BRPI0407294B1

BRPI0407294B1 - Use of a protease of the peptidases family s2a and / or peptidasis fmilia s1e, method for producing polipeptide, animal feed additive, animal feed composition, and, detergent composition

Info

Publication number: BRPI0407294B1
Application number: BRPI0407294-4A
Authority: BR
Inventors: Rahbek Oestergaard Peter; De Maria Leonardo
Original assignee: Novozymes A/S
Priority date: 2003-02-07
Filing date: 2004-02-09
Publication date: 2017-06-13
Also published as: US20060147499A1; AU2004211446A1; US7588926B2; ES2291883T3; WO2004072221A2; US7906310B2; ATE368105T1; US20110124084A1; EP1594963A2; BRPI0407294A; US20090238922A1; DE602004007766T2; AU2004211446B2; CN1774504A; DK1594963T3; DE602004007766D1; CN1774504B; WO2004072221A3; EP1594963B1

Abstract

"protease da família de peptidases s2a e/ou família de peptidases s1e, seqüência de ácido nucleico isolada, construção de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, método para produzir um polipeptídeo, planta transgênica, ou parte de planta, animal transgênico não-humano ou produtos ou elementos dos mesmos, uso de pelo menos um polipeptídeo, aditivo de ração animal, composição de ração animal, e, composição detergente". a invenção refere-se a uma nova classe de serina proteases da família de peptidases s2a ou s1e que são estáveis na presença de cobre (cu2+) e/ou que são inibidas pelo cobre apenas em grau reduzido. características estruturais de relevância potencial para este efeito também são divulgadas. esta classe de proteases inclui proteases derivadas de brachysporiella gayana, nocardiopsis dassonvillei subespécie dassonvillei, nocardiopsis prasina, e nocardiopsis alba, porém também exclui proteases conhecidas derivadas de metarhizium anisopliae e nocardiopsis sp. nrrl 18262. a invenção refere-se também a dna que codifica referidas proteases, à expressão das mesmas em uma célula hospedeira, incluindo a invenção refere-se a uma nova classe de serina proteases da família de peptidases s2a ou s1e que são estáveis na presença de cobre (cu2+) e/ou que são inibidas pelo cobre apenas em grau reduzido. características estruturais de relevância potencial para este efeito também são divulgadas. esta classe de proteases inclui proteases derivadas de brachysporiella gayana, nocardiopsis dassonvillei subespécie dassonvillei, nocardiopsis prasina, e nocardiopsis alba, porém também exclui proteases conhecidas derivadas de metarhizilím anisopliae e nocardiopsis sp. nrrl 18262. a invenção refere-se também a dna que codifica referidas proteases, à expressão das mesmas em uma célula hospedeira, incluindo células de planta e animais, assim como o seu uso, por exemplo em ração animal e em detergentes. em particular, a invenção se refere à ração animal e aos aditivos de ração animal, tais como pré-mistura, incorporando essas proteases junto com 1-500 ppm cu (concentração na ração).

Description

“USO DE UMA PROTEASE DA FAMÍLIA DE PEPTIDASES S2A E/OU FAMÍLIA DE PEPTIDASES S1E, MÉTODO PARA PRODUZIR O POLIPEPTÍDEO, ADITIVO DE RAÇÃO ANIMAL, COMPOSIÇÃO DE RAÇÃO ANIMAL, E, COMPOSIÇÃO DETERGENTE” CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a determinada classe de serina proteases que são estáveis e/ou relativamente não afetadas pelo cobre, e também a DNA que codifica estas proteases, e a seu uso na ração animal e em detergentes.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO A clonagem e expressão de uma protease derivada de Metarhizium anisopliae é divulgada por Steven E. Screen e Raymond J. St. Leger no The Journal ofBiological Chemistry, vol. 275, n° 9, 2000, pp. 66896694. A seqüência de nucleotídeos, chyl, da mesma é mostrada na seqüência de listagem como SEQ ID NO: 3, e a seqüência de aminoácidos deduzida, CHY1, como SEQ ID NO: 4 (TREMBL:Q9Y843).

Proteases derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 e Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133 encontram-se descritas no WO 88/03947. O DNA e seqüências de aminoácidos da protease derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 são mostrados no pedido de patente DK n° 1996 00013. WO 01/58276 descreve o uso, na ração animal, de proteases estáveis a ácido relacionadas com a protease derivada de Nocardiopsis sp. NRRL n° 18262. JP 2255081 A descreve uma protease purificada de Nocardiopsis sp, FERM P-1-508, GDR patente n° DD 2,004,328 divulga uma protease derivada de Nocardiopsis dassonvillei ZIMET 43647.

Constitui um objeto da presente invenção proporcionar proteases alternativas para vários usos industriais, por exemplo, para uso na ração animal e/ou detergentes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção refere-se a um protease da família de peptidases S2A ou S1E que: i) apresenta uma atividade residual de pelo menos 0,80 após incubação durante 164 horas, a pH 7 e 25°C, em tampão de ensaio suplementado com 0,1 % de K-Sorbate, e na presença de 1 mM de Cu2+, sendo que a atividade residual é medida relativamente à atividade após 0 horas de incubação; e/ou ii) apresenta uma atividade relativa de pelo menos 0,66 na presença de 1 mM de Cu , relativamente a um controle sem Cu ; sendo que as medições de atividade de i) e ii) são no substrato Suc-AAPF-pNA, em tampão de ensaio a pH 7,0 e 25°C; e sendo que para as medições de i), a protease apresenta uma pureza por SDS-PAGE de pelo menos 90 %. A invenção refere-se também a seqüências de ácido nucleico isoladas codificando esta protease e a construções de ácido nucleico, vetores, e células hospedeiras compreendendo as seqüências de ácido nucleico, e também a métodos para produzir e utilizar a protease.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 é um alinhamento múltiplo da parte madura do peptídeo de proteases derivadas de Nocardiopsis sp. NRRL 18262 (Protease 10, aminoácidos de 1-188 da SEQ ID NO: 2), Metarhizium anisopliae (Metarhizium protease, aminoácidos de 1-188 da SEQ ID NO: 4), Nocardiopsis prasina DSM 15648 (Protease 11, aminoácidos de 1-188 da SEQ ID NO: 6), Nocardiopsis prasina DSM 15649 (Protease 35, aminoácidos de 1-188 da SEQ ID NO: 8), Nocardiopsis alba DSM 15647 (Protease 08, aminoácidos de 1-188 da SEQ ID NO: 10), Nocardiopsis dassonvillei subespécie dassonvilki DSM 43235 (Protease 18, aminoácidos de 1-188 da SEQ ID NO: 12), e Brachysporiella gayana CGMCC 0865 (Brachysporiella protease, aminoácidos de 1-186 da SEQ ID NO: 14).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Uma descrição de serina proteases de famílias de peptidases S2A e S1E é incluída na seção intitulada "polipeptídeos apresentando atividade de protease".

Estabilidade E Inibição Na Presença De Cobre A invenção refere-se a proteases que são i) relativamente estáveis na presença de Cu2+, e/ou ii) inibidas por Cu2+ em grau relativamente reduzido.

Característica i) é determinada como atividade enzimática residual (= restante, ou remanescente) após se ter incubado a enzima durante 164 horas, a pH 7 e 25 °C, em tampão de ensaio suplementado com 0,1 % de K-Sorbate (para fins de preservação), e na presença de 1 mM de Cu , A atividade residual é medida relativamente à atividade após 0 horas de incubação. Para a protease da invenção, a atividade residual é de pelo menos 0,80(= 80 %). A atividade de protease é medida utilizando-se o substrato Suc-AAPF-pNA, em tampão de ensaio a pH 7,0 e 25°C. Para mais detalhes, pede-se referir ao ensaio de pNA descrito no Exemplo 4, que também descreve em detalhe a determinação de acordo com i) e ii).

Considera-se presentemente que a pureza da protease testada pode influenciar estes resultados de estabilidade, e portanto a protease, pelo menos quando analisada quanto à estabilidade de acordo com i), é de preferência pelo menos 90 % pura conforme medido por SDS-PAGE. Um procedimento para determinar a pureza por meio de SDS-PAGE é divulgado no Exemplo 2. Em concretizações particulares, a pureza por SDS-PAGE é de pelo menos 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, ou pelo menos 95 %. Em concretizações alternativas, a pureza de absorção (ver Exemplo 3), em particular para os fins de teste i), corresponde a uma relação A2so/A2go de pelo menos 1,40, ou de pelo menos 1,42,1,44,1,46,1,48,1,50,1,60, ou pelo menos 1,70.

Característica ii) é determinada como a atividade de enzima na 7-4* presença de 1 mM de Cu , relativamente à atividade da mesma enzima nas Λ , mesmas condições, exceto quanto à presença de Cu . Para a protease da invenção, esta atividade relativa é de pelo menos 0,66 (=66 %). Para os fins da característica ii), a atividade de enzima (protease) é medida como descrito acima.

Em concretizações particulares das proteases da invenção, a atividade residual de acordo com i) é de pelo menos 0,81, 0,82, 0,83, 0,84, 0,85,0,86,0,87,0,88,0,89,0,90,0,91,0,92,0,93,0,94,0,95,0,96, ou de pelo menos 0,97.

Em concretizações alternativas, a atividade residual de acordo com i) é de pelo menos 0,76, 0,77, 0,78, ou 0,79. Em outras concretizações alternativas, a atividade residual de acordo com i) é determinada após incubação durante 116 horas, sendo que neste caso a atividade residual para proteases da invenção é de pelo menos 0,84, com as mesmas faixas preferidas conforme listado acima (de pelo menos 0,85 e acima). Em outras concretizações alternativas adicionais, a atividade residual de acordo com i) é determinada após incubação durante 188,6 horas, sendo que neste caso a atividade residual para as proteases da invenção é de pelo menos 0,73, com as mesmas faixas preferidas como listado acima (de pelo menos 0,76 e acima, mais os seguintes: ou de pelo menos 0,74, ou de pelo menos 0,75).

Em outro conjunto particular de concretizações das proteases da invenção, a atividade relativa de acordo com ii) é de pelo menos 0,67, 0,68,0,69,0,70,0,71,0,72,0,73,0,74,0,75,0,76,0,77,0,78,0,79, 0,80,0,81, ou de pelo menos 0,82.

Em uma concretização alternativa, o substrato Boc-VLGR- pNA é usado em lugar de Suc-AAPF-pNa para as medições de atividade - de acordo com i) e/ou ii).

Resultados de estudos de estabilidade e inibição de acordo com características i) e ii), respectivamente, são mostrados nas Tabelas 2 e 1, respectivamente, do Exemplo 4. A partir destas tabelas está claro que as proteases designadas como Protease 18 e protease de Brachysporiella são as únicas proteases testadas que atendem à característica i), sendo que a característica ii) é atendida por todas as proteases testadas, exceto quanto às proteases conhecidas designadas Protease 10 e protease d & Metarhizium.

Observando-se mais atentamente, a Tabela 1 revela que Protease 18 e Protease 08 formam um subgrupo muito interessante com uma atividade relativa distintamente maior na presença de cobre (ambos com uma atividade relativa acima de 0,80). No entanto, a protease de Brachysporiella também é muito boa (próxima de uma atividade relativa de 0,70). Isto significa que os dois testes i) e ii) identificam estas três proteases como particularmente interessante.

Antes de considerar elementos estruturais potenciais que possam explicar os efeitos observados, apresentamos aqui primeiramente algumas diretrizes para a numeração dos resíduos de aminoácidos nas várias proteases testadas, e instruções sobre como deduzir resíduos de aminoácidos correspondentes nas várias espinhas dorsais.

Numeração de resíduos de aminoácidos No presente contexto, para identificar resíduos de aminoácidos correspondentes em várias proteases, fez-se referência à numeração dos resíduos de aminoácidos na parte madura (aminoácidos de 1-188) da SEQ ID NO: 2, Protease 10, iniciando com Al e terminando com TI 88. Fig. 1 mostra, em aglomerados de alinhamento de 10 resíduos, os números do último resíduo de aminoácido de cada aglomerado do tipo referido, videlicet nas fileiras superiores do alinhamento. Por exemplo, o número "10" significa que o último resíduo de aminoácido de Protease 10 no primeiro aglomerado de 10 resíduos, "T" é o resíduo de aminoácido número 10 na seqüência de aminoácido da Protease 10 madura. Como outro exemplo, o número "145" significa que o último resíduo de aminoácido da Protease 10 neste último aglomerado de resíduos na terceira fileira do alinhamento da Fig. 1, que é um "G," é o resíduo número 145 na seqüência de aminoácidos da Protease 10 madura. Esta numeração é idêntica à numeração da SEQID NO: 2, no entanto não é necessariamente idêntica à numeração das SEQ ID NOs: 4, 6, 8,10,12, e 14, sendo que a razão é que, para os fins de identificar resíduos de aminoácidos correspondentes em várias proteases, utiliza-se uma numeração uniforme com base na Protease 10. O procedimento para determinação de uma numeração uniforme é descrita adicionalmente abaixo.

Para cada um dos resíduos de aminoácidos da Protease 10, é possível identificar um resíduo "correspondente" em cada uma das outras seis proteases mostradas na Fig. 1, porque resíduos "correspondentes" são simplesmente aqueles que são substituídos um acima do outro, ou no topo um do outro, no alinhamento da Fig. 1. Por exemplo, o décimo resíduo de aminoácido, T, da Protease 10 (T10 da SEQ ID NO: 2) corresponde a Y10 das SEQ ID NOs: 4 e 12; a T10 das SEQ ID NOs: 6, 8 e 10; e a V8 da SEQ ID NO: 14. No presente contexto, contudo, para todos os fins exceto para os fins de Listagem de Seqüência, estes resíduos recebem todos o mesmo número, porque eles se qualificam como "resíduos correspondentes", e o número designado é aquele do resíduo correspondente na Protease 10, viz. resíduo número 10. Assim, T10 da Protease 10 corresponde a Y10, T10, T10, T10, Y10, e V10, da protease de Metarhizium, Protease 11, Protease 35, Protease 08, Protease 18, e a protease de Brachysporiella, respectivamente. Quando nada mais é indicado, utiliza-se a numeração a seguir. O alinhamento múltiplo da Fig. 1, em determinadas fileiras, em determinadas posições, inclui intervalos, que podem ser considerados deleções de resíduos de aminoácidos. No presente contexto, os intervalos, ou os resíduos de aminoácidos deletados, são numerados designando-se a cada intervalo letras minúsculas em ordem alfabética, viz. a, b, c, d, —-1, u, v, x, y, z. Caso se necessite mais de 25 de designações do tipo referido, a numeração poderia continuar com aa, bb, cc etc. Por exemplo, o intervalo entre G12 e G13 da Protease 10 corresponde a uma deleção de dois resíduos de aminoácidos nas posições 12a, e 12b. Assim, os resíduos correspondentes na protease de Metarhizium (SEQ ID NO: 4) mostrados na segunda fileira da Fig, 1 são denominados RI2a, e SI2b. Por analogia, os resíduos de aminoácidos sucessivos FPGSA na protease de Metarhizium correspondente a FPGN nas posições de 57-60 da Protease 10 são numerados como a seguir: F57, P58, G59, S59a, e A60; posição 59a é equivalente a uma deleção de um aminoácido na Protease 10.

Duas das proteases incluídas no alinhamento da Fig. 1 compreendem extensões C-terminais em comparação com a Protease 10, viz. a protease de Metarhizium e a protease de Brachysporiella. Os aminoácidos de referidas extensões são numeradas como é usual na técnica continuando do n° 188, viz. 189, 190, 191 e assim por diante. Por exemplo, o último aminoácido da protease de Metarhizium é referido como Al 89.

Outra protease apresentando uma seqüência de aminoácidos com uma parte madura do peptídeo da SEQ ID NO: X pode ser adicionada ao alinhamento da Fig. 1 como a seguir: O percentual de identidade da SEQ ID NO: X com cada uma das sete proteases da Fig. 1 (cada uma das partes maduras dos peptídeos das SEQ ID NOs: 2, 4,6, 8,10,12 e 14) é determinado utilizando-se o programa "Align" como descrito abaixo. Com isso produz-se sete alinhamentos pareados. A seqüência com o grau mais alto de identidade com a SEQ ID NO: X é selecionada como uma protease modelo. Se houver mais proteases modelo Candidatas, seleciona-se uma que é listada primeiramente no alinhamento da Fig. 1. Se, por exemplo, SEQID NO: X puder ter o percentual de identidades a seguir com as SEQ ID NOs: 2,4, 6, S, 10,12, e 14:45 %, 55 %, 50 %, 65 %, 65 %, 45 %, e 40 %, respectivamente, então SEQ ID NO: 8 podería ser selecionado como a protease modelo. Como uma etapa seguinte, utilizando-se o alinhamento pareado da SEQ ID NO: X com a SEQ ID NO: 8, a SEQ ID NO: X é colada (ou podería simplesmente ser escrita) sobre o alinhamento da Fig. 1 como a fileira inferior, assegurando que resíduos de aminoácidos correspondentes (aqui "correspondente" refere-se ao alinhamento pareado da SEQ ID NO: X e SEQ ID NO: 8) são colocados um sobre o outro.

Enquanto que o alinhamento da Fig. 1 permanece não afetado por este procedimento de adicionar uma nova seqüência ao mesmo, o procedimento descrito pode dar origem a intervalos na SEQ ID NO: X; "alças" na SEQ ID NO: X, e/ou extensões N- ou C-terminais da SEQ ID NO: X, em, comparação com Protease 10 da Fig. 1.

No que se refere à numeração de referidas posições com vistas a identificar resíduos de aminoácidos correspondentes na SEQ ID NO: X, os intervalos e as extensões C-terminais são tratadas como descrito acima. Extensões N-terminais, se as houver, são numeradas como é usual na técnica, -1, -2, -3 e assim por diante ("-" significando "menos"). Por exemplo, se a SEQ ID NO: X, quando adicionada ao alinhamento da Fig. 1 puder começar com a seqüência ALI posicionada antes do aminoácido N-terminal Al da Protease 10, estes poderíam ser numerados A-3, L-2, e 1-1, respectivamente. No que se refere às alças, se as houver, isto corresponde à SEQ ID NO: X apresentando resíduos de aminoácidos em "excesso", para o que o alinhamento da Fig. 1 não oferece espaço. Tipograficamente, referidos resíduos em excesso são transferidos para a fileira seguinte, porém evidentemente eles são considerados incluídos no alinhamento múltiplo, e são numerados por analogia com o que se descreveu acima para a numeração de intervalos (utilizando-se as indicações a, b, c etc.)· For exemplo, o alinhamento pareado da SEQ ID NO: X e SEQ ID NO: 8 podería incluir a seguinte parte: (parte da SEQ ID NO: 8) FART—NAAGQP (parte da SEQ ID NO: X) YAVSCRTAKNAACQP.

Os resíduos de aminoácidos FAATNAAGQP da Protease 08 (SEQ ID NO: 8) apresentam números de alinhamento de 19 a 28 estes acabam correspondendo, no alinhamento pareado, aos seguintes resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO: X: YAVSCRTAKNAACQP. Para os presentes fms, os resíduos de aminoácidos da SEQ ID NO: X deveríam ser numerados como a seguir: Y19, A20, V21, S22, C22a, R22b, T22c, A22d, K22e, N23, A24, A25, C26, Q27, e P28.

No alinhamento da Fig. 1 isto pode ser escrito da seguinte maneira: (parte da SEQ ID NO: 8) FAATNAAGQP (parte da SEQ ID NO: X) YAVSNAACQP, CRTAK 22e Em concretizações alternativas particulares, os alinhamentos pareados referidos acima são produzidos utilizando-se as partes CDS completas (incluindo, adicionalmente às partes de peptídeo maduras, quaisquer partes de peptídeo-sinal, e/ou partes pró-peptídeo) das SEQ ID NOs: 2,4,6, 8,10,12 e 14. A seguir encontram-se exemplos da designação utilizada aqui para caracterizar proteases: Expressões como as seguintes: "Uma protease compreendendo uma seqüência de aminoácidos que, quando alinhada de acordo com a Fig. 1, compreende VI66, sendo que a numeração do resíduo de aminoácido corresponde à numeração da Protease 10 (aminoácidos de 1-188 da SEQ ID NO: 2)" significam que a seqüência de aminoácidos da protease em questão, quando adicionados ao alinhamento múltiplo da Fig. 1 como descrito acima, na posição número 166 (que se refere ao número de alinhamento deduzido como descrito acima) possui um V.

Expressões como "pelo menos um de (LI 14 ou Y114); (S121 ou D121); (Q130 ou M130); (NI 62 ou T162 ou S162); (S163 ou R163); E174; e/ou (S177 ou E177)," são usadas com relação a uma protease que atende um dos critérios (pelo menos um) separados por ponto-e-vírgula (;). Este é o caso, por exemplo, de uma protease apresentando Y114, ou S121, ou M130, ou El74, mas também de uma protease apresentando LI 14 e D121.

Expressões como: "Uma protease compreendendo pelo menos um dos seguintes: a) (T120 + R122 + T127 + Y129), (T120 + N122 + P127 + F129), ou (TI20 + S122 + T127 + Q129); e/ou b) (T91 + T176 + 1179 + NI 80), (S91 + N176 + L179 ΠΕΙ 80), ou (S91 + NI76 + LI79 + SI80)," são usadas com relação a uma protease que atende todos os critérios separados por sinais de mais (+) em pelo menos um dos seis parênteses. Este é o caso, por exemplo, da Protease 18 apresentando T120, R122, T127, e Y129 (primeiro colchete em a)). Além disso, esta protease também compreende T91, T176,1179 e N180 (primeiro colchete em b)).

Expressões como "(H35+D61+S143)" são usadas com relação à protease compreendendo H35, D61 e S143 (resíduos de aminoácido de sitio ativo).

Considerações estruturais relativas ao Cu As surpreendentes verificações da presente invenção, no que se refere à influência variável do cobre sobre as várias enzimas testadas, suscitou alguma pesquisa visando definir, se possível, elementos estruturais que poderíam explicar as diferenças observadas. Identificou-se dois sítios de ligação de cobre em potencial (sítios nums. I e II como mostrado na Tabela abaixo), dentre os quais se espera que o sítio n° I seja o sítio mais importante: Na Tabela acima, uma linha dupla (=) é colocada entre estas proteases que são relativamente não afetadas pelo cobre, e aquelas que são mais afetadas negativamente pelo cobre (aquelas acima e abaixo, respectivamente, da linha dupla).

Nesta Tabela tem-se a impressão de que as combinações de resíduos de sítio n° I a seguir são vantajosas no que se refere à obtenção de uma alta estabilidade e/ou uma baixa inibição pelo cobre: a) (T120+N122+A127+S129), eb) (S120+S122+T127+T129).

Por analogia, as combinações de resíduos de sítio n° II a seguir também podem ser desvantajosas: a) (S91+N176+L179+Q180), e b) (H91+T176+V179+N180).

Por outro lado, as combinações de resíduos de sítios nums. I e II a seguir parecem ser vantajosas: a) (T120+R122+T127+Y129), (T120+N 122+P127+F129), ou (T120+S122+T127+Q129); e/ou b) (T91+T176+1179+N180), (S91+N176+L179+E180), ou (S91+N176+L179+S180).

Outros resíduos que podem contribuir para uma explicação estrutural das diferenças observadas são os resíduos na posição 51,54, 86, 89, 99,125,130,131,135,165, e 166. Portanto, em concretizações particulares, a protease da invenção não compreende qualquer uma das combinações de resíduos a seguir: a) (V51 + Q54 + A86 + A89 + S99 + E125 + N130 + M131 + T135 + R165 + TI 66), e não b) (T51 + G54 + P86 + S89 +S99 + Q125 + S130 + L131 + S135 + S165+ R166).

Por outro lado, em concretizações particulares adicionais, a protease da invenção compreende pelo menos um dos seguintes: T51; N54 ou G54; Q86 ou P86; T89 ou F89; A99 ou G99; Q125 ou V125; S130 ou G130; L131; N135 ou S135; S165 ou T165; V166 ou S166. A expressão "pelo menos um" significa um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, ou todos os onze destes resíduos, em combinação. Para os fins da presente invenção, esta definição de "pelo menos um" é geralmente aplicável por analogia.

Em concretizações alternativas, a presente invenção refere-se explicitamente a proteases como definido nesta seção sem as características funcionais i) e ii) de acordo com a reivindicação 1 como depositado, de preferência proteases da família das peptidases S2A ou S1E.

Polipeptídeos apresentando atividade de protease Polipeptídeos apresentando atividade de protease, ou proteases, também são referidos algumas vezes como peptidases, proteinases, peptídeo hidrolases, ou enzimas proteolíticas. Proteases podem ser do tipo exo que hidrolisa peptídeos partindo de qualquer ponta dos mesmos, ou do tipo endo que atua intemamente em cadeias de polipeptídeo (endopeptidases). Endopeptidases apresentam atividade em substratos de peptídeos bloqueados N- e C-terminalmente que são relevantes para a especificidade da protease em questão. O termo "protease" é definido aqui como uma enzima que hidrolisa ligações de peptídeos. Ela inclui qualquer enzima pertencente ao grupo de enzimas EC 3.4 (incluindo cada uma das trezes subclasses das mesmas). O número de EC refere-se à Enzyme Nomenclature 1992 da NC- IUBMB, Academic Press, San Diego, Califórnia, incluindo suplementos 1-5 publicados em Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250,1-6; e Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; respectivamente. A nomenclatura é suplementada e atualizada regularmente; ver por exemplo o endereço na World Wide Web (WWW) em http://www.chem.qmw,ac.uk/iubmb/enzyme/ index.html.

Proteases são classificadas com base em seu mecanismo catalítico nos seguintes grupos: serina proteases (S), proteases de Cisteína (C), proteases Aspárticas (A), Metaloproteases (M), e proteases desconhecidas, ou ainda não classificadas (U), ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J.Barrett, N.D.Rawlings, J.F.Woessner (eds), Academic Press (1998), em particular a parte de introdução geral.

As proteases da invenção são selecionadas do grupo que consiste de: (a) serina proteases da família de peptidases S2A de acordo com o Manual acima; e (b) serina proteases da família de peptidases S1E como descrito em Biochem. J. 290:205-218 (1993) e no banco de dados de proteases MEROPS, edição 6,20, 24 de março de 2003, (www.merops.ac.uk). O banco de dados é descrito em Rawlings, N.D., 0'Brien, E, A. & Barrett, A.J. (2002) MEROPS: theproiease database. Nucleic Acids Res. 30, 343-346. A família de peptidases S2A representa a maneira tradicional de classificar proteases. Hoje em dia, proteases classificadas tradicionalmente como proteases S2A são freqüentemente classificadas de acordo com a classificação MEROPS em família de peptidases SI E.

Em uma concretização particular, a protease é da família de peptidases S2A. Em outra concretização particular, a protease é da família de peptidases SI E.

Em concretizações alternativas, as proteases da invenção são selecionados do grupo que consiste de: (c) proteases pertencentes ao grupo de enzimas EC 3.4.--; e (d) serina proteases pertencentes ao grupo S do Manual acima;

Para se determinar se uma dada protease é uma protease Serina, uma protease da família S2A, e/ou uma protease da família S1E, deve-se fazer referência às referências acima e aos princípios ali indicados. Uma determinação do tipo referido pode ser realizada para todos os tipos de proteases, sejam proteases naturalmente ocorrentes ou de tipo selvagem; ou proteases sintéticas ou modificadas geneticamente. A atividade de protease pode ser medida utilizando-se qualquer ensaio em que se emprega um substrato que inclui ligações peptídicas relevantes para a especificidade da protease em questão. O pH do ensaio e a temperatura do ensaio também precisam ser adaptados para a protease em questão. Exemplos de valores de pH para o ensaio pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,10,11, ou 12. Exemplos de temperaturas para o ensaio são 20, 25, 30,35,37,40,45,50,55,60,65,70 ou 80°C.

Exemplos de substratos de protease são caseína, como Azurim-Crosslinked Casein (AZCL-casein). Para os fins desta invenção, o assim-chamado ensaio de pNA é um ensaio preferido, e um substrato preferido é Suc-AAPF-pNA. Não há limitações quanto à origem da protease da invenção. Assim, o termo protease inclui não só proteases naturais ou de tipo selvagem obtidas de microorganismos de qualquer gênero, mas também quaisquer mutantes, variantes, fragmentos etc. dos mesmos apresentando atividade de protease, e também proteases sintéticas, como proteases embaralhadas, e proteases de consensus. Referidas proteases manipuladas geneticamente podem ser preparadas como é de conhecimento geral na técnica, por exemplo por meio de mutagênese direcionada-para-sítio, por meio de Reação em Cadeia de Polimerase [PCR] (utilizando-se um fragmento de PCR contendo a mutação desejada como um dos iniciadores nas reações de PCR), por meio de embaralhamento, ou por meio de Mutagênese Randômica. A preparação de proteínas de consensus é descrita, por exemplo, na EP 897985, o termo "obtido de" como usado aqui em conexão com uma dada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado pela seqüência de ácido nucleico é produzido pela fonte ou por uma célula em que a seqüência de ácido nucleico da fonte está presente. Em uma concretização preferida, o polipeptídeo é secretado extracelularmente.

Em uma concretização especifica, a protease é uma variante hipo-alergênica, projetada para evocar uma resposta imunológica reduzida quando exposta a animais, incluindo o Homem. O termo resposta imunológica deve ser compreendido como qualquer reação por parte do sistema imunológico de um animal exposto à protease. Um tipo de resposta imunológica é uma resposta alérgica que leva a níveis incrementados IgE no animal exposto. É possível preparar variantes hipo-alergênicas utilizando técnicas conhecidas na técnica. Por exemplo, a protease pode ser conjugada com porções de polímero que protegem porções ou epitopos da protease envolvida em uma resposta imunológica. A conjugação com polímeros pode envolver acoplamento químico in viiro de polímero com a protease, por exemplo como descrito em WO 96/17929, WO 98/30682, WO 98/35026, e/ou WO 99/00489. Adicionalmente ou altemativamente a isto, conjugação pode envolver acoplamento in vivo de polímeros com a protease. Referida conjugação pode ser obtida por meio de manipulação genética da seqüência de nucleotídeos que codifica a protease, inserindo seqüências consensus que codificam sítios de glicosilação adicional na protease e expressando a protease em um hospedeiro capaz de glicosilar a protease, ver por exemplo WO 00/26354. Outra maneira de proporcionar variantes hipo-alergênicas é a manipulação genética da seqüência de nucleotídeos que codifica a protease de forma a causar auto-oligomerização da protease, proporcionando assim que monômeros de protease possam proteger os epitopos de outros monômeros de protease e, com isso, diminuir a antigenicidade dos oligômeros. Referidos produtos e sua preparação são descritos, por exemplo no WO 96/16177. Epitopos envolvidos numa resposta imunológica podem ser identificados por meio de vários métodos, como o método de apresentação de fago descrito no WO 00/26230 e WO 01/83559, ou a abordagem randômica descrita na EP 561907. Uma vez identificado um epitopo, sua seqüência de aminoácidos pode ser alterada para produzir propriedades imunológicas alteradas da protease por meio de técnicas de manipulação genética conhecidas, como mutagênese direcionada-para-sítio (ver por exemplo WO 00/26230, WO 00/26354 e/ou WO 00/22103) e/ou a conjugação de um polímero pode ser realizada em suficiente proximidade com o epitopo para que o polímero possa proteger o epitopo.

Em uma concretização particular, o polipeptídeo da invenção compreende uma seqüência de aminoácidos apresentando atividade de protease e apresentando um grau de identidade de pelo menos 40 % com os aminoácidos de 1 a 186 da SEQ ID NO: 14, e/ou com os aminoácidos de 1188 da (SEQ ID NOs: 12, 10, 8, 6, 4 ou 2) (denominados a seguir "polipeptídeos homólogos"). Em outras concretizações particulares, o grau de identidade é pelo menos cerca de 42 %, 44 %, 46 %, 48 %, 50 %, 52 %, 54 %, 56 %, 58 %, 60 %, 62 %, 63 %, 64 %, 66 %, 68 %, 70 %, 72 %, 75 %, 77 %, 80 %, 82 %, 85 %, 87 %, 90 %, 92 %, 95 %, ou pelo menos cerca de 97 %. Em outra concretização alternativa, qualquer um dos graus de identidade acima é relativo a qualquer uma das partes CDS completas das SEQ ID NOs: 14, 12, 10, 8, 6, 4 ou 2, por exemplo aminoácidos de 189 a 186 da SEQ ID NO: 2. Em particular concretizações, os polipeptídeos da invenção i) possuem; ou ii) consistem de uma seqüência de aminoácidos com qualquer um dos graus de identidade indicados acima.

Para os fins da presente invenção, o grau de identidade entre duas seqüências de aminoácidos, e também o grau de identidade entre duas seqüências de nucleotídeos, é determinado com o programa "Align" que é um alinhamento de Needleman-Wunsch (isto é um alinhamento global). O programa é usado para alinhamento de polipeptídeo, e também seqüências de nucleotídeos. Utiliza-se a matriz de classificação padrão BLOSUM50 para alinhamentos de polipeptídeos, e utiliza-se a matriz de identidade padrão para alinhamentos de nucleotídeos. A penalidade para o primeiro resíduo de um intervalo é -12 para polipeptídeos e -16 para nucleotídeos. As penalidades para resíduos adicionais de um intervalo são -2 para polipeptídeos, e -4 para nucleotídeo. "Align" é parte do pacote [de programas] FASTA versão v20u6 (ver W. R. Pearson e D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448, e W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP e FASTA," Methods in Enzymology 183:63-98). Alinhamentos de proteína FASTA utilizam o algoritmo Smith-Waterman sem limitação quanto ao tamanho do intervalo (ver "Smith-Waterman algorithm", T. F. Smith e M. S. Waterman (1981)7. Mol. Biol. 147:195-197).

Em uma concretização particular, as partes de peptídeo maduro, ou partes de peptídeo maduro preditas ou esperadas, das duas seqüências de aminoácidos são usadas para o alinhamento.

Na alternativa, o grau de identidade entre duas seqüências de aminoácidos pode ser determinado por meio do método Clustal (Higgins, 1989, CABIOS 5: 151-153) utilizando-se o programa LASERGENE® MEGALÍGN® (DNASTAR, Inc., Madison, WI) com uma tabela de identidade e os parâmetros de alinhamento múltiplos a seguir: Penalidade de Intervalo de 10, e penalidade de comprimento de intervalo de 10. Parâmetros de alinhamento pareado são Ktuple=l, penalidade de intervalo =3, janelas =5, e diagonais=5. 0 grau de identidade entre duas seqüências de nucleotídeos pode ser determinado utilizando-se o mesmo algoritmo e pacote de programas descritos acima, com os seguintes ajustes: penalidade de intervalo de 10, e comprimento de penalidade de intervalo de 10. Parâmetros de alinhamento pareado são Ktuple=3, penalidade de intervalo =3 e janelas=20.

Em uma concretização particular, os polipeptídeos homólogos apresentam uma seqüência de aminoácidos que difere em dez, ou nove, ou oito, ou sete, ou seis, ou cinco aminoácidos. Em outra concretização particular, os polipeptídeos homólogos diferem em quatro, ou três, ou dois aminoácidos, ou um aminoácido dos aminoácidos de 1 a 186 da SEQ ÍD NO: 14, ou dos aminoácidos de 1-188 da (SEQ ID NOs: 12,10, 8, 6, 4 ou 2). Em concretizações alternativas, os polipeptídeos homólogos apresentam uma seqüência de aminoácidos que difere em quarenta, trinta e cinco, trinta, vinte e cinco, vinte, ou quinze aminoácidos dos aminoácidos de 1 a 186 da SEQ ID NO: 14, ou dos aminoácidos de 1-188 da (SEQ ID NOs: 12,10,8,6,4 ou 2).

Em uma concretização particular, os polipeptídeos da presente invenção compreendem a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos de 1 a 186 da SEQ ID NO: 14, ou aminoácidos de 1-188 da (SEQ ID NOs: 12,10, 8, 6, 4 ou 2), ou variantes alélicas das mesmas; ou fragmentos das mesmas que apresentam atividade de protease.

Em outra concretização preferida, os polipeptídeos da presente invenção consistem de aminoácidos de 1 a 186 da SEQ ID NO: 14, ou dos aminoácidos de 1-188 da (SEQ ID NOs: 12, 10, 8 ou 6), ou variantes alélicas das mesmas; ou fragmentos das mesmas que apresentam atividade de protease.

Um fragmento é um polipeptídeo apresentando um ou mais aminoácidos deletados da ponta amino e/ou carboxila destas seqüências de aminoácidos. Em uma concretização um fragmento contém pelo menos 75 resíduos de aminoácidos, ou pelo menos 100 resíduos de aminoácidos, ou pelo menos 125 resíduos de aminoácidos, ou pelo menos 150 resíduos de aminoácidos, ou pelo menos 160 resíduos de aminoácidos, ou pelo menos 165 resíduos de aminoácidos, ou pelo menos 170 resíduos de aminoácidos, ou pelo menos 175 resíduos de aminoácidos.

Uma variante alélica indica qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo lócus cromossômico. Variação alélica ocorre naturalmente por meio de mutação, e pode resultar em polimorfismo entre populações. Mutações gênicas podem ser silenciosas (sem alteração do polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos apresentando seqüências de aminoácidos alteradas. Uma variante alélica de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificada por uma variante alélica de um gene. A presente invenção refere-se também a polipeptídeos isolados apresentando atividade de protease e que são codificados por seqüências de ácido nucleico que hibridizam em condições de estringência muito baixas, ou baixas, ou médias, ou médias-altas, ou altas, ou muito altas com uma sonda de ácido nucleico que hibridiza nas mesmas condições com (a) nucleotídeos de 726-1283 da SEQ ID NO: 13, nucleotídeos de 499-1062 da SEQ ID NO: 11, nucleotídeos de 502-1065 da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos de 496-1059 da SEQ ID NO: 7, nucleotídeos de 496-1059 da SEQ ID NO: 5, nucleotídeos de 559-1122 da SEQ ID NO: 3, e/ou nucleotídeos de 900-1466 da SEQ ID NO: 1; (b) uma subseqüência de (a), ou (c) um filamento complementar de (a), ou (b) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, T edição, Cold Spring Harbor, New York). Em uma concretização particular a sonda de ácido nucleico é selecionada dentre as seqüências de ácido nucleico de (a), (b), ou (c) acima. Nucleotídeos de 7261283 da SEQ ID NO: 13, nucleotídeos de 499-1062 da SEQ ID NO: 11, nucleotídeos de 502-1065 da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos de 496-1059 da SEQ ID NO: 7, nucleotídeos de 496-1059 da SEQ ID NO: 5, nucleotídeos de 559-1122 da SEQ ID NO: 3, e/ou nucleotídeos de 900-1466 da SEQ ID NO: 1, correspondentes às respectivas partes de peptídeo maduro, são sondas preferidas. A subseqüência pode ser de pelo menos 100 nucleotídeos, ou em outra concretização de pelo menos 200 nucleotídeos. Além disso, a subseqüência pode codificar um fragmento de polipeptídeo que apresenta atividade de protease.

As seqüências de ácido nucleico listadas em (a) ou (b) acima, e também as correspondentes seqüências de aminoácidos ou fragmentos das mesmas, podem ser usadas para projetar uma sonda de ácido nucleico para identificar e clonar DNA que codifica polipeptídeos apresentando atividade de protease de cepas de diferente gêneros ou espécies de acordo com métodos poço conhecidos na técnica. Em particular, referidas sondas podem ser usadas para hibridização com o cDNA ou DNA genômico do gênero ou espécie de interesse, de acordo com procedimentos de Southern blotting convencionais, para identificar e isolar o gene correspondente ali. Referidas sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a seqüência inteira, porém deveríam ter comprimento de pelo menos 15, de preferência pelo menos 25, e mais preferivelmente pelo menos 35 nucleotídeos. Também é possível usar sondas mais longas. E possível utilizar ambas as sondas de DNA e RNA. As sondas são marcadas tipicamente para detectar o gene correspondente (por exemplo, com P, H, S, biotina, ou avidina). Referidas sondas são abrangidas pela presente invenção.

Assim, uma coleção de cDNA ou DNA genômico preparada de tais outros organismos pode ser selecionada quanto a DNA que hibridiza com as sondas descritas acima e que codifica um polipeptídeo apresentando atividade de protease. DNA genômico ou outro DNA de referidos outros organismos pode ser separado por meio de eletroforese em gel de agarose ou poliacrilamida, ou por meio de outras técnicas de separação. DNA das coleções ou o DNA separado pode ser transferido para, e imobilizado em, nitrocelulose ou outro material de veículo apropriado. Para identificar um clone homólogo ou DNA homólogo, o material de veículo é usado em um Southern blotting. Para os fins da presente invenção, hibridização indica que a seqüência de ácido nucleico hibridiza com uma sonda de ácido nucleico marcada correspondente à seqüência de ácido nucleico selecionada, seu filamento complementar, ou uma subseqüência do mesmo, em condições de estringência muito altas. Moléculas com as quais a sonda de ácido nucleico hibridiza nessas condições podem ser detectadas utilizando-se película de raios-X.

Em uma concretização particular, a sonda de ácido nucleico consiste de nucleotídeos de 726-1283 da SEQ ID NO: 13, nucleotídeos de 499-1062 da SEQ ID NO: 11, nucleotídeos de 502-1065 da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos de 496-1059 da SEQ ID NO: 7, nucleotídeos de 496-1059 da SEQ ID NO: 5, nucleotídeos de 559-1122 da SEQ ID NO: 3, e/ou nucleotídeos de 900-1466 da SEQ ID NO: 1. Em outra concretização, a sonda de ácido nucleico é uma seqüência de ácido nucleico que codifica as seqüências de aminoácidos correspondentes a qualquer uma das seqüências de nucleotídeos listadas na frase precedente.

Em outra concretização preferida, a sonda de ácido nucleico é a seqüência de ácido nucleico, ou, de preferência, a região codificante do polipeptídeo maduro do mesmo, que é contida no plasmídeo que está contido em Escherichia coli DSM 15509, sendo que a seqüência de ácido nucleico codifica um polipeptídeo apresentando atividade de protease.

Para sondas longas com um comprimento de pelo menos 100 nucleotídeos, condições de estringência de muito baixa até muito alta são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3 % de SDS, 200 pg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e ou 25 % de formamida para estringências muito baixas e baixas, 35 % de formamida para estringências médias e médias-altas, ou 50 % de formamida para estringências altas e muito altas, permitindo procedimentos de Southern blotting.

Para sondas longas com um comprimento de menos 100 nucleotídeos, o material de veículo é finalmente lavado três vezes cada um durante 15 minutos utilizando-se 2 x SSC, 0,2 % de SDS de preferência pelo menos a 45°C (estringência muito baixa), mais preferivelmente pelo menos a 50°C (baixa estringência), mais preferivelmente pelo menos a 55°C (média estringência), mais preferivelmente pelo menos a 60°C (estringência média-alta), ainda mais preferivelmente pelo menos a 65°C (alta estringência), e, o mais preferivelmente, pelo menos a 70°C (estringência muito alta).

Para sondas curtas, com um comprimento de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos, condições de estringência são definidas como pré-hibridização, hibridização, e lavagem pós-hibridização a 5°C a 10°C abaixo da Tra calculada utilizando-se o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) em 0,9 M de NaCl, 0,09 M de Tris-HCl pH 7, 6, 6 mM de EDTA, 0,5 % de NP-40, IX solução de Denhardt, 1 mM de pirofosfato de sódio, 1 mM de fosfato de sódio monobásico, 0,1 mM de ATP, e 0,2 mg de RNA de levedura por ml segundo procedimentos de Southern blotting padrão.

Para sondas curtas com um comprimento de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos, o material de veículo é lavado uma vez em 6X SSC mais 0,1 % de SDS durante 15 minutos e duas vezes cada um durante 15 minutos utilizando-se 6X SSC a de 5°C a 10°C abaixo da Tm calculada. A presente invenção refere-se também a variantes do polipeptídeo apresentando aminoácidos de 1 a 186 da SEQ ID NO: 14, e/ou aminoácidos de 1-188 da (SEQ ID NOs: 12,10, 8, 6, 4 ou 2) compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos.

As seqüências de aminoácidos dos polipeptideos variantes podem diferir da seqüência de aminoácidos dos aminoácidos de 1 a 186, de -170 a 186, ou de -189 a 186 da SEQ ID NO: 14, ou das partes correspondentes de qualquer uma das SEQ ID NOs: 12,10, 8, 6, 4 ou 2, por meio de uma inserção ou deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos e/ou a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos por meio de diferentes resíduos de aminoácidos. De preferência, alterações de aminoácidos são de natureza menor, ou seja, substituições conservativas de aminoácidos que não afetam significativamente a dobragem e/ou atividade da proteína; pequenas deleções, tipicamente de um até cerca de 30 aminoácidos; pequenas extensões amino- ou carboxila-terminais, como um resíduo metionina amino-terminal; um peptídeo ligante menor com até 20-25 resíduos; ou uma pequena extensão que facilita purificação por meio de alteração pura ou outra função, como um trato poli-histidina, um epitopo antigênico ou um domínio de ligação.

Exemplos de substituições conservativas encontram-se dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoácidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na técnica e encontram-se descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, em The Proteins, Academic Press, New York. As alterações que ocorrem mais comumente são Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/val, Ala/Glu, e Asp/Gly bem como estes de forma invertida.

Em uma concretização particular, os polipeptideos da invenção e para uso de acordo com a invenção são estáveis a ácido. Para os presentes fins, o termo estável a ácido significa que a atividade residual após 2 horas de incubação a pH 3,0 e 37°C, é de pelo menos 20 %, em comparação com a atividade residual de uma amostra correspondente incubada durante 2 horas a pH 9,0 e 5°C. Em uma concretização particular, a atividade residual é de pelo menos 22 %, 24 %, 25 % ou de pelo menos 26 %. Na alternativa, a definição de estabilidade a ácido refere-se à atividade residual de pelo menos 50 %, ou 60 %, ou 70 % quando medida a pH 3,5 e 37°C, em comparação com a atividade residual de uma amostra correspondente incubada durante 2 horas a pH 9,0 e 5°C. Um ensaio vantajoso para determinar a estabilidade a ácidos encontra-se divulgado no Exemplo 2C do WO 01/58276.

Em outra concretização particular, os polipeptídeos da invenção e para uso de acordo com a invenção apresentam a atividade relativa a pH 7,0 de pelo menos 0,2, 0,3, 0,4, ou de pelo menos 0,5. O teste de perfil de pH do Exemplo 2B do WO 01/58276 é um ensaio vantajoso. O polipeptídeo da invenção e para uso de acordo com a invenção pode ser um polipeptídeo bacteriano ou fungico. O polipeptídeo fúngico pode ser derivado de um fungo filamentoso ou de uma levedura.

Em particular concretizações, o polipeptídeo da invenção é i) uma protease fungica; ii) uma protease derivada de filo Ascomycota; iii) o subfilo Pezizomycotina; iv) a classe Sordariomycetes; v) a ordem Sordariales; vi) a família Annulatascaceae; vii) o gênero Ascotaiwania e/ou Brachysporiella (sendo que Brachysporiella é o estado anamórfico (assexual) deste fungo, e sendo que Ascotaiwania é o estado teleomórfico ou sexual); e/ou viii) uma protease derivada de uma cepa de Ascotaiwania e/ou Brachysporiella, por exemplo Ascotaiwania mitriformis, Ascotaiwania sawada, Brachysporiella gayana, e Brachysporiella sp., por exemplo Brachysporiella gayana CGMCC 0865, como um polipeptídeo com a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos de 1 a 186, de -170 a 186, ou de - 189 a 186 da SEQIDNO: 14.

Deve-se compreender que no caso da espécie previamente indicada, a invenção abrange os estados perfeito e imperfeito, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamórficos, independentemente do nome da espécie pelo que são conhecidos. Aqueles versados na técnica perceberão facilmente a identidade de equivalentes apropriados. A taxonomia acima é principalmente de acordo com Ranghoo, V.M., Goh, T.K. & Hyde, K.D. 1999. Novas observações relativas a Monotosporella rhizoidea. Mycosciences 40: 377-382; e Sivichai, S., Hywel-Jones, N. & J. E.B.G. 1998, Liginicolous freshwater Ascomycota from Thailand: I. Ascotaiwania sawada e its anamorph State Monotosporella. Mycosciense 39: 307-311, Em outra concretização particular, o polipeptídeo da invenção é i) uma protease bacteriana; ii) uma protease derivada do filo Actinobacteria; iii) a classe Actinobacteria; iv) a ordem Actinomycetales v) a família Nocardiopsaceae; vi) o gênero Nocardiopsis; e/ou uma protease derivada de vii) espécie Nocardiopsis, como Nocardiopsis alba, Nocardiopsis antarctica, Nocardiopsis prasina, Nocardiopsis composta, Nocardiopsis exhalans, Nocardiopsis halophila, Nocardiopsis halotolerans, Nocardiopsis kunsanensis, Nocardiopsis listeri, Nocardiopsis lucentensis, Nocardiopsis metallicus, Nocardiopsis synnemataformans, Nocardiopsis trehalosi, Nocardiopsis tropica, Nocardiopsis umidischolae, Nocardiopsis xinjiangensis, ou Nocardiopsis dassonvillei, por exemplo: Nocardiopsis dassonvillei DSM 43235, como Protease 18, um polipeptídeo com a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos de 1 a 188, ou de-166 a 188, da SEQ IDNO: 12;

Nocardiopsis alba DSM 15647, como uma Protease 08, um polipeptídeo com a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos de 1 a 188, ou de-167 a 188, da SEQ IDNO: 10;

Nocardiopsis prasina DSM 15649, como Protease 35, um polipeptídeo com a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos de 1 a 188, ou de-165 a 188, daSEQID NO: 8;

Nocardiopsis prasina DSM 15648, como Protease 11, um polipeptídeo com a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos de 1 a 188, ou de-165 a 188, daSEQ IDNO:6.

Estas quatro proteases, juntamente com a protease de Brachysporiella gayana CGMCC 0865, a protease de Brachysporiella, como um polipeptídeo com a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos de 1 a 186, de -170 a 186, ou de -189 a 186 da SEQ ID NO: 14, formam uma concretização particular da invenção. Um subgrupo que consiste de Protease 18, Protease 08, e a protease de Brachysporiella é outra concretização particular da invenção, e um subgrupo que consiste da protease de Brachysporiella e Protease 18 é uma outra concretização particular adicional da invenção. A taxonomia acima é de acordo com o capítulo: The road map to the Manual por G.M. Garrity & J. G. Holt em Bergey's Manual of Systemaüc Bacteriology, 2001, segunda edição, volume 1, David R. Bone, Richard W. Castenholz. Cepas destas espécies são facilmente acessíveis ao público numa quantidade de coleções de cultura, como a American tipo Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).

Além disso, referidos polipeptídeos podem ser identificados e obtidos de outras fontes incluindo microorganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, compostos, água, etc.) utilizando-se as sondas indicadas acima. Técnicas para isolar microorganismos de habitats naturais são bem conhecidas na técnica. A seqüência de ácido nucleico pode então ser derivada selecionando-se de maneira semelhante uma coleção de cDNA ou DNA genômico de outro microorganismo. Uma vez que uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo foi detectada com a(s) sonda(s), a seqüência pode ser isolada ou clonada utilizando-se técnicas que são conhecidas por aqueles com prática ordinária na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et ai, 1989, supra).

Uma seleção de proteases que não são afetadas, ou que são relativamente não-afetadas, pelo cobre pode ser conduzida incorporando-se níveis desejados de Cu2+ e/ou Cu2+ em meio de seleção apropriado e seleção dos produtores de protease mais potentes. A expressão "potente" refere-se evidentemente à atividade de protease, que pode ser estimada utilizando-se qualquer procedimento de seleção de protease vantajoso, por exemplo baseado no tamanho das zonas de eliminação em meio sólido contendo leite desnatado. Exemplos de níveis desejados de cobre são de até 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000,5500,6000,6500,7000,7500,8000, 8500,9000,9500, ou de até 10000 ppm de Cu. O teor de Cu deveria ser de pelo menos 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 2, 3,4,5,6,7, 8,9 ou de pelo menos 10 ppm. A expressão 'ppm' meio partes por milhão (peso/peso), por exemplo mg/kg, e pode ser convertida a concentrações molares de Cu utilizando-se seu peso atômico (aprox. 63,5), como é de conhecimento comum na técnica, por exemplo 1 mM de Cu corresponde a 63,5 ppm de Cu.

Em uma concretização particular, a protease da invenção é isolada e/ou purificada. Como definido aqui, um polipeptídeo "isolado" é um polipeptídeo que é essencialmente livre de outros polipeptídeos, por exemplo, apresentando pelo menos cerca de 20 % de pureza, de preferência pelo menos cerca de 40 % pureza, mais preferivelmente cerca de 60 % de pureza, ainda mais preferivelmente cerca de 80 % de pureza, sendo o mais preferível cerca de 90 % de pureza, e de forma ainda mais preferível cerca de 95 % de pureza, conforme determinado por SDS-PAGE.

Polipeptídeos codificados pela seqüência de ácido nucleicos da presente invenção também incluem polipeptídeos fusionados ou polipeptídeos de fusão clivável em que outro polipeptídeo é fusionado na ponta N ou na ponta C do polipeptídeo ou fragmento do mesmo. Um polipeptídeo fusionado é produzido fusionando-se uma seqüência de ácido nucleico (ou uma porção do mesmo) codificando outro polipeptídeo com uma seqüência de ácido nucleico (ou uma porção da mesma) da presente invenção. Técnicas para produzir polipeptídeos de fusão são conhecidas na técnica, e incluem ligação das seqüências que codificam os polipeptídeos de tal forma que elas se encontrem na matriz e que a expressão do polipeptídeo fusionado se encontre sob o controle do mesmo promotor(es) e terminador.

Em concretizações particulares, o polipeptídeo da invenção não abrange (isto é, exclui): a) aminoácidos de -186 a 188,de -167 a 188, ou de 1-188 da SEQID NO: 4; b) aminoácidos de 1-188 da SEQ ID NO: 2; c) a protease de Nocardiopsis dassonvillei NRRL 18133 que é descrita em WO 88/03947, de preferência apresentando um peso molecular (MW) por SDS-PAGE de 20,500 Dalton, e pontos isoelétricos, pi, de 9,15 e 8,2; d) a protease de Nocardiopsis sp. que é descrita na JP 2255081 A, apresentando, de preferência, um MW por SDS eletroforese de 21.000 Da e um pH ótimo de 10-12; e/ou e) a protease derivada da cepa ZIMET 43647 da espécie Nocardiopsis dassonvillei descrita pela patente da GDR [German Democratic Republic, república democrática alemã] n° DD 2,004,328.

Seqüências de ácido nucleicos A presente invenção refere-se também a seqüências de ácidos nucleicos isoladas que codificam um polipeptídeo da presente invenção. Seqüência particular de ácido nucleicos da invenção são nucleotídeos de 7261283 da SEQ ID NO: 13, nucleotídeos de 499-1062 da SEQ ID NO: 11, nucleotídeos de 502-1065 da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos de 496-1059 da SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 496-1059 da SEQ ID NO: 5. Outra seqüência particular de ácido nucleico da invenção é a seqüência, de preferência a região codificante madura do polipeptídeo, que está contida no plasmídeo que está contido no microorganismo depositado Escherichia coli DSM 15509. A presente invenção também abrange seqüência de ácido nucleicos que codifica um polipeptídeo apresentando a seqüência de aminoácidos dos aminoácidos de 1 a 186 da SEQ ID NO: 14, e/ou aminoácidos de 1-188 da (SEQ ID NOs: 12, 10, 8, 6, 4 ou 2), que diferem das seqüências de nucleotídeos correspondentes em virtude da degeneração do código genético. A presente invenção refere-se também a subseqüências das seqüências de nucleotídeos acima que codificam fragmentos das seqüências de aminoácidos acima que apresentam atividade de protease.

Em uma subseqüência deletou-se um ou mais nucleotídeos da ponta 5' e/ou 3'. De preferência, uma subseqüência contém pelo menos 150, 190 ou pelo menos 225 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 300 nucleotídeos, ainda mais preferivelmente pelo menos 375,450,500, 531, 600, 700, 800,900,1000, ou 1100 nucleotídeos. A presente invenção refere-se também seqüências de nucleotídeos que codificam proteases que são mais estáveis na presença de cobre e/ou menos inibidas pelo cobre, que apresenta um grau de identidade de pelo menos 40 % com os nucleotídeos de 726-1283 da SEQ ID NO: 13, nucleotídeos de 499-1062 da SEQ ID NO: 11, nucleotídeos de 502-1065 da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos de 496-1059 da SEQ ID NO: 7, nucleotídeos de 496-1059 da SEQ ID NO: 5, nucleotídeos de 559-1122 da SEQ ID NO: 3, e/ou com os nucleotídeos de 900-1466 da SEQ ID NO: 1. Em concretizações particulares, o grau de identidade é de pelo menos 42 %, 45 %, 47 %, 50 %, 52 %, 55 %, 57 %, 60 %, 62 %, 64 %, 65 %, 67 %, 70 %, 72 %, 75, 77 %, 80 %, 82 %, 85 %, 87 %, 90 %, 92 %, 95 %, ou de pelo menos 97 %. A presente invenção refere-se também a seqüências de ácido nucleico mutantes compreendendo pelo menos uma mutação em qualquer uma das seqüências de nucleotídeos acima, em que a seqüência de ácido nucleico mutante codifica um polipeptídeo que (i) consiste de qualquer uma das seqüências de aminoácidos correspondentes, ou (ii) é uma variante de qualquer uma das seqüências de (i), sendo que a variante compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos, ou (iii) é uma variante alélica de qualquer uma das seqüências de (i), ou (iv) é um fragmento de qualquer uma das seqüências de (Í).

As técnicas usadas para isolar ou clonar uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo são conhecidas na técnica e incluem isolamento de DNA genômico, preparação de cDNA, ou uma combinação das mesmas. A clonagem da seqüência de ácido nucleicos da presente invenção de referido DNA genômico pode ser efetuada, por exemplo, por meio do uso de reação em cadeia de polimerase (PCR) bem conhecida ou de seleção com anticorpos de coleções de expressão para detectar fragmentos de DNA clonados com características estruturais compartilhadas. Ver, por exemplo, Innis et ai, 1990, PCR: A Guide to Methods e Application, Academic Press, New York, É possível utilizar outros procedimentos de amplificação de ácido nucleico, como reação em cadeia de ligase (LCR), transcrição ligada ativada (LAT) e amplificação baseada em seqüência de ácido nucleico (NASBA). A seqüência de ácido nucleico pode ser clonada da cepa de Brachysporiella (Ascotaiwania), ou de uma cepa de Nocardiopsis, ou de outro organismo ou organismo relacionado e, assim, por exemplo, pode ser uma variante alélica ou de espécie das regiões que codificam polipeptídeo da seqüência de ácido nucleicos. O termo "seqüência isolada de ácido nucleico" como usado aqui refere-se a uma seqüência de ácido nucleico que é essencialmente livre de outra seqüência de ácido nucleicos, por exemplo, com pelo menos cerca de 20 % de pureza, de preferência com pelo menos cerca de 40 % de pureza, mais preferivelmente com pelo menos cerca de 60 % de pureza, ainda mais preferivelmente com pelo menos cerca de 80 % de pureza, e, o mais preferivelmente, com pelo menos cerca de 90 % de pureza conforme determinado por meio de eletroforese em agarose. Por exemplo, é possível obter uma seqüência isolada de ácido nucleico por meio de procedimentos de clonagem convencionais usados na engenharia genética para relocar a seqüência de ácido nucleico de sua localização natural para um sítio diferente onde será produzida. Os procedimentos de clonagem podem envolver excisão e isolamento de um fragmento de ácido nucleico desejado compreendendo a seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, inserção do fragmento em uma molécula de vetor, e incorporação do vetor recombinante em uma célula hospedeira em que se replicará múltiplas cópias ou clones da seqüência de ácido nucleico. A seqüência de ácido nucleico pode ser de origem genômica, cDNA, RNA, semissintética, sintética, ou quaisquer combinações das mesmas.

Modificação de uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de polipeptídeos substancialmente semelhante ao polipeptídeo. O termo "substancialmente semelhante" ao polipeptídeo refere-se a formas não-naturalmente do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir, em alguma forma manipulada do polipeptídeo isolado, de sua fonte nativa, por exemplo, variantes que diferem em atividade específica, termoestabilidade, pH ótimo, alergenicidade, ou análogos. A seqüência variante pode ser construída com base na seqüência de ácido nucleico apresentada como a parte codificante de polipeptídeo da SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 ou 13, por exemplo, uma subseqüência da mesma, e/ou por meio de introdução de substituições de nucleotídeos que não dão origem a outra seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificada pela seqüência de ácido nucleico, mas que corresponde à utilização de códon do organismo hospedeiro que se destina à produção da protease, ou por meio de introdução de substituições de nucleotídeos que pode dar origem a uma seqüência diferente de aminoácidos. Para uma descrição geral da substituição de nucleotídeos, ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Proteína Expressão e Purification 2: 95-107. Polipeptídeos hipo-alergênicos podem ser preparados, por exemplo como descrito acima.

Aqueles com prática na técnica perceberão que referidas substituições podem ser realizadas fora das regiões críticas para a função da molécula e ainda resultam em um polipeptídeo ativo. Resíduos de aminoácidos essenciais para a atividade do polipeptídeo codificado pela seqüência isolada de ácido nucleico da invenção, e, portanto, de preferência, não sujeitos a substituição, podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na técnica, como mutagênese direcionada-para-sítio ou mutagênese de varredura de alanina (ver, por exemplo, Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na técnica referida por último, introduz-se mutações em cada resíduo carregado positivamente na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto à atividade de protease para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Sítios de interação substrato-protease também podem ser determinados por meio de análise da estrutura tridimensional conforme determinado por referidas técnicas, como análise de ressonância magnética nuclear, cristalografia ou marcação por fotoafínidade (ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al, 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et ai, 1992, FEBS Letters 309: 59-64). A presente invenção refere-se também a seqüências isoladas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo da presente invenção, que hibridizam em condições de estringência muito baixas, de preferência condições de estringência baixas, mais preferivelmente condições de estringência médias, mais preferivelmente condições de estringência média- alta, ainda mais preferivelmente condições de estringência alta, e, o mais preferivelmente, condições de estringência muito altas com uma sonda de ácido nucleico que hibridiza nas mesmas condições com nucleotídeos de 7261283 da SEQ ID NO: 13, nucleotídeos de 499-1062 da SEQ ID NO: 11, nucleotídeos de 502-1065 da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos de 496-1059 da SEQ ID NO: 7, nucleotídeos de 496-1059 da SEQ ID NO: 5, nucleotídeos de 559-1122 da SEQ ID NO: 3, e/ou nucleotídeos de 900-1466 da SEQ ID NO: 1; ou seus filamentos complementares; ou variantes alélicas e subseqüências das mesmas (Sambrook et ai, 1989, supra), como definido aqui. A presente invenção refere-se também a seqüências isoladas de ácido nucleico produzidas por meio de (a) hibridização de um DNA em condições de estringência muito baixas, baixas, médias, médias-altas, altas ou muito altas com (i) nucleotídeos de 726-1283 da SEQ ID NO: 13, nucleotídeos de 499-1062 da SEQ ID NO: 11, nucleotídeos de 502-1065 da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos de 496-1059 da SEQ ID NO: 7, nucleotídeos de 496-1059 da SEQ ID NO: 5, nucleotídeos de 559-1122 da SEQ ID NO: 3, e/ou nucleotídeos de 900-1466 da SEQ ID NO: 1; (ii) uma subseqüência de (i), ou (iii) um filamento complementar de (i), ou (ii); e (b) isolamento da seqüência de ácido nucleico. A subseqüência é, de preferência, uma seqüência de pelo menos 100 nucleotídeos, como uma seqüência que codifica um fragmento de polipeptídeo que apresenta atividade de protease.

Em concretizações particulares, a seqüência de ácido nucleico da invenção não abrange (isto é, exclui): a) nucleotídeos de 1-1122 e/ou de 559-1122 da SEQ ID NO: 3; e/ou b) nucleotídeos de 1-1596 e/ou de 900-1466 da SEQ ID NO: 1. Métodos de produzir seqüências mutantes de ácidos nucleicos A presente invenção refere-se adicionalmente a métodos de produzir uma seqüência de ácido nucleico mutante, compreendendo introduzir pelo menos uma mutação na seqüência codificante de polipeptídeo maduro com os nucleotídeos de 726-1283 da SEQ ID NO: 13, nucleotideos de 4991062 da SEQ ID NO: 11, nucleotídeos 502-1065 da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos 496-1059 da SEQ ID NO: 7, nucleotídeos 496-1059 da SEQ ID NO: 5, nucleotídeos 559-1122 da SEQ ID NO: 3, e/ou nucleotídeos 900-1466 da SEQ ID NO: 1, ou uma subseqüência da mesma, sendo que a seqüência mutante de ácido nucleico codifica um polipeptídeo que consiste das seqüências de aminoácidos correspondentes; ou fragmentos das mesmas que apresentam atividade de protease. A introdução de uma mutação na seqüência de ácido nucleico para trocar um nucleotídeo por outro nucleotídeo pode ser realizada por meio de mutagênese direcionada-para-sítio utilizando-se qualquer um dos métodos r conhecidos na técnica. E particularmente útil o procedimento que utiliza um vetor de DNA de filamento duplo, super-enrolado, com um inserto de interesse e dois iniciadores sintéticos contendo a mutação desejada. Os iniciadores de oligonucleotídeo, sendo cada um complementar para filamentos opostos do vetor, estendem-se durante a ciclização de temperatura por meio de Pfu DNA polimerase. Quando da incorporação dos iniciadores gera-se um plasmídeo mutado contendo vincos escalonados. Após ciclização de temperatura, o produto é tratado com Dpnl que é específico para DNA metilado e hemi-metilado para digerir o modelo de DNA parental e selecionar DNA sintetizado contendo mutação. Também é possível utilizar outros procedimentos conhecidos na técnica.

Construções de ácido nucleico A presente invenção refere-se também a construções de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de ácido nucleico da presente invenção ligada operacionalmente com um ou mais seqüências de controle que dirigem a expressão de seqüência codificante em uma célula hospedeira em condições compatíveis com as seqüências de controle. Expressão será compreendida como incluindo qualquer etapa envolvida na produção do polipeptídeo, incluindo, sem limitação, transcrição, modificação pós-transcricional, tradução, modificação pós-tradução, e secreção. "Construção de ácido nucleico" é definida aqui como uma molécula de ácido nucleico, de filamento simples ou duplo, que é isolada de um gene naturalmente ocorrente ou que foi modificado de forma a conter segmentos de ácido nucleico combinado e justaposto de uma maneira que, de outra forma, não podería existir na natureza. O termo construção de ácido nucleico é sinônimo do termo cassete de expressão quando a construção de ácido nucleico contém todas as seqüências de controle requeridas para expressão de uma seqüência codificante da presente invenção. O termo "seqüência codifícante" é definido aqui como uma seqüência de ácido nucleico que especifica a seqüência de aminoácidos de seu produto de proteína. Os limites da seqüência codifícante são geralmente determinados por um sítio de ligação de ribossoma (procariontes) ou por meio do códon de partida ATG (eucariontes) localizado imediatamente a montante da matriz de leitura aberta na ponta 5' do mRNA e uma seqüência terminadora de transcrição localizada imediatamente a jusante da matriz de leitura aberta na ponta 3' do mRNA. Uma seqüência codifícante pode incluir, porém sem limitação, seqüências de DNA, cDNA, e de ácido nucleico.

Uma seqüência de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser manipulada de diversas maneiras para proporcionar expressão do polipeptídeo.

Manipulação da seqüência de ácido nucleico antes de sua inserção em um vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar seqüências de ácido nucleico utilizando métodos de DNA recombinante são bem conhecidas na técnica. O termo "seqüências de controle" é definido aqui de forma a incluir todos os componentes que são necessários ou vantajosos para a expressão de um polipeptídeo da presente invenção. Cada seqüência de controle pode ser nativa ou estranha para a seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Referidas sequências de controle incluem, porém sem limitação, uma seqüência inicial, seqüência de poliadenilação, seqüência pró-peptídeo, promotor, seqüência peptídeo-sinal, e terminador de transcrição. No mínimo, as seqüências de controle incluem um promotor, e sinais de parada de tradução e transcricional. As seqüências de controle podem ser dotadas com ligantes com o objetivo de introduzir sítios de restrição específicos que facilitam a ligação das seqüências de controle com a região codificante da seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo. O termo "ligado operacionalmente" é definido aqui como uma configuração em que uma seqüência de controle é colocada apropriadamente numa posição relativa à seqüência codificante da seqüência de DNA de tal forma que a seqüência de controle venha a dirigir a expressão de um polipeptídeo. A seqüência de controle pode ser uma seqüência promotora apropriada, uma seqüência de ácido nucleico que é reconhecida por uma célula hospedeira para expressão da seqüência de ácido nucleico. A seqüência promotora contém seqüências de controle transcricionais que mediam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer seqüência de ácido nucleico que apresenta atividade transcricional na célula hospedeira de escol incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido de genes que codificam polipeptídeos extracelulares ou intracelulares homólogos ou heterólogos para a célula hospedeira.

Exemplos de promotores vantajosos para dirigir a transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção em uma célula hospedeira de fimgo filamentoso são promotores obtidos dos genes para amilase de Aspergillus oryzae TAKA, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, alfa-amilase neutra de Aspergillus niger, alfa-amilase estável a ácido de Aspergillus niger, glucoamilase (glaA) de Aspergillus niger ou Aspergillus awamori, lipase de Rhizomucor miehei, protease alcalina de Aspergillus oryzae, triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae, acetamidase de Aspergillus nidulans, e protease semelhante a tripsina de Fusarium oxysporum (WO 96/00787), e também o promotor NA2-tpi (um híbrido dos promotores dos genes para alfa-amilase neutra de Aspergillus niger e triose fosfato isomerase de Aspergillus oryzae), e seus promotores mutantes, truncados, e híbridos.

Em uma célula hospedeira, promotores úteis são obtidos dos genes para enolase de Saccharomyces cerevisiae (ENO-1), galactoquinase de Saccharomyces cerevisiae (GAL1), álcool desidrogenase / gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae e 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae. Outros promotores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et ah, 1992, Yeast 8: 423-488.

Exemplos de promotores vantajosos para dirigir a transcrição de ácido nucleicos da presente invenção, particularmente em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos do óperon lac de E. coli, gene da agarase (dagA) de Streptomyces coelicolor, gene da levansucrase (sacB) de Bacillus subtilis, gene da alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, gene da amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothermophilus, gene da alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens, gene da penicilinase (penP) de Bacillus licheniformis genes xylA e xylB de Bacillus subtilis, e gene da beta-lactamase procariótica (Villa-Kamaroff et al, 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731), e também o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Promotores adicionais encontram-se descritos em "Useful proteins íforn recombinant bactéria" em Scientific American, 1980, 242: 74-94; e em Sambrook etal, 1989, supra, A seqüência de controle também pode ser uma seqüência terminadora de transcrição vantajosa, uma sequência reconhecida por uma célula hospedeira para terminar transcrição. A sequência terminadora é ligada operacionalmente com a ponta 3' da seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo, Qualquer terminador que é funcional na célula hospedeira de escol pode ser usado na presente invenção.

Terminadores preferidos para células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidos dos genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, anthranilato sintase de Aspergillus nidulans, alfa-glucosidase de Aspergillus niger, e protease semelhante a tripsina de Fusarium oxysporum.

Terminadores preferidos para células hospedeiras de levedura são obtidos do gene para enolase de Saccharomyces cerevisiae, cytochrome C (CYC1) de Saccharomyces cerevisiae, e gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Saccharomyces cerevisiae. Outros terminadores úteis para células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et ai, 1992, supra.

Terminadores preferidos para células hospedeiras bacterianas, como uma célula hospedeira de Bacillus, são os terminadores do gene de alfa-amilase (amyL) de Bacillus licheniformis, o gene de amilase maltogênica (amyM) de Bacillus stearothenmophilus, ou o gene da alfa-amilase (amyQ) de Bacillus amyloliquefaciens. A seqüência de controle também pode ser uma seqüência inicial apropriada, uma região não-traduzido de um mRNA que é importante para tradução pela célula hospedeira. A seqüência inicial é ligada operacionalmente à ponta 5' da seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo. Qualquer seqüência inicial que é funcional na célula hospedeira de escol pode ser usada na presente invenção.

Sequências iniciais preferidas para células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidas dos genes de para células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidos dos genes para amilase TAKAde Aspergillust oryzae e triose fosfato isomerase de Aspergillus nidulans.

Seqüências iniciais vantajosos para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para enolase (ENO-1) de Saccharomyces cerevisiae, 3-fosfoglicerato quinase de Saccharomyces cerevisiae, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae, e álcool desidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (ADH2/GAP) de Saccharomyces cerevisiae. A seqüência de controle também pode ser uma seqüência de poliadenilação, uma seqüência ligada operacionalmente à ponta 3' da seqüência de ácido nucleico e que, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos poliadenosina a mRNA transcrito. Qualquer seqüência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira de escol pode ser usadas na presente invenção.

Seqüências de poliadenilação preferidas para células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidas dos genes para amilase TAKA de Aspergillus oryzae, glucoamilase de Aspergillus niger, antranilato sintase de Aspergillus nidulans, protease semelhante a tripsina de Fusarium oxysporum, e alfa-glucosidase de Aspergillus niger.

Seqüências de poliadenilação úteis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990. A seqüência de controle também pode ser uma região codificante de peptídeo-sinal que codifica para uma seqüência de aminoácidos ligada à ponta amino de um polipeptídeo e [que] dirige o polipeptídeo codificado na via secretora da célula. A ponta 5' da seqüência codificante da seqüência de ácido nucleico pode conter inerentemente uma região codificante de peptídeo-sinal ligada naturalmente em matriz de leitura de tradução com o segmento da região codificante que codifica o polipeptídeo secretado. Altemativamente, a ponta 5' da seqüência codificante pode conter uma região codificante de peptídeo-sinal que e estranha à seqüência codificante. A região codificante de peptídeo-sinal estranha pode ser requerida onde a seqüência codificante não contém naturalmente uma região codifícante de peptídeo-sinal. Altemativamente, a região codifícante de peptídeo-sinal estranha pode substituir simplesmente a região codifícante de peptídeo-sinal natural para incrementar a secreção do polipeptídeo. No entanto, qualquer região codifícante de peptídeo-sinal que dirige o polipeptídeo expresso na via secretora de uma célula hospedeira de escol pode ser usado na presente invenção. Regiões codificantes efetivas de peptídeos-sinais para células hospedeiras bacterianas são a região codifícante de peptídeos-sinais obtida dos genes para amilase maltogênica de Bacillus NCIB 11837, alfa-amilase de Bacillus stearothermophilus, subtilisina de Bacillus licheniformis, alfa-amilase de Bacillus licheniformis, proteases neutras (nprT, nprS, nprM) de Bacillus stearothermophilus, e prsA de Bacillus subtilis. Outros peptídeos-sinais são descritos por Simonen e Paiva, 1993, Microbiological Reviews 57:109-137.

Regiões codificantes efetivas de peptídeo-sinal para células hospedeiras de fungos filamentosos são as regiões codificantes de peptídeo-sinal obtidas dos genes para TAKA amilase de Aspergillus oryzae, amilase neutra de Aspergillus niger, glucoamilase de Aspergillus niger, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, celulase de Humicola insolens, e lipase de Humicola lanuginosa.

Peptídeos-sinais úteis para células hospedeiras de levedura são obtidos dos genes para fator-alfa de Saccharomyces cerevisiae e invertase de Saccharomyces cerevisiae. Outras regiões codificantes úteis de peptídeo-sinal são descritas por Romanos et ai, 1992, supra.

Em uma concretização preferida, a região codifícante de peptídeo-sinal é selecionada das regiões codificantes de peptídeo-sinal da SEQIDNO: 1,3,5,7,9,11 e 13. A seqüência de controle também pode ser uma região codificante pró-peptídeo que codifica para uma seqüência de aminoácidos posicionada na ponta amino de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma pró-enzima ou pró-polipeptideo (ou um zimógeno em alguns casos). Um pró-polipeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido a um polipeptídeo maduro ativo por meio de divagem catalítica ou autocatalítica do pró-peptídeo do pró-polipeptídeo. A região codificante de pró-peptídeo pode ser obtida, por exemplo, dos genes para protease alcalina (aprE) de Bacillus subtilis, protease neutra (nprT) de Bacillus subtilis, fator alfa de Saccharomyces cerevisiae, proteinase aspártica de Rhizomucor miehei, e lacase de Myceliophíhora thermophila (WO 95/33836).

Em uma concretização preferida, a região codificante pró-peptídeo é selecionada das regiões codificantes pró-peptídeo da SEQ ID NO: 1,3,5,7,9,11 e 13.

Onde ambas as regiões, peptídeo-sinal e pró-peptídeo estão presentes na ponta amino de um polipeptídeo, a região pró-peptídeo encontra-se posicionada próximo da ponta amino de um polipeptídeo e a região de peptídeo-sinal encontra-se posicionada próximo da ponta amino da região pró-peptídeo.

Vetores de expressão A presente invenção refere-se também a vetores de expressão recombinante compreendendo uma seqüência de ácido nucleico da presente invenção, um promotor, e sinais de parada de transcrição e de tradução. As várias seqüências de ácido nucleico e de controle descritas acima podem ser combinadas para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais sítios de restrição convenientes para permitir inserção ou substituição da seqüência de ácido nucleico que codifica o polipeptídeo nos referidos sítios. Altemativamente, a seqüência de ácido nucleico da presente invenção pode ser expressa inserindo-se a seqüência de ácido nucleico ou uma construção de ácido nucleico compreendendo a seqüência em um vetor de expressão apropriado. Na criação do vetor de expressão, a seqüência codificante encontra-se localizada no vetor de forma que a seqüência codificante encontra-se localizada operacionalmente com as seqüências de controle apropriadas para expressão. O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser submetido convenientemente a procedimentos de DNA recombinante e que pode proporcionar a expressão da seqüência de ácido nucleico. A escolha do vetor dependerá tipicamente da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira em que se pretende introduzir o vetor. Os vetores podem ser plasmídeos lineares ou circulares fechados. O vetor pode ser um vetor autonomamente replicante, isto é um vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente de replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extracromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter qualquer meio que assegure auto-replicação. Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado juntamente com o cromossomo(s) em que foi integrado. Além disso, é possível utilizar um plasmídeo ou vetor simples ou dois ou mais plasmídeos ou vetores que, em conjunto, contém o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon.

Os vetores da presente invenção contêm, de preferência, um ou mais marcadores selecionados que permitem fácil seleção de células transformadas. Um marcador selecionável é um gene cujo produto proporciona resistência biocida ou viral, resistência a metais pesados, prototrofia a autotrófícos, e análogos. Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são os genes dal de Bacillus subtilis ou Bacillus licheniformis.

Marcadores vantajosos para células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Marcadores selecionáveis para uso em uma célula hospedeira de fungo filamentoso incluem, porém sem limitação, amdS (acetamidase), argB (omitina carbamoiltransferase), bar (fosfmotricina acetiltransferase), hygB (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato redutase), pyrG (orotidina-5’-fosfato descarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), trpC (antranilato sintase), e também seus equivalentes. São preferidos para utilização em uma célula de Aspergillus os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.

Os vetores da presente invenção contêm, de preferência, um elemento(s) que permite integração estável do vetor no genoma da célula hospedeira, ou replicação autônoma do vetor na célula independentemente do genoma.

Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode basear-se na seqüência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração estável do vetor no genoma por meio de recombinante homóloga ou não-homóloga. Altemativamente, o vetor pode conter seqüência adicionais de ácido nucleico para dirigir integração por meio de recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira. As seqüências adicionais de ácido nucleico permitem que o vetor seja integrado no genoma da célula hospedeira em um sítio(s) preciso no cromossomo(s). Para aumentar a probabilidade de integração em um sítio preciso, os elementos integracionais contêm, de preferência, um número suficiente de ácidos nucleicos, como de 100 a 1.500 pares de bases, de preferência de 400 a 1.500 pares de bases, e, o mais preferivelmente, de 800 a 1.500 pares de bases, que são altamente homólogos com a seqüência-alvo correspondente para incrementar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser de qualquer seqüência que é homóloga com a seqüência-alvo no genoma da célula hospedeira. Além disso, os elementos integracionais podem ser seqüências de ácido nucleico codificantes ou não-codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por meio de recombinação não-homóloga.

Para replicação autônoma, o vetor pode compreender adicionalmente uma origem de replicação que permite que o vetor replique autonomamente na célula hospedeira em questão. Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACIC177, e pACIC184 permitindo replicação em E. coli, e pUBUO, pE194, pTAlOóO, e ρΑΜβΙ permitindo replicação em Bacillus. Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são origem de replicação de 2 mícrons, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6. A origem de replicação pode ser uma que apresenta uma mutação que toma seu funcionamento sensível à temperatura na célula hospedeira (ver, por exemplo, Ehrlich, 1978, Proceedings ofihe National Academy ofSciences USA 75:1433), É possível inserir mais de uma cópia de uma seqüência de ácido nucleico da presente invenção na célula hospedeira para aumentar a r produção do produto gênico. E possível obter um incremento do número de cópias da seqüência de ácido nucleico integrando-se pelo menos um cópia adicional da seqüência no genoma da célula hospedeira ou incluindo um gene marcador selecionável amplificável com a seqüência de ácido nucleico onde células contendo cópias amplificadas do gene marcador selecionável, e, com isso, cópias adicionais da seqüência de ácido nucleico, podem ser selecionadas mediante o cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.

Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinante da presente invenção são bem conhecidos por alguém versado na técnica (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra). A protease também pode ser co-expressa juntamente com pelo menos uma outra enzima de interesse para ração animal, como fítase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); xilanase (EC 3.2.1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); protease (EC 3.4,-.-). fosfolipase Al (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3,1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D (EC 3.1.4.4); e/ou beta-glucanase (EC 3.2.1.4 ou EC 3.2.1.6).

As enzimas podem ser co-expressas de diferentes vetores, de um vetor, ou utilizando-se uma mistura de ambas as técnicas. Quando se utiliza diferentes vetores, os vetores podem apresentar diferentes marcadores selecionáveis, e diferentes origens de replicação. Quando se utiliza apenas um vetor, os genes podem ser expressos de um ou mais promotores. Clonando-se sob a regulação de um promotor (di- ou multi-cistrônico), a ordem em que os genes são clonados pode afetar os níveis de expressão das proteínas. A protease também pode ser expressa como uma proteína de fusão, isto é em que o gene que codifica a protease foi fusionado na matriz com o gene que codifica outra proteína. Esta proteína pode ser outra enzima ou um domínio funcional de outra enzima. Células hospedeiras A presente invenção refere-se também a células hospedeiras recombinantes, compreendendo uma seqüência de ácido nucleico da invenção, que são usadas vantajosamente na produção recombinante dos polipeptídeos. Um vetor compreendendo uma seqüência de ácido nucleico da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira de tal forma que o vetor é mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extra-cromossômico auto-replicante como descrito previamente. O termo "célula hospedeira" abrange qualquer progênie de uma célula parental que não é idêntica à célula parental devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira dependerá em grande parte do gene que codifica o polipeptídeo e sua fonte. A célula hospedeira pode ser um microorganismo unicelular, por exemplo, um procarionte, ou um microorganismo não-unicelular, por exemplo, um eucarionte. Células unicelulares úteis são células bacterianas, como bactérias gram-positivas incluindo, embora sem limitação, uma célula de Bacillus, ou uma célula de Streptomyces, ou células de bactérias de ácido láctico; ou bactérias gram-negativas, como bactérias de E. coli e Pseudomonas sp. ácido láctico incluem, porém sem limitação, espécies dos gêneros Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Pediococcus, e Enterococcus. A introdução de um vetor numa célula hospedeira bacteriana pode ser efetuada, por exemplo, por meio de transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), utilizando-se células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizina, 1961, Journal ofBacteriology 81:.823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56:2 09-221), eletroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Biotechniques 6: 742-751), ou conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5771-5278). A célula hospedeira pode ser um eucarionte, como uma célula animal não-humana, uma célula de inseto, uma célula de planta, ou uma célula fungica.

Em uma concretização particular, a célula hospedeira é uma célula fungica. "Fungos" como usado aqui inclui os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota (como definido por Hawksworth et al., em Ainsworth e Bisby's Dictionary of The Fungi, 8a edição, 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) e também o Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, página 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).

Em outra concretização particular, a célula hospedeira fiingica é uma célula de levedura. "Levedura" como usado aqui inclui levedura ascosporogenosa (Endomycetales), levedura basidiosporogenosa, e levedura pertencentes aos Fungi Imperfecti (Blastomicetes). Como a classificação de leveduras pode ser alterada no futuro, para os fins desta invenção, levedura deveria ser definido como descrito em Biology e Activities of Yeast (Skinner, F.A., Passmore, S.M., e Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9,1980). A célula hospedeira de levedura pode ser uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, SchizoSaccharomyces, ou Yarrowia. A célula hospedeira fungica pode ser uma célula de fungo filamentoso. "Fungos fílamentosos" incluem todas as formas filamentosas da subdivisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos fílamentosos são caracterizados por uma parede miceliana. Os fungos fílamentosos são caracterizados por uma parede miceliana constituída de quitina, celulose, glucano, quitosano, manano, e outros polissacarídeos complexos. Crescimento vegetativo é por meio de alongamento hifal, e catabolismo do carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, crescimento vegetativo por leveduras, como Saccharomyces cerevisiae é por meio de brotamento de um talo unicelular, e o catabolismo do carbono pode ser fermentativo.

Exemplos de células hospedeiras de fungos fílamentosos são células de espécies de, embora sem limitação, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Flumicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium, ou Trichoderma. Células fungicas podem ser transformadas por meio de um processo que envolve formação de protoplasto, transformação dos protoplastos, e regeneração da parede celular de uma maneira conhecida per se. Procedimentos vantajosos para transformação de células hospedeiras de Áspergillus encontram-se descritos na EP 238 023 e Yelton et ai, 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Métodos vantajosos para transformar espécies de Fusarium encontram-se descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156 e WO 96/00787. Levedura pode ser transformada utilizando-se os procedimentos descritos por Becker e Guarente, In Abelson, J.N. e Simon, M.I., editors, Guide to Yeast Genetics e Molecular Biology, Methods in Enzymology, volume 194, pp. 182187, Academic Press, Inc., New York; Ito et al, 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:1920, Métodos de produção A presente invenção refere-se também a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultivar uma cepa, que, em sua forma selvagem, é capaz de produzir o polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. De preferência, a cepa é do gênero Brachysporiella, como Brachysporiella gayana, ou do gênero Nocardiopsis, como Nocardiopsis dassonvillei ou Nocardiopsis alba. Cepas de tipo selvagem mais preferidas são: Nocardiopsis dassonvillei DSM 43235, Nocardiopsis alba D SM 15647, Nocardiopsis prasina DSM 15649, Nocardiopsis prasina DSM 15648, e Brachysporiella gayana CGMCC 0865. A presente invenção refere-se também a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção compreende (a) cultivar uma célula hospedeira em condições favoráveis para produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. A presente invenção refere-se também a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultivar uma célula hospedeira em condições favoráveis para produção do polipeptídeo, sendo que a célula hospedeira compreende uma seqüêncía de ácido nucleico mutante compreendendo pelo menos uma mutação em nucleotídeos de 726-1283 da SEQID NO: 13, nucleotídeos de 499-1062 da SEQ ID NO: 11, nucleotídeos de 502-1065 da SEQ ID NO: 9, nucleotídeos de 496-1059 da SEQ ID NO: 7, nucleotídeos de 496-1059 da SEQ ID NO: 5, nucleotídeos de 559-1122 da SEQ ID NO: 3, e/ou nucleotídeos de 900-1466 da SEQ ID NO: 1, em que a seqüência mutante de ácido nucleico codifica os polipeptídeos correspondentes que (i) consiste de aminoácidos de 1 a 186 da SEQ ID NO: 14, ou aminoácidos de 1-188 de qualquer uma das (SEQ ID NOs: 12,10,8,6, 4 ou 2), ou (ii) é uma variante de qualquer uma das seqüências de (i), em que a variante compreende uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais aminoácidos, ou (iii) é uma variante alélica de qualquer uma das seqüências de (i), ou (iv) é um fragmento de qualquer uma das seqüências de (i)· Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente vantajoso para produção do polipeptídeo utilizando-se métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por meio de cultivo em frasco agitado, fermentação em pequena escala ou em grande escala (incluindo fermentações contínuas, em batelada, batelada alimentada, ou estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais, realizada em um meio apropriado e em condições que permitem que o polipeptídeo seja expressado e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente apropriado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, utilizando-se procedimentos conhecidos na técnica. Meios vantajosos podem ser obtidos de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos da American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio. Se o polipeptídeo não for secretado, o mesmo pode ser recuperado de lisados de células.

Os polipeptídeos podem ser detectados utilizando-se métodos conhecidos na técnica que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, formação de um produto, ou desaparecimento de um substrato. Por exemplo, é possível utilizar um ensaio de protease para determinar a atividade do polipeptídeo como descrito aqui. O polipeptídeo resultante pode ser recuperado por meio de métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por meio de procedimentos convencionais incluindo, embora sem limitação, centrifugação, filtração, extração, secagem com pulverização, evaporação, ou precipitação.

Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificadas por meio de diversos procedimentos conhecidos na técnica incluindo, embora sem limitação, cromatografia (por exemplo, troca de íon, afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização, e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforésicos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial (por exemplo, precipitação com amônio sulfate), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Proteína Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, New York, 1989).

Plantas A presente invenção refere-se também a uma planta transgênica, parte de planta, ou célula de planta que foi transformada com uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo apresentando atividade de protease da presente invenção de modo a expressar e produzir o polipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode ser recuperado da planta ou parte de planta. Altemativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptídeo recombinante pode ser usada tal qual para aperfeiçoar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, aperfeiçoando valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou para destruir um fator antinutritivo.

Em uma concretização particular, o polipeptídeo é objetivado aos vacúolos de armazenamento de endosperma em sementes. Isto pode ser obtido sintetizando-se o mesmo como um precursor com um peptídeo-sinal apropriado, ver Horvath et al em PNAS, 15 de fevereiro de 2000, vol. 97, no. 4, p. 1914-1919. A planta transgênica pode se dicotiledônea (um dicotiledôneo) ou monocotiledônea (um monocotiledôneo) ou formas manipuladas das mesmas. Exemplos de plantas monocotiledôneas são capins, como capim do prado (erva-de-febra, Poa), capim de forragem, como Festuca, Lolium, capim temperado, como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo, e milho (milho). Exemplos de plantas dicotiledôneas são tabaco, legumes, como tremoços, batata, beterraba açucareira, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), como couve-flor, colza, e o organismo-modelo estreitamente relacionado Arabidopsis thaliana. Plantas com baixo teor de fitato como descrito, por exemplo na patente dos E.U.A. n° 5,689,054 e patente dos E.U.A. n° 6,111,168 são exemplos de plantas manipuladas.

Exemplos de partes de plantas são caules, calos, folhas, raízes, frutas, sementes, e tubérculos, e também os tecidos individuais compreendendo estas partes, por exemplo epiderme, mesofilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Também compartimentos específicos de células de plantas, como cloroplasto, apoplasto, mitocôndrias, vacúolos, peroxissomas, e citoplasma são considerados como sendo uma parte de planta. Além disso, qualquer célula de planta, qualquer que seja sua origem, é considerada como sendo uma parte de planta. Da mesma forma, partes de plantas, como células e tecidos específicos isolados para facilitar a utilização da invenção também são considerados partes de plantas, por exemplo, embriões, aleurona e revestimentos de sementes.

Também inclui-se na abrangência da presente invenção a progênie de referidas plantas, partes de plantas e células de plantas. A célula de planta ou planta transgênica que expressa um polipeptídeo da presente invenção pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em resumo, a célula de planta ou planta é construída incorporando-se uma ou mais construções de expressão que codificam um polipeptídeo da presente invenção no genoma da planta hospedeira e propagando-se a célula de planta ou planta resultante em uma célula de planta ou planta transgênica.

De maneira conveniente, a construção de expressão é uma construção de ácido nucleico que compreende uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da presente invenção ligado operacionalmente com seqüências reguladoras apropriadas requeridas para expressão da seqüência de ácido nucleico na planta ou parte de planta de escol. Além disso, a construção de expressão pode compreender um marcador selecionável útil para identificar células hospedeiras em que a construção de expressão foi integrada, e seqüências de DNA necessárias para introdução da construção na planta em questão (estas últimas dependem do método de introdução de DNA a ser utilizado). A escolha das seqüências reguladoras, como seqüências promotora e terminadora, e opcionalmente seqüências-sinal ou de trânsito, é determinada, por exemplo, com base em quando, onde, e como se deseja expressar o polipeptídeo. Por exemplo, a expressão do gene que codifica um polipeptídeo da presente invenção pode ser constitutiva ou induzível, ou pode ser desenvolvimental, específica para estágio ou tecido, e o produto gênico pode ser objetivado para um tecido ou parte de planta específica, como sementes ou folhas. Seqüências reguladoras são descritas, por exemplo, por Tague et al, 1988, Plant Physiology 86: 506.

Para expressão constitutiva, é possível utilizar o seguinte: Pode-se utilizar o promotor 35S-CaMV (Franck et al, 1980, Cell 21: 285294), a ubiquitina do milho 1 (Christensen AH, Sharrock RA e Quail 1992, Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expressão e transcript splicing, e promoter activity foüowing transfer to protoplasts by electroporation), ou o promotor de actina do arroz 1 (Plant Mo. Biol. 18,675689; Zhang W, McElroy D. e Wu R 1991, Analysis of rice Actl 5' region activity in transgenic rice plants. Plant Cell 3, 1155-1165). Promotores específicos para órgão podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de depósito de armazenamento, como sementes, tubérculos de batatas, e frutas (Edwards & Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de armazenamento metabólicos, como meristemas (Ito et al, 1994, Plant Mol Biol. 24: 863-878), um promotor específico para sementes, como o promotor glutelina, prolamina, globulina, ou albumina do arroz (Wu et al, 1998, Plant e Cell Physiology 39: 885-889), um promotor de Vicia faba da legumina B4 e o gene de proteínas de semente desconhecido de Vicia faba (Conrad et al, 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), um promotor de uma proteína de corpo de óleo de semente (Chen et al, 1998, Plant e Cell Physiology 39: 935-941), o promotor napA de proteína de armazenamento de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico para semente conhecido na técnica, por exemplo, como descrito no WO 91/14772. Além disso, o promotor pode ser um promotor específico para folhas, como o promotor rbcs do arroz ou do tomate (Kyozuka et al, 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, o promotor do gene de adenina metiltransferase do vírus chiorella (Mitra e Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), ou o promotor do gene aldP do arroz (Kagaya et al, 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), ou um promotor induzível com ferimento, como o promotor pin2 da batata (Xu et al, 1993, Plant Molecular Biology 22: 573- 588). Da mesma forma, o promotor pode ser induzível por meio de tratamentos abióticos, como temperatura, seca ou alterações na salinidade ou induzível por meio de substâncias aplicadas exogenamente que ativa o promotor, por exemplo etanol, estrógenos, hormônios de plantas, como etileno, ácido abscíssico, ácido gibberélico, e/ou metais pesados.

Também é possível utilizar um elemento acentuador de promotor para se obter maior expressão da protease na planta. Por exemplo, o elemento acentuador de promotor pode ser um íntron que é colocado entre o promotor e a seqüência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra divulgam o uso do primeiro íntron do gene actina 1 do arroz para acentuar expressão.

Ainda adicionalmente, a utilização de códon pode ser otimizada para a espécie de planta em questão para aperfeiçoar a expressão (ver Horvath et al referido acima). O gene marcador selecionável e quaisquer outras partes da construção de expressão podem ser selecionados daqueles obteníveis na técnica. A construção de ácido nucleico é incorporada no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na técnica, incluindo transformação mediada com Agrobacterium, transformação mediada com vírus, microinjeção, bombardeio de partículas, transformação biolística, e eletroporação (Gasser et al, 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Technology 8: 535; Shimamoto et al, 1989, Nature 338: 274).

Presentemente, transferência de gene mediada com Agrobacterium tumefaciens é o método de escol para gerar dicotiledôneos transgênicos (para uma revisão, ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38), e também pode ser usada para transformar monocotiledôneos, embora outros métodos de transformação sejam geralmente preferidos para estas plantas. Presentemente, o método de escol para gerar monocotiledôneos transgênicos, suplementando a abordagem com Agrobacterium, é bombardeio de partículas (ouro microscópico ou partículas de tungstênio revestidas com o DNA transformante) de calos embriônicos ou embriões em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para a transformação de monocotiledôneos baseia-se na transformação de protoplastos como descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology2\A\b-M%, Após transformação, os transformantes apresentando ali a construção de expressão são selecionados e regenerados em plantas inteiras de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. A presente invenção refere-se também a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção compreendendo (a) cultivar uma planta transgênica ou uma planta transgênica compreendendo uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo apresentando atividade de protease da presente invenção em condições condutivas para produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

Animais A presente invenção refere-se também a um animal transgênico, animal não-humano e produtos ou elementos dos mesmos, cujos exemplos são fluidos corporais, como leite e sangue, órgãos, came, e células animais. Técnicas para expressar proteínas, por exemplo em células mamíferas, são conhecidas na técnica, ver por exemplo o manual Protein Expression: A Practical Approach, Higgins e Hames (eds), Oxford University Press (1999), e os outros três manuais nesta série referentes a transcrição de genes, processamento de RNA, e processamento pós-tradução. De uma maneira geral, para preparar um animal transgênico, células selecionadas de um animal selecionado são transformadas com uma seqüência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo apresentando atividade de protease da presente invenção de forma a expressar e produzir o polipeptídeo. O polipeptídeo pode ser recuperado do animal, por exemplo do leite de animais fêmeas, ou o polipeptídeo pode ser expresso em benefício do próprio animal, por exemplo para assistir na digestão do animal. Exemplos de animais são indicados abaixo na seção intitulada Ração animal.

Para produzir um animal transgênico com vistas a recuperar a protease do leite do animal, é possível inserir um gene que codifica a protease nos ovos fertilizados de um animal em questão, por exemplo por meio do uso de um vetor de expressão de transgene que compreende um promotor de proteína do leite adequado, e o gene que codifica a protease. O vetor de expressão de transgene é microinjetado em ovos fertilizados, e, de preferência, integrado permanentemente no cromossomo. Uma vez que o ovo começa a crescer e dividir-se, o embrião potencial é implantado numa mãe substituta, e identifica-se animais que portam o transgene. O animal resultante pode então ser multiplicado por meio de cruzamento convencional. O polipeptídeo pode ser purificado do leite do animal, ver por exemplo Meade, H.M. et al (1999): Expression of recombinant proteins in the milk of transgenic animais, Gene expressão systems: Using nature for the art of expression. J. M. Femandez e J. P. Hoeffer (eds.), Academic Press.

Na alternativa, para produzir um animal não-humano transgênico que porta, no genoma de suas células somáticas e/ou germinativas, uma seqüência de ácido nucleico incluindo uma construção de transgene heterólogo incluindo um transgene que codifica a protease, o transgene pode ser ligado operacionalmente à primeira seqüência reguladora para expressão específica-para-glândula salivar da protease, como divulgado no WO 2000064247.

Composições Em um outro aspecto adicional, a presente invenção refere-se a composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção.

As composições de polipeptídeos podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos na técnica e podem ser em forma de um líquido ou uma composição seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode ser na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodos conhecidos na técnica.

Exemplos são dados abaixo de usos preferidos dos polipeptídeos ou composições de polipeptídeos da invenção.

Ração animal A presente invenção também se dirige a métodos para utilização da protease da invenção na ração animal, e também a composições de ração e aditivos alimentares compreendendo estes polipeptídeos. O termo animal inclui todos os animais, incluindo seres humanos. Exemplos de animais são não-ruminantes, e ruminantes, como ovelhas, cabras, cavalos, e gado, por exemplo came de gado, vacas, e bezerros jovens. Em uma concretização particular, o animal é um animal não-ruminante. Animais não-mminantes incluem animais monogástricos, por exemplo porcos ou suínos (incluindo, embora sem limitação, leitões, porcos em crescimento, e porcas); galináceos, como perus, patos e galinhas (incluindo embora sem limitação frangos, poedeiras); bezerros jovens; e peixes (incluindo embora sem limitação salmão, truta, tilápia, peixe-gato e carpas); e cmstáceos (incluindo embora sem limitação camarões e pitus). O termo 'ração ou composição de ração' significa qualquer composto, preparação, mistura, ou composição apropriada durante, ou destinada à ingestão por um animal.

No uso de acordo com a invenção a protease pode ser alimentada ao animal antes, após, ou simultaneamente com a dieta. Esta última é preferida.

Em uma concretização particular, a protease, na forma em que é adicionada à ração, ou quando é incluída em um aditivo de ração, é bem definida. 'Bem definida' significa que a preparação de protease é pelo menos 50 % pura conforme determinado por cromatografia de exclusão de tamanho (ver Exemplo 12 do WO 01/58275). Em outras concretizações particulares a preparação de protease é pelo menos 60, 70,80, 85, 88, 90, 92, 94, ou pelo menos 95 % pura conforme determinado por este método.

Uma preparação de protease bem definida é vantajosa. Por exemplo, é muito mais fácil dosar corretamente na ração uma protease que é essencialmente livre de outras proteases interferentes ou contaminantes. O termo 'dose' refere-se corretamente, em particular, ao objetivo de obter resultados consistentes e constantes, e à capacidade de otimizar dosagem baseada no efeito desejado.

Contudo, para o uso na ração animal, a protease não precisa ser tão pura; ela pode incluir, por exemplo outras enzimas, sendo que neste caso isto deveria ser denominado uma preparação de protease. A preparação de protease pode ser (a) adicionada diretamente na ração (ou usada diretamente em um processo de tratamento de proteínas vegetais), ou (b) ela pode ser usada na produção de uma ou mais composições intermediárias, como aditivos de ração ou pré-misturas que são adicionados subseqüentemente à ração (ou usados no processo de tratamento). O grau de pureza descrito acima refere-se à pureza da preparação de protease original, quer usado de acordo com (a) ou (b) acima.

Preparações de protease com purezas desta ordem de magnitude podem ser obtidas, em particular, utilizando-se métodos recombinantes de produção, enquanto que não são tão facilmente obtidas e também são sujeitas a uma variação entre bateladas muito maior quando a protease é produzida por meio de métodos de fermentação tradicionais.

Evidentemente, referida preparação de protease pode ser misturada com outras enzimas.

Em uma concretização particular, a protease para uso de acordo com a invenção é capaz de solubilizar proteínas vegetais. Um ensaio vantajoso para determinar proteínas solubilizada encontra-se divulgado no Exemplo 4 do WO 01/58276. O termo 'proteínas vegetais' como usado aqui refere-se a qualquer composto, composição, preparação ou mistura que inclui pelo menos uma proteína derivada de ou originada de um vegetal, incluindo proteínas modificadas e derivados de proteína. Em particular concretizações, o teor de proteína das proteínas vegetais é de pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, ou 60 % (peso/peso).

Proteínas vegetais podem ser derivadas de fontes de proteína vegetal, como legumes e cereais, por exemplo materiais de plantas das famílias Fabaceae (Leguminosae), Cruciferaceae, Chenopodiaceae, e Poaceae, como farinha de semente de soja, farinha de soja, farinha de tremoço e farinha de colza.

Em uma concretização particular, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Fabaceae, por exemplo soja, tremoço, ervilha, ou feijão.

Em outra concretização particular, a fonte de proteína vegetal é material de uma ou mais plantas da família Chenopodiaceae, por exemplo beterraba, beterraba açucareira, espinafre ou quenopódio.

Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são colza, e repolho. Soja é uma fonte de proteína vegetal preferida.

Outros exemplos de fontes de proteína vegetal são cereais, como cevada, trigo, centeio, aveia, milho (milho), arroz, e sorgo. O tratamento de acordo com a invenção de proteínas vegetais com pelo menos uma protease da invenção resulta em uma solubilização incrementada de proteínas vegetais. 0 termo solubilização de proteínas significa basicamente colocar proteína(s) em solução. Referida solubilização pode dever-se à liberação mediada com protease de proteína de outros componentes das composições naturais usualmente complexas, como ração. Solubilização pode ser medida como um incremento da quantidade de proteínas solúveis, com referência a uma amostra de controle sem tratamento de protease.

Em uma concretização particular de um processo de (pré-) tratamento da invenção, a protease(s) em questão afeta (ou atua sobre, ou exerce sua influência solubilizadora sobre) as proteínas ou fontes de proteínas vegetais. Para se obter isto, a proteína ou fonte de proteína vegetal é suspensa tipicamente em um solvente, por exemplo um solvente aquoso, como água, e os valores de pH e temperatura são ajustados considerando-se as características da enzima em questão. Por exemplo, o tratamento pode ocorrer a um valor de pH em que a atividade da protease atual é pelo menos,[.] Da mesma forma, por exemplo, o tratamento pode ocorrer a uma temperatura à qual a atividade da protease atual é de pelo menos 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou pelo menos 90 %. As indicações de percentual de atividade acima são relativas às atividades máximas. A reação enzimática é continuada até que o resultado desejado seja obtido, após o que o mesmo pode ou não ser interrompido inativando-se a enzima, por exemplo por meio de uma etapa de tratamento com calor.

Em outra concretização particular de um processo de tratamento da invenção, a ação da protease é sustentada, significando por exemplo que a protease é adicionada às proteínas ou fontes de proteínas vegetais, porém sua influência solubilizadora não é, por assim dizer, ativada até um momento futuro quando desejado, uma vez que se tenha estabelecido condições solubilizadoras vantajosas, ou uma vez que quaisquer inibidores de enzima tenham sido inativados, ou quaisquer outros meios que possam ter sido aplicados para postergar a ação da enzima.

Em uma concretização, o tratamento é um pré-tratamento de ração animal ou proteínas vegetais para uso na ração animal. O termo 'melhorar o valor nutricional de uma ração animal' significa melhorar a disponibilidade das proteínas, levando com isso a maior extração de proteína, maiores rendimentos de proteína, e/ou maior utilização de proteína. O valor nutricional da ração é, portanto, aumentado, e a taxa de crescimento e/ou ganho de peso e/ou conversão do alimento (isto é o peso de alimento ingerido relativamente ao ganho de peso) do animal é/são aperfeiçoada(s). A protease pode ser adicionada à ração em qualquer forma, seja ela uma protease relativamente pura, ou em mistura com outros componentes destinados à adição na ração animal, isto é na forma de aditivos de ração animal, como as assim-chamadas pré-misturas para ração animal.

Em um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a composições para uso na ração animal, como ração animal, e aditivos de ração animal, por exemplo pré-misturas.

Além da protease da invenção, os aditivos de ração animal da invenção contêm pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou pelo menos um mineral em traços. O aditivo de ração também pode conter pelo menos um macro mineral, Adicionalmente, ingredientes aditivos opcionais para ração compreendem agentes corantes, compostos aromatizantes, estabilizantes, peptídeos antimicrobianos, incluindo polipeptídeos antifungicos, e/ou pelo menos uma outra enzima selecionada dentre fitase (EC 3.1.3.8 ou 3.1.3.26); xilanase (EC 3.2,1.8); galactanase (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidase (EC 3.2.1.22); protease (EC 3.4.-.-). fosfolipase Al (EC 3.1.1.32); fosfolipase A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipase (EC 3.1.1.5); fosfolipase C (3.1.4.3); fosfolipase D(EC3.1.4.4); e/oubeta-glucanase (EC 3.2.1.4ou EC 3.2.1.6).

Em uma concretização particular estas outras enzimas são bem definidas (como definido acima para preparações de protease).

Exemplos de peptídeos antimicrobianos (AMP's) são CAP18, Leucocina A, Tritrpticina, Protegrina-1, Tanatina, Defensina, Lactoferrina, Lactoferricina, e Ovispirina, como Novispirina (Robert Lehrer, 2000), Plectasinas, e Estatinas, incluindo os compostos e polipeptídeos divulgados no WO 03/044049 e WO 03/048148, e também variantes ou fragmentos dos indicados acima que conservam atividade microbiana.

Exemplos de polipeptídeos antifungicos (AFFs) são o Aspergíllus giganteus, e peptídeos de Aspergiüus niger, e também variantes e fragmentos dos mesmos que conservam atividade antifungica, como divulgado no WO 94/01459 e WO 02/090384. Exemplos de ácidos graxos poliinsaturados são ácidos graxos poliinsaturados com Cl8, C20 e C22, como ácido araquidônico, ácido docosoexaenóico, ácido eicosapentaenóico e ácido gama-linoléico. Exemplos de espécies geradoras de oxigênio reativo são químicos, como perborato, persulfato, ou percarbonato; e enzimas, como uma oxidase, uma oxigenase ou uma sintetase.

Usualmente, vitaminas solúveis em gordura e solúveis em água, e também minerais em traços, fazem parte da assim-chamada pré-mistura destinada à adição na ração, conquanto que macro minerais usualmente são adicionados separadamente na ração. Uma pré-mistura enriquecida com uma protease da invenção, é um exemplo de um aditivo de ração animal da invenção.

Em uma concretização particular, o aditivo de ração animal da invenção destina-se a ser incluído (ou prescrito como devendo ser incluído) em rações ou dietas animais em níveis de 0,01 a 10,0 %; mais particularmente de 0,05 a 5,0 %; ou de 0,2 a 1,0 % (% significando gramas de aditivo por 100 g de ração). Isto se dá, em particular, no caso de pré-misturas. A seguir encontra-se listas não-exclusivas de exemplos destes componentes: Exemplos de vitaminas solúveis em gordura são vitamina A, vitamina D3, vitamina E, e vitamina K, por exemplo vitamina K3.

Exemplos de vitaminas solúveis em água são vitamina BI2, biotina e colina, vitamina Bl, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico e pantotenato, por exemplo Ca-D-pantotenato.

Exemplos de minerais em traços são manganês, zinco, ferro, cobre, iodo, selênio, e cobalto.

Exemplos de macro minerais são cálcio, fósforo e sódio.

As exigências nutricionais destes componentes (exemplificados no caso de galináceos, leitões/porcos) são listadas na Tabela A do WO 01/58275. 'Exigências nutricionais' significa que estes componentes deveríam ser proporcionados na dieta nas concentrações indicadas.

Na alternativa, o aditivo de ração animal da invenção compreende pelo menos um dos componentes individuais especificados na Tabela A do WO 01/58275. No presente contexto, 'pelo menos um' significa qualquer um de, um ou mais de, um, ou dois, três, ou quatro etc, até todos os treze, ou até todos os quinze componentes individuais. Mais especifícamente, este pelo menos um componente individual é incluído no aditivo da invenção numa tal quantidade a proporcionar uma concentração-na-ração dentro da faixa indicada na coluna quatro, ou coluna cinco, ou coluna seis da Tabela A.

Além disso, a definição acima de "pelo menos um" é geralmente válida em todo o presente pedido de patente - evidentemente numa base por analogia, significando que o limite superior desta definição, no exemplo quinze acima, podería refletir evidentemente o número máximo de escolhas dadas em cada caso particular. A presente invenção refere-se também a composições de ração animal. Composições de ração ou dieta animal apresentam um teor relativamente alto de proteína. Dietas para galináceos e porcos podem ser caracterizadas conforme indicado na Tabela B do WO 01/58275, colunas 2-3.

Dietas para peixes podem ser caracterizadas como indicado na coluna 4 desta Tabela B. Adicionalmente, referidas dietas para peixes apresentam usualmente um teor de gordura bruta de 200-310 g/kg.

Uma composição de ração animal de acordo com a invenção apresenta um teor de proteína bruta de 50-800 g/kg, e compreende adicionalmente pelo menos uma protease como reivindicado aqui.

Adicionalmente, ou na alternativa (relativamente ao teor de proteína bruta indicado acima), a composição de ração animal da invenção apresenta um teor de energia metabolizável de 10-30 MJ/kg; e/ou um conteúdo de cálcio de 0,1-200 g/kg; e/ou um teor de fósforo disponível de 0,1-200 g/kg; e/ou um teor de metionina de 0,1-100 g/kg; e/ou um teor de metionina mais cisteína de 0,1-150 g/kg; e/ou um teor de lisina de 0,5-50 g/kg.

Em particular concretizações, o conteúdo de energia metabolizável, proteína bmta, cálcio, fósforo, metionina, metionina mais cisteína, e/ou lisina encontra-se dentro de qualquer uma das faixas 2, 3,4 ou 5 na Tabela B do WO 01/58275 (R. 2-5).

Proteína bmta é calculada como nitrogênio (N) multiplicado por um fator de 6,25, isto é proteína bruta (g/kg)= N (g/kg) x 6,25. O teor de nitrogênio é determinado por meio do método de Kjeldahl (A.O.A.C., 1984, Officiaí Methods of Analysis 14th ed., Association of Official Analytical Chemists, Washington DC).

Energia metabolizável pode ser calculada com base nas exigências de nutrientes da publicação NRC em suínos, nona edição revisada de 1988, subcomitê sobre nutrição de suínos, comitê sobre nutrição animal, conselho de agricultura, conselho de pesquisa nacional. National Academy Press, Washington, D.C., pp. 2-6, e a European Table of Energy Values for Poultry Feed-stuffs, Spelderholt Centre for Poultry Research and Extension, 7361 DA Beekbergen, The Netherlands. Grafisch bedrijf Ponsen & Iooijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5. O teor dietético de cálcio, fósforo disponível e aminoácidos em dietas animais completas é calculado com base em tabelas nutricionais, como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische samenstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6,8219 pk Lelystad. ISBN 90-72839-13-7.

Em uma concretização particular, a composição de ração animal da invenção contém pelo menos uma proteína ou fonte de proteína vegetal como definido acima.

Em outras concretizações particulares adicionais a composição de ração animal da invenção contém 0-80 % de milho; e/ou 0-80 % de sorgo; e/ou 0-70 % de trigo; e/ou 0-70 % de cevada; e/ou 0-30 % de aveia; e/ou 0-40 % de farinha de soja; e/ou 0-10 % de farinha de peixe; e/ou 0-20 % de soro.

Dietas animais, por exemplo, podem ser manufaturadas como ração compostada (não-pelotizada) ou ração pelotizada. Tipicamente, os alimentos moídos são misturados e adiciona-se quantidades suficientes de minerais e vitaminas essenciais de acordo com as especificações para a espécie em questão. Enzimas podem ser adicionadas como formulações sólidas ou líquidas de enzima. Por exemplo, uma formulação de enzima sólida é adicionada tipicamente antes ou durante a etapa de mistura; e adiciona-se tipicamente uma preparação de enzima líquida após a etapa de pelotização. A enzima também pode ser incorporada em uma pré-mistura ou aditivo de ração. A concentração final de enzima na dieta encontra-se na faixa de 0,01-200 mg de proteína de enzima por kg de dieta, por exemplo na faixa de 0,5-25, ou 5-30, mg de proteína de enzima por kg de dieta animal.

Evidentemente, a protease deveria ser aplicada numa quantidade efetiva, isto é numa quantidade adequada para melhorar a solubilização e/ou melhorar o valor nutricional da ração. Considera-se presentemente que a enzima é administrada em uma ou mais das quantidades a seguir (faixas de dosagem): 0,01-200; 0,01-100; 0,05-100; 0,5-100; 1-100; 5-100; 10-100; 0,05-50; 1-50; ou 0,10-10 - sendo que todas estas faixas são em mg de proteína de enzima protease por kg de ração (ppm).

Para determinar os mg de proteína de enzima por kg de ração, a protease é purificada da composição de ração, e a atividade específica da protease purificada é determinada utilizando-se um ensaio relevante (ver: atividade de protease, substratos, e ensaios). A atividade de protease da composição de ração como tal também é determinada utilizando-se o mesmo ensaio, e com base nestas duas determinações, calcula-se a dosagem em mg de proteína de enzima por kg de ração.

Os mesmos princípios aplicam-se para determinar os mg de proteína de enzima em aditivos de ração. Evidentemente, se estiver disponível uma amostra da protease usada para preparar o aditivo de ração ou a ração, determina-se a atividade específica desta amostra (sem necessidade de purificar a protease da composição de ração ou do aditivo).

Em uma concretização particular, o aditivo de ração animal da invenção é uma pré-mistura. Uma pré-mistura destina-se usualmente para adição (inclusão) na ração animal. Uma taxa de inclusão típica de pré-mistura na ração é de 0,01-10,0 %, mais particularmente de 0,05-5,0 %, ou 0,2-1,0 %, tipicamente de 0,5-1,0 %. Como a taxa de inclusão de pré-mistura na ração animal varia, faz sentido descrever referidas pré-misturas considerando as concentrações-na-ração intencionadas, ou prescritas, dos diversos ingredientes. A pré-mistura da invenção contém uma protease da invenção, e adicionalmente pelo menos uma vitamina solúvel em gordura e/ou em água, e/ou pelo menos um mineral em traços.

Em uma concretização particular, a pré-mistura inclui, compreende ou contém o cobre mineral em traços, usualmente na forma de sais do íon cupri ou cupro, isto é Cu2+ ou Cu', respectivamente, em particular sais inorgânicos do mesmo. Em concretizações particulares de uma pré-mistura da invenção, pré-mistura contém uma tal quantidade de cobre (Cu) de forma a proporcionar, quando incluída na ração na taxa de inclusão prescrita, uma concentração na ração de 1-500 ppm de cobre (ppm significando, por exemplo, mg/kg de ração).

Em concretizações particulares adicionais, a concentração-na-ração de cobre é abaixo ou igual a 5,10,20, 25, 50, 60, 70, 80, 90,100,110, 120,130,140,150,200, 300, ou abaixo ou igual a 400 ppm. Por outro lado, a concentração-na-ração de Cu deveria ser de pelo menos 0,2, 0,4, 0,6, 0,8,1,0, 2,0, 3,0, 4,0, ou de pelo menos 5,0 ppm. Inclui-se aqui especificamente quaisquer faixas de concentrações-na-ração que utilizam qualquer conjunto de limites superior e inferior indicados acima. Exemplos não-limitantes dos mesmos são 0,2-100, 0,4-100, 0,6-200, 0,8-100, 1-25, 1-50, 1-100, 1-140, 1150, 2-100, 3-100, 4-100, 5-100, 3-200, 4-200, 5-200, 3-300, 4-300 e 5-300 ppm de Cu.

Evidentemente, a concentração de Cu na pré-mistura como tal é maior do que a intencionada concentração-na-ração, tipicamente de 100-200 vezes a concentração-na-ração (baseado em taxas de inclusão de 1 %, e 0,5 %, respectivamente). Portanto, uma pré-mistura pode conter, compreender ou incluir Cu em concentrações de até 100.000 ppm (200 vezes uma concentração-na-ração de 500 ppm), ou mesmo maior. Os seguintes são exemplos não-limitantes de concentrações máximas de Cu na pré-mistura: 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 10000, 20000, 30000, 40000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 ppm de Cu. Os seguintes são exemplos não-limitantes de concentrações de Cu na pré-mistura: 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, ou 2000 ppm de Cu. Inclui-se aqui especificamente quaisquer faixas de concentrações na pré-mistura utilizando qualquer conjunto dos limites superior e inferior indicados acima. Exemplos não-limitantes dos mesmos são 100-100.000; 200-90.000; 300-80.000; 400-70.000; 500-50.000; 100-10.000; 100-5.000; e 100-2000 ppm de Cu.

Os seguintes são exemplos específicos de composições de pré-mistura da invenção, sendo que todos incluem adicionalmente uma protease da invenção de forma a proporcionar uma concentração-na-ração de 1-50 mg/kg. As concentrações indicadas abaixo dos vários outros componentes de pré-mistura também são concentrações-na-ração (por kg da ração).

Pré-mistura para uma dieta de leitões (ração de composto completa): 135 ppm de Cu, 100 ppm de Zn, 90 ppm de Fe, 50 mg de Mn, 1,24 ppm de 1,0,3 ppm de Se, 0,10 ppm de Co, 10000 IE/kg de vit. A, 2000 IE/kg de vit. D3, 90 mg/kg de vit. E, 2,25 ppm de vit. Bl, 3,75 ppm de vit. B2, 10,50 ppm de vit. B3, 7,5 ppm de vit. B6, 0,03 ppm de vit. B12, 0,75 ppm de vit. K, 0,06 ppm de vit. H, 0,9 ppm de ácido fólico, 16,5 ppm de niacina.

Pré-mistura para outra dieta de leitões: 14400 IE de vit. A, 120000 IE de vit. D3,1440 mg de vit. E, 2,4 mg de vit. Bl, 7,2 mg de vit. B2, 30 mg de niacina, 4,8 mg de vit. B6, 48 μg de vit. B12, 240 pg de biotina, 21,6 mg de ácido pantotênico, 600 mg de colincloreto, 120 mg de Zn, 90 mg de Fe, 90 mg de Mn, 24 mg de Cu, 1,8 mg de I, 0,84 mg de Co, 0,48 mg de Se, 600 mg de Mg.

Pré-mistura para uma terceira dieta para leitões: 210 mg de Zn, 246 mg de Fe, 84 mg de Mn, 24 mg de Cu, e 4 mg de I.

Pré-mistura para uma dieta de frangos: Retinol, 4,05; colecalciferol, 0,05; tocoferol, 13,5; menadiona, 2,25; tiamina, 1; colina, 375; riboflavina, 5,4; ácido pantotênico, 13,5; piridoxina, 1,1, cianocobalamina, 0,01; acido nicotônico, 40; biotina, 0,15; I, 2,1; Co, 1,4; Se, 0,43; Cu, 7,2; Mn, 86; Zn, 57; Fe, 65; Mg, 110. Pré-misturas para outras dietas de frangos continham 8 ou 10 mg de Cu/kg de dieta.

Composições detergentes A protease da invenção pode ser adicionada e, assim tomar-se um componente de uma composição detergente. A composição detergente da invenção, por exemplo, pode ser formulada como uma composição detergente para lavagem à mão ou em máquina-de-lavar incluindo uma composição aditiva para lavanderia apropriada para pré-tratamento de tecidos manchados e uma composição amaciante de tecidos adicionada ao enxágüe, ou pode ser formulada como uma composição detergente para uso em operações de limpeza de superfícies duras para uso doméstico em geral, ou pode ser formulada para operações de lavagem de louça à mão ou à máquina.

Em um aspecto específico, a invenção proporciona um aditivo detergente compreendendo a protease da invenção. O aditivo detergente e também a composição detergente pode compreender uma ou mais outras enzimas, como uma lipase, uma cutinase, uma amilase, uma carboidrase, uma celulase, uma pectinase, uma mananase, uma arabinase, uma galactanase, uma xilanase, uma oxidase, por exemplo, uma lacase, e/ou uma peroxidase.

Em geral, as propriedades da enzima(s) selecionada deveríam ser compatíveis com o detergente selecionado, (isto é pH ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não-enzimáticos, etc.), e a enzima(s) deveria estar presente em quantidades efetivas.

Lipase vantajosas incluem aquelas de origem bacteriana ou fímgica. Inclui-se mutantes modificados quimícamente ou manipulados com proteína. Exemplos de lipases úteis incluem lipases de Humicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo de E lanuginosa (T. lanuginosus) como descrito em EP 258068 e EP 305216 ou de H. insolens como descrito em WO 96/13580, uma lipase de Pseudomonas, por exemplo de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaUgenes (EP 218272), P. cepacia (EP 331376), P. stutzerí (GB 1,372,034), P. fluorescens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), uma lipase de Bacillus, por exemplo de B. subtilis (Dartois et al. (1993), Biochemica et Biophysica Acta, 1131, 253-360), B. stearothermophilus (JP 64/744992) ou B. pumilus (WO 91/16422). Outros exemplos são variantes de lipase, como aquelas descritas em WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407225, EP 260105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202. Enzimas de lipase preferidas e comercialmente obteníveis incluem Lipolase® e Lipolase Ultra® (Novozymes A/S).

Amilases vantajosas (alfa- e/ou beta-) incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Inclui-se mutantes modificados quimicamente ou manipulados com proteína. Amilases incluem, por exemplo, alfa-amilases obtidas de Bacillus, por exemplo uma cepa especial de B. licheniformis, descrita mais detalhadamente na GB 1,296,839. Exemplos de amilases úteis são as variantes descritas no WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, e WO 97/43424, particularmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23, 105, 106,124, 128, 133, 154, 156, 181, 188,190,197, 202, 208, 209,243, 264, 304,305, 391, 408, e 444. Amilases comercialmente obteníveis são Duramyl®, Termamyl®, Fungamyl® e BAN® (Novozymes A/S), Rapidase® e Purastar® (da Genencor International Inc.).

Celulases vantajosas incluem aquelas de origem bacteriana ou fúngica. Inclui-se mutantes modificados quimicamente ou manipulados com proteína. Celulases vantajosas incluem celulases dos gêneros Bacillus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavia, Acremônio, por exemplo as celulases fungicas produzidas de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxysporum reveladas nas US 4,435,307, US 5,648,263, US 5,691,178, US 5,776,757 e WO 89/09259. Celulases particularmente vantajosas são as celulases alcalinas ou neutras apresentando benefícios de tratamento de cores. Exemplos de referidas celulases são celulases descritas na EP 0 495257, EP 531372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são variantes de células, como aqueles descritos no WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5,457,046, US 5,686,593, US 5,763,254, WO 95/24471, WO 98/12307 e WO 99/01544. Celulases comercialmente obteníveis incluem Celluzyme®, e Carezyme® (Novozymes A/S), Clazinase®, e Puradax HA® (Genencor International Inc.), e KAC-500(B)® (Kao Corporation).

Peroxidases/oxidases vantajosas incluem aquelas de origem vegetal, bacteriana ou fungica. Inclui-se mutantes modificados quimicamente ou manipulados com proteína. Exemplos de peroxidases úteis incluem peroxidases de Coprinus, por exemplo de C. cinereus, e variantes das mesmas como aquelas descritas em WO 93/24618, WO 95/10602, e WO 98/15257. Peroxidases comercialmente obteníveis incluem Guardzyme® (Novozymes). A(s) enzima(s) detergente(s) podem ser incluída(s) em uma composição detergente mediante aditivos separados contendo uma ou mais enzimas, ou mediante adição de um aditivo combinado compreendendo todas estas enzimas. Um aditivo detergente da invenção, isto é um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado, por exemplo como um granulado, um líquido, uma calda, etc. Formulações aditivas detergentes preferidas compreendem granulados, em particular granulados não-pulverulentos, líquidos, em particular líquidos estabilizados, ou caldas.

Granulados não-pulverulentos podem ser produzidos, por exemplo, como divulgado na US 4,106,991 e 4,661,452 e podem ser revestidos opcionalmente por meio de métodos conhecidos na técnica, Exemplos de materiais de revestimento cerosos são produtos de poli(óxido de etileno) (polietilenoglicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000; nonilfenóis etoxilados apresentando de 16 a 50 de unidades de óxido de etileno; alcoóis graxos etoxilados em que o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e em que há de 15 a 80 unidades de óxido de etileno; alcoóis graxos; ácidos graxos; e mono- e di- e triglilcerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento formadores de película adequados para aplicação por meio de técnicas de leito fluidizado são dadas na GB 1483591. Preparações de enzima líquidas podem ser estabilizadas, por exemplo, adicionando-se um poliol, como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo com métodos estabelecidos. Enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método divulgado na EP 238216. A composição detergente da invenção pode ser em qualquer forma conveniente, por exemplo, uma barra, um tablete, um pó, um grânulo, uma pasta ou um líquido. Um detergente líquido pode ser aquoso contendo tipicamente até 70 % de água e 0-30 % de solvente orgânico, ou não-aquoso. A composição detergente compreende um ou mais tensoativos, que podem ser não-iônicos incluindo semi-polares e/ou aniônicos e/ou catiônicos e/ou zwitteriônicos. Os tensoativos estão presentes tipicamente em um nível de 0,1 % a 60 % em peso.

Quando incluído o detergente conterá usualmente de cerca de 1 % a cerca de 40 % de um tensoativo aniônico, como alquilbenzenossulfonato linear, alfa-olefmossulfonato, sulfato de alquila (sulfato de álcool graxo), etoxissulfato de álcool, alcanossulfonato secundário, metil éster de ácido alfa-sulfo graxo, sabão ou ácido alquil- ou alquenilsuccínico.

Quando incluído o detergente conterá usualmente de cerca de 0,2 % a cerca de 40 % de um tensoativo não-iônico, como etoxilato de álcool, etoxilato de nonilfenol, alquilpoliglicosida, óxido de alquildimetilamina, monoetanolamida de ácido graxo etoxilado, monoetanolamida de ácido graxo, amida de ácido graxo de poliidróxi alquila, ou derivados de N-acila N-alquila de glucosamina ("glucamidas"). O detergente pode contém 0-65 % de um reforçador de detergência ou agente complexador, como zeólito, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminotetraacético, ácido dietilenotriaminopentaacético, ácido alquil-ou alquenilsuccínico, silicatos solúveis ou silicatos estratificados (por exemplo SKS-6 da Hoechst). O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Exemplos são carboximetilcelulose, poli(vinilpirrolidona)> poli(etileno glicol), poli(álcool de vinila), poli(vinilpiridino-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos, como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico e copolímeros de lauril metacrilato/ácido acrílico. O detergente pode conter um sistema de branqueamento que pode compreender uma fonte de H2C>2, como perborato ou percarbonato que pode ser combinado com um ativador de branqueamento formador de perácido, como tetracetiletilenodiamina ou nonanoiloxibenzenossulfonato. Altemativamente, o sistema branqueador pode compreender peroxiácidos, por exemplo, do tipo amida, imida, ou sulfona. A enzima(s) da composição detergente da invenção pode ser estabilizada utilizando agentes estabilizadores convencionais, por exemplo, um poliol, como propileno glicol ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico, ou um derivado de ácido bórico, por exemplo, um éster de borato aromático, ou um derivado de ácido fenil borônico, como ácido 4-formilfenil borônico, e a composição pode ser formulada como descrito em, por exemplo, WO 92/19709 e WO 92/19708. O detergente também pode conter outros ingredientes detergentes convencionais, como por exemplo condicionadores de tecidos, incluindo argilas, intensificadores de espuma, supressores de espuma, agentes anti-corrosão, agentes de suspensão de sujeira, agentes anti-redeposição de sujeira, corantes, bactericidas, branqueadores ópticos, hidrótropos, inibidores de manchas, ou perfumes.

Considera-se presentemente que, nas composições detergentes, qualquer enzima, em particular a enzima da invenção, pode ser adicionada numa quantidade correspondente a 0,01-100 mg de enzima proteína por litro de licor de lavagem, de preferência, 0,05-5 mg de enzima proteína por litro de licor de lavagem, em particular 0,1-1 mg de enzima proteína por litro de licor de lavagem. A enzima da invenção pode ser incorporada adicionalmente nas formulações detergentes divulgadas no WO 97/07202.

Depósito de material biológico Os materiais biológicos a seguir foram depositados sob os termos do Tratado de Budapeste junto ao NRRL (Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center), ao DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen e Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha), e ao CGMCC (China General Microbiological Culture Collection Center, Institute of Microbiology, Beijing 100080, China), respectivamente, e receberam os seguintes números de acesso: Depósito Número de acesso Data do depósito Nocardiopsis sp. NRRL 18262 10 de novembro de 1987 Nocardiopsis prasina DSM 15648 30 de maio de 2003 Nocardiopsis prasina DSM 15649 30 de maio de 2003 Nocardiopsis alba DSM 15647 30 de maio de 2003 Brachysporiella sp. CGMCC 0865 19 de dezembro de 2002 Escherichia coli DSM 15509 18 de março de 2003 A cepa Nocardiopsis dassonvillei subespécie âassonvittei DSM 43235 é obtenível publicamente do DSM, Esta cepa também foi depositada em outras instituições depositárias como a seguir: ATCC 23219, IMRU 1250, NCTC 10489. A cepa Nocardiopsis sp. NRRL 18262 foi depositada em conexão com o depósito de outro pedido de patente.

As cepas foram depositadas em condições que asseguram que o acesso às culturas serão disponíveis durante a pendência deste pedido de patente para alguém determinado pelo Commissioner of Patents and Trademarks a ser intitulado a isto sob 37 C.F.R. §1.14 e 35 U.S C. §122. Os depósitos representam culturas substancialmente puras das cepas depositadas. Os depósitos são disponíveis conforme requerido por leis de patentes estrangeiras em países em que contrapartes do pedido em pauta ou sua progênie são depositados. No entanto, deveria-se compreender que a disponibilidade de um depósito não constitui uma licença para praticar a presente invenção em detrimento de direitos de patentes garantidos por ação governamental. A cepa de Brachysporiella CGMCC 0865 foi isolada de ramos mortos de uma planta não-identificada na China em outubro de 1998. As cepas Nocardiopsis prasina DSM 15648, Nocardiopsis prasina DSM 15649, e Nocardiopsis alba DSM 15647 foram isoladas de amostras de solo na Dinamarca em 2001. A invenção descrita e reivindicada aqui não tem sua abrangência limitada por concretizações específicas divulgadas aqui, porque essas concretizações destinam-se a ilustrar vários aspectos da invenção. Quaisquer concretizações equivalentes serão abrangidas pelo escopo desta invenção. Efetivamente, diversas modificações da invenção, adicionalmente àquelas mostradas e descritas aqui se tomarão perceptíveis para aqueles versados na técnica a partir da descrição a seguir. Referidas modificações também devem recair na abrangência das reivindicações anexas. No caso de conflito, a presente descrição incluindo definições terá a precedência. Várias referências indicadas aqui, sendo que suas descrições são incorporadas aqui integralmente por referência.

Exemplos Exemplo 1: Proteases As proteases a seguir foram purificadas empregando-se métodos convencionais a partir de fermentações das respectivas cepas de tipo selvagem ou células hospedeiras recombinantes: Protease 10 (aminoácidos de 1-188 da SEQ ID NO: 2), Protease 18 (aminoácidos de 1-188 da SEQ ID NO: 12), a protease de Brachysporiella (aminoácidos de 1-186 da SEQ ID NO: 14), a protease de Metarhizium (aminoácidos de 1-188 da SEQ ID NO: 4), Protease 08 (aminoácidos de 1-188 da SEQ ID NO: 10), Protease 11 (aminoácidos de 1188 da SEQ ID NO: 6), e Protease 35 (aminoácidos de 1-188 da SEQ ID NO: 8). A pureza por meio de SDS-PAGE (ver Exemplo 2) das preparações de protease foi acima de 95 %, e a pureza de absorção (relação A280/A280; ver Exemplo 3) foi acima de 1,40.

Exemplo 2: Determinação de pureza por meio de SDS-PAGE A pureza das proteases mencionadas no Exemplo 1 conforme determinado por SDS-PAGE utilizando-se o procedimento a seguir: 40 ul (microlitros) de solução de protease (concentração de A28o = 0,025) foram misturados com 40 ul de PMSF 0,1 M em um tubo de Eppendorf sobre gelo e deixados descansar durante uma hora. Em seguida, adicionou-se 20 ul 50 % (peso/volume) de TCA (ácido tricloroacético) no tubo de Eppendorf. Após outra meia hora sobre gelo o tubo foi centrifugado (5 minutos, 0°C, 14.000 x g) e o sobrenadante foi removido cuidadosamente. Adicionou-se 20 ul de tampão de amostra de SDS-PAGE (200 ul de tampão de amostra de Tris-Glicina SDS (2x) (125 mM de Tris/HCl, pH 6,8, 4 % (peso/volume) de SDS, 50 ppm de azul de bromofenol, 20 % (vol/vol) Glicerol, LC2676 da Invítrogen®) + 160 ul de água destilada + 20 ul de beta-mercaptoetanol + 20 ul de base Tris não-tamponada 3M (Sigma T-1503) ao precipitado e o tubo foi fervido durante 3 minutos. O tubo foi centrifugado por curto período e aplicou-se 10 ul da amostra em um gel de gradiente de 420 % de Tris-Glicina precast da Invítrogen® (gel de gradiente de poliacrilamida com base na química de Laemmli porém sem SDS no gel, (Laemmli, U.K., (1970) Naíure, vol. 227, pp. 680-685), EC60255). A

eletroforese foi realizada com tampão de fluxo Tris-Glicina (2,9 g de base Tris, 14,4 g de Glicina, 1,0 g de SDS, água destilada até 1 litro) em ambos os reservatórios de tampão a uma voltagem constante de 150 V até que o corante de rastreamento azul de bromofenol houvesse atingido o fundo do gel. Após eletroforese, o gel foi enxaguado 3 vezes, 5 minutos cada um, com 100 ml de água destilada com agitação delicada. O gel foi então agitado cuidadosamente com reagente de manchamento azul Gelcode® (produto coloidal Comassie G-250 da PIERCE, PIERCE número de catálogo 24592) durante uma hora e lavado com agitação delicada durante de 8 a 16 horas com água destilada, com várias trocas da água destilada. Finalmente, o gel foi secado entre 2 pedaços de celofane. Géis secos foram escaneados com um escaner Arcus II da AGFA equipado com programa Fotolook 95 v2.08 e importado [transferido] para o programa de avaliação de imagem CREAM™ para Windows (números de catálogos 990001 e 990005, Kem-En-Tec, Dinamarca) com o comando File/Acquire [arquivo/adquirir] com os ajustes a seguir (do Fotolook 95 v2.08): OriginaHReflective, Mode=Color RGB, Scan resolution=240 ppi, Output resolution=l 201pi, Scale factor=100 %, Range=Histogram with Global selection e Min=0 e Max=215, ToneCurve=None, Sharpness=None, Descreen=None e Flavor=None, produzindo com isso um arquivo de imagem *.img do gel de SDS-PAGE, que foi usado para uma avaliação em CREAM®. O arquivo de imagem *.img foi avaliado com o comando de menu Analysis/l-D. Duas linhas de varredura foram colocadas no arquivo de imagem *.ímg com a ferramenta Lane Place Tool: uma linha de varredura da amostra e uma linha de varredura do fundo. A linha de varredura da amostra foi colocada no meio de uma banda de amostra (com a protease em questão) de imediatamente abaixo da fenda de aplicação até imediatamente acima do corante de rastreamento de azul de bromofenol. A linha de varredura do fundo foi colocada em paralelo com a linha de varredura da amostra, porém em uma posição no gel de SDS-PAGE representado em que não se aplicou amostra, pontos deiníeio e de final para a linha de varredura do fundo eram perpendiculares aos pontos de início de final da linha de varredura da amostra. A linha de varredura do fundo representa o fundo verdadeiro do gel. A largura e a forma das linhas de varredura não foram ajustadas. A intensidade ao longo das linhas de varredura foram então registradas com o comando 1-D/Scan menu com sensibilidade média. Utilizando-se o comando 1 -D/Editor menu, a varredura do fundo foi subtraída da varredura da amostra. Em seguida, selecionou-se o comando 1-D/Results menu e utilizou-se o % de área do pico da protease, conforme calculado com o programa CREAM®, como a pureza por SDS-PAGE das proteases.

Todas as amostras de protease apresentaram uma pureza por SDS-PAGE acima de 95%.

Exemplo 3: Determinação da pureza de absorção A relação A28o/A26o das amostras de protease purificadas foi determinada como a seguir. A260 significa a absorção de uma amostra de protease a 260 nm em uma cubeta com comprimento do percurso de 1 cm relativamente a um controle de tampão. A2S0 significa a absorção da mesma amostra de protease a 280 nm em uma cubeta com comprimento do percurso de 1 cm relativamente a um controle de tampão.

Amostras das proteases purificadas do Exemplo 1 foram diluídas em tamponador até que a leitura de A2go do espectrofotômetro se encontrasse dentro da parte linear de sua curva de resposta. A relação A28o/A26o foi determinada a partir das leituras. Obteve-se os resultados a seguir: Protease 10: 1,94, Protease 18: 1,96, protease de Brachysporiella·, 1,48, protease de Metarhizium: 1,95, Protease 08: 1,86, Protease 11: 1,95, Protease 35:1,94.

Exemplo 4: Ensaio de Protease - e a influência de vários inibidores sobre a estabilidade e atividade de proteases selecionadas A influência de vários inibidores potenciais sobre a atividade e estabilidade das proteases do Exemplo I foi testada como descrito abaixo. Tampão de ensaio 100 mM de ácido succínico (Merck 1.00682), 100 mM de HEPES (Sigma H-3375), 100 mM de CHES (Sigma C-2885), 100 mM de CABS (Sigma C-5580), 1 mM de CaCl2, 150 mM de KCI, 0,01 % de Triton X-100 (Sigma T-9284) ajustado em pH 7,0 com NaOH.

Inibidores Fe(II)S047H20, Sigma F-7002 Cu(II)S045H20, Merck 2790 Zn(II)Ac22H20, Merck 8802 Mg(II)Cl26H20, Merck 105832 Mn(II)Cl22H20, Merck 5934 Cloreto de colina, Aldrich C7.970-0 Ensaio de pNA

Substrato de pNA: Suc-AAPF-pNA (Bachem L-1400) ou Boc-VLGR-pNA (Bachem L-1205). Temperatura: 25°C. 20 ul (microlitro) de protease (diluída em 0,01 % de Triton X-100) foram colocados em um poço de uma placa de microtitulação. O ensaio foi iniciado adicionando-se 200 ul de substrato de pNA (50 mg dissolvidos em 1,0 ml de DMSO e diluídos adicionalmente lOOx com tampão de ensaio). O incremento da OD405 foi monitorado como uma medida da atividade de protease.

Relações dose/resposta (OD^/min versus (mg de enzima)/l) foram determinados utilizando-se o ensaio de pNA para uma quantidade de proteases, com e sem os diversos inibidores, As curvas dose-resposta foram lineares numa ampla faixa satisfatória de concentrações de enzima. Observou-se graus variáveis de inibição: Algumas proteases incluíram finalidades comparativas, videlicet tripsina porcina e a protease SAVINASE™ (uma protease de subtilisina derivada de Bacillus clausü, comercialmente obtenível da Novozimes A/S, Krogshoejvej 36, D K-2880 Bagsvaerd, Dinamarca) não foram inibidas, enquanto que outras proteases foram inibidas. A adição de inibidores para corja desenvolvida de amarelo p-nitroanilina mostrou não ter qualquer efeito. Concluiu-se portanto que o ensaio de pNA foi efetivamente apropriado para medições de inibição.

Ensaio de estabilidade A protease foi diluída a aprox. 1 m g/ml (ver abaixo) em tampão de ensaio com 0,1 (peso/volume) de K-sorbato (sal de potássio do ácido sórbico) e 1 mM de inibidor, A mistura foi incubada a 25°C). Em intervalos recolheu-se uma amostra da incubação (após misturação íntima) e a mesma foi congelada. Após diluição em tampão de ensaio mediu-se a atividade residual utilizando o ensaio de pNA. Para as adições de 1 mM de inibidor, a incubação foi diluída em tampão de ensaio com 5 mM de EDTA para se verificar um efeito de pura estabilidade.

Concentrações de protease foram avaliadas a partir dos coeficientes teóricos de extinção molar, E28o (1M), que podem ser calculados a partir da composição de aminoácidos utilizando-se a fórmula: E2go (1M) = 5690 * NTrp+ 1280 Njyr + 120 ^ NCyS, em que Njrp, Njyr, ehlcys sao o numero de resíduos Trp, Tyr, e Cys de aminoácidos na protease (Gill, S.C., von Hippel, P.H., Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989)) e o peso molecular, Mw, da protease foi calculado a partir da seqüência der aminoácidos. A partir de uma medição de A28o de uma amostra de protease pura (com pureza acima de 95 % de acordo com Exemplo 2), calculou-se a concentração de protease como: Cone (mg/ml) = (A280 * Mw) / E2g0 (1 M)). Resultados de inibição As curvas dose/resposta (OD^/min versus (mg de enzima)/l) Λ I Λ I não apresentaram inibição de qualquer uma das proteases com Fe , Zn , 2_|_ 2+ · Mg , Μη ou cloreto de colina (era concentrações de 1 mM, adicionados ao tampão de ensaio). No entanto Cu inibiu todas as proteases testadas (em graus variáveis, conforme se depreende da Tabela 1 abaixo). Λ * Primeiramente, o efeito de várias concentrações de Cu foi testado com uma dosagem de enzima de 1 mg/1. Pelo menos na faixa de 0 a 1 mM Cu pareceu não haver uma relação linear entre inibição e concentração de Cu2+, sendo que a inibição se manifesta como um decréscimo na atividade enzimática com concentrações crescentes de Cu (sendo que a atividade enzimática é medida como aumento médio da OD405 /tempo da parte linear de curvas dose/resposta).

Tabela 1 apresenta a atividade das diversas proteases testadas (a concentrações de enzimas de 1 mg/1, utilizando-se uma concentração de Λ i Cu de 1 mM, e utilizando-se Suc-AAPF-pNA como um substrato, a pH 7 e 25°C), relativamente a um experimento de controle que foi idêntico, exceto que não se adicionou Cu .

Tabela 1 Resultados de estabilidade A estabilidade das várias proteases na presença dos diversos inibidores numa concentração de 1 mM foi testada como descrito acima. O único inibidor que exerceu algum efeito sobre a estabilidade de algumas das proteases foi Cu . No entanto, o efeito deste inibidor não foi o mesmo em todas as proteases: ver os resultados na Tabela 2 abaixo mostrando que Protease 18 e as proteases de Brachysporiella são efetivamente estáveis na presença de 1 mM deCu2+, enquanto que as outras proteases não o são.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Uso de uma protease da família de peptidases S2A e/ou família de peptidases S1E, na ração animal; na preparação de uma composição para uso na ração animal; para melhorar o valor nutricional de uma ração animal; para incrementar proteína digerível e/ou solúvel em dietas animais; para incrementar o grau de hidrólise de proteínas em dietas animais; e/ou para o tratamento cJe proteínas vegetais; caracterizado pelo fato de que apresenta uma atividade relativa de pelo menos 0,66 na presença de I mM de Cu2+, relativa mente a um controle sem Cu2+ sendo que as medições dc atividade cncontram-sc no substrato Suc-AAPF-pNA, em tampão de ensaio a pH 7,0 e 25°C; e em que a protease é selecionada do grupo que consiste dei (a) um polipeptídeo apresentando uma sequência de amínoãcidos consistindo dos amínoãcidos 1-188 de SEQ ID NOs: 12, 8 ou 6; (b) uma variante de (a) consistindo em uma substituição conservativa de um a dois amínoãcidos,

2. Uso da protease de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as substituições conservativas se encontram dentro do grupo de aminoãcidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoâcidos ácidos (ácido glutâmico e ácido aspãrtico), aminoãcidos polares (glutamina e asparagína), aminoãcidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoãcidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e pequenos aminoâcidos (glicina, alanina, serina, treonina e metionina).

3. Uso da protease de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a substituição conservativa é selecionada do grupo consistindo em Ala/Ser, Val/lle, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/lle, Leu/val, Ala/Glu, e Asp/Gly bem como estes de forma invertida.

4. Uso da protease de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a protease consiste nos aminoácidos 1-188 de SEQ ID NO: 6, aminoácidos 1-188 de SEQ ID NO: 8, ou os aminoácidos 1188 de SEQID NO: 12.

5. Método para produzir o polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o método compreende (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante compreendendo: (i) a construção de ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NOS 11, 9, 7 ou 5, operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo, ou (ii) o vetor compreendendo a construção de ácido nucleico que compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NOS 11, 9, 7 ou 5, operacionalmente ligado a uma ou mais sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo, para produzir um sobrenadante compreendendo o polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.

6. Aditivo de ração animal, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma protease como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4; e (a) pelo menos uma vitamina solúvel em gordura, e/ou (b) pelo menos uma vitamina solúvel em água, e/ou (c) pelo menos um mineral em traços.

7. Aditivo de ração animal de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que contém Cu, de preferência em tal quantidade de forma a proporcionar uma concentração-na-ração de Cu de 1-500 ppm.

8. Aditivo de ração animal de acordo a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que contém Cu em uma concentração de até 100.000 ppm.

9. Composição de ração animal, caracterizada pelo fato de que apresenta um teor de proteína bruta de 50 a 800 g/kg e compreende pelo menos uma protease como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, ou pelo menos um aditivo alimentar como definido em qualquer uma das reivindicações de 6 a 8.

10. Composição de ração animal de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que contém Cu, de preferência em uma concentração de 1-500 ppm.

11. Composição detergente, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos uma protease como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 e pelo menos um tensoativo.