CN1809635A

CN1809635A - 蛋白酶

Info

Publication number: CN1809635A
Application number: CNA2004800171419A
Authority: CN
Inventors: 索伦·F·拉森; 卡斯滕·肖霍姆; 彼得·R·奥斯特加德; 卡斯藤·安德森; 莫滕·费希尔
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2003-06-19
Filing date: 2004-06-21
Publication date: 2006-07-26
Also published as: PL1639105T5; CA2526974A1; WO2004111220A1; PL1639105T3; EP1639105A1; AU2004247801B2; BRPI0410797B1; US20050058747A1; JP2006527583A; CN103509776B; US7179630B2; DE602004016654D1; ES2315666T5; BRPI0410797A; DK1639105T4; DK1639105T3; ATE408682T1; CN103509776A; AU2004247801A1; EP1639105B2

Abstract

与源自Nocardiopsis的蛋白酶同源的热稳定的蛋白酶，和其由野生型在重组宿主细胞中的制备，所述重组宿主细胞包括转基因植物和非人的转基因动物。所述蛋白酶在动物饲料，尤其是鱼饲料和洗涤剂中是有效的。所述蛋白酶能够降解大豆Bowman－Birk抑制物，和其他抗营养因子，诸如大豆凝集素和Kunitz胰蛋白酶抑制物，以及分离的大豆贮存蛋白大豆球蛋白和beta－conglycinin。公开了与肽酶家族S2A或S1E的这些蛋白酶的热稳定性相关的特征的结构特点。

Description

蛋白酶

技术领域

本发明涉及分离的多肽，其具有蛋白酶活性并与Nocardiopsis蛋白酶同源，以及编码所述多肽的分离的核酸序列。本发明进一步涉及含有这些核酸序列的核酸构建体、载体和宿主细胞，所述宿主细胞包括转基因的植物和非-人动物，以及制备和具体在动物饲料，例如鱼饲料方面应用所述蛋白酶的方法。

本发明的蛋白酶是热稳定性的，并公开了与肽酶家族S2A或S1E的蛋白酶的热稳定性相关的特征的结构特点。

本发明的蛋白酶进一步有效地降解大豆Bowman-Birk抑制物，以及其他抗营养因子(anti-nutritional factor)，诸如大豆凝集素(soybean agglutinin)和Kunitz胰蛋白酶(trypsin)抑制物，以及分离的大豆贮存蛋白(soy storageprotein)，如大豆球蛋白(glycinin)和beta-conglycinin。

背景技术

来自Nocardiopsis sp.NRRL 18262和Nocardiopsis dassonvillei NRRL18133的蛋白酶在WO88/03947中公开。源自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶的DNA序列和氨基酸序列显示在DK application no.199600013中。WO 01/58276公开了酸-稳定性的蛋白酶在动物饲料中的用途，所述酸-稳定性的蛋白酶与源自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶，以及源自Nocardiopsis alba DSM 14010的蛋白酶相关。然而，这些蛋白酶不是热稳定性的。

JP 2-255081-A公开了源自Nocardiopsis sp.菌株OPC-210(FERM P-10508)的蛋白酶，然而却没有序列信息。该菌株已不能得到，因为此保藏物已经撤消。

DD 20043218公开了源自Nocardiopsis dassonvillei菌株ZIMET 43647的蛋白水解的制剂，然而却没有序列信息。看来该菌株已不能得到。

在本发明的首次申请日之后出版的JP 2003284571-A公开了源自Nocardiopsis sp.TOA-1(FERM P-18676)的蛋白酶的氨基酸序列和相应的DNA序列，该序列已经以no.ADF43564进入GENESEQP。

在已有技术中描述了热稳定性蛋白酶，例如Lao和Wilson在Appl.Environ.Microbiol.62：4256-4259(1996)中描述的来自Thermomonospora fuscaYX的蛋白酶，而且它的序列已经作为sptrembl_086984提交到公共数据库中。然而，此蛋白酶与Nocardiopsis蛋白酶不同源，因为其与本发明的蛋白酶的同一性百分数低于60％。

本发明的一个目的是提供热稳定性的蛋白酶，其与Nocardiopsis蛋白酶同源，尤其是有潜力应用于动物饲料和/或洗涤剂。

发明内容

分离并鉴定了若干热稳定性的蛋白酶，即源自 Nocardiopsis dassonvillei 亚种dassonvillei DSM 43235的蛋白酶(见SEQ ID NOs：1和2)、合成的 Protease 22(见SEQ ID NOs：7和8)、源自Nocardiopsis sp.DSM 16424的蛋白酶 L2a(见SEQ ID NOs：9和10)和源自Nocardiopsis alba DSM 15647的 Protease 8(见SEQ ID NOs：11和12)。

在第一个方面，本发明涉及分离的多肽，其具有蛋白酶活性并具有至少78℃的解链温度(T_m)，如通过差示扫描量热法(DSC)在10mM磷酸钠、50mM氯化钠缓冲液中，pH7.0，应用1.5℃/分钟的恒定扫描速率进行测定，其中所述多肽选自：(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的1-188、SEQ ID NO：8的1-196、SEQ ID NO：10的1-189和/或SEQ ID NO：12的1-188的氨基酸具有至少60％的同一性程度；(b)由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在低严谨条件下，与SEQ ID NO：1的499-1062、SEQID NO：7的577-1164、SEQ ID NO：9的586-1152和/或SEQ ID NO：11的502-1065的核苷酸杂交；和(c)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列与SEQID NO：1的499-1062、SEQ ID NO：7的577-1164、SEQ ID NO：9的586-1152和/或SEQ ID NO：11的502-1065的核苷酸中的任一个具有至少60％的同一性程度。本发明还涉及编码所述蛋白酶的分离的核酸序列；核酸构建体、载体和包含所述核酸序列的宿主细胞；以及制备和具体在动物饲料方面应用所述蛋白酶的方法。

在第二个方面，本发明涉及：

A.肽酶家族S2A和/或肽酶家族S1E的分离的多肽，其具有蛋白酶活性并具有氨基酸序列，所述氨基酸序列在所述的指定位点包含至少一个下列的氨基酸：10Y、24S、38T、42G、49T、51T、53Q、54N、82S、86Q、87S、89T、91T、92S、96A、99A、118N、120T、122R、125Q、129Y、130S、131L、135N、147F、151S、165S、166V、171Y、179I和/或186I；优选10Y、38T、82S、99A、118N、120T、122R、125Q、129Y、130S、131L、165S和/或171Y；更优选与95P、100V和/或114I中的至少一个一起；和/或与(H35+D61+S143)一起；其中每个位点对应于SEQ ID NO：2的位点；

B.B的多肽，其在所述的指定位点包含至少一个下列的氨基酸：38T、92S、120T、125Q、131L、135N、147F、151S、165S和/或171Y；

C.A的多肽，其在所述的指定位点包含至少一个下列的氨基酸：10Y、24S、42G、49T、51T、53Q、54N、82S、86Q、87S、89T、91T、96A、99A、118N、122R、129Y、130S、166V、179I和/或186I；

D.肽酶家族S2A和/或肽酶家族S1E的分离的多肽，其具有蛋白酶活性并具有氨基酸序列，所述氨基酸序列在所述的指定位点包含至少一个下列的氨基酸：25S、38T、42P、44S、49Q、54R、62S、89S、91S、92S、95A、99Q、100I、114V、120T、125Q、129Q、131L、135N、147F、151S、165S、166F、171Y、176N、179L、180S、184L和/或185T；优选25S、38T、42P、44S、54R、62S、125Q、131L、165S、171Y、176N、179L、180S、184L和/或185T；更优选与24A、51V、53E、86A、87T、96I和/或186L中至少一个一起，和/或与(H35+D61+S143)一起；其中每个位点对应于SEQ ID NO：12的位点；

E.D的多肽，其在所述的指定位点包含至少一个下列的氨基酸：38T、92S、120T、125Q，131L、135N、147F，151S、165S和/或171Y；

F.D的多肽，其在所述的指定位点包含至少一个下列的氨基酸：25S、42P、44S、49Q、54R、62S、89S、91S、95A、99Q、100I、114V、129Q、166F、176N、179L、180S、184L和/或185T；

G.A、B、C、D、E和F中任一个的多肽，其具有至少78℃的Tm，如通过差示扫描量热法(DSC)在10mM磷酸钠、50mM氯化钠，pH7.0中进行测定，和/或在pH9和80℃至少0.40的相对活性；

H.A、B、C、D、E、F和G中任一个的多肽，其与SEQ ID NO：2的氨基酸-166至188，优选1-188；SEQ ID NO：8的氨基酸-192至196，优选1-196；SEQ ID NO：10的氨基酸-195至189，优选1-189；SEQ ID NO：12的氨基酸-167至-1，优选1-188中的任一个具有至少60％的同一性百分数。

I.A、B、C、D、E、F、G和H中任一个的多肽，其为i)细菌蛋白酶；ii)放线菌门(phylum Actinobacteria)的蛋白酶；iii)放线菌纲(class Actinobacteria)；iv)放线菌目(order Actinomycetales)；v)Nocardiopsaceae科；vi)Nocardiopsis属；和/或蛋白酶，其源自vii)Nocardiopsis菌种，诸如Nocardiopsis alba、Nocardiopsis alkaliphila、Nocardiopsis antarctica、Nocardiopsis prasina、Nocardiopsis composta、Nocardiopsis exhalans、Nocardiopsis halophila、Nocardiopsis halotolerans、Nocardiopsis kunsanensis、Nocardiopsis listeri、Nocardiopsis lucentensis、Nocardiopsis metallicus、Nocardiopsissynnemataformans、Nocardiopsis trehalosi、Nocardiopsis tropica、Nocardiopsisumidischolae、Nocardiopsis xinjiangensis或Nocardiopsis dassonvillei，例如源自Nocardiopsis antartica或Nocardiopsis dassonvillei的蛋白酶，例如Nocardiopsis dassonvillei DSM 43235、Nocardiopsis sp.DSM 16424或Nocardiopsis alba DSM 15647，如具有SEQ ID NOs：2、8、10或12中任一个的成熟肽部分的氨基酸序列的多肽；

J.分离的核酸序列，包括编码A、B、C、D、E、F、G、H或I中任一个的多肽的核酸序列；

K.核酸构建体，包括可操作地与一个或多个控制序列(control sequence)连接的J的核酸序列，所述的控制序列在合适的表达宿主中指导多肽的产生；

L.重组表达载体，包括K的核酸构建体；

M.重组宿主细胞，包括K的核酸构建体或L的载体；

N.产生A、B、C、D、E、F、G、H或I中任一个的多肽的方法，所述方法包括：(a)培养M的重组宿主细胞，以产生包含所述多肽的上清；和(b)回收所述的多肽；

O.转基因的植物，或植物部分，其能够表达A、B、C、D、E、F、G、H或I中任一个的多肽；

P.转基因的非-人动物或产品或其成分，能够表达A、B、C、D、E、F、G、H或I中任一个的多肽；

Q.将至少一种在A、B、C、D、E、F、G、H或I中定义的多肽应用于(i)动物饲料；(ii)制备用于动物饲料的组合物；(iii)改善动物饲料的营养值；(iv)在动物饮食(diet)中增加可消化的和/或可溶的蛋白；(v)在动物饮食中增加蛋白水解的程度；和/或(vi)加工处理蛋白质；

R.动物饲料添加剂，包括至少一种A、B、C、D、E、F、G、H或I中的任一个所定义的多肽；和(a)至少一种脂溶性的维生素，和/或(b)至少一种水溶性的维生素，和/或(c)至少一种痕量矿物(trace mineral)；

S.动物饲料组合物，优选鱼饲料，其具有50-800g/kg的粗蛋白含量并包含至少一种A、B、C、D、E、F、G、H或I中的任一个所定义的多肽，或至少一种R的饲料添加剂；

T.一种组合物，包括至少一种A、B、C、D、E、F、G、H或I中的任一个所定义的多肽，连同至少一种其他的酶，所述其他的酶选自alpha-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、植酸酶(phytase)(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、半乳糖酶(EC 3.2.1.89)、alpha-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、蛋白酶(EC 3.4.-.-)、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)、磷脂酶C(3.1.4.3)、磷脂酶D(EC 3.1.4.4)、和/或beta-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC3.2.1.6)；以及

U.至少一种A、B、C、D、E、F、G、H或I中的任一个所定义的多肽在洗涤剂中的用途。

在第三个方面，本发明涉及：

I.具有蛋白酶活性的分离的多肽，其在37℃和pH6.5温育4小时之后，降解至少36％(优选至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或至少81％)的大豆Bowman-Birk抑制物，所述的降解百分数是用100％减去在温育后染色的SDS-PAGE(Tris-甘氨酸4-20％)凝胶上完整的Bowman-Birk抑制物条带的百分比强度进行测定的，相对所述温育之前的同样条带的强度，所述条带的强度通过扫描凝胶进行测定；其中所述多肽选自：(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的1-188、SEQ IDNO：8的1-196、SEQ ID NO：10的1-189和/或SEQ ID NO：12的1-188的氨基酸具有至少60％的同一性程度；(b)由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在低严谨条件下，与SEQ ID NO：1的499-1062、SEQ ID NO：7的577-1164、SEQ ID NO：9的586-1152和/或SEQ ID NO：11的502-1065的核苷酸中的任一个杂交；和(c)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列与SEQ IDNO：1的499-1062、SEQ ID NO：7的577-1164、SEQ ID NO：9的586-1152和/或SEQ ID NO：11的502-1065的核苷酸中的任一个具有至少60％的同一性程度；

II.I的多肽，其中所述温育在温育缓冲液中进行，所述温育缓冲液含有50mM二甲基戊二酸、150mM NaCl、1mM CaCl₂、0,0l％Triton X-100，pH6.5；

III.I或II中任一个的多肽，其中，在温育过程中，蛋白酶多肽和Bowman-Birk抑制物之间的比例为1∶10，基于A₂₈₀；

IV.I、II或III中任一个的多肽，其中所述凝胶用考马斯亮蓝(CoomassieBrilliant Blue)染色；

V.I、II、III或IV中任一个的多肽，其中所述Bowman-Birk抑制物是SigmaT-9777；

VI.I、II、III、IV或V中任一个的多肽，进一步能够降解至少一种下列纯化的大豆蛋白：大豆凝集素(Soybean agglutinin)(SBA)、Kunitz胰蛋白酶抑制物、大豆球蛋白(glycinin)和/或beta-conglycinin，应用如在I、II、III、IV或V中任一个所述的原理；

VII.VI的多肽，其将至少一种纯化的大豆蛋白降解到至少10％的程度，优选至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、92％、94％、96％或至少98％；

VIII.分离的核酸序列，包括编码I、II、III、IV、V、VI或VII中任一个的多肽的核酸序列；

IX.分离的核酸序列，包括编码多肽的核酸序列，所述多肽具有蛋白酶活性，所述多肽在37℃和pH 6.5温育4小时后降解至少36％(优选至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或至少81％)的大豆Bowman-Birk抑制物，所述的降解百分数是用100％减去在温育后染色的SDS-PAGE(Tris-甘氨酸4-20％)凝胶上完整的Bowman-Birk抑制物条带的百分比强度进行测定的，相对所述温育之前的同样条带的强度，所述条带的强度通过扫描凝胶进行测定；其中所述核酸序列(a)在低严谨条件下，与SEQ ID NO：1的499-1062、SEQ ID NO：7的577-1164、SEQ ID NO：9的586-1152和/或SEQ IDNO：11的502-1065的核苷酸中的任一个杂交；(b)与SEQ ID NO：1的499-1062、SEQ ID NO：7的577-1164、SEQ ID NO：9的586-1152和/或SEQ IDNO：11的502-1065的核苷酸中的任一个具有至少60％的同一性程度；和/或(c)编码一种多肽，所述多肽与SEQ ID NO：2的1-188、SEQ ID NO：8的1-196、SEQ ID NO：10的1-189和/或SEQ ID NO：12的1-188的氨基酸具有至少60％的同一性程度；

X.核酸构建体，包括可操作地与一个或多个控制序列连接的VIII或IX中任一个的核酸序列，所述的控制序列在合适的表达宿主中指导多肽的产生；

XI.重组表达载体，包括X的核酸构建体；

XII.重组宿主细胞，包括X的核酸构建体或XI的载体；

XIII.产生I的多肽的方法，所述方法包括：(a)培养XII的重组宿主细胞，以产生包含所述多肽的上清；和(b)回收所述的多肽；

XIII.转基因的植物，或植物部分，其能够表达I的多肽；

XIV.转基因的非-人动物或产品或其成分，其能够表达I的多肽；

XV.产生I的多肽的方法，所述方法包括(a)培养如下菌株中的任一种：(i)Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235，(ii)Nocardiopsissp.DSM 16424，或(iii)Nocardiopsis alba DSM 15647；和(b)回收所述的多肽；

XVI.将至少一种I中定义的多肽应用于(i)动物饲料；(ii)制备用于动物饲料的组合物；(iii)改善动物饲料的营养值；(iv)在动物饮食中增加可消化的和/或可溶的蛋白；(v)在动物饮食中增加蛋白水解的程度；和/或(vi)加工蛋白质；

XVII.动物饲料添加剂，包括至少一种I中定义的多肽；和(a)至少一种脂溶性的维生素，和/或(b)至少一种水溶性的维生素，和/或(c)至少一种痕量矿物；

IIXX.动物饲料组合物，其具有50-800g/kg的粗蛋白含量并包含至少一种I中定义的多肽，或至少一种XVII的饲料添加剂；

IXX.IIXX的饲料组合物，其为鱼饲料；

XX.一种组合物，包括至少一种I中所定义的多肽，连同至少一种其他的酶，所述其他的酶选自alpha-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、半乳糖酶(EC 3.2.1.89)、alpha-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蛋白酶(EC 3.4.-.-)、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)、磷脂酶C(3.1.4.3)、磷脂酶D(EC 3.1.4.4)、和/或beta-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)；以及

XXI.至少一种I中定义的多肽在洗涤剂中的用途。

在第四个方面，本发明涉及：

a.具有蛋白酶活性的分离的多肽，所述多肽选自：(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列(i)与SEQ ID NO：2的氨基酸1-188具有至少85％的同一性程度，(ii)与SEQ ID NO：8的氨基酸1-196具有至少85％的同一性程度，(iii)与SEQ ID NO：10的氨基酸1-189具有至少85％的同一性程度，和/或与SEQ ID NO：12的氨基酸1-188具有至少89％的同一性程度；(b)由核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列在中-高严谨条件下，与(i)SEQ ID NO：1的核苷酸499-1062，(ii)SEQ ID NO：7的核苷酸577-1164，(iii)SEQ ID NO：9的核苷酸586-1152，(iv)SEQ ID NO：11的核苷酸502-1065，(v)至少100个核苷酸的(i)-(iv)中任一个的子序列(subsequence)；和/或(vi)(i)-(v)中任一个的互补链杂交；(c)所述多肽的变体，其具有(i)SEQ ID NO：2的氨基酸1-188，(ii)SEQID NO：8的氨基酸1-196，(iii)SEQ ID NO：10的氨基酸1-189，或SEQ ID NO：12的氨基酸1-188的氨基酸序列，其包含取代、缺失、延伸和/或插入一个或多个氨基酸；(d)(a)、(b)或(c)的等位基因变体；和(e)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)或(d)的片段；

b.分离的核酸序列，包括核酸序列其(a)编码a的多肽；(b)编码具有蛋白酶活性的多肽，其在中-高严谨条件下与(i)SEQ ID NO：1的核苷酸499-1062，(ii)SEQ ID NO：7的核苷酸577-1164，(iii)SEQ ID NO：9的核苷酸586-1152，(iv)SEQ ID NO：11的核苷酸502-1065，(v)至少100个核苷酸的(i)-(iv)中任一个的子序列(subsequence)；和/或(vi)(i)-(v)中任一个的互补链杂交；和/或(c)编码具有蛋白酶活性的多肽，其(i)与SEQ ID NO：1的核苷酸499-1062具有至少86％的同一性程度，(ii)与SEQ ID NO：7的核苷酸577-1164具有至少86％的同一性程度，(iii)与SEQ ID NO：9的核苷酸586-1152具有至少85％的同一性程度，(iv)与SEQ ID NO：11的核苷酸502-1065具有至少89％的同一性程度；

c.分离的核酸序列，其通过(a)在中-高严谨条件下，将DNA与(i)SEQ IDNO：1的核苷酸499-1062，(ii)SEQ ID NO：7的核苷酸577-1164，(iii)SEQ IDNO：9的核苷酸586-1152，(iv)SEQ ID NO：11的核苷酸502-1065，(v)至少100个核苷酸的(i)-(iv)中任一个的子序列；和/或(vi)(i)-(v)中任一个的互补链杂交；和(b)分离所述核酸序列来制备；

d.核酸构建体，包括可操作地与一个或多个控制序列连接的b或c中任一个的核酸序列，所述的控制序列在合适的表达宿主中指导多肽的产生。

e.重组表达载体，包括d的核酸构建体。

f.重组宿主细胞，包括d的核酸构建体或e的载体。

g.产生a的多肽的方法，所述方法包括：(a)培养f的重组宿主细胞，以产生包含所述多肽的上清；和(b)回收所述的多肽。

h.转基因的植物，或植物部分，其能够表达a的多肽。

i.转基因的非-人动物或产品或其成分，其能够表达a的多肽。

j.产生a的多肽的方法，所述方法包括(a)培养如下菌株中的任一种：(i)Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235，(ii)Nocardiopsis sp.DSM 16424，或(iii)Nocardiopsis alba DSM 15647；和(b)回收所述的多肽。

k.将至少一种a中定义的多肽应用于(i)动物饲料；(ii)制备用于动物饲料的组合物；(iii)改善动物饲料的营养值；(iv)在动物饮食中增加可消化的和/或可溶的蛋白；(v)在动物饮食中增加蛋白水解的程度；和/或(vi)加工蛋白质。

l.动物饲料添加剂，包括至少一种a中定义的多肽；和(a)至少一种脂溶性的维生素，和/或(b)至少一种水溶性的维生素，和/或(c)至少一种痕量矿物。

m.动物饲料组合物，其具有50-800g/kg的粗蛋白含量并包含至少一种a中定义的多肽，或至少一种l的饲料添加剂。

n.m的饲料组合物，其为鱼饲料。

o.一种组合物，包括至少一种a中所定义的多肽，连同至少一种其他的酶，所述其他的酶选自alpha-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、半乳糖酶(EC 3.2.1.89)、alpha-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蛋白酶(EC 3.4.-.-)、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)、磷脂酶C(3.1.4.3)、磷脂酶D(EC 3.1.4.4)、和/或beta-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)；以及

p.至少一种a中定义的多肽在洗涤剂中的用途。

在第五个方面，本发明涉及：具有蛋白酶活性的分离的多肽，所述多肽选自：(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的1-188，SEQ ID NO：8的1-188，SEQ ID NO：8的1-196的氨基酸具有至少84％的同一性程度；(b)具有氨基酸序列的多肽，其与SEQ ID NO：2的-166至188，和/或SEQ ID NO：8的-192至196的氨基酸具有至少75％的同一性程度；(c)由核酸序列编码的多肽，其在中-高严谨条件下与(i)编码可从基因组DNA得到的蛋白酶的DNA，所述基因组DNA来自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235，通过应用引物SEQ ID NOs：3和4；(ii)SEQ ID NO：1的核苷酸499-1062，和/或SEQ ID NO：7的核苷酸577-1164；(iii)SEQID NO：1的核苷酸1-1062，和/或SEQ ID NO：7的核苷酸1-1164；(iv)至少100个核苷酸的(i)或(ii)或(iii)的子序列；和/或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的互补链杂交；(d)所述多肽的变体，其具有SEQ ID NO：2的氨基酸1至188或-166至188，或SEQ ID NO：8的氨基酸1至196或-192至196的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一个或多个氨基酸；(e)(a)、(b)或(c)的等位基因变体；和(f)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的片段；

具有蛋白酶活性的分离的多肽，并具有至少78℃的解链温度(T m)如通过差示扫描量热法(DSC)在10mM磷酸钠、50mM氯化钠、pH7.0中，应用1.5℃/分钟的恒定扫描速率进行测定，其中所述多肽选自：(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1-188，与SEQ ID NO：8的氨基酸1-188和/或SEQ ID NO：8的氨基酸1-196具有至少50％的同一性程度；(b)具有氨基酸序列的多肽，其与SEQ ID NO：2的氨基酸-166至188，和/或SEQ ID NO：8的氨基酸-192至196具有至少50％的同一性程度；(c)由核酸序列编码的多肽，其在低严谨条件下与编码可从基因组DNA得到的蛋白酶的DNA，所述基因组DNA来自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvilleiDSM 43235，通过应用引物SEQ ID NOs：3和4；SEQ ID NO：1的核苷酸499-1062，和/或SEQ ID NO：7的核苷酸577-1164；(iii)SEQID NO：1的核苷酸1-1062，和/或SEQ ID NO：7的核苷酸1-1164；(iv)至少100个核苷酸的(i)或(ii)或(iii)的子序列；和/或(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)的互补链杂交；(d)所述多肽的变体，其具有SEQ ID NO：2的氨基酸1至188或-166至188，或SEQ ID NO：8的氨基酸1至196或-192至196的氨基酸序列，包括取代、缺失、延伸和/或插入一个或多个氨基酸；(e)(a)、(b)或(c)的等位基因变体；和(f)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)、(d)或(e)的片段；

分离的核酸序列，其包括(a)编码权利要求1的核酸序列；(b)编码多肽，所述多肽具有蛋白酶活性，并在中-高严紧性条件下与(i)编码可从基因组DNA得到的蛋白酶的DNA，所述基因组DNA来自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235，通过应用引物SEQ ID NOs：3和4；(ii)SEQ IDNO：1的核苷酸499-1062或1-1062，和/或SEQ ID NO：7的核苷酸577-1164或1-1164；(iii)至少100个核苷酸的(i)或(ii)或(iii)的子序列；和/或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链杂交；(c)编码多肽，其具有蛋白酶活性并与SEQ ID NO：1的核苷酸499-1062，和/或SEQ ID NO：7的核苷酸577-1164具有至少85％的同一性程度；和/或(d)编码多肽，其具有蛋白酶活性并与SEQ ID NO：1的核苷酸1-1062，和/或SEQ ID NO：7的核苷酸1-1164具有至少81％的同一性程度的核酸序列；

分离的核酸序列，其包括核酸序列，所述核酸序列编码多肽，所述多肽具有蛋白酶活性并具有至少78℃的解链温度(T_m)如通过差示扫描量热法(DSC)在10mM磷酸钠、50mM氯化钠、pH7.0中，应用1.5℃/分钟的恒定扫描速率进行测定，其中所述核酸序列(a)编码上述的多肽；(b)在低严紧性条件下与：编码可从基因组DNA得到的蛋白酶的DNA，所述基因组DNA来自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235，通过应用引物SEQ ID NOs：3和4；SEQ ID NO：1的核苷酸499-1062或1-1062，和/或SEQID NO：7的核苷酸577-1164或1-1164；至少100个核苷酸的(i)或(ii)的子序列；和/或(i)、(ii)或(iii)的互补链杂交；(c)与SEQ ID NO：1的核苷酸499-1062和/或SEQ ID NO：7的核苷酸577-1164具有至少50％的同一性程度；和/或(d)与SEQ ID NO：1的核苷酸1-1062和/或SEQ ID NO：7的核苷酸1-1164具有至少50％的同一性程度；

通过(a)将DNA在中-高严紧性条件下与编码蛋白酶的DNA杂交，所述的蛋白酶可从来自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235的基因组DNA通过应用引物SEQ ID NOS.3和4得到；SEQ ID NO：1的核苷酸499-1062或1-1062，和/或SEQ ID NO：7的577-1164或1-1164；至少100个核苷酸的(i)或(ii)的子序列；或(i)、(ii)或(iii)的互补链；和(b)分离所述的核酸序列；产生分离的核酸序列

核酸构建体，包括可操作地与一个或多个控制序列连接的上述核酸序列，所述的控制序列在合适的表达宿主中指导多肽的产生。

重组表达载体，包括所述的核酸构建体。

重组宿主细胞，包括所述的核酸构建体或所述的载体。

产生上述的多肽的方法，所述方法包括：(a)培养权利要求8的重组宿主细胞，以产生包含所述多肽的上清；和(b)回收所述的多肽。

转基因的植物，或植物部分，其能够表达上述的多肽。

转基因的非-人动物或产品或其成分，其能够表达上述的多肽。

将至少一种上述的多肽应用于(i)动物饲料；(ii)制备用于动物饲料的组合物；(iii)改善动物饲料的营养值；(iv)在动物饮食中增加可消化的和/或可溶的蛋白；(v)在动物饮食中增加蛋白水解的程度；和/或(vi)加工蛋白质。

动物饲料添加剂，包括至少一种上述定义的多肽；和(a)至少一种脂溶性的维生素，和/或(b)至少一种水溶性的维生素，和/或(c)至少一种痕量矿物。

动物饲料组合物，其具有50-800g/kg的粗蛋白含量并包含至少一种上述定义的多肽，或至少一种饲料添加剂。

一种组合物，包括至少一种上述定义的多肽，连同至少一种其他的酶，所述其他的酶选自alpha-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、半乳糖酶(EC 3.2.1.89)、alpha-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、蛋白酶(EC 3.4.-.-)、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)、磷脂酶C(3.1.4.3)、磷脂酶D(EC 3.1.4.4)、和/或beta-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)；

至少一种上述定义的多肽在洗涤剂中的用途；

肽酶家族S2A和/或肽酶家族S1E的分离的多肽，其具有蛋白酶活性并具有氨基酸序列，所述的氨基酸序列在指定的位点包含至少一个下列的氨基酸：10Y、24S、38T、42G、49T、51T、53Q、54N、82S、86Q、87S、89T、91T、92S、96A、99A、118N、120T、122R、125Q、129Y、130S、131L、135N、147F、151S、165S、166V、171Y、179I和/或186I；优选10Y、38T、82S、95P、99A、100V、114I、118N、120T、122R、125Q、129Y、130S、131L、165S和/或171Y；更优选连同95P、100V和/或114I的至少一个；和/或连同(H35+D61+S143)；其中每个位点对应于SEQ ID NO：2的位点；

上述家族S2A或S1E多肽，其在指定的位点包含至少一个下列的氨基酸：38T、92S、120T、125Q、131L、135N、147F、151S、165S和/或171Y；

上述家族S2A或S1E多肽，其在指定的位点包含至少一个下列的氨基酸：10Y、24S、42G、49T、51T、53Q、54N、82S、86Q、87S、89T、91T、96A、99A、118N、122R、129Y、130S、166V、179I和/或186I；

上述家族S2A或S1E多肽，其具有至少78℃的T_m，如通过DSC在10mM磷酸钠、50mM氯化钠、pH7.0中进行测定；和/或在pH9和80℃至少0.40的相对活性；

上述家族S2A或S1E多肽，其与SEQ ID NO：2的氨基酸1-188或-166至188和/或SEQ ID NO：8的氨基酸1-196或-192至196具有至少50％的同一性百分数；

上述家族S2A或S1E多肽，其为i)细菌的蛋白酶；ii)Actinobacteria门的蛋白酶；iii)Actinobacteria纲的；iv)Actinomycetales目的v)Nocardiopsaceae科的；vi)Nocardiopsis属的；和/或蛋白酶，其源自vii)Nocardiopsis菌种，诸如Nocardiopsis alba、Nocardiopsis antarctica、Nocardiopsis prasina、Nocardiopsis composta、Nocardiopsis exhalans、Nocardiopsis halophila、Nocardiopsis halotolerans、Nocardiopsis kunsanensis、Nocardiopsis listeri、Nocardiopsis lucentensis、Nocardiopsis metallicus、Nocardiopsissynnemataformans、Nocardiopsis trehalosi、Nocardiopsis tropica、Nocardiopsisumidischolae、Nocardiopsis xinjiangensis或Nocardiopsis dassonvillei，例如源自Nocardiopsis antarcticaor或Nocardiopsis dassonvillei的蛋白酶，例如Nocardiopsis dassonvillei DSM 43235，如具有SEQ ID NO：2的氨基酸1至188或-166至188的氨基酸序列的多肽；

分离的核酸序列，包含编码上述家族S2A或S1E多肽的氨基酸序列；

核酸构建体，包括可操作地与一个或多个控制序列连接的所述核酸序列，所述的控制序列在合适的表达宿主中指导多肽的产生。

重组表达载体，包括所述的核酸构建体。

重组宿主细胞，包括所述的核酸构建体或所述的载体。

产生上述家族S2A或S1E多肽的方法，所述方法包括：(a)培养权利要求8的重组宿主细胞，以产生包含所述多肽的上清；和(b)回收所述的多肽。

转基因的植物，或植物部分，其能够表达上述家族S2A或S1E多肽。

转基因的非-人动物或产品或其成分，其能够表达上述家族S2A或S1E多肽。

将至少一种上述家族S2A或S1E多肽应用于(i)动物饲料；(ii)制备用于动物饲料的组合物；(iii)改善动物饲料的营养值；(iv)在动物饮食中增加可消化的和/或可溶的蛋白；(v)在动物饮食中增加蛋白水解的程度；和/或(vi)加工蛋白质。

动物饲料添加剂，包括至少一种上述家族S2A或S1E多肽；和(a)至少一种脂溶性的维生素，和/或(b)至少一种水溶性的维生素，和/或(c)至少一种痕量矿物。

动物饲料组合物，其具有50-800g/kg的粗蛋白含量并包含至少一种上述家族S2A或S1E多肽，或至少一种饲料添加剂。

一种组合物，包括至少一种上述家族S2A或S1E多肽，连同至少一种其他的酶，所述其他的酶选自alpha-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、半乳糖酶(EC 3.2.1.89)、alpha-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)、蛋白酶(EC 3.4.-.-)、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)、磷脂酶C(3.1.4.3)、磷脂酶D(EC 3.1.4.4)、和/或beta-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)；以及

至少一种上述家族S2A或S1E多肽在洗涤剂中的用途；

上述第二、第三、第四和第五方面是互相独立的，也是本发明的第一方面的优选的子方面，以及相互的优选的子方面。

发明详述

具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶，有时也称为肽酶(peptidases)、蛋白质酶(proteinases)、肽水解酶(peptide hydrolases)或蛋白水解酶(proteolyticenzymes)。蛋白酶可为外-类型的，其从肽的任一个末端开始水解肽；或为内-类型的，其在多肽链的内部起作用(内肽酶)。内肽酶在N和C-末端封闭的(blocked)肽底物上显示活性，所述的肽底物与所述的蛋白酶的特异性相关。

术语“蛋白酶”此处定义为水解肽键的酶。它包括属于EC 3.4酶组的任何酶(包括其第13小类的每一种)。所述EC编号指来自NC-IUBMB，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥，加利福尼亚的酶命名法1992(EnzymeNomenclature 1992)，包括补充1-5，其分别发表于Eur.J.Biochem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250，1-6和Eur.J.Biochem.1999，264，610-650中。该命名法被定期地补充和更新；参见例如环球网(World Wide Web)(WWW)，在http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。

蛋白酶根据它们的催化机理分为如下组：丝氨酸蛋白酶(Serine proteases)(S)、半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteases)(C)、天冬氨酸蛋白酶(Asparticproteases)(A)、金属蛋白酶(Metallo proteases)(M)和未知的或作为尚未分类的蛋白酶(U)，参见蛋白水解酶手册(Handbook of Proteolytic Enzymes)，A.J.Barrett，N.D.Rawlings，J.F.Woessner(编者)，Academic Press(1998)，尤其是概括介绍部分。

在具体的实施方案中，本发明的蛋白酶和根据本发明应用的蛋白酶选自：

(a)属于EC 3.4.-.-酶组的蛋白酶；

(b)属于上述手册的S组的丝氨酸蛋白酶；

(c)肽酶家族S2A的丝氨酸蛋白酶；和/或

(d)肽酶家族S1E的丝氨酸蛋白酶，如在Biochem.J.290：205-218(1993)和在MEROPS蛋白酶数据库，版本6.20，March 24，2003，(www.merops.ac.uk)中描述的。该数据库在Rawlings，N.D.，O′Brien，E.A.& Barrett，A.J.(2002)MEROPS：the protease database.Nucleic Acids Res.30，343-346中描述。

为检测一种给定的蛋白酶是否是丝氨酸蛋白酶及家族S2A蛋白酶，参考了上述手册和其中提及的原理。所有类型的蛋白酶都可以进行上述检测，无论是天然存在的或野生的蛋白酶，或是基因工程的或合成的蛋白酶。

蛋白酶活性可以应用任何测定方法进行测定，其中应用一种底物，它包含与所述蛋白酶的特异性相关的肽键。实验-pH和实验-温度同样地适合于所述的蛋白酶。实验-pH-值的实例为pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12。实验-温度的实例为30、35、37、40、45、50、55、60、65、70、80、90或95℃。

蛋白酶底物的实例为酪蛋白(casein)，如天青蛋白-交联的酪蛋白(Azurine-Crosslinked Casein)(AZCL-casein)。两种蛋白酶实验在本文的实施例2中描述，它们的任一种可以用于检测蛋白酶活性。为了实现本发明的目的，所谓的pNA实验是优选的测试方法。

本发明的蛋白酶和根据本发明应用的蛋白酶的来源没有限制。因此，该术语蛋白酶不仅包括由任何属的微生物得到的天然的或野生型的蛋白酶，而且也包括其显示蛋白酶活性的任何突变体(mutant)、变体(variant)、片段(fragment)等，以及合成的蛋白酶，如改组的(shuffled)蛋白酶和共有的(consensus)蛋白酶。上述基因工程的蛋白酶可如本技术领域所公知的进行制备，例如通过定点突变(Site-directed Mutagenesis)、通过PCR(应用包含所需突变的PCR片段作为PCR反应中的一个引物)，或通过随机突变(RandomMutagenesis)。共有的蛋白质的制备描述于，例如EP 897985。基因改组一般地描述于，例如WO 95/22625和WO 96/00343。蛋白酶基因的重组可以由亲代的具体序列通过如Ness，J.E.et al在Nature Biotechnology，Vol.20(12)，pp.1251-1255，2002中描述的合成的改组独立地完成。合成的寡核苷酸在它们的DNA序列中简并(degenerate)以提供设计亲代蛋白酶组中发现的所有氨基酸的可能性和根据所述参考文献组合的基因。可以对序列的全长进行所述的改组或者只对序列的一部分进行改组，然后再与该基因剩余的部分连接以得到全长的序列。SEQ ID NOs：2、8、10和12的成熟肽部分的蛋白酶，如蛋白酶22(SEQ ID NO：8)和源自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM43235的蛋白酶(SEQ ID NO：2)，是这些可以用于如上所述的改组的亲代蛋白酶的具体实例，如果需要，连同源自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶，以提供本发明的附加的蛋白酶。本文应用的术语“从...获得”与一个给出的来源连接，它指由核酸序列编码的多肽是通过所述来源或通过细胞产生的，在所述细胞中存在来自所述来源的核酸序列。在优选的实施方案中，所述的多肽是分泌到细胞外的。

在具体的实施方案中，所述蛋白酶是低-变应原的(low-allergenic)变体，设计成当其暴露于动物，包括人时，产生还原的(reduced)免疫反应(immunological response)。术语免疫反应被理解为暴露于所述蛋白酶的动物的免疫系统的任何反应。免疫反应的一种类型是过敏反应(allergic response)，其导致暴露的动物中的IgE水平上升。低-变应原的变体可以应用本技术领域已知的技术制备。例如，所述的蛋白酶可与聚合物部分防护部分或涉及免疫反应的蛋白酶的抗原决定部位(epitope)结合。与聚合物的结合包括聚合物与所述蛋白酶的体外化学耦合，例如在WO 96/17929、WO 98/30682、WO 98/35026和/或WO99/00489中所描述的。结合可另外或可选择地包括聚合物与所述蛋白酶的体内耦合。这样的结合可以通过编码所述蛋白酶的核苷酸序列的基因工程、插入蛋白酶中编码附加的糖基化位点的共有序列、和在能使蛋白酶糖基化的宿主中表达所述的蛋白酶实现，参见例如WO 00/26354。提供低-变应原的变体的另一种方法是编码所述蛋白酶的核苷酸序列的基因工程，以使蛋白酶产生自寡聚化(self-oligomerize)，结果蛋白酶单体可防护其他蛋白酶单体的抗原决定部位，并由此降低了所述寡聚体的抗原性。上述产物和它们的制剂例如在WO 96/16177中描述。涉及免疫反应的抗原决定部位可以通过多种方法进行鉴定，如在WO 00/26230和WO 01/83559中描述的噬菌体显示方法(phage display method)或在EP 561907中描述的随机方法(random approach)。一旦鉴定了抗原决定部位，可以改变其氨基酸序列以通过已知的基因操作方法，如定点突变(参见例如WO 00/26230、WO 00/26354和/或WO 00/22103)，使所述蛋白酶产生改变的免疫性质，和/或充分接近所述抗原决定部位可进行聚合物的结合以使聚合物防护该抗原决定部位。

本发明的任何一个方面的多肽可以包括氨基酸序列，其与SEQ ID NOs：2、8、10或12中的任一个的成熟肽部分，例如SEQ ID NO：2的氨基酸1至188和/或SEQ ID NO：8的氨基酸1至196(所述的成熟肽部分)具有例如至少大约60％的同一性程度，并且其具有蛋白酶活性(在下文称为“同源多肽”)。在具体的实施方案中，与SEQ ID NOs：2、8、10或12中任一个的任一成熟肽部分的同一性程度为至少大约62％、64％、66％，68％、70％，72％、74％、76％、80％、81％、82％、83％，84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。在替换的实施方案中，所述同一性程度为至少大约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％或至少大约59％。

在具体的实施方案中，本发明的多肽i)具有；或ii)由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列具有如上所述的任何的同一性程度。

为了实现本发明的目的，两个氨基酸序列之间的同一性程度，以及两个核苷酸序列之间的同一性程度，通过程序“比对”(align)进行确定，所述的程序“比对”为Needleman-Wunsch排列(即全局排列)。该程序用于多肽以及核苷酸序列的排列，默认的评分矩阵BLOSUM50用于多肽排列，而默认的同一性矩阵用于核苷酸排列。缺口(gap)的第一个残基的罚分对于多肽为-12，对于核苷酸为-16。缺口的更多的残基的罚分对于多肽为-2，对于核苷酸为-4。

“比对”是FASTA程序包版本v20u6的一部分(参见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，″Improved Tools for Biological Sequence Analysis″，PNAS85：2444-2448和W.R.Pearson(1990)″Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTA，″Methods in Enzymology 183：63-98)。FASTA蛋白质排列采用缺口大小上没有限制的Smith-Waterman算法(参见″Smith-Waterman algorithm″，T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)。

在具体的实施方案中，两个氨基酸序列的成熟肽部分，或预测的或预期的成熟肽部分用于排列。在替换的方案中，选择序列的一部分，其与SEQ IDNO：2和/或SEQ ID NO：8的成熟肽部分的同一性已进行过检验，所述序列的一部分根据如下描述进行的多重比对，与SEQ ID NO：2和/或8的成熟肽部分最相似，即相对应的氨基酸残基，如通过多重比对排列所鉴定的。

在本上下文中，氨基酸残基编号或分配位点序号的的基础，参照本发明的第二方面，为以A1开始以T188结束的SEQ ID NO：2。在替换的方案中，所述基础是源自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶的氨基酸1-188(如在WO 01/58276中公开的SEQ ID NO：1，优选如在WO01/58276中公开的SEQID NO：1，其中A87用T87取代)。蛋白酶可包括延伸(extension)，如与这些参比序列相比，例如SEQ ID NO：2，即在其N-末端和/或C-末端。这些延伸的氨基酸，如果有的话，如本技术领域中通常的进行编号，即对于C-末端延伸：189、190、191等，而对于N-末端延伸-1、-2、-3等。

对于与参比序列，例如SEQ ID NO：2进行比对排列的每种蛋白酶中的氨基酸残基，如上述解释的(用于确定同一性程度的目的)，可能直接且明确地在参比序列，例如SEQ ID NO：2中将氨基酸残基分配给其所对应的。相对应的残基通过参照例如SEQ ID NO：2，被分配相同的位点或编号。

对于另一种蛋白酶中的每个氨基酸残基，可以发现参比序列，例如SEQID NO：2的对应位点，如下：

其他蛋白酶的氨基酸序列记为SEQ X。发现对应于SEQ ID NO：2的位点N的位点如下：SEQ X如上所述与SEQ ID NO：2排列，从排列中，对应于SEQ ID NO：2的位点N的序列SEQ X中的位点可以应用下面描述的原理，清楚而明确地导出。

SEQ X可为所述蛋白酶的成熟部分，或者它也可以包括信号肽部分，或它可为具有蛋白酶活性的成熟蛋白酶的片段，例如与SEQ ID NO：2长度相同的片段和/或它可为当与本文所述的SEQ ID NO：2排列时从A1延伸到T188的片段。

下面插入三种排列比对，如表I、II和III。所述排列如上所述进行制备，将又一种蛋白酶的成熟部分(分别为SEQ X1、SEQ X2和SEQ X3)与SEQ IDNO：2排列。显示了每种蛋白酶的大约50个氨基酸残基。

首先看表I的排列，很清楚，例如SEQ ID NO：2的G42对应于SEQX1的P42，如这些残基在排列中互为彼此之上。它们都被分配编号42，即SEQ IDNO：2中对应的残基的编号。此排列中显然，例如，SEQ X1不包括10Y，但的确包括38T。

Table I

ADIIGGLAYY MGGRCSVGFA ATNSAGQPGF VTAGHCGTVG TGVTIGNGTG SEQ ID NO：2

ADIIGGLAYT MGGRCSVGFA ATNASGQPGF VTAGHCGTVG TPVSIGNGQG SEQ X1

10 20 30 40 50

表II和表III是在两个序列的任一个中产生缺口的排列的实例。

在表II的排列中，在SEQ X2中产生缺口。SEQ X2的突出显示的氨基酸残基P为了本发明的目的指定为P28，尽管在SEQ X中，同样的它为P25。

Table II

ADIIGGLAYY MGGRCSVGFA ATNSAGQPGF VTAGHCGTVG TGVTIGNGTG SEQ ID NO：2

ADIIGGLAYT MGGRCSVGFA ATNA---PGF VTAGHCGTVG TPVSIGNGQG SEQ X2

10 20 30 40 50

在表III的排列中，在SEQ X3中产生缺口。当在具有SEQ ID NO：2的位点编号nn和(nn+1)的氨基酸之间产生缺口时，缺口的每个位点分配一个小写字体或下标字母：a、b、c等给先前的位点编号，即nn。因此，缺口的每个位点编号为nna、nnb等。SEQ X3的突出显示的氨基酸残基R，为了本发明的目的指定为R33a，尽管在SEQ X3中，同样的它为R 34。

Table III

ADIIGGLAYY MGGRCSVGFA ATNSAGQPGF VTA--GHCGT VGTGVTIGNGTG SEQ ID NO：2

ADIIGGLAYT MGGRCSVGFA ATNASGQPGF VTA RSGHCGT VGTPVSIGNGQG SEQ X3

10 20 30 40 50

在本发明的任一个方面的又一具体的实施方案中，本发明的多肽具有至少75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃或至少95℃的解链温度(T_m)，如通过差示扫描量热法(DSC)进行测定。

DSC在10mM磷酸钠、50mM氯化钠缓冲液，pH7.0中进行测定。

扫描速率是恒定的，例如1.5℃/分钟。

扫描间隔可为20-100℃。

T_m没有上限，然而，目前预期的T_m可低于150℃、145℃、140℃、135℃、130℃、125℃、120℃、115℃、110℃、105℃或低于100℃。

在替换的实施方案中，选择另一种缓冲液用于扫描，例如pH5.0、5.5、6.0或pH6.5的缓冲液。

在又一个替换的实施方案中，可以采用更快或更慢的扫描速率，例如更慢的扫描速率1.4℃/min、1.3℃/min、1.2℃/min、1.1℃/min、1.0℃/min或0.9℃/min。

有关扫描步骤的进一步的细节参照实施例2。

在具体的实施方案中，本发明的蛋白酶如源自Nocardiopsis sp.NRRL18262的蛋白酶相比，显示出修正的温度活性曲线(amended temperatureactivity profile)。例如，本发明的蛋白酶可在pH 9和80℃显示至少0.40，优选至少0.45、0.50、0.55、0.60、0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90或至少0.95的相对活性，术语“相对”指所述蛋白酶测定的最高活性。对于蛋白酶22、L2a蛋白酶以及对于源自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM43235的蛋白酶，所述的活性是相对于被设为1.000(100％)的80℃的活性，而对于蛋白酶8和源自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶，70℃的活性被设为1.000(100％)，参见实施例2、7、8和9。作为另外的实施例，本发明的蛋白酶在pH9和90℃显示至少0.10，优选至少0.15、0.20、0.25、0.30或至少0.35的相对活性。在具体的实施方案中，所述的蛋白酶活性采用实施例2的Protazyme AK assay进行测定。

筛选有关本发明的SEQ ID NOs：2、8、10或12的热稳定性的蛋白酶可如下进行：用引物例如SEQ ID NOs：3或4的任一个，或优选地用SEQ ID NOs：1、7、9或11中任一个的成熟肽编码部分筛选DNA文库；在合适的菌株，例如芽孢杆菌(Bacillus)或大肠杆菌(E.coli)中表达杂交的克隆。在下一步中，优选在微-纯化过程中(参见例如WO 03/037914)，纯化与SEQ ID NOs：2、8、10和/或12的任一个相关的表达的蛋白酶，并通过应用以所述酶的强抑制物的活性位点滴定(AST)的熟知的原理，确定每个选择物的活性蛋白酶的量。在后续步骤中，然后将已知量的所述酶在所需的高温，例如85℃温育所需的时间，例如2小时；并确定残余的蛋白酶活性，例如通过应用本文中描述的任一种蛋白酶实验，例如实施例2的Protazyme AK assay。所述步骤的主要部分可为自动化的，并如果需要在机器人(robot)的帮助下进行。确认热稳定性例如通过纯化蛋白酶，和通过如在本文的实验部分描述的DSC确定T_m来完成。

本发明也涉及本发明的多肽用作动物饲料。

两个氨基酸序列之间的同一性程度，也可通过Clustal方法(Higgins，1989，CABIOS 5：151-153)应用LASERGENE^TM MEGALIGN^TM软件(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)及同一性表和如下的多重排列参数进行确定：缺口罚分10和缺口长度罚分10。成对排列参数为Ktuple＝1，缺口罚分＝3，窗口(window)＝5和对角线(diagnal)＝5。两个核苷酸序列之间的同一性程度可应用同样的算法和上述的软件包，以如下的设置进行确定：缺口罚分10和缺口长度罚分10。成对排列参数为Ktuple＝3，缺口罚分＝3，窗口＝20。

在具体的实施方案中，所述同源多肽具有氨基酸序列，所述的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1至188或SEQID NO：2的氨基酸-166至188，或者SEQ ID NO：8的氨基酸1至196或SEQ ID NO：8的氨基酸-192至196的差异

(i)不超过75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、62、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21或不超过20个氨基酸；

(ii)不超过20、19、18、17、16、15、14、13、12或不超过11个氨基酸；

(iii)不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；

(iv)10或为9个，或为8个，或为7个，或为6个，或为5个氨基酸；或

(v)4，或为3个，或为2个氨基酸，或为1个氨基酸。

在具体的实施方案中，本发明的多肽包括SEQ ID NOs：2、8、10或12中任一个成熟肽部分的氨基酸序列，或其等位基因的变体；或其具有蛋白酶活性的片段。

在另一个优选的实施方案中，本发明的多肽由SEQ ID NOs：2、8、10或12中任一个的成熟肽部分，或其等位基因的变体；或其具有蛋白酶活性的片段组成。

SEQ ID NOs：2、8、10或12的任一个的成熟肽部分的片段，是具有一个或多个氨基酸的多肽，所述氨基酸是从这些氨基酸序列的氨基和/或羧基末端删除的。在一个实施方案中，片段含有至少75个氨基酸残基，或至少100个氨基酸残基，或至少125个氨基酸残基，或至少150个氨基酸残基，或至少160个氨基酸残基，或至少165个氨基酸残基，或至少170个氨基酸残基，或至少175个氨基酸残基。

等位基因变体表示占据相同染色体位点(chromosomal locus)的基因的任何两种或多种替换形式。等位基因变异通过突变自然地出现，并可导致种群内的多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽中没有变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是通过基因的等位基因变体编码的多肽。

本发明也涉及具有蛋白酶活性的分离的多肽，其由核酸序列编码，所述核酸序列在非常低，或低，或中，或中-高，或高，或非常高的严紧性条件下与核酸探针杂交，所述核酸探针在同样条件下与(a)SEQ ID NO：1的核苷酸499-1062、SEQ ID NO：7的核苷酸577-1164、SEQ ID NO：9的核苷酸586-1152和/或SEQ ID NO：11的核苷酸502-1065；(b)(a)的子序列，或(c)(a)或(b)的互补链杂交(J.Sambrook，E.F.Fritsch，和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，2nd edition，Cold Spring Harbor，New York)。在一个具体的实施方案中，所述的核酸探针选自上述(a)、(b)或(c)的核酸序列。(a)的核苷酸对应于成熟肽编码部分。

(a)中提及的核苷酸的子序列可为至少100个核苷酸，或在另一个实施方案中至少200个核苷酸。而且，所述的子序列可编码具有蛋白酶活性的多肽片段。

上述(a)或(b)的核酸序列，以及相对应的SEQ ID NOs：2、8、10或12的成熟的氨基酸序列或其部分，可用于根据本技术领域中熟知的方法，设计核酸探针以鉴定和克隆DNA，所述DNA编码来自不同属或种的菌株的具有蛋白酶活性的多肽。具体地，上述探针可用于与目标属或种的基因组DNA或cDNA杂交，然后是标准的Southern印迹步骤，以在其中鉴定并分离对应的基因。上述探针可显著地短于全长，但其长度应该至少为15个，优选至少25个并更优选至少35个核苷酸。较长的探针也可以应用。DNA探针和RNA探针都可以采用。所述探针通常被标记用于检测对应的基因(例如，用³²P、³H、³⁵S、生物素或抗生物素蛋白标记)。上述探针包含在本发明之内。

因此，由上述其他生物体制备的基因组DNA或cDNA文库可用于筛选DNA，所述DNA与上述探针杂交并编码具有蛋白酶活性的多肽。来自上述其他生物体的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳，或其他分离方法进行分离。来自所述文库的DNA或所述分离的DNA可被转移到并固定在硝化纤维素(nitrocellulose)或其他合适的载体(carrier)材料上。为了鉴定与SEQ ID NOs：1、7、9或11或其子序列同源的克隆或DNA，将所述载体材料用于Southern印迹。为了实现本发明的目的，杂交显示出，所述的核酸序列在非常低至非常高的严紧性条件下，与标记的对应于(a)、(b)或(c)的序列的上述核酸探针杂交。在这些条件下所述核酸探针杂交的分子应用X-光胶片(X-ray film)检测。

在具体的实施方案中，所述的核酸探针是核酸序列，其编码SEQ ID NO：2的氨基酸1至188，SEQ ID NO：8的氨基酸1至196，SEQ ID NO：10的氨基酸1至189和/或SEQ ID NO：12的氨基酸1至188，或其子序列。在另一个实施方案中，所述的核酸探针是SEQ ID NO：1的核苷酸499-1062，SEQ IDNO：7的核苷酸577-1164，SEQ ID NO：9的核苷酸586-1152和/或SEQ ID NO：11的核苷酸502-1065(成熟多肽编码区)。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，非常低至非常高的严紧性条件定义为在42℃，在5×SSPE，0.3％SDS，200μg/ml剪切的(sheared)和变性的(denatured)鲑精DNA中，及对于非常低和低严紧性25％的甲酰胺，对于中和中-高严紧性35％的甲酰胺，或对于高和非常高严紧性50％的甲酰胺，进行预杂交(prehybridization)和杂交，然后是标准的Southern印迹步骤。

对于长度至少100个核苷酸的长探针，所述的载体材料最终用0.2×SSC，0.2％SDS，20％甲酰胺，优选至少在45℃(非常低严紧性)，更优选至少在50℃(低严紧性)，更优选至少在55℃(中严紧性)，更优选至少在60℃(中-高严紧性)，甚至更优选至少在65℃(高严紧性)，并最优选至少在70℃(非常高严紧性)洗涤三次，每次15分钟。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，严紧性条件定义为在比用Bolton和McCarthy计算(1962，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 48：1390)得出的T_m低5℃至10℃，在0.9M NaCl，0.09M Tris-HCl pH7.6，6mM EDTA，0.5％NP-40，1×登哈特溶液(Denhardt′ssolution)，1mM焦磷酸钠(sodium pyrophosphate)，1mM磷酸二氢钾(sodiummonobasic phosphate)，0.1mM ATP和0.2mg每ml的酵母RNA中，进行预杂交、杂交和杂交后洗涤，然后是标准的Southern印迹步骤。

对于长度大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针，所述载体材料在6×SSC加0.1％SDS中洗涤一次15分钟，并用6×SSC在低于计算的T_m5℃至10℃洗涤两次，每次15分钟。

本发明也涉及多肽的变体，所述多肽具有SEQ ID NO：2的氨基酸1至188，SEQ ID NO：8的氨基酸1至196，SEQ ID NO：10的氨基酸1至189和/或SEQ ID NO：12的氨基酸1至188的氨基酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸。

变体多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：2的氨基酸1至188，SEQ ID NO：8的氨基酸1至196，SEQ ID NO：10的氨基酸1至189和/或SEQ ID NO：12的氨基酸1至188的差异，为一个或多个氨基酸残基的插入或缺失和/或用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基。在具体的实施方案中，氨基酸改变较少是天然的，其为保守的氨基酸取代，所述氨基酸取代不显著地影响蛋白的折叠和/或蛋白的活性；小缺失，通常为1个至大约30个氨基酸；小氨基-或羧基-末端延伸，如氨基-末端甲硫氨酸(methionine)残基；多至大约20-25个残基的小肽；或小延伸，其通过改变净电荷或其他功能，如聚-组氨酸域(poly-histidine tract)、抗原的抗原决定部位(antigenic epitope)或结合域(binding domain)来促进纯化。

保守取代的实例在碱性氨基酸组(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)，酸性氨基酸组(谷氨酸和天冬氨酸)，极性氨基酸组(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸组(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)，芳香氨基酸组(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)，和小氨基酸组(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)之内。因此，例如，本发明涉及多肽，其具有或包括如在SEQ ID NOs：2、8、10或12中任一个的成熟肽部分中所列出的序列，其中保守的氨基酸取代包括，在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)中，在酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)中，在极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)中、在疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)中，在芳香氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)中，和在小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)中，或其任何组合或其活性片段中用一个替换为另一个。通常不改变比活性(specific activity)的氨基酸取代是本技术领域内所公知的，并例如由H.Neurath和R.L.Hill，1979在The Proteins，Academic Press，New York中描述。最通常出现的变化是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly以及将它们反过来。

在具体的实施方案中，本发明的多肽和本发明应用的多肽是酸-稳定性的。为了实现本发明的目的，术语酸-稳定性的指在pH2.0、pH2.5或pH3.0和37℃温育2小时之后的残余活性为至少50％，与在pH9.0和5℃温育2小时的对应的样品的残余活性相比。在具体的实施方案中，所述的残余活性至少为60％、70％、80％或至少90％。确定酸-稳定性的合适的实验方法是实施例2的pH-稳定性实验方法。

在另一个具体的实施方案中，本发明的多肽和本发明应用的多肽在pH7.0具有至少0.10、0.15、0.20、0.25、0.30或至少0.35的相对活性。实施例2的pH-曲线实验用于上述测定。

在又一种具体的实施方案中，本发明的多肽和本发明应用的多肽1)在60℃和pH9具有至少0.05、0.10、0.15或至少0.19的相对活性；和/或ii)在70℃具有至少0.40、0.50或至少0.60的相对活性。实施例2的温度-曲线实验用于这些测定。

本发明的多肽和本发明应用的多肽可为细菌的和真菌的多肽。所述真菌的多肽可源自丝状真菌或来自酵母。

在具体的实施方案中，本发明的多肽为i)细菌的蛋白酶；ii)放线菌门(phylum Actinobacteria)的蛋白酶；iii)放线菌纲的(class Actinobacteria)；iv)放线菌目的(order Actinomycetales)；v)Nocardiopsaceae科的；vi)Nocardiopsis属的；和/或蛋白酶，其源自vii)Nocardiopsis菌种，诸如Nocardiopsis alba、Nocardiopsis alkaliphila、Nocardiopsis antarctica、Nocardiopsis prasina、Nocardiopsis composta、Nocardiopsis exhalans、Nocardiopsis halophila、Nocardiopsis halotolerans、Nocardiopsis kunsanensis、Nocardiopsis listeri、Nocardiopsis lucentensis、Nocardiopsis metallicus、Nocardiopsissynnemataformans、Nocardiopsis trehalosi、Nocardiopsis tropica、Nocardiopsisumidischolae、Nocardiopsis xinjiangensis或Nocardiopsis dassonvillei，例如Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235、Nocardiopsis sp.DSM16424，或Nocardiopsis alba DSM 15647；如SEQ ID NOs：2、8、10和12中任一个成熟氨基酸序列的多肽。在具体的实施方案中，所述的蛋白酶源自Nocardiopsis alba、Nocardiopsis antartica或Nocardiopsis dassonvillei。

上述分类法的根据是在Bergey′s Manual of Systematic Bacteriology，2001，second edition，volume l，David R.Bone，Richard W.Castenholz中的章节，G.M.Garrity和J.G.Holt的手册路线图(The road map to the Manual)。

当然，对应上述提到的菌种，本发明包括了完全状态(perfect state)和不完全状态(imperfect state)，和其他分类学的相等物，例如无性型(anamorphs)，而不考虑它们公知的种名。本领域的技术人员可容易地辨别适当的相等物的同一性。

这些菌种的菌株在若干菌种保藏中心容易地被公众获得，所述菌种保藏中心如美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC)、DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，CentraalbureauVoor Schimmelcultures(CBS)和Agricultural Research Service Patent CultureCollection，Northern Regional Research Center(NRRL)。

此外，上述多肽可由其他来源鉴定和获得，所述其他来源包括从自然(例如土壤、堆肥(compost)、水等)中应用上述的探针分离到的微生物。从天然生境(natural habitat)分离微生物的方法是本技术领域熟知的。然后所述的核酸序列可类似地通过筛选另一种微生物的基因组DNA或cDNA获得。一旦用所述的探针检测到编码多肽的核酸序列，所述的序列可通过应用本领域的普通技术人员所公知的方法进行分离或克隆(参见，例如，Sambrook et a1.，1989，见前文)。

如本文定义的，“分离的”多肽是基本不含有其他多肽的多肽，例如，至少大约20％纯度，优选至少大约40％纯度，更优选大约60％纯度，还更优选大约80％纯度，最优选大约90％纯度，和还最优选大约95％纯度，如通过SDS-PAGE测定的。

由本发明的核酸序列编码的多肽也包括融合的多肽(fused polypeptide)或可切割的(cleavable)融合多肽，其中另一种多肽融合于多肽或其片段的N-末端或C-末端。融合的多肽通过将编码另一种多肽的核酸序列(或其部分)与本发明的核酸序列(或其部分)进行融合而产生。产生融合多肽的方法是本技术领域所公知的，例如PCR或连接编码所述多肽的编码序列，所以它们在框(frame)内，而且融合多肽的表达受到同样的启动子和终止子的控制。

在又一个具体的实施方案中，本发明排除一种或几种蛋白酶，其源自(i)Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133，它已经在WO 88/03947中公开；(ii)Nocardiopsis sp.菌株OPC-210(FERM P-10508)，它已经在JP 2-255081-A中公开；(iii)菌种Nocardiopsis dassonvillei的菌株ZIMET 43647，它已经在DD20043218中公开；(iv)Nocardiopsis sp.TOA-1(FERM-P-18676)，它已经在JP 2003284571中公开；和/或(v)相对应的DNA。

核酸序列

本发明也涉及分离的核酸序列，其编码本发明的多肽。本发明的具体的核酸序列为SEQID NO：1的核苷酸499-1062、SEQ ID NO：7的核苷酸577-1164、SEQ ID NO：9的核苷酸586-1152和/或SEQ ID NO：11的核苷酸502-1065；分别对应于SEQ ID NOs：2、8、10和12的成熟多肽编码区域。本发明也包括编码多肽的核酸序列，所述多肽具有SEQ ID NOs：2、8、10和12中任一个的成熟肽部分的氨基酸序列，但所述的核酸序列分别与SEQ ID NOs：1、7、9和11的对应部分通过遗传密码简并性(degeneracy)的优点相区别。本发明也涉及SEQ ID NOs：1、7、9和11的子序列，其分别编码具有蛋白酶活性的SEQ ID NOs：2、8、10和12的片段。

SEQ ID NOs：1、7、9和11的子序列，是分别被SEQ ID NOs：1、7、9和11包含的核酸序列，除了来自5′和/或3′末端的一个或多个核苷酸已经被缺失。优选地，子序列包含至少225个核苷酸，更优选至少300个核苷酸，还更优选至少375、450、500、531、600、700、800、900或1000个核苷酸。

本发明也涉及核苷酸序列，所述核苷酸序列与SEQ ID NO：1的核苷酸499-1062、SEQ ID NO：7的核苷酸577-1164、SEQ ID NO：9的核苷酸586-1152和/或SEQ ID NO：11的核苷酸502-1065具有至少60％的同一性程度。在具体的实施方案中，与这些核苷酸中任一个的同一性程度为至少62％、64％、66％、68％、70％、72％、74％、76％、78％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。

本发明也涉及突变体核酸序列，其在SEQ ID NOs：1、7、9或11中任一个的成熟肽编码部分包括至少一个突变，其中所述的突变体核酸序列编码多肽，所述多肽(i)分别由SEQ ID NOs：2、8、10和12中任一个的成熟肽部分组成，或(ii)是任何(i)的序列的变体，其中所述的变体包括一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入，或(iii)是任何(i)的序列的等位基因变体，或(iv)是任何(i)的序列的片段。

用于分离或克隆编码多肽的核酸序列的方法是本技术领域公知的，并包括从基因组DNA分离、从cDNA制备或其组合。从上述基因组DNA克隆本发明的核酸序列可例如，通过应用公知的聚合酶链式反应(polymerase chainreaction)(PCR)或抗体筛选表达文库(antibody screening of expression libraries)以应用共享的结构特点检测克隆的DNA片段实施。参见，例如Innis et al.，1990，PCR：A Guide to Methods and Application，Academic Press，New York。可以应用其他核酸扩增方法，诸如连接酶链式反应(ligase chain reaction)(LCR)、连接的活化转录(ligated activated transcription)(LAT)和基于核酸序列的扩增(nucleic acid-based amplification)(NASBA)。可从Nocardiopsis或另一种或相关的生物体的菌株克隆所述的核酸序列，而由此，例如，所述的核酸序列可为所述核酸序列的多肽编码区的等位基因变体或菌种变体。

如本文应用的术语“分离的核酸序列”指基本上无其他核酸序列的核酸序列，例如，至少大约20％纯度，优选至少大约40％纯度，更优选大约60％纯度，还更优选大约80％纯度，最优选大约90％纯度，如通过琼脂糖电泳测定的。例如，分离的核酸序列可以通过用于基因工程的标准的克隆方法获得，以重新定位(relocate)所述的核酸序列，从其天然的位点移至不同的位点而得到复制。所述的克隆方法可包括切除和分离所需的核酸片段，所述核酸片段包括编码所述多肽的核酸序列，将所述片段插入载体分子，和将重组的载体整合入宿主细胞，其中所述核酸序列的多个拷贝或多个克隆将得到复制。所述核酸序列可以是基因组的、cDNA、RNA、半合成的、合成的来源，或其任意组合。

修饰编码本发明的多肽的核酸序列，可为合成基本类似于所述多肽的多肽所必需的。术语“基本类似”(substantially similar)于所述的多肽指所述多肽的非-天然存在的形式。这些多肽可以以一些工程的方法与从其天然来源分离的多肽相区别，例如，在比活性、热稳定性、最适pH、变应原性等不同的变体。所述的变体序列可在核酸序列的基础上构建，所述的核酸序列如SEQID NOs：1、7、9和/或11的多肽编码部分所显示的，例如其子序列，和/或通过导入核苷酸取代，所述的核苷酸取代不产生由所述核酸序列编码的多肽的另一个氨基酸序列，但其对应于用于产生所述蛋白酶的宿主生物体的密码子使用，或通过导入可产生不同氨基酸序列的核苷酸取代。对于核苷酸取代的一般性描述，参见，例如，Ford et al.，1991，Protein Expression and Purification2：95-107。低-变应原性的多肽可例如，如上所述进行制备。

明显地，对于那些本领域的技术人员，上述取代可以在分子功能的关键区域之外进行，并仍产生活性的多肽。可根据本领域公知的方法，诸如定点突变(site-directed mutagenesis)或丙氨酸-扫描突变(alanine-scanningmutagenesis)，鉴定多肽的活性所必需的氨基酸残基，所述的氨基酸残基由本发明的分离的核酸序列编码，并由此优选不经过取代(参见，例如，Cunningham和Wells，1989，Science 244：1081-1085)。在后面的方法中，在分子每一个带正电荷的残基中引入突变，并测定得到的突变体分子的蛋白酶活性，以鉴定对于分子的活性关键的氨基酸残基。

底物-蛋白酶相互作用的位点也可以通过分析三维结构进行测定，如通过诸如核磁共振分析(nuclear magnetic resonance analysis)、结晶学(crystallography)、或光亲和标记(photoaffinity labelling)的方法进行测定(参见，例如，de Vos et al.，1992，Science 255：306-312；Smith et al.，1992，Journal ofMolecular Biology 224：899-904；Wlodaver et al.，1992，FEBS Letters 309：59-64)。

本发明也涉及编码本发明的多肽的分离的核酸序列，其在非常低的严紧性条件下，优选低严紧性条件，更优选中严紧性条件，更优选中-高严紧性条件，还更优选高严紧性条件，并最优选非常高严紧性条件下与核酸探针杂交，所述的核酸探针在同样的条件下与所述核酸序列，优选SEQ ID NOs：1、7、9或11中任一个的成熟肽编码部分，或它们的互补链；或其等位基因变体和其子序列杂交(Sambrook et al.，1989，见前文)，如本文所定义的。

本发明也涉及分离的核酸序列，其通过(a)在非常低、低、中、中-高、高或非常高的严紧性条件下将DNA与(i)SEQ ID NO：1的核苷酸499-1062、SEQID NO：7的核苷酸577-1164、SEQ ID NO：9的核苷酸586-1152和/或SEQID NO：11的核苷酸502-1065，(ii)(i)的子序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；和(b)分离所述的核酸序列产生。所述的子序列优选为至少100个核苷酸的序列，如编码具有蛋白酶活性的多肽片段的序列。

产生突变体核酸序列的方法

本发明进一步涉及产生突变体核酸序列的方法，其包括将至少一个突变引入SEQ ID NOs：1、7、9或11中任一个的成熟多肽编码序列，或其子序列，其中所述的突变体核酸序列编码多肽，所述多肽分别由SEQ ID NOs：2、8、10或12中的任一个的成熟肽，或其具有蛋白酶活性的片段构成。

将突变引入所述核酸序列以用一个核苷酸交换另一个核苷酸，可以通过定点突变，应用任何本领域公知的方法实现。尤其有用的是应用超螺旋的(supercoiled)双链的DNA载体及目标插入体，和两个含有所需突变的合成引物的方法。所述的寡核苷酸引物，每一个与所述载体的相反链互补，在温度循环的过程中通过Pfu DNA聚合酶延伸。在引物结合的过程中，产生含有交错切口(staggered nick)的突变的质粒。温度循环之后，将所述产物用对甲基化的和半甲基化的DNA有特异性的DpnI处理，以消化亲代DNA模板，并选择含有突变的合成的DNA。也可以应用本领域中公知的其他方法。

核酸构建体

本发明也涉及核酸构建体，包括可操作地与一个或多个控制序列连接的本发明的核酸序列，所述的控制序列在合适的表达宿主细胞中，在与控制序列相适合的条件下指导编码序列的表达。表达可理解为包括任何与产生多肽有关的步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰(posttranscriptionalmodification)、翻译、翻译后修饰(post-translational modification)和分泌。

“核酸构建体”在本文中定义为单链或双链的核酸分子，其分离自天然产生的基因，或其已被修饰以含有以自然中不存在的方式组合的和并列的核酸的区段。当所述的核酸构建体含有表达本发明的编码序列所需的所有控制序列时，术语核酸构建体与术语表达盒是同义的。术语“编码序列”在本文中定义为核酸序列，其直接地指明其蛋白产物的氨基酸序列。编码序列的边界通常由核糖体结合位点(ribosome binding site)(原核生物)或由恰位于mRNA的5’末端的开放阅读框的上游的ATG起始密码子(真核生物)和恰位于mRNA的3’末端的开放阅读框的下游的转录终止子序列进行确定。编码序列可以包括，但不限于DNA、cDNA和重组的核酸序列。

编码本发明的多肽的分离的核酸序列，可以以各种方式操作以提供所述多肽的表达。将所述核酸序列插入载体之前的操作可为需要的或必须的，这取决于表达载体。应用重组DNA方法修饰核酸序列的方法在本技术领域中是众所周知的。

术语“控制序列”在本文中定义为，包括所有对于表达本发明的多肽来说必需的或有利的成分。每个控制序列对于编码所述多肽的核酸序列可为天然的或外源的。上述控制序列包括，但不限于，前导序列(leader)、聚腺苷酸化序列(polyadenylation sequence)、前肽(propeptide sequence)、启动子(promoter)、信号肽序列(signal peptide sequence)和转录终止子(transcriptionterminator)。最低限度，所述的控制序列包括启动子和转录信号和转录终止信号。所述的控制序列可与接头一起提供，用于引入具体的限制酶切位点(restriction sites)以便于将所述的控制序列与编码多肽的核酸序列的编码区连接。术语“可操作地连接”在本文中定义为一种构造(configuration)，其中控制序列适合地位于相对于DNA序列的编码序列的位点，以使所述的控制序列指导多肽的表达。

所述的控制序列可为适当的启动子序列，即被表达所述核酸序列的宿主序列识别的核酸序列。所述启动子序列包含转录控制序列(transcriptionalcontrol sequences)，其介导所述多肽的表达。所述启动子可为任意核酸序列，其在优先选择的宿主细胞中显示转录活性，包括突变体启动子(mutant)、被截短的启动子(truncated)和杂合体启动子(hybrid promoter)，所述启动子可从编码细胞外或细胞内与所述宿主细胞同源或异源的多肽的基因中获得。

指导本发明的核酸构建体，尤其是在细菌宿主细胞中转录的合适的启动子的实例，是从大肠杆菌lac操纵子、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂水解酶(agarase)基因(dagA)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果聚糖蔗糖酶(levansucrase)基因(sacB)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)alpha-淀粉酶(alpha-amylase)基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶(maltogenic amylase)基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)alpha-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶(penicillinase)基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因和原核beta-内酰胺酶(beta-lactamase)基因(Villa-Kamaroff et al.，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75：3727-3731)，以及tac启动子(DeBoer et al.，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80：21-25)得到的启动子。其他的启动子在Scientific American，1980，242：74-94的″Useful proteins fromrecombinant bacteria″中和在Sambrook et al.，1989，见前文中描述。

指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适的启动子的实例，是从米曲霉(Aspergillus oryzae)TAKA淀粉酶、曼赫根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶(aspartic proteinase)、黑曲霉(Aspergillus niger)中性alpha-淀粉酶(neutral alpha-amylase)、黑曲霉酸稳定性alpha-淀粉酶(acid stablealpha-amylase)、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori) 葡糖淀粉酶(glucoamylase)(glaA)、曼赫根毛霉脂肪酶(lipase)、米曲霉碱性蛋白酶(alkalineproteinase)、米曲霉磷酸丙糖异构酶(triose phosphate isomerase)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶(acetamidase)和尖镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶-样蛋白酶(trypsin-like proteinase)(WO 96/00787)，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性alpha-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的启动子的杂合体)的基因中得到的启动子，及其突变体启动子、被截短的启动子和杂合体启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇酶(enolase)(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(galactokinase)(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)/3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油酸酯激酶(3-phosphoglycerate kinase)的基因中得到。酵母宿主细胞的其他有用的启动子通过Romanos et al.，1992，Yeast 8：423-488描述。

所述的控制序列也可为合适的转录终止序列，即由宿主细胞识别以终止转录的序列。所述终止序列可操作地与编码所述多肽的核酸序列的3’末端连接。任何在优先选择的宿主细胞中有功能的终止子可用于本发明。

丝状真菌宿主细胞的优选的终止子从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸盐合成酶(anthranilate synthase)、黑曲霉alpha-葡萄糖苷酶(alpha-glucosidase)和尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶的基因中得到。

优选的酵母宿主细胞的终止子从酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(cytochrome C)(CYC1)和酿酒酵母3-磷酸甘油醛脱氢酶的基因中得到。酵母宿主细胞的其他有用的终止子通过Romanos et al.，1992，见前文描述。

优选的细菌宿主细胞，如芽孢杆菌宿主细胞的终止子，是来自地衣芽孢杆菌alpha-淀粉酶基因(amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)或解淀粉芽孢杆菌alpha-淀粉酶基因(amyQ)的终止子。

所述控制序列也可为合适的前导序列(leader sequence)，即mRNA的不翻译的区域，其对于由宿主细胞的翻译是重要的。所述的前导序列可操作地与编码所述多肽的核酸序列的5’末端连接。任何在优先选择的宿主细胞中有功能的前导序列可用于本发明。

优选的丝状真菌宿主细胞的前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶的基因中得到。

合适的酵母宿主细胞的前导序列从酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸酯激酶、酿酒酵母alpha-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/3-磷酸甘油醛脱氢酶(ADH2/GAP)的基因中得到。

所述的控制序列以可为聚腺苷酸化序列，即可操作地与所述核酸序列的3’末端连接的序列，而且当它被转录时，它被宿主细胞识别为一个信号以将聚腺苷酸残基添加在转录的mRNA上。任何在优先选择的宿主细胞中有功能的聚腺苷酸化序列可用于本发明。

优选的丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸盐合成酶、尖镰孢胰蛋白酶-样蛋白酶和黑曲霉alpha-葡萄糖苷酶的基因中得到。

酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化序列通过Guo和Sherman，1995，Molecular Cellular Biology 15：5983-5990描述。

所述的控制序列也可为信号肽编码区域，其编码与多肽的氨基末端连接的氨基酸序列，并指导编码的多肽进入细胞的分泌途径(secretory pathway)。所述核酸序列的编码序列的5′末端可天然地包含信号肽编码区，所述信号肽编码区天然地在翻译阅读框中与编码分泌的多肽的编码区的部分连接。可替换地，编码序列的5′末端可包含信号肽编码区，其对于所述的编码序列是外源的。所述外源的信号肽编码区可为必需的，其中所述编码序列天然地不含信号肽编码区。可替换地，所述外源的信号肽编码区可简单地替换天然的信号肽编码区以增强所述多肽的分泌。然而，任何指导所表达的多肽进入优先选择的宿主细胞的分泌途径可用于本发明。

细菌宿主细胞的有效的信号肽编码区为从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌alpha-淀粉酶、解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)、解淀粉芽孢杆菌alpha-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因中得到的信号肽编码区。另外的信号肽通过Simonen和Palva，1993，Microbiological Reviews 57：109-137描述。

丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码区为从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、Humicola insolens纤维素酶和Humicola lanuginosa脂肪酶的基因中得到的信号肽编码区。

酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母alpha-因子(alpha-factor)和酿酒酵母转化酶(invertase)的基因中得到。其他有用的信号肽编码区通过Romanoset al.，1992，见前文描述。

所述控制序列也可为前肽编码区，其编码位于多肽的氨基末端的氨基酸序列。得到的多肽被称为前酶(proenzyme)或前多肽(propolypeptide)(或有些情况下称为酶原(zymogen))。前多肽通常是无活性的，并可通过将多肽从前多肽上催化的或自催化的(autocatalytic)切割，转化为成熟的活性多肽。所述多肽编码区可从枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)，枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)，酿酒酵母alpha-因子、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶和嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)漆酶(laccase)(WO 95/33836)的基因中得到。

在优选的实施方案中，所述前肽编码区为编码SEQ ID NO：2的氨基酸-166至-1的SEQ ID NO：1的核苷酸1-498、编码SEQ ID NO：8的氨基酸-165至-1的SEQ ID NO：7的核苷酸82-576、编码SEQ ID NO：10的氨基酸-166至-1的SEQ ID NO：9的核苷酸88-585和编码SEQ ID NO：12的氨基酸-167至-1的SEQ ID NO：11的核苷酸1-501。

在优选的实施方案中，所述信号肽编码区为编码SEQ ID NO：8的氨基酸1至29的SEQ ID NO：7的核苷酸1-81，或编码SEQ ID NO：10的氨基酸1-29的SEQ ID NO：9的核苷酸1-87。

信号肽区和前肽区出现在多肽的氨基末端，所述前肽区紧接着位于多肽的氨基末端，而所述信号肽区紧接着位于前肽区的氨基末端。

也需要添加调控序列，其允许调控相对于所述宿主细胞的生长的多肽的表达。调控系统的实例是那些响应化学的或物理的刺激物(stimulus)，包括调控化合物的存在，使所述基因的表达开启或关闭的调控系统。原核系统中的调控系统包括lac，tac和trp操纵子系统。在酵母中，可采用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，TAKA alpha-淀粉酶启动子、黑曲霉葡萄糖淀粉酶启动子和米曲霉葡萄糖淀粉酶启动子可用作调控序列。其他调控序列的实例是那些允许基因扩增的调控系统。在真核系统中，这些调控系统包括二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reductase)基因，其在甲氨喋呤(methotrexate)存在的条件下被扩增，和金属硫蛋白(metallothionein)基因，其以重金属扩增。在这些情况中，编码所述多肽的核酸序列可操作地与所述调控序列连接。

表达载体

本发明也涉及重组表达载体，包括本发明的核酸序列、启动子、转录和翻译终止信号。可将上述的多种核酸和控制序列结合在一起以产生重组表达载体，其可包括一种或多种方便的限制酶切位点，以允许在这些位点上插入或取代编码所述多肽的核酸序列。可替换地，本发明的核酸序列可以通过将所述核酸序列或包含所述序列的核酸构建体插入适于表达的载体中进行表达。在创建所述表达载体的过程中，使所述编码序列位于所述载体中，这样一来，所述的编码序列可操作地与适于表达的控制序列连接。

所述的重组表达载体可为任意载体(例如，质粒或病毒)，其可以方便地经过重组DNA方法，并可使所述核酸序列表达。所述载体的选择通常依赖于所述载体与被导入所述载体的宿主细胞的相容性(compatibility)。所述载体可为线状的质粒或闭合的环状质粒。

所述载体可为自发复制的(autonomously replicating)载体，即作为染色体外的实体存在的载体，它的复制不依赖于染色体的复制，例如，质粒、染色体外的元件(element)、极微染色体(minichromosome)或人造染色体。所述质粒可包含确保自我复制(self-replication)的任何方法(means)。可替换地，所述载体可为当它被导入宿主细胞时它被整合入基因组，并与被整合入所述载体的染色体一起复制。此外，可以采用单一的载体或质粒或一起含有待导入宿主细胞的基因组的总DNA的两种或多种载体或质粒，或转座子(transposon)。

本发明的载体优选包含一种或多种可选择的标记，其允许容易地选择转化的细胞。可选择的标记为基因，该基因的产物可提供给杀虫剂(biocide)或病毒抗性(viral resistance)、抗重金属(resistance to heavy metals)、营养缺陷型的原营养(prototrophy to auxotrophs)等。细菌的可选择的标记的实例是来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因。酵母宿主细胞的合适的标记为ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。在丝状真菌宿主细胞中应用的可选择的标记包括，但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶(omithine carbamoyltransferase))、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶(phosphinothricin acetyltransferase))、hygB(潮霉素磷酸转移酶(hygromycinphosphotransferase))、niaD(硝酸盐还原酶(nitrate reductase))、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(orotidine-5′-phosphate decarboxylase))、sC(硫酸腺苷酰基转移酶(sulfate adenyltransferase))、trpC(邻氨基苯甲酸盐合成酶)，以及其相等物。优选用于曲霉细胞的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因和吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

本发明的载体优选含有元件，所述元件允许将所述载体稳定地整合到宿主细胞的基因组，或在所述细胞中不依赖于基因组自发地复制所述载体。

为了整合入所述宿主细胞基因组，所述载体可依赖于编码多肽的核酸序列或通过同源的或非同源的重组将所述载体稳定地整合入基因组中的任何其他元件。可替换地，所述的载体可包含附加的核酸序列，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞的基因组。所述附加的核酸序列使所述载体在染色体的准确位置整合入宿主细胞基因组。为了提高在准确位置进行整合的可能性，所述的整合元件应优选含有足够数量的核酸，如100至1,500个碱基对，优选400至1,500个碱基对并最优选800至1,500个碱基对，所述的核酸与对应的靶序列高度同源以增强同源重组的可能性。所述的整合元件可为与所述宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，所述的整合元件可为非-编码的或编码的核酸序列。另一方面，所述载体可通过非-同源重组整合如所述宿主细胞的基因组中。

为了自发复制，所述载体可进一步包含复制起点(origin of replication)，它能够使所述质粒在所述的宿主细胞中自发的复制。细菌的复制起点的实例为允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184的复制起点，和允许在芽孢杆菌中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMf31的复制起点。在酵母宿主细胞中应用的复制起点的实例为2微米(micron)复制起点，ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、和ARS4和CEN6的组合。所述的复制起点可为具有突变的复制起点，所述突变使其在所述宿主细胞中具有温度-敏感性的功能(参见，例如，Ehrlich，1978，Proceedings of theNational Academy of Sciences USA 75：1433)。

超过一个拷贝的本发明的核酸序列可被插入宿主细胞以提高基因产物的产生。通过将所述序列的至少一个附加的拷贝整合如宿主细胞基因组，或者通过将可扩增的可选择的标记基因包含于所述的核酸序列中，其中细胞含有可选择的标记基因的扩增的拷贝，并由此所述核酸序列的附加的拷贝可以通过在适当的选择性试剂存在的条件下培养所述细胞来选择，所述核酸序列的拷贝数可以得到增加。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域的技术人员所熟知的(参见，例如，Sambrook et al.，1989，见前文)。

所述的蛋白酶也可与至少一种其他用于动物饲料的目标酶一起共-表达，所述的目标酶如alpha-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、半乳糖酶(EC 3.2.1.89)、alpha-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、蛋白酶(EC 3.4.-.-)、磷酯酶A1(EC 3.1.1.32)、磷酯酶A2(EC 3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)、磷酯酶C(3.1.4.3)、磷酯酶D(EC 3.1.4.4)和/或beta-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。

所述的酶可为由不同的载体、由一种载体或应用两种方法的结合进行共-表达。当应用不同载体时，所述载体可具有不同的可选择的标记和不同的复制起点。当只应用一种载体时，所述基因可以从一个或多个启动子表达。如果在一个启动子(双-或多-顺反子的)的调控下克隆，克隆的基因的顺序可影响蛋白的表达水平。所述蛋白酶也可表达为融合蛋白，即编码所述蛋白酶的基因已经被融合到编码另一个蛋白的基因的框架内。此蛋白可为另一种酶或来自另一种酶的功能域(functional domain)。

宿主细胞

本发明也涉及包括本发明的核酸序列的重组宿主细胞，其方便地应用于所述多肽的重组产生。包含本发明的核酸序列的载体被引入宿主细胞，所以所述载体作为染色体的组成部分，或作为自我-复制的染色体外的载体保持，如较早所述的。术语“宿主细胞”包括任何亲代细胞的后代，其由于复制过程中发生的突变而与亲代细胞不相同。宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码所述多肽的基因及其来源。

所述宿主细胞可为单细胞的微生物，例如原核生物，或非单细胞的微生物，例如真核生物。

有用的单细胞的细胞是细菌细胞，如革兰氏阳性细菌，包括但不限于，芽孢杆菌细胞，或链霉菌细胞，或乳酸细菌的细胞；或革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌和假单胞菌。所述的乳酸细菌包括，但不限于，乳球菌属(Lactococcus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、链球菌属(Streptococcus)、片球菌属(Pediococcus)和肠球菌属(Enterococcus)的菌种。

将载体导入细菌宿主细胞可，例如，通过原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Molecular general genetics 168：111-115)，应用感受态细胞(competent cells)(参见，例如，Young和Spizizin，1961，Journal of Bacteriology81：823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson，1971，Journal of MolecularBiology 56：209-221)，电穿孔(electroporation)(参见，例如，Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6：742-751)或接合(conjugation)(参见，例如，Koehler和Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169：5771-5278)进行。

宿主细胞可为真核的，如非-人动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或真菌细胞。

在一个具体的实施方案中，所述宿主细胞是真菌细胞。本文中应用的“真菌”包括子囊菌门(phyla Ascomycota)，担子菌门(Basidiomycota)，壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)(如由Hawksworth et al.在Ainsworth and Bisby′s Dictionary of The Fungi，8th edition，1995，CABInternational，University Press，Cambridge，UK中所定义的)，以及卵菌门(Oomycota)(如在Hawksworth et al.，1995，见前文，page 171所引用的)和所有有丝分裂孢子的真菌(Hawksworth et al.，1995，见前文)。

在另一个具体的实施方案中，所述真菌宿主细胞是酵母细胞。本文中应用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类在将来可变化，为了实现本发明的目的，将酵母定义为如在Biology and Activities ofYeast(Skinner，F.A.，Passmore，S.M.和Davenport，R.R.，eds，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9，1980)中所描述的。

酵母宿主细胞可为念珠菌属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharornyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或Yarrowia细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括所有丝状形式的真菌和卵菌亚门(如由Hawksworth et al.，1995，见前文所定义的)。所述的丝状真菌以由甲壳质(chitin)、纤维素、葡聚糖(glucan)、壳聚糖(chitosan)、甘露聚糖(mannan)和其他复合多糖类(complex polysaccharides)组成的菌丝体壁(mycelial wall)为特征。通过菌丝延长(hyphal elongation)进行营养生长(vegetative growth)，而碳分解代谢(carbon catabolism)是专性需氧的(obligatelyaerobic)。与此相反，酵母，诸如酿酒酵母的营养生长则是通过单细胞菌体的出芽生殖(budding)进行的，而碳分解代谢是可为发酵的(fermentative)。

丝状真菌宿主细胞的实例为，但不限于，枝顶孢霉属(Acremonium)、曲霉属、镰孢属、腐质霉属(Humicola)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)的菌种的细胞。

真菌细胞可通过包括形成原生质体、转化原生质体和细胞壁再生的方法，以其公知的方式进行转化。

转化曲霉属宿主细胞的合适的方法在EP 238 023和Yelton et al.，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81：1470-1474中描述。转化镰孢属菌种的合适的方法由Malardier et al.，1989，Gene 78：147-156和WO 96/00787描述。可应用由Becker和Guarente在Abelson J.N.和Simon，M.I.，editors，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology，Methods in Enzymology，Volume 194，pp 182-187，Academic Press，Inc.，New York；Ito et al.，1983，Journalof Bacteriology 153：163和Hinnen et al.，1978，Proceedings of the NationalAcademy of Sciences USA 75：1920描述的方法转化酵母。

产生方法

本发明也涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)培养菌株，其野生型能够产生所述的多肽；和(b)回收所述的多肽。优选地，所述菌株是Nocardiopsis属，更优选Nocardiopsis dassonvillei、Nocardiopsis alba或Nocardiopsisantarctica，更优选Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei。

本发明也涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养宿主细胞；和(b)回收所述的多肽。

本发明也涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包括突变体核酸序列，其包括SEQID NO：1的核苷酸499-1062，SEQ ID NO：7的核苷酸577-1164，SEQ ID NO：9的核苷酸586-1152，和/或SEQ ID NO：11的核苷酸502-1065中至少一个突变，其中所述突变体核酸序列编码多肽，其(i)由SEQ ID NO：2的氨基酸1至188，SEQ ID NO：8的氨基酸1至196，SEQ ID NO：10的氨基酸1至189和/或SEQ ID NO：12的氨基酸1至188，或(ii)为(i)的任何序列的变体，其中所述的变体包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸，或(iii)为(i)的任何序列的等位基因变体，或(iv)为(i)的任何序列的片段。

在本发明的产生方法中，所述细胞在适于产生所述多肽的营养培养基中，用本技术领域公知的方法培养。例如，所述细胞可通过摇瓶培养、小-规模或大-规模发酵(包括连续的、批式的、补料分批的或固态的发酵)，在实验室或工业发酵罐中，在合适的培养基中和允许所述多肽表达和/或分离的条件下进行培养。所述的培养采用本技术领域公知的方法，在合适的包含碳源、氮源和无机盐的营养培养基中发生。合适的培养基可从商业供应者得到，或杆菌发表的组合物(例如，在American Type Culture Collection的目录中)进行制备。如果所述多肽分泌到营养培养基中，所述多肽可直接从培养基中回收，如果所述多肽不分泌，那么它可以从细胞裂解物(cell lysate)中回收。

所述多肽可采用本技术领域公知的、对所述多肽具有特异性的方法进行检测。这些检测方法可包括应用特异性抗体、产物形成或底物消失。例如，蛋白酶分析可用于测定所述多肽的活性，如本文所述。

得到的多肽可以通过本技术领域公知的方法进行回收。例如，所述多肽可以通过常规的方法从营养培养基中回收，所述常规方法包括，但不限于离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

本发明的多肽可通过本技术领域公知的各种方法进行纯化，所述方法包括，但不限于色谱法(例如，离子交换、亲和、疏水、色谱焦聚和大小排阻)、电泳的方法(例如，制备等电聚焦(preparative isoelectric focusing))、溶解性差异(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(extraction)(参见，例如，ProteinPurification，J.-C.Janson和Lars Ryden，editors，VCH Publishers，New York，1989)。

植物

本发明也涉及转基因的植物、植物部分或植物细胞，其已经用编码具有本发明的蛋白酶活性的多肽的核酸序列转化，以表达和以可回收的量产生所述多肽。所述多肽可从植物或植物部分中回收。可替换地，可应用所述的包含重组多肽的植物或植物部分以提高食物(food)或饲料(feed)的质量，例如，提高营养价值(nutritional value)、适口性(palatability)和流变学的(rheological)性质，或破坏反营养性的因子(antinutritive factor)。

在具体的实施方案中，将所述的多肽靶向种子中的胚乳贮藏液泡(endosperm storage vacuoles)。这可通过将其作为一个合适的信号肽的前体合成而得到，参见Horvath et al在PNAS，Feb.15，2000，vol.97，no.4，p.1914-1919。

转基因的植物可为双子叶的(dicotyledonous)(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)或其工程的变体。单子叶植物的实例是草(grasses)，如草地早熟禾(meadow grass)(蓝草(blue grass)，早熟禾属(Poa))；饲用牧草(forage grass)如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；寒地型牧草(temperate grass)，如Agrostis；和谷类，例如，小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、黑小麦(triticale)(小麦(Tricicum)和黑麦(黑麦属(Secale))的稳定杂交体和玉蜀黍(maize)(玉米)。双子叶植物的实例是烟草(tobacco)，豆类(legumes)，如向日葵(sunflower)(向日葵属(Helianthus))，棉花(棉属(Gossypium))羽扇豆(lupins)，马铃薯，糖甜菜(sugarbeet)，豌豆，豆(bean)和大豆(soybean)和十字花科的(cruciferous)植物(十字花科(family Brassicaceae))，如花椰菜(cauliflower)，油菜籽(rape seed)和紧密相关的模型生物体拟南芥(Arabidopsis thaliana)。低-肌醇六磷酸盐(Low-phytate)植物，例如在美国专利no.5,689,054和美国专利no.6,111,168中描述的，是工程植物的实例。

植物部分的实例是茎(stem)、愈伤组织(callus)、叶(leave)、根(root)、果实(fruits)、种子(seed)和根茎(tuber)，以及包含这些部分的独立组织，例如，表皮(epidermis)、叶肉(mesophyll)、薄壁组织(parenchyma)、维管组织(vasculartissues)、分生组织(meristems)。而且具体的植物细胞区室(compartments)，如叶绿体(chloroplast)、质外体(apoplast)、线粒体(mitochondria)、液泡(vacuole)、过氧化物酶体(peroxisome)和细胞质(cytoplasm)被认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，都被认为是植物部分。

同样地，植物部分，如分离以促进本发明的应用的具体组织和细胞也被认为是植物部分，例如胚胎(embryos)、胚乳(endosperms)、糊粉(aleurone)和种皮(seed coat)。上述植物、植物部分和植物细胞的子代也包括在本发明的范围之内。

表达本发明的多肽的转基因的植物或植物细胞，可以依照本技术领域公知的方法构建。简言之，所述植物或植物细胞通过将一个或多个编码本发明的表达构建体整合入植物宿主基因组，并在转基因的植物或植物细胞中，增殖得到的改良的植物或植物细胞进行构建。

方便地，所述的表达构建体是核酸构建体，其包括编码本发明的多肽的核酸序列，所述核酸序列可操作地与在优先选择的植物或植物部分中表达所述核酸序列所必需的适当的调控序列相连接。此外，所述的表达构建体可包含可选择的标记，其用于鉴别已经整合入表达构建体的宿主细胞，和将该构建体导入所述植物所需的DNA序列(后者依赖于所采用的DNA导入方法)。

调控序列，如启动子和终止子序列及任选的信号序列或转运(transit)序列的选择，例如，在需要所述多肽何时、何地和怎样表达的基础上进行确定，例如，表达编码本发明的多肽的基因可为组成型的(constitutive)或诱导的(inducible)，或可为发育特异性的、阶段特异性的或组织特异性的，而基因产物可靶向具体的组织或植物部分，如种子或叶。调控序列为，例如，由Tagueet al.，1988，Plant Physiology 86：506所描述的。

对于组成型表达，可以应用下面的启动子：35S-CaMV启动子(Franck et al.，1980，Cell 21：285-294)、玉米泛素(maize ubiquitin)1(Christensen AH，SharrockRA和Quail 1992.Maize polyubiquitin genes：structure，thermal perturbation ofexpression and transcript splicing，and promoter activity following transfer toprotoplasts byelectroporation)、或稻肌动蛋白(rice actin)1启动子(Plant Mo.Biol.18，675-689.；Zhang W，McElroy D.和Wu R 1991，Analysis ofrice Actl 5′regionactivity in transgenic rice plants.Plant Cell 3，1155-1165)。器官特异性的启动子可为，例如，来自贮藏库组织(storage sink tissue)，如种子、马铃薯根茎和果实的启动子(Edwards & Coruzzi，1990，Ann.Rev.Genet.24：275-303)，或来自代谢库组织(metabolic sink tissues)，如分生组织(Ito et al.，1994，Plant Mol.Biol.24：863-878)，种子特异性的启动子，诸如来自稻的谷蛋白(glutelin)启动子、醇溶蛋白(prolamin)启动子、球蛋白(globulin)启动子或白蛋白(albumin)启动子(Wu et al.，1998，Plant和Cell Physiology 39：885-889)，来自豆球蛋白(legumin)B4和蚕豆(Vicia faba)的未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad et al.，1998，Journal of Plant Physiology 152：708-711)、来自种子油体蛋白(body protein)的启动子(Chen et al.，1998，Plant和Cell Physiology 39：935-941)，来自Brassicanapus的贮藏蛋白apA启动子，或本技术领域公知的任何其他种子特异性的启动子，例如，在WO 91/14772中所描述的。此外，启动子可为叶特异性的启动子，如来自稻或马铃薯的rbcs启动子(Kyozuka et al.，1993，PlantPhysiology 102：991-1000)，小球藻病毒(chlorella virus)腺嘌呤甲基转移酶(adenine methyltransferase)基因启动子(Mitra和Higgins，1994，Plant MolecularBiology 26：85-93)，或来自稻的aldP基因启动子(Kagaya et al.，1995，Molecular和general genetics 248：668-674)，或伤口诱导的启动子，如马铃薯pin2启动子(Xu et al.，1993，Plant Molecular Biology 22：573-588).同样地，所述启动子可通过非生物的处理诱导，所述非生物的处理诸如温度、干旱或盐度变化，或通过外源应用的激活所述启动子的物质诱导，例如乙醇、雌激素(oestrogens)、植物激素(plant hormones)如乙烯、脱落酸(abscisic acid)、赤霉酸(gibberellic acid)和/或重金属。

启动子增强子元件也可用于在所述植物中实现所述蛋白酶的更高表达。例如，所述启动子增强子元件可为内含子(intron)，其被置于启动子和编码本发明的多肽的核苷酸序列之间。例如，Xu et al.，1993，见前文公开了稻肌动蛋白1基因的第一个内含子增强表达的应用。

更进一步，可优化植物种的密码子应用以改善表达(参见前面提到的Horvath et al)。

可选择的标记基因和所述表达构建体的任何其他部分，可选自本技术领域中可得到的那些。

所述的核酸构建体，根据本技术领域公知的常规技术，整合入植物基因组，包括土壤杆菌(Agrobacterium)-介导的转化、显微注射(microinjection)、粒子轰击(particle bombardment)、生物射弹转化(biolistic transformation)和电穿孔(Gasser et al.，1990，Science 244：1293；Potrykus，1990，Bio/Technology 8：535；Shimamoto etal.，1989，Nature 338：274)。

目前，根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)-介导的基因转移(genetransfer)是产生转基因双子叶植物的优先选择的方法(为了考察，参见Hooykas和Schilperoort，1992，Plant Molecular Biology 19：15-38)，而且它也可以用于转化单子叶植物，虽然对于这些植物其他的转化方法通常是优选的。目前，产生转基因双子叶植物的优先选择(以补充土壤杆菌方法)的方法，是用粒子(涂有转化DNA的微观的金或钨粒子)轰击胚胎愈伤组织(embryonic calli)或发育中的胚芽(developing embryos)(Christou，1992，Plant Journal 2：275-281；Shimamoto，1994，Current Opinion Biotechnology 5：158-162；Vasil et al.，1992，Bio/Technology 10：667-674)。转化单子叶植物的可替换的方法是基于原生质体转化，如由Omirulleh et al.，1993，Plant Molecular Biology 21：415-428中所描述的。

转化之后，筛选具有整合入其中的表达构建体的转化体，并将其根据本技术领域中熟知的方法在全植物中再生。

本发明也涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)培养转基因的植物或植物细胞，其包括编码多肽的核酸序列，所述多肽在有助于产生所述多肽的条件下具有本发明的蛋白酶活性；和(b)回收所述的多肽。

动物

本发明也涉及转基因的非-人动物和产物或其成分，其实例为体液，如乳液和血液，器官，肉和动物细胞。表达蛋白质的方法，例如在哺乳动物细胞中，是本技术领域中公知的，参见例如the handbook Protein Expression：APractical Approach，Higgins和Hames(eds)，Oxford University Press(1999)，和此系列中与基因转录、RNA加工和翻译后加工有关的其他三本手册。一般而言，为了制备转基因的动物，用编码具有本发明的蛋白酶活性的多肽的核酸序列，转化选择的动物的选择的细胞，以表达和产生所述的多肽。所述的多肽可从所述的动物，例如从雌性动物的乳液中回收，或可表达所述的多肽以有益于动物本身，例如帮助动物消耗。动物的实例在下面标题为动物饲料的部分中提及。

产生转基因的动物的目的在于从该动物的乳液中回收所述的蛋白酶，可将编码所述蛋白酶的基因插入所述动物的受精卵中，例如通过利用转基因表达载体，其包括合适的乳蛋白启动子和编码所述蛋白酶的基因。将所述的转基因表达载体显微注射乳受精卵，并优选永久地整合乳染色体。一旦所述的卵开始生长和分裂，就将可能的胚胎植入代孕母体(surrogate mother)中，并鉴定携带所述转基因的动物。然后将得到的动物通过常规的饲养进行繁殖。所述多肽可从所述动物的乳液中纯化，参见例如Meade，H.M.et al(1999)：Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animals，geneexpression systems：Using nature for the art of expression.J.M.Femandez和J.P.Hoeffler(eds.)，Academic Press。

在替换方案中，为了产生转基因的非-人动物，在其体细胞和/或生殖细胞中，携带含有异源的转基因构建体的核酸序列，所述转基因构建体包括编码所述蛋白酶的转基因，所述的转基因可操作地与所述蛋白酶的唾液腺(salivarygland)特异性表达的第一个调控序列相连接，如在WO00/064247中公开的。

组合物

在又一方面，本发明涉及包含本发明的多肽的组合物。

所述的多肽组合物可以根据本技术领域公知的方法制备，并可为液体组合物或者干燥的组合物的形式。例如，所述的多肽组合物可为颗粒(granulate)或微粒(microgranulate)的形式。包含在所述组合物中的多肽可依据本技术领域公知的方法稳定。

本发明的多肽或多肽组合物的优选的用途在下面给出实施例。

动物饲料

本发明也着眼于本发明的多肽在动物饲料中应用的方法，以及包含本发明的多肽的饲料组合物和饲料添加剂。

术语动物包括所有的动物，包括人。动物的实例为非-反刍动物(non-ruminant)和反刍动物(ruminant)。反刍动物包括，例如，动物诸如绵羊、山羊、马和牛，例如肉牛(beef cattle)、奶牛和小牛犊(young calves)。在具体的实施方案中，所述动物是非-反刍动物。非-反刍动物包括单胃的(monogastric)动物，例如猪(pig)或猪(swine)(包括，但不限于小猪(piglet)、成长的猪(growingpig)和母猪(sow))；家禽，诸如火鸡(turkey)、鸭(duck)和小鸡(chicken)(包括但不限于肉鸡(broiler chick)、蛋鸡(layers))；young calves；和鱼(包括但不限于鲑鱼(salmon)、鳟鱼(trout)、罗非鱼(tilapia)，鲶鱼(catfish)和鲤鱼(carp)；和甲壳类动物(crustacean)(包括但不限于虾(shrimp)和对虾(prawn))。

术语饲料或饲料组合物指适于或旨在被动物摄取的任何化合物、制剂、混合物或组合物。

在本发明的应用中，所述的蛋白酶可以在饮食之前、之后或与饮食同时喂给所述的动物，后者是优选的。

在具体的实施方案中，所述的蛋白酶，其加入所述饲料的形式或何时包含入饲料添加剂，是适当限定的(well-defined)。适当限定的指所述的蛋白酶制剂至少50％的纯度，如通过大小排阻色谱测定的(参见WO01/58275的实施例12)。在其他具体的实施方案中，所述的蛋白酶制剂至少60、70、80、85、88、90、92、94或至少95％纯度，如通过此方法测定的。

适当限定的蛋白酶制剂是有利的。例如，更容易正确地配制(dose)以将基本无其他蛋白酶干扰或污染的蛋白酶作为饲料供给。术语正确地配制具体指获得一致的(consistent)和不变的(constant)产物的目的，和根据所需的效果优化剂量的能力。

然而，对于在动物饲料中的应用，所述的蛋白酶并不需要那么纯；它可以例如包括其他酶，在这样的情况下它可被称为蛋白酶制剂。

所述的蛋白酶制剂可以(a)直接加入所述的饲料(或直接用于蛋白质的处理过程)，或(b)它可被用于产生一种或多种中间体组合物(intermediatecomposition)，如饲料添加剂或被随后加入所述饲料(或用于处理过程)的预混合物。上述的纯度(The degree of purity)指初始的蛋白酶制剂纯度，无论根据上面的(a)还是(b)进行应用。

尤其是应用重组产生方法，可得到具有此数量级纯度的蛋白酶制剂，然而并不容易得到，而且当所述的蛋白酶通过传统发酵方法产生时，也遭受到更大的批与批间的变化。

上述蛋白酶制剂当然可与其他酶混合。

在具体的实施方案中，本发明应用的蛋白酶能够溶解蛋白质。检测溶解的蛋白质的合适的实验在实施例3中公开。

所述蛋白可为动物蛋白，如肉和骨粉，和/或鱼粉；或者它可为植物蛋白。

本文中应用的术语植物蛋白指包含至少一种蛋白的任何化合物、组合物、制剂或混合物，所述蛋白源自或起源于含有变性蛋白(modified protein)和蛋白衍生物(protein-derivative)的植物。在具体的实施方案中，所述植物蛋白的蛋白含量为至少10、20、30、40、50或60％(w/w)。

植物蛋白可源自植物蛋白来源，如豆类和谷类，例如来自豆科(familiesFabaceae)(豆科(Leguminosae))、十字花科(Cruciferaceae)、藜科(Chenopodiaceae)和禾本科(Poaceae)的植物的材料，诸如大豆粉(soy beanmeal)，羽扇豆粉(lupin meal)和油菜籽粉(rapeseed meal)。

在具体的实施方案中，所述的植物蛋白来源是来自豆科的一种或多种植物的材料，例如大豆、羽扇豆、豌豆或豆(bean)。

在另一个具体的实施方案中，所述的植物蛋白来源是来自藜科的一种或多种植物的材料，例如甜菜(beet)、糖甜菜(sugar beet)、菠菜(spinach)或昆诺阿藜(quinoa)。

植物蛋白来源的其他实例为油菜籽、向日葵子(sunflower seed)、棉籽(cotton seed)和甘蓝(cabbage)。

大豆是优选的植物蛋白来源。

植物蛋白来源的其他实例为谷类，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻、小麦属植物(triticale)和高粱。

根据本发明，用至少一种本发明的蛋白酶处理蛋白质导致蛋白的溶解性增加。

下面为在单胃体外模型(monogastric in vitro model)中应用本发明的蛋白酶得到的％溶解蛋白的实例：至少102％、103％、104％、105％、106％或至少107％，相对于空白。溶解的蛋白的百分数，应用实施例3和/或实施例10的单胃体外模型确定。术语蛋白质的增溶溶解(solubilisation)基本上指将蛋白质带入溶液。上述增溶溶解可由蛋白酶-介导的蛋白从常见复合物天然组合物，如饲料的其他成分中释放而引起。

在又一个具体的实施方案中，本发明应用的蛋白酶能够增加可消化的(digestible)蛋白质的量。下面为在单胃体外模型中应用本发明的蛋白酶得到的％已消化的或可消化的蛋白的实例：至少104％、105％、106％、107％、108％、109％、110％，111％、112％、113％、114％、115％或至少116％，相对于空白。已消化的或可消化的蛋白的百分数，应用实施例3和/或实施例10的体外模型确定。

下面为在溶液培养体外模型(aquaculture in vitro model)中，应用本发明的蛋白酶得到的％已消化的或可消化的蛋白的实例：至少103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％或至少110％，相对于空白。已消化的或可消化的蛋白的百分数，应用实施例4的溶液培养体外模型确定。

在又一个具体的实施方案中，本发明应用的蛋白酶能够增加蛋白质的水解程度(the Degree of Hydrolysis)(DH)。下面为在单胃体外模型中应用本发明的蛋白酶得到水解程度增加的实例：至少102％、103％、104％、105％、106％或至少107％，相对于空白。所述的DH应用实施例3的单胃体外模型确定。下面为在溶液培养体外模型中，应用本发明的蛋白酶得到水解程度增加的实例：至少102％、103％、104％、105％、106％或至少107％，相对于空白。所述的DH应用实施例4的溶液培养体外模型确定。

在本发明的(预-)处理方法的具体的实施方案中，所述蛋白酶影响(或作用于，或发挥其溶解效应(solubilising influence)于)蛋白或蛋白来源。为了实现它，所述蛋白或蛋白来源通常悬浮于溶剂，例如水的溶剂，如水，并根据所述的酶的特性调节pH和温度值。例如，所述的处理可在pH-值进行，在所述的pH值，实际的蛋白酶的活性为至少40％、50％、60％、70％、80％或至少90％。同样地，例如，所述的处理可在温度进行，在所述的温度，实际的蛋白酶的活性为至少40％、50％、60％、70％、80％或至少90％。上述的百分比活性指标与最大活性相关。所述的酶反应持续直到得到需要的结果，然后可以或不可以通过使所述的酶失活，例如通过热-处理步骤终止所述的酶反应。

在本发明的处理方法的又一个具体的实施方案中，所述的蛋白酶作用得到保持，它的意思是，例如将所述的蛋白酶加入所述蛋白或蛋白来源，但其溶解效应可以说直到后来需要的时候才出现，一旦建立合适的溶解条件，或一旦任何酶抑制物失活，或诸如此类，可以应用其他方法延迟所述的酶的作用。

在一个实施方案中，所述的处理是动物饲料或用于动物饲料的蛋白质的预-处理。

术语改善动物饲料的营养值，是指改善所述蛋白质的可用性和/或可消化性，由此导致从饮食成分中提取蛋白增加，蛋白产量(yield)更高，蛋白降解增加和/或蛋白用途改善。所述饲料的营养值由此增加，而且动物性能(animalperformance)，诸如所述动物的生长速率(growth rate)和/或增重(weight gain)和/或饲料转化率(feed conversion ratio)(即消化的饲料的重量与增重之比)得到改善。

在具体的实施方案中，所述的饲料转化率增长至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或至少10％。在又一个具体的实施方案中，增重增加至少2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或至少11％。这些数字相对于不加入蛋白酶的对照实验。

所述的饲料转化率(FCR)和增重可以如在EEC(1986)：Directive de laCommission du 9 avril 1986 fixant la méthode de calcul de la valeur énérgetiquedes aliments composés destinés àla volaille.Journal Officiel des CommunautésEuropéennes，L130，53-54中所描述的进行计算。

所述的蛋白酶可以以任何形式，或作为相对纯的蛋白酶，或与意欲加入动物饲料的其他成分相混合，即以动物饲料添加剂，如所谓的动物饲料的预混物的形式，加入所述的饲料中。

在又一方面，本发明涉及用于动物饲料的组合物，诸如动物饲料和动物饲料添加剂，例如预混物。

除了本发明的蛋白酶之外，本发明的动物饲料添加剂含有至少一种脂溶性维生素和/或至少一种水溶性维生素，和/或至少一种痕量矿物。所述的饲料添加剂也可包含至少一种常量的(macro)矿物。

其他的、可选择的饲料添加剂成份为着色剂(colouring agent)，例如类葫萝卜素(carotenoids)诸如beta-胡萝卜素、虾青素(astaxanthin)和叶黄素(lutein)；芳香族化合物(aroma compounds)；稳定剂(stabiliser)；抗微生物肽(antimicrobialpeptides)；聚不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids)；活性氧产生物(reactiveoxygen generating species)；和/或至少一种其他的酶，所述其他的酶选自alpha-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)、木聚糖酶(EC 3.2.1.8)、半乳糖酶(EC 3.2.1.89)、alpha-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)、蛋白酶(EC 3.4.-.-)、磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)、磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)、溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)、磷脂酶C(3.1.4.3)、磷脂酶D(EC 3.1.4.4)、淀粉酶，例如，alpha-淀粉酶(EC 3.2.1.1)和/或beta-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)。

在具体的实施方案中，这些其他的酶是适当限定的(在前面对于蛋白酶制剂所限定的)。

抗微生物肽(AMP′s)的实例是CAP18、Leucocin A、Tritrpticin、内源性抗微生物多肽(Protegrin)-1、Thanatin、防卫素(Defensin)、乳铁蛋白(Lactoferrin)、Lactoferricin和Ovispirin如Novispirin(Robert Lehrer，2000)、Plectasins和他汀类(Statins)，其包括在WO 03/044049和WO 03/048148中公开的化合物和多肽，以及上述保持抗微生物活性的变体或片段。

抗真菌多肽(AFP′s)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)肽和黑曲霉肽peptides，以及其保持抗真菌活性的变体和片段，如在WO 94/01459和WO02/090384中所公开的。

聚不饱和脂肪酸的实例是C18、C20和C22聚不饱和脂肪酸，如花生四烯酸(arachidonic acid)、二十二碳六烯酸(docosohexaenoic acid)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid)和gamma-亚油酸(gamma-linoleic acid)。

活性氧产生物是化学品，诸如过硼酸盐(perborate)、过硫酸盐(persulphate)、或过碳酸盐；和酶诸如氧化酶(oxidase)、加氧酶(oxygenase)或合成酶(syntethase)。

通常地，脂溶性和水溶性维生素以及痕量矿物，形成意欲加入到所述的饲料中的所谓的预混物的一部分，然而，常量矿物通常单独地加入所述的饲料。富含本发明的蛋白酶的预混物是本发明的动物饲料添加剂的实例。

在具体的实施方案中，本发明的动物饲料添加剂，以0.01至10.0％；更具体为0.05至5.0％；或0.2至1.0％(％表示g添加剂每100g饲料)的水平预期包含(或规定为必须包含)在动物饮食或饲料中。尤其对于预混物来说是这样的。

下面是这些成分的实例的非-排他性(non-exclusive)的列表：

脂溶性维生素的实例为维生素A、维生素D3、维生素E，和维生素K，例如维生素K3。

水溶性维生素的实例为维生素B12、生物素(biotin)和胆碱(choline)、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸(niacin)、叶酸(folic acid)和泛酸盐(pantothenate)，例如Ca-D-泛酸盐。

痕量矿物的实例为锰、锌、铁、铜、碘、硒和钴。

常量矿物的实例为钙、磷和钠。

这些成分的营养需求(以家禽和小猪/猪进行例示)列表于WO 01/58275的表A中。营养需求指这些成分应该以指定的浓度在所述的饮食中提供。

在替换方案中，本发明的动物饲料添加剂包括WO 01/58275的表A中的指明的独立成分的至少一种。至少一种是指一种，或两种，或三种，或四种等等直至所有十三种，或直至所有十五种独立成分中的任何一种或多种。更具体地，此至少一种独立成分，以提供给料浓度(in-feed-concentration)的含量，包含在本发明的添加剂中，所述的给料浓度在表A的第四列，或第五列，或第六列中显示的范围之内。

本发明也涉及动物饲料组合物。动物饲料组合物或食物(diet)具有相对高含量的蛋白。可以表征家禽和猪的食物，如在WO 01/58275的表B，第2-3列中所显示的。可以表征鱼食，如此表B的第4列中所显示的。此外，这样的鱼食通常具有200-310g/kg的粗脂肪(crude fat)含量。WO01/58275对应于US 09/779334，其在此并入以作为参考。

本发明的动物饲料组合物具有50-800g/kg的粗蛋白含量，并进一步包含至少一种蛋白酶，如本文要求的。

而且，或在(上面显示的粗蛋白含量的)替换方案中，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量的含量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的可利用磷(available phosphorus)的含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸的含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸的含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸的含量。

在具体的实施方案中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸和/或赖氨酸的含量，在WO 01/58275(R.2-5)的表B中范围2、3、4或5中的任一个之内。

将氮(N)乘以因子6.25计算粗蛋白，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)×6.25。所述氮含量由Kjeldahl方法(A.O.A.C.，1984，Official Methods of Analysis 14thed.，Association of Official Analytical Chemists，Washington DC)确定。

可代谢能量可根据NRC出版物Nutrient requirements in swine，ninthrevised edition 1988，subcommittee on swine nutrition，committee on animalnutrition，board of agriculture，national research council.National Academy Press，Washington，D.C.，pp.2-6和the European Table of Energy Values for PoultryFeed-stuffs，Spelderholt centre for poultry research and extension，7361 DABeekbergen，The Netherlands.Grafisch bedrijf Ponsen & looijen bv，Wageningen.ISBN 90-71463-12-5进行计算。

钙、可利用磷和氨基酸在完整动物食物中食用的量，根据饲料表(feedtable)，诸如Veevoedertabel 1997，gegevens over chemische samenstelling，verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen，Central Veevoederbureau，Runderweg 6，8219 pk Lelystad.ISBN 90-72839-13-7进行计算。

在具体的实施方案中，本发明的动物饲料组合物包含至少一种蛋白或蛋白来源，如上面定义的。它也可通常以0-25％的含量包含动物蛋白，诸如肉和骨粉和/或鱼粉。

在又一个具体的实施方案中，本发明的动物饲料组合物包含0-80％玉蜀黍；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％大麦；和/或0-30％燕麦；和/或0-40％大豆粉；和/或0-25％鱼粉；和/或0-25％肉和骨粉；和/或0-20％乳清(whey)。

动物食物可，例如作为糊状物饲料(非颗粒状的(non pelleted))或颗粒状饲料(pelleted feed)产生。通常，将磨碎了的饲料材料混合，并根据所述物种的说明书添加足够量的基本的维生素和矿物。酶可以作为固体或液体的酶剂型(enzyme formulations)添加。例如，固体酶剂型通常在混合步骤之前或其过程中加入；而液体酶制剂通常在造粒步骤之后加入。所述的酶也可被整合到饲料添加剂或预混物中。

食物中的终酶浓度在0.01-200mg酶蛋白每kg食物的范围之内，例如在0.5-25mg酶蛋白每kg动物食物的范围内。

所述的蛋白酶当然应该以有效量应用，即足够改善溶解性和/或改善饲料的营养值的量。目前可以预期，所述的酶以下列含量(剂量范围)的一种或多种给予：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-.00；10-100；0.05-50；或0.10-10-所有这些范围的单位是mg蛋白酶酶蛋白每kg饲料(ppm)。

为了确定mg酶蛋白每kg饲料，从所述的饲料组合物中纯化所述的蛋白酶，并用相关的分析方法测定纯化的蛋白酶的比活性(参见蛋白酶活性、底物和分析方法)。所述饲料组合物的蛋白酶活性同样也应用相同的分析方法进行测定，并基于这两种测定计算mg酶蛋白每kg饲料的剂量。

在饲料添加剂中确定mg酶蛋白每kg饲料应用同样的原理。当然，如果可以得到用于制备所述饲料添加剂活所述饲料的蛋白酶的样品，就可以从这个样品(不需要从所述饲料组合物或所述的添加剂中纯化所述的蛋白酶)测定比活性。

洗涤剂组合物(detergent composition)

可加入本发明的蛋白酶，其因此成为洗涤剂组合物的成分。

本发明的洗涤剂组合物，可被配制为手洗或机洗的洗涤剂组合物，其包括适于预-处理弄脏的纤维织物的洗衣添加剂组合物，和漂洗加入的织物柔软剂组合物，或被配制为洗涤剂组合物，用于一般的家庭硬面的清洁操作，或被配制用于手洗或机洗碗碟的操作。

在具体的方面，本发明提供了含有本发明的蛋白酶的洗涤剂添加剂。所述的洗涤剂添加剂，以及所述的洗涤剂组合物可包括一种或多种其他的酶，如另一种蛋白酶，如来自芽孢杆菌的碱性蛋白酶、脂肪酶、cutinase、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶(pectinase)、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶(galactanase)、木聚糖酶、氧化酶，例如，漆酶和/或过氧化物酶。

通常，所选择的酶的性质应该与所选择的洗涤剂相适应，(即最适pH，与其他的酶成份和非-酶成份等相适应，而且所述的酶应以有效量存在。

合适的脂肪酶包括那些细菌来源或真菌来源的。包括化学修饰的或蛋白工程的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(异名嗜热霉属)的脂肪酶，例如来自H.lanuginosa(T.lanuginosus)，如在EP 258068和EP 305216中所描述的，或来自H.insolens，如在WO96/13580中所描述的；假单胞菌脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)、P.wisconsinensis(WO96/12012)；芽孢杆菌脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(Dartois et al.(1993)，Biochemica et Biophysica Acta，1131，253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(JP64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO 91/16422)。其他实例为蛋白酶变体如那些在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260105、WO95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO95/22615、WO 97/04079和WO 97/07202中所描述的。优选的商业可得到的脂肪酶包括Lipolase^TM和Lipolase Ultra^TM(Novozymes A/S)。合适的淀粉酶(alpha-和/或beta-)包括那些细菌来源或真菌来源的。包括化学修饰的或蛋白工程的突变体。蛋白酶包括，例如，从芽孢杆菌得到的alpha-淀粉酶，例如地衣芽孢杆菌的具体菌株，在GB 1,296,839中详述。有用的淀粉酶的实例为在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 95/26397、WO96/23873、WO 97/43424、WO 00/60060和WO 01/66712中描述的变体，尤其是在一个或多个如下位点具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。商业上可得到的淀粉酶是Natalase^TM、Supramyl^TM、Stainzyme^TM、Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM和BAN^TM(Novozymes A/S)，Rapidase^TM和Purastar^TM(来自genencor International Inc.)。

合适的纤维素酶包括那些细菌来源或真菌来源的。包括化学修饰的或蛋白工程的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如由Humicola insolens、Myceliophthora thermophila和尖镰孢产生的在US 4,435,307、US 5,648,263、US 5,691,178、US 5,776,757和WO 89/09259中公开的真菌纤维素酶。特别合适的纤维素酶是具有颜色养护(colour care)益处的碱性或中性的纤维素酶。这样的纤维素酶的实例为在EP 0 495257、EP 531372、WO 96/11262、WO96/29397、WO98/08940中描述的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，如那些在WO 94/07998，EP 0 531 315、US 5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307和WO 99/01544中所描述的。商业上可得到的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(Novozymes A/S)，Clazinase^TM和Puradax HA^TM(genencor International Inc.)和KAC-500(B)^TM(KaoCorporation)。

合适的过氧化物酶/氧化酶包括那些植物、细菌或真菌来源的。包括化学修饰的或蛋白工程的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)的过氧化物酶，例如来自灰盖鬼伞(C.cinereus)及其变体，如那些在WO 93/24618、WO 95/10602和WO 98/15257中所描述的。商业上可得到的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(Novozymes)。

所述的洗涤剂酶可通过加入含有一种或多种酶的独立的添加剂，或通过加入包含所有所述酶的组合的添加剂，包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即独立的添加剂或组合的添加剂，可以配制为，例如颗粒、液体、浆体(slurry)等。优选的洗涤剂添加剂配制为颗粒，尤其是非-粉化的(non-dusting)颗粒，液体，尤其是稳定的液体，或浆体。

非-粉化的颗粒可以，例如，如在US 4,106,991和4,661,452中所公开的进行制备，并可以任意地通过本技术领域公知的方法进行包覆(coat)。蜡质包覆材料(waxy coating material)的实例是具有1000至20000的平均分子量的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇(polyethyleneglycol)，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化的壬基酚(ethoxylated nonylphenols)；乙氧基化的脂肪醇，其中所述的醇包含12至20个碳原子，而且其中有15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇类；脂肪酸；和脂肪酸的甘油单酯和甘油二酯和甘油三酯。适于以流化床技术应用的成膜包覆材料(film-forming coating material)的实例在GB1483591中给出。液体酶制剂可，例如，根据已建立的方法，通过添加多元醇(polyol)，如丙二醇(propylene glycol)，糖或糖醇(sugar alcohol)，乳酸或硼酸(boric acid)稳定化。保护的酶可根据在EP 238216中公开的方法进行制备。

本发明的洗涤剂组合物可为任何方便的形式，例如，条、片、粉、颗粒、糊或液体。液体洗涤剂可为水性的，通常包含多至70％的水和0-30％的有机溶剂；或为非-水性的。

所述的洗涤剂组合物包含一种或多种表面活性剂(surfactant)，其为非-离子的，包括半-极性的(semi-polar)和/或阴离子的和/或阳离子的和/或两性离子的(zwitterionic)。所述的表面活性剂通常以0.1％至60％(按重量计算)的水平存在。

当在其中包含时，所述的洗涤剂通常包含大约1％至大约40％的阴离子表面活性剂，诸如线状的烷基苯磺酸盐(linear alkylbenzenesulfonate)、alpha-烯烃磺酸盐(alpha-olefinsulfonate)，烷基硫酸酯(alkyl sulfate)(脂肪醇硫酸酯(fatty alcohol sulfatfate))，醇乙氧基硫酸酯(alcohol ethoxysulfate)，仲烷基磺酸盐(secondary alkanesulfonate)，alpha-磺基脂肪酸甲酯(alpha-sulfo fatty acid methylester)，烷基-或烯基丁二酸(alkenylsuccinic acid)或肥皂。

当在其中包含时，所述的洗涤剂通常包含大约0.2％至大约40％的非-离子表面活性剂，诸如醇乙氧基化合物，壬基酚乙氧基化合物(nonyl phenolethoxylate)，烷基聚糖苷(alkyl polyglycoside)，烷基二甲基氧化胺(alkyldimethylamineoxide)，乙氧化的脂肪酸单乙醇酰胺(ethoxylated fatty acidmonoethanolamide)，脂肪酸单乙醇酰胺(fatty acid monoethanolamide)，多羟基化的烃基脂肪酸酰胺(polyhydroxy alkyl fatty acid amide)，或葡糖胺(glucosamine)(“葡糖酰胺(glucamides)”)的N-酰基N烃基(N-acyl N-alkyl)衍生物。

所述的洗涤剂可包含0-65％的洗涤增效助剂(detergent builder)或络合剂(complexing agent)，诸如沸石(zeolite)，二磷酸盐(diphosphate)，三磷酸盐(triphosphate)，膦酸盐(phosphonate)，碳酸盐(carbonate)，柠檬酸盐(citrate)，氮川三乙酸(nitrilotriacetic acid)，以二胺四乙酸(ethylenediaminetetraaceticacid)，二次乙基三胺五乙酸(diethylenetriaminepentaacetic acid)，烷基-或烯基丁二酸，可溶性的硅酸盐(silicate)或层状硅酸盐(例如来自Hoechst的SKS-6)。

所述的洗涤剂可包括一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素(carboxymethylcellulose)，聚(乙烯砒咯烷酮)(poly(vinylpyrrolidone))，聚(乙二醇)(poly(ethylene glycol))，聚(乙烯醇)(poly(vinyl alcohol))，聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(poly(vinylpyridine-N-oxide))，聚(乙烯咪唑)(poly(vinylimidazole))，聚羧酸酯(polycarboxylates)，诸如聚丙烯酸酯(polyacrylate)，马来酸/丙烯酸共聚物(maleic/acrylic acid copolymet)和十二烷基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物(lauryl methacrylate/acrylic acid copolymer)。

所述的洗涤剂可包含漂白装置(bleaching system)，所述漂白装置可包括H₂O₂源，诸如过硼酸盐(perborate)或过碳酸盐(percarbonate)，其可与形成过酸的漂白活化剂(peracid-forming bleach activator)，如四乙酰乙二胺(tetraacetylethylenediamine)或壬酰氧基苯磺酸酯(nonanoyloxybenzenesulfonate)。可替换地，所述漂白装置可包括例如酰胺类、酰亚胺类或砜类的过氧酸。

本发明的洗涤剂组合物的酶可应用常规的稳定剂进行稳定化，所述的稳定剂，例如，多元醇如丙二醇或甘油，糖或糖醇，乳酸，硼酸或硼酸衍生物，例如，芳香族的硼酸酯(aromatic borate ester)或苯基硼酸衍生物如4-甲酰苯基(formylphenyl)硼酸，而所述的组合物可例如在WO 92/19709和WO 92/19708中所描述的进行配制。

所述的洗涤剂也可含有其他常规洗涤剂成分，例如纤维调节剂(fabricconditioners)包括粘土(clay)，发泡剂(foam booster)，抑泡剂(suds suppressor)，防腐蚀剂(anti-corrosion agent)，悬污剂(soil-suspending agent)，抗污垢再沉积试剂(anti-soil redeposition agent)，染料(dye)，杀菌剂(bactericide)，荧光增白剂(optical brightener)，助水溶物(hydrotrope)，晦暗抑制剂(tamish inhibitor)或香料(perfume)。

目前可以预期，在所述的洗涤剂组合物中，任何酶，尤其是本发明的酶可以以相应于0.0l-100mg的酶蛋白每升洗涤液(wash liquor)的量加入，优选0.05-5mg的酶蛋白每升洗涤液，尤其是0.1-1mg的酶蛋白每升洗涤液。

本发明的酶可附加地并入WO 97/07202中公开的洗涤剂配方中。

生物材料的保藏

如下的生物材料已经根据布达佩斯条约在DSMZ(Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，MascheroderWeg 1b，D-38124Braunschweig，Germany)进行了保藏，并提供了如下的登记号(accessionnumbers)：

保藏物(Deposit) 保藏登记号保藏日期(Date of Deposit)

Nocardiopsis alba DSM 15647 May 30，2003

Nocardiopsis sp. DSM 16424 May 24，2004

这些菌株已在确保在这样的条件下得到保藏，所述条件为确保在本专利申请在未决(pendency)的过程中，由Commissioner of Patents and Trademarks所确定的人根据37C.F.R.§1.14和35U.S.C.§122有权得到所述的培养物。所述的保藏物代表被保藏的菌株的基本纯的培养物。所述的保藏物在提交这些申请的副本(counterpart)或其后续文件的国家按照该外国专利法所要求是可以得到的。然而，应该理解的是，保藏物的获得不构成实施本发明的许可，实施本发明将侵权由政府行为所授予的专利权。

Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235可公开地从DSMZ获得。它也在如下其他保藏机构保藏：ATCC 23219、IMRU 1250、NCTC 10489。

在此描述并要求的本发明不受限于在此公开的具体实施方案的范围内，因为这些实施方案旨在作为本发明的某些方面的说明。任何等同的实施方案确定地包含在本发明的范围内。实际上，除去在这里显示和描述的之外，对本发明前述的说明书的各种更改，对于本领域的那些技术人员是显而易见的。这样的更改也确定地落在附加的权利要求的范围内。在有冲突的情况下，以包含定义的本说明书为准。

在此引用各种参考文献，其公开整体地并入作为参考。

实施例

实施例1：克隆和表达来自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvilleiDSM 43235的蛋白酶

试剂和培养基

LB琼脂在Ausubel，F.M.et al.(eds.)″Current protocols inMolecular Biology″.John Wiley和Sons，1995中描述

LB-PG琼脂 LB琼脂中添加0.5％葡萄糖和0.05M磷酸钾，pH7.0

PS-1 10％蔗糖，4％大豆粉，1％Na₃PO₄-12H₂O，0.5％CaCO₃，和0.01％聚氧丙烯酸(pluronic acid)

TE 10mM Tris-HCl，pH7.4 1mM EDTA，pH8.0

TEL 50mg/ml Lysozym in TE-缓冲液

Thiocyanate 5M硫氰酸胍(guanidium thiocyanate)

100mM EDTA

0.6％w/v N-十二烷基肌氨酸(N-laurylsarcosine)，钠盐

60g硫氰酸盐，20ml 0.5M EDTA，pH8.0，20ml H₂O在65℃溶解。冷却到室温(RT)并加入0.6g N-十二烷基肌氨酸。加H₂O至100ml并用0.2μ无菌过滤器过滤。

NH₄Ac 7.5M CH₃COONH₄

TER 1μg/ml Rnase A在TE-缓冲液中

CIA 氯仿/异戊醇24∶1

实验步骤

SEQ ID NO：1是编码来自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM43235的蛋白酶的前形式(proform)的DNA序列。核苷酸499-1062对应于成熟肽编码部分。

SEQ ID NO：2是SEQ ID NO：1的推导出的氨基酸序列。氨基酸-166至-1为所述的前肽，而氨基酸1至188为成熟肽。

克降SEQ ID NO：1

将野生型在如下的培养基中在30℃生长3天，然后收获：

Trypticase 20g

酵母提取物 5g

氯化铁(Ferro chloride) 6mg

硫酸镁(Magnesiumsulfate) 15mg

加蒸馏水 1000ml

通过加入氢氧化钠调整pH至7.2

来自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235的基因组DNA按照如下步骤进行分离：

1.收获1.5ml培养物并重悬于100μl TEL中。在37℃温育30分钟。

2.加入500μl硫氰酸盐缓冲液，并在室温放置10分钟。

3.加入250μl NH₄Ac并在冰上放置10分钟。

4.加入500μl CIA并混合。

5.转移至离心管中，并以全速旋转10分钟。

6.将上清转移到新的Eppendorf管中，并加入0.54体积的冷异丙醇。充分混合。

7.用70％EtOH离心并洗涤DNA沉淀。

8.将基因组DNA在100μl TER中重悬。

所述的基因组DNA用作采用下面的引物SEQ ID NOS.3和4进行PCR扩增的模板。所述的PcR片段在0.7％琼脂糖凝胶上分离，并以限制性酶ClaI和BamH I消化。引物1565(SEQ ID NO：4)通过将精氨酸密码子从CGG变为AGA破坏BamH I位点并在终止密码子的下游引入新的BamH I位点。

引物：

1423：5′-GCT TTT AGT TCA TCG ATC GCA TCG GCT GCT CCG GCCCCC GTC CCC CAG-3′(SEQ ID NO：3)

1565：5′-GCG GAT CCT ATT AGG TTC TGA TCC TGA CAC CCC AG-3′(SEQ ID NO：4)

消化并纯化的PCR片段与Cla I和BamH I消化的质粒pDG268NeoMCS-PramyQ/PrcryIII/cryIIIAstab/Sav连接(美国专利：5,955,310)。

连接混合物被用于转化入大肠杆菌TOP10F′(Invitrogen BV，TheNetherlands)，并筛选若干菌落用于小量制备(miniprep)(QIAprep spin，QIAGEN GmbH，Germany)。在转化入源自枯草芽孢杆菌DN 1885具有破坏的apr、npr和pel基因的枯草芽孢杆菌的菌株之前，检查纯化的质粒的插入片段(Diderichsen et al(1990)，J.Bacteriol.，172，4315-4321)。基本如“枯草芽孢杆菌和其他革兰氏-阳性细菌”American Society for Microbiology，p.618，eds.A.L.Sonenshein，J.A.Hoch和Richard Losick(1993)中所描述的进行所述的破坏。转化的细胞涂布在，添加6μg/ml氯霉素(chloramphenicol)的1％脱脂乳LB-PG琼脂平板上。将涂布于平板的细胞在37℃温育过夜，而含蛋白酶的菌落通过周围的清楚区(clearing zone)进行鉴定。筛选蛋白酶-阳性菌落，并通过DNA序列分析确认由表达构建体表达的酶的编码序列。

发酵

如上面的描述转化的枯草芽孢杆菌宿主细胞在旋转摇床(rotary shakingtable)(250r.p.m.)上，在含有加入6μg/ml氯霉素的100ml PS-1培养基的500ml带挡板的Erlenmeyer摇瓶中，在37℃发酵16个小时，并在26℃再发酵4天。

实施例2：纯化并表征来自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvilleiDSM 43235的蛋白酶

蛋白酶测定

1)pNA测定：

pNA底物：Suc-AAPF-pNA(Bachem L-1400)

温度：室温(25℃)

测定缓冲液：100mM丁二酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCABS，1mM CaCl₂，150mm KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节pH值2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0。

将20μl蛋白酶(在0.01％Triton X-100中稀释)与100μl测定缓冲液混合。通过加入100μl pNA底物(50mg溶于1.0ml DMSO并进一步用0.01％的TritonX-100稀释45×)开始所述的测定。监测OD₄₀₅的增加作为蛋白酶活性的测量方法。

2)Protazyme AK测定：

底物：Protazyme AK tablet(交联的和染色的酪蛋白；来自Megazyme)

温度：控制的(测定温度)。

测定缓冲液：100mM丁二酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mMCABS，1mM CaCl₂，150mm KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节pH值2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0。

将Protazyme AK片通过轻微搅动重悬于2.0ml 0.01％Triton X-100中。500μl此重悬液和500μl测定缓冲液混合于Eppendorf管，并置于冰上。加入20μl蛋白酶样品(稀释于0.01％TritonX-100中)。通过将所述的Eppendorf管转移到设置为测定温度的Eppendorf热混合器(thermomixer)中启动该测定摇振。将所述的管在Eppendorf热混合器中在其最高摇振速率保温15分钟。所述的保温通过将所述的管重新转移到冰浴中。然后，将所述的管在冰冻的离心机中离心几分钟，并将200μl上清转移至微孔板(microtiterplate)上。读取OD₆₅₀作为蛋白酶活性的测定方法。缓冲液遮蔽物包含在本测定中(替代酶)。

实验步骤

实施例1中描述的蛋白酶发酵进行离心(20000×g，20分钟)，并小心地从沉淀中轻轻倒出上清。合并的上清通过Seitz EKS板过滤以去除剩余的芽孢杆菌宿主细胞。将EKS过滤物转移到50mM H₃BO₃，5mM丁二酸，1mM CaCl₂，pH7的G25 sephadex柱上，并应用于在同样的缓冲液中平衡的杆菌肽硅柱(bacitracin silica column)。充分用平衡缓冲液洗涤该柱子之后，以100mMH₃BO₃，10mM丁二酸，2mM CaCl₂，1M NaCl，25％异丙醇，pH7分步洗脱(step-eluted)所述的蛋白酶。将杆菌肽洗脱物转移到50mM H₃BO₃，10mMCH₃COOH，1mM CaCl₂，pH4.5中，并应用于在同样的缓冲液中平衡的Ssepharose HP柱。充分用平衡缓冲液洗涤该柱子之后，以同样缓冲液中的线性NaCl梯度(0-->0.5M)洗脱所述的蛋白酶。分析来自该柱子的级分的蛋白酶活性(采用在37℃和pH9的Protazyme AK测定)，并进一步通过SDS-PAGE分析活性级分。只有一个条带显示在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上的级分，作为纯化的制备物收集，并用于进一步的表征。

pH-活性、pH-稳定性和温度-活性

所述的pNA测定用于获得pH-活性分布图，以及pH-稳定性分布图。对于pH-稳定性分布图，所述的蛋白酶在测定缓冲液中稀释10×并在37℃温育2个小时。温育之后，在测定残余活性之前，通过在pH9的测定缓冲液中稀释，将所述的蛋白酶样品转移到同样的pH-pH9。Protazyme AK测定用于在pH9获得温度-活性分布图。结果在下面的表1-3中显示。

表1：pH-活性分布图

pH	源自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235的蛋白酶	源自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶
pH	源自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235的蛋白酶	源自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶	2	0.00	-
3	0.00	0.00	2	0.00	-
3	0.00	0.00	4	0.03	0.02
5	0.11	0.07	4	0.03	0.02
5	0.11	0.07	6	0.21	0.21
7	0.37	0.44	6	0.21	0.21
7	0.37	0.44	8	0.71	0.67
9	0.97	0.88	8	0.71	0.67
9	0.97	0.88	10	1.00	1.00
11	0.94	0.93	10	1.00	1.00

表2：pH-稳定性分布图

pH	源自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235的蛋白酶	源自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶
pH	源自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235的蛋白酶	源自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶	2.0	1.00	0.78
2.5	0.95	1.00	2.0	1.00	0.78
2.5	0.95	1.00	3.0	0.97	1.03
3.5	1.01	0.98	3.0	0.97	1.03
3.5	1.01	0.98	4.0	0.98	0.99
5.0	0.97	1.02	4.0	0.98	0.99
5.0	0.97	1.02	6.0	0.98	1.00
7.0	0.96	1.01	6.0	0.98	1.00
7.0	0.96	1.01	8.0	0.99	0.98
9.0	0.99	0.99	8.0	0.99	0.98
9.0	0.99	0.99	10.0	0.96	0.99
11.0	0.94	0.86	10.0	0.96	0.99
11.0	0.94	0.86	12.0	0.84	-
9.0且在5℃2小时之后	1.00	1.00	12.0	0.84	-

表3：温度-活性分布图

温度(℃)	源自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235的蛋白酶	源自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶
温度(℃)	源自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235的蛋白酶	源自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶	15	0.08	0.02
25	0.01	0.02	15	0.08	0.02
25	0.01	0.02	37	0.03	0.07
50	0.09	0.20	37	0.03	0.07
50	0.09	0.20	60	0.19	0.51
70	0.63	1.00	60	0.19	0.51
70	0.63	1.00	80	1.00	0.39
90	0.35	-	80	1.00	0.39

差示扫描量热法(DSC)

采用DSC确定源自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235和Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶在pH7.0的温度稳定性。纯化的蛋白酶在4℃对于10mM磷酸钠，50mM氯化钠，pH7.0进行过夜透析，并以1.5℃/min的恒定扫描速率从20至100℃在VP-DSC仪器(Micro Cal)上运行。应用MicroCal Origin软件进行数据处理。

得到的变性温度或解链温度，T_m′s，为：对于源自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei的本发明的蛋白酶为83.0℃；对于源自Nocardiopsis sp.NRRL18262的蛋白酶为：76.5℃。

其他特性

发现所述的蛋白酶被苯甲磺酰氟(Phenyl Methyl Sulfonyl Fluoride)抑制。其通过SDS-PAGE确定的相对分子量为Mr＝20kDa，且N-末端序列为：ADIIGGLAYYMGGRC。

实施例3：Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235蛋白酶在单胃的体外消化模型中的性能

具有SEQ ID NO：2的蛋白酶成熟部分的纯化的制备物(如实施例1和2中描述的进行制备)，其性能在模拟单胃动物消化的体外模型中进行了测定。具体地，检测了所述的蛋白酶改善溶解和消化玉米/-SBM(玉米/-大豆粉)蛋白质的能力。在下表中，此蛋白酶被称为“本发明的蛋白酶”。所述的体外系统由15个摇瓶组成，在所述的摇瓶中玉米/-SBM底物起初与HCl/胃蛋白酶一起温育-模拟胃的消化-并随后与胰酶一起温育-模拟肠的消化。所述摇瓶中的10个在胃阶段开始时以蛋白酶配制，然而剩余的摇瓶作为空白。在肠的温育阶段的结尾，移出体外消化的样品并分析溶解的和消化的蛋白。

体外消化方法概要

加入的成分	pH	温度	时间	模拟的消化阶段
加入的成分	pH	温度	时间	模拟的消化阶段	10g玉米/-SBM底物(6∶4)，41ml HCl(0.105M)	3.0	40℃	t＝0min	混合
5ml HCl(0.105M)/胃蛋白酶(3000U/g底物)，1mL本发明的蛋白酶	3.0	40℃	t＝30min	胃的消化	10g玉米/-SBM底物(6∶4)，41ml HCl(0.105M)	3.0	40℃	t＝0min	混合
5ml HCl(0.105M)/胃蛋白酶(3000U/g底物)，1mL本发明的蛋白酶	3.0	40℃	t＝30min	胃的消化	16ml H₂O	3.0	40℃	t＝1.0小时	胃的消化
7ml NaOH(0,39M)	6.8	40℃	t＝1.5小时	肠的消化	16ml H₂O	3.0	40℃	t＝1.0小时	胃的消化
7ml NaOH(0,39M)	6.8	40℃	t＝1.5小时	肠的消化	5ml NaHCO₃(1M)/胰酶(pancreatin)(8mg/g食物)	6.8	40℃	t＝2.0小时	肠的消化
终止温育	7.0	40℃	t＝6.0小时		5ml NaHCO₃(1M)/胰酶(pancreatin)(8mg/g食物)	6.8	40℃	t＝2.0小时	肠的消化

条件

底物： 4g SBM，6g玉米(预混的)

pH： 3.0胃步骤/6.8-7.0肠步骤

HCl： 0.105M进行1.5小时(即30分钟HCl-底物预混合)

胃蛋白酶： 3000U/g食物进行1小时

胰酶： 8mg/g食物进行4小时

温度： 40℃

重复： 5

溶液

0.39M NaOH

0.105M HCl

0.105M HCl每5ml含有6000U胃蛋白酶

1M NaHCO₃每ml含有16mg胰酶

125mM NaAc-缓冲液，pH6.0

测定酶蛋白

蛋白酶酶蛋白的量(在下文中，酶蛋白简写为EP)根据A₂₈₀值和氨基酸序列(氨基酸组成)，应用在S.C.Gill & P.H.von Hippel，Analytical Biochemistry182，319-326，(1989)中概括的原理进行计算。

体外模型的实验步骤

所述的实验步骤按照上述的概述进行。在1、2.5和5.5小时测定pH。温育在6小时之后终止，移出30ml的样品并在离心(10000×g，10min，4℃)前置于冰上。移出上清并贮藏于-20℃。

分析

所有样品用OPA方法分析蛋白的％程度，以及用凝胶过滤分析溶解的和消化的蛋白的含量。

通过OPA-方法测定DH

不同样品中的蛋白的水解程度(DH)应用半-自动化的微孔板根据比色法测定(Nielsen，P.M.；Petersen，D.；Dambmann，C.Improved method fordetermining food protein degree of hydrolysis.J.Food Sci.2001，66，642-646)。所述的OPA试剂如下制备：7.620g di-Na四硼酸盐十水合物和200mg十二烷基硫酸钠(sodiumdodecyl sulphate)(SDS)溶于150ml去离子水中。在继续之前将所述的试剂完全溶解。将160mg邻苯二醛(o-phthal-dialdehyde)97％(OPA)溶于4ml乙醇中。将所述的OPA溶液通过用去离子水洗涤定量地转移到上述的溶液中。将176mg二硫苏糖醇(dithiothreitol)99％(DTT)加入用去离子水定容至200ml的溶液中。丝氨酸标准品(0.9516 meqv/I)通过在500ml去离子水中溶解50mg丝氨酸(Merck，Germany)来制备。

样品溶液通过将每个样品稀释到吸光度(280nm)大约0.5来制备。通常地，上清采用自动化的Tecan dilution station(Mannedorf，Switzerland)进行稀释(100×)。所有其他的分光光度计读数在340nm进行，采用去离子水作为对照。将25μl的样品、标准品和遮蔽物配制到微孔板中。将所述的微孔板插入EMSMF读数器(Labsystems，Finland)，并自动地配制200μl的OPA试剂。在测定吸光度之前，振荡微孔板(2分钟；700rpm)。最后计算DH。所有的样品进行八次测定。

估测溶解的和消化的蛋白

来自体外消化的样品的的上清中溶解的蛋白的含量，通过应用凝胶过滤HPLC定量粗蛋白(CP)进行估测。将上清融化，通过0.45μm聚碳酸酯(polycarbonate)过滤器过滤并用H₂O稀释(1∶50，v/v)。稀释的样品通过HPLC应用Superdex Peptide PE(7.5×300mm)凝胶过滤柱(Global)进行层析。用于等度洗脱(isocratic elution)的洗脱剂为含有150mM NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)。每次操作的洗脱剂的总体积为26ml而且流速为0.4ml/min。洗脱外廓线在214nm记录，并通过积分确定所述外廓线下的总面积。为了估测积分面积的蛋白含量，由具有已知总蛋白含量的体外消化的参比玉米/-SBM样品的系列稀释物，产生校正曲线(R²＝0.9993)。在此参比样品中检测所述的蛋白采用Kjeldahl方法进行(测定％氮；A.O.A.C.(1984)Official Methods ofAnalysis 14th ed.，Washington DC)。

消化的蛋白的含量通过积分对应于具有1500Dalton或1500Dalton以下的多肽和氨基酸的色谱图面积进行估测(Savoie，L.；Gauthier，S.F.Dialysis CellFor The In-vitro Measurement Of Protein Digestibility.J.Food Sci.1986，51，494-498；Babinszky，L.；Van，D.M.J.M.；Boer，H.；Den，H.L.A.An In-vitroMethod for Prediction of The Digestible Crude Protein Content in Pig Feeds.J.Sci.Food Agr.1990，50，173-178；Boisen，S.；Eggum，B.O.Critical Evaluation ofInvitro Methods for Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animals.Nutrition Research Reviews 1991，4，141-162)。为了确定所述的1500Dalton分界线，凝胶过滤柱采用细胞色素C(Boehringer，Germany)、抑肽酶(aprotinin)、胃泌素1(gastrin I)和P物质(substance P)(Sigma Aldrich，USA)作为分子量标准进行校准。

结果

在表4和5中显示的结果说明，所述的蛋白酶使水解程度(DH)，以及可溶的和可消化的蛋白显著地增加。

表4

水解程度(DH)，绝对值和相对值

酶(mg EP/kg饲料的剂量)	n	总蛋白的			相对于空白
		总蛋白的			相对于空白			％DH		SD	％DH		％CV
		空白	5	26.84	a	0.69	100.0	％DH		SD	％DH		％CV	a	2.57
本发明的蛋白酶(100)	5	空白	5	26.84	a	0.69	100.0	28.21	b	0.35	105.1	b	1.25	a	2.57

同一栏中不同的字母表示显著的差异(1-way ANOVA，Tukey-Kramer检验，P＜0.05)。SD＝标准偏差(Standard Deviation)。％CV＝方差系数(Coeffieient of Variance)＝(SD/平均值)×100％

表5

通过KTA HPLC测定溶解的和消化的粗蛋白

酶(mgEP/kg饲料的剂量)	n	总蛋白的						相对于空白
		总蛋白的						相对于空白						％dig.CP		SD	％sol.CP		SD	％dig.CP		％CV	％sol.CP		％CV
		空白	5	54.1	a	1.1	90.1	a	1.1	100.0	a	2.0	100.0	％dig.CP		SD	％sol.CP		SD	％dig.CP		％CV	％sol.CP		％CV	a	1.2
本发明的蛋白酶(50)	5	空白	5	54.1	a	1.1	90.1	a	1.1	100.0	a	2.0	100.0	57.7	b	1.1	93.2	b	1.4	106.7	b	1.9	103.4	b	1.5	a	1.2
本发明的蛋白酶(50)	5	(100)	5	58.9	b	0.8	94.8	b	0.9	108.9	b	1.3	105.2	57.7	b	1.1	93.2	b	1.4	106.7	b	1.9	103.4	b	1.5	b	0.9

同一栏中不同的字母表示显著的差异(l-way ANOVA，Tukey-Kramer检验，P＜0.05)。SD＝标准偏差。％CV＝方差系数＝(SD/平均值)×100％

实施例4：来自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235的蛋白酶在溶液培养体外模型中的性能

在实施例3中描述的蛋白酶制剂，在模拟冷水鱼消化的溶液培养体外模型中检测。所述的体外系统由15个摇瓶组成，在所述的摇瓶中SBM底物起初与HCl/胃蛋白酶一起温育-模拟胃的消化，并随后与胰酶一起温育-模拟肠的消化。所述摇瓶中的10个在胃阶段开始时以蛋白酶配制，然而剩余的5个摇瓶作为空白。在肠的温育阶段的结尾，移出体外消化的样品并分析溶解的和消化的蛋白。

体外消化方法概要

加入的成分	pH	温度	时间	模拟的消化阶段
加入的成分	pH	温度	时间	模拟的消化阶段	10g挤压的SBM底物，62ml HCl(0.155M)/胃蛋白酶(4000U/g底物)，1mL本发明的蛋白酶	3.0	15℃	t＝0min	胃的消化
7ml NaOH(0,39M)	6.8	15℃	t＝6小时	肠的消化	10g挤压的SBM底物，62ml HCl(0.155M)/胃蛋白酶(4000U/g底物)，1mL本发明的蛋白酶	3.0	15℃	t＝0min	胃的消化
7ml NaOH(0,39M)	6.8	15℃	t＝6小时	肠的消化	5ml NaHCO₃(1M)/胰酶(8mg/g食物)	6.8	15℃	t＝7小时	肠的消化
终止温育	7.0	15℃	t＝24小时		5ml NaHCO₃(1M)/胰酶(8mg/g食物)	6.8	15℃	t＝7小时	肠的消化

条件

底物： 10g挤压的SBM

pH： 3.0胃步骤/6.8-7.0肠步骤

HCl： 0.155M进行6小时

胃蛋白酶： 4000U/g食物，进行6小时

胰酶： 8mg/g食物，进行17小时

温度： 15℃

重复： 5

溶液

0.39M NaOH

0.105M HCl

0.155M HCl/胃蛋白酶(6000U/g食物)

1M NaHCO₃每ml含有16mg胰酶

125mM NaAc-缓冲液，pH6.0

溶液体外模型的实验步骤

所述的实验步骤按照上述的概述进行。在1、5、8和23小时测定pH。温育在24小时之后终止，移出30ml的样品并在离心(13000×g，10min，0℃)前置于冰上。移出上清并贮藏于-20℃。

分析

所有上清用OPA方法分析(水解的％程度)，并通过KTA HPLC确定溶解的和消化的蛋白(参见单胃的实施例)。

以EASY SPE柱预-处理体外上清

在KTA HPLC分析之前，来自体外系统的上清采用固-相样品纯化进行预处理。这个处理用于改善色谱，并由此防止不稳定的洗脱曲线(profile)和基线。用于提取的柱子是固相提取柱(来自Macherey-Nagel的Chromabond EASYSPE柱)。将2mL milliQ水通过应用真空室(vacuum chamber)(vacuum 0.15×100kPa)通过所述的柱子洗脱。随后，将3mL体外样品配制到柱子上，并洗脱(真空0.1×100kPa)，将最初的1/2mL的洗脱样品弃去并将一个洁净的管置于柱子下，然后洗脱并保存剩余的样品用于进一步的稀释。

结果

下面在表6和7中显示的结果说明，所述的蛋白酶使水解的程度和蛋白可消化性(digestibility)显著地增加。

表6：水解程度(DH)

酶(mg EP/kg食物)	n	总蛋白的			相对于空白
		总蛋白的			相对于空白			％DH		SD	％DH		％CV
		空白	5	21.30	a	0.52	100.0	％DH		SD	％DH		％CV	a	2.42
本发明的蛋白酶(100)	5	空白	5	21.30	a	0.52	100.0	21.98	b	0.22	103.2	b	1.00	a	2.42

同一栏中不同的字母表示显著的差异(1-way ANOVA，Tukey-Kramer检验，P＜0.05)。SD＝标准偏差。％CV＝方差系数＝(SD/平均值)×100％

表7：溶解的和消化的粗蛋白

酶(mgEP/kg食物)	n	总蛋白的						相对于空白
		总蛋白的						相对于空白						％dig.CP		SD	％sol.CP		SD	％dig.CP		％CV	％sol.CP		％CV
		空白	5	50.0	a	2.2	89.9	a	3.2	100.0	a	4.5	100.0	％dig.CP		SD	％sol.CP		SD	％dig.CP		％CV	％sol.CP		％CV	a	3.5
本发明的蛋白酶(50)	5	空白	5	50.0	a	2.2	89.9	a	3.2	100.0	a	4.5	100.0	52.3	b	1.1	91.4	a	1.5	104.8	b	2.1	101.7	a	1.6	a	3.5

(100)

5

53.4

b

0.4

91.6

a

1.0

107.0

b

0.7

101.9

a

1.1

同一栏中不同的字母表示显著的差异(1-way ANOVA，Tukey-Kramer检验，P＜0.05)。

SD＝标准偏差。％CV＝方差系数＝(SD/平均值)×100％

实施例5：构建枯草芽孢杆菌菌株L2、L2HV0和L2HV1

也制备了蛋白酶的两个“尾部(Tail)”变体(具有C-末端延伸)，所述的蛋白酶具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-188的氨基酸序列。在下文中称为L2 HV0的尾部变体在C-末端具有下列8个附加的氨基酸：QSHVQSAP，其具有下列的插在TAA终止密码子之前的DNA序列延伸(在SEQ ID NO：1的核苷酸1059和1060之间)：

5′-CAATCGCATGTTCAATCCGCTCCA-3′(SEQ ID NO：5)

下文中称为L2HV1的尾部变体在C-末端具有下列4个附加的氨基酸：QSAP，其具有下列的插在TAA终止密码子之前的DNA序列延伸(在SEQ IDNO：1的核苷酸1059和1060之间)：

5′-CAATCGGCTCCT-3’(SEQ ID NO：6)

构建了三株枯草芽孢杆菌的菌株：一株携带编码蛋白酶的DNA构建体，所述的蛋白酶具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-188的氨基酸序列，表示为L2，而两株携带分别编码尾部变体L2 HV0和L2 HV1的DNA构建体。这些构建体通过PCR与编码信号肽的DNA融合，所述信号肽来自SAVINASE^TMBacillus clausii(Takami，H.；Kobayashi，T.；Kobayashi，M.；Yamamoto，M.；Nakamura，S.；Aono，R.；Horikoshi，K.；Molecular cloning，nucleotide sequenceand expression of the structural gene for alkaline protease from alkaliphilicBacillus sp.221)Biosci.Biotechnol.Biochem.56：1455(1992)，并通过枯草芽孢杆菌宿主细胞基因组的同源重组成为一体(在实施例1中描述)。所述的基因在三个启动子系统的控制下表达(如在WO 99/43835中描述的)，所述的三个启动子由来自地衣芽胞杆菌alpha-淀粉酶基因(amyL)的启动子、解淀粉芽孢杆菌alpha-淀粉酶基因(amyQ)和包含稳定化序列(stabilizing sequence)的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA启动子。编码氯霉素乙酰转移酶(Chloramphenicol acetyltransferase)的基因被用作标记(在例如Diderichsen，B.；Pulsen，G.B.；Joergensen，S.T.；A useful cloning vector for B.subtilis.Plasmid 30：312(1993)中所描述的)。

在1％脱脂乳LB-PG琼脂平板(添加6μg/ml氯霉素)上，检查氯霉素抗性转化体的蛋白酶活性。通过插入体的DNA测序，进一步分析一些蛋白酶阳性菌落，得到正确的基因DNA序列，并选出每种构建体的一株菌株，称为枯草芽包杆菌L2菌株、枯草芽孢杆菌L2 HV0菌株、枯草芽孢杆菌L2 HV1菌株。

实施例6：枯草芽孢杆菌菌株L2、L2 HV0和L2 HV1的发酵

将三株枯草芽孢杆菌菌株，L2、L2 HV0和L2 HV1，在旋转摇床上，在500ml带挡板的Erlenmeyer摇瓶中发酵，在所述的摇瓶中含有添加6mg/l氯霉素的100ml TY。

三株枯草芽孢杆菌菌株的每株的6个Erlenmeyer摇瓶平行地进行发酵。6个Erlenmeyer摇瓶中的两个在37℃温育(250rpm)，两瓶在30℃温育(250rpm)，而最后两瓶在26℃温育(250rpm)。

在第1天、第2天和第3天从每个摇瓶中取样并分析蛋白水解活性。

表8.37℃的蛋白水解活性

菌株	37℃的相对活性
	37℃的相对活性			第1天	第2天	第3天
	L2	1.0	1.0	第1天	第2天	第3天	1.0
L2-HV1	L2	1.0	1.0	1.4	1.3	1.2	1.0
L2-HV1	L2-HV0	1.3	1.1	1.4	1.3	1.2	1.4

表9.30℃的蛋白水解活性

菌株	30℃的相对活性
	30℃的相对活性			第1天	第2天	第3天
	L2	1.0	1.0	第1天	第2天	第3天	1.0
L2-HV1	L2	1.0	1.0	1.0	1.2	1.4	1.0
L2-HV1	L2-HV0	1.1	1.3	1.0	1.2	1.4	1.3

表10.26℃的蛋白水解活性

菌株	26℃的相对活性
	26℃的相对活性			第1天	第2天	第3天
	L2	1.0	1.0	第1天	第2天	第3天	1.0

L2-HV1	1.3	1.1	1.1
L2-HV1	1.3	1.1	1.1	L2-HV0	0.2	1.1	1.1

从上面的表8-10可以看出，在枯草芽孢杆菌中表达时，尾部的作用使来自Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei，DSM 43235的S2A蛋白酶的表达水平增加。在此实验中观察到增加可达40％，但总的说来，两株尾部变体L2 HV1和L2 HV0，在所有三种温度的测定都观察到了改进。

实施例7：蛋白酶22

指定为“蛋白酶22”的蛋白酶经设计以包括SEQ ID NO：2的成熟部分(氨基酸1-188)的下列特征氨基酸：10Y、38T、82S、95P、99A、100V、114I、118N、120T、122R、125Q、129Y、130S、131L、165S和171Y；其中每个位点对应于SEQ ID NO：2的位点。

蛋白酶22的成熟部分是SEQ ID NO：8的氨基酸1-196。对应于SEQ IDNO：8的DNA序列是SEQ ID NO：7。

构建SEQID NO：7的DNA序列，并导入芽孢杆菌宿主用于表达。纯化表达的蛋白酶，并作为alpha-lytic蛋白酶(肽酶家族S1E和/或S2A)表征。

蛋白酶22的温度-活性关系在pH9，应用实施例2的Protazyme AK测定方法进行测定。为了对比的目的，也包括来自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶。结果在下面的表11中显示。

蛋白酶22的变性温度或解链温度，如在实施例2中所描述的，确定为T_m＝83.5℃。

表11.温度分布图

温度(℃)	pH9的相对活性
温度(℃)	pH9的相对活性			蛋白酶22	来自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶
15	0.016	0.015		蛋白酶22	来自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶
15	0.016	0.015	25	0.010	0.024
37	0.028	0.068	25	0.010	0.024
37	0.028	0.068	50	0.069	0.199
60	0.138	0.510	50	0.069	0.199

70	0.474	1.000
70	0.474	1.000	80	1.000	0,394
90	0,375	-	80	1.000	0,394

从这些结果显示出，蛋白酶22具有较高的解链温度和在pH9较高的最适温度，均与Nocardiopsis sp.NRRL 18262蛋白酶相比较，即解链温度升高7.0℃，而在pH9的最适温度升高大约10℃。

实施例8：蛋白酶L2a

蛋白酶L2a的成熟部分是SEQ ID NO：10的氨基酸1-189。SEQ ID NO：9是对应于SEQ ID NO：10的DNA序列。

构建SEQID NO：9的DNA序列，并导入芽孢杆菌宿主用于表达，如实施例1中的描述。并如实施例2中的描述进行纯化。

蛋白酶L2a是alpha-lytic蛋白酶(肽酶家族SlE和/或S2A)。

蛋白酶L2a的温度-活性关系在pH9，应用实施例2的Protazyme AK测定方法进行测定。为了对比的目的，也包括来自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶(蛋白酶10)。结果在下面的表12中显示。

蛋白酶L2a的变性温度或解链温度，如在实施例2中所描述的，确定为T_m＝78.2℃。

表12：温度活性分布图

温度(℃)	L2a蛋白酶	蛋白酶10
温度(℃)	L2a蛋白酶	蛋白酶10	15	0.02	0.02
25	0.02	0.02	15	0.02	0.02
25	0.02	0.02	37	0.05	0.07
50	0.13	0.20	37	0.05	0.07
50	0.13	0.20	60	0.31	0.51
70	0.79	1.00	60	0.31	0.51
70	0.79	1.00	80	1.00	0.39
90	0.28	-	80	1.00	0.39

从这些结果显示出，蛋白酶L2a具有较高的解链温度和在pH9较高的最适温度，均与Nocardiopsis sp.NRRL 18262蛋白酶相比较，即解链温度升高1.7℃，而在pH9的最适温度升高大约10℃。

实施例9：蛋白酶8

蛋白酶8的成熟部分是SEQ ID NO：12的氨基酸1-188。SEQ ID NO：11是对应于SEQ ID NO：12的DNA序列。

构建SEQID NO：11的DNA序列，并导入芽孢杆菌宿主用于表达，如实施例1中的描述。并如实施例2中的描述进行纯化。

蛋白酶8是alpha-lytic蛋白酶(肽酶家族SlE和/或S2A)。

蛋白酶8的温度-活性关系在pH9，应用实施例2的Protazyme AK测定方法进行测定。为了对比的目的，也包括来自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶(蛋白酶10)。结果在下面的表13中显示。

蛋白酶8的变性温度或解链温度，如在实施例2中所描述的，确定为T_m＝78.3℃。

表13：温度活性分布图

温度(℃)	蛋白酶8	蛋白酶10
温度(℃)	蛋白酶8	蛋白酶10	15	0.02	0.02
25	0.05	0.02	15	0.02	0.02
25	0.05	0.02	37	0.10	0.07
50	0.27	0.20	37	0.10	0.07
50	0.27	0.20	60	0.56	0.51
70	1.00	1.00	60	0.56	0.51
70	1.00	1.00	80	0.49	0.39
90	-	-	80	0.49	0.39

从这些结果显示出，蛋白酶L2a具有较高的解链温度和在pH9较高的最适温度，均与蛋白酶10相比较，例如解链温度升高1.8℃。

实施例10：L2a蛋白酶在单胃体外消化模型中的性能

在实施例8中描述的纯化的L2a蛋白酶，其性能在模拟单胃动物消化的体外模型中进行了测定，与源自Nocardiopsis sp.NRRL 18262(“蛋白酶10”)的已知蛋白酶进行比较。具体地，检测了所述的蛋白酶改善溶解和消化玉米/-SBM(玉米/-大豆粉)蛋白质的能力。所述的体外系统由18个摇瓶组成，在所述的摇瓶中玉米/-SBM底物起初与HCl/胃蛋白酶一起温育-模拟胃的消化，并随后与胰酶一起温育-模拟肠的消化。所述摇瓶中的8个在胃阶段开始时以蛋白酶配制，然而剩余的摇瓶作为空白。在肠的温育阶段的结尾，移出体外消化的样品并分析溶解的和消化的蛋白。

体外消化方法概要

加入的成分	pH	温度	时间	模拟的消化阶段
加入的成分	pH	温度	时间	模拟的消化阶段	10g玉米/-SBM底物(6∶4)，41ml HCl(0.105M)	3.0	40℃	t＝0min	混合
5ml HCl(0.105M)/胃蛋白酶(3000U/g底物)，1mL蛋白酶(以提供100mg蛋白酶酶蛋白每kg底物)	3.0	40℃	t＝30min	胃的消化	10g玉米/-SBM底物(6∶4)，41ml HCl(0.105M)	3.0	40℃	t＝0min	混合
5ml HCl(0.105M)/胃蛋白酶(3000U/g底物)，1mL蛋白酶(以提供100mg蛋白酶酶蛋白每kg底物)	3.0	40℃	t＝30min	胃的消化	16ml H₂O	3.0	40℃	t＝1.0小时	胃的消化
7ml NaOH(0,39M)	6.8	40℃	t＝1.5小时	肠的消化	16ml H₂O	3.0	40℃	t＝1.0小时	胃的消化
7ml NaOH(0,39M)	6.8	40℃	t＝1.5小时	肠的消化	5ml NaHCO₃(1M)/胰酶(pancreatin)(8mg/g食物)	6.8	40℃	t＝2.0小时	肠的消化
终止温育	7.0	40℃	t＝6.0小时		5ml NaHCO₃(1M)/胰酶(pancreatin)(8mg/g食物)	6.8	40℃	t＝2.0小时	肠的消化

条件

底物： 4g SBM，6g玉米(预混的)

pH： 3.0胃步骤/6.8-7.0肠步骤

HCl： 0.105M进行1.5小时(即30分钟HCl-底物预混合)

胃蛋白酶： 3000U/g食物进行1小时

胰酶： 8mg/g食物进行4小时

温度： 40℃

重复： n

溶液

0.39M NaOH

0.105M HCl

0.105M HCl每5ml含有6000U胃蛋白酶

1M NaHCO₃每ml含有16mg胰酶

125mM NaAc-缓冲液，pH6.0

测定酶蛋白

蛋白酶酶蛋白(EP)的量根据A₂₈₀值和氨基酸序列(氨基酸组成)，应用在S.C.Gill & P.H.von Hippel，Analytical Biochemistry 182，319-326，(1989)中概括的原理进行计算。

体外模型的实验步骤

分析

所有样品用凝胶过滤分析溶解的和消化的蛋白的含量。

估测溶解的和消化的蛋白

来自体外消化的样品的上清中溶解的蛋白的含量，通过应用凝胶过滤HPLC定量粗蛋白(CP)进行估测。将上清融化，通过0.45μm聚碳酸酯(polycarbonate)过滤器过滤并用H₂O稀释(1∶50，v/v)。稀释的样品通过HPLC应用Superdex Peptide PE(7.5×300mm)凝胶过滤柱(Global)进行层析。用于等度洗脱的洗脱剂为含有150mM NaCl的50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)。每次操作的洗脱剂的总体积为26ml而且流速为0.4ml/min。洗脱外廓线在214nm记录，并通过积分确定所述外廓线下的总面积。为了估测积分面积的蛋白含量，由具有已知总蛋白含量的体外消化的参比玉米/-SBM样品的系列稀释物，产生校正曲线(R²＝0.9993)。在此参比样品中检测所述的蛋白采用Kjeldahl方法进行(测定％氮；A.O.A.C.(1984)Official Methods of Analysis 14th ed.，Washington DC)。

消化的蛋白的含量通过积分对应于具有1500Dalton或1500Dalton以下的多肽和氨基酸的色谱图面积进行估测(Savoie，L；Gauthier，S.F.Dialysis CellFor The In-vitro Measurement Of Protein Digestibility.J.Food Sci.1986，51，494-498；Babinszky，L.；Van，D.M.J.M.；Boer，H.；Den，H.L A.An In-vitroMethod for Prediction of The Digestible Crude Protein Content in Pig Feeds.J.Sci.Food Agr.1990，50，173-178；Boisen，S.；Eggum，B.O.Critical Evaluation ofInvitro Methods for Estimating Digestibility in Simple-Stomach Animals.Nutrition Research Reviews 1991，4，141-162)。为了确定所述的1500Dalton分界线，凝胶过滤柱采用细胞色素C(Boehringer，Germany)、抑肽酶、胃泌素1和P物质(substance P)(Sigma Aldrich，USA)作为分子量标准进行校准。

结果

在下面的表14和5中显示的结果说明，所述的L2a蛋白酶，如同蛋白酶10，使可溶解的和可消化的蛋白的水平相对于空白显著地增加。此外，所述的L2a蛋白酶至少在数字上看来提高了可消化的蛋白的水平，与已知的蛋白酶10相比。

表14：溶解的和消化的粗蛋白

酶	n	相对于空白
		相对于空白						％消化的CP		％CV	％溶解的CP		％CV
		空白	10	100.0	a	5.5	100.0	％消化的CP		％CV	％溶解的CP		％CV	a	4.4
L2a蛋白酶	3	空白	10	100.0	a	5.5	100.0	116.1	b	0.7	107.2	b	1.1	a	4.4
L2a蛋白酶	3	蛋白酶10	5	112.1	b	1.0	110.2	116.1	b	0.7	107.2	b	1.1	b	0.6

SD＝标准偏差。％CV＝方差系数＝(SD/平均值)×100％

实施例11：鱼饲料试验

虹鳟鱼(Oncorhyncus mykiss)，所有具有大约27.3g的原始体重的雌性原种，用含有49％SBM(大豆粉)和12％FM(鱼粉)的实际的基础饮食饲养，在所述的基础饮食中不加入(对照)和以50mg蛋白酶酶蛋白/kg饲料的量，加入具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-188的本发明的蛋白酶。随意地饲养鱼。饲养试验在500L水池中进行，其为半循环单元(semi-recirculating unit)的部分，具有15℃+/-1℃的水温，每个水池养50条鱼，每种处理和平行测定4次。在85天的养殖期结束时测定存活、生长和饲料转化。

结果显示在下面的表15中。通过向食物中加入本发明的蛋白酶，体重得到显著的增加。

表15：鱼体内结果

处理	存活％	初始体重/g	最终体重/g	增重/g
处理	存活％	初始体重/g	最终体重/g	增重/g	对照	100.0+/-0.0	27.3+/-0.0	305.0+/-5.3	277.7+/-5.3
蛋白酶SEQ IDNO：2的1-188	100.0+/-0.0	27.3+/-0.0	333.5+/-4.7	306.2+/-4.7	对照	100.0+/-0.0	27.3+/-0.0	305.0+/-5.3	277.7+/-5.3

实施例12：主要的纯化的大豆蛋白的蛋白水解的降解

我们已经研究了来自Nocardiopsis sp.NRRL 18262的蛋白酶和具有SEQID NO：2的氨基酸1-188的本发明的蛋白酶降解纯化的大豆蛋白的能力。研究的纯化的大豆蛋白为大豆蛋白的三种所谓的抗营养因子(anti-nutritionalfactor)：大豆凝集素(SBA)、大豆Kunitz胰蛋白酶抑制物、大豆Bowman-Birk抑制物和来自大豆的主要的贮存蛋白中的两种：大豆球蛋白和beta-conglycinin。

如下得到这些大豆蛋白：从未加热的大豆粉中，通过亲和色谱应用N-氨基己酰基-beta-D-galactopyranosylamine Sepharose(Sigma)纯化SBA(prod.No.S-9633，Sigma)。从所述的柱子洗脱的级分应用SDS-PAGE(Tris-甘氨酸4-20％)进行分析，并收集含有基本上纯的蛋白的级分。大豆球蛋白和beta-conglycinin根据由Fischer，M.et al：Enzymatic Extractability of Soybean Meal Proteins andCarbohydrates：Heat and Humidity Effects.J.Agric.Food Chem.2001，49，4463-4469中描述的步骤进行纯化。所述的Bowman-Birk抑制物和Kunitz胰蛋白酶抑制物为商业的产品(分别为Sigma T-9777和Fluka 93618)。

纯化的大豆蛋白与所述的两种蛋白酶在37℃和pH 6.5温育4小时(蛋白酶∶大豆蛋白＝1∶10，基于A₂₈₀)。温育缓冲液：50mM二甲基戊二酸(dimethylglutaric acid)、150mM NaCl、1mM CaCl₂、0,01％ Triton X-100，pH6.5。

所述的蛋白酶降解这五种蛋白质中的每种的能力，估计为以考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)染色的SDS-PAGE(Tris-甘氨酸4-20％)凝胶上完整的大豆蛋白条带的相对强度的降低。在大豆球蛋白和beta-conglycinin情况下，术语“完整的大豆蛋白条带”实际上分别指两个和三个条带，因为这两种蛋白质在SDS-PAGE凝胶上经受还原环境时，分别变性形成两个和三个亚基。

完整的大豆蛋白条带的强度(以所述的两种蛋白酶处理之前和之后)通过扫描染色的SDS凝胶测定，而五种蛋白中的每种通过两种蛋白酶中的每种降解，确定为降解后单独的完整的大豆蛋白条带的强度，相对于蛋白酶处理之前的单独的完整的大豆蛋白条带的强度。蛋白降解百分数计算如下：100％-((之后的条带强度/之前的条带强度)×100％)。结果在下面表16中显示。

表16：分离的大豆蛋白的降解百分数

蛋白酶	SBA	Bowman-Birk抑制物	Kunitz胰蛋白酶抑制物	大豆球蛋白	Beta-conglycinin
蛋白酶	SBA	Bowman-Birk抑制物	Kunitz胰蛋白酶抑制物	大豆球蛋白	Beta-conglycinin	来自Nocardiopsis sp.NRRL 18262	100	35	94	98	95
具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-188的蛋白酶	95	81	97	100	100	来自Nocardiopsis sp.NRRL 18262	100	35	94	98	95

实施例13：动物饲料和动物饲料添加剂

组成包含本发明的具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-188的蛋白酶的动物饲料添加剂，以维生素和矿物预混物的形式，如在下面表17显示的。所述的维生素和类胡罗卜素是从DSM Nutritional Products商业上可得到的。所有的量为g/kg。

表17：预混组合物

维生素A	ROVIMIX A 500	4.00
维生素A	ROVIMIX A 500	4.00	维生素D3	ROVIMIX D3 500	1.00
维生素E	ROVIMIX E 50 Ads	8.00	维生素D3	ROVIMIX D3 500	1.00
维生素E	ROVIMIX E 50 Ads	8.00	维生素B2	ROVlMIX B280-SD	1.0
	CAROPHYLL Yellow	10.0	维生素B2	ROVlMIX B280-SD	1.0
	CAROPHYLL Yellow	10.0		胆碱盐酸盐50％，min.	300.0
矿物	Mn氧化物	60.0		胆碱盐酸盐50％，min.	300.0
矿物	Mn氧化物	60.0		Zn氧化物	12.0
	Fe硫酸盐一水合物	20.0		Zn氧化物	12.0

	Cu氧化物	2.0
	Cu氧化物	2.0	Co硫酸盐	0.2
酶	具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-188的蛋白酶(酶蛋白)	3.0	Co硫酸盐	0.2
酶	具有SEQ ID NO：2的氨基酸1-188的蛋白酶(酶蛋白)	3.0	粗小麦粉(Wheat middling)	578.8

表17的预混物与下面表18中显示的组合物包含在鳟鱼饲料中。每种成分的量确定为％(w/w)。本发明的蛋白酶的饲养浓度为51mg蛋白酶酶蛋白每kg。

表18：trout饲料组合物

小麦	11.20
小麦	11.20	大豆	14.00
鱼粉(Fish meal)	57.00	大豆	14.00
鱼粉(Fish meal)	57.00	大豆油	4.00
淀粉	8.00	大豆油	4.00
淀粉	8.00	酵母	4.00
胆碱氯化物75％	0.10	酵母	4.00
胆碱氯化物75％	0.10	表17的预混组合物	1.70

PCT 原始文件(用于提交)(该页不是也不作为国际申请的一部分)

0-10-1-1	PCT/RO/134表(SAFE)对保藏的微生物或其它生物材料的说明(PCT细则13之二)备用(prepared using)	PCT-SAFE[EASY mode]Version 3.50(Build 0002.162)
0-10-1-1		PCT-SAFE[EASY mode]Version 3.50(Build 0002.162)	0-2	国际申请号
0-3	申请人或代理人档案号	10436.504-WO	0-2	国际申请号

11-11-2	以下说明是针对在说明书被提及的保藏的微生物或其它生物材料：页数行数	575
11-11-2	以下说明是针对在说明书被提及的保藏的微生物或其它生物材料：页数行数	575	1-31-3-11-3-21-3-31-3-4	保藏鉴定保藏机构保藏机构的地址保藏日期保藏编号	DSMZ DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroor-ganismen and Zellkulturen GmbHMascheroder Weg lb，D-38124Braunschweig，Germany30 May 2003(30.05.2003)DSMZ 15647
1-4	补充说明	Nocardiopsis alba	1-31-3-11-3-21-3-31-3-4	保藏鉴定保藏机构保藏机构的地址保藏日期保藏编号
1-4	补充说明	Nocardiopsis alba	1-5	本说明所针对的指定国	All designations

22-12-2	以下说明是针对在说明书被提及的保藏的微生物或其它生物材料：页数行数	576
22-12-2	以下说明是针对在说明书被提及的保藏的微生物或其它生物材料：页数行数	576	2-32-3-12-3-22-3-32-3-4	保藏鉴定保藏机构保藏机构的地址保藏日期保藏编号	DSMZ DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroor-ganismen and Zellkulturen GmbHMascheroder Weg lb，D-38124Braunschweig，Germany24 May 2004(24.05.2004)DSMZ 16424
2-4	补充说明	Nocardiopsis sp.	2-32-3-12-3-22-3-32-3-4	保藏鉴定保藏机构保藏机构的地址保藏日期保藏编号
2-4	补充说明	Nocardiopsis sp.	2-5	本说明所针对的指定国(designatedstates)	All designations

由受理局填写

0-4	本表格已经和国际申请一起收到(是或否)	是
0-4	本表格已经和国际申请一起收到(是或否)	是	0-4-1	受理官员

由国际局填写

0-5	国际局收到本表格日期	2004/07/09
0-5	国际局收到本表格日期	2004/07/09	0-5-1	受理官员

编号：10436.504-WO

附加说明(PCT/RO/134表)

关于“专家的选择”(expert option)的声明

保藏的微生物：

就PCT/RO/134表中所列出的保藏微生物，我们要求所谓的专家的选择：

直到欧洲专利授予所述的公开或，如果该申请已经被驳回，撤回或视撤，自申请之日起20年，若可以使用，保藏的微生物样品仅提供给需求该样品的人所提名的独立的专家(cf.Rule 28(4)EPC)。就澳大利亚而言，专家的选择类似地要求参考Regulation 3.25 of Australia Statutory Rules 1991s 1991 No 71。对于加拿大，我们要求是仅授权提供保藏样品给Commissioner推荐的独立的专家。

Bagsvrd，21 June 2004

Novozymes A/S

Karen stergaard Pedersen，Patent Counsel

序列表

<110>诺维信公司(Novozymes A/S)

<120>蛋白酶

<130>10436.504-WO

<160>12

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1065

<212>DNA

<213>Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonyillei DSM 43235

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1062)

<220>

<221>mat_peptide

<222>(499)..(1062)

<400>1

gct ccg gcc ccc gtc ccc cag acc ccc gtc gcc gac gac agc gcc 45

Ala Pro Ala Pro Val Pro Gln Thr Pro Val Ala Asp Asp Ser Ala

-165 -160 -155

gcc agc atg acc gag gcg ctc aag cgc gac ctc gac ctc acc tcg 90

Ala Ser Met Thr Glu Ala Leu Lys Arg Asp Leu Asp Leu Thr Ser

-150 -145 -140

gcc gag gcc gag gag ctt ctc tcg gcg cag gaa gcc gcc atc gag 135

Ala Glu Ala Glu Glu Leu Leu Ser Ala Gln Glu Ala Ala Ile Glu

-135 -130 -125

acc gac gcc gag gcc acc gag gcc gcg ggc gag gcc tac ggc ggc 180

Thr Asp Ala Glu Ala Thr Glu Ala Ala Gly Glu Ala Tyr Gly Gly

-120 -115 -110

tca ctg ttc gac acc gag acc ctc gaa ctc acc gtg ctg gtc acc gac 228

Ser Leu Phe Asp Thr Glu Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp

-105 -100 -95

gcc tcc gcc gtc gag gcg gtc gag gcc acc gga gcc cag gcc acc gtc 276

Ala Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gln Ala Thr Val

-90 -85 -80 -75

gtc tcc cac ggc acc gag ggc ctg acc gag gtc gtg gag gac ctc aac 324

Val Ser His Gly Thr Glu Gly Leu Thr Glu Val Val Glu Asp Leu Asn

-70 -65 -60

ggc gcc gag gtt ccc gag agc gtc ctc ggc tgg tac ccg gac gtg gag 372

Gly Ala Glu Val Pro Glu Ser Val Leu Gly Trp Tyr Pro Asp Val Glu

-55 -50 -45

agc gac acc gtc gtg gtc gag gtg ctg gag ggc tcc gac gcc gac gtc 420

Ser Asp Thr Val Val Val Glu Val Leu Glu Gly Ser Asp Ala Asp Val

-40 -35 -30

gcc gcc ctg ctc gcc gac gcc ggt gtg gac tcc tcc tcg gtc cgg gtg 468

Ala Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ser Ser Ser Val Arg Val

-25 -20 -15

gag gag gcc gag gag gcc ccg cag gtc tac gcc gac atc atc ggc ggc 516

Glu Glu Ala Glu Glu Ala Pro Gln Val Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly

-10 -5 -1 1 5

ctg gcc tac tac atg ggc ggc cgc tgc tcc gtc ggc ttc gcc gcg acc 564

Leu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr

10 15 20

aac agc gcc ggt cag ccc ggt ttc gtc acc gcc ggc cac tgc ggc acc 612

Asn Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr

25 30 35

gtc ggc acc ggc gtg acc atc ggc aac ggc acc ggc acc ttc cag aac 660

Val Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly Thr Gly Thr Phe Gln Asn

40 45 50

tcg gtc ttc ccc ggc aac gac gcc gcc ttc gtc cgc ggc acc tcc aac 708

Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn

55 60 65 70

ttc acc ctg acc aac ctg gtc tcg cgc tac aac tcc ggc ggc tac cag 756

Phe Thr Leu Thr Ash Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly Tyr Gln

75 80 85

tcg gtg acc ggt acc agc cag gcc ccg gcc ggc tcg gcc gtg tgc cgc 804

Ser Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala Gly Ser Ala Val Cys Arg

90 95 100

tcc ggc tcc acc acc ggc tgg cac tgc ggc acc atc cag gcc cgc aac 852

Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn

105 110 115

cag acc gtg cgc tac ccg cag ggc acc gtc tac tcg ctc acc cgc acc 900

Gln Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Tyr Ser Leu Thr Arg Thr

120 125 130

aac gtg tgc gcc gag ccc ggc gac tcc ggc ggt tcg ttc atc tcc ggc 948

Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly

135 140 145 150

tcg cag gcc cag ggc gtc acc tcc ggc ggc tcc ggc aac tgc tcc gtc 996

Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Val

155 160 165

ggc ggc acg acc tac tac cag gag gtc acc ccg atg atc aac tcc tgg 1044

Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Ile Asn Ser Trp

170 175 180

ggt gtc agg atc cgg acc taa 1065

Gly Val Arg Ile Arg Thr

185

<210>2

<211>354

<212>PRT

<213>Nocardiopsis dassonvillei 亚种dassonvillei DSM 43235

<400>2

Ala Pro Ala Pro Val Pro Gln Thr Pro Val Ala Asp Asp Ser Ala

-165 -160 -155

Ala Ser Met Thr Glu Ala Leu Lys Arg Asp Leu Asp Leu Thr Ser

-150 -145 -140

Ala Glu Ala Glu Glu Leu Leu Ser Ala Gln Glu Ala Ala Ile Glu

-135 -130 -125

Thr Asp Ala Glu Ala Thr Glu Ala Ala Gly Glu Ala Tyr Gly Gly

-120 -115 -110

Ser Leu Phe Asp Thr Glu Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp

-105 -100 -95

Ala Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gln Ala Thr Val

-90 -85 -80 -75

Val Ser His Gly Thr Glu Gly Leu Thr Glu Val Val Glu Asp Leu Asn

-70 -65 -60

Gly Ala Glu Val Pro Glu Ser Val Leu Gly Trp Tyr Pro Asp Val Glu

-55 -50 -45

Ser Asp Thr Val Val Val Glu Val Leu Glu Gly Ser Asp Ala Asp Val

-40 -35 -30

Ala Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ser Ser Ser Val Arg Val

-25 -20 -15

Glu Glu Ala Glu Glu Ala Pro Gln Val Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly

-10 -5 -1 1 5

Leu Ala Tyr Tyr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr

10 15 20

Ash Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr

25 30 35

Val Gly Thr Gly Val Thr Ile Gly Asn Gly Thr Gly Thr Phe Gln Asn

40 45 50

Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn

55 60 65 70

Phe Thr Leu Thr Ash Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly Tyr Gln

75 80 85

Ser Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala Gly Ser Ala Val Cys Arg

90 95 100

Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn

105 110 115

Gln Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Tyr Ser Leu Thr Arg Thr

120 125 130

Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly

135 140 145 150

Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Val

155 160 165

Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Ile Asn Ser Trp

170 175 180

Gly Val Arg Ile Arg Thr

185

<210>3

<211>48

<212>DNA

<213>合成的

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>3

gcttttagtt catcgatcgc atcggctgct ccggcccccg tcccccag 48

<210>4

<211>35

<212>DNA

<213>合成的

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

gcggatccta ttaggttctg atcctgacac cccag 35

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>合成的

<220>

<221>misc_feature

<223>延伸

<400>5

caatcgcatg ttcaatccgc tcca 24

<210>6

<211>12

<212>DNA

<213>合成的

<220>

<221>misc_feature

<223>

<400>6

caatcggctc ct 12

<210>7

<211>1164

<212>DNA

<213>合成的(″蛋白酶22″)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1164)

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(81)

<220>

<221>misc_feature

<222>(82)..(576)

<223>前肽

<220>

<221>mat_peptide

<222>(577)..(1164)

<400>7

atg aaa aaa ccg ctg gga aaa att gtc gca agc aca gca ctt ctt 45

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu

-190 -185 -180

att tca gtg gca ttt agc tca tct att gca tca gca gct aca gga 90

Ile Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Thr Gly

-175 -170 -165

gca tta ccg cag tct ccg aca ccg gaa gca gat gca gtc tca atg 135

Ala Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Glu Ala Asp Ala Val Ser Met

-160 -155 -150

caa gaa gca ctg caa aga gat ctt gat ctt aca tca gca gaa gca 180

Gln Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Asp Leu Thr Ser Ala Glu Ala

-145 -140 -135

gaa gaa ctt ctt gct gca caa gat aca gca ttt gaa gtg gat gaa 225

Glu Glu Leu Leu Ala Ala Gln Asp Thr Ala Phe Glu Val Asp Glu

-130 -125 -120

gca gcg gca gaa gca gca gga gat gca tat ggc ggc tca gtt ttt 270

Ala Ala Ala Glu Ala Ala Gly Asp Ala Tyr Gly Gly Ser Val Phe

-115 -110 -105

gat aca gaa tca ctt gaa ctt aca gtt ctt gtt aca gat gca gca gca 318

Asp Thr Glu Ser Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala Ala Ala

-100 -95 -90

gtt gaa gca gtt gaa gca aca gga gca gga aca gta ctt gtt tca tat 366

Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Val Leu Val Ser Tyr

-85 -80 -75

gga att gat ggc ctt gat gaa att gtt caa gaa ctg aat gca gct gat 414

Gly Ile Asp Gly Leu Asp Glu Ile Val Gln Glu Leu Asn Ala Ala Asp

-70 -65 -60 -55

gct gtt ccg ggc gtt gtt ggc tgg tat ccg gat gtt gct gga gat aca 462

Ala Val Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala Gly Asp Thr

-50 -45 -40

gtt gtc ctt gaa gtt ctt gaa gga tca ggc gca gat gtt tca ggc ctg 510

Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp Val Ser Gly Leu

-35 -30 -25

ctg gca gac gca gga gtc gat gca tca gca gtt gaa gtt aca aca tca 558

Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Glu Val Thr Thr Ser

-20 -15 -10

gat caa ccg gaa ctt tat gca gat att att ggc ggc ctg gca tat tat 606

Asp Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Tyr

-5 -1 1 5 10

atg ggc ggc aga tgc agc gtt ggc ttt gca gca aca aat gca tca ggc 654

Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ser Gly

15 20 25

caa ccg ggc ttt gtt aca gca ggc cat tgc ggc aca gtt ggc aca cca 702

Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Pro

30 35 40

gtt tca att ggc aat ggc aaa ggc gtt ttt gaa cga agc att ttt ccg 750

Val Ser Ile Gly Asn Gly Lys Gly Val Phe Glu Arg Ser Ile Phe Pro

45 50 55

ggc aat gat tca gca ttt gtt aga ggc aca tca aat ttt aca ctt aca 798

Gly Asn Asp Ser Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr

60 65 70

aat ctg gtt tca aga tat aat tca ggc ggc tat gca aca gtt gca ggc 846

Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly

75 80 85 90

cat aat caa gca ccg att ggc tca gca gtt tgc aga tca ggc tca aca 894

His Asn Gln Ala Pro Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr

95 100 105

aca ggc tgg cat tgc ggc aca att caa gca aga aat caa aca gtt agg 942

Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln Thr Val Arg

110 115 120

tat ccg caa ggc aca gtt tat agt ctg aca aga aca aca gtt tgt gca 990

Tyr Pro Gln Gly Thr Val Tyr Ser Leu Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala

125 130 135

gaa ccg ggc gat tca ggc ggc tca tat att agc ggc act caa gca caa 1038

Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln

140 145 150

ggc gtt aca tca ggc ggc tca ggc aat tgc agt gct ggc ggc aca aca 1086

Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Ala Gly Gly Thr Thr

155 160 165 170

tat tac caa gaa gtt aat ccg atg ctt agt tca tgg ggc ctt aca ctt 1134

Tyr Tyr Gln Glu Val Asn Pro Met Leu Ser Ser Trp Gly Leu Thr Leu

175 180 185

aga aca caa tcg cat gtt caa tcc gct cca 1164

Arg Thr Gln Ser His Val Gln Ser Ala Pro

190 195

<210>8

<211>388

<212>PRT

<213>合成的(″蛋白酶22″)

<400>8

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu

-190 -185 -180

Ile Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Thr Gly

-175 -170 -165

Ala Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Glu Ala Asp Ala Val Ser Met

-160 -155 -150

Gln Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Asp Leu Thr Ser Ala Glu Ala

-145 -140 -135

Glu Glu Leu Leu Ala Ala Gln Asp Thr Ala Phe Glu Val Asp Glu

-130 -125 -120

Ala Ala Ala Glu Ala Ala Gly Asp Ala Tyr Gly Gly Ser Val Phe

-115 -110 -105

Asp Thr Glu Ser Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala Ala Ala

-100 -95 -90

Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Val Leu Val Ser Tyr

-85 -80 -75

Gly Ile Asp Gly Leu Asp Glu Ile Val Gln Glu Leu Asn Ala Ala Asp

-70 -65 -60 -55

Ala Val Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala Gly Asp Thr

-50 -45 -40

Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp Val Ser Gly Leu

-35 -30 -25

Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Glu Val Thr Thr Ser

-20 -15 -10

Asp Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala Tyr Tyr

-5 -1 1 5 10

Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala Ser Gly

15 20 25

Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val Gly Thr Pro

30 35 40

Val Ser Ile Gly Asn Gly Lys Gly Val Phe Glu Arg Ser Ile Phe Pro

45 50 55

Gly Asn Asp Ser Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr Leu Thr

60 65 70

Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly Tyr Ala Thr Val Ala Gly

75 80 85 90

His Asn Gln Ala Pro Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser Gly Ser Thr

95 100 105

Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln Thr Val Arg

110 115 120

Tyr Pro Gln Gly Thr Val Tyr Ser Leu Thr Arg Thr Thr Val Cys Ala

125 130 135

Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Gln

140 145 150

Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Ala Gly Gly Thr Thr

155 160 165 170

Tyr Tyr Gln Glu Val Ash Pro Met Leu Ser Ser Trp Gly Leu Thr Leu

175 180 185

Arg Thr Gln Ser His Val Gln Ser Ala Pro

190 195

<210>9

<211>1155

<212>DNA

<213>Nocardiopsis sp.DSM 16424

<220>

<221>sig_peptide

<222>(1)..(87)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1152)

<220>

<221>mat_peptide

<222>(586)..(1152)

<400>9

atg aga ccc tcc acc atc gcc tcc gcc gtc ggc aca gga gca ctg 45

Met Arg Pro Ser Thr Ile Ala Ser Ala Val Gly Thr Gly Ala Leu

-195 -190 -185

gcc ttc ggt ctg gca ctg tcc atg gcc ccc gga gcc ctc gcg gcg 90

Ala Phe Gly Leu Ala Leu Ser Met Ala Pro Gly Ala Leu Ala Ala

-180 -175 -170

ccc ggc ccc gtc ccc cag acc ccc gtc gcc gac gac agc gcc gcc 135

Pro Gly Pro Val Pro Gln Thr Pro Val Ala Asp Asp Ser Ala Ala

-165 -160 -155

agc atg acc gaa gcg ctc aag cgt gac ctc aac ctc tcc tcg gcc 180

Ser Met Thr Glu Ala Leu Lys Arg Asp Leu Asn Leu Ser Ser Ala

-150 -145 -140

gag gcc gag gag ctg ctc tcg gcg cag gaa gcc gcg atc gag acc 225

Glu Ala Glu Glu Leu Leu Ser Ala Gln Glu Ala Ala Ile Glu Thr

-135 -130 -125

gac gcc gag gcc gcc gag gcc gcg gga gag gcc tac ggc ggc tcc 270

Asp Ala Glu Ala Ala Glu Ala Ala Gly Glu Ala Tyr Gly Gly Ser

-120 -115 -110

ctg ttc gac acc gaa acc ctc gaa ctc acc gtg ctg gtg acc gac acc 318

Leu Phe Asp Thr Glu Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Thr

-105 -100 -95 -90

acg gcc gtc gac gcg gtc gag gcc acc gga gcc gag gcc acc gtg gtc 366

Thr Ala Val Asp Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Glu Ala Thr Val Val

-85 -80 -75

acc cac ggc acc gac ggc ctg gcc gag gtc gtg gag gac ctc aac agc 414

Thr His Gly Thr Asp Gly Leu Ala Glu Val Val Glu Asp Leu Asn Ser

-70 -65 -60

gcc gac gcc ccg gcg ggc gtc ctc ggc tgg tac ccc gac atg gag agc 462

Ala Asp Ala Pro Ala Gly Val Leu Gly Trp Tyr Pro Asp Met Glu Ser

-55 -50 -45

gac acc gtg gtg gtc gag gtg ctg gag ggc tcc gac gcc gac gtc gcc 510

Asp Thr Val Val Val Glu Val Leu Glu Gly Ser Asp Ala Asp Val Ala

-40 -35 -30

gcc ctg ctc gcc gac gcc ggc gtg gac gcc tcc gcc gtc cgg gtg gag 558

Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Arg Val Glu

-25 -20 -15 -10

gag gcg gag gag gtc ccg cag gtc tac gcc aac atc atc ggc ggc ctg 606

Glu Ala Glu Glu Val Pro Gln Val Tyr Ala Asn Ile Ile Gly Gly Leu

-5 -1 1 5

gcc tac acc atg ggc gga cgc tgc tcc gtc ggc ttc gcg gcg acc aac 654

Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn

10 15 20

agc gcc gga cag ccc ggt ttc gtg acg gcg ggc cac tgc ggc acc gtc 702

Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val

25 30 35

ggc acc gcc gtg acc atc ggc gac ggc cgc ggc gtc ttc gag cgc tcg 750

Gly Thr Ala Val Thr Ile Gly Asp Gly Arg Gly Val Phe Glu Arg Ser

40 45 50 55

gtc ttc ccc ggc aac gac gcc gcc ttc gtc cgc ggc acc tcc aac ttc 798

Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe

60 65 70

acc ctg acc aac ctg gtc tcc cgc tac aac tcc ggc ggc cac cag gcg 846

Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly His Gln Ala

75 80 85

gtg acc ggc acc agc cag gcc ccg gcc ggc tcg gcc gtc tgc cgc tcc 894

Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser

90 95 100

ggc tcc acc acc ggc tgg cac tgc ggc acc atc cag gcc cgc aac cag 942

Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln

105 110 115

acc gtg cgc tac ccg cag ggc acc gtc aac gcg ctc acc cgc acc aac 990

Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Asn Ala Leu Thr Arg Thr Asn

120 125 130 135

gtg tgc gcc gag ccc ggt gac tcc ggc ggc tcg ttc atc tcc ggc tcg 1038

Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser

140 145 150

cag gcc cag ggc gtc acc tcc ggc ggc tcc ggc aac tgc tcc ttc ggc 1086

Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Phe Gly

155 160 165

ggc acg acc tac tac cag gag gtc gcc ccg atg atc aac tcc tgg ggc 1134

Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Ala Pro Met Ile Asn Ser Trp Gly

170 175 180

gtt cgc atc cgc acc agc tga 1155

Val Arg Ile Arg Thr Ser

185

<210>10

<211>384

<212>PRT

<213>Nocardiopsis sp.DSM 16424

<400>10

Met Arg Pro Ser Thr Ile Ala Ser Ala Val Gly Thr Gly Ala Leu

-195 -190 -185

Ala Phe Gly Leu Ala Leu Ser Met Ala Pro Gly Ala Leu Ala Ala

-180 -175 -170

Pro Gly Pro Val Pro Gln Thr Pro Val Ala Asp Asp Ser Ala Ala

-165 -160 -155

Ser Met Thr Glu Ala Leu Lys Arg Asp Leu Asn Leu Ser Ser Ala

-150 -145 -140

Glu Ala Glu Glu Leu Leu Ser Ala Gln Glu Ala Ala Ile Glu Thr

-135 -130 -125

Asp Ala Glu Ala Ala Glu Ala Ala Gly Glu Ala Tyr Gly Gly Ser

-120 -115 -110

Leu Phe Asp Thr Glu Thr Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Thr

-105 -100 -95 -90

Thr Ala Val Asp Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Glu Ala Thr Val Val

-85 -80 -75

Thr His Gly Thr Asp Gly Leu Ala Glu Val Val Glu Asp Leu Asn Ser

-70 -65 -60

Ala Asp Ala Pro Ala Gly Val Leu Gly Trp Tyr Pro Asp Met Glu Ser

-55 -50 -45

Asp Thr Val Val Val Glu Val Leu Glu Gly Ser Asp Ala Asp Val Ala

-40 -35 -30

Ala Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Arg Val Glu

-25 -20 -15 -10

Glu Ala Glu Glu Val Pro Gln Val Tyr Ala Asn Ile Ile Gly Gly Leu

-5 -1 1 5

Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn

10 15 20

Ser Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Thr Val

25 30 35

Gly Thr Ala Val Thr Ile Gly Asp Gly Arg Gly Val Phe Glu Arg Ser

40 45 50 55

Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe

60 65 70

Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Ser Gly Gly His Gln Ala

75 80 85

Val Thr Gly Thr Ser Gln Ala Pro Ala Gly Ser Ala Val Cys Arg Ser

90 95 100

Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Asn Gln

105 110 115

Thr Val Arg Tyr Pro Gln Gly Thr Val Asn Ala Leu Thr Arg Thr Asn

120 125 130 135

Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser Gly Ser

140 145 150

Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser Phe Gly

155 160 165

Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Ala Pro Met Ile Asn Ser Trp Gly

170 175 180

Val Arg Ile Arg Thr Ser

185

<210>11

<211>1068

<212>DNA

<213>Nocardiopsis alba DSM 15647

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1065)

<220>

<221>mat_peptide

<222>(502)..(1065)

<220>

<221>sig_peptide

<222>(502)..(1065)

<400>11

gcg acc ggc ccc ctc ccc cag tcc ccc acc ccg gat gaa gcc gag 45

Ala Thr Gly Pro Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Asp Glu Ala Glu

-165 -160 -155

gcc acc acc atg gtc gag gcc ctc cag cgc gac ctc ggc ctg tcc 90

Ala Thr Thr Met Val Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Gly Leu Ser

-150 -145 -140

ccc tct cag gcc gac gag ctc ctc gag gcg cag gcc gag tcc ttc 135

Pro Ser Gln Ala Asp Glu Leu Leu Glu Ala Gln Ala Glu Ser Phe

-135 -130 -125

gag atc gac gag gcc gcc acc gcg gcc gca gcc gac tcc tac ggc 180

Glu Ile Asp Glu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Asp Ser Tyr G1y

-120 -115 -110

ggc tcc atc ttc gac acc gac agc ctc acc ctg acc gtc ctg gtc acc 228

Gly Ser Ile Phe Asp Thr Asp Ser Leu Thr Leu Thr Val Leu Val Thr

-105 -100 -95

gac gcc tcc gcc gtc gag gcg gtc gag gcc gcc ggc gcc gag gcc aag 276

Asp Ala Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Ala Gly Ala Glu Ala Lys

-90 -85 -80

gtg gtc tcg cac ggc atg gag ggc ctg gag gag atc gtc gcc gac ctg 324

Val Val Ser His Gly Met Glu Gly Leu Glu Glu Ile Val Ala Asp Leu

-75 -70 -65 -60

aac gcg gcc gac gct cag ccc ggc gtc gtg ggc tgg tac ccc gac atc 372

Asn Ala Ala Asp Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Ile

-55 -50 -45

cac tcc gac acg gtc gtc ctc gag gtc ctc gag ggc tcc ggt gcc gac 420

His Ser Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp

-40 -35 -30

gtg gac tcc ctg ctc gcc gac gcc ggt gtg gac acc gcc gac gtc aag 468

Val Asp Ser Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Thr Ala Asp Val Lys

-25 -20 -15

gtg gag agc acc acc gag cag ccc gag ctg tac gcc gac atc atc ggc 516

Val Glu Ser Thr Thr Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly

-10 -5 -1 1 5

ggt ctc gcc tac acc atg ggt ggg cgc tgc tcg gtc ggc ttc gcg gcc 564

Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala

10 15 20

acc aac gcc tcc ggc cag ccc ggg ttc gtc acc gcc ggc cac tgc ggc 612

Thr Asn Ala Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly

25 30 35

acc gtc ggc acc ccg gtc agc atc ggc aac ggc cag ggc gtc ttc gag 660

Thr Val Gly Thr Pro Val Ser Ile Gly Asn Gly Gln Gly Val Phe Glu

40 45 50

cgt tcc gtc ttc ccc ggc aac gac tcc gcc ttc gtc cgc ggc acc tcg 708

Arg Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ser Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser

55 60 65

aac ttc acc ctg acc aac ctg gtc agc cgc tac aac acc ggt ggt tac 756

Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr

70 75 80 85

gcg acc gtc tcc ggc tcc tcg cag gcg gcg atc ggc tcg cag atc tgc 804

Ala Thr Val Set Gly Ser Set Gln Ala Ala Ile Gly Ser Gln Ile Cys

90 95 100

cgt tcc ggc tcc acc acc ggc tgg cac tgc ggc acc gtc cag gcc cgc 852

Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Val Gln Ala Arg

105 110 115

ggc cag acg gtg agc tac ccc cag ggc acc gtg cag aac ctg acc cgc 900

Gly Gln Thr Val Ser Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Asn Leu Thr Arg

120 125 130

acc aac gtc tgc gcc gag ccc ggt gac tcc ggc ggc tcc ttc atc tcc 948

Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser

135 140 145

ggc agc cag gcc cag ggc gtc acc tcc ggt ggc tcc ggc aac tgc tcc 996

Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser

150 155 160 165

ttc ggt ggc acc acc tac tac cag gag gtc aac ccg atg ctg agc agc 1044

Phe Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Ash Pro Met Leu Ser Ser

170 175 180

tgg ggt ctg acc ctg cgc acc tga 1068

Trp Gly Leu Thr Leu Arg Thr

185

<210>12

<211>355

<212>PRT

<213>Nocardiopsis alba DSM 15647

<400>12

Ala Thr Gly Pro Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Asp Glu Ala Glu

-165 -160 -155

Ala Thr Thr Met Val Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Gly Leu Ser

-150 -145 -140

Pro Ser Gln Ala Asp Glu Leu Leu Glu Ala Gln Ala Glu Ser Phe

-135 -130 -125

Glu Ile Asp Glu Ala Ala Thr Ala Ala Ala Ala Asp Ser Tyr Gly

-120 -115 -110

Gly Ser Ile Phe Asp Thr Asp Ser Leu Thr Leu Thr Val Leu Val Thr

-105 -100 -95

Asp Ala Ser Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Ala Gly Ala Glu Ala Lys

-90 -85 -80

Val Val Ser His Gly Met Glu Gly Leu Glu Glu Ile Val Ala Asp Leu

-75 -70 -65 -60

Asn Ala Ala Asp Ala Gln Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Ile

-55 -50 -45

His Ser Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp

-40 -35 -30

Val Asp Ser Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Thr Ala Asp Val Lys

-25 -20 -15

Val Glu Ser Thr Thr Glu Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly

-10 -5 -1 1 5

Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala

10 15 20

Thr Asn Ala Ser Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly

25 30 35

Thr Val Gly Thr Pro Val Ser Ile Gly Asn Gly Gln Gly Val Phe Glu

40 45 50

Arg Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ser Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser

55 60 65

Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Ash Thr Gly Gly Tyr

70 75 80 85

Ala Thr Val Ser Gly Ser Ser Gln Ala Ala Ile Gly Ser Gln Ile Cys

90 95 100

Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Val Gln Ala Arg

105 110 115

Gly Gln Thr Val Ser Tyr Pro Gln Gly Thr Val Gln Asn Leu Thr Arg

120 125 130

Thr Asn Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Phe Ile Ser

135 140 145

Gly Ser Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Ser

150 155 160 165

Phe Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Gln Glu Val Asn Pro Met Leu Ser Ser

170 175 180

Trp Gly Leu Thr Leu Arg Thr

185

Claims

1.分离的多肽，其具有蛋白酶活性并具有至少78℃的解链温度(T_m)，如通过差示扫描量热法(DSC)在10mM磷酸钠、50mM氯化钠缓冲液中，pH 7.0，应用1.5℃/分钟的恒定扫描速率进行测定，其中所述多肽选自：

(a)具有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：2的1-188、SEQ ID NO：8的1-196、SEQ ID NO：10的1-189和/或SEQ ID NO：12的1-188的氨基酸具有至少60％的同一性程度；

(b)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列在低严谨条件下，与SEQ IDNO：1的499-1062、SEQ ID NO：7的577-1164、SEQ ID NO：9的586-1152和/或SEQ ID NO：11的502-1065的核苷酸杂交；和

(c)由核酸序列编码的多肽，所述核酸序列与SEQ ID NO：1的499-1062、SEQ ID NO：7的577-1164、SEQ ID NO：9的586-1152和/或SEQ ID NO：11的502-1065的核苷酸中的任一个具有至少60％的同一性程度。

2.分离的核酸序列，包括编码权利要求1的多肽的核酸序列。

3.分离的核酸序列，包括编码多肽的核酸序列，所述多肽具有蛋白酶活性并具有至少78℃的解链温度(T_m)，如通过差示扫描量热法(DSC)在10mM磷酸钠、50mM氯化钠缓冲液中，pH 7.0，应用1.5℃/分钟的恒定扫描速率进行测定，其中所述核酸序列

(a)在低严谨条件下，与SEQ ID NO：1的499-1062、SEQ ID NO：7的577-1164、SEQ ID NO：9的586-1152和/或SEQ ID NO：11的502-1065的核苷酸中的任一个杂交；

(b)与SEQ ID NO：1的499-1062、SEQ ID NO：7的577-1164、SEQ ID NO：9的586-1152和/或SEQ ID NO：11的502-1065的核苷酸中的任一个具有至少60％的同一性程度；和/或

(c)编码多肽，所述多肽与SEQ ID NO：2的1-188、SEQ ID NO：8的1-196、SEQ ID NO：10的1-189和/或SEQ ID NO：12的1-188的氨基酸具有至少60％的同一性程度。

4.核酸构建体，包括可操作地与一个或多个控制序列连接的权利要求2或3的核酸序列，所述的控制序列在合适的表达宿主中指导多肽的产生。

5.重组表达载体，包括权利要求4的核酸构建体。

6.重组宿主细胞，包括权利要求4的核酸构建体或权利要求5的载体。

7.产生权利要求1的多肽的方法，所述方法包括：(a)培养权利要求6的重组宿主细胞，以产生包含所述多肽的上清；和(b)回收所述的多肽。

8.转基因的植物，或植物部分，其能够表达权利要求1的多肽。

9.转基因的非-人动物或产品或其成分，能够表达权利要求1的多肽。

10.产生权利要求1的多肽的方法，所述方法包括

(a)培养如下菌株中的任一种：

(i)Nocardiopsis dassonvillei亚种dassonvillei DSM 43235，

(ii)Nocardiopsis sp.DSM 16424，或

(iii)Nocardiopsis alba DSM 15647；和

(b)回收所述的多肽。

11.将至少一种权利要求1中定义的多肽应用于(i)动物饲料；(ii)制备用于动物饲料的组合物；(iii)改善动物饲料的营养值；(iv)在动物饮食中增加可消化的和/或可溶的蛋白；(v)在动物饮食中增加蛋白水解的程度；和/或(vi)加工蛋白质。

12.动物饲料添加剂，包括至少一种权利要求1中定义的多肽；和

(a)至少一种脂溶性的维生素，和/或

(b)至少一种水溶性的维生素，和/或

(c)至少一种痕量矿物。

13.动物饲料组合物，其具有50-800g/kg的粗蛋白含量并包含至少一种权利要求1中定义的多肽，或至少一种权利要求12的饲料添加剂。

14.权利要求13的饲料组合物，其为鱼饲料。

15.一种组合物，包括至少一种权利要求1中定义的多肽，连同至少一种其他的酶，所述其他的酶选自淀粉酶、植酸酶、木聚糖酶、galactanase、alpha-半乳糖苷酶、蛋白酶、磷脂酶和/或beta-葡聚糖酶。

16.至少一种权利要求1中定义的多肽在洗涤剂中的用途。

17.Nocardiopsis sp.DSM 16424。

18.Nocardiopsis alba DSM 15647。