104mg/l

L-缬氨酸                  94mg/l

CaCl₂                    200mg/l

Fe(NO₃)₃.9H₂O         0.1mg/l

KCl                       400mg/l

MgSO₄                    97.67mg/l

NaCl                      6,400mg/l

NaHCO₃                   3,700mg/l

NaH₂PO₄.H₂O           125mg/l

D-泛酸钙                  4mg/l

氯化胆碱                  4mg/l

叶酸                      4mg/l

i-肌醇                    7.2mg/l

尼克酰胺              4mg/l

核黄素                0.4mg/l

硫胺素HCl             4mg/l

维生素B6 HCl          4mg/l

当重新配置时，除下述修改外，粉末配方(23700)与上述一致，所述修改之处在于：含4,750mg HEPES，而不含丙酮酸钠和NaHCO₃，NaCl的用量为4,750mg/l，而不是6,400mg/l。

(b)OPTI-MEMI(注册商标)降低血清培养基

这是一种可商购的MEM修饰培养基(Life Technologies Cat.No.31985)，设计该培养基是使得细胞在无血清培养基上生长。这种无血清培养基常在应用阳离子脂质体转染子如GenePORTER2(商标)或LIPOFECTAMINE(商标)获得高转染频率的时候使用。

(c)磷酸盐缓冲液(PBS)

磷酸盐缓冲液是由可商购的粉末混合物(Sigma，Cat.No.P-3813)依制造商提供的方法制备的。1×PBS溶液(pH7.4)由下述组分组成：

Na₂HPO₄                      10mM

KH₂PO₄                       1.8mM

NaCl                           138mM

KCl                            2.7mM

(d)胰蛋白酶-EDTA

胰蛋白酶-EDTA通常用于分散粘着性细胞使其传代。在这些实验中使用了一种可商购的制剂(Life Technologies，Cat.No.15400)。这种10×贮液由下述组分组成：

胰蛋白酶                       5g/l

EDTA.4Na                    2g/l

NaCl                        8.5g/l

用9倍体积的1×PBS稀释上述贮液以制备工作用溶液。

                    实施例2

           稳定的EGFP-转化的细胞系的产生

转化在6-孔组织培养容器中进行。每孔接种于2ml DMEM，10％v/vFBS中的1×10³ PK-1细胞，培养至单层细胞铺满达60-90％，典型地需24到48hr。转化一个板(6孔)需将12μg质粒pEGFP-Nl和108μlGenePORTER2(商标)(基因治疗系统)在OPTI-MEM I(注册商标)培养基中稀释至终体积6ml，再于室温下培养45min。

去除每孔中的组织生长培养基后，用1ml 1×PBS如上所述对每个孔进行清洗。对于每个孔，所述的单层细胞用1ml质粒DNA/GenePORTER结合物覆盖并于37℃，5％v/v CO₂条件下培养4.5hr。

向每孔中加入添加了20％v/v FBS的1ml OPTI-MEMI(注册商标)，将所述容器继续培养24hr，用1×PBS洗细胞并用2ml含10％v/v FBS的新鲜DMEM培养基更换用过的培养基。在这一阶段可利用荧光显微镜观察瞬时GFP表达。

转染后48hr去除培养基，如上所述用PBS洗细胞，并向每孔中加入含10％v/v FBS并添加了1.5mg/l遗传霉素的4ml新鲜DMEM；培养基中添加遗传霉素是为了挑选稳定转化的细胞系。所述的DMEM，10％v/v FBS，1.5mg/l遗传霉素培养基每48-72hr更换一次。筛选了21天后，推定的转化克隆清晰可见。在这一阶段，将细胞转移到更大的培养容器中以便于扩增、培养和生物克隆。

为移出已转化的克隆，如上述实施例1中所描述的将细胞用胰蛋白酶-EDTA处理后转移到11ml DMEM，10％v/v FBS，1.5mg/l遗传霉素中用T25培养瓶于37℃ 5％v/v CO₂条件下培养。当这些单层细胞达90％铺满时，将其用胰蛋白酶-EDTA重悬，然后转移到40ml DMEM，10％v/v FBS，1.5mg/l遗传霉素中。将盛有细胞的容器在37℃ 5％v/v CO₂条件下培养。当单层细胞铺满时每48-72hr如上所述通过用胰蛋白酶处理细胞使其传代，并将1/10的细胞于40ml新鲜DMEM，10％v/v FBS，1.5mg/l遗传霉素中稀释。同时将一些细胞冷冻以作长期保存。这些培养物包含转化细胞系的混合物。

                         实施例3

                 转化细胞系的稀释克隆

用稀释策略将转化细胞进行生物克隆，由此以单细胞建立克隆。为支持单克隆的生长，使用了“条件培养基”。条件培养基是通过用40ml含10％v/v FBS的DMEM覆盖于T75培养瓶中生长的达20-30％铺满的单层PK-1细胞而制备的。所述容器在37℃，5％v/v CO₂下培养24hr，此后所述的生长培养基转移到无菌的50ml管(Falcon)并500xg离心。将所述的生长培养基通过0.45μm过滤器倒入一个新的无菌管中用作“条件培养基”。

含有转化的达20-30％铺满的PK-1细胞混合克隆的T75培养瓶用1×PBS洗细胞，再用胰蛋白酶如上所述进行处理，再用10ml DMEM，10％v/v FBS稀释。所述细胞浓度用显微镜通过血细胞计数器确定，然后将细胞用条件培养基稀释至10细胞每ml。在96-孔组织培养容器中每孔接种200μl用条件培养基稀释后的细胞，将所述细胞在37℃ 5％v/v CO₂下培养48hr。用显微镜观察上述的孔，由单细胞产生的含单一克隆的那些定义为克隆细胞系。去除最初的条件培养基，加入200μl新鲜的条件培养基，并将所述细胞在37℃5％v/v CO₂下培养48hr。此后，用200μl DMEM，10％v/v FBS和1.5mg/l遗传霉素替换条件培养基，所述细胞继续在37℃5％ v/v CO₂下培养。使克隆扩增，每48hr更换培养基。

当每孔中的单层细胞达90％铺满时，所述的细胞用100μl 1×PBS洗涤，并通过20μl 1×PBS/1x胰蛋白酶-EDTA如上所述进行处理分散细胞。一个孔中的细胞转移到含500μl DMEM，10％v/v FBS和1.5μg/ml遗传霉素的48-孔培养容器的一个孔中。如上文所述每48-72hr更换一次培养基。

48-孔培养容器的一个孔中的细胞达90％铺满时，如上所述用胰蛋白酶-EDTA处理将所述细胞转移到6-孔组织培养容器中。相互分离的细胞转移到4ml DMEM，10％ v/v FBS，1.5μg/ml遗传霉素中并转移到6-孔组织培养容器的一个孔中。细胞在37℃ 5％ v/v CO₂下培养使克隆扩增。每48hr更换培养基。

当6-孔培养容器中的单层细胞达90％铺满时，如上所述用胰蛋白酶-EDTA处理将细胞转移到T25培养瓶中。当这些单层细胞达90％铺满时，如上所述将其转移到T75培养瓶中。当在T75培养瓶中建立了单独的细胞系后它们或可通过1/10稀释每隔48-72hr传代培养，或冷冻保存。

                          实施例4

                用于连缀转录分析的核的制备

为分析已转化的克隆细胞系中单基因转录的状态，进行了核连缀分析。用T75培养瓶向40ml DMEM，10％ v/v FBS中接种4×10⁶转化的PK-1细胞以建立单层细胞，培养所述细胞使其达到90％铺满。用5ml 1×PBS洗细胞，再用2ml胰蛋白酶-EDTA处理使细胞分离后转移到含10％ v/v FBS的2ml DMEM中。

将这些细胞转移到10ml加盖的管中，加入3ml用冰冷却的1×PBS将管中内容倒转混合。已转化的PK-1细胞通过4℃下500xg离心收集弃上清，用3ml冰冷的1×PBS重悬并轻旋混合。用血细胞计数器确定总的细胞数；最多2×10⁸细胞用于后续实验。

已转化的PK-1细胞通过4℃下500xg离心收集，重悬于4ml蔗糖缓冲液1(0.3M蔗糖，3mM氯化钙，2mM醋酸镁，0.1mM EDTA，10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM二硫苏糖醇(DTT)，0.5％ v/vIgepal CA-630(Sigma))中。所述细胞在4℃下温育5min使其裂解，然后用相差显微镜检查小份的样品。此种情况下可以观察到裂解物。组织匀浆转移到含4ml冰冷的蔗糖缓冲液2(1.8M蔗糖，5mM醋酸镁，0.1mM EDTA，10mM Tris-HCl(pH8.0)，1mM DTT)的50ml管中。

为获得有效的连缀转录分析，需从细胞碎片中将核纯化出来。纯化核的一种方法是通过蔗糖衬垫进行超离心。在细胞组织匀浆中的最终蔗糖浓度应足以在组织匀浆和蔗糖垫间的界面阻挡大量碎片。因此添加到初始细胞组织匀浆中的蔗糖缓冲液2的量在一些情况下是变化的。

为制备蔗糖垫，4.4ml冰冷的蔗糖缓冲液2转移到同质异晶聚合物SW41管(Beckman)中。将核制品小心地铺在所述的蔗糖垫上于4℃下30,000xg(13,300rpm用SW41转子)离心45min。弃上清，轻轻涡旋5秒使成团的核散开。每5×10⁷核在200μl冰冷的甘油贮存缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8.3)，40％v/v甘油，5mM氯化镁，0.1mM EDTA)中研磨、重悬。100μl此种悬浮液(约2.5×10⁷核)等分至预冷的微离心管中并添加1μL(40U)RNasin(Promega)。通常此种抽提物直接用于连缀转录分析，但也可以在-70℃的液氮中保存以备使用。

                          实施例5

                       核连缀转录分析

  所有的NTP均购自Roche。添加100μl 1mM ATP，1mM CTP，1mM GTP，5mM DTT和5μl(50μCi)[α³²P]-UTP(GeneWorks)到100μl分离的核中，所述核的制备如上所述。所述的反应混合物在30℃下振荡温育30min，添加400μl 4M硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠(pH7.0)，100mM 2-巯基乙醇和0.5％ v/v N-月桂酰肌氨酸(溶液D)终止反应。为在体外纯化合成的RNA，60μl 2M醋酸钠(pH 4.0)和600μl水饱和酚添加到反应混合物中涡旋混合；添加120μl 氯仿/异戊醇(49∶1)涡旋混合，然后离心分相。

将水相移出至新管中，添加20μg tRNA作为载体。加入650μl异丙醇在-20℃下温育10min沉淀RNA。在4℃下12,000rpm离心20min收集RNA，所得的颗粒状物用冷的70％ v/v乙醇漂洗。将颗粒状物溶解于30μl TE pH 7.3(10mM Tris-HCl，1mM EDTA)，通过涡旋混合重悬上述颗粒状物。向混合物中添加400μl溶液D，涡旋混合。通过添加430μl异丙醇沉淀RNA，在-20℃下放置10min，再在4℃下10,000g离心20min。弃上清，用70％ v/v乙醇漂洗RNA粒状物。上述颗粒状物用200μl 10mM Tris(pH 7.3)，1mM EDTA重悬，通过手提盖革计数器估计掺入。

为制备用于杂交的放射性RNA，通过添加20μl 3M醋酸钠pH5.2,500μl乙醇沉淀样品，在4℃下12,000xg离心20收集样品。弃上清，用1.5ml杂交缓冲液(MRC#；HS 114F，MolecularResearch Centre Inc.)重悬。

                      实施例6

                 斑点印迹滤膜的制备

制备斑点印迹滤膜以检测如上述制备的³²P-标记的新生mRNA转录本。为分析每-PK-1细胞系制备一种Hybond NX滤膜(Amersham)。所制备的每种滤膜包含四种经连续1/5稀释的质粒。所述的质粒是pBluescript(注册商标)II SK⁺(Stratagene)，pGEM.Actin(昆士兰大学微生物和寄生虫学系)，pCMV.Galt，和pBluescript.EGFP。

质粒pCMV.Galt是通过用猪α-1，3-半乳糖基转移酶(GalT)结构基因序列替换pEGFP-N1(Clontech)的EGFP开放阅读框而构建的。用PinAI和Not I消化质粒pEGFP-N1，用PfuI聚合酶形成钝端，然后再连接以产生质粒pCMV.cass。从pCDNA3.GalT(Bresagen)上切除含GalT结构基因的EcoRI片段并将其连接到pCMV.cass的EcoRI位点。

质粒pBluescript.EGFP是通过切除pEGFP-N1的EGFP开放阅读框并将该片段连接到质粒pBluescript(注册商标)II SK⁺上而构建的。用NotI和XhoI消化质粒pEGFP-N1，再将NotI-EGFP-Xho片段连接到pBluescript II SK⁺的NotI和XHoI位点。

对每一构建体，将10微克质粒在200μl反应体积中用EcoRI消化。所述的混合物用苯酚/氯仿/异戊醇抽提后再用氯仿/异戊醇抽提，再用乙醇沉淀。所述的质粒DNA颗粒状物悬浮于500μl 6×SSC(0.9M氯化钠，90mM柠檬酸钠；pH7.0)中，然后用6×SSC稀释至浓度为1μg/50μl，200ng/50μl，40ng/50μl和8ng/50μl。将上述质粒加热至100℃ 10min然后在冰上冷却。

将8×11.5cm的一张Hybond NX滤膜在6×SSC中浸泡30min。然后将所述的滤膜置于96-孔(3mm)斑点印迹装置(LifeTechnologies)中真空固定。每槽中加入500μl 6×SSC，抽真空。保持真空状态下，将每种质粒DNA浓度的50μl质粒以4×4矩阵加于滤膜上。在所述滤膜上复制6次。

在保持真空状态下每槽加入250μl 6×SSC。解除真空状态。将所述的滤膜在(DNA面朝上)用变性溶液(1.5M氯化钠，0.5M氢氧化钠)湿透的印迹纸上放置10min。然后将所述的滤膜转移到用中和溶液湿透的印迹纸上在1M氯化钠，0.5M Tris-HCl(pH7.0)中浸5min。

将所述滤膜置于GS Gene Linker(Bio Rad)用150m焦耳的能量使质粒DNA交联到滤膜上。用无菌水漂洗滤膜。为检查印迹操作是否成功将所述滤膜，用在300mM含0.4％ v/v亚甲基蓝的醋酸钠(pH5.2)染色5min。将所述的滤膜用无菌水漂洗两次后，用40％ v/v乙醇脱色。再用无菌水漂洗滤膜以去除乙醇，然后将滤膜切成6个四-质粒/浓度矩阵块。

                      实施例7

                核转录本的滤膜杂交

斑点印迹或Southern印迹滤膜转移到10ml MacCartney瓶中，每瓶加入2ml预杂交液(Molecular Research Centre Inc.#；WP117)。将滤膜置于培养箱中在42℃下轻轻旋转温育过夜(Hybaid)。

去除所述的预杂交缓冲液，添加1.5ml含如实施例5和6中所述的³²P-标记的新生RNA的杂交缓冲液(MRC #HS 114F，MolecularResearch Centre Inc.)，将此探针和滤膜在42℃下杂交48hr。

杂交后，去除放射性标记的杂交缓冲液，用洗涤溶液(MRC#WP117)清洗滤膜。总共更换5次清洗溶液洗滤膜，每次使用2ml。上述清洗在杂交箱中进行；头三次在30℃下进行，后两次在50℃下进行。

为进一步提高严谨度降低背景，用RNase A处理滤膜。将滤膜置于5ml 10μg/ml RNase A(Sigma)，10mM Tris(pH7.5)，50mM NaCl中在37℃下温育5min。

将滤膜卷于塑料套中暴露于X-光片下。

                 实施例8

      在哺乳动物细胞中的共抑制：EGFP

检测了6个PK-1细胞系。这6个细胞系由一个未转化的对照细胞系(野生型)和五个用pCMV.EGFP构建体转化的细胞系(参见实施例1)组成。通过显微镜在UV光下观察，这5个细胞系中的两个是EGFP表达阳性。所有来自A4g系的单层细胞都是EGFP表达阳性，而来自A7g系的单层细胞只有约0.1％是EGFP阳性。观察到所余的C3，C8，和C10系是EGFP表达阴性的。

如上述实施例4到7所述进行核连缀转录分析。在标记产物的膜杂交分析四种质粒的四种浓度结果可达到两个目的。所述的四种浓度具体地表示检测靶mRNA所需的靶质粒最低浓度。所述的四种质粒作为所述实验的特定靶和对照。所述质粒所起的功能如下。

pBluescript II SK⁺

这一质粒用于检测合成的核RNA与所用的所有靶构建体所共同的质粒骨架的非特异性杂交。

pBluescript.EGFP

这一质粒是³²P-标记的核EGFP RNA的靶。与该质粒杂交指示有效的EGFP RNA转录。这在A4g，A7g，C3和C8系中很明显，但在C10系中不明显。

pCMV.GalT

GalT(α-1，3-半乳糖基转移酶)是一种猪内源基因。这一质粒由此作为猪内源基因的阳性对照。

pGem.Actin

β-肌动蛋白是一种普遍存在的真核基因和共有mRNA种。这一质粒含有鸡β-肌动蛋白cDNA序列，作为附加的阳性对照。

根据这些实验的结果可以得出如下结论：

(1)没有出现与这些构建体质粒骨架的非特异性杂交。与所预期的一致由于这一基因的mRNA并不充足，所有的细胞系均未出现与GalT阳性对照的杂交。

(2)与所预期的一致，由于这一基因的mRNA丰富，所有的细胞系均出现与β-肌动蛋白基因阳性对照的杂交。

(3)A4g和A7g系的新生RNA与EGFP杂交与所预期的一致，这是基于观察到在这些细胞系中EGFP表达的结果。

(4)沉默的C3和C8系的新生RNA与EGFP杂交表明在这些细胞系的正常生长条件下EGFP转录本的共抑制。

(5)C10系的共抑制活性没有在这一实验中表现出来。

表1总结了³²P-标记的核RNA与上述质粒杂交的预期结果和所观察到的结果。表1也表明了观察到与特异核RNA杂交的靶质粒DNA的最小浓度。

表1

细胞系	EGFPExpress	靶的量	pBluescriptII SK+		pCMV.GalT		pBluescriptII.EGFP		pGem.Actin
											Exp	Obs	Exp	Obs	Exp	Obs	Exp	Obs
			PK	否		无	无	Hyb’n	Hyb’n	无									无	Hyb’n	Hyb’n
A4g	是	1μg									无	无	Hyb’n	Hyb’n	Hyb’n	Hyb’n	Hyb’n	Hyb’n
			A7g	是	1μg	无	无	Hyb’n	Hyb’n	Hyb’n									Hyb’n	Hyb’n	Hyb’n
C3	否	＞200ng									无	无	Hyb’n	Hyb’n	Hyb’n	Hyb’n	Hyb’n	Hyb’n
			C8	否	1μg	无	无	Hyb’n	无	Hyb’n									Hyb’n	Hyb’n	Hyb’n
C10	否	1μg									无	无	Hyb’n	无	Hyb’n	无	Hyb’n	Hyb’n

EGFP Express-EGFP表达

Exp＝PTGS的预期结果

Obs＝所观察到的结果

Hyb’n＝杂交

                          实施例9

                       基因的共抑制

本发明人证明了在所培养的猪肾细胞中转基因，增强的绿荧光蛋白(EGFP)的共抑制。本发明人进一步证明了在不同细胞类型中更广泛的内源基因和主体如病毒，癌和移植抗原的共抑制。特定的靶包括：

(a)牛肠道病毒(BEV)。在被BEV攻击前冷冻的BEV-转化的细胞系复苏并可传代几周/月。有效地共抑制的细胞不会立即被病毒杀死。这一耐病毒的表型提供了一种有用的示范。

(b)酪氨酸酶，一种皮肤黑色素(黑色)形成所必需的基因的产物。酪氨酸酶基因的沉默易于从所培养的小鼠黑素细胞中检测到，并在随后的黑色小鼠株中检测到。

(c)半乳糖基转移酶(GalT)。尽管GalT本身对于细胞存活并非至关重要，GalT基因的沉默伴随细胞死亡。本发明人推测细胞死亡是由于GalT是某DNA家族的成员之一，该家族成员共有某种反应相似功能(糖基转移)的相似的DNA序列。这些基因中的一些可能对于细胞存活至关重要。本发明人用GalT基因的3’非翻译区(3’-UTR)而非全基因转化猪细胞以靶向GalT降解所独有的节段，由此仅GalT沉默了。

(d)胸苷激酶(TK)将胸苷转变为胸苷单磷酸(TMP)。药物5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)筛选已失去TK的细胞。在含有功能的TK的细胞中，所述的酶将该药物类似物转换其相应的5’-单磷酸，一旦其整合到DNA中将具有致命性。用含有TK基因的构建体转化NIH/3T3细胞。有效地共抑制的细胞可以耐受添加到培养基中的BrdU并继续复制。

(e)细胞致癌基因如HER-2或Brn-2，与正常细胞转变为癌细胞相关。

(f)在人和/或小鼠造血(″血液形成″)细胞系上的细胞表面抗原。这些细胞是白细胞的前体，负责免疫；其特征在于对其免疫功能至关重要的特定表面抗原。这一系统特有的好处在于细胞悬浮(而非彼此粘附或附着于培养容器上)生长所以容易通过显微镜检测并通过荧光激活细胞分选仪定量。另外，可以得到大量的鉴定特定抗原的试剂。

(g)酪氨酸酶，在小鼠黑素细胞中对黑色素的产生至关重要的产物。在转基因小鼠中内源酪氨酸酶的失活可以通过在正常情况下产生黑色素的动物种的毛色变化容易地检测出来。这一表型提供了转基因动物的有用示范。

(h)半乳糖基转移酶(GalT)催化将半乳糖残基添加到细胞表面蛋白上。在转基因小鼠中可以通过分析转基因动物组织是否失去了半乳糖残基而容易地检测出来，并为转基因动物提供了有用的示范。

(i)YB-1(Y-框DNA/RNA-结合因子1)是一种转录因子，其主要结合于p53基因的启动子区域，并由此抑制其表达。在以正常水平表达正常的p53蛋白的癌细胞(所有人癌症的50％)中p53的表达受控于YB-1，因此YB-1的沉默导致p53蛋白水平的提高和此后的细胞程序性死亡。

                       实施例10

                       一般技术

1.组织培养操作

(a)粘着性细胞系

粘着性单层细胞的生长，维持和计数如实施例1中所述。生长培养基或由添加了10％ v/v FBS的DMEM组成，或由添加了10％ v/v FBS的RPMI 1640培养基(Life Technologies)组成。细胞一直在37℃并含5％ v/v CO₂的空气中生长。

在这些实验中经常需要单层细胞的传代。为此，用1×PBS洗单细胞层两次，然后用胰蛋白酶-EDTA在37℃下处理5min。用于上述操作的胰蛋白酶-EDTA针对96-孔，48-孔，6-孔，T25和T75培养瓶典型地分别为20μl，100μl，500μl，1ml和2ml。用等体积的生长培养基终止胰蛋白酶-EDTA的作用。所述细胞通过研磨悬浮。1/5体积的细胞选液转移到新的含有生长培养基的容器中。组织培养培养基的体积典型地为，对96-孔组织培养板，192μl，对48-孔组织培养板960μl，对6-孔组织培养板3.8ml，对T25和T75培养瓶分别为9.6ml和39.2ml。

细胞悬液的计数如上述的实施例1中所述。

(b)非粘着性细胞

非粘着性细胞在与粘着性细胞类似的生长培养基中生长。

与粘着单层细胞一样，需要经常更换组织培养容器。对于T25和T75培养瓶，将所述的细胞悬液转移到50ml无菌塑料管(Falcon)在4℃下以500xg离心5min。弃上清将细胞的颗粒状物悬浮于生长培养基中。将上述细胞悬液置于新的组织培养容器中。对96-孔，48-孔，和6-孔容器，将所述容器在4℃下以500xg离心5min。将细胞颗粒状物上的上清液吸出弃去，将细胞悬浮于生长培养基中。然后将所述细胞转移到新的组织培养容器。组织培养培养基的体积典型地为，对96-孔组织培养板，200μl，对48-孔组织培养板400μl，对6-孔组织培养板4ml，对T25和T75培养瓶分别为11ml和40ml。

以下述方式实现细胞悬液的传代。将所细胞在4℃下以500xg离心5min，然后悬浮于5ml生长培养基中。0.5ml(T25)或1.0ml(T75)的细胞悬液转移到含有生长培养基的新的容器中。对96-孔，48-孔，和6-孔板中的细胞，1/5体积的细胞转移到含有4/5生长培养基的相应孔中。

细胞计数如上述对粘着性细胞的描述。

2.冷冻细胞的方法

如实施例1的方法中所述储存以备后用的细胞被冷冻。将粘着性细胞用1×PBS洗单细胞层两次，然后用胰蛋白酶-EDTA(LifeTechnologies)在37℃下处理5min。非粘着性细胞在4℃下以500xg离心5min所述细胞通过研磨悬浮并转移到由添加了20％v/v FBS和10％v/v二甲亚砜(Sigma)的DMEM RPMI 1640贮存培养基中。

3.细胞系的克隆

用带有靶向特定感兴趣的基因的表达构建体的特定质粒载体转染粘着和非粘着类型的哺乳动物细胞。用添加了遗传霉素或嘌呤霉素的生长培养基(或是DMEM，10％v/v FBS或RPMI 1640，10％ v/v FBS)经过2-3的时间选择稳定的转化克隆。克隆单独的克隆以建立新转染的细胞系。

(a)粘着性细胞

与实施例3中所述的稀释克隆的方法相反，在下述使用粘着性细胞的实验中，如下所述由分散的集落克隆单独的细胞系。首先从6-孔组织培养容器的各个孔中去除培养基，然后将所述的细胞集落用2ml 1×PBS洗两遍。接下来，用无菌的塑料吸头将单集落从塑料培养容器中分离出来，转移到含200μl添加了遗传霉素或嘌呤霉素的条件培养基的96-孔板(参见实施例1)。所述的容器在37℃ 5％ v/v CO₂下培养约72hr。对每个孔进行生长克隆的显微镜检并更换新鲜的生长培养基。当每一稳定的单层细胞达约90％铺满时，即如上所述进行如上所述的连续步骤直至稳定的转化系贮藏于T25培养瓶。此时，每一稳定的细胞系小份进行冷冻以备长期保存。

(b)非-粘着性细胞

非-粘着性细胞如实施例3所述用稀释克隆法克隆。

4.细胞核分离方法

(a)粘着性细胞

向含30ml含10％ v/v FBS的生长培养基(DMEM或RPMI 1640)的100mm培养皿(Costar)或T75培养瓶中接种4×10⁶细胞并在37℃5％ v/v CO₂条件下培养至单层细胞达约90％铺满(过夜)。所述的含单层细胞的培养皿在进行操作前置于冰床上冷却。

倒出培养基向培养皿中添加8ml 1×PBS(冰冷的)，轻摇培养皿清洗所述的组织单层细胞。倒出所述的PBS重复清洗。

所述的组织单层细胞用4ml冰冷的蔗糖缓冲液A[0.32M 蔗糖；0.1mM EDTA；0.1％ v/v Igepal；1.0mM DTT；10mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM PMSF；1.0mM EGTA；1.0mM精脒]覆盖在冰上孵育2min裂解细胞。

用细胞刮刀将粘着性细胞打散并用相差显微镜观察小份的细胞。如果细胞没有裂解则将其转移到冰冷的杜恩斯(dounce)匀浆器(Braun)用S型槌以5-10冲程使之破裂。有时还需要更多冲程。对细胞进行镜检以证明核与胞质碎片相分离。然后向培养皿中添加冰冷的蔗糖缓冲液B[1.7M蔗糖；5.0mM醋酸镁；0.1mM EDTA；1.0mM DTT.10mM Tris-HCl，pH8.0；0.1mM PMSF](4ml)然后用细胞刮刀轻绞缓冲液。细胞组织匀浆中的蔗糖终浓度应足以阻止大部分碎片在组织匀浆和蔗糖垫之间的界面。据此调节添加到细胞组织匀浆中的蔗糖缓冲液2的量。

(b)非粘着性细胞

将4×10⁶的细胞接种于含包括10％ v/v FBS的30ml生长培养基(DMEM或RPMI 1640)的T75培养瓶中，在37℃、5％v/v CO₂条件下培养过夜。

T75培养瓶中的内容转移到50ml螺旋口带盖的管(Falcon)中，所述的管在进行操作前已置于冰上冷却。将上述管在冷却离心机中500xg离心5min使细胞成为小块。弃去培养基，向管中添加10ml 1×PBS(冰冷的)然后轻轻研磨以悬浮细胞。再弃去PBS重复清洗。

将细胞悬浮于4ml冰冷的蔗糖缓冲液A中在冰上孵育2min使细胞裂解，可任选地使用上述应用于粘着性细胞的杜恩斯匀浆器。

(c)分离方法

依实施例4所述方法通过蔗糖垫离心将核与细胞碎片向分离，但分别用蔗糖缓冲液A和B替代蔗糖缓冲液1和2。

5.核连缀转录方法

实施例5提供了该方法，通过核连缀转录方法，以制备通过膜杂交进行基因特异性检测的[α-³²P]-UTP-标记的新生RNA转录本(实施例6，7和8)。为检测基因特异性连缀转录产物，一种可替代膜杂交的方法是核糖核酸酶保护分析。通过标准的方法制备链特异性，基因特异性非标记的RNA探针。它们与³²P-标记的由连缀转录实验分离得到的RNA退火。为检测双链RNA，用对单链具有特异性的RNA酶处理退火产物并用PAGE检测。这一技术对本领域的技术人员是已知的并在RPAIII(商标)手册“糖核酸酶保护分析”(Catalog #s 1414，1415；-AmbionInc.)中有描述。

一种另外的方法用于制备由实时PCR试验进行基因特异性检测的RNA转录本(Patrone等，2000)。从粘着性细胞和非-粘着性细胞中分离完整核(参见实施例12-19，如下)，在甘油贮存缓冲液[50mMTris-HCl，pH8.3；40％v/v甘油，5mM MgCl₂和0.1mM EDTA]以1×10⁸每ml的浓度保存于-70℃。

在甘油贮存缓冲液中的100微升核(10⁷)添加到100μl冰冷的添加了核苷酸的反应缓冲液[200mM KCl，20mM Tris-HCl pH 8.0，5mM MgCl₂，4mM二硫苏糖醇(DTT)，ATP，GTP和CTP各4mM，200mM蔗糖和20％v/v甘油]中。生物素-16-UTP(由10mM四锂盐；Sigma)添加的混合物中并于29℃下孵育30min。终止反应，所述的核裂解，添加20μl 20mM氯化钙(Sigma)和10μl 10mg/ml无RNA酶的DNA酶I(Roche)消化DNA。所述混合物在29℃下温育10min。

用TRIzol(注册商标)试剂(Life Technologies)依制造商提供的方法进行核连缀和总的(包含细胞质的)RNA的分离。RNA悬浮于50μl无RNase的水中。将新生的生物素-16-UTP标记的连缀转录物通过抗生蛋白链霉素珠(Dynabeads(注册商标)kilobaseBINDER(商标)Kit，Dynal)依照制造商提供的方法从总RNA中分离出来。

实时PCR反应对这些连缀实验中的基因转录比率进行定量。实时PCR化学过程对本领域的技术人员是已知的。设计对转基因，内源基因和普遍表达的对照序列特异的寡核苷酸引物对。用引物表达软件(Perkin Elmer)进行寡核苷酸的扩增和报告引物的设计。相对转录水平用Rotor-Gene RG-2000系统(Corbett Research)进行定量。

6.mRNA的检测

核糖核酸酶保护试验，用未标记的mRNA与³²P标记的探针退火的方法，可用于检测细胞质中的内源基因和转基因转录本。用PAGE检测反应产物。通过Northern分析估计内源基因和转基因稳定状态下的RNA产物水平。

可替代地，使用以引物表达软件设计的对转基因，内源基因和普遍表达的对照序列特异的扩增和报告寡核苷酸，由Rotor-Gene RG-2000系统，通过实时PCR对相对mRNA水平进行定量。

7.哺乳动物基因组DNA的Southern印迹实验

对于所有的下述实施例，基因组DNA的Southern印迹实验是通过下述方法进行的。向含40ml DMEM或RPMI 1640，10％v/v FBS T75培养瓶中接种4×10⁶细胞并在37℃5％ v/v CO₂条件下培养24hr。

(a)粘着性细胞

对于粘着性细胞，操作如下：倒出培养基添加5ml 1×PBS到T75培养瓶中轻轻晃动以清洗组织单层细胞。倒出PBS重复用1×PBS清洗细胞。倒出PBS。用2ml 1×PBS/1x胰蛋白酶-EDTA覆盖所述的单层细胞。轻晃上述的瓶水平地盖上所述的单层细胞表面。将T75培养瓶在37℃和5％ v/v CO₂条件下培养，直到所述单层细胞与瓶相脱离。向所述的瓶中添加2ml含10％ v/v FBS的培养基。进行镜检此时的细胞应是分离的且为圆形。将细胞转移到10ml带盖的管中添加3ml冰冷的1×PBS。将管倒转混合。通过冷冻离心机(4℃)500xg离心10min使细胞结为颗粒状物。弃上清向带盖的管中添加5ml冰冷的1×PBS。轻轻涡旋使细胞悬浮。用血细胞计数板确定细胞总数。细胞数应不超过2×10⁸。通过(4℃)500xg冷冻离心10min使细胞结为颗粒状物。弃上清。

(b)非-粘着性细胞

对非-粘着性细胞操作如下：将细胞悬液倒入50ml Falcon管，500xg冷冻离心10min(4℃)。倒出上清液，向细胞中添加5ml冰冷的1×PBS，轻轻涡旋使细胞悬浮。通过冷冻离心机(4℃)500xg离心10min使细胞结为颗粒状物。弃上清向Falcon管中添加5ml冰冷的1×PBS。用血细胞计数板确定细胞总数。细胞数应不超过2×10⁸。通过(4℃)500xg冷冻离心10min使细胞结为颗粒状物。弃上清。

(c)DNA抽提和分析

对于粘着性和非-粘着性细胞均通过Qiagen基因组DNA抽提试剂盒(Cat No.10243)依照制造商提供的方法抽提基因组DNA。用Beckman model DU64分光光度计在260nm的波长下检测回收的基因组DNA的浓度。

用合适的限制性内切酶和缓冲液以200μl的体积在37℃下消化基因组DNA(10μg)约16hr。消化后，向消化物中添加20μl 3M醋酸钠pH5.2和500μl无水乙醇并将所述溶液倒转混合。所述的混合物在-20℃下处理2hr以沉淀所消化的基因组DNA。在4℃下10,000xg离心30min所述的DNA结为颗粒状物。弃上清用500μl 70％ v/v乙醇洗DNA沉淀。弃去70％ v/v乙醇，将DNA沉淀在空气中干燥，再将DNA溶解于20μl水中。

向重悬DNA中添加凝胶上样染料(0.25％ w/v 溴酚蓝(Sigma)；0.25％ w/v二甲苯氰基FF(Sigma)；15％ w/v Ficoll Type 400(Pharmacia))(5μl)混合后上样到含0.5μg/ml溴化乙锭的0.7％w/v琼脂糖/TAE凝胶孔中。消化的基因组DNA在14伏下电泳约16hr。在平行的孔中含有适当的DNA分子标记。

将所消化的基因组DNA在凝胶中变性(1.5M NaCl，0.5M NaOH)再使所述的凝胶中和(1.5M NaCl，0.5M Tris-HCl pH7.0)。经电泳的DNA片段通过毛细作用印迹到Hybond NX(Amersham)膜上并通过UV交联固定(Bio Rad GS Gene Linker)。

含交联的基因组DNA的膜浸润于无菌中。然后将所述的膜在0.4％v/v300mM醋酸钠(pH5.2)亚甲基蓝中染色5min以观察所转移的基因组DNA。将所述的膜在无菌水中浸润两次再用40％ v/v乙醇脱色。然后再浸润于无菌水中以去除乙醇。

将所述的膜置于添加了5ml预杂交液(6×SSPE，5×Denhardt’s试剂，0.5％ w/v SDS，100μg/ml变性的，片段化的鲱精DNA)的杂交瓶中。将所述的膜在60℃下于杂交箱中预杂交约14hr，杂交箱恒定转速(6rpm)。

探针(25ng)依制造商提供的方法通过MegaprimeDNA标记系统(Amersham Cat.No.RPN1606)用[α³²p]-dCTP(特定活性3000Ci/mmol)标记。依制造商提供的方法将标记探针过G50 SephadexQuick Spin(商标)柱(Roche，Cat.No.1273973)以去除未掺入的核苷酸。

将热变性的探针加入2ml杂交缓冲液(6×SSPE，0.5％ w/v SDS，100μg/ml变性的片段化鲱精DNA)预热至60℃。弃去所述的预杂交缓冲液，换为含有标记探针的2ml预热的杂交缓冲液。将所述的膜在60℃下于杂交箱中杂交约16hr，杂交箱恒定转速(6rpm)。

弃去含有探针的杂交缓冲液，将上述的膜进行下述清洗：

2×SSC，0.5％ w/v SDS 5min，室温下；

2×SSC，0.1％ w/v SDS 15min，室温下；

0.1×SSC，0.5％ w/v SDS 30min，37℃下，轻轻晃动；

0.1×SSC，0.5％ w/v SDS 1hr，68℃轻轻晃动；和

0.1×SSC 5min，室温下，轻轻晃动。

在68℃下的清洗时间随用手提式盖革计数器所检测的放射性的量的不同而变化。

将湿润的膜包在塑料膜中暴露于X-光片(Curix Blue HC-S Plus，AGFA)下24到48hr，显影后可以观察到与探针杂交的基因组DNA带。

8.培养细胞的免疫荧光标记

盖玻片(12mm×12mm)用乙醇通过火焰灭菌后浸没于2ml生长培养基，在6-孔板中每孔两个。将细胞加入含有1-2ml培养基的孔中，生长16hr后使细胞达到一定的密度并保持相互分离(依细胞的大小和生长速率200,000到500,000)。在不从孔上取下盖片的情况下将培养基吸除并用PBS洗细胞。用4％ w/v于PBS中的低聚甲醛(Sigma)处理1hr以固定细胞，然后用PBS洗三次。固定的细胞用PBS中的0.1％ v/v Triton X-100(Sigma)渗透5min然后用PBS洗三次。将盖片上的细胞用一滴(约100μl)0.5％ w/v牛血清白蛋白片段V(BSA，Sigma)封闭10min。

将盖片置于25μl用含0.5％ v/v BSA的PBS进行1/100稀释的初级小鼠单克隆抗体中至少1hr。然后用100μl含0.5％ v/v BSA的PBS将盖片洗三次每次约3min，然后置于25μl用含0.5％ v/v BSA的PBS进行1/100稀释的二抗Alexa Fluor(注册商标)488羊抗鼠IgG偶联物(Molecular Probes)30min到1hr。将盖片上的细胞用PBS洗三次。将盖片固定在玻片上，每玻片上三片，于甘油/DABCO[25mg/ml DABCO(1，4-二氮杂二环(2.2.2)-辛烷(Sigma D 2522))在含80％ v/v甘油的PBS]用100X油浸物镜于500-550nm UV光下检测。

9.实验用培养基的组分

所用DMEM，OPTI-MEM I(注册商标)减少血清的培养基，及PBS和胰蛋白酶-EDTA的组成于实施例1中列出。

(a)RPMI 1640培养基

使用购自Life Technologies的RPMI 1640培养基制剂(Cat.No.21870)。该液体制剂是：

Ca(NO₃)₂.4H₂O     100mg/l

KCl                   400mg/l

MgSO₄(无水)               48.84mg/l

NaCl                       6,000mg/l

NaHCO₃                    2,000mg/l

NaH₂PO₄(无水)            800mg/l

D-葡萄糖                   2,000mg/l

谷胱甘肽(还原型)           1.0mg/l

酚红                       5mg/l

L-精氨酸                   200mg/l

L-天冬酰胺(游离碱)         50mg/l

L-天冬氨酸                 20mg/l

L-胱氨酸.2HCl              65mg/l

L-谷氨酸                   20mg/l

甘氨酸                     10mg/l

L-组氨酸(游离碱)           15mg/l

L-羟脯氨酸                 20mg/l

L-异亮氨酸                 50mg/l

L-亮氨酸                   50mg/l

L-赖氨酸HCl                40mg/l

L-甲硫氨酸                 15mg/l

L-苯丙氨酸                 15mg/l

L-脯氨酸                   20mg/l

L-丝氨酸                   30mg/l

L-苏氨酸                   20mg/l

L-色氨酸                   5mg/l

L-酪氨酸.2Na.2H₂O         29mg/l

L-缬氨酸                   20mg/l

生物素                     0.2mg/l

D-泛酸钙                   0.25mg/l

氯化胆碱                   3mg/l

叶酸                          1mg/l

i-肌醇                        35mg/l

尼克酰胺                      1mg/l

对氨基苯甲酸                  1mg/l

盐酸吡哆醇                    1mg/l

核黄素                        0.2mg/l

盐酸硫胺素                    1mg/l

维生素B12                     0.005mg/l

                      实施例11

       用于实现共抑制的质粒构建体盒的制备

1.一般的RNA分离，cDNA合成和PCR方法

依制造商提供的方法用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen)从所指出的细胞系中纯化总RNA。为制备cDNA，用Omniscript反转录酶(Qiagen)将该RNA进行反转录。依制造商提供的方法(Qiagen)，用2微克总RNA用1μM寡dT(Sigma)作为引物在20μl反应体系中进行反转录。

为扩增特定的产物用2μl这种混合物作为底物用HotStarTaq DNA聚合酶依制造商提供的方法(Qiagen)进行PCR扩增。PCR扩增条件包括最初的激活步骤95℃ 15min，接下来在94℃30秒，60℃30秒，72℃60秒扩增35个循环，最后的延长步骤是在72℃4min。

所克隆的PCR产物通常是用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化；当由PCR产生了多种片段时可依制造商提供的方法用QIAquick凝胶纯化试剂盒(Qiagen)纯化正确大小的片段。

依制造商提供的方法将扩增产物克隆到pCR(注册商标)2.1-TOPO(Invitrogen)中。

2.一般克隆技术

为制备下述的构建体，依制造商提供的方法(Roche)用限制性内切酶从中间载体上切下插入片段，并将片段依制造商提供的方法用QIAquick凝胶纯化试剂盒(Qiagen)从凝胶中纯化出来。载体通常依制造商提供的方法经限制酶消化并经虾碱性磷酸酶(Amersham)处理。依制造商提供的方法(Roche)用T4 DNA将载体和插入片段连接起来并通过标准的方法(Sambrook等；1984)转化到感受态的大肠杆菌DH5α中。

3.构建

(a)可商购质粒

质粒pEGFP N1

质粒pEGFP-N1(图1；Clontech)包含CMV IE启动子，该启动子可操作的与编码野生型GFP的红移(red-shifted)变异体的开放阅读框相连，所述的变异体经优化产生更亮的荧光。Cormack等(1996)已描述了由pEGFP-N1编码的特定GFP变异体。质粒pEGFP-N1带有包含BglII和BamHI位点和许多其它限制性内切酶位点的多克隆位点，所述多克隆位点位于CMV IE启动子和EGFP开放阅读框之间。所述的质粒pEGFP-N1在哺乳动物细胞中表达EGFP蛋白。

另外，克隆到多克隆位点的结构基因假如与EGFP-编码序列在同一框内并缺乏功能性的翻译终止密码，则将作为EGFP融合多肽表达。所述的质粒中进一步包含位于EGFP开放阅读框下游的SV40多聚腺苷酸信号以指导由CMV IE启动子序列(SV40pA)转录的mRNA3’-端的正确加工。所述的质粒还包括在动物细胞中有功能的SV40复制起点；含SV40早期启动子和HSV胸苷激酶多聚腺苷酸信号的新霉素抗性基因(SV40-E，在图1中)，所述的启动子可操作地与来自Tn5(Kan/Neo图1中)的新霉素/卡那霉素-抗性基因相连接，以便利用卡那霉素，新霉素或遗传霉素筛选转化细胞；在细菌中是功能的pUC19复制起点和用于制备单链DNA的f1复制起点。

质粒pBluescript II SK ⁺

质粒pBluescript II SK⁺购自Stratagene，其包含lacZ启动子序列和lacZ-α转录终止子，和位于其间的多限制性内切酶克隆位点。设计质粒pBluescript II SK⁺以通过该多限制性内切酶克隆位点克隆核酸片段。质粒还包括Col E1和f1复制起点和氨苄青霉素抗性基因。

质粒pCR(注册商标)2.1

质粒pCR2.1是可从Invitrogen商购的T-尾载体，其包括lacZ启动子序列和lacZ-α转录终止子，和位于其间用于插入结构基因序列的克隆位点。设计质粒pCR(注册商标)2.1以便利用在聚合酶链式反应中Taq聚合酶经常合成的A-突出端克隆核酸片段。所述的质粒还包括ColE1和f1复制起点和卡那霉素抗性和氨苄青霉素抗性基因。

质粒pCR(注册商标)2.1-TOPO

质粒pCR(注册商标)2.1-TOPO是可商购的T-尾载体，来自Invitrogen，其含有lacZ启动子序列和lacZ-α转录终止子，和位于其间的限制性内切酶克隆位点。质粒pCR(注册商标)2.1-TOPO带有共价结合的拓扑异构酶I以便快速克隆。所述的质粒还包括ColE1和f1复制起点和卡那霉素和氨苄青霉素抗性基因。

质粒pPUR

质粒pPUR可由Clontech购得，其包含SV40早期启动子，后者可操作地与编码白黑链霉菌(Streptomyces alboniger)嘌呤霉素-N-乙酰转移酶(pac)基因的开放阅读框相连接(de la Luna和Ortin，1992)。该质粒还包括pac开放阅读框下游的SV40多聚腺苷酸信号，以指导由SV40E启动子序列转录的mRNA3’-端的正确加工。该质粒还包括用于大肠杆菌复制的细菌中复制起点和氨苄青霉素(β-内酰胺酶)基因。

(b)中间盒

质粒TOPO.BGI2

质粒TOPO.BGI2包含位于质粒pCR(注册商标)2.1-TOPO多克隆区域的人β-珠蛋白内含子2(BGI2)。为产生该质粒，用下述扩增引物从人基因组DNA中克隆人β-珠蛋白内含子2：：

GD1  GAG CTC TTC AGG GTG AGT CTA TGG GAC CC[SEQ ID NO：1]和

GAl CTG CAG GAG CTG TGG GAG GAA GAT AAG AG[SEQ ID NO：2]并将其克隆到质粒pCR(注册商标)2.1-TOPO中以形成质粒TOPO.BGI2。BGI2是哺乳动物细胞中的功能性的内含子序列，其在转录后能够从含有它的RNA转录本中切除。

质粒TOPO.PUR

质粒TOPO.PUR包含位于质粒pCR(注册商标)2.1-TOPO的多克隆区域的来自pPUR的SV40E启动子，嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因，SV40多聚腺苷酸信号序列。为产生该质粒，质粒pPUR中含SV40E启动子，嘌呤霉素-N-乙酰-转移酶基因，和SV40多聚腺苷酸的区域通过下述扩增引物由质粒pPUR(Clontech)扩增获得：

AflIII-pPUR-Fwd TCT CCT TAC GCG TCT GTG CGG TAT[SEQID NO：3]和

AflIII-pPUR-Rev ATG AGG ACA CGT AGG AGC TTC CTG[SEQID NO：4]并克隆到质粒pCR(注册商标)2. 1-TOPO中以形成质粒TOPO.PUR。

(c)质粒盒

质粒pCMV.cass

质粒pCMV.cass(图2)是驱动CMV-IE启动子序列控制下的结构基因序列表达的表达盒。质粒pCMV.cass是通过下述方式缺失EGFP开放阅读框由pEGFP-N1(图1)衍生而来。用PinAI和NotI消化质粒pEGFP-N1，用PfuI DNA聚合酶进行平末端化然后再连接。利用多克隆位点将结构基因序列克隆到pCMV.cass，上述多克隆位点除缺少PinAI位点外，与pEGFP-N1的多克隆位点相同。

质粒pCMV.BGI2.cass

为构建pCMV.BGI2.cass(图3)，从TOPO.BGI2中分离含人β珠蛋白序列的SacI/PstI片段，然后克隆到pCMV.cass.的SacI和PstI位点之间。在pCMV.BGI2.cass中，任何由CMV启动子转录的RNA均包含人β-珠蛋白内含子2序列；由于所述的内含子序列包括正常内含子加工所需的剪接供体和剪接受体序列，故推测这些内含子序列将作为正常内含子加工程序的一部分从转录本中被切除掉。

                     实施例12

      在体外猪肾1型细胞中绿色荧光蛋白的共抑制

1.细胞系的培养

如上述实施例10所述将PK-1细胞(来自猪肾上皮细胞)利用添加了10％ v/v FBS的DMEM培养为贴壁单层。

2.遗传构建体的制备

(a)中间质粒

质粒pBluescript.EGFP

质粒pBluescript.EGFP包含置于质粒pBluescript II SK⁺多克隆区域的来源于质粒pEGFP-N1(图1，参见实施例11)的EGFP开放阅读框。为构建该质粒，用限制性内切酶NotI和XhoI消化质粒pEGFP-N1切除EGFP开放阅读框，再将其与经NotI和XhoI消化的质粒pBluescript II SK⁺相连接。

质粒pCR.Bgl-GFP-Bam

质粒pCR.Bgl-GFP-Bam包含来自质粒pEGFP-N1(图1)并置于质粒pCR2.1(Invitrogen，参见实施例11)的多克隆区域的EGFP开放阅读框的内部区域。为构建该质粒，依制造商的指导(Invitrogen)用下述扩增引物由pEGFP-N1扩增EGFP开放阅读框：

Bgl-GFP：CCC GGG GCT TAG TGT AAA ACA GGC TGA GAG[SEQID NO：5]和

GFP-Bam：CCC GGG CAA ATC CCA GTC ATT TCT TAG AAA[SEQID NO：6]并克隆到质粒pCR2.1中。

在质粒pCR.Bgl-GFP-Bam中的EGFP编码区域的内部区域缺乏功能性的翻译起始和终止密码子。

质粒pCMV.GFP.BGI2.PFG

质粒pCMV.GFP.BGI2.PFG(图4)包含被人β-珠蛋白内含子2序列的插入打断的EGFP开放阅读框内部区的倒转重复或回文结构。质粒pCMV.GFP.BGI2.PFG由下述连续的步骤构建：(i)将质粒pCR.Bgl-GFP-Bam的GFP序列作为BglII-到-BamHI片段以有义方向亚克隆到用BglII-消化的pCMV.BGI2.cass(图3，参见实施例11)中以构建质粒pCMV.GFP.BGI2，及(ii)来自质粒pCR.Bgl-GFP-Bam的GFP序列作为BglII-到-BamHI片段以反义方向亚克隆到用BamHI-消化的pCMV.GFP.BGI2中以构建质粒pCMV.GFP.BGI2.PFG。

(b)检测质粒

质粒pCMV.FGFP

质粒pCMV.EGFP(图5)在CMV-IE启动子序列的控制下能够表达完整的EGFP开放阅读框。为构建pCMV.EGFP，上述来自pBluescript.EGFP的EGFP序列作为BamHI-到-SacI片段以有义方向亚克隆到由BglII/SacI-消化的pCMV.cass(图2，参见实施例11)中以构建质粒pCMV.EGFP.

质粒pCMV ^pur .BGI2.cass

质粒pCMV^pur.BGI2.cass(图6)包含在pCMV.BGI2.cass中的嘌呤霉素抗性选择标记基因(图3)，并作为这些实验中的对照。为构建PCMV^pur BG12.cass，将来自TOPO.PUR(实施例10)的嘌呤霉素抗性基因以AflII片段克隆到用AflII-消化的pCMV.BGI2.cass中。

质粒pCM ^pur .GFP.BGI2.PFG

质粒pCMV^pur.GFP.BGI2.PFG(图7)包含被人β-珠蛋白内含子2序列的插入打断的EGFP开放阅读框编码区的倒转重复或回文结构和嘌呤霉素抗性选择标记基因。将TOPO.PUR(实施例10)中含有嘌呤霉素抗性基因的AflII片段克隆到由AflII-消化的pCMV.GFP.BGI2.PFG(图4)中以构建质粒pCMV^Pur.GFP.BGI2.PFG。

3.共抑制表型的检测

(a)将表达EGFP的转基因插入PK-1细胞

 在6-孔组织培养容器中进行转化。每孔在2ml of DMEM，10％ v/vFBS中接种4×10⁴ PK-1细胞，在37℃5％v/v CO₂条件下培养到单层细胞生长达60-90％汇合，典型地需16到24hr。

要转化一块板(6孔)，12μg pCMV.EGFP(图5)质粒DNA和108μl GenePORTER2(商标)(Gene Therapy Systems)在OPTI-MEM-I(注册商标)中稀释至终体积6ml，于室温下温育45min。

去除每孔中的组织生长培养基，用1ml 1×PBS洗其中的单层细胞。每孔中用1ml质粒DNA/GenePORTER2(商标)偶联物覆盖所述的单层细胞并在37℃ 5％ v/v CO₂条件下温育4.5hr。

向每孔添加含20％ v/v FBS的OPTI-MEM-I(注册商标)(1ml)并将所述的容器继续温育24hr，此时用1×PBS洗涤所述单层细胞，用2ml含10％ v/v FBS的新鲜DMEM培养基更换所用的培养基。用pCMV.EGFP转化的细胞经24-48hr后用荧光显微镜在500-550nm的波长下检测瞬间EGFP表达。

转染后48hr，去除培养基，用1×PBS洗细胞，向每孔中添加4ml新鲜的含10％ v/v FBS和1.5mg/ml遗传霉素(Life Technologies)的DMEM。培养基中含遗传霉素以选择稳定转化的细胞系。所述的DMEM，10％ v/v FBS，1.5mg/ml遗传霉素培养基每48-72hr更换一次。筛选进行21天后稳定的，表达EGFP的PK-1集落即显而易见。

如实施例10的一般技术中所述对稳定转染的PK-1细胞单集落进行克隆，维持和贮存。

用pCMV.EGFP转化了大量亲本细胞系。如表2和图9A，9B，9C和9D所示，其中许多的GFP表达极低或完全检测不到。

表2

亲本细胞系	所检测的克隆细胞系的数量	极低或检测不到GFP的细胞系的数量
			PK-1	59	2
MM96L	12	4
			B16	12	10
MDAMB468	11	1

这些数据表明GFP的失活经常出现在由3个不同的种所建立的不同类型的细胞系中。

(b)在PK-1细胞中表达EGFP的转基因的转录后沉默

为研究表达EGFP的转基因的转录后沉默(PTGS)的起始，用构建体pCMV^pur GFP.BGI2.PFG(图7)转染来自12个稳定的表达EGFP的PK-1细胞系(PK-1/EGFP)的细胞。还包括两个对照。第一个对照是每个稳定的由质粒pCMV^par.BGI2.cass转化的细胞系的复制物(图6)。第二个对照是用未转染的PK1/EGFP细胞系的复制物。

用pCMV^pur.GFP.BGI2.PFG和pCMV^pur.BGI2.cass转化PK-1细胞是在6-孔组织培养容器中进行的，用如上述(a)中所述的方法，一式三份。

转染后48hr去除培养基用PBS洗涤细胞单层(见上)，向每孔细胞中加入4ml含10％ v/v FBS和1mg/ml遗传霉素的新鲜DMEM(GGM)。另外，用pCMV^pur.BGI2.cass或pCMV^pur.GFP.BGI2.PFG转染细胞时，所述的GGM中还要添加1.0μg/ml嘌呤霉素；培养基中包含嘌呤霉素是为了筛选稳定转化的细胞系。筛选后21天，共转化的沉默集落即显而易见。转染后，所有的复制物在显微镜下镜检是否存在PTGS，用pCMV^pur.GFP.BGI2.PFG转化的细胞缺失表达EGFP的表型，而用pCMV^pur.BGI2.cass转化的细胞或转染的复制物对照中不存在上述缺失。

3.核连缀转录分析实验

为检测转基因RNA在PK-1细胞核中的转录，用由活跃分裂的细胞中分离出的无细胞的核进行了核连缀转录分析。所述的核是依照上述实施例10中的核分离方法获得的。

依照上述实施例10中所述的核连缀转录分析方法对来自转染质粒pCMV.EGFP的转基因EGFP和来自共转染质粒pCMV^pur.GFP.BGI2.PFG的转基因GFP.BGI2.PFG的核RNA转录本进行分析。

对于所有被分析的PK-1细胞核，无论是用质粒pCMV.EGFP或用转基因GFP.BGI2.PFG转染的，与用未转染的PK-1/EGFP对照细胞系或用质粒pCMV^pur.BGI2.cass转化的对照细胞系的核相比，其中的转录速率基本上没有区别。

5.未转化和共抑制的细胞系中的mRNA的比较

依照上述实施例10中所述的方法分析了来自质粒pCMV.EGFP的EGFP的信使RNA和由转基因GFP.BGI2.PFG转录的RNA。

6.Southern实验

用Southern印迹实验分析各转基因PK-1细胞系(转染的和共转染的)以确定整合及转基因的拷贝数。上述实验依照实施例10中所述的方法进行。图8中举例说明了一个实例。

                      实施例13

  体外Madin Darby牛肾CRIB-1型细胞中的牛肠道病毒的共抑制

1.细胞系的培养

CRIB-1细胞(来自牛肾上皮细胞)如上述实施例10中所述在添加了10％v/v供体小牛血清的(DCS；Life Technologies)的DMEM中生长成为贴壁单层细胞。细胞一直在37℃含5％ v/v CO₂的空气中生长。

2.遗传构建体的制备

(a)中间质粒

质粒pCR.BEV2

用下述引物由编码牛肠道病毒RNA聚合酶的全长cDNA克隆扩增完整的牛肠道病毒(BEV)RNA聚合酶编码区域：

BEV-1 CGG CAG ATC CTA ACA ATG GCA GGA CAA  ATC GAG TACATC  [SEQ ID NO：7]和

BEV-3 GGG CGG ATC CTT AGA AAG AAT CGT ACC AC[SEQ ID NO：8]。

引物BEV-1的第4到9位(首尾包括在内)包含BglII限制性内切酶位点，在第16-18位(首尾包括在内)为ATG起始点。引物BEV-3在第5到10位(首尾包括在内)包含BamHI酶切位点和在第11到13位(首尾包括在内)包含与TAA翻译终止信号互补的碱基。结果含有翻译起始和终止信号的开放阅读框包含在BglII和BamHI酶切位点之间。将所述扩增片段克隆到pCR2.1中以构建质粒pCR.BEV2。

质粒pBS.PFGE

质粒pBS.PFGE包含克隆到pBluescript II SK⁺的多接头的来自pEGFP-N1的EGFP编码序列。为构建该质粒，来自pEGFP-N1的EGFP编码序列作为NotI-到-SacI片段克隆到用NotI/SacI-消化的pBluescript II SK⁺中。

(b)检测质粒

质粒pCMV.EGFP

质粒pCMV.EGFP(图5)能够表达完整的EGFP开放阅读框，在本实施例和下面的实施例中用作阳性转染对照(参见实施例12，2(b))。

质粒pCMV.BEV2.BGI2 2VEB

质粒pCMV.BEV2.BGI2.2VEB(图10)包含被人β-珠蛋白内含子2序列的插入打断的BEV聚合酶编码区的倒转重复或回文结构。质粒pCMV.BEV2.BGI2.2VEB通过下述连续的步骤构建：(i)将来自质粒pCR.BEV2的BEV2序列以BglII-到-BamHI片段按有义方向亚克隆到用BglII-消化的pCMV.BGI2.cass(实施例11)以构建质粒pCMV.BEV2.BGI2，和(ii)将来自质粒pCR.BEV2的BEV2序列以BglII-到-BamHI片段按反义方向亚克隆到用BamHI-消化的pCMV.BEV2.BGI2中以构建质粒pCMV.BEV2.BGI2.2VEB。

质粒pCMV.BEV.EGFP.VEB

质粒pCMV.BEV.EGFP.VEB(图11)包含被作为填充片段的EGFP编码序列打断的BEV聚合酶编码区的倒转重复或回文结构。为构建该质粒，将来自pBS.PFGE的含EGFP编码序列的EcoRI片段分离出来，按相对于CMV启动子的有义方向克隆到用EcoRI-消化的pCMV.cass中以构建pCMV.EGFP.cass。质粒pCMV.BEV.EGFP.VEB是通过下述的连续步骤构建的：(i)将来自质粒pCR.BEV2的BEV聚合酶序列以BglII-到-BamHI片段按有义方向亚克隆到用BglII-消化的pCMVEGFP.cass中以构建质粒pCMV.BEV.EGFP和(ii)将来自质粒pCR.BEV2的BEV聚合酶序列以BglII-到-BamHI片段按反义方向亚克隆到用BamHI-消化的pCMV.BEV.EGFP中以构建质粒pCMV.BEV.EGFP.VEB。

 3.共抑制表型的检测

(a)将表达牛肠道病毒RNA聚合酶的转基因插入CRIB-1细胞

转化在6-孔组织培养容器中进行。在每孔的2m DMEM，10％v/vDCS中接种2×10⁵ CRIB-1细胞并在37℃ 5％ v/v CO₂下培养，直到单层细胞达60-90％汇合，典型地需要16到24hr。

在10ml无菌的管中配置下述溶液：

溶液A：对每次转染，1μg DNA(pCMV.BEV2.BGI2. 2VEB或pCMV.EGFP-转染对照)在100μl OPTI MEM-I(注册商标)减少血清培养基(无血清培养基)中稀释；

溶液B：对于每次转染，10μl LIPOFECTAMINE(商标)试剂于100μl OpTI-MEM-I(注册商标)减少血清培养基中稀释。

将两种溶液倒在一起轻轻混合于室温下温育45min以形成DNA-脂质体复合物。形成复合物时将所述的CRIB-1用2ml OPTI-MEMI(注册商标)减少血清培养基冲洗一次。

对于每次转染，将0.8ml OPTI-MEMI(注册商标)减少血清培养基添加到含上述复合物的管中，将所述的管轻轻混合，将经过稀释的复合物溶液倒在冲洗过的CRIB-1细胞上。然后将所述细胞与上述复合物在37℃5％ v/v CO₂条件下孵育16到24hr。

去除转染复合物，用2ml DMEM，10％ v/v DCS覆盖CRIB-1单层细胞。所述细胞在37℃ 5％ v/v CO₂下培养约48hr。为选择稳定的转化子，所述的培养基每72hr用4ml DMEM，10％ v/v DCS，0.6mg/ml遗传霉素更换一次。24-48hr后用荧光显微镜在500-550nm波长下检测由转染对照pCMV.EGFP转化的细胞中的瞬间EGFP表达。筛选21天后，稳定转化的CRIB-1集落显而易见。

如实施例10的一般技术中所述对稳定转染的CRIB-1细胞单集落进行克隆，维持和贮存。

(b)牛肠道病毒滴度的确定

用于这些实验中的BEV分离物是一种克隆分离物，K2577。这一原始的病毒贮藏物的滴度是未知的。为从这一贮藏物中扩增BEV病毒，如下所述每孔用5μl病毒贮藏物转染细胞，使病毒复制48hr。收获培养基将其转移到带有螺旋盖的管中。在Sigma 3K18离心机中于4℃下3,500rpm离心15min以去除死细胞和细胞碎片。将上清倒入新管中用Beckman J2-M1离心机于4℃下20,000rpm离心30min以去除余下的碎片。倒出上清，如下所述测定这一新BEV贮液的滴度并于4℃下保存。

绝对值：

用6-孔组织培养板，在每孔2ml DMEM，10％ v/v DCS中接种2.5×10⁵ CRIB-1细胞。将所述细胞37℃含 5％ v/v CO₂下培养直到所述细胞达90-100％汇合。

用无血清培养基DMEM按10^-1到10^-9稀释BEV。从CRIB-1单层细胞中吸出培养基。用2ml 1×PBS覆盖单层细胞，并轻轻摇动组织培养容器以清洗所述单层细胞。从上述单层细胞中吸出PBS再重复洗一次。

立即将1ml经稀释的病毒溶液(10^-4到10^-9)直接添加到清洗过的CRIB-1细胞中，每孔用一个稀释度，一式两份。将所述的CRIB-1细胞与BEV在37℃ 5％ v/v CO₂条件下培养1hr并伴随轻柔搅拌。吸出病毒接种物，用3ml营养琼脂(在DMEM中加入1％纯净琼脂)覆盖转染后的细胞。用无菌蒸馏水配置2％ w/v纯净琼脂，DMEM为2×DMEM。熔化所述的纯净琼脂在50℃水浴中平衡1hr。在使用前将2×DMEM在37℃水浴中平衡15min。将两种溶液以1∶1混合，用于覆盖转染后的细胞。

使所覆盖的营养琼脂凝结，于37℃ 5％ v/v CO₂条件下倒置培养18-24hr。培养后每孔用3ml中性红琼脂(1.7ml中性红溶液(LifeTechnologies)/100ml营养琼脂)覆盖。使所覆盖的中性红琼脂凝结将所述的6孔板倒置，于黑暗中在37℃ 5％ v/v CO₂条件下培养18-24hr。在加入中性红琼脂后24hr数噬斑的数目以确定BEV病毒贮液的滴度。

经验值：

用24-孔组织培养板，在每孔800μl DMEM，10％ v/v DCS中接种4×10⁴ CRIB-1细胞。将所述细胞37℃含 5％ v/v CO₂下培养直到所述细胞达90-100％铺满。

由浓缩的BEV病毒贮液，用无血清培养基DMEM按10^-1到10^-9稀释BEV。从CRIB-1单层细胞中吸出培养基。用800μl 1×PBS覆盖单层细胞，并轻轻摇动组织培养容器以清洗所述细胞。从上述单层细胞中吸出PBS再重复洗一次。

立即将200μl经稀释的病毒溶液(10^-3到10^-9)直接添加到清洗过的CRIB-1细胞中，每孔用一个稀释度，一式两份。将所述的CRIB-1细胞与BEV在37℃ 5％ v/v CO₂条件下培养1hr，并对每孔镜检细胞裂解的情况。在每孔中再添加600μl无血清的DMEM。再经过24hr后，对每孔进行镜检细胞裂解的情况。正确的稀释度是可以在24后杀死大部分CRIB-1细胞，在48hr后杀死全部细胞的最低病毒浓度。

(c)牛肠道病毒攻击由pCMV.BEV2.BGI2.2VEB转化的CRIB-1细胞

用24-孔组织培养板，在每孔800μl DMEM，10％ v/v DCS中接种4×10⁴ CRIB-1细胞，一式三份。将所述细胞37℃含5％ v/v CO₂下培养直到所述细胞达90-100％铺满。

由浓缩的BEV病毒贮液，用无血清的DMEM以通过绝对或经验方式确定的正确稀释度稀释BEV病毒。另外，将BEV病毒贮液用高于和低于正确稀释度1个log值的稀释度(典型的为10^-4到10^-6)稀释。由CRIB-1单层细胞中吸出培养基，然后用800μl 1×PBS覆盖所述的单层细胞，轻轻晃动所述的组织培养容器以洗细胞。吸出PBS，再重复洗一次。

立即将200μl经稀释的病毒溶液(每个平行实验一个稀释度)直接添加到清洗过的CRIB-1细胞中。将所述的CRIB-1细胞与BEV在37℃ 5％ v/v CO₂条件下培养24hr，并对每孔镜检细胞裂解的情况。再在每孔中在添加600μl无血清的DMEM。再经过24hr后，对每孔进行镜检细胞裂解的情况。

转基因(BEV2.BGI2.2VEB)的转录诱导对于病毒复制是必需的BEV RNA聚合酶基因的转录后基因沉默。BEV RNA聚合酶基因基因沉默诱导抗牛肠道病毒感染。这些细胞系在病毒存在下继续分裂生长，而对照细胞在48hr内死亡。将耐受病毒的细胞进行下面的实验。

(d)CRIB-1病毒耐受性细胞系的产生

为确定用pCMV.BEV.EGFP.VEB或pCMV.BEV2.BGI2.2VEB转化的细胞是否可以耐BEV感染，用BEV稀释液侵染转化后的细胞系并检测细胞的存活情况。为克服这些实验的固有差异，进行了多个侵染试验，将一致表现耐病毒性的细胞分离出来进行下面的实验。这些实验的结果列于表3和4中。

表3 pCMV.BEV.EGFP.VEB转染的CRIB-1细胞(CRIB-1 EGFP)

细胞系	侵染1		侵染2		侵染3		侵染4
									10-4	10-5	10-4	10-5	10-4	10-5	10-4	10-5
	CRIB-1	nd	nd	-	-	-	-	-									-
CRIB-1  EGFP#1									-	-	-	-	-	-	+	-
	CRIB-1  EGFP#3	-	-	+	++	-	-	nd									nd
CRIB-1  EGFP#4									-	-	-	-	-	-	++	-
	CRIB-1  EGFP#5	-	-	+	+++	-	-	nd									nd
CRIB-1  EGFP#6									-	+	-	-	-	-	-	-
	CRIB-1  EGFP#7	+	+	-	+	+	+	nd									nd
CRIB-1  EGFP#8									+	+++	+	+	+	+++	-	++
	CRIB-1  EGFP#9	-	-	-	+	+	+	nd									nd
CRIB-1  EGFP#10									-	+	-	+	+	++	nd	nd
	CRIB-1  EGFP#11	+	++	-	-	+	+++	nd									nd
CRIB-1  EGFP#12									-	+	+	++	+	+	nd	nd
	CRIB-1  EGFP#13	-	-	+	+	-	-	nd									nd
CRIB-1  EGFP#14									++	++	+	++	++	+	+	+
	CRIB-1  EGFP#15	-	+	++	++	+	++	nd									nd
CRIB-1  EGFP#16									-	+	-	++	+	++	nd	nd
	CRIB-1  EGFP#17	-	-	+	+	-	-	nd									nd
CRIB-1  EGFP#18									+	+	++	+	++	++	nd	nd
	CRIB-1  EGFP#20	-	-	-	-	+	+++	nd									nd
CRIB-1  EGFP#21									-	++	+	++	+	+	nd	nd
	CRIB-1  EGFP#22	-	+	+	+	+	+	nd									nd
CRIB-1  EGFP#23									-	-	-	+++	-	++	-	-
	CRIB-1  EGFP#24	-	-	+	++	-	+	-									-
CRIB-1  EGFP#25									-	+	-	+++	-	-	nd	nd
	CRIB-1 EGFP#26	+	++	++	+++	++	+++	-									-

 -：  没有细胞存活+：  1-10％的细胞存活++： 10-90％的细胞存活+++：90％+的细胞存活nd： 未测

表4 用pCMV.BEV2.BGI2.2VEB转染的CRIB-1细胞(CRIB-1 BGI2)

细胞系	侵染1		侵染2		侵染3		侵染4
										10-4	10-5	10-4	10-5	10-4	10-5	10-4	10-5
CRIB-1	nd	nd	-	-	-	-	-	-
									CRIB-1  BGI2#1	-	-	-	-	-	-	nd	nd
CRIB-1  BGI2#2	-	-	-	+	-	-	-	-
									CRIB-1  BGI2#3	-	-	++	++	+	++	nd	nd
CRIB-1  BGI2#4	-	-	-	+	-	-	nd	nd
									CRIB-1  BGI2#5	-	-	-	++	-	-	nd	nd
CRIB-1  BGI2#6	+	+	+++	++	+	+	nd	nd
									CRIB-1  BGI2#7	+	+	-	+++	-	-	nd	nd
CRIB-1  BGI2#8	-	+	+++	++	-	+	nd	nd
									CRIB-1  BGI2#9	-	+	-	++	+	++	-	++
CRIB-1  BGI2#10	++	++	++	+++	+	+	-	-
									CRIB-1  BGI2#11	+	++	+	+	-	+	nd	nd
CRIB-1  BGI2#12	+	+	+	+++	-	-	nd	nd
									CRIB-1  BGI2#13	-	-	+++	+++	-	-	nd	nd
CRIB-1  BGI2#14	+	++	+	++	+	+	nd	nd
									CRIB-1  BGI2#15	+	+	+	++	+	++	-	-
CRIB-1  BGI2#16	-	-	-	-	-	-	nd	nd
									CRIB-1  BGI2#17	-	+	-	++	-	-	nd	nd
CRIB-1  BGI2#18	-	-	-	+++	-	-	nd	nd
									CRIB-1  BGI2#19	-	-	-	++	+	+++	+	+++
CRIB-1  BGI2#20	+	+	+	+++	+	+	nd	nd
									CRIB-1  BGI2#21	-	-	-	-	-	-	-	-
CRIB-1  BGI2#22	-	-	-	-	-	-	-	-
									CRIB-1  BGI2#23	-	+	+++	+++	+	+	nd	nd
CRIB-1  BGI2#24	-	++	+++	+	-	-	nd	nd

 -：  没有细胞存活+：  1-10％的细胞存活++： 10-90％的细胞存活+++：90％+的细胞存活nd： 未测

这些数据表明耐病毒的细胞系可以以这种方式定义。另外，能在病毒侵染下存活的细胞逐渐增长用于下述实验。

为进一步确定这些细胞系的病毒耐受程度，细胞系CRIB-1 BGI2#19，和由在初次侵染(CRIB-1细胞系BGI2#19(tol))下存活的细胞长成的耐病毒细胞系用更细比例的系列稀释的BEV进行进一步分析。

用部份3(c)中概述的方法，将三倍系列稀释的BEV用于感染一式三份的细胞系。结果列于表5中。

表5

细胞系	病毒贮液的稀释
								3.3×10-4	1.1×10-4	3.7×10-5	1.2×10-5	4.1×10-5	1.3×10-6
CRIB-1平行实验1	-	-	-	-	-	+++
							CRIB-1平行实验1	-	-	-	-	-	+
CRIB-1平行实验1	-	-	-	-	-	+++
							CRIB-1 BGI2#19平行实验1	-	-	+	+	++	+++
CRIB-1 BGI2#19平行实验2	-	-	-	-	++	+++
							CRIB-1 BGI2#19平行实验3	-	-	-	+	+++	+++
CRIB-1 BGI2#19(tol)平行实验1	-	-	+	+	+++	+++
							CRIB-1 BGI2#19(tol)平行实验2	-	-	+	+	++	+++
CRIB-1 BGI2#19(tol)平行实验3	-	-	+	+	+++	+++

  -： 转染后48hr没有细胞存活+： 转染后48hr 1-10％的细胞存活。++：转染后48hr 10-90％的细胞存活。+++：转染后48hr 90％+的细胞存活。

这些数据表明细胞系CRIB-1 BGI2#19和CRIB-1 BGI2#19(tol)比亲本CRIB-1细胞系能耐受更高滴度的BEV。图12A，12B和12C是比较CRIB-1和CRIB-1 BGI2#19(tol)细胞在转染前和转染后48hr的显微照片。

4.核连缀转录分析实验

为检测CRIB-1的细胞核中转基因的转录，用由活跃分裂的细胞中分离出的无细胞的核进行了核连缀转录分析。所述的核是依照上述实施例10中的核分离方法获得的。

依照上述实施例10中所述的核连缀转录分析方法对来自转染质粒pCMV.BEV2.BGI2.2VEB的转基因BEV2.BGI2.2VEB的核RNA转录本进行分析。

5.未转化的和共抑制的细胞系中mRNA的比较

依照上述实施例10中所述的方法分析了相应于BEVRNA聚合酶的信使RNA和由转基因BEV2.BGI2.2VEB转录的RNA。

6.Southern实验

用Southern印迹实验分析各转基因CRIB-1细胞系以确定转基因的整合及转基因的拷贝数。上述实验依照实施例10中所述的方法进行。

                          实施例14

         体外鼠科动物B16型细胞中酪氨酸酶的共抑制

1.细胞系的培养

依上述实施例10中所述，来自鼠科动物黑素瘤的B16细胞(ATCCCRL-6322)用添加了10％ v/v FBS的RPMI 1640培养，长成贴壁单层细胞

2.遗传构建体的制备

(a)中间质粒

质粒TOPO.TYR

如实施例11所述方法，从所培养的鼠科动物B16黑素瘤细胞中纯化总RNA并制备cDNA。

为扩增鼠科动物酪氨酸酶基因区域，用2μl这种混合物作为底物利用如下引物进行PCR扩增：

TYR-F：GTT TCC AGA TCT CTG ATG GC[SEQ ID NO：9]和

TYR-R：AGT CCA CTC TGG ATC CTA GG[SEQ ID NO：10]。

用HotStarTaq DNA聚合酶依制造商提供的方法(Qiagen)进行PCR扩增。PCR扩增的条件包括起始激活步骤95℃ 15min，接下来在94℃30秒、55℃ 30秒、72℃ 60秒扩增35个循环，最后的延长步骤是在72℃ 4min。

酪氨酸酶的PCR扩增区域用柱纯化(PCR纯化柱，Qiagen)然后依制造商的说明书(Invitrogen)克隆到pCR(注册商标)2.1-TOPO中以构建质粒TOPO.TYR。

(b)测试质粒

质粒pCMV.EGFP

质粒pCMV.EGFP(图5)能够表达完整的EGFP开放阅读框，在本实施例和下面的实施例中用作阳性转染对照(参见实施例12，2(b))。

质粒pCMV.TYR.BGI2.RYT

质粒pCMV.TYR.BGI2.RYT(图13)包含被人β-珠蛋白内含子2序列的插入打断的鼠科动物酪氨酸酶基因区域的倒转重复或回文结构。质粒pCMV.TYR.BGI2.RYT通过下述连续的步骤构建：(i)将来自质粒TPOP.TYR的TYR序列以BglII-到-BamHI片段按有义方向亚克隆到用BglII-消化的pCMV.BGI2以构建质粒pCMV.TYR.BGI2，和(ii)将来自质粒TOPO.TYR的TYR序列以BglII-到-BamHI片段按反义方向亚克隆到用BamHI-消化的pCMV.TYR.BGI2中以构建质粒pCMV.TYR.BGI2.RYT。

质粒pCMV.TYR

质粒pCMV.TYR(图14)包含单拷贝的酪氨酸酶cDNA序列，其表达受CMV启动子的控制。将质粒TOPO.TYR上带有TYR序列的BamHI-到-BglII片段克隆到由BamHI-消化的pCMV.cass中，筛选含有相对于CMV启动子为有义方向的TYR序列的质粒，以构建质粒pCMV.TYR。

质粒pCMV.TYR.TYR

质粒pCMV.TYR.TYR(图15)包含小鼠酪氨酸酶cDNA序列的直接重复，其表达受CMV启动子的控制。质粒pCMV.TYR.TYR是通过下述方式构建的：将质粒TOPO.TYR的含TYR序列的BamHI-到-BglII片段克隆到用BamHI-消化的pCMV.TYR中，筛选含有第二个TYR序列(相对于CMV启动子为有义方向)的质粒。

4.共抑制表型的检测

(a)向鼠科动物黑素瘤B16细胞插入酪氨酸酶基因区域通过酪氨酸酶的PTGS减少黑色素形成

酪氨酸酶是哺乳动物细胞中控制色素形成的主要的酶。如果该基因失活，B16黑素瘤细胞将不再产生黑色素。这与白化病动物中的反应过程本质上相同。

转化在6-孔组织培养容器中进行。在每孔的2ml RPMI 1640，10％v/v FBS中接种1×10⁵细胞并在37℃ 5％ v/v CO₂下培养，直到单层细胞达60-90％铺满，典型地需要16到24hr。

接下来的步骤除了B16细胞与DNA脂质体复合物仅在37℃ 5％ v/vCO₂下培养3到4hr外，同上述实施例13，3(a)中所述。

如实施例10的一般技术中所述对稳定转染的B16细胞单集落进行克隆，维持和贮存。

筛选出36个用pCMV.TYR.BGI2.RYT稳定转化的克隆、34个用pCMV.TYR稳定转化的克隆、和37个用pCMV.TYR.TYR稳定转化的克隆进行下面的实验。

当内源酪氨酸酶基因转录后沉默时，在B16细胞产生的黑色素减少。在正常情况下带有深棕色色素沉淀的B16细胞表现出浅色素沉淀或无色素沉淀。

(b)在转化的B16细胞系中可见地监测黑色素的产生

为监测转化的细胞系中黑色素的含量，将细胞用胰蛋白酶消化，转移到含FBS的培养基中以抑制胰蛋白酶的活性。用血细胞计数板对细胞计数，再将2×10⁶细胞转移到微离心管中。于室温下2,500rpm离心3min收集细胞，凭视力检测沉淀物。

用pCMV.TYR.BGI2.RYT转化的5个克隆，即B16.21.11，B163.1.4，B16 3.1.15，B16 4.12.2和B16 4.12.3，比B16对照苍白(图16)。用pCMV.TYR转化的4个克隆(B16+Tyr2.3，B16+Tyr 2.9，B16+Tyr 3.3，B16+Tyr 3.7和B16+Tyr4.10)和用pCMV.TYR.TYR转化的5个克隆(B16+TyrTyr 1.1，B16+TyrTyr 2.9，B16+TyrTyr 3.7，B16+TyrTyr 3.13和B16+TyrTyr 4.4)也比B16对照苍白得多。

(c)依照Schmorl通过染色鉴定黑色素

用经修饰的Schmorl’s黑色素染色方法(Koss，L.G.(1979)Diagnostic Cytology.J.B. Lippincott，Philadelphia)可以特异性诊断细胞黑色素的存在。用该方法可以通过将黑色素转变成深绿色(greenish-black)色素的特异性染色过程检测细胞中的黑色素。

将待染色的细胞群以500,000细胞每ml RPMI 1640培养基的浓度重悬。滴加200μl到表面无菌的显微镜载玻片上，将所述玻片置于100mm TC盘中在湿润的空气中于37℃下孵育，直到细胞与玻片紧密粘附。去除培养基在加热块上于37℃空气干燥30min以固定细胞，然后再用PBS中的4％ w/v低聚甲醛(Sigma)后固定1hr。将固定后的细胞浸润在用蒸馏水配置的96％ v/v乙醇，70％ v/v乙醇，50％ v/v乙醇，然后是蒸馏水中进行水合。带有贴壁细胞的玻片置于硫酸亚铁溶液[2.5％ w/v硫酸亚铁/水]中1hr，然后用蒸馏水冲洗4次，每次1min。再将所述玻片置于高铁氰化钾溶液[1％(w/v)高铁氰化钾在1((v/v)乙酸的蒸馏水溶液中]中30min。所述玻片浸润于1％ v/v乙酸(浸15下)然后浸于蒸馏水中(浸15下)。

  细胞在Nuclear Fast Red制剂[在5％ w/v硫酸铵水溶液中加热溶解0.1％ w/v Nuclear Fast Red(C.I.60760 Sigma N 8002)]中染色1-2min。在玻片上固定并染色的细胞浸润于蒸馏水中清洗(浸15下)。将盖玻片盖在于甘油/DABCO[在含80％ v/v甘油的PBS液中含25mg/ml DABCO(1，4-二氮杂二环(2.2.2)辛烷(Sigma D2522))]中的载玻片上。用100x油浸物镜通过亮视野检测细胞。

对所有细胞，通过Schmorl’s染色的结果与经简单观察的数据(如图16所示)相关。当用上述方法对B16细胞进行染色时，在大部分细胞中黑色素均很明显。相反，在转化系B16 2.1.11，B16 3.1.4，B16 3.1.15，B16 4.12.2，B16 4.12.3，B16 Tyr 2.3，B16Tyr 2.9，B16 Tyr 4.10，B16 TyrTyr 1.1，B16 TyrTyr 2.9和B16 TyrTyr 3.7中几乎没有细胞表现出黑色素染色，这与在这些细胞系中所观察到的总酪氨酸酶活性降低相一致。

(d)在转化的细胞系中分析酪氨酸酶的酶活性

酪氨酸酶催化黑色素合成的头两步：酪氨酸羟基化成多巴(二羟苯基丙氨酸)，多巴氧化成多巴醌。可通过测定多巴氧化酶活性测定酪氨酸酶。这一实验用Besthorn腙(3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐，MBTH)捕获L-多巴氧化形成的多巴醌。在反应混合物中低浓度N，N’-二甲基甲酰胺的存在使MBTH可溶解，该方法可在一定范围的pH下使用。通过Michael加成反应MBTH与多巴醌反应形成可由分光光度计或平板读数仪监测的深粉红色的产物。可以认为MBTH与多巴醌的反应相对于酶-催化的L-多巴氧化来说相当迅速。产生粉红色素的速率可用于定量测定酶活性(Winder和Harris，1991；Dutkiewicz等，2000)。

B16细胞和转化的B16细胞系置于96-孔板的各孔中，一式三份。恒量的细胞(25,000)加入各孔中并将细胞培养过夜。在培养24或48hr后如下述进行酪氨酸酶实验。

每孔用200μl PBS洗，然后每孔加入20μl于50mM磷酸钠缓冲液(pH 6.9)中的0.5％ v/v Triton X-100。通过下述冻-融操作使细胞裂解和溶解：-70℃ 30min，接着于室温下25min和37℃下5min孵育。

向每孔添加190μl新鲜配制的分析缓冲液(6.3mM MBTH，1.1mML-多巴，4％ v/v N，N’-二甲基甲酰胺于48mM磷酸钠缓冲液(pH7.1)中)以分析酪氨酸酶活性。在Tecan板读数仪中于505nm下监测颜色的形成用X/Scan软件收集数据。以恒定的时间间隔读数，于室温下，典型地为22℃下监测反应。计算所测定的三个平行样品的平均酶活性。分析数据，在产物线性形成的早期时间点(典型地为2到12min之间)，估计酪氨酸酶活性。这些实验的结果列于下述表6和7中。

表6

细胞系	酪氨酸酶活性(ΔOD505nm/min/25,000细胞)	与B16细胞相比的相对酪氨酸酶活性(％)
			B16	0.0123	100
B16 2.1.6	0.0108	87.8
			B16 2.1.11	0.0007	5.7
B16 3.1.4	0.0033	26.8
			B16 3.1.15	0.0011	8.9
B16 4.12.2	0.0013	10.6
			B16 4.12.3	0.0011	8.9
B16 Tyr Tyr 1.1	0.0043	34
			B16 Tyr Tyr 2.9	0.0042	34.1
B16 Tyr Tyr 3.7	0.0087	70.7

表7

细胞系	酪氨酸酶活性(ΔOD 505nm/min/25,000细胞)	与B16细胞相比的相对酪氨酸酶活性(％)
			B16	0.0200	100
B16 Tyr 2.3	0.0036	18.2
			B16 Tyr 2.9	0.0017	8.7
B16 Tyr 4.10	0.0034	17.2

这些数据表明酪氨酸酶的酶活性在用构建体pCMV.TYR.BGI2.RYT，pCMV.TYR和pCMV.TYR.TYR转化的细胞系中受到抑制。

4.核连缀转录分析实验

为检测转基因RNA在B16细胞核中的转录，用由活跃分裂的细胞中分离出的无细胞的核进行了核连缀转录分析。所述的核是依照上述实施例10中的核分离方法获得的。

依照上述实施例10中所述的核连缀转录分析方法对来自转染质粒pCMV.TYR.BGI2.RYT的转基因TYR.BGI2.RYT和内源酪氨酸酶基因的核RNA转录本进行分析。

为评估在B16细胞和转化系B163.1.4和B16 Tyr Tyr 1.1中内源酪氨酸酶基因转录速率，用由活跃分裂的细胞中分离出的细胞核进行了核连缀转录分析。所述的核是依照上述实施例10中的核分离方法获得的。用实施例10概述的方法，连缀转录本用生物素标记，并用链霉亲合素捕获物进行纯化。

为确定上述细胞中内源酪氨酸酶基因的转录速率，用实时PCR反应对由核连缀转录分析实验中分离出的生物素标记的酪氨酸酶转录本进行定量。内源酪氨酸酶基因的相对转录速率通过将生物素标记的酪氨酸酶RNA的水平与普遍表达的内源转录本，即鼠科动物磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的水平比较进行评估。

内源酪氨酸酶和小鼠GAPDH基因的表达水平通过重复PCR反应确定。为对这些数据进行定量地解释，用由B16细胞分离的经寡dT-纯化的RNA制作了标准曲线。用Dynabeads mRNA DIRECT Micro试剂盒依照制造商的建议(Dynal)进行寡dT-纯化。这些实验的结果列于表8中。

表8

细胞系	在生物素捕获的核连缀转录RNA中的酪氨酸酶和GAPDH RNA水平			酪氨酸酶基因的相对转录速率
						Ct TYR	Ct GAPDH	ΔCt
B16	38.6	27.2	11.5	1.00
					B16 3.1.4	36.5	24.4	12.1	0.65
B16 TyrTyr 1.1	38.5	26.2	12.4	0.59

这些数据清楚地表明在两个分别用pCMV.TYR.BGI2.RYT和pCMV.TYR.TYR转化的沉默的B16细胞系B16 3.1.4和B16 TyrTyr1.1的核中内源酪氨酸酶基因的转录速率与未转化的B16细胞核中的酪氨酸酶基因的转录速率没有明显的差异。

5.在未转化的和共抑制的细胞系中mRNA的比较

依照上述实施例10中所述的方法分析了内源酪氨酸酶的信使RNA和由转基因TYR.BGI2.RYT转录的RNA。

为精确地评估在B16和转化系中的酪氨酸酶mRNA水平而进行了实时PCR反应。这些实验的结果列于表9中

表9

细胞系	在寡-dT纯化的总RNA中酪氨酸酶和GAPDH mRNA的水平			酪氨酸酶mRNA的相对水平
						Ct TYR	Ct GAPDH	ΔCt
B16	33.5	21.9	11.7	1.0
					B16 3.1.4	33.8	22.1	11.7	1.0
B16 TyrTyr1.1	35.1	23.0	12.1	0.7

这些数据清楚地表明，在两个沉默的B16细胞系B16 3.1.4和B16 TyrTyr 1.1(分别用pCMV.TYR.BGI2.RYT和pCMV.TYR.TYR转化的)中酪氨酸酶mRNA的水平(作为poly(A)RNA)与未转化的B16细胞中的酪氨酸酶mRNA水平没有显著的差异。

6.Southern分析

用Southern印迹实验分析各转基因B16细胞系以确定整合及转基因的拷贝数。上述实验依照实施例10中所述的方法进行。

                         实施例15

       在Mus肌肉株C57BL/6和C57BL/6×DB1杂合体中酪氨酸酶的

                        体内共抑制

1.构建体的制备

所述的中间质粒TOPO.TYR和测试质粒pCMV.TYR.BGI2. RYT如上述实施例14中所述进行制备。

2.转基因小鼠的制备

通过对受精卵的原核进行遗传修饰产生转基因小鼠。将受精卵从输卵管中分离出来后置于注射显微镜上，将以纯化的DNA溶液形式存在的转基因注射到最可见的原核中(U.S.专利No.4,873,191)。

通过诱导模拟受孕的激素阶段产生假孕的雌鼠作为“受体母亲”。经过注射的受精卵或培养过夜以评估其存活力，或直接转回到假孕受体的输卵管中。在421个已注射的受精卵中转移了255个。通过上述注射所形成的转基因子代称作“基鼠(founder)”。为确定转基因是否已整合到小鼠基因组中，断奶后确定了子代的基因型。确定基因型是通过对从尾活检组织纯化的基因组DNA进行PCR和/或Southern印迹进行的。

使基鼠进行交配开始建立转基因系。由于每一谱系在转基因拷贝数和染色体定位方面均不同，因此基鼠和其子代维持不同的血统。通过原核注射产生的每一转基因小鼠都是一个新种的基鼠。如果所述的基鼠是雌鼠，则分析了一些由该基鼠产生的第一窝子鼠的转基因传递情况。

3.共抑制表型的检测

成功转基因的小鼠的可见变化是皮毛颜色的改变。通过标准的方法(Bennett等，1989；Spanakis等，1992；Sviderskaya etal.，1995)从转基因小鼠获得皮肤细胞活检组织，并作为黑色素细胞的原代培养物进行培养。

剃除成年小鼠进行活组织检查部分的毛，用70％ v/v乙醇进行皮肤表面消毒，然后用PBS冲洗。在无菌条件下移出待进行活组织检查的部分。对新生小鼠进行取样是在处死动物后进行的，将所述样品用70％v/v乙醇消毒再用PBS冲洗。在无菌条件下解剖皮肤样品。

所有的活检组织均贮藏于6-孔板的PBS中。为获得单细胞悬浮液，用移液管移去PBS，将皮肤样品用解剖刀切成小块(2×5mm)然后在2x胰蛋白酶(5mg/ml)PBS中于37℃下孵育约1hr(对于新生样品)，和在1x胰蛋白酶(2.5mg/ml)中于4℃孵育多达15hr(对于成熟的皮肤样品)(0.5g在2.5ml中)。这一消化使表皮和真皮相分离。用RPMI 1640培养基替换胰蛋白酶以终止酶活性。用细镊子(无菌的)分离每一片表皮，收集分离的表皮样品合并于1x胰蛋白酶的PBS液中。通过抽吸制备单细胞悬液，将已分离的细胞收集在RPMI1640培养基中。可将表皮样皮重复用胰蛋白酶消化。稍离心(1000rpm，3min)浓缩汇合的表皮细胞，再将细胞重悬于生长培养基[RPMI 1640加有5％ v/v FBS，2mML-谷氨酰胺，20单位/ml青霉素，20μg/ml链霉素加13-乙酸12-肉豆蔻佛波醇(PMA)10ng/ml(16nM)和霍乱毒素(CTX)20ng/ml(1.8nM)]。将悬液转移到T25培养瓶在没有扰动的条件下培养48hr。更换培养基并在48hr时去除未贴壁的细胞。继续培养48-72后弃去培养基，将贴壁的细胞用PBS洗涤，由1x胰蛋白酶的PBS处理。经过此种处理后，黑素细胞首先分离开，将已分离开的细胞转移到新烧瓶中的新鲜培养基中。

由形态可以容易地将组织培养中的黑素细胞与角质细胞区分开。角质细胞具有圆或多角的外形；黑素细胞为两极或分枝状。黑素细胞可由Schmorl’s法(参见实施例14，见上)染色以检测黑色素颗粒。另外，可以利用鼠科动物对MART-1(NeoMarkers MS-614)的单克隆抗体为一抗通过免疫荧光标记(参见实施例10，见上)检测在盖玻片上生长的培养物样品，所述的MART-1是一种在黑素体中发现的抗原。这一抗体不与上皮细胞，淋巴细胞或间充质细胞发生交叉反应。

4.核连缀转录分析

为检测酪氨酸酶内源基因和转基因RNA在原代培养的黑素细胞的核中的转录，用由活跃分裂的细胞中分离出的无细胞的核进行了核连缀转录分析。所述的核是依照上述实施例10中的核分离方法获得的。

依照上述实施例10中所述的核连缀转录分析方法对酪氨酸酶内源基因和来自转染质粒pCMV.TYR.BGI2.RYT的转基因的核RNA转录本进行分析。

5.在未转化的和共抑制的细胞系中mRNA的比较

依照上述实施例10中所述的方法分析了内源酪氨酸酶的信使RNA和由转基因TYR.BGI2.RYT转录的RNA。

6.Southern分析

用Southern印迹实验分析原代培养的黑素细胞系以确定整合及转基因的拷贝数。上述实验依照实施例10中所述的方法进行。

                        实施例16

在Mus肌肉株C57BL/6中α-1，3，-半乳糖基转移酶(GalT)的体

                        内共抑制

1.遗传构建体的制备

(a) 质粒TOPO.GALT

如实施例11中所述方法，从所培养的鼠科动物2. 3D17神经细胞纯化总RNA，并制备cDNA。

用2μl此种混合物作为底物，用下述引物通过PCR扩增鼠科动物α-1，3，-半乳糖基转移酶(GalT)基因的3’-UTR：

GALT-F2：CAC AGA CAG ATC TCT TCA GG[SEQ ID NO：11]和

GALT-R1：ACT TTA GAC GGA TCC AGC AC[SEQ ID NO：12]。

PCR扩增使用HotStar Taq DNA聚合酶按厂家说明书(Qia gen)进行。PCR扩增条件包括最初的激活步骤95℃15min，接下来在94℃30秒、55℃30秒、72℃60秒扩增35个循环，最后的延长步骤是在72℃4min。

GalT的PCR扩增区域用柱纯化(PCR纯化柱，Qiagen)然后依制造商的建议(Invitrogen)克隆到pCR2.1-TOPO中以构建质粒TOPO.GALT。

(b)检测质粒

质粒pCMV.GALT.BGI2.TLAG

质粒pCMV.GALT.BGI2.TLAG(图17)包含被人β-珠蛋白内含子2序列的插入打断的鼠科动物GalT基因3’UTR的倒转重复或回文结构。质粒pCMV.GALT.BGI2.TLAG通过下述连续的步骤构建：(i)将来自质粒质粒TOPO.GALT的GALT序列以BglII-到-BamHI片段按有义方向亚克隆到用BglII-消化的pCMV.BGI2中以构建质粒pCMV.GALT.BGI2，和(ii)将来自质粒TOPO.GALT的GALT序列以BglII-到-BamHI片段按反义方向亚克隆到用BamHI-消化的pCMV.GALT.BGI2中以构建质粒pCMV.GALT.BGI2.TLAG。

2.转基因小鼠的制备

通过对受精卵的原核进行遗传修饰产生转基因小鼠。将受精卵从输卵管中分离出来后置于注射显微镜上，将以纯化的DNA溶液形式存在的转基因注射到最可见的原核中(U.S.Patent No.4,873,191)。

通过诱导模拟受孕的激素阶段产生假孕的雌鼠作为“受体母亲”。经过注射的受精卵或培养过夜以评估其存活力，或直接转回到假孕受体的输卵管中。在99个已注射的受精卵中转移了25个。通过上述注射所形成的转基因子代称作“基鼠”。为确定转基因是否已整合到小鼠基因组中，断奶后确定了子代的基因型。确定基因型是通过对从活检组织中纯化的基因组DNA进行PCR和/或Southern印迹进行的。

使基鼠进行交配开始建立转基因系。由于每一谱系在转基因拷贝数和染色体定位方面均不同，因此基鼠和其子代维持不同的血统。通过原核注射产生的每一转基因小鼠都是一个新种的基鼠。如果所述的基鼠是雌鼠，则分析了一些由该基鼠产生的第一窝子鼠的转基因传递情况。

3.共抑制表型的检测

所述的α-1，3，-半乳糖基转移酶(GalT)催化将半乳糖残基添加到除人和其它灵长目之外的所有哺乳动物细胞的细胞表面蛋白上。由GalT的作用造成的表位是负责人体中异体移植(xenotransplants)排斥的主要抗原。用FACS对外周血白细胞(PBL)和脾细胞中的GalT表达水平的细胞学分析确证了基因活性的下调。

通过FACS对转基因小鼠的外周血白细胞和脾细胞的分析

为分析用GalT构建体转化的转基因小鼠的细胞，对外周血白细胞(PBL)和脾细胞进行了FACS分析。白细胞是最方便用于分析的组织来源其可由PBL或脾细胞中分离获得。为分离PBL，将小鼠从眼部放血，收集50到100μl血液到肝素化管中。所述的红细胞(RBCs)通过NH₄Cl缓冲液(0.168M)的处理而裂解，回收PBL。

为获得脾细胞，将动物安乐死，取出脾脏浸润并如上述裂解RBCs。将产生的脾细胞在体外于白介素-2(IL-2；Sigma)存在下培养以产生短期T培养物。所述的细胞用4％ w/v PFA的PBS固定。所有的操作步骤均在冰上进行。GalT活性最适宜通过能与细胞表面蛋白的半乳糖残基特异结合的植物凝集素(IB4；Sigma)进行分析。通过结合与生物素偶联的IB4，在细胞表面检测GalT。用与Cy5荧光团偶联的链霉抗生物素蛋白处理所述的白细胞。另一细胞标记，T特异的糖蛋白Thy-1用异硫氰酸荧光素-偶联抗体(FITC；Sigma)标记。所述的白细胞与上述试剂混合物一起温育30min对细胞进行标记。清洗后，所述细胞在FACScan上进行分析(Tearle，R.G.等，1996)。

4.核连缀转录分析

为检测脾细胞核中转基因RNA的转录，用由活跃分裂的细胞中分离出的无细胞的核进行了核连缀转录分析。脾细胞在体外于白介素-2(IL-2；Sigma)存在下培养以产生短期T培养物。所述的核是依照上述实施例10中用于悬浮细胞培养物的核分离方法获得的。

依照上述实施例10中所述的核连缀转录分析方法对GalT内源基因和转染质粒pCMV.GALT.BGI2.TLAG的转基因的核RNA转录本进行分析。

5.未转化和共抑制的细胞系中的mRNA的比较

依照上述实施例10中所述的方法分析了内源GalT的信使RNA和由转基因GALT.BGI2.TLAG转录的RNA。

6.Southern实验

用Southern印迹实验分析各转基因脾细胞系以确定整合及转基因的拷贝数。上述实验依照实施例10中所述的方法进行。

                      实施例17

           体外NIH/3T3细胞中小鼠胸苷激酶的共抑制

细胞通过两条途径-从头合成途径或补救途径产生核糖核酸和脱氧核糖核酸。从头合成途径是从简单化合物如氨基酸，糖，CO₂和NH₃装配核苷酸。嘌呤和嘧啶核苷酸的各自前体肌苷5’一磷酸盐(IMP)和尿苷5’一磷酸盐(UMP)最初是通过该途径产生的。IMP和胸苷5’一磷酸盐(TMP)的从头合成需要四氢叶酸衍生物作为辅因子，并且这些核苷酸的从头合成受抑制二氢叶酸还原酶的抗叶酸氨基蝶呤的阻断。补救途径是指将游离的已形成的嘌呤碱基或胸苷转化到相应的核苷单磷酸(NMP)的酶促反应。当从头合成途径受阻时，若培养基中存在预形成的碱基则补救酶可使细胞存活。

正常情况下哺乳动物细胞表达几种补救酶，包括可将胸苷转化成TMP的胸苷激酶(TK)。药物5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU；Sigma)可选择缺乏TK的细胞。含有功能性TK的细胞中，所述的酶将上述药物的类似物转化或相应的5’一磷酸盐，当其整合到DNA中后即成为致命因子。相反，无TK表达的细胞不能在含氨基喋呤和胸苷的HAT培养基(Life Technologies)上生长。上述补充的第一个因子阻断了NMP的从头合成途径，第二个因子提供了TK补救途径的底物，因此具有完整的该途径的细胞可以存活。

1.NIH/3T3细胞系的培养

鼠科动物成纤维细胞样细胞系NIH/3T3(ATCC CRL-1658)的细胞如上述实施例10中所述在添加了10％ v/v FBS和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中生长成为贴壁单层细胞。细胞按常规在37℃含5％ v/v CO₂的空气中生长。

2.遗传构建体的制备(a)中间质粒

质粒TOPO.MTK

用鼠科动物cDNA作为模板通过PCR扩增鼠科动物胸苷激酶基因区域。所述的cDNA由自鼠科动物黑素瘤细胞系B16中分离的总RNA制备。所述的总RNA按上述实施例14中所述进行纯化。用下述引物扩增鼠科动物胸苷激酶序列：

MTK1：AGA TCT ATT TTT CCA CCC ACG GAC TCT CGG[SEQ IDNO：13]和

MTK4：GGA TCC GCC ACG AAC AAG GAA GAA ACT AGC[SEQ IDNO：14]。

将上述扩增产物克隆到pCR(注册商标)2. 1-TOPO以构建中间克隆TOPO.MTK。

(b)检测质粒

质粒DCMV MTK.BG12.KTM

质粒pCMV.MTK.BGI2.KTM(图18)包含被人β-珠蛋白内含子2序列的插入打断的鼠科动物胸苷激酶编码区的倒转重复或回文结构。质粒pCMV.MTK.BGI2.KTM通过下述连续的步骤构建：(i)将来自质粒TOPO.MTK的MTK序列以BglII-到-BamHI片段按有义方向亚克隆到用BglII-消化的pCMV.BGI2.cass(实施例11)以构建质粒pCMV.MTK.BGI2，和(ii)将来自质粒TOPO.MTK的MTK序列以BglII-到-BamHI片段按反义方向亚克隆到用BamHI-消化的pCMV.MTK.BGI2中以构建质粒pCMV.MTK.BGI2.KTM。

3.共抑制表型的检测

(a)将表达TK的转基因插入到NIH/3T3细胞中

转化在6-孔组织培养容器中进行。在每孔的2ml DMEM，10％ v/vFBS中接种1×10⁵细胞并在37℃5％ v/v CO₂下培养，直到单层细胞达60-90％铺满，典型地需要16到24hr。

接下来的步骤除了NIH/3T3细胞与DNA脂质体复合物仅在37℃ 5％v/v CO₂下培养3到4hr外，同上述实施例13，3(a)中所述。

(b)在NIHl3T3细胞中小鼠TK基因的转录后沉默

具有PTGS的TK的NIH/3T3细胞能够耐受在其正常生长的培养基中添加100μg/ml的BrdU(NeoMarkers)，并在这种情况下继续复制。经过类似处理的对照NIH/3T3细胞群停止复制，在含BrdU的培养基的培养基中生长7天后，细胞数不再增加。对照NIH/3T3细胞能够在添加了1xHAT的生长培养基中复制，而在此种条件下TK发生PTGS的细胞不能生长。TK发生PTGS的再一证据是通过利用直接针对BrdU的单克隆抗体进行细胞的免疫荧光染色(参见实施例10，见上)以检测细胞核中的BrdU整合而获得的。符合所有标准的克隆(i)抵抗BrdU的致命作用；(ii)失去了核苷酸补救途径，和(iii)在核中没有BrdU整合-经核连缀转录分析对PTGS进行直接检测。

4.核连缀转录分析

为检测转基因RNA在NIH/3T3细胞核中的转录，用由活跃分裂的细胞中分离出的无细胞的核进行了核连缀转录分析。所述的核是依照上述实施例10中的核分离方法获得的。

依照上述实施例10中所述的核连缀转录分析方法对来自转染质粒pCMV.MTK.BGI2.KTM的转基因MTK.BGI2.KTM和内源TK基因的核RNA转录本进行分析。

5.未转化和共抑制的细胞系中的mRNA的比较

依照上述实施例10中所述的方法分析了内源TK的信使RNA和由转基因MTK.BGI2.KTM转录的RNA。

6.Southern实验

用Southern印迹实验分析各转基因NIH/3T3细胞系以确定整合及转基因的拷贝数。上述实验依照实施例10中所述的方法进行。

                         实施例18

              体外MDA-MB-468细胞中的HER-2共抑制

HER-2(也称作neu和erbB-2)编码185kDa的以低水平被组成型激活的跨膜受体酪氨酸激酶，当其过表达时表现潜在的致癌活性。HER-2蛋白过表达在约30％侵袭性人乳腺癌中出现。HER-2的生物功能并不十分清楚。其与表皮生长因子受体家族的其他成员具有共同的组织结构，并可以参与相似信号转导途径，导致细胞骨架的重组，细胞移动，蛋白酶表达和细胞粘附方面的改变。HER-2在乳腺癌细胞中的过表达导致瘤性，侵染性和转移潜力的提高(Slamon等，1987)。

1.细胞系的培养

人MDA-MB-468细胞在添加了10％ v/v FBS的RPMI 1640中培养。通过胰蛋白酶处理打散细胞，将一定比例的培养物转移到新鲜的培养基中以使细胞每周传代两次，如上述实施例10中所述。

2.遗传构建体的制备

(a)中间质粒

质粒TOPO.HER-2

用人cDNA作为模板通过PCR扩增人HER-2基因区域。所述的cDNA是从由人乳腺肿瘤细胞系SK-BR-3分离的总RNA制备的。所述的总RNA如上述实施例14所述进行纯化。人HER-2序列用下述引物扩增：

H1：CTC GAG AAG TGT GCA CCG GCA CAG ACA TG[SEQ ID NO：15]和

H3：GTC GAC TGT GTT CCA TCC TCT GCT GTC AC[SEQ ID NO：16]。

将所述的扩增产物克隆到pCR(注册商标)2. 1-TOPO中以构建中间克隆TOPO.HER-2。

(b)检测质粒

质粒pCMV.HER2.BGI2.2REH

质粒pCMV.HER2.BGI2.2REH(图19)包含被人β-珠蛋白内含子2序列的插入打断的HER-2b编码区域的倒转重复或回文结构。质粒pCMV.HER2.BGI2.2REH通过下述连续的步骤构建：(i)将来自质粒TOPO.HER2的HER-2序列以SalI/XhoI片段按有义方向亚克隆到用SalI-消化的pCMV.BGI2.cass(实施例11)以构建质粒pCMV.HER2.BGI2，和(ii)将来自质粒TOPO.HER2的HER2序列以SalI/XhoI片段按反义方向亚克隆到用XhoI-消化的pCMV.HER2.BGI2中以构建质粒pCMV.HER2.BGI2.2REH。

4.共抑制起始的确定

(a)HER-2构建体的转染

 转化在6-孔组织培养容器中进行。在每孔的2ml RPMI1640培养基，10％ v/v FBS中接种4×10⁵ MDA-MB-468细胞并在37℃ 5％ v/vCO₂下培养，直到单层细胞达60-90％铺满，典型地需要16到24hr。

接下来的步骤除了MDA-MB-468细胞与DNA脂质体复合物仅在37℃5％ v/v CO₂下培养3到4hr外，同上述实施例13，3(a)中所述。分离出36个转化细胞系进行下面的实验。

(b)MDA-MB-468细胞中的HER-2的转录后沉默

 MDA-MB-468细胞过表达HER-2，该基因在由这一细胞系衍生的由遗传霉素-选择的克隆中的PTGS首先利用直接针对HER-2蛋白细胞外结构域的鼠科动物单克隆抗体(Transduction Laboratories和NeoMarkers)作为-抗通过免疫荧光标记克隆(参见实施例10，见上)进行检测。用抗-HER-2抗体通过western印迹实验(见下)比较(i)MDA-MB-468细胞；(ii)明显表现出该基因PTGS的克隆，和(iii)对照人细胞系中的HER-2蛋白的水平。完全符合标准，即缺乏HER-2蛋白表达的克隆通过核连缀转录分析对PTGS进行直接检测。

为分析MDA-MB-468细胞和转化细胞系中HER-2的表达，细胞如实施例10中所述利用免疫荧光标记进行检测。所述的一抗是小鼠抗-erbB2单克隆抗体(Transduction Laboratories，Cat.No.E19420，一种IgG2b同种型)，以1/400稀释使用；二抗是AlexaFluor 488羊抗-鼠IgG(H+L)偶联物(Molecular Probes，Cat.No.A-11001)，以1/100稀释使用。作为阴性对照，MDA-MB-468细胞(亲本和转化系)仅用Alexa Fluor 488羊抗-鼠IgG(H+L)偶联物探测。

发现几种用pCMV.HER2.BGI2.2REH转化的MDA-MB-468细胞系免疫荧光降低，其实例如图20A，20B，20C和20D所示。

(c)FACS分析以定义Her-2表达降低的细胞系

为确定转化细胞系中HER-2的表达水平，将在6-孔板中生长的约500,000细胞用1×PBS洗两次，然后用500μl细胞离散溶液(Sigma C 5789)依制造商的建议(Sigma)分散。细胞转移到微离心管中的培养基中，经2,500rpm离心3min收集细胞。弃上清将细胞重悬于1ml 1×PBS中。

为固定，如上所述通过离心收集细胞并悬浮于50μl PBA(1×PBS，0.1％ w/v BSA组分V(痕量)和0.1％w/v叠氮化钠)，接下来添加250μl 4％ w/v低聚甲醛的1×PBS，在4℃下培养10min。为透化细胞，通过10,000rpm离心30秒收集细胞，弃上清，将细胞悬浮于50μl 0.25％ w/v皂苷(Sigma S 4521)的PBA中，于4℃下孵育10min。为封闭细胞，通过10,000rpm离心30sec收集细胞，弃上清，将细胞悬浮于50μl PBA，1％ v/v FBS，在4℃下培养10min。

为对HER-2蛋白进行定量，经固定、透化的细胞用1/100稀释的抗-erbB2单克隆抗体(Transduction Laboratories)，然后用1/100稀释的Alexa Fluor 488羊抗-鼠IgG偶联物(分子探针)探测。然后用Becton Dickinson FACSCalibur和Cellquest软件(Becton Dickinson)通过FACS分析细胞。为估计真实的背景荧光值，用均为1/100稀释的无关的一抗 (MART-1，一种IgG2b抗体(NeoMarkers))和所述的Alexa Fluor 488二抗对未染色的MDA-MB-468细胞进行标记。FACS数据的实例如图21A，21B和21C所示。对所有细胞系的分析结果汇编于表10。

表10

细胞系	平均荧光	几何平均荧光	中值荧光
				MDA-MB-468(对照1)	5.07	4.72	4.78
MDA-MB-468(对照2)	137.24	121.68	117.57
				MDA-MB-468	1224.90	1086.47	1175.74
MDA-MB-468 1.1	1167.94	1056.17	1124.04
				MDA-MB-468 1.4	781.72	664.67	673.17
MDA-MB-468 1.5	828.34	673.82	710.50
				MDA-MB-468 1.6	925.16	807.09	850.53
MDA-MB-468 1.7	870.81	749.27	791.48
				MDA-MB-468 1.8	1173.92	938.72	1124.04
MDA-MB-468 1.10	701.24	601.84	604.30
				MDA-MB-468 1.11	1103.18	980.10	1064.99
MDA-MB-468 1.12	817.39	666.61	710.50
				MDA-MB-468 2.5	966.72	862.76	905.80
MDA-MB-468 2.6	752.70	633.49	649.38
				MDA-MB-468 2.7	842.00	677.15	716.92
MDA-MB-468 2.8	986.05	792.13	881.68
				MDA-MB-468 2.9	802.36	686.06	716.92
MDA-MB-468 2.10	1061.79	944.49	1009.04
				MDA-MB-468 2.12	931.63	790.81	820.47
MDA-MB-468 2.13	894.47	792.46	827.88
				MDA-MB-468 2.15	1052.87	946.79	1009.04
MDA-MB-468 3.1	1049.88	931.96	991.05
				MDA-MB-468 3.2	897.00	802.43	842.91
MDA-MB-468 3.4	981.63	858.95	913.98
				MDA-MB-468 3.5	1072.00	930.17	982.17
MDA-MB-468 3.7	1098.95	993.26	1036.63
				MDA-MB-468 3.8	1133.86	1026.31	1074.61
MDA-MB-468 3.9	831.73	729.32	763.51
				MDA-MB-468 3.12	1120.82	998.67	1064.99
MDA-MB-468 3.13	1039.41	963.71	1036.63
				MDA-MB-468 4.5	770.93	681.01	697.83
MDA-MB-468 4.7	838.16	752.74	784.39
				MDA-MB-468 4.8	860.76	769.51	813.12
MDA-MB-468 4.10	1016.21	904.69	947.46
				MDA-MB-468 4.11	870.10	776.73	813.12
MDA-MB-468 4.12	986.93	857.20	913.98
				MDA-MB-468 4.13	790.41	712.25	743.18
MDA-MB-468 4.14	942.36	842.34	873.79
				MDA-MB-468 4.16	771.81	677.69	697.83

″MDA-MB-468对照1″是未经一抗和二抗染色的MDA-MB-468细胞。″MDA-MB-468对照2″是用无关一抗MART-1和Alexa Fluor 488二抗染色的MDA-MB-468细胞。其他的所有细胞，如上，是用抗-erbB2一抗和Alexa Fluor 488二抗染色的。

这些数据表明，用pCMV.HER2.BGI2.2REH转化的MDA-MB-468细胞中HER-2蛋白表达水平显著下降了。

4.核连缀转录分析

为检测转基因RNA在MDA-MB-468细胞核中的转录，用由活跃分裂的细胞中分离出的无细胞的核进行了核连缀转录分析。所述的核是依照上述实施例10中的核分离方法获得的。

依照上述实施例10中所述的核连缀转录分析方法对转基因HER2.BGI2. 2REH和内源HER-2基因的核RNA转录本进行分析。

5.未转化和共抑制的细胞系中的mRNA的比较

依照上述实施例10中所述的方法分析了内源HER-2基因的信使RNA和由转基因HER2.BGI2. 2REH转录的RNA。

6.Southern实验

用Southern印迹实验分析各转基因NIH/3T3细胞系以确定整合及转基因的拷贝数。上述实验依照实施例10中所述的方法进行。

7.Western印迹分析

将选择的克隆和对照MDA-MB-468细胞培养过夜至接近铺满100mmTC板(10⁷细胞)。将板中的细胞首先用含磷酸酶抑制剂的缓冲液(50mM Tris-HCl pH6.8，1mM Na₄P₂O₇，10mM NaF，20μM Na₂MoO₄，1mM Na₃VO₄)清洗，然后用已加热到100℃的600μl裂解缓冲液(50mM Tris-HCl pH 6.8，1mM Na₄P₂O₇，10mM NaF，20μM Na₂MoO₄，1mM Na₃VO₄，2％ w/v SDS)将细胞从板上刮下。将所得悬液在带盖的螺口管中于100℃下处理15min。带有裂解细胞的管于13,000rpm离心10min；将上清提取物吸出在-20℃下贮存。

在Protean装置(BioRad)中用29∶1丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺(Bio-Rad)和Tris-HCl缓冲液(分别在pH8.8和6.8)制备SDS-PAGE 10％ v/v分离胶和5％ v/v浓缩胶(0.75mm)。60μl体积的抽提物结合20μl 4x上样缓冲液(50mM Tris-HCl pH6.8，2％w/v SDS，40％ v/v甘油，溴酚蓝和400mM二硫苏糖醇，使用前添加)在100℃下加热5min，冷却后上样到孔中，用120V电压在寒冷的房间里电泳使蛋白样品进入分离胶，然后换为240V电压。依制造商提供的方法通过电印迹(Bio-Rad)将分离的蛋白转移到Hybond-ECL硝酸纤维膜(Amersham)上。

将上述膜在TBST缓冲液(10mM Tris-HCl pH8.0，150mMNaCl，0.05％ v/v Tween20)中漂洗后在含TBST的平皿中用5％w/v脱脂奶粉加磷酸酶抑制剂(1mM Na₄P₂O₇，10mM NaF，20uM Na₂MoO₄，1mM Na₃VO₄)封闭。所述的膜在小体积的TBST(含1∶4000稀释的抗HER-2的ECD的小鼠单克隆抗体(Transduction Laboratories，NeoMarkers)、2.5％w/v脱脂奶粉加磷酸酶抑制剂)中孵育。将膜在含2.5％w/v 脱脂奶粉加磷酸酶抑制剂的TBST中洗三次，10min。所述的膜在小体积的TBST(含1∶1000稀释的辣根过氧化物酶偶联的二抗、2.5％ w/v脱脂奶粉加磷酸酶抑制剂)中孵育。将膜在TBST中(含2.5％w/v 脱脂奶粉加磷酸酶抑制剂)洗三次，10min。

依制造商提供的方法用基于ECL氨基苯二酰一肼的系统(Amersham)检测HER-2蛋白的存在。将膜上探针剥离以便进行第二对照蛋白的检测，方式是将膜在100ml剥离缓冲液(62mM Tris-HClpH 6.7，2％w/v SDS，100mM新鲜配置的2-巯基乙醇)55℃下处理30min。

                          实施例19

体外MM96L黑素瘤细胞中Brn-2的共抑制

Brn-2转录因子属于一类DNA结合蛋白，称作Oct因子，其可特异性的与八聚体控制序列ATGCAAAT相互作用。所有的Oct-因子属于原本根据对序列特异性的高亲和力的DNA结合至关重要的保守区域，称作POU结构域而划分的蛋白家族。所述的POU结构域存在于三个哺乳动物转录因子，Pit-1，Oct-1和Oct-2和C.elegans中的发育控制基因unc-86中。其他的POU蛋白已在许多种中有所描述，且它们是以细胞谱系特异的方式表达的。所述的brn-2基因可能参与胚胎神经元发育途径，Brn-2蛋白出现于成人的脑中。培养的小鼠神经元和神经嵴来源的肿块的核提取物的电泳迁移率变动分析(EMSAs)已检测了许多Oct-因子蛋白。这些包括N-Oct-2，N-Oct-3，N-Oct-4和N-Oct-5。已经证实N-Oct-2，N-Oct-3和N-Oct-5在人黑素细胞、黑素瘤组织和黑素瘤细胞系(均来自神经嵴谱系)中也是差异性表达的。已知所述的bru-2基因组座位编码N-Oct-3和N-Oct-5 DNA结合活性。N-Oct-3存在于所有检测的黑素瘤细胞中，包括应用于这些实验的MM96L系。当Brn-2蛋白的表达被封闭时，N-Oct-3 DNA-结合活性消失，并产生其它下游效应，包括细胞形态的改变，黑素生成/色素沉着途径的元件表达的丧失，黑素细胞谱系的神经嵴和标记和其他标记的丧失。无Brn-2的黑素瘤细胞在免疫缺陷的小鼠中不再致肿瘤(Thomson等，1995)。

1.细胞系的培养

来自人黑素瘤的MM96L系细胞在添加了10％ v/v FBS和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640中培养以长成贴壁单层细胞，参见上述实施例10中所述方法。

2.遗传构建体的制备

(a)中间质粒

质粒TOPO.BRN-2

用人Brn-2基因组克隆由下述引物通过PCR扩增人Brn-2基因区域：

brn1：AGA TCT GAC AGA AAG AGC GAG CGA GGA GAG[SEQ IDNO：17]和

brn4：GGA TTC AGT GCG GGT CGT GGT GCG CGC CTG[SEQ IDNO：18]。

将所述扩增产物克隆到pCR(注册商标)2.1-TOPO中以构建中间克隆TOPO.BRN-2。

(d)检测质粒

质粒pCMV.BRN2.BGI2. 2NRB

质粒pCMV.BRN2.BGI2.2NRB(图22)包含被人β-珠蛋白内含子2序列的插入打断的BRN-2编码区域的倒转重复或回文结构。质粒pCMV.BRN2.BGI2.2NRB通过下述连续的步骤构建：(i)将来自质粒TOPO.BRN2的BRN2序列以BglII-到-BamHI片段按有义方向亚克隆到用BglI-消化的pCMV.BGI2.cass(实施例11)以构建质粒pCMV.BRN2.BGI2，和(ii)将来自质粒TOPO.BRN2的BRN2序列以BglII-到-BamHI片段按反义方向亚克隆到用BamgI-消化的pCMV.BRN2.BGI2中以构建质粒pCMV.BRN2.BGI2. 2NRB。

3.共抑制表型的检测

(a)Brn-2构建体转染：将表达Brn2的转基因插入到MM96L细胞中

转化在6-孔组织培养容器中进行。在每孔的2ml RPMI/640培养基，10％v/v FBS中接种1×10⁵ MM96L细胞并在37℃ 5％ v/v CO₂下培养，直到单层细胞达60-90％铺满，典型地需要16到24hr。

接下来的步骤除了MM96L细胞与DNA脂质体复合物仅在37℃ 5％v/v CO₂下培养3到4hr外，同上述实施例13，3(a)中所述。

总共筛选出36个用构建体pCMV.BRN2.BGI2.2NRB转化的细胞系用于下面的实验。

(b)在MM96L细胞中表达Brn-2的转基因的转录后沉默

来源于MM96L细胞由所述构建体稳定转染且具有Brn-2的PTGS特征的克隆，基于下述的形态改变进行筛选：即从黑素细胞所共有的明亮相，两极和多分枝细胞型到清楚且易于鉴定的低反差(LC)，圆形。由这种LC克隆衍生的细胞通过电泳迁移率变动分析(EMSA，见下)鉴定N-Oct-3活性的存在或不存在。其它的实验基于色素的消失。为确定黑色素的存在，如上述实施例14中所述，用经修饰的用于色素生物聚合体染色的Schmorl方法对LC克隆的细胞进行染色。符合所有标准，即(i)LC形态；(ii)缺乏N Oct-3 DNA结合活性，和(iii)色素沉着消失，的克隆通过核连缀转录分析直接检测其PTGS。

为分离用于进一步实验的细胞系，用上述概述中描述的技术，筛选出形态发生改变的细胞系，通过在低密度下铺亲本克隆然后挑选形态发生改变的克隆以获得这些细胞系的亚克隆(参见实施例10)。所选择的用于下述实验的亚克隆是MM96L 2.1.1和MM96L 3.19.1。

4.核连缀转录分析

为评估在MM96L细胞和转化系MM96L 2.1.1和MM96L 3.19.1中内源BRN-2基因的转录速率，用由活跃分裂的细胞中分离出的核进行了核连缀转录分析。所述的核是依照上述实施例10中的核分离方法获得的。依照上述实施例10中所述，连缀转录的转录本用生物素标记，并用链霉抗生物素蛋白捕获纯化。

为确定内源BRN-2基因在上述细胞系中的转录速率，由核连缀转录实验中分离的生物素标记的BRN-2转录本用实时PCR反应进行定量。内源BRN-2基因的相对转录速率是通过将生物素标记的BRN-2 RNA的水平与普遍表达的内源转录本，即人磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的水平相比较而确定的。

内源BRN-2和人 GAPDH基因的表达水平通过双份PCR反应确定。

5.未转化和共抑制细胞系的mRNA的比较

内源Brn-2基因的信使RNA和由转基因BRN2.BGI2. 2NRB转录的RNA用如上述实施例10中所述的方法进行了分析。

用实时PGR反应精确地估计MM96L和转化系中BRN-2mRNA的水平。这些实验的结果如表11所示。

表11

细胞系	在寡-dT纯化的总RNA中BRN-2和GAPDH mRNA的水平			BRN-2mRNA的相对水平
						Ct TYR	Ct GAPDH	ΔCt
MM96L	33.1	22.7	10.4	1.00
					MM96L 2.1.1	33.2	22.5	10.7	0.83
MM96L3.19.1	32.1	22.6	9.5	0.89

这些数据表明带有回复表型的两转化系，MM96L 2.1.1和MM96L3.19.1中的BRN-2mRNA(poly(A)RNA)水平与未转化的MM96L细胞中的BRN-2 mRNA水平没有显著的差异。

6.Southern分析

用Southern印迹实验分析各转基因MM96L细胞系以确定整合及转基因的拷贝数。上述实验依照实施例10中所述的方法进行。

7.电泳迁移率变动分析(EMSA)

为制备核和细胞质抽提物，2×10⁷细胞铺于100mmTC皿中培养过夜。收获细胞前，将TC皿置于冰上，完全吸出培养基，用冰冷的PBS将细胞洗两次。加入700μl体积的PBS，将细胞从板上刮下，将悬浮液转移到1.5ml微离心管中。将上述平板用400μl冰冷的PBS漂洗并将此加入管中。下述所有工作均在4℃下进行。将细胞悬液于2,500rpm离心5min弃上清。150μl体积的HWB溶液[10mMHEPES pH7.4，1.5mM MgCl₂，10mM KCl，蛋白酶抑制剂(Roche)，1mM原钒酸钠和磷酸酶抑制剂(含10mM NaF，15mM Na₂MoO₄和100μM Na₃VO₄)]加入沉淀物中。用移液管将细胞重悬。在此时检查细胞融胀。加入300μl体积的LB溶液[10mM HEPES pH 7.4，1.5mM MgCl₂，10mM KCl，蛋白酶抑制剂(Roche)，1mM原矾酸钠和磷酸酶抑制剂和0.1％NP-40]，细胞置于冰上5min。在此时检查细胞裂解。将上述的管2500rpm离心5min，将上清液转移到一新管中。留下包含细胞核的沉淀物。

核重悬于800μl HWB溶液中清洗，然后将上述管于2,500rpm离心5min。弃上清，将核重悬于150μl NEB溶液[20mM HEPES pH7.8，0.42M NaCl，20％v/v甘油，0.2mM EDTA，1.5mM MgCl₂，蛋白酶抑制剂，1mM原矾酸钠和磷酸酶抑制剂]中，置于冰上10min。再将所述的管于13,000rpm离心使核剩余物沉淀，去除作为核提取物的上清液。保留小份的每一核提取物以通过Bradford比色实验(Bio-Rad)确定蛋白浓度。剩余物于-70℃贮藏。保存NEB溶液用于将提取物稀释到工作浓度。

用于N-Oct-1和N-Oct-3的EMSA的双链DNA探针如下：

克隆25  GCATAATTAATGAATTAGTG      [SEQ ID NO：19]

        CGTATTAATTACTTAATCAC

Oct-WT  GAAGTATGCAAAGCATGCATCTC   [SEQ ID NO：20]

        CTTCATACGTTTCGTACGTAGAG

Oct-dpm8  GAAGTAAGGAAAGCATGCATCTC [SEQ ID NO：21]

          CTTCATTCCTTTCGTACGTAGAG

克隆25探针对Oct-1和N-Oct-3具有高亲和性。根据这一特性将所述序列从一组随机形成的双链寡核苷酸中筛选出来(Bendall等，1993)。探针Oct-WT由SV40增强子序列衍生，包含在Oct-dpm8探针中发生突变的共有八聚体结合位点(Sturm等，1987；Thomson等，1995)。

探针用[γ-³²P]-ATP标记。将所述探针稀释到1μM，将5μl与1x多核苷酸激酶(PNK)缓冲液(Roche)，2μl[γ-³²P]-ATP(10mCi/ml，3000Ci/mmol，Amersham)，1μl T4 PNK(10U/ul(Roche))(用MilliQ水调节体积到20μl)，在37℃下培养1hr。将所述的反应用TE缓冲液(参见实施例10)稀释到100μl，用TE过SephadexG25柱(Nap柱(Roche))。约4.5pmol的标记探针以0.15pmol/μl的浓度回收，于-20℃贮存。

探针和抽提物的结合反应在含12％v/v甘油，1x结合缓冲液(20mM HEPES pH7.0，140mM KCl)，13mM NaCl，5mM MgCl₂，2μl标记探针(0.04mol)，1μg蛋白抽提物，MilliQ水和需要时加入的未标记探针竞争物的10μl体积中进行。加入的顺序通常是竞争物或水，标记探针，蛋白抽提物。制备一个含有2μl PAGE上样染料而不含蛋白样品的管(参见实施例10)。

在将9μl上样于用7％丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺29∶1 Tris-甘氨酸凝胶制备的Mini-Protean装置(Bio-Rad)的孔中之前先将结合反应物于室温下孵育30min。所述的1x凝胶和1x凝胶电泳缓冲液分别自5x贮液0.75M Tris-HCl pH8.8和125mM Tris-HClpH8.3，0.96M甘氨酸，1mM EDTA pH8稀释而来。凝胶于10V/cm下电泳，在10％v/v乙酸中固定15min，转移到Whatman 3MM上，干燥然后在X-射线胶片下曝光16-48hr。

                      实施例20

体外鼠科动物B10.2型和Pam212型细胞中YB-1和p53的共抑

                        制

1.细胞系的培养

来自鼠科动物纤维肉瘤的B10.2细胞，来自鼠科动物表皮角质细胞的Pam212细胞用如上述实施例10中所述的方法在添加了5％v/vFBS的RPMI 1640或DMEM中生长成为贴壁单层细胞。

2.遗传构建体的制备

(a)中间质粒

质粒TOPO.YB-1

用25ng含小鼠YB-1 cDNA(购自Genesis Research  &Development Corporation，Auckland NZ)的质粒克隆作为底物，用下述引物通过PCR扩增小鼠YB-1基因区域：

Y1：AGA TCT GCA GCA GAC CGT AAC CAT TAT AGG[SEQ ID NO：22]和

Y4：GGA TCC ACC TTT ATT AAC AGG TGC TTG CAG[SEQ ID NO：23]。

用HotStarTaq DNA聚合酶依制造商提供的方法(Qiagen)进行PCR扩增。PCR扩增条件包括最初的激活步骤95℃15min，接下来在94℃30秒、55℃30秒、72℃60秒扩增35个循环，最后的延长步骤是在72℃ 4min。

PCR扩增的YB-1区域用柱纯化(PCR纯化柱，Qiagen)然后依制造商的建议(Invitrogen)克隆到pCR(注册商标)2. 1-TOPO中以构建质粒TOPO.YB-1。

质粒TOPO.p53

用25ng含小鼠p53cDNA(购自Genesis Research &Development Corporation，Auckland NZ)的质粒克隆作为底物用下述引物通过PCR扩增小鼠p53基因区域：

P2：AGA TCT AGA TAT CCT GCC ATC ACC TCA CTG[SEQ ID NO：24]和

P4：GGA TCC CAG GCC CCA CTT TCT TGA CCA TTG[SEQ ID NO：25]。

用HotStarTaq DNA聚合酶依制造商提供的方法(Qiagen)进行PCR扩增。PCR扩增条件包括最初的激活步骤95℃15min，接下来在94℃30秒、55℃30秒、72℃60秒扩增35个循环，最后的延长步骤是在72℃4min。

PCR扩增的p53区域用柱纯化(PCR纯化柱，Qiagen)，然后依制造商的建议(Invitrogen)克隆到pCR(注册商标)2. 1-TOPO中以构建质粒TOPO. p53。

质粒TOPO.YB1.p53

为构建融合YB-1和p53 cDNA序列的构建体，分离来自TOPO.YB-1含鼠科动物YB-1序列的BglII-到-BamHI片段，将其克隆到TOPO.p53的BamHI位点。筛选YB-1以与p53相同的有义方向插入的克隆，将其命名为TOPO.YB1.p53。

(b)检测质粒

质粒pCMV.YB1.BGI2.1BY

质粒pCMV.YB1.BGI2.1BY(图23)能够转录被人β-珠蛋白内含子2序列的插入打断的倒转重复或回文结构形式的鼠科动物YB-1基因区域。质粒pCMV.YB1.BGI2.1BY通过下述连续的步骤构建：(i)将来自质粒TOPO.YB-1的YB-1序列以BglII-到-BamHI片段按有义方向亚克隆到用BglII-消化的pCMV.BGI2以构建质粒pCMV.YB1.BGI2，和(ii)将来自质粒TOPO.YB1的YB1序列以BglII-到-BamHI片段按反义方向亚克隆到用BamHI-消化的pCMV.YB1.BGI2中以构建质粒pCMV.YB1.BGI2.1BY。

质粒pCMV.YB1.p53.BGI2.35p.1BY

质粒pCMV.YB1.p53.BGI2.35p.1BY(图24)能够表达鼠科动物YB-1和p53基因融合区域。该区域是被人β-珠蛋白内含子2序列的插入打断的倒转重复或回文结构形式。质粒pCMV.YB1.p53.BGI2.35p.1BY通过下述连续的步骤构建：(i)将来自质粒TOPO.YB1.p53的YB-1.p53融合序列以BglII-到-BamHI片段按有义方向亚克隆到用BglII-消化的pCMV.BGI2以构建质粒pCMV.YB1.p53.BGI2，和(ii)将来自质粒TOPO.YB1.p53.的YB1.p53.融合序列以BglII-到-BamHI片段按反义方向亚克隆到用BamHI-消化的pCMV.YB1.p53.BGI2中以构建质粒pCMV.YB1.p53.BGI2.35p.1BY。

3.共抑制表型的检测

(a)通过将YB-1基因插入鼠科动物纤维肉瘤B10.2细胞和鼠科动物表皮角质细胞Pam 212后YB-1的转录后基因沉默

YB-1(Y-框DNA/RNA-结合因子1)是一种转录因子，其主要结合于p53基因的启动子区域并由此抑制其表达。在以正常水平表达正常p53蛋白的癌细胞中(约占全部人癌症的50％)，p53的表达受控于YB-1，因此YB-1表达的减少导致p53蛋白水平的升高以及随后的细胞程序性死亡。鼠科动物细胞系B10.2和Pam 212是这样两个具有正常p53表达的致肿瘤细胞系。在这两个细胞系中所预望的YB-1共抑制表型就是细胞程序性死亡。

用pCMV.YB1.BGI2. 1BY进行的转化在6孔组织培养容器中进行。转染前，在每孔的2ml RPMI 1640或DMEM，5％ v/v FBS中接种3.5×10⁴细胞(B10.2或Pam 212)并在37℃ 5％ v/v CO₂下培养24hr。

用于制备转染培养基的两种混合物为：

混合物A：1.5μl L1POFECTAMINE 2000(商标)试剂(LifeTechnologies)于100μl OPTI-MEM I(注册商标)培养基(LifeTechnologies)中，于室温下温育5min；

混合物B：1μl(400ng)pCMV.YB1.BGI2.1BY DNA于100μl OPTI-MEM I(注册商标)培养基中。

预孵育过后，将混合物A添加到混合物B中混合并于室温下继续孵育20min。

覆盖每一细胞培养物的培养基用800μl新鲜培养基和200μl转染混合物替换。细胞在37℃ 5％ v/v CO₂下培养72hr。

转染两种细胞类型(B10.2和Pam 212)的双份培养物。

如实施例10中所述的方法将细胞用胰蛋白酶悬浮，离心并重悬于PBS中。

通过台盼蓝(0.2％)染色并一式四份在血细胞计数板上计数确定活的和死的细胞数。结果如图25A，252B，25C和25D(参见附图说明)。(b)通过将YB-1和p53基因共插入鼠科动物纤维肉瘤B10.2细胞和鼠科动物表皮角质细胞Pam 212后YB-1和p53的转录后基因沉默

如图25A，25B，25C和25D所示的数据表明，与共抑制的诱导相一致，在设计为诱导YB-1共抑制的YB-1构建体插入后在B10.2和Pam212细胞中死亡的细胞数增多了。负责在这些细胞中起始细胞程序性死亡应答的p53的同时共抑制，预期将消除由于细胞程序性死亡而造成的过量细胞死亡。

用pCMV.YB1.p53.BGI2.35p.1BY进行的转化在6-孔组织培养容器中进行。转染前，在每孔的2ml RPMI 1640或DMEM，5％ v/vFBS中接种3.5×10⁴细胞(B10.2或Pam 212)并在37℃ 5％ v/v CO₂下培养24hr。

用于制备转染介质的两种混合物为：

混合物A：1.5μl L1POFECTAMINE 2000(商标)试剂(LifeTechnologies)于100μl OPTI-MEM I(注册商标)培养基(LifeTeehnologies)中，于室温下温育5min；

混合物B：1μl(400ng)pCMV.YB1.p53.BGI2.35p.1BYDNA于100μl OPTI-MEMI(注册商标)培养基中。

预孵育过后，将混合物A添加到混合物B中混合并于室温下继续孵育20min。

覆盖每一细胞培养物的培养基用800μl新鲜培养基和200μl转染混合物替换。细胞在37℃ 5％ v/v CO₂下培养72hr。

如实施例10中所述的方法将细胞用胰蛋白酶悬浮，离心并重悬于PBS中。

通过台盼蓝(0.2％)染色并一式四份在血细胞计数板上计数确定活的和死的细胞数。结果如图25A，252B，25C和25D(参见附图说明)。

(c)对照：将GFP插入到鼠科动物纤维肉瘤B10.2细胞和鼠科动物表皮角质细胞Pam 212中

用pCMV.EGFP进行的转化在6-孔组织培养容器中进行。转染前，在每孔的2ml RPMI 1640或DMEM，5％ v/v FBS中接种3.5×10⁴细胞(B10.2或Pam 212)并在37℃ 5％ v/v CO₂下培养24hr。

用于制备转染介质的两种混合物为：

混合物A：1.5μl L1POFECTAMINE 2000(商标)试剂(LifeTechnologies)于100μl OPTI-MEM I(注册商标)培养基(LifeTechnologies)中，于室温下温育5min；

混合物B：1μl(400ng)pCMV.EGFP DNA于100μl OPTI-MEMI(注册商标)培养基中。

预孵育过后，将混合物A添加到混合物B中混合并于室温下继续孵育20min。

覆盖每一细胞培养物的培养基用800μl新鲜培养基和200μl转染混合物替换。细胞在37℃ 5％ v/v CO₂下培养72hr。

如实施例10中所述的方法将细胞用胰蛋白酶悬浮，离心并重悬于PBS中。

通过台盼蓝(0.2％)染色并一式四份在血细胞计数板上计数确定活的和死的细胞数。结果如图25A，252B，25C和25D(参见附图说明)。

(d)对照：通过将假Y-框寡核苷酸插入到鼠科动物纤维肉瘤B10.2细胞和鼠科动物表皮角质细胞Pam 21引起的YB-1表型弱化

所述的在B10.2和Pam 212细胞中抑制p53起始的细胞程序性死亡的YB-1的功能已通过下述两种途径对此种抑制的缓解表现出来：(i)用YB-1反义寡核苷酸转染；(ii)用相应于p53启动子Y-框序列的假寡核苷酸转染。后者用作本实施例中的阳性对照。

用假YB1和对照(非特异性的)寡核苷酸进行的转化在24孔组织培养容器中进行。转染前，在每孔的2ml RPMI 1640或DMEM，5％ v/vFBS中接种3.5×10⁴细胞(B10.2或Pam 212)并在37℃ 5％ v/v CO₂下培养24hr。

用于制备转染介质的两种混合物为：

混合物A：1.5μl Lipofectin(商标)剂试(Life Technologies)于100μl OPTI-MEM I(注册商标)培养基(Life Technologies)中，于室温下温育30min；

混合物B：0.4μl(40pmol)寡核苷酸(假YB1或对照)于100μl OPTI-MEM I(注册商标)培养基中。

预孵育过后，将混合物A添加到混合物B中混合并于室温下继续孵育15min。

制备一个无寡核苷酸的(仅有Lipofectin(商标))对照。

细胞用无血清的培养基(Optimen)洗，然后加入转染混合物。细胞在37℃ 5％ v/v CO₂下培养4hr，然后用1ml含10％ v/v FBS的RPMI替换所用的培养基，再继续培养过夜(18hr)。

如实施例10中所述的方法将细胞用胰蛋白酶悬浮，离心并重悬于PBS中。

通过台盼蓝(0.2％)染色并一式四份在血细胞计数板上计数确定活的和死的细胞数。结果如图25A，252B，25C和25D(参见附图说明)。

本领域的技术人员将理解可以对本文所述发明进行改变和修饰，而非仅仅局限于此处特定描述的那些。应当理解，本发明包括了所有这些改变和修饰。本发明还包括在上述说明书中单独或集中涉及或指明的所有步骤，特征，组分和化合物，以及上述两种或更多步骤或特征的任意或全部结合。

                     参考文献Altschul，S.F.，Madden，T.L，Schaffer，A.A.，Zhang，J.H.，Zhang，Z.，Miller，W.和Lipman，D.J.(1997)Nucl.Acids Res.25：3389.Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R，E.，Moor，D.D.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.，Struhtl，K.(eds)“Current Protocols inMolecular Biology”John Wiley&Sons Inc，1994-1998，Chapter15.Bahramian，M.B.和Zarbl，H.(1999)Mol.Cell.Biol.19：274-283.Bingham，P.M.(1997)Cell 90：385-387.Bonner和Laskey，(1974)Eur.J. Biochem.46：83.Bendall，A.J.，Sturm，R.A.，Danoy，P.A.C.和Molloy，P.L.(1993)Broad binding-site specificity and affinity properties ofoctamer 1 and brain octamer-binding proteins.European Journalof Biochemistry 217：799-811.Bennett，D.C.，Cooper，P.J.，Dexter，T.J.，Devlin，L.M.，Heasman，J.，和Nester，B.(1989)Development 105：379-385.Cogoni，C.，Irelan，J.T.，Schumacher，M.，Schmidhauser，T.J.，Selker，E.J.和Macino，G.(1996)The EMBO Journal 15：3153-3163.Cogoni，C.和Macino，G.(1997)Proceedings of the NationalAcademy of Sciences 94：10233-10238.Cormack，B.P.，Valdivia，R.H.和Falkow，S.(1996)Gene 173(1Spec.No.)：33-38.de la Luna，S.和Ortin，J.(1992)Methods in Enzymology216：376-385.Doherty，J.K.，Bond，C.，Jardim，A.，Adelman，J.P.和Clinton，G.M.(1999)Proceedings of the National Academies of Scienceof the USA 96(19)：10869-10874.Dutkiewicz，R.，Albert，D.M.和Levin，L.A.(2000)Effects oflatanoprost on tyrosine activity and mitotic index of culturedmelanoma lines. Experimental Eye Research 70：563-569.Garrick，D.，Fiering，S.，Martin，D.I.K.和Whitelaw，E.(1998)Nature Genetics 18：56-59.Koss，L.G.(1979)Diagnostic Cytology.J.B. Lippincott，Philadelphia.Lindbo，J.A.，Silva-Rosales，L.Proebsting，W.M.和Dougherty，W.G.(1993)The Plant Cell 5：1749-1759.Littlefield，J.W.(1964)Science 154：709-710.Marmur和Doty(1962)J. Mol.Biol.5：109.Napoli，C.，Lemieux，C.和Jorgensen，R.(1990)The Plant Cell2：279-289.Pal-Bhadra，M.，Bhadra，U.和Birchler，J.A.(1997)Cell90：479-490.Patrone，G.，Puppo，F.，Cusano，R.，Scarnari，M.，Ceccherini，I.，Puliti，A.和Ravazzolo，R.(2000)BioTechiques29：1012-1017.Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989). MolecularCloning-A laboratory Manual，2nd ed. Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor.Slamon，D.J.，Clark，G.M.，Wong，S.G.，Levin，W.J.，Ullrich，A.和McGuire，W.L.(1987)Science 235：77-182.Spanakis，E.，Lamina，P.，和Bennett，D.C.(1992)Development114：675-680.Sturm，R.，Baumruker，T.，Franza Jr，B.R.，Herr，W.(1987)Genes and Development 1：1147-1160.Sviderskaya，E.V.，Wakeling，W.F.，和Bennett，D.C.(1995)Development 114：1547-1557.Tearle，R.G.，Tange，M.J.，Zannettino，Z.L.，Katerelos，M.，Shinkel，T.A.，van Denderen，B.J.W.，Lonie，A.J.，Lyons，I.，Nottle，M.B，Cox，T.，Becker，C.，Peura，A.M，Wigley，P.L.，Crawford，R.J.，和d’Apice，A.J.F.(1996)Transplantation61：13-19.Thomson，J.A.F.，Murphy，K.，Baker，E.，Sutherland，Grant R.，Parsons，Peter G.和Sturm，Richard A.(1995)Oncogene11：691-700.van der Krol，A.R.，Mur，LA.，Beld，M.，Mol，J.N.和Stuitje，A.R.(1990)The Plant Cell 2：291-299.Waterhouse，P.M.，Graham，M.W.和Wang，Ming-Bo(1998)Proceedings of the National Academy of Sciences95：13959-13964.Winder，A.J.和Harris，H.(1991)New assays for the tyrosinehydroxylase and dopa oxidase activities of tyrosinase.European Journal of Biochemistry 198：317-326.

                          序列表

<110>Benitec Australia Ltd

     The State of Queensland through its Department of Primary

     Industries

<120>  遗传沉默

<130>  2392557/EJH

<140>  International

<141>  2001-03-16

<150>  AU PQ6363

<151>  2000-03-17

<150>  AU PR2700

<151>  2001-01-24

<160>  25

<170>  PatentIn version 3.0

<210>  1

<211>  29

<212>  DNA

<213>  引物

<400>  1

gagctcttca gggtgagtct atgggaccc                                          29

<210>  2

<211>  29

<212>  DNA

<213>  引物

<400> 2

ctgcaggagc tgtgggagga agataagag                                        29

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物

<400> 3

tctccttacg cgtctgtgcg gtat                                             24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物

<400> 4

atgaggacac gtaggagctt cctg                                             24

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物

<400> 5

cccggggctt agtgtaaaac aggctgagag                                       30

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物

<400> 6

cccgggcaaa tcccagtcat  ttcttagaaa                                      30

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物

<400> 7

cggcagatcc taacaatggc aggacaaatc gagtacatc                               39

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物

<400> 8

gggcggatcc ttagaaagaa tcgtaccac                                          29

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 9

gtttccagat ctctgatggc                                                    20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 10

agtccactct ggatcctagg                                                    20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 11

cacagacaga tctcttcagg                                                  20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物

<400> 12

actttagacg gatccagcac                                                  20

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物

<400> 13

agatctattt ttccacccac ggactctcgg                                       30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物

<400> 14

ggatccgcca cgaacaagga agaaactagc                                       30

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物

<400> 15

ctcgagaagt gtgcaccggc acagacatg                                       29

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 引物

<400> 16

gtcgactgtg ttccatcctc tgctgtcac                                      29

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物

<400> 17

agatctgaca gaaagagcga gcgaggagag                                     30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物

<400> 18

ggattcagtg cgggtcgtgg tgcgcgcctg                                     30

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 双链

<400> 19

gcataattaa tgaattagtg                                                20

<210>  20

<211>  23

<212>  DNA

<213>  双链

<400>  20

gaagtatgca aagcatgcat ctc                                         23

<210>  21

<211>  23

<212>  DNA

<213>  双链

<400>  21

gaagtaagga aagcatgcat ctc                                         23

<210>  22

<211>  30

<212>  DNA

<213>  引物

<400>  22

agatctgcag cagaccgtaa ccattatagg                                   30

<210>  23

<211>  30

<212>  DNA

<213>  引物

<400>  23

ggatccacct ttattaacag gtgcttgcag                                   30

<210>  24

<211>  30

<212>  DNA

<213> 引物

<400> 24

ggattcagtg cgggtcgtgg tgcgcgcctg                                          30

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 引物

<400> 25

ggatcccagg ccccactttc ttgaccattg                                          30

Claims (91)

1.遗传构建体，其含有与脊椎动物细胞基因组中靶内源核苷酸序列基本同一的核苷酸序列，其中，当将所述遗传构建体引入所述动物细胞后，由含有所述内源靶核苷酸序列的基因转录形成的RNA转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力。

2.如权利要求1所述的遗传构建体，其中，所述的脊椎动物细胞来自哺乳动物，鸟类，鱼或爬行动物。

3.如权利要求2所述的遗传构建体，其中，所述的脊椎动物细胞来自哺乳动物。

4.如权利要求3所述的遗传构建体，其中，所述的哺乳动物是人，灵长类动物，家畜动物或实验动物。

5.如权利要求4所述的遗传构建体，其中，所述的哺乳动物是鼠科动物种。

6.如权利要求4所述的遗传构建体，其中，所述的哺乳动物是人。

7.如权利要求1所述的遗传构建体，其中，该构建体还包含与所述的靶内源核苷酸序列互补的核苷酸序列。

8.如权利要求7所述的遗传构建体，其中，与所述的靶内源核苷酸序列同一和互补的核苷酸序列被内含子序列所分隔。

9.如权利要求8所述的遗传构建体，其中，所述的内含子序列是来自编码β-珠蛋白的基因的内含子。

10.如权利要求9所述的遗传构建体，其中，所述的β-珠蛋白内含子是人β-珠蛋白内含子2。

11.如权利要求1到10任一项所述的遗传构建体，其中，包含内源靶序列的所述基因的转录水平基本上没有降低。

12.如权利要求1到10中任意一项所述的遗传构建体，其中，包含所述内源靶核苷酸序列的基因所转录的RNA总水平基本上没有降低。

13.遗传构建体，其包含：

(i)与脊椎动物细胞基因组中靶内源核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列；

(ii)与(i)中定义的所述靶内源核酸序列基本上互补的单一核苷酸序列；

(ii)  将上述(i)和(ii)中所述的核苷酸序列分隔开的内含子核苷酸序列；

其中，当将所述的构建体引入所述动物细胞之后，由含有所述内源靶核苷酸序列的基因转录形成的RNA转录本表现出改变了的转录能力。

14.如权利要求13所述的遗传构建体，其中，所述的脊椎动物细胞来自哺乳动物，鸟类，鱼或爬行动物。

15.如权利要求14所述的遗传构建体，其中，所述的脊椎动物细胞来自哺乳动物。

16.如权利要求15所述的遗传构建体，其中，所述的哺乳动物是人，灵长类动物，家畜或实验动物。

17.如权利要求16所述的遗传构建体，其中，所述的哺乳动物是鼠科动物种。

18.如权利要求15所述的遗传构建体，其中，所述的哺乳动物是人。

19.如权利要求13到18中任意一项所述的遗传构建体，其中，所述包含内源靶序列的基因的转录水平基本上没有降低。

20.如权利要求13到18中任意一项所述的遗传构建体，其中，所述包含所述内源靶核苷酸序列的基因所转录的RNA总水平基本上没有降低。

21.遗传构建体，其包含：

(i)与脊椎动物细胞基因组中靶内源核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列；

(ii)与(i)中定义的所述靶内源核酸序列基本上互补的核苷酸序列；

(iii)将上述(i)和(ii)中所述的核苷酸序列分隔开的内含子核苷酸序列；

其中，当将所述的构建体引入所述的动物细胞后，由含有所述内源靶核苷酸序列的基因转录形成的RNA转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力，且包含内源靶序列的所述基因的转录水平基本上没有降低和/或包含所述内源靶核苷酸序列的所述基因所转录的RNA总水平基本上没有降低。

22.如权利要求21所述的遗传构建体，其中，所述的脊椎动物细胞来自哺乳动物，鸟类，鱼或爬行动物。

23.如权利要求22所述的遗传构建体，其中，所述的脊椎动物细胞来自哺乳动物。

24.如权利要求23所述的遗传构建体，其中，所述的哺乳动物是人，灵长类动物，家畜或实验动物。

25.如权利要求24所述的遗传构建体，其中，所述的哺乳动物是鼠科动物种。

26.如权利要求24所述的遗传构建体，其中，所述的哺乳动物是人。

27.经遗传修饰的脊椎动物细胞，其特征在于所述的细胞：

(i)包含导入所述细胞或其亲本细胞的靶内源核苷酸序列的有义拷贝；和

(ii)与未经遗传修饰的相同细胞相比，基本上没有由包含所述内源靶核苷酸序列的基因编码的蛋白产物。

28.如权利要求27所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的脊椎动物细胞来自哺乳动物，鸟类，鱼类和爬行动物。

29.如权利要求28所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的脊椎动物细胞来自哺乳动物。

30.如权利要求29所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的哺乳动物是人，灵长类，家畜或实验动物。

31.如权利要求30所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的哺乳动物是鼠科动物种。

32.如权利要求30所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的哺乳动物是人。

33.如权利要求27所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的构建体还包含与所述的靶内源核苷酸序列互补的核苷酸序列。

34.如权利要求33所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，与所述的靶内源核酸序列同一和互补的核苷酸序列被内含子序列所分隔。

35.如权利要求34所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的内含子序列是来自编码β-珠蛋白的基因的内含子。

36.如权利要求35所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的β-珠蛋白内含子是人β-珠蛋白内含子2。

37.如权利要求27到36中任意一项所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的含内源靶序列的基因的转录水平基本上没有下降。

38.如权利要求27到36中任意一项所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，由所述含所述内源靶核苷酸序列的基因所转录的RNA总水平基本上没有降低。

39.经遗传修饰的脊椎动物细胞，其特征在于所述的细胞：

(i)包含导入所述细胞或其亲本细胞的靶内源核苷酸序列的有义拷贝；

(ii)与未经遗传修饰的相同细胞相比，基本上没有由包含所述内源靶核苷酸序列的基因编码的蛋白产物；和

(iii)  与未经遗传修饰的相同细胞相比，稳定状态的总RNA的水平基本上没有降低。

40.如权利要求39所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的脊椎动物细胞来自哺乳动物，鸟类，鱼类或爬行动物。

41.如权利要求40所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的脊椎动物细胞来自哺乳动物。

42.如权利要求41所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的哺乳动物是人，灵长类，家畜或实验动物。

43.如权利要求42所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的哺乳动物是鼠科动物种。

44.如权利要求42所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的哺乳动物是人。

45.如权利要求39所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的细胞还包含与所述靶内源核苷酸序列互补的核苷酸序列。

46.如权利要求39所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，与所述的靶内源核酸序列同一和互补的核苷酸序列被内含子序列所分隔。

47.如权利要求46所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的内含子序列是来自编码β-珠蛋白的基因的内含子。

48.如权利要求47所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞，其中，所述的β-珠蛋白内含子是人β-珠蛋白内含子2。

49.改变脊椎动物细胞表型的方法，其中所述的表型是由内源基因的表达所赋予或促进的，该方法包括向所述细胞或所述细胞的亲本细胞中导入遗传构建体，其中所述的遗传构建体包含与含有所述内源基因或其部分的核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列，且与未导入所述遗传构建体的细胞相比，转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力。

50.如权利要求49所述的方法，其中，所述的脊椎动物细胞来自哺乳动物，鸟类，鱼类或爬行动物。

51.如权利要求50所述的方法，其中，所述的脊椎动物细胞来自哺乳动物。

52.如权利要求51所述的方法，其中，所述的哺乳动物是人，灵长类，家畜或实验动物。

53.如权利要求52所述的方法，其中，所述的哺乳动物是鼠科动物种。

54.如权利要求52所述的方法，其中，所述的哺乳动物是人。

55.如权利要求49所述的方法，其中，所述的构建体还包含与所述靶内源核酸序列互补的核苷酸序列。

56.如权利要求49所述的方法，其中，与所述的靶内源核苷酸序列同一和互补的核苷酸序列被内含子序列所分隔。

57.如权利要求56所述的方法，其中，所述的内含子序列是来自编码β-珠蛋白的基因的内含子。

58.如权利要求57所述的方法，其中，所述的β-珠蛋白内含子是人β-珠蛋白内含子2。

59.经遗传修饰的动物，其包含如权利要求27到38中任意一项所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞。

60.经遗传修饰的动物，其包含如权利要求39到48中任意一项所述的经遗传修饰的脊椎动物细胞。

61.经遗传修饰的鼠科动物，其包含与所述鼠科动物细胞基因组中靶内源核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列，其中，由含有所述内源靶核苷酸序列的基因转录形成的RNA转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力。

62.如权利要求61所述的经遗传修饰的鼠科动物，其中，所述的构建体还包含与所述的靶内源核酸序列互补的核苷酸序列。

63.如权利要求61所述的经遗传修饰的鼠科动物，其中，与所述的靶内源核酸序列同一和互补的核苷酸序列被内含子序列所分隔。

64.如权利要求63所述的经遗传修饰的鼠科动物，其中，所述的内含子序列是来自编码β-珠蛋白的基因的内含子。

65.如权利要求64所述的经遗传修饰的鼠科动物，其中，所述的β-珠蛋白内含子是人β-珠蛋白内含子2。

66.如权利要求61到65中任意一项所述的经遗传修饰的鼠科动物，其中，所述的含内源靶序列的基因的转录水平基本上没有下降。

67.如权利要求61到65中任意一项所述的经遗传修饰的鼠科动物，其中，由含所述内源靶核苷酸序列的所述基因所转录的RNA总水平基本上没有降低。

68.含有与脊椎动物细胞基因组中靶内源核苷酸序列基本同一的核苷酸序列的遗传构建体在产生动物细胞中的用途，其中，由含有所述内源靶核苷酸序列的基因转录形成的RNA转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力.

69.如权利要求68所述的用途，其中，所述的脊椎动物细胞来自哺乳动物，鸟类，鱼类或爬行动物。

70.如权利要求69所述的用途，其中，所述的脊椎动物细胞来自哺乳动物。

71.如权利要求70所述的用途，其中，所述的哺乳动物是人，灵长类，家畜或实验动物。

72.如权利要求71所述的用途，其中，所述的哺乳动物是鼠科动物种。

73.如权利要求71所述的用途，其中，所述的哺乳动物是人。

74.如权利要求68所述的用途，其中，所述的构建体还包含与所述的靶内源核酸序列互补的核苷酸序列。

75.如权利要求74所述的用途，其中，与所述的靶内源核酸序列同一和互补的核苷酸序列被内含子序列所分隔。

76.如权利要求75所述的用途，其中，所述的内含子序列是来自编码β-珠蛋白的基因的内含子。

77.如权利要求76所述的用途，其中，所述的β-珠蛋白内含子是人β-珠蛋白内含子2。

78.如权利要求68到77中任意一项所述的用途，其中，所述的含内源靶序列的基因的转录水平基本上没有下降。

79.如权利要求68到77中任意一项所述的用途，其中，由所述含所述靶核苷酸内源序列的基因所转录的RNA总水平基本上没有降低。

80.在脊椎动物中进行遗传治疗的方法，所述的方法包括向所述动物的细胞中引入含有与所述动物细胞基因组中的靶内源核苷酸序列基本上同一的核苷酸序列的构建体，以使得在引入所述的核苷酸序列后，由含有所述内源靶核苷酸序列的基因转录形成的RNA转录本表现出改变了的翻译成蛋白产物的能力。

81.如权利要求80所述的方法，其中，所述的脊椎动物是哺乳动物，鸟类，鱼类或爬行动物。

82.如权利要求81所述的方法，其中，所述的脊椎动物是哺乳动物。

83.如权利要求82所述的方法，其中，所述的哺乳动物是人，灵长类，家畜或实验动物。

84.如权利要求83所述的方法，其中，所述的哺乳动物是鼠科动物种。

85.如权利要求83所述的方法，其中，所述的哺乳动物是人。

86.如权利要求80所述的方法，其中，所导入的核苷酸序列还包含与所述的靶内源核苷酸序列互补的核苷酸序列。

87.如权利要求86所述的方法，其中，与所述的靶内源核苷酸序列同一和互补的核苷酸序列被内含子序列所分隔。

88.如权利要求87所述的方法，其中，所述的内含子序列是来自编码β-珠蛋白的基因的内含子。

89.如权利要求88所述的方法，其中，所述的β-珠蛋白内含子是人β-珠蛋白内含子2。

90.如权利要求80到89中任意一项所述的方法，其中，所述的含内源靶序列的基因的转录水平基本上没有下降。

91.如权利要求80到89中任意一项所述的方法，其中，由所述含所述内源靶核苷酸序列的基因所转录的RNA总水平基本上没有降低。

Images